DE60130235T2

DE60130235T2 - Screening-verfahren für probiotische stämme der gattung bifidobacterium

Info

Publication number: DE60130235T2
Application number: DE60130235T
Authority: DE
Inventors: Seppo Salminen; Arthur Ouwehand; Eeva Salminen; Erika Isolauri
Original assignee: Raisio Oyj; Bioferme Oy
Current assignee: Raisio Oyj; Bioferme Oy
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: EE05412B1; EP1332223A1; DE60130235D1; ES2289010T3; FI20002445A0; WO2002038798A1; AU2002223695A1; EE200300220A; EP1332223B1; DK1332223T3; ATE371746T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen von Bakterien, welche für die menschliche Gesundheit von Nutzen sind, und von spezifischen Stämmen, die unter Verwendung des Verfahrens ausgewählt werden. Spezifisch stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen probiotischer Stämme von Bifidobakterien bereit, welche bei der Herstellung funktioneller und klinischer Nahrungsprodukte oder Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Probiotika sind lebende Bakterien oder ihre inaktivierten Zellen oder Zellwandbestandteile, welche eine vorteilhafte Wirkung auf die menschliche Gesundheit haben [Salminen et al. (1999) Trends in Food Science and Technology 10: 107–110]. Probiotika sind meistens lebensfähige Lactobacillus-Zubereitungen, aber unlängst wurde auch für Bifidobakterien und andere Mikroben gezeigt, dass sie probiotische Eigenschaften haben.
Die Bedeutung der menschlichen Mikroflora des Intestinaltraktes für das Wohlbefinden des menschlichen Wirts und die Bedeutung der Entwicklung der intestinalen Mikroflora nach der Geburt, während der Kindheit, während des Erwachsenenalters und während des hohen Alters sind der Hintergrund der vorliegenden Erfindung.
Bei der Geburt ist das Neugeborene praktisch steril und wird durch die im Geburtskanal der Mutter und in der Umwelt vorhandenen Mikroben besiedelt. Bifidobakterien besiedeln bald ein gesundes Kleinkind und können im Stuhl vom zweiten oder dritten Tag nach der Geburt an nachgewiesen werden. Das Wachstum von Bifidobakterien wird durch Stillen gefördert.
Neben Bifidobakterien sind Lactobacillen unter den ersten Besiedlern des Intestinaltraktes nach der Geburt eines Menschen. Diese beiden Gattungen bilden bald die wesentliche Basis der intestinalen Mikroflora bei Gesundheit, wodurch Krankheiten in der frühen Kindheit verhindert werden. Während des Wachstums und des Alterns wird die Mikroflora diverser, aber die Rolle der Lactobacillen und der Bifidobakterien bleibt wichtig. Insbesondere wurde in japanischen Studien gezeigt, dass die Zahl der Bifidobakterien sinkt und die der Lactobacillen steigt, und die Vielfalt der Stämme, die im Intestinaltrakt der älteren Menschen vorhanden sind, ist geringer als in Erwachsenen oder Kleinkindern [Mitsuoka et al., (1974) Zbl. Bakt. Hyg. I Abt. Orig. A 266: 469–478]. Folglich wurde nahegelegt, dass die Lactobacillus-Flora und die Bifidobacterium-Flora wichtige Faktoren bei der Gesundheitsförderung und der Vermeidung oder Verminderung des Krankheitsrisikos sind. Die Ergänzung der Mikroflora mit ausgewählten Stämmen der Gattungen Lactobacillus und Bifidobacterium können daher die Gesundheit und das Wohlbefinden des Wirts verbessern. Die zu diesem Zweck verwendeten Stämme sollen verschiedene vorteilhafte Eigenschaften besitzen, um potenziell erfolgreiche probiotische Stämme zu sein [Ouwehand et al. (1999), Int. Dairy J. 9: 43–52].
Die Typen der Bifidobakterien, die im Inhalt des Intestinaltraktes von Älteren und Kleinkindern vorhanden sind, variieren und gesunde Individuen haben eine höhere Anzahl von Bifidobakterien und andere Bifidobacterium-Arten. Insbesondere Bifidobakterien scheinen weniger an den intestinalen Schleim von älteren Individuen zu binden, sie können aber bei gesunden, sehr alten Individuen in größerer Zahl vorhanden sein. In ähnlicher Weise besiedeln unterschiedliche Stämme von Bifidobakterien Individuen verschiedener Altersgruppen und Patientenpopulationen.
Auf der anderen Seite gibt es spezifische Stämme von Bifidobakterien, welche eine nachgewiesene gesundheitliche Wirkung haben, und diese umfassen die Vorbeugung und Behandlung von Durchfall bei Kindern und die Linderung von Symptomen der Lebensmittelallergie bei Kindern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Beobachtung der Erfinder, dass Bifidobakterien eine differenzielle Bindung nicht nur an menschliche intestinale Schleimpräparationen von Individuen unterschiedlicher Altersgruppen zeigen, sondern insbesondere an die gesamte intestinale Schleimhaut (ex vivo) solcher Gruppen.
Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde ein Verfahren zum Screenen probiotischer Stämme von Bifidobakterien entwickelt. Die so erhaltenen probiotischen Stämme haben erwünschte Eigenschaften und können bei der Herstellung funktioneller und klinischer Nahrungsprodukte oder Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden.
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Screenen probiotischer Stämme der Gattung Bifidobacterium, umfassend die Isolierung von Bifidobakterien aus Stuhlproben von gesunden älteren menschlichen Individuen und das Screenen auf ihre alters- und krankheitsspezifischen Eigenschaften durch Screenen auf ihre Adhäsion an intestinale muköse Glycoproteine (in vitro) und an gesamte menschliche intestinale Schleimhaut (ex vivo), Screenen auf die Fähigkeit der Stämme, auf auf Getreide basierenden Substraten zu wachsen, und gegebenenfalls weiterhin Unterziehen der Bakterien spezifischen Selektionschritten, wie nachfolgend definiert, um bakterielle Stämme zu erhalten, die spezifische probiotische Eigenschaften haben.
Spezifische bifidobakterielle Stämme, die durch das Verfahren des Screenens erhalten werden, sind weitere Aufgaben der Erfindung. Solche Stämme zeigen vorzugsweise z. B. altersspezifische oder krankheitsspezifische Eigenschaften und können infolgedessen bei der Herstellung von funktionellen Lebensmitteln für Zielpopulationen, insbesondere ältere Menschen, beziehungsweise von krankheitsspezifischen funktionellen Lebensmitteln zur Verringerung des Krankheitsrisikos verwendet werden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Unsere in vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass die adhäsiven Eigenschaften der meisten kommerziell verwendeten Bifidobakterien bei älteren Menschen niedriger sind und dass sich bei Menschen die Typen der Bifidobakterien in verschiedenen Altersgruppen verändern, wobei die Adhärenz mit hohem Alter sinkt. Weiterhin haben unsere ex vivo-Untersuchungen mit gesamter menschlicher intestinaler Schleimhaut, die aus operativ entferntem Colongewebe erhalten wurde, eine ähnliche Variation der Adhärenz in verschiedenen Gruppen gezeigt.
Infolgedessen haben wir, außer dass wir gezeigt haben, dass die Typen von Bifidobakterien für bestimmte Altersgruppen spezifisch sind, gezeigt, dass die Adhärenz bei älteren Individuen als Selektionskriterium für Stämme, die bei intestinalen Zuständen älterer Individuen angewendet werden können, verwendet werden kann.
Wir haben Bifidobakterien aus dem Stuhl von gesunden älteren menschlichen Individuen isoliert und gezeigt, dass diese Stämme verschiedene Bindungseigenschaften in vitro und ex vivo aufweisen. Wir haben bemerkt, dass es unter den gesunden und alten Individuen eine Population von Bifidobakterien gibt, die eine gute Adhärenz an diese Individuen zeigt und daher die Möglichkeit einer intestinalen Besiedlung in solchen Individuen mit gesundheitsfördernden Wirkungen auf die intestinale Mikroflora und Funktion erhöht.
Es sollte auch angemerkt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren des Screenens auch bei Bakterien aus Stuhlproben aus beliebigen geeigneten Tieren, nicht nur Menschen, angewendet werden kann.
In dieser Beschreibung bezieht sich der Begriff „ältere" z. B. im Ausdruck „ältere menschliche Individuen" auf Individuen in einem Alter von etwa 60 Jahren oder älter. Auf der anderen Seite bezieht sich der Begriff „sehr alt", z. B. im Zusammenhang mit dem Ausdruck „sehr alte menschliche Individuen" auf Individuen in einem Alter von etwa 80 Jahren oder älter.
Die Mikroben werden aus gesunden Individuen aus frisch entleerten Stuhlproben unter Verwendung spezifischer Medien für die Isolierung von Bifidobacterien isoliert. Die isolierten Bakterien werden gemäß den beschriebenen Selektionskriterien und -verfahren ausgewählt.
Die in vitro-Adhasion von Probiotika wird im Allgemeinen unter Verwendung von Enterocyten-ähnlichen Gewebekulturzellen oder menschlichem intestinalen Schleim untersucht. Der Schleim wird üblicherweise aus Stuhlproben isoliert. Obwohl diese Verfahren gut eingeführt sind, berücksichtigen sie nur einen Teil der intestinalen Schleimhaut; d. h. entweder die Enterocyten oder die darüberliegende Schleimschicht. Keines des derzeit verwendeten Modelle berücksichtigt die Anwesenheit der normalen intestinalen Mikroflora.
Die in dieser Anmeldung beschriebenen Bifidobakterien wurden zusätzlich auf ihre adhäsive Fähigkeit an gesamte menschliche intestinale Schleimhaut, die aus operativ entferntem Colongewebe erhalten wurde, untersucht. Dieses neue ex vivo-Modell zieht die Wechselwirkung von Bifidobakterien mit sowohl dem intestinalen Schleim und den Enterocyten und auch der normalen intestinalen Mikroflora in Betracht. Dies stellt ein genaueres Wissen über die adhäsiven Fähigkeiten von Bifidobakterien bereit als frühere Modelle.
Folglich werden spezifische Bakterien einem Test unter Verwendung gesamter menschlicher intestinaler Schleimhaut und ihrer alters- und krankheitsabhängigen Proben unterzogen, um auf spezifische Bakterien zu selektieren, die an der Schleimhaut von sehr alten gesunden Individuen anhaften. Dies screent auf altersspezifische Adhäsionseigenschaften bei älteren Individuen. Gesamte Schleimhaut aus Individuen mit Colonkrebs, chronisch entzündlicher Darm erkrankung oder anderen intestinalen Dysfunktionen können verwendet werden, um auf krankheitsspezifische probiotische Bifidobakterien zu screenen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden spezifische Bakterien einem Test unter Verwendung menschlicher intestinaler muköser Glycoproteine und ihrer alters- und krankheitsabhängigen Proben unterzogen, um auf spezifische Bakterien zu selektieren, die am Schleim von sehr alten gesunden Individuen anhaften. Dies screent auch auf altersspezifische Eigenschaften bei älteren Individuen. Schleim von Individuen mit Rotavirus-Durchfall oder anderen intestinalen Dysfunktionen kann verwendet werden, um auf Krankheitsspezifität zu screenen.
Das Screenen auf Toxinbindung wird unter Verwendung von Mycotoxin- und/oder bakterieller Toxinbindung als Modell für die Bindung intestinaler Toxine durchgeführt. Vorzugsweise sollte die Bindung beträchtlich sein, so dass die anhaftenden Stämme ihre Adhärenz verlieren, wenn das Toxin gebunden ist.
Vielversprechende Stämme werden mit Hilfe von Durchflußcytometrie auf ihre relative Resistenz gegen Gallenflüssigkeit und niedrigen pH-Wert geprüft, um auf Stämme zu selektieren, für die es wahrscheinlich ist, dass sie die Passage durch den Intestinaltrakt überleben.
Die Fähigkeit der Stämme, auf bestimmten, auf Getreide basierenden Substraten zu wachsen, wird bestimmt. Nützliche Cerealien sind Hafer, Roggen, Gerste, Weizen und Reis. Gemische davon oder Fraktionen davon können ebenfalls verwendet werden. Am stärksten bevorzugt für die Zwecke der Erfindung ist Hafer. Interessierende Substrate umfassen Getreide-Bestandteile wie Kohlenhydrate (Stärke, Oligosaccharide, β-Glucane) und Proteine oder andere fermentierbare Komponenten. Hafer-Oligosaccharide oder speziell Haferfraktionen, die mit β-Glucan, Protein oder Stärke angereichert sind, werden am stärksten bevorzugt. Dies ist für die Anwendung funktioneller Lebensmittel und für Gesundheitswirkungen wichtig.
Um Lebensmitteltechnologie und industrielle Verfahren möglich zu machen, wird ein Screenen auf relativ aerotolerante Stämme gebraucht. Das Screenen wird durch Züchtung der Stämme auf Blut-Leber-Agarplatten in einer Atmosphäre mit vermindertem Sauerstoffdruck erreicht.
Die interessierenden Stämme werden einem kompetitiven Ausschluß von Modell-Pathogenen wie E. coli-Stämme, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhimurium oder S. enteritidis unterzogen, um auf die wirksamsten Stämme zu selektieren, welche die üblichen intestinalen Pathogene hemmen.
Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen werden auf den Einfluss der Wirts-Mikroflora auf die Schleim-bindenden Fähigkeiten der ausgewählten Stämme geprüft. Das Ziel ist es, die eigene Mikroflora der spezifischen Zielgruppe als ein Selektionskriterium für gut anhaftende Stämme in altersspezifischen und krankheitsspezifischen Populationen zu verwenden.
Alters- und Krankheitsspezifität werden als Kriterien zur Auswahl von Stämmen verwendet. Krankheitsspezifische und altersspezifische Darmsegmente aus chirurgischen Verfahren werden zum Screenen verwendet. Die Proben werden unmittelbar nach der Operation verwendet. Die Spezifität wurde für im Handel erhältliche Stämme bezüglich des Alters der Individuen und der Krankheiten gezeigt.
Eine spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Screenen von probiotischen Stämmen der Gattung Bifidobacterium, umfassend die Isolierung von Bifidobakterien aus Stuhlproben von gesunden älteren menschlichen Individuen und Screenen auf ihre alters- und krankheitsspezifischen Eigenschaften durch Screenen auf ihre Adhäsion an intestinale muköse Glycoproteine und an die gesamte intestinale Schleimhaut, das Screenen auf die Fähigkeit der Stämme, auf auf Getreide basierenden Substraten zu wachsen, sowie das Screenen auf die Aerotoleranz der Stämme und gegebenenfalls das Unterziehen der Bakterien den Schritten des:

a) Auswählens von Stämmen, die, wenn sie an intestinale Toxine binden, ihre Adhärenz an den Schleim verlieren,
b) Auswählens von Stämmen, die voraussichtlich die Passage durch den Intestinaltrakt überleben, und
c) Auswählens der wirksamsten Stämme, die übliche intestinale Pathogene hemmen, und

Eine spezifische Gruppe von Bifidobacterium-Stämmen mit solchen Eigenschaften wurde charakterisiert und wird im Nachfolgenden beschrieben. Einige Stämme können in der Tat diese Eigenschaften haben, während andere nur einige der erwähnten Eigenschaften haben. Zum Beispiel binden einige Stämme Aflatoxin am besten, wenn sie gekocht wurden. Offenkundig ist eine Resistenz gegen Gallenflüssigkeit und Säure für diese Organismen nicht relevant, wenn sie in dieser Art und Weise verwendet werden.
Die folgenden Stämme A bis H, welche einen weiteren Gegenstand dieser Erfindung darstellen, wurden aus Stuhlproben von sehr alten gesunden japanischen Männern isoliert. Die Stämme wurden unter Anwendung der vorstehend angegebenen Selektionskriterien ausgewählt.
Stamm A: Bifidobacterium adolescentis 5 zeigt eine gute Adhärenz an operativ entferntes Colongewebe. Der Stamm hat auch eine hohe Aflatoxin B1-Bindungskapazität, sowohl wenn lebensfähig als auch nach Hitzebehandlung. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 24. Oktober 2000 mit der Zugangsnummer DSM 13797 hinterlegt.
Stamm B: Bifidobacterium adolescentis 15 zeigt eine gute Adhärenz an operativ entferntes Colongewebe und hat eine hohe Aflatoxin B1-Bindungskapazität, sowohl wenn lebensfähig als auch nach Hitzebehandlung. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 24. Oktober 2000 mit der Zugangsnummer DSM 13798 hinterlegt.
Stamm C: Bifidobacterium adolescentis 19 zeigt eine gute Adhärenz an intestinalen Schleim und eine gute Resistenz gegenüber Gallenflüssigkeit. Er hat auch eine hohe Aflatoxin B1-Bindungskapazität, sowohl wenn lebensfähig als auch nach Hitzebehandlung. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 24. Oktober 2000 mit der Zugangsnummer DSM 13799 hinterlegt.
Stamm D: Bifidobacterium adolescent/s 34 hat eine hohe Aflatoxin B1-Bindungskapazität nach Hitzebehandlung und zeigt gute Säurebildung, gutes Wachstum und Überleben in Medien auf Haferbasis. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 24. Oktober 2000 mit der Zugangsnummer DSM 13800 hinterlegt.
Stamm E: Bifidobacterium longum 56 hat eine hohe Aflatoxin B1-Bindungskapazität nach Hitzebehandlung und zeigt einige Toleranz gegenüber niedrigem pH-Wert (2,5). Der Stamm zeigt auch eine gute Adhärenz an operativ entferntes Colongewebe. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 24. Oktober 2000 mit der Zugangsnummer DSM 13801 hinterlegt.
Stamm F: Bifidobacterium breve 134 zeigt eine gute Resistenz gegenüber Gallenflüssigkeit und niedrigem pH-Wert und zeigt ein schnelles Wachstum in konventionellen Labormedien. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 24. Oktober 2000 mit der Zugangsnummer DSM 13802 hinterlegt.
Stamm G: Bifidobacterium longum 46 zeigt eine gute Resistenz gegenüber Gallenflüssigkeit und Sauerstoff. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 15. Oktober 2001 mit der Zugangsnummer DSM 14583 hinterlegt.
Stamm H: Bifidobacterium longum 51 zeigt eine gute Adhäsion an intestinalen Schleim und eine gute Resistenz gegenüber Sauerstoff. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 15. Oktober 2001 mit der Zugangsnummer DSM 14584 hinterlegt.
Die folgenden Stämme I bis L, welche einen weiteren Gegenstand dieser Erfindung darstellen, wurden aus Stuhlproben von sehr alten gesunden finnländischen Frauen und Männern isoliert. Die Stämme wurde unter Anwendung der vorstehend angegebenen Selektionskriterien ausgewählt.
Stamm I: Bifidobacterium adolescentis 2C zeigt eine gute Adhärenz an intestinalen Schleim und an die gesamte intestinale Schleimhaut. Er zeigt eine gute Säurebildung, gutes Wachstum und Überleben in Medien auf Haferbasis. Der Stamm hat auch eine gute Resistenz gegen Sauerstoff. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 15. Oktober 2001 mit der Zugangsnummer DSM 14579 hinterlegt.
Stamm J: Bifidobacterium longum 3A zeigt eine gute Adhärenz und hat eine gute Resistenz gegenüber Gallenflüssigkeit und Sauerstoff. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 15. Oktober 2001 mit der Zugangsnummer DSM 14580 hinterlegt.
Stamm K: Bifidobacterium longum 6 zeigt eine gute Adhärenz und hat eine gute Resistenz gegenüber Gallenflüssigkeit und Sauerstoff. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 15. Oktober 2001 mit der Zugangsnummer DSM 14581 hinterlegt.
Stamm L: Bifidobacterium adolescentis 9J zeigt eine gute Säurebildung, gutes Wachstum und Überleben in Medien auf Haferbasis. Dieser Stamm wurde gemäß dem Budapester Abkommen bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland, am 15. Oktober 2001 mit der Zugangsnummer DSM 14582 hinterlegt.
Alle vorstehenden Stämme sind nicht-sporenbildende Gram-positive Anaerobe mit einer Stäbchen- oder 'Y'-förmigen Zellmorphologie. Ihre Form und Koloniemorphologie auf BL-Agar ist typisch für Bifidobakterien (rund, glatt, braun). Alle Stämme fermentieren Ribose, Glucose, Fructose, Galactose, Saccharose, Maltose, Cellobiose, Lactose, Melibiose, Sorbit (A nur schwach) und Raffinose, jedoch keiner davon fermentiert Melezitose oder Inosit. Die Stämme zeigen gegenseitige Unterschiede zueinander bei der Fermentation von Arabinose und Xylose [Stamm F(–), andere (+)], Mannose [A, E, G, H, J, K und L (–), F unbekannt, andere (+)], Trehalose [A, F, G, H, I, J, K und L (–), andere (+)], Stärke [D, G, H, I, J, K (–), andere (+)], Inulin [A und E (+), andere (–)], Glycogen [D, G, H, I, J, K, L (–), andere (+)] und Mannit [E, G, H, I, J, K, L (–), andere (+)].
Weitere Stämme können in einer ähnlichen Art und Weise, so dass alle oder einige der vorstehend erwähnten Eigenschaften enthalten sind, zur Verwendung in krankheitsspezifischen funktionellen Lebensmitteln und Lebensmitteln zur Verringerung des Risikos von Krankheiten wie Darmkrebs isoliert werden.
Die daraus erhaltenen Stämme können an Zielpopulationen spezifisch angewendet werden, insbesondere an älteren Menschen, um funktionelle Lebensmittel für solche Populationen herzustellen.
Zum Beispiel wurde für die Stämme B. adolescentis 5, B. adolescentis 15 und B. longum 56, die aus gesunden älteren japanischen Männern isoliert wurden, gefunden, dass sie an die intestinale Schleimhaut von Colonkrebspatienten binden.
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Bifidobakterienstämme im Vergleich zum probiotischen Stamm gemäß dem Stand der Technik Bifidobacterium lactis Bb12.
EXPERIMENTELLER TEIL
Isolierung von Bifidobakterien aus Stuhlproben
Die gesammelten Stuhlproben wurden bei 4°C aufbewahrt und innerhalb von 6 Stunden analysiert. Fäkale Bifidobakterien wurden unter Verwendung der Verfahren, die von Mitsuoka [(1980) A color atlas of anaerobic bacteria, Sobunsya, Tokyo S. 341] isoliert und identifiziert. In Kürze beschrieben wurden die Stuhlproben homogenisiert und eine 10-fache serielle Verdünnung wurde mit einer anaeroben Pufferlösung hergestellt. 50 Mikroliter der geeigneten Verdünnungen wurden auf Blut-Leber-Agar (BL-Agar, Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) ausplattiert. Das Impfgut wurde unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für 72 Std. inkubiert. Die charakteristischen braunen Kolonien, die sich auf BL-Agar bildeten wurden als potenzielle Bifidobakterien zufällig entnommen und durch Gram-Färbung, Zellmorphologie, Abwesenheit von Wachstum unter aeroben Bedingungen und Sporenbildung weiter bestätigt. Die Stämme wurden auf Ebene der Art basierend auf ihrem Zuckerfermentationsmuster, wie von Mitsuoka [(1980) A color atlas of anaerobic bacteria, Sobunsya, Tokyo S. 341] beschrieben, identifiziert. Die isolierten Bifidobakterien wurden bei –75°C in 50% Glycerin bis zur Verwendung aufbewahrt.
Screenen auf Adhäsionseigenschaften durch einen in vitro-Adhäsionstest unter Verwendung von isoliertem intestinalen Schleim
Der Schleim wurde aus dem Stuhl durch Extraktion und doppelte Ethanolpräzipitation isoliert [Kirjavainen et al. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 167: 185-189, Millerand & Hoskins (1981) Gastroenterology 81: 759–765]. In Kürze beschrieben wurde der Stuhl von gesunden älteren Freiwilligen in eiskaltem PBS, enthaltend Proteaseinhibitoren und Natriumazid, suspendiert. Stuhlextrakte wurden durch Zentrifugieren der Suspensionen bei 15000 × g bei 4°C hergestellt. Der Schleim wurde aus dem Stuhlextrakt durch doppelte Ethanolpräzipitation isoliert. Der vereinigte Schleim wurde in mit HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2(ethansulfonsäure) gepufferter balancierter Hanks-Salzlösung (HH, 10 mM HEPES, pH 7,4) bei einer Konzentration von 1 mg ml^–1 gelöst. Jegliches partikuläre Material wurde durch Zentrifugieren aus der Suspension entfernt (2000 × g für 10 Min.).
Die getesteten Bakterien wurden in 1 ml GAM-Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) aus tiefgefrorenen Lagerkulturen gezüchtet. Um die Bakterien metabolisch radioaktiv zu markieren, wurden 20 μl (Methyl-1,2³H)-Thymidin (117 Ci mMol^–1) zu dem Medium gegeben. Nach etwa 36 Std. anaeroben Wachstums bei 37°C wurden die Bakterien durch Zentrifugieren (2000 × g, 7 min) geerntet, zweimal gewaschen und in HH-Puffer resuspendiert. Die Absorption bei 600 nm wurde auf 0,25 ± 0,01 eingestellt, um die Anzahl der Bakterien zu standardisieren (etwa 10⁷ KbE ml^–1).
Der Adhäsionstest wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie früher berichtet [Kirjavainen et al. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 167, 185–189, Ouwehand (1999) FEMS Microbiol. Lett. 172, 61–64]. In Kürze beschrieben wurde der intestinale Schleim auf Polystyrol-Mikrotiterplatten-Vertiefungen durch Inkubation über Nacht bei 4°C passiv immobilisiert. Die Vertiefungen wurden mit HH-Puffer gewaschen und die radioaktiv markierten Bakterien wurden zugegeben. Nach 1,5 Std. Inkubation bei 37°C wurden die Vertiefungen gewaschen und die anhaftenden Bakterien wurden mit 1% SDS in 0,1 M NaOH bei 60°C für 1 Std. lysiert. Die Radioaktivität der lysierten Bakterien wurde durch Flüssigkeitsszintillation untersucht. Die Adhäsion wird als Prozentanteil der aus den Vertiefungen gewonnenen Radioaktivität im Vergleich zur Radioaktivität, die zu den Vertiefungen gegeben wurde, ausgedrückt.
Sreenen auf Adhäsionseigenschaften durch einen ex vivo-Adhasionstest unter Verwendung von operativ entferntem intestinalen Gewebe
Colongewebe wurde durch Operation aus Colonkrebspatienten entfernt. Der erkrankte Teil des operativ entfernten Gewebes wurde für Adhäsionsuntersuchungen, um die Krankheitsspezifität zu untersuchen, und der gesunde Teil zur Untersuchung der Adhäsion der gesunden menschlichen Schleimhaut verwendet. Das operativ entfernte Material wurde innerhalb von 20 Min. nach der Operation auf Eis gesammelt und sofort weiterverarbeitet. Der Darm wurde aufgeschnitten und möglicher Inhalt wurde entfernt. Anschließend wurde das Gewebe vorsichtig in PBS, enthaltend 0,01 % Gelatine, gewaschen, bis kein Inhalt sichtbar war. Aus dem Gewebe wurden runde Stücke von 9 mm (64 mm²) gestanzt. Die Stücke wurden bei –70°C in PBS mit 40% Glycerin bis zur Verwendung aufbewahrt.
Für die Adhäsion an menschliches Colongewebe wurde ein Verfahren, das nach Henriksson et al. [(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57: 499–502] modifiziert wurde, verwendet. Die Gewebestücke wurden aufgetaut und vorsichtig in HH gewaschen. Die Stücke wurden dann mit der Schleimhautseite nach oben in Vertiefungen von Kulturschalen mit 24 Vertiefungen gelegt. Zu den Vertiefungen wurden 0,5 ml der radioaktiv markierten Bakterien gegeben, um das Gewebe zu bedecken. Die Platten wurden für 1 Std. in einem Wasserbad mit 37°C inkubiert. Anschließend wurde jede Vertiefung zweimal mit 1 ml PBS gewaschen und die Gewebestücke wurden mit 3% Glutaraldehyd in PBS für 45 Min. bei Raumtemperatur fixiert. Die Schleimhaut wurde dann mit einem Skalpell vom Muskelgewebe getrennt und über Nacht mit 300 μl 30% H₂O₂ und 150 μl 70%-iger Perchlorsäure in gläsernen Szintillationsgefäßen bei 60–70°C gespalten. Nach der Spaltung wurden 4 ml der Szintillationslösung zugegeben und die Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsszintillation bestimmt. Die prozentuale Adhäsion wurde aus der Radioaktivität in 0,5 ml der ursprünglichen Bakteriensuspension, wie vorstehend erwähnt, für Colonschleim bestimmt.
Auswahl von Stämmen, welche ihre Adhärenz an den Schleim verlieren, wenn sie intestinale Toxine binden
Die Bakterien wurden in GAM-Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) über Nacht unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Bakterien wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) gewaschen und die Konzentration wurde unter Anwendung des Verfahrens, das von Virta und Mitarbeitern beschrieben wurde [(1998) Appl. Environ. Microbiol. 2: 515–519], auf 1 × 10⁸ KbE/ml eingestellt. Aflatoxin B1 (5 μg/ml) in PBS wurde zugegeben, das Gemisch wurde bei 37°C für 4 Std. inkubiert und die Überstände wurden mittels HPLC, wie zuvor beschrieben [El-Nezami et al. (1996) Nutr. Today 31: 41–42], analysiert. Der Adäsionstest an intestinalen Schleim wurde, wie vorstehend beschrieben, mit mit Aflatoxin-B1 vorinkubierten sowie mit nicht-vorinkubierten Bakteriensuspensionen durchgeführt.
Einfluss der Nahrungsmittelmatrix auf die Gewebeadhäsion
Der Einfluss der Nahrungsmittelmatrix auf die Adhäsion von Mikroorganismen wurde nur geringfügig für Milch untersucht. Es wurde beobachtet, dass Milch die Adhäsion aller geprüfter probiotischer Mikroorganismen hemmte. Unter Verwendung des neuen Modells mit gesamter intestinaler Schleimhaut wurde die Wirkung von Getreidesubstraten, insbesondere Hafer, auf die Adhäsion von Bifidobakterien untersucht. Im Gegensatz zu den Beobachtungen mit Milch (Ouwehand et al. 2001, Int. J. Food Microbiol. 64: 119–126), wurde beobachtet, dass das Hafersubstrat die Adhäsion der gesamten intestinalen Schleimhaut (ex vivo) ausgewählter B. adolescentis-Stämme mehr als verdoppelte. Andere geprüfte Stämme waren in ihrer (ex vivo) Adhäsion nicht beeinträchtigt. Dies legt nahe, dass ein Getreidesubstrat, insbesondere Hafersubstrat, eine positive oder keine Wirkung auf die Adhäsion probiotischer Bakterien hat, während Milch eine starke negative Wirkung auf die Adhäsion von Probiotika hat (Ouwehand et al. 2001 Int. J. Food Microbiol. 64: 119–126).
Die Wirkung des Gehalts von Asche, Protein und Fasern wurde unter Verwendung verschiedener durch Mühlen fraktionierter Getreidesorten, Hafer, Roggen und Gerste, untersucht. Bifidobacterium-Stämme zeigten Wachstum in allen Fraktionen, am besten war aber Hafer und Hafer erhöhte auch die Gewebeadhäsion.
Auswahl von Stämmen, für die es wahrscheinlich ist, dass sie die Passage durch den Intestinaltrakt überleben
Bakterien wurden in GAM-Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) über Nacht unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Bakterien wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) gewaschen und die Konzentration wurde durch Einstellen der Absorption bei 600 nm auf 0,5 auf etwa 10⁸ KbE/ml eingestellt. Die Bakterien wurden zentrifugiert, in PBS, PBS + 0,3% Ochsengalle oder PBS bei pH 2,5 resuspendiert und für 60 Min. bei 37°C inkubiert. Die Lebensfähigkeit bei den verschiedenen Inkubationen wurde durch Plattenzählung auf BL-Agar untersucht und mit der PBS-Inkubation verglichen.
Screenen von Stämmen mit der Fähigkeit, auf Getreide-Oligosacchariden zu wachsen
Mehlfraktionen, die mit Haferstärke oder Hafer-β-Glucan angereichert waren, wurden hergestellt. Aus diesen Fraktionen und Vollkorn-Hafermehl wurde ein stabiler Brei hergestellt, so dass ein Hafertrunk erhalten wurde. Die Stämme wurden in diesen Trunk geimpft und ihr Wachstum (bestimmt als KbE/ml auf BL-Agar) und ihre Fähigkeit die Substrate anzusäuern wurden bestimmt.
Screenen auf Aerotoleranz von Bakterien
Die Bakterien wurden in GAM-Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) über Nacht unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Bakterien wurden auf BL-Agar ausgebracht und unter streng anaeroben Bedingungen (Kontrolle), unter aeroben Bedingungen und unter Bedingungen mit 3–5% Sauerstoff inkubiert. Mögliches Wachstum auf beiden letzteren wurde mit dem Wachstum auf der Kontrolle verglichen.
Screenen auf die wirksamsten Stämme, welche das Wachstum üblicher intestinaler Pathogene hemmen
Die Bakterien wurden in GAM-Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) über Nacht unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren aus der Brühe entfernt. Die verbrauchte Kulturflüssigkeit wurde auf einen pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von 1 M NaOH neutralisiert und filtersterilisiert. Intestinale Pathogene wurden über Nacht bei 37°C in einem geeigneten Medium (Luria-Bertani-Brühe, LB-Brühe) gezüchtet. Die neutralisierte, verbrauchte Kulturflüssigkeit wurde in einem Verhältnis von 1:1 mit doppelt konzentrierter LB-Brühe gemischt und mit intestinalen Pathogenen beimpft. Das Wachstum der Pathogene wurde durch Bestimmung der Absorption bei 600 nm in regelmäßigen Intervallen untersucht. Die Ergebnisse wurden mit dem Wachstum in frischer GAM-Brühe, gemischt mit doppelt konzentrierter LB-Brühe als Kontrolle, verglichen.
Screenen auf die wirksamsten Stämme, welche die Adhärenz üblicher intestinaler Pathogene hemmen
Schleim wurde durch Extraktion und doppelter Ethanolpräzipitation aus dem Stuhl isoliert, wie vorstehend beschrieben.
In vitro-Adhäsionstest
Die geprüften Bakterien wurden in 1 ml GAM-Brühe Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) aus gefrorenen Lagerkulturen gezüchtet. Nach etwa 36 Std. anaeroben Wachstums bei 37°C wurden die Bakterien durch Zentrifugieren geerntet (2000 × g, 7 Min.), zweimal gewaschen und in HH-Puffer resuspendiert. Die Absorption bei 600 nm wurde auf 0,25 ± 0,01 eingestellt, um die Zahl der Bakterien zu standardisieren (etwa 10⁷ CFU ml^–1).
Die intestinalen Pathogene wurden in LB-Brühe gezüchtet und metabolisch mit 10 μl (Methyl-1,2-³H)Thymidin (117 Ci mMol^–1) im Medium radioaktiv markiert. Nach Wachstum über Nacht bei 37°C wurden die Bakterien durch Zentrifugieren (2000 × g, 7 Min.) geerntet, zweimal gewaschen und in HH-Puffer resuspendiert. Die Absorption bei 600 nm wurde auf 0,25 ± 0,01 eingestellt, um die Zahl der Bakterien zu standardisieren (etwa 10⁷ KbE ml^–1).
Der Adhäsionstest wurde im Wesentlichen, wie früher berichtet, durchgeführt [Kirjavainen et al. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 167, 185–189, Ouwehand et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 172, 61–64]. In Kürze beschrieben, wurde der intestinale Schleim auf Polystyrol-Mikrotiterplatten durch Inkubation über Nacht bei 4°C passiv immobilisiert. Die Vertiefungen wurden mit HH-Puffer gewaschen und die zu untersuchenden Bakterien wurden zugegeben. Nach Inkubation für 1 Std. bei 37°C wurden die Vertiefungen gewaschen und die radioaktiv markierten intestinalen Pathogene wurden zugegeben und wiederum für 1 Std. bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle wurde den intestinalen Pathogenen auch ermöglicht, an den immobilisierten intestinalen Schleim anzuhaften, der nicht mit den Testbakterien vorbehandelt war. Die anhaftenden Bakterien wurden mit 1% SDS in 0,1 M NaOH bei 60°C für 1 Std. lysiert. Die Radioaktivität der lysierten Bakterien wurde durch Flüssigkeitsszintillation untersucht. Die Wirkung der Testbakterien auf die Adhäsion der intestinalen Pathogene wurde als prozentualer Anteil der Radioaktivität, die aus den Vertiefungen gewonnen wurde, die mit Testbakterien vorbehandelt waren, verglichen mit der Radioaktivität, die aus Vertiefungen ohne Testbakterien gewonnen wurde, ausgedrückt.
Bestimmung der Absorption von Aflatoxin B1 und anderen Mycotoxinen an lebensfähige und hitzeinaktivierte Stämme
Die Bakterien wurden über Nacht in GAM-Brühe (Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan) unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Bakterien wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) gewaschen und die Konzentration wurde unter Anwendung des Verfahrens, das von Virta und Mitarbeitern beschrieben wurde [(1998) Appl. Environ. Microbiol. 2: 515–519] auf 1 × 10¹⁰ KbE/ml eingestellt. Aflatoxin B1 (5 μg/ml) in PBS wurde zugegeben, das Gemisch wurde bei 37°C für 4 Std. inkubiert und die Überstände wurden mittels HPLC, wie zuvor beschrieben [El-Nezami et al. (1996) Nutr. Today 31: 41–42], analysiert. Die getesteten Bakterien wurden durch Kochen für 1 Std. hitzeinaktiviert.
Bestimmung des Einflusses der Mikroflora des Wirtes auf ihre Schleim-bindenden Eigenschaften unter Verwendung der der jeweiligen Zielgruppe eigenen Mikroflora als ein Auswahlkriterium
Schleim wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert. Der Adhäsionstest wurde ausgehend von der Beschreibung im Absatz „Screenen auf Adhäsionseigenschaften durch einen in vitro-Adhäsionstest..." modifiziert. In Kürze beschrieben wurde der intestinale Schleim auf Polystyrol-Mikrotiterplatten durch Inkubation über Nacht bei 4°C immobilisiert. Die Vertiefungen wurden mit HH-Puffer gewaschen. Zu den Vertiefungen wurden 100 μl PBS, Stuhlextrakt, fäkale Bakterien oder gewaschene fäkale Bakterien zugegeben und für 1 Std. bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend gewaschen und 100 μl radioaktiv markierte probiotische Bakterien wurden zugegeben. Nach Inkubation für 1 Std. bei 37°C wurden die Vertiefungen gewaschen und die anhaftenden Bakterien wurden mit 1% SDS in 0,1 M NaOH lysiert. Die Radioaktivität der lysierten Bakterien wurde durch Flüssigkeitsszintillation untersucht. Die Adhäsion wird als prozentualer Anteil der Radioaktivität, die aus den Vertiefungen gewonnen wurde, verglichen mit der Radioaktivität, die zu den Vertiefungen zugegeben wurde, ausgedrückt.
Herstellung von Nahrungsprodukten und Nahrungsergänzungsmitteln
Beispiel 1. Kalte Hafermahlzeit mit Bifidobakterien

Ein oder mehrere Stämme von Bifidobacterium adolescentis 5, 15, 19, 34, 2C, 9J, Bifidobacterium longum 51, 56, 46, 3A, 6 oder Bifidobacterium breve 134 wurden in einem Medium gezüchtet:

Trypticasepepton	8 g/l
Phytonpepton	3 g/l
Hefeextrakt	5 g/l
K₂HPO₄	2 g/l
KH₂PO₄	3 g/l
MgCl₂·6H₂O	0,5 g/l
FeSO₄·7H₂O	10 mg/l
Propionat	50 mg/l
Glucose	20 g/l
L-Cystein-HCl	0,5 g/l

Wachstumsbedingungen: pH-kontrolliert: 6,5, Temp.: 37°C, Inkubationszeit: etwa 2 Tage (bis der Verbrauch von NaOH zum Neutralisieren des Mediums geendet hat), N₂-Atmosphäre.

Die Bakterienzellen wurden getrennt und gefriergetrocknet. Die kalte Hafermahlzeit wurde durch Mischen der trockenen Cerealien und Beerenzutaten mit dem Pulver des/der Bifidobacterium-Stamms oder der -Stämme wie folgt hergestellt:

Tafelfertige Haferflocken	75 %
Trockene Beeren oder Fruchtpulver (Brombeeren, Erdbeeren, Bananen, Apfel)	10 %
Zucker	14 %
Gefriergetrocknete(r) Stamm oder Stämme von Bifidobakterien (enthaltend 10¹²–10¹³ Zellen/g)	0,05 %

Das Produkt wurde sofort in einer Stickstoffatmosphäre in Einweg-Aluminiumfolienverpackungen unter Gas abgepackt. Die Größe einer Portion beträgt 35 g und sie enthält mindestens 10⁸–10⁹ bifidobakterielle Zellen pro Portion. Eine Portion einer Trockenmahlzeit wird mit %-1 dl kalter oder lauwarmer Milch vermischt.
Beispiel 2. Fermentiertes Hafermaterial
Die folgenden Bestandteile wurde in einem Behälter, der für eine Hitzebehandlung geeignet ist, gemischt:
9,5 % Hafermehl
2,6 % resistente Stärke oder Haferstärke
3,0 % Oligofructose
84,9 % Wasser
Das Gemisch, das erst durch Erhitzen mittels Dampf gelatinisiert wurde, so dass eine Temperatur von 131°C erreicht wurde, und weiterhin bei dieser Temperatur für 2–3 Minuten gehalten wurde, wurde mechanisch homogenisiert und schließlich bei etwa 37°C gekühlt. Der erhaltene Brei wurde dann in einen Fermentationstank überführt und mit einem der Stämme oder mit einem Gemisch von Stämmen von Bifidibacterium-Arten, die ausgewählt werden aus Bifidobacterium adolescentis 5, 15, 19, 34, 2C, 9J, Bifidobacterium longum 56, 51, 46, 3A, 6 oder Bifidobacterium breve 134, beimpft.
Ein gefriergetrockneter Stamm oder Stämme von Bifidobakterien enthielt(en) 10¹²–10¹³ koloniebildende Einheiten pro Gramm. Die Konzentration der Bakterien, die zu dem Brei zugegeben wurde, war 0,05–0,1% bezogen auf das Gewicht des Ansatzes. Die Fermentation fand bei 37°C für 18–24 Stunden statt, was fermentiertes Material lieferte, welches wie folgt charakterisiert wurde: pH-Wert 4,2–4,8, koloniebildende Einheiten der Bifidobakterien pro Gramm: 10⁸–10⁹, gesamte Säure von etwa 0,2–0,4 Gewichts-%, ausgedrückt als Milchsäuregehalt.
Das fermentierte Getreidematerial kann unter 8°C für bis zu 2 Tage vor der Verwendung gelagert oder für eine Langzeitlagerung pasteurisiert werden. Dieses Material ist für die Zubereitung von Fruchtdesserts, Frischkäse, Joghurts, Getränken etc. geeignet. Die Dosierung, die Wege zur Einführung und die Endbehandlung werden durch das gewünschte Produkt bestimmt.
Beispiel 3. Fermentiertes Material mit Hafer und Reis
Die folgenden Bestandteile wurde in einem Behälter, der für eine Hitzebehandlung geeignet ist, gemischt:

6 % Hafermehl

1,5 % Haferstärke

3,0 % Reismehl

1,5 % isoliertes Sojaproteinat

3,0 % Oligofructose

1,0 % Glucose

1,0 % Caseinhydrolysat

83 % Wasser
Das Gemisch wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt, um ein entsprechendes Produkt zu erhalten.

Claims

Verfahren zum Screenen probiotischer Stämme der Gattung Bifidobacterium, umfassend das Isolieren von Bifidobakterien aus Stuhlproben gesunder älterer menschlicher Individuen, und das Screenen auf deren alters- und krankheitsspezifische Eigenschaften durch Screenen auf ihre Adhäsion an intestinale muköse Glycoproteine und an die gesamte intestinale Schleimhaut, Screenen auf die Fähigkeit der Stämme, auf auf Getreide basierenden Substraten zu wachsen, sowie das Screenen auf die Aerotoleranz der Stämme und, gegebenenfalls, des Weiteren das Unterziehen der Bakterien den Schritten des (a) Auswählens von Stämmen, die, wenn sie an intestinale Toxine binden, ihre Adhärenz an den Schleim verlieren, (b) Auswählens von Stämmen, die voraussichtlich die Passage durch den Intestinaltrakt überleben, und (c) Auswählens der wirksamsten Stämme, die übliche intestinale Pathogene hemmen, und das Isolieren und Identifizieren der Stämme, die eine geeignete Auswahl der obengenannten Eigenschaften aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bifidobakterien aus frisch entleerten Stuhlproben gesunder, sehr alter menschlicher Individuen isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screenen auf altersspezifische Eigenschaften dadurch durchgeführt wird, dass die Bakterien einem Test unter Verwendung menschlicher intestinaler muköser Glycoproteine und deren altersabhängigen Proben unterzogen werden, um spezifische Bakterien auszuwählen, die an Schleim sehr alter gesunder Individuen anhaften.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screenen auf krankheitsspezifische Eigenschaften dadurch durchgeführt wird, dass die Bakterien einem Test unter Verwendung menschlicher intestinaler muköser Glycoproteine oder gesamter intestinaler Schleimhaut aus Individuen mit verschiedenen intestinalen Dysfunktionen unterzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Auswahl von Stämmen, die, wenn sie intestinale Toxine binden, ihre Adhärenz an den Schleim verlieren, dadurch durchgeführt wird, dass die Bakterien in einen Test eingebracht werden, der Binden an Mykotoxin und/oder bakterielles Toxin als Modell für Binden an intestinales Toxin verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Auswahl der Stämme, die voraussichtlich die Passage durch den Intestinaltrakt überleben, dadurch durchgeführt wird, dass ihre relative Widerstandsfähigkeit gegenüber Gallenflüssigkeit und niedrigem pH-Wert durch Feststellen ihrer Lebensfähigkeit unter Verwendung von Durchflusscytometrie getestet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screenen auf die Fähigkeit der Stämme, auf auf Getreide basierenden Substraten zu wachsen, durch Züchten der Stämme auf verschiedenen Substraten und Auswählen der Stämme durchgeführt wird, die in der Lage sind, auf einem Substrat von Interesse zu wachsen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die auf Getreide basierenden Substrate auf Hafer basierende Substrate sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die auf Hafer basierenden Substrate Haferkohlenhydrate sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screenen auf die Aerotoleranz der Bakterien durch Züchten der Stämme auf Blut-Leber-Agar-Platten in einer Atmosphäre mit vermindertem Sauerstoffdruck durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Auswahl von Stämmen, die übliche intestinale Pathogene hemmen, dadurch durchgeführt wird, dass die Bakterien einem kompetitiven Ausschluss von Modellpathogenen unterzogen werden.
Biologisch reine Kultur eines probiotischen Bifidobacterium-Stammes, ausgewählt aus den Stämmen Bifidobacterium adolescentis 2C mit der Zugangsnummer DSM 14579, Bifidobacterium longum 3A mit der Zugangsnummer DSM 14580, Bifidobacterium longum 6 mit der Zugangsnummer DSM 14581, Bifidobacterium longum 46 mit der Zugangsnummer DSM 14583 und Bifidobacterium longum 51 mit der Zugangsnummer DSM 14584.
Verwendung der wie in Anspruch 12 definierten probiotischen Bifidobacterium-Stämme für die Herstellung funktioneller oder klinischer Nahrungsprodukte oder Nahrungsergänzungsmittel.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die funktionellen oder klinischen Nahrungsprodukte altersspezifische oder krankheitsspezifische funktionelle oder klinische Nahrungsprodukte sind.
Funktionelles oder klinisches Nahrungsprodukt, umfassend mindestens einen der wie in Anspruch 12 definierten Bifidobacterium-Stämme.
Nahrungsergänzungsmittel, umfassend mindestens einen der wie in Anspruch 12 definierten Bifidobacterium-Stämme.