DE60128835T2

DE60128835T2 - Selbstreplizierendes rna-molekül aus hepatitis-c-virus

Info

Publication number: DE60128835T2
Application number: DE60128835T
Authority: DE
Inventors: George Laval KUKOLJ; Arnim Laval PAUSE
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: HUP0302593A3; EP1379660A2; HUP0302593A2; US6956117B2; IL156058A0; US6706874B2; ATE364085T1; AU2002218906B2; CA2430607A1; CA2430607C; MXPA03005638A; EP1379660B1; JP2006304803A; US20040203020A1; JP2004516039A; NZ527035A; US20020142350A1; US7344723B2; HU229567B1; WO2002052015A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein HCV-RNA-Molekül, das in geeigneten Zelllinien selbstreplizierend ist; insbesondere ein selbstreplizierendes HCV-RNA-Konstrukt mit einem erhöhten Wirkungsgrad bei der Gewährleistung der Zellkulturreplikation.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) ist weltweit der wichtigste ätiologische Auslöser von durch Transfusion und durch allgemeine Umstände erworbene Nicht-A- Nicht-B-Hepatitis. Es wird angenommen, dass weltweit mehr als 200 Millionen Personen mit dem Virus infiziert sind. Bei einem hohen prozentualen Anteil von Virusträgern entsteht eine chronische Infektion, wobei es in zahlreichen Fällen zu einer chronischen Leberkrankheit kommt, der sogenannten chronischen Hepatitis C. Bei dieser Gruppe besteht wiederum die starke Gefahr von ernsthaften Leberkrankheiten, wie Leberzirrhose, hepatozellulärem Karzinom und zum Tod führenden terminalen Stadien von Lebererkrankungen. Der Mechanismus, gemäß dem HCV seinen viralen Fortbestand gewährleistet und eine hohe Rate an chronischen Lebererkrankungen hervorruft, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist nicht bekannt, wie HCV mit dem Wirtsimmunsystem in Wechselwirkung tritt und diesem ausweicht. Ferner müssen die Rollen der zellulären und humoralen Immunreaktionen beim Schutz gegen HCV-Infektionen und -Krankheiten noch aufgeklärt werden.
Es wurden verschiedene klinische Studien mit dem Ziel durchgeführt, pharmazeutische Verbindungen zu identifizieren, die in wirksamer Weise zur Behandlung von HCV-Infektionen bei von chronischer Hepatitis C betroffenen Patienten befähigt sind. Bei diesen Untersuchungen verwendete man Interferon-alpha, allein und in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln, wie Ribavirin. Derartige Untersuchungen haben ergeben, dass eine erhebliche Anzahl der Teilnehmer auf diese Therapien nicht reagiert und dass von den Teilnehmern, die eine günstige Reaktion zeigen, ein großer Anteil nach Beendigung der Behandlung einen Rückfall erleidet. Bisher sind keine antiviralen Verbindungen mit breitem Wirkungsspektrum zur Behandlung einer HCV-Infektion bekannt.
HCV ist ein umhülltes Plusstrang-RNA-Virus der Familie Flaviviridae. Das einzelsträngige HCV-RNA-Genom weist eine positive Polarität auf und besitzt einen einzigen offenen Leseraster (ORF) mit einer Länge von etwa 9 600 Nucleotiden, der für ein lineares Polyprotein mit etwa 3010 Aminosäuren kodiert.
In infizierten Zellen wird dieses Polyprotein an mehreren Stellen durch zelluläre und virale Proteasen gespalten, wodurch strukturelle und nicht-strukturelle (NS) Proteine entstehen. Die strukturellen Proteine (C, E1, E2 und E2-p7) umfassen Polypeptide, die das Virusteilchen darstellen (Hijikata et al., 1991; Grakoui et al., 1993 (a)). Die nicht-strukturellen Proteine (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) kodieren für Enzyme oder zusätzliche Faktoren, die die Replikation des HCV-RNA-Genoms katalysieren und regulieren. Die Prozessierung der strukturellen Proteine wird durch Wirtszell-Proteasen katalysiert (Hijikata et al., 1991). Die Erzeugung der reifen, nicht-strukturellen Proteine wird durch zwei viral kodierte Proteasen katalysiert. Bei der ersten handelt es sich um die von Zink abhängige NS2/3-Metalloprotease, die eine Autokatalyse der Freisetzung des NS3-Proteins aus dem Polyprotein bewirkt. Das freigesetzte NS3 enthält eine N-terminale Serinprotease-Domäne (Grakoui et al., 1993 (b);. Hijikata et al., 1993) und katalysiert die restlichen Spaltungen aus dem Polyprotein. Das freigesetzte NS4A-Protein übt mindestens zwei Rollen aus. Erstens bildet es einen stabilen Komplex mit dem NS3-Protein und unterstützt die Membranlokalisierung des NS3/NS4A-Komplexes (Kim et al., Arch. Virol., Bd. 144 (1999), S. 329–343), und zweitens wirkt es als Kofaktor für die NS3-Protease-Aktivität. Dieser membranassoziierte Komplex katalysiert wiederum die Spaltung der verbleibenden Stellen am Polyprotein und bewirkt somit die Freisetzung von NS4B, NS5A und NS5B (Gartenschlager et al., 1993; Grakoui et al., 1993 (a); Hijikata et al., 1993; Love et al., 1996; Übersichtsartikel von Kwong et al., 1998). Das C-terminale Segment des NS3-Proteins besitzt auch Nucleosid-triphosphatase- und RNA-Helicase-Aktivität (Kim et al., 1995). Die Funktion des Proteins NS4B ist unbekannt. NS5A, ein hochgradig phosphoryliertes Protein, scheint für die Interferon-Resistenz von verschiedenen HCV-Genotypen verantwortlich zu sein (Gale Jr. et al., Virology, Bd. 230 (1997), S. 217; Reed et al., 1997). NS5B ist eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp), die an der Replikation von HCV beteiligt ist.
Der offene Leseraster des HCV-RNA-Genoms wird an seinem 5'-Ende von einer nicht-translatierten Region (NTR) mit etwa 340 Nucleotiden flankiert, die als interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) dient. An seinem 3'-Ende wird es von einer NTR mit etwa 230 Nucleotiden flankiert. Sowohl die 5'-NTR als auch die 3'-NTR sind für die RNA-Genomreplikation von Bedeutung. Die genomische Sequenzvarianz ist nicht gleichmäßig über das Genom verteilt und die 5'-NTR und Teile der 3'-NTR stellen die am stärksten konservierten Bereiche dar. Das authentische, hochgradig konservierte 3'-NTR ist Gegenstand des US-Patents 5,874,565 (Rice et al.).
Die klonierten und charakterisierten partiellen und vollständigen Sequenzen des HCV-Genoms wurden ferner bezüglich geeigneter Ziele für eine prospektive antivirale Therapie analysiert. Vier virale Enzymaktivitäten bieten mögliche Ziele, z. B. (1) die NS2/3-Protease; (2) der NS3/4A-Protease-Komplex; (3) die NS3-Helicase; und (4) die RNA-abhängige RNA-Polymerase NS5B. Der NS3/4A-Protease-Komplex und die NS3-Helicase wurden bereits kristallisiert und ihre dreidimensionale Struktur wurde bestimmt (Kim et al., 1996; Yem et al., 1998; Love et al., 1996; Kim et al., 1998; Yao et al., 1997; Cho et al., 1998). Die RNA-abhängige RNA-Polymerase NS5B wurde ebenfalls kristallisiert, wobei sich eine Struktur ergab, die an andere Nucleinsäure-polymerasen erinnert (Bressanelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 96 (1999), S. 13034–13039; Ago et al. Structure, Bd. 7 (1999). S. 1417–1426; Lesburg et al., Nat. Struct. Biol., Bd. 6 (1999), S. 937–943).
Obgleich mit diesen Enzymen wichtige Ziele für die Entwicklung einer Therapie chronischer HCV-Infektionen bestimmt worden sind und trotz einer weltweiten intensiven Suche nach geeigneten Inhibitoren mit Unterstützung durch rationale Arzneistoffentwicklung ("rational drug design") und HTS besteht bei der Entwicklung einer Therapie ein Hauptnachteil, nämlich das Fehlen von Zellkultursystemen oder einfachen Tiermodellen, die eine direkte und zuverlässige Vermehrung von HCV-Viren ermöglichen. Das Fehlen eines wirksamen Zellkultursystems stellt bisher immer noch den Hauptgrund dafür dar, dass die HCV-Replikation nicht aufgeklärt worden ist.
Obgleich selbstreplizierende Flavi- und Pestivirus-RNAs beschrieben und für die Replikation in verschiedenen Zelllinien in relativ hoher Ausbeute eingesetzt worden sind, erwiesen sich ähnliche Experimente mit HCV bisher nicht als erfolgreich (Khromykh et al., 1997; Gehrens et al., 1998; Moser et al., 1998). Aus verschiedenen Veröffentlichungen ist bekannt, dass Zelllinien oder primäre Zellkulturen mit Hochtiter-Patientenseren mit einem Gehalt an HCV infiziert werden können (Lanford et al., 1994; Shimizu et al., 1993; Mizutani et al. 1996; Ikda et al., 1998; Fourner et al., 1998; Ito et al., 1996). Jedoch ermöglichen diese virusinfizierten Zelllinien oder Zellkulturen nicht den direkten Nachweis von HCV-RNA oder HCV-Antigenen.
Ferner ist aus den Veröffentlichungen von Yoo et al., 1995, und Dash et al., 1997, bekannt, dass Hepatom-Zelllinien mit synthetischer HCV-RNA, die durch in vitro-Transkription des klonierten HCV-Genoms erhalten worden ist, transfiziert werden können. In beiden Veröffentlichungen gingen die Autoren von der grundlegenden Idee aus, dass es sich beim viralen HCV-Genom um eine Plusstrang-RNA handelt, die nach Transfektion in die Zelle direkt als mRNA wirkt, was die Synthese von viralen Proteinen im Verlauf des Translationsprozesses ermöglicht, so dass neue HCV-Teilchen HCV-Viren bilden könnten und ihre RNA durch RT-PCR nachgewiesen werden könnte. Jedoch zeigen die veröffentlichten Ergebnisse der RT-PCR-Experimente, dass die HCV-Replikation in den beschriebenen HCV-transfizierten Hepatomzellen nicht besonders wirksam ist und nicht ausreicht, um die Qualität der Replikation zu messen, ganz abgesehen von der Messung von Modulationen in der Replikation nach Einwirkung von potentiellen antiviralen Arzneistoffen. Ferner ist nicht bekannt, dass die hochgradig konservierte 3'-NTR für die Virusreplikation wesentlich ist (Yanagi et al., 1999). Diese Kenntnis steht in striktem Gegensatz zu den Angaben von Yoo et al., (a.a.O.) und Dash et al. (a.a.O.), die für ihre Experimente nur HCV-Genome mit kürzeren 3'-NTRs und nicht das authentische 3'-Ende des HCV-Genoms einsetzten.
In WO-98/39031 beschreiben Rice et al. authentische HCV-Genom-RNA-Sequenzen, die insbesondere folgende Bestandteile enthalten: a) die hochgradig konservierte 5'-terminale Sequenz "GCCAGCC"; b) die für das HCV-Polyprotein kodierende Region; und c) authentische 3'-NTR-Sequenzen.
In WO-99/04008 beschreiben Purcell et al. ein infektiöses HCV-Klon, das ebenfalls nur die hochgradig konservierte 5'-terminale Sequenz "GCCAGC" enthält.
Vor kurzem beschrieben Lohman et al., (Science, Bd. 285 (1999), S. 110–113 und Bartenschlager et al. ( CA 2 303 526 , offengelegt am 3. Oktober 2000, entsprechend EP-1 043 399 ) ein HCV-Zellkultursystem, bei dem die virale RNA (1377/NS2-3') einer Selbstreplikation in den transfizierten Zellen mit einem solchen Wirkungsgrad unterliegt, dass die Qualität der Replikation genau und reproduzierbar gemessen werden kann. Die Veröffentlichungen von Lohman und Bartenschlager stellten den ersten Nachweis einer HCV-RNA-Replikation in Zellkultur dar, wobei der Nachweis durch direkte Messung mit Northern-Blots erfolgte. Dieses Replicon-System und die darin beschriebenen Sequenzen stellen erneut die konservierte 5'-Sequenz "GCCAGC" heraus. Eine ähnliche Beobachtung, die die Konservierung der 5'-NTR betont, wurde von Blight et al., (Science, Bd. 290 (2000), S. 1972–1974), und WO-01/89364 , veröffentlicht am 29. November 2001, gemacht.
Zusätzlich zur Konservierung der 5-' und 3'-untranslatierten Regionen in RNAs, die einer Replikation in Zellkultur unterliegen, beschrieben drei weitere Veröffentlichungen von Lohman et al., 2001, Krieger et al., 2001 und Guo et al., 2001, kürzlich eindeutige adaptive Mutanten innerhalb der HCV-Nicht-Strukturprotein-Kodierungsregion. Von spezifischen Nucleotidänderungen, die die Aminosäuren der HCV-Nicht-Strukturproteine verändern, wurde gezeigt, dass sie den Wirkungsgrad der Bereitstellung von stabilen, replizierenden HCV-Subgenom-Replicons in Kulturzellen verstärken.
Der Anmelder hat nunmehr festgestellt, dass im Gegensatz zu sämtlichen früheren Berichten die hochgradig konservierte 5'-NTR durch Anpassung mutiert werden kann, so dass eine HCV-RNA-Sequenz entsteht, die in Verbindungen mit Mutationen in der HCV-Nicht-Strukturregion für einen höheren Wirkungsgrad der Transduktion und/oder Replikation sorgt.
Der Anmelder hat ferner neue adaptive Mutationen innerhalb der HCV-Nicht-Strukturregion identifiziert, die den Wirkungsgrad der Bereitstellung von fortdauernd replizierender HCV-RNA in Zellkultur verbessern.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Alternative zu den existierenden Systemen, die ein HCV-RNA-Molekül, das selbstreplizierend ist, umfassen. Die vorliegende Erfindung weist nach, dass das erste Nucleotid des Plusstrang-Genoms A sein kann, als Alternative zu G, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines einzigartigen HCV-RNA-Moleküls, das mit einem höheren Wirkungsgrad einer Transduktion und/oder Replikation unterliegt. Der Anmelder weist die Eignung dieses spezifischen RNA-Moleküls in einer Zelllinie und deren Verwendung bei der Bewertung eines spezifischen Inhibitors der HCV-Replikation nach.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird eine 5'-nicht-translatierte Region des Hepatitis C-Virus bereitgestellt, wobei hochgradig konserviertes Guanin in Position 1 durch Adenin ersetzt ist.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Hepatitis C-Virus-Polynucleotid, das Adenin in Position 1 in der Nummerierung gemäß dem 1377/NS2-3'-Konstrukt (Lohmann et al., 1999, Hinterlegungsnummer AJ242651) umfasst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid mit einem 5'-Terminus, der ACCAGC umfasst (SEQ ID NO: 8), bereitgestellt, wobei es sich beim ersten A dieser Sequenz um das Nucleotid in Position 1 der 5'-NTR handelt.
Der Ausdruck "erfindungsgemäßes selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid" umfasst jede dieser Modifikationen.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein erfindungsgemäßes selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid abgestellt, das für ein Polyprotein kodiert, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: R(1135)K; S(1148)G; S(1560)G; K(1691)R; L(1701)F; I(1984)V; T(1993)A; G(2042)C; G(2042)R; S(2404)P; L(2155)P; P(2166)L und M(2992)T.
Insbesondere ist die Erfindung auf ein erfindungsgemäßes selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid abgestellt, das für ein Polyprotein kodiert, das eine der vorstehend beschriebenen Aminosäuresubstitutionen umfasst und ferner die Aminosäuresubstitution E(1202)G umfasst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid bereitgestellt, das für ein Polyprotein kodiert, das eine G2042C- oder G2042R-Mutation umfasst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid bereitgestellt, das eine Nucleotidsubstitution G → A in Position 1 umfasst, wobei dieses Polynucleotid für ein Polyprotein kodiert, das ferner eine G2042C- oder G2042R-Mutation umfasst.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Polynucleotid in Form von RNA oder DNA, die zu RNA transkribiert werden kann, vorliegen.
Erfindungsgemäß wird ferner ein Expressionsvektor bereitgestellt, der eine DNA-Form des vorstehenden erfindungsgemäßen Polynucleotids in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor umfasst.
Die Erfindung stellt ferner eine Wirtszelle bereit, die mit dem erfindungsgemäßen selbstreplizierenden Polynucleotid oder dem erfindungsgemäßen Vektor gemäß den vorstehenden Ausführungen transfiziert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen RNA-Replikationstest bereit, der folgende Stufen umfasst:

– das Inkubieren der Wirtszelle gemäß den vorstehenden Ausführungen in Abwesenheit oder Gegenwart eines potentiellen Hepatitis C-Virus-Inhibitors;
– das Isolieren der gesamten zellulären RNA aus den Zellen;
– das Analysieren der RNA, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen; und
– das Vergleichen der Konzentrationen an HCV-RNA in Zellen in Abwesenheit und Gegenwart des Inhibitors.

Ferner ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Testen einer Verbindung auf Hemmung der HCV-Replikation abgestellt, das die folgenden Stufen umfasst:

a) das Behandeln der vorstehend beschriebenen Wirtszelle mit der Verbindung;
b) das Bewerten der behandelten Wirtszelle in Bezug auf eine verringerte Replikation, wobei eine verringerte Replikation die Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Replikation anzeigt.

Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der bi-cistronischen Replicon-RNA. Die Sequenzabweichungen zwischen dem I377/NS2-3'-Replicon gemäß Lohman et al., 1999, und dem APGK12-Replicon sind unterhalb des Replicons angegeben. Anstelle eines G-Nucleotids in der +1-Position im I377/NS2-3'-Replicon enthält das APGK12-Replicon ein zusätzliches G, was zu GG am 5'-Terminus führt (das erste G wird als Position –1 gezählt). In der Linkerregion zwischen dem neo-Gen und der EMCV-IRES-Sequenz weichen zwei Bereiche von I377/NS2-3' ab: 14 Nucleotide (CGCGCCCAGATGTT), die in I377/NS2/3 nicht vorhanden sind, sind in Position 1184 in APGK12 inseriert; 11 Nucleotide (1231–1241), die in I377/NS2-3' vorhanden sind, sind deletiert, um APGK-12 zu erzeugen. In der NS5B-Kodierungsregion wurde ein T in Position 8032 zu C mutiert, um eine Ncol-Restriktionsstelle zu beseitigen.
2 zeigt Northern-Blots von RNA-transfizierten Huh-7-Zelllinien. 12 μg der gesamten zellulären RNA oder der Kontroll-RNA wurden an 0,5 % Agarose-Formaldehyd-Gelen getrennt und auf Hybond N⁺-Papier übertragen, fixiert und (2A) radioaktiv mit HCV-spezifischer Minusstrang-RNA geprüft, die das Vorliegen der Plusstrang-Replicon-RNA nachweist. Bahnen 1 und 2: positive Kontrollen, die 10⁹ Kopien von in vitro-transkribierter APGK12-RNA enthalten. Bahn 3: negative Kontrolle von gesamter zellulärer RNA aus untransfizierten Huh-7-Zellen. Bahnen 4 und 5: zelluläre RNA aus B1- und B3-Zelllinien, in die DNA-Kopien des Neomycin-phosphotransferase-Gens integriert sind. Bahn 6: gesamte zelluläre RNA aus einer Huh-7-Zelllinie mit der Bezeichnung S22.3, die eine hohe Kopienzahl an subgenomischer HCV-Replicon-RNA enthält, wie durch den Pfeil betont wird. Weitere Zelllinien weisen keine nachweisbare Replicon-RNA auf. 2B ist identisch mit 2A, mit der Ausnahme, dass das Blot radioaktiv mit HCV-spezifischer Plusstrang-RNA geprüft wurde, um die Anwesenheit von HCV Minusstrang-RNA nachzuweisen. Bei den Bahnen 1 und 2 handelt es sich um positive Kontrollbahnen, die 10⁹ Kopien der HCV-Minusstrang-RNA von voller Länge enthalten. Die Bahn 6, die 12 μg der gesamten zellulären RNA aus der Zelllinie S22.3 enthält, beinhaltet nachweisbare Minusstrang-Replicon-RNA in der erwarteten Größe von 8–9 Kilobasen. M stellt die Migration von nicht-radioaktiven Molekulargrößenmarkern am Agarosegel dar. 28s stellt die Migration der ribosomalen 28s-RNA dar und ist für den Nachweis dieser Spezies in Proben von gesamter zellulärer RNA verantwortlich.
3 zeigt die indirekte Immunofluoreszenz eines HCV-Nicht-Strukturproteins in der S22.3-Zelllinie. Die indirekte Immunofluoreszenz wurde an Zellen durchgeführt, die gezüchtet, fixiert, permeabilisiert und einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der spezifisch für ein Segment des HCV-NS4A-Proteins war, ausgesetzt worden waren. Sekundärer Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, der mit Red-Fluor-Alexa 594 (molekulare Sonden) konjugiert war, wurde zum Nachweis verwendet. Die oberen Felder zeigen die Ergebnisse der Immunofluoreszenz (Objektiv 40X) und die spezifische Färbung der S22.3-Zellen. Die unteren Felder zeigen das identische Feld von Zellen bei Betrachtung mit einem diffraktiven Interferenzkontrastmikroskop (DIC). Der Großteil der S22.3-Zellen (3A) im Feld färbte sich positiv auf HCV-NS4A-Protein, das im Zytoplasma lokalisiert ist, während die B1-Zellen (36), die keine HCV-Proteine exprimieren, nur eine Färbung auf Hintergrundniveau aufweisen.
4 zeigt Western-Blots nach SDS-PAGE-Trennung der gesamten Proteine, die aus drei Zelllinien extrahiert worden sind: (i) naive Huh-7-Zelllinie, (ii) gegen Neomycin resistente Huh-7-Zelllinie B1 und (iii) die S22.3-Zelllinie. Die Felder A, B und C zeigen die Ergebnisse von Western-Blots bei Prüfung mit polyklonalen Antiseren, die spezifisch für Neomycin-phosphotransferase (NPT), HCV-NS3 bzw. HCV-NS5B sind. Eine Sichtbarmachung erfolgte durch autoradiographischen Nachweis eines chemilumineszierenden, reaktiven, sekundären Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörpers. Das Feld A zeigt, dass die S22.3-RNA-Replicon-Zelllinie das NPT-Protein in höheren Konzentrationen als Kontroll-B1-Zellen exprimiert und dass die naive Huh-7-Zelllinie nicht das NPT-Protein erzeugt. Die Felder B und C zeigen, dass nur die S22.3-Zelllinie die reifen HCV-NS3- bzw. NS5B-Proteine erzeugt. M bedeutet Molekulargewicht (in Kilodalton) von vorher gefärbten Polypeptidmarkern.
5A und 5B identifizieren die Nucleotid- bzw. Aminosäuresequenzen, die sich von der APGK12-Sequenz in den verschiedenen bi-cistronischen HCV-Replicons unterscheiden. Das adaptierte S22.3-Replicon stellt ein Replicon der ersten Generation dar, das im Anschluss an die Transfektion von aus der APGK12-Matrize transkribierter RNA ausgewählt worden ist. R3, R7, R16 sind Replicons der zweiten Generation, die im Anschluss an die Transfektion von RNA, die aus der S22.3-Replicon-Zelllinie der ersten Generation isoliert worden ist, ausgewählt wurden. 5A: Nucleotidmutationen, die in jeder der adaptierten Replicons charakterisiert wurden, sind neben dem entsprechenden Segment des Replicons angegeben (IRES, NS3, NS4A, NS5A und NS5B). 5B: die Aminosäurenummern sind entsprechend dem HCV-Polyprotein von voller Länge nummeriert, wobei die erste Aminosäure im zweiten Cistron der Aminosäure 810 in NS2 des I377/NS2-3'-Konstrukts entspricht.
6 zeigt den Wirkungsgrad der Kolonienbildung von vier in vitro-transkribierten subgenomischen, bi-cistronischen HCV-Replicon-RNAs. Das APGK12 dient als Referenzsequenz; die Initiationsnucleotide von HCV-IRES in jedem der Konstrukte und die Aminosäureunterschiede (zu der APGK12-Referenzsequenz) in der nicht-strukturellen HCV-Region für die beiden R3-rep sind hervorgehoben. Es ist darauf hinzuweisen, dass die in vitro transkribierten APGK-12-RNAs, die entweder ein 5'G oder ein 5'A beherbergen, Kolonien mit dem gleichen Wirkungsgrad (etwa 80 cfu/μg in den Feldern A und B) nach Selektion mit 0,25 mg/ml G418 bilden. Aus der R3-Zelllinie der zweiten Generation isolierte RNA wurde revers in DNA transkribiert und in das pAPGK12-Vektorgerüst kloniert, um das R3-rep zu erzeugen, das sequenziert wurde und von dem festgestellt wurde, dass es für zusätzliche Veränderungen kodiert, die die L(2155)P-Substitution im NS5A-Segment des HCV-Polyproteins beinhalten (vergl. R3-rep-Sequenz mit der R3-Sequenz in den Tabellen 2 und 3). Verschiedene Mengen an R3-rep-5'G wurden ebenfalls transfiziert, was zu einem Wirkungsgrad der Kolonienbildung von 2 × 10⁶ cfu/μg RNA führte (Feld D).
7 zeigt ein typisches RT-PCR-Amplifikationsdiagramm (linkes Feld) und die graphische Wiedergabe der Ct-Werte bei Auftragung gegen die bekannte HCV-RNA-Menge in einer Eichkurve (rechtes Feld). Die im linken Feld aufgetragenen Kurven stellen die Zunahme des Fluoreszenz-Reportersignals (delta-Rn) bei Auftragung gegen die PCR-Zykluszahl für eine vorgegebene Menge an HCV-Replicon-RNA dar. Der Ct-Wert wird durch Bestimmen des Punkts erhalten, an dem die Fluoreszenz einen willkürlichen Wert (horizontale Linie) übersteigt. Das rechte Feld zeigt die lineare Beziehung zwischen der RNA-Kopienzahl der vorgegebenen Standards (große schwarze Punkte) zu Beginn und dem Ct-Wert. Kleinere Punkte stellen die Ct-Werte von RNA-Proben (mit einem Gehalt an einer unbekannten Menge an HCV-Replicon-RNA). aus S22.3-Zellen dar, die mit verschiedenen Konzentrationen eines spezifischen Inhibitors der HCV-Replikation behandelt worden sind.
8 zeigt den Einfluss einer steigenden Konzentration an Inhibitor A auf die HCV-RNA-Replicon-Konzentrationen in Huh7-Zellen. S22.3-Zellen wurden in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Inhibitor A (von 0,5 nM bis 1024 nM) gezüchtet. Die Inhibitor-Dosis-Reaktionskurve ist das Ergebnis von 11 Konzentrationen, die sich durch serielle Zweifachverdünnungen (1:1) ergaben. In die Versuchsreihe wurde im Versuchsverlauf auch eine Kontrollvertiefung ohne Inhibitor aufgenommen. Die Zellen wurden 4 Tage in einem 5 % CO₂-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Die gesamte zelluläre RNA wurde extrahiert und aufgrund der optischen Dichte quantitativ bestimmt. HCV-Replicon-RNA wurde durch Echtzeit-RT-PCR bewertet und als Genomäquivalente/μg gesamte RNA als Funktion der Inhibitorkonzentration aufgetragen.
Definitionen
Sofern nichts anderes angegeben ist, haben die wissenschaftlichen und technologischen Ausdrücke und Nomenklaturen, die hier verwendet werden, die gleichen Bedeutungen, wie sie dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind. Im allgemeinen handelt es sich bei den Zellzüchtungsverfahren, der Infektion, den molekularbiologischen Methoden und dergl. um auf dem einschlägigen Gebiet übliche Verfahren. Derartige Techniken finden sich in Handbüchern, wie Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1994).
Nucleotidsequenzen werden hier durch den Einzelstrang in Richtung von 5' nach 3' von links nach rechts angegeben, wobei die üblichen Einbuchstaben-Nucleotidsymbole gemäß den Empfehlungen der IUPAC-IUB-Biochemical Nomenclature Commission (1972) verwendet werden.
Die vorliegende Beschreibung nimmt Bezug auf eine Anzahl von routinemäßig verwendeten Ausdrücken auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie (rDNA). Dennoch werden Definitionen für ausgewählte Beispiele derartiger rDNA-Ausdrücke aus Gründen der Klarheit und der Konsistenz vorgelegt.
Der hier verwendete Ausdruck "DNA-Segment oder -Molekül oder -Sequenz" bezieht sich auf Moleküle, die aus den Desoxyribonucleotiden Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und/oder Cytosin (C) bestehen. Diese Segmente, Moleküle oder Sequenzen treten in der Natur auf oder ergeben sich durch Synthese. Beim Lesen in Übereinstimmung mit dem genetischen Code können diese Sequenzen für eine lineare Strecke oder Sequenz von Aminosäuren kodieren, die als Polypeptid, Protein, Proteinfragment und dergl. bezeichnet werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "Gen" ist auf dem einschlägigen Gebiet bekannt und betrifft eine Nucleinsäuresequenz, die für ein einzelnes Protein oder Polypeptid kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz von voller Länge oder durch einen beliebigen Teil der Kodierungssequenz kodiert werden, sofern die funktionelle Aktivität des Proteins erhalten bleibt.
Ein "Strukturgen" definiert eine DNA-Sequenz, die in RNA transkribiert und zu einem Protein translatiert wird, das eine spezifische Strukturfunktion zur Bildung der viralen Teilchen aufweist. "Strukturproteine" definieren die HCV- Proteine, die in die Virusteilchen eingebaut werden, nämlich Kern "C", E1, E2 und E2-p7.
"Nicht-Strukturproteine" definieren HCV-Proteine, die nicht in viralen Teilchen enthalten sind, nämlich NS2, NS3, NS4A, NS5A und NS5B.
Eine "Restriktionsendonuclease" oder ein "Restriktionsenzym" ist ein Enzym, das eine spezifische Basensequenz (üblicherweise mit einer Länge von 4, 5 oder 6 Basenpaaren) in einem DNA-Molekül erkennen und das DNA-Molekül an jeder Stelle, wo diese Sequenz auftritt, spalten kann. Ein Beispiel für ein derartiges Enzym ist EcoRI, das die Basensequenz G↓AATTC erkennt und ein DNA-Molekül an dieser Erkennungsstelle spaltet.
"Restriktionsfragmente" sind DNA-Moleküle, die durch Verdau von DNA mit einer Restriktionsendonuclease erzeugt werden. Jedes gegebene Genom oder DNA-Segment kann durch eine bestimmte Restriktionsendonuclease in mindestens zwei diskrete Moleküle von Restriktionsfragmenten gespalten werden.
"Agarose-Gelelektrophorese" ist ein analytisches Verfahren zum Fraktionieren von Polynucleotidmolekülen auf der Grundlage ihrer Größe. Das Verfahren beruht auf der Tatsache, dass Nucleinsäuremoleküle durch ein Gel (wie durch ein Sieb) wandern, wobei das kleinste Molekül die größte Beweglichkeit aufweist und am raschesten durch das Gel wandert. Die Siebeigenschaften des Gels verlangsamen die größten Moleküle, so dass diese die geringste Beweglichkeit besitzen. Die fraktionierten Polynucleotide können durch Färbung des Gels unter Anwendung bekannter Verfahren, durch Nucleinsäure-Hybridisierung oder durch Markierung der fraktionierten Moleküle mit einer nachweisbaren Markierung sichtbar gemacht werden. Alle diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt; spezielle Verfahren finden sich bei Ausubel et al. (a.a.O.).
Ein "Oligonucleotid" oder ein "Oligomer" ist ein Molekül aus zwei oder mehr Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, vorzugsweise aus mehr als drei Bestandteilen. Die genaue Größe des Moleküls hängt von zahlreichen Faktoren ab, die wiederum von der letztendlichen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Ein Oligonucleotid kann synthetisch, durch Klonierung oder durch Amplifikation erhalten werden.
Eine "Sequenzamplifikation" ist ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen einer Zielsequenz. Im allgemeinen werden ein oder mehr Amplifikationsprimer an eine Nucleinsäuresequenz angelagert. Unter Verwendung geeigneter Enzyme werden Sequenzen, die sich neben oder zwischen den Primern befinden, amplifiziert. Ein hier verwendetes Amplifikationsverfahren ist die Polymerase- Kettenreaktion (PCR), die in Verbindung mit reverser Transkriptase (RT) zur Erzeugung amplifizierter DNA-Kopien von spezifischen RNA-Sequenzen verwendet werden kann.
Ein "Amplifikationsprimer" bezeichnet ein Oligonucleotid, das zur Anlagerung an eine RNA- oder DNA-Region neben einer Zielsequenz befähigt ist und als Initiationsprimer für die DNA-Synthese unter Bedingungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, dient. Das synthetisierte Primer-Erweiterungsprodukt ist komplementär zur Zielsequenz.
Der Ausdruck "Domäne" oder "Region" betrifft eine spezifische Aminosäuresequenz, die eine spezifische Funktion oder eine Struktur innerhalb eines Proteins definiert. Ein Beispiel hierfür ist die NS3-Protease-Domäne, die im HCV-Nichtstruktur-Polyprotein enthalten ist.
Die Ausdrücke "Plasmid", "Vektor" oder "DNA-Konstrukt" sind aus dem Stand der Technik bekannt und beziehen sich auf beliebige genetische Elemente, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf), Plasmid-DNA, Phagen-DNA, Virus-DNA und dergl., die die Oligonucleotidsequenzen oder die erfindungsgemäßen Sequenzen einbauen können und als DNA-Vehikel dienen, in die die erfindungsgemäße DNA kloniert werden kann. Es gibt zahlreiche Typen von Vektoren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Der Ausdruck "Expressionsvektor" definiert einen Vektor gemäß den vorstehenden Angaben, der aber dazu dient, die Expression einer inserierten Sequenz im Anschluss an die Transformation oder Transfektion in einen Wirt zu ermöglichen. Das klonierte Gen (inserierte Sequenz) wird üblicherweise unter die Kontrolle von Kontrollelementsequenzen, wie Promotorsequenzen, gestellt. Derartige Expressionskontrollsequenzen variieren je nach dem, ob der Vektor dafür konzipiert ist, das funktionell verknüpfte Gen in vitro oder in vivo in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt oder in beiden (Shuttle-Vektoren) zu exprimieren. Sie können zusätzlich Transkriptionselemente, wie Enhancer-Elemente, Terminationssequenzen, gewebespezifische Elemente und/oder Translationsinitiationsstellen und -terminationsstellen umfassen.
Eine Wirtszelle oder Indikatorzelle ist durch exogene oder heterologe DNA (z. B. ein DNA-Konstrukt) oder RNA "transfiziert", wenn eine derartige Nucleinsäure in das Innere der Zelle eingeführt worden ist. Die transfizierende DNA kann in die chromosomale DNA, die das Genom der Zelle bildet, integriert (kovalent gebunden) werden oder nicht. In Prokaryonten, Hefe und Säugetierzellen kann beispielsweise die transfizierende/transformierende DNA in einem episomalen Element, wie einem Plasmid, aufrechterhalten werden. In Bezug auf eukaryontische Zellen handelt es sich bei einem Beispiel einer in stabiler Weise transfizierten Zelle um eine Zelle, bei der die transfizierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist und von Tochterzellen durch Chromosomen-Replikation vererbt wird. Eine Wirtszelle oder Indikatorzelle kann mit RNA transfiziert werden. Eine Zelle kann in stabiler Weise mit RNA transfiziert werden, wenn die RNA einer Replikation unterliegt und Kopien der RNA bei der Zellteilung in Tochterzellen gelangen. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryontischen Zelle zur Bildung von Zelllinien oder Klonen, die aus einer Population von Tochterzellen mit einem Gehalt der transfizierenden DNA oder RNA bestehen, nachgewiesen. Transfektionsverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Wenn die RNA für einen genetischen Marker kodiert, der einen feststellbaren Phänotyp verleiht, z. B. antibiotische Resistenz, kann die stabile Transfektion der replizierenden RNA dadurch überwacht werden, dass die Wirtszelle einen derartigen Phänotyp annimmt.
Der hier verwendete Ausdruck "Transduktion" bezieht sich auf die Übertragung eines genetischen Markers auf Wirtszellen durch die stabile Transfektion von replizierender RNA.
Die für die Ausübung der Erfindung geeigneten Nucleotidsequenzen und Polypeptide umfassen (ohne Beschränkung hierauf) Mutanten, Homologe, Subtypen, Quasispezies, Allelen und dergl. Es ist darauf hinzuweisen, dass im allgemeinen die erfindungsgemäßen Sequenzen für ein Polyprotein kodieren. Für einen Fachmann ist es ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Polyprotein oder beliebige Varianten, Derivate oder Fragmente davon einer Autoprozessierung zu einer aktiven Protease unterliegen.
Der hier verwendete Ausdruck "Variante" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein aus einer Sequenz von Nucleinsäuren oder Aminosäuren bestehendes Molekül, das eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) aufweist, die in erheblichem Maße der Aktivität der ursprünglichen Sequenz ähnlich ist. Diese Variante kann aus gleichen oder unterschiedlichen Spezies stammen und es kann sich um natürliche oder um synthetisch hergestellte Varianten handeln. Derartige Varianten umfassen Aminosäuresequenzen mit Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität des Proteins erhalten bleibt. Das gleiche gilt für Varianten von Nucleinsäuresequenzen, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einem oder mehreren Nucleotiden aufweisen können, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität der Sequenz im allgemeinen erhalten bleibt.
Der Ausdruck "Derivat" umfasst beliebige der vorstehend beschriebenen Varianten, wenn sie einen zusätzlichen chemischen Rest umfassen, der normalerweise nicht Bestandteil dieser Moleküle ist. Diese chemischen Reste können verschiedenen Zwecken dienen, wozu eine Verbesserung der Löslichkeit des Moleküls, der Absorption und der biologischen Halbwertszeit, eine Verringerung der Toxizität und eine Beseitigung oder Verringerung von unerwünschten Nebenwirkungen gehören. Ferner können diese Reste zur Markierung oder Bindung verwendet werden oder sie können in Fusionsprodukten enthalten sein. Verschiedene Reste, die zur Vermittlung der vorstehend beschriebenen Wirkungen geeignet sind, finden sich in Remington, The Science and Practice of Pharmacy (1995). Methoden zur Kupplung derartiger Reste an ein Molekül sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf ein beliebiges Segment einer identifizierten DNA-, RNA- oder Aminosäuresequenz und/oder ein beliebiges Segment von einer der vorstehend beschriebenen Varianten oder Derivaten, wobei die biologische Aktivität (funktionell oder strukturell) entsprechend dem Erfordernis der Erfindung im Wesentlichen erhalten bleibt.
Der Ausdruck "Variante", "Derivat" und "Fragment", wie er erfindungsgemäß verwendet wird, bezieht sich auf Proteine oder Nucleinsäuremoleküle, die isoliert/gereinigt, chemisch synthetisiert oder durch rekombinante DNA-Technik erzeugt werden können. Alle diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Wie nachstehend durch Beispiele belegt, lassen sich die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen und Polypeptide modifizieren, z. B. durch in vitro-Mutagenese.
Der hier verwendete Ausdruck "HCV-Polyprotein-Kodierungsregion" bedeutet den Bereich eines Hepatitis C-Virus, der für den offenen Leseraster (ORF) des Polyproteins kodiert. Dieser ORF kann für Proteine kodieren, die mit Wildtyp-HCV-Proteinen identisch sind oder sich von diesen unterscheiden. Der ORF kann auch nur für einen Teil des funktionellen Proteins, das durch die Wildtyp-Polyprotein-Kodierungsregion kodiert wird, kodieren. Das darin kodierte Protein kann auch aus verschiedenen Isolaten von HCV stammen und auch ein Nicht-HCV-Protein kann darin kodiert werden.
Die hier im Zusammenhang mit einem Polynucleotidmolekül verwendete Abkürzung "NTR" bedeutet eine nicht-translatierte Region. Der Ausdruck "UTR" bedeutet eine untranslatierte Region. Beide Ausdrücke werden in austauschbarer Weise verwendet.
Bevorzugte Ausführungsformen
Insbesondere stellt die Erfindung ein selbstreplizierendes HCV-Polynucleotidmolekül bereit, das einen 5'-Terminus umfasst, der aus ACCAGC (SEQ ID NO: 8) besteht.
Erfindungsgemäß wird insbesondere ein HCV-Polynucleotid bereitgestellt, das folgendes umfasst:

– eine 5'-nicht translatierte Region (NTR), die die Sequenz ACCAGC an oder in der Nähe ihres 5'-Terminus umfasst, d. h. wobei es sich beim ersten A der Sequenz um das Nucleotid in Position 1 der 5'-NTR handelt;
– eine HCV-Polyprotein-Kodierungsregion; und
– eine 3'-NTR-Region.

Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein erfindungsgemäßes selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid abgestellt, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: R(1135)K; S(1148)G; S(1560)G; K(1691)R; L(1701)F; I(1984)V; T(1993)A; G(2042)C; G(2042)R; S(2404)P; L(2155)P; P(2166)L und M(2992)T.
Insbesondere ist die Erfindung auf ein selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid abgestellt, das für ein Polyprotein kodiert, das eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen Aminosäuresubstitutionen umfasst und ferner die Aminosäuresubstitution E(1202)G umfasst.
Alternativ ist die vorliegende Erfindung auf ein erfindungsgemäßes selbstreplizierendes HCV-Polynucleotidmolekül abgestellt, das eine G2042C/R-Mutation umfasst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein HCV-Polynucleotidkonstrukt bereitgestellt, das folgendes umfasst:

– eine 5'-NTR-Region, die die Sequenz ACCAGC an ihrem 5'-Terminus umfasst;
– eine HCV-Polyproteinregion, die für ein HCV-Polyprotein kodiert, das eine G(2042)C- oder eine G(2042)R-Mutation umfasst; und
– eine 3'-NTR-Region.

Vorzugsweise handelt es sich beim erfindungsgemäßen Polynucleotidkonstrukt um ein DNA- oder RNA-Molekül. Insbesondere handelt es sich beim Konstrukt um ein RNA-Molekül. Ganz besonders handelt es sich beim Konstrukt um ein DNA-Molekül.
Insbesondere ist die Erfindung auf ein RNA-Molekül abgestellt, das durch das DNA-Molekül kodiert wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 7, 24 und 25 besteht.
Ganz besonders stellt die Erfindung ein DNA-Molekül bereit, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 24 und 25 besteht.
Die Erfindung ist ferner auf einen Expressionsvektor abgestellt, der DNA-Formen des vorstehenden Polynucleotids in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor umfasst.
Insbesondere ist der Promotor aus der Gruppe ausgewählt, die aus T3, T7 und SP6 besteht.
Die Erfindung ist ferner auf eine Wirtszelle abgestellt, die mit dem vorstehend beschriebenen selbstreplizierenden Polynucleotid oder Vektor transfiziert ist. Insbesondere handelt es sich bei der Wirtszelle um eine eukaryontische Zelllinie. Insbesondere handelt es sich bei der eukaryontischen Zelllinie um eine hepatische Zelllinie. Ganz besonders handelt es sich bei der hepatischen Zelllinie um Huh-7.
Die vorliegende Erfindung stellt einen RNA-Replikationstest bereit, der folgende Stufen umfasst:

a) das Inkubieren der Wirtszelle gemäß den vorstehenden Ausführungen unter Bedingungen, die sich für die RNA-Replikation eignen;
b) das Isolieren der gesamten zellulären RNA aus den Zellen; und
c) das Analysieren der RNA, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen.

Vorzugsweise wird die Analyse der RNA-Konzentrationen in Stufe c) durchgeführt, indem man die RNA durch Echtzeit-RT-PCR-Analyse unter Verwendung von HCV-spezifischen Primern amplifiziert, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen.
Alternativ umfasst das Konstrukt ein Reportergen und die Analyse der RNA-Konzentrationen in Schritt c) wird durch Bestimmung der Konzentration des exprimierten Reporters vorgenommen.
Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zum Testen einer Verbindung auf Hemmung der HCV-Replikation abgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

a) das Durchführen von Schritt a) gemäß den Angaben für den vorstehenden Test in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung;
b) das Isolieren der gesamten zellulären RNA aus den Zellen; und
c) das Analysieren der RNA, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen;
d) das Vergleichen der Konzentrationen an HCV-RNA in Zellen in Abwesenheit und Gegenwart des Inhibitors,

Vorzugsweise wird die Zelllinie mit der Testverbindung etwa 3–4 Tage bei einer Temperatur von etwa 37 °C inkubiert.
Beispiele
Beispiel 1
Replicon-Konstrukte (APGK-12; 1)
pET9a-EMCV wurde erhalten durch Verknüpfen des Oligonucleotid-Linkers 5'-gaattccagatggcgcgcccagatgttaaccagatccatggcacactctagagtactgtcgac-3' (SEQ ID NO: 9) mit pET-9a (Novagen), das mit EcoRI und SalI geschnitten wurde, um den Vektor pET-9a-mod zu bilden. Der Linker enthält die folgenden Restriktionsstellen: EcoRI, AscI, HpaI, NcoI, XbaI, ScaI, SalI. Das EMCV-IRES wurde durch PCR aus dem Vektor pTM1 mit den Primern 5'-cggaatcgttaacagaccacaacggtttccctc-3' (SEQ ID NO: 10) und 5'-ggcgtacccatggtattatcgtgtttttca-3' (SEQ ID NO: 11) amplifiziert und über EcoRI und Ncol in pET-9a-mod ligiert, um pET-9a-EMCV zu bilden.
Die Sequenz von HCV-NS2 bis -NS5B, gefolgt von der 3'-UTR von HCV wurde aus dem Replicon-Konstrukt I377/NS2-3' (Lohman et al., 1999; Hinterlegungsnummer AJ242651) erhalten und durch Operon Technologies Inc. mit einem Austausch von T zu C an der NcoI-Stelle in NS5B am Nucleotid 8032 synthetisiert. Diese Sequenz wurde aus einem Gen Op^R-Vektor (Operon Technologies) mit Ncol und ScaI freigesetzt und in pET-9a-EMCV transferiert, um pET-9a-EMCV-NS2-5B-3'-UTR zu bilden. pET-9a-HCV-neo wurde durch Amplifikation des HCV-IRES aus einer HCV-cDNA, die aus Patientenserum isoliert worden war, mit den Primern 5'-gcatatgaattctaatacgactcactataggccagcccccgattg-3' (SEQ ID NO: 12) mit einem Gehalt an einem T7-Promotor und 5'-ggcgcgccctttggtttttctttgaggtttaggattcgtgctcat-3' (SEQ ID NO: 13) und durch Amplifikation des Neomycin-Phosphotransferase-Gens aus dem Vektor pcDNA 3.1 (Invitrogen) mit den Primern 5'-aaagggcgcatgattgaacaagatggattgcacgca-3' (SEQ ID NO: 14) und 5'-gcatatgttaactcagaagaactcgtcaagaaggcgata-3' (SEQ ID NO: 15) erhalten. Diese beiden PCR-Fragmente wurden vermischt und mit den Primern 5'-gcatatgaattctaatacgactcactataggccagcccccgattg-3' (SEQ ID NO: 16) und 5'-gcatatgttaactcagaagaactcgtcaagaaggcgata-3' (SEQ ID NO: 15) amplifiziert, mit EcoRI und HpaI geschnitten und in pET-9a-mod transferiert, um pet-9a-HCV-neo zu bilden. Die EMCV-NS2-5B-3'-UTR wurde aus pET-9a-EMCV-NS2-5B-3'-UTR mit HpaI und ScaI freigesetzt und in pet-9a-HCV-neo übertragen, das mit HpaI geschnitten wurde, um pET-9a-APGK12 zu bilden. Dieses Insert wurde mit spezifischen aufeinanderfolgenden Primern unter Verwendung des ABI Prism^R BigDye^R-Terminator-Zyklus-Sequenzierungskits sequenziert und an einem ABI Prism^R 377-DNA-Sequenziergerät analysiert. Die Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt.
RNA-in vitro-Transkription
PET-9a-APGK12-DNA wurde mit ScaI für die Expression des Replicons von voller Länge oder mit BglII für die Expression einer verkürzten negativen Kontroll-RNA geschnitten. Die DNA wurde an 1 % Agarosegel analysiert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt. RNA wurde unter Verwendung eines T7-Ribomax^R-Kits (Promega) erzeugt, wonach sich die Extraktion mit Phenol/Chloroform und die Fällung mit 7,5 M LiCl₂ anschloss. Die RNA wurde 15 Minuten mit DNAse I behandelt, um die DNA-Matrize zu entfernen, und ferner mit einer RNeasy^R-Säule (Qiagen) gereinigt. Die RNA-Integrität wurde an einem denaturierenden 1 % Formaldehyd-Agarosegel verifiziert.
Beispiel 2
Primäre Transfektion von Huh7-Zellen und Selektion von Replicon-Zelllinien Humane Hepatom-Huh7-Zellen (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan) wurden in 10 % FBS/DMEM gezüchtet. Die Zellen wurden bis zu einer 70%igen Konfluenz gezüchtet, trypsiniert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und auf 1 × 10⁷ Zellen/m1 PBS eingestellt. 800 μl Zellen wurden in 0,4 cm-Küvetten übertragen und mit 15 μg Replicon-RNA vermischt. Die Zellen wurden unter Anwendung von 960 μF, 300 V ~18 msec der Elektroporation unterworfen und gleichmäßig auf zwei 15 cm-Gewebekulturplatten verteilt und 24 Stunden in einem Gewebekultur-Inkubator inkubiert. Die Selektion der ersten und zweiten Generation von Replicon-Zelllinien wurde mit 10 % FBS/DMEM-Medium, das mit 1 mg/ml G418 ergänzt war, durchgeführt. Die Zellen wurden 3–5 Wochen selektiert, bis Kolonien beobachtet wurden, die isoliert und expandiert wurden.
Im Anschluss an die G418-Selektion und Vermehrung von Huh-7-Zellen, die mit APGK12 (SEQ ID NO: 1)-RNA transfiziert waren, wurden Zellen, die an einer einzelnen Kolonie gebildet worden waren, mit Trypsin behandelt und seriell in größere Kulturkolben übertragen, um Zelllinien bereitzustellen. Etwa 10 × 10⁶-Zellen wurden von jeder Zelllinie geerntet. Die Zellen wurden lysiert und die gesamte zelluläre RNA wurde extrahiert und gereinigt, wie es für die Qiagen RNAeasy^R-Präparationsverfahren beschrieben wurde. 2 zeigt die Analyse von 12 μg gesamter zellulärer RNA aus verschiedenen Zelllinien bei Analyse an einem Northern-Blot eines denaturierenden Agarose-Formaldehyd-Gels.
2A ist ein Northern-Blot (mit einer radioaktiven HCV-spezifischen Minusstrang-RNA als Sonde versehen), das die Anwesenheit von Plusstrang- Replicon-RNA nachweist. Die Bahnen 1 und 2 sind positive Kontrollen, die 109 Kopien von in vitro-transkribierter APGK12-RNA enthalten. Die Bahn 2 enthält die in vitro-transkribierte RNA im Gemisch mit 12 μg gesamter zellulärer RNA aus naiven Huh-7-Zellen. Die Bahn 3 ist eine negative Kontrolle von gesamter zellulärer RNA aus unbehandelten Huh-7-Zellen. Die Bahnen 4 und 5 enthalten zelluläre RNA aus den B1- und B3-G418-resistenten Zelllinien, die DNA-integrierte Kopien des Neomycin-Phosphotransferase-Gens aufweisen. Die Bahn 6 enthält gesamte zelluläre RNA aus einer Huh-7-Zelllinie mit der Bezeichnung S22.3, die eine hohe Kopienzahl von subgenomischer HCV-Replicon-RNA gemäß Nachweis durch das positive Signal im 8 Kilobasen-Bereich beinhaltet. Andere Zelllinien weisen keine nachweisbare Replicon-RNA auf. 2B ist ein Northern-Blot eines Wiederholungsversuchs für das Gel gemäß 2A, mit der Ausnahme, dass das Blot mit einer radioaktiv markierten, HCV-spezifischen Plusstrang-RNA-Sonde behandelt wurde, um die Anwesenheit von HCV-Minusstrang-RNA nachzuweisen (die Bahnen 1 und 2 sind positive Kontrollbahnen, die 10⁹ Kopien genomischer HCV-Minusstrang-RNA von voller Länge enthalten); nur die Bahn 6, die 12 μg an gesamter zellulärer RNA aus der Zelllinie S22.3 enthält, beinhaltet nachweisbare Minusstrang-Replicon-RNA in der erwarteten Größe von 8–9 Kilobasen. Eine quantitative Bestimmung der RNA-Kopienzahl (auf der Grundlage einer Phosphorimager-Abtastung der Northern-Blots) ergibt etwa 6 × 10⁷ Kopien Plusstrang/μg gesamter RNA und 6 × 10⁶ Kopien Minusstrang/μg gesamter RNA. Die Anwesenheit der Plusstrang- und Minusstrang-Zwischenprodukte bestätigt, dass die subgenomische HCV-RNA in der S22.3-Zelllinie aktiv repliziert wird.
Beispiel 3
522.3-Zelllinie exprimiert in konstitutiver Weise nicht-strukturelle HCV-Proteine.
Die Expression von nicht-strukturellem HCV-Protein wurde in der S22.3-Zelllinie untersucht. 3 zeigt das Ergebnis einer indirekten Immunofluoreszenz, die das HCV-NS4A-Protein in der S22.3-Zelllinie und nicht in der negativen Replicon-B1-Zelllinie (eine G418-resistente Huh-7-Zelllinie) nachweist. Die indirekte Immunofluoreszenz wurde an Zellen durchgeführt, die an Lab-tek-Kammer-Objektträgern gezüchtet und fixiert (mit 4 % Paraformaldehyd) worden waren. Die Zellen wurden 10 Minuten mit 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und anschließend 1 Stunde mit 5 % Milchpulver in Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) behandelt. Kaninchenserum mit einem Gehalt an polyklonalem Antikörper gegen ein Peptid, das die HCV-NS4A-Region überspannt, stellte den beim Nachweis verwendeten primären Antikörper dar.
Nach 2-stündiger Inkubation mit dem primären Antikörper wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 3 Stunden lang mit einem sekundären Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, der mit "red-fluor Alexa^R 594" (Molecular Probes) konjugiert war, versetzt. Ungebundener sekundärer Antikörper wurde durch Waschen mit PBS entfernt und die Zellen wurden mit einem Abdeckstreifen verschlossen. 3 (obere Felder) zeigt die Ergebnisse der Immunofluoreszenz bei mikroskopischem Nachweis mit spezifischer Fluoreszenz-Filterung. Die unteren Felder zeigen das identische Feld von Zellen bei Betrachtung mit einem Beugungsinterferenz-Kontrastmikroskop (DIC). Der Großteil der S22.3-Zellen ( 3A) innerhalb des Feldes ergab eine positive Färbung auf HCV-NS4A-Protein, das im Zytoplasma lokalisiert ist, während die B1-Zellen (3B), die keine HCV-Proteine exprimieren, nur eine Färbung auf Hintergrundniveau aufweisen. Ein geringer Anteil von S22.3-Zellen exprimiert hohe Konzentrationen an intensiv gefärbtem HCV-NS4A.
Die Expression der durch die bi-cistronische Replicon-RNA kodierten Proteine wurde auch an Western-Blots nach SDS-PAGE-Trennung von gesamten Proteinen, die aus folgenden Zellen extrahiert worden waren, geprüft: (i) naive Huh-7-Zelllinie, (ii) neomycinresistente Huh-7-Zelllinie B1 und (iii) die S22.3-Zelllinie. In 4 zeigen die Felder A, B und C die Ergebnisse von Western-Blots bei Prüfung mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren, die spezifisch für Neomycin-phosphotransferase (NPT), HCV-NS3 bzw. HCV-NS5B sind. Die Sichtbarmachung wurde durch autoradiographischen Nachweis eines chemilumineszierenden, reaktiven, sekundären, HRP-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörpers erreicht. In 4 zeigt das Feld A, dass die S22.3-RNA-Replicon-Zelllinie das NPT-Protein in höheren Konzentrationen als die B1-Zellen (die eine integrierte DNA-Kopie des npt-Gens enthalten) exprimiert und dass die naive Huh-7-Zelllinie nicht das NPT-Protein erzeugt. In 4 zeigen die Felder B und C, dass nur die S22.3-Zelllinie das reife HCV-NS3- bzw. NS5B-Protein erzeugt. Die Western-Blots zeigen, dass die S22.3-Zelllinie, die aktiv replizierende, subgenomische HCV-Replicon-RNA enthält, die Replikation der RNA durch die hochgradige Expression der nicht-strukturellen HCV-Proteine aufrechterhält.
Beispiel 4
Sequenzbestimmung von adaptierten Replicons
Gesamte RNA wurde aus repliconhaltigen Huh7-Zellen unter Verwendung eines RNeasy-Kits (Qiagen) extrahiert. Replicon-RNA wurde revers transkribiert und durch PCR unter Verwendung eines OneStep-RT-PCR-Kits (Qiagen) und von HCV-spezifischen Primern (ausgewählt aus der in WO-00/66623 beschriebenen Sequenz von voller Länge) amplifiziert. Zehn verschiedene RT-PCR-Produkte, die das gesamte bi-cistronische Replicon in gestaffelter Weise überdeckten, wurden unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern amplifiziert. Die PCR-Fragmente wurden direkt durch ABI Prism^R BigDye^R-Terminator Cycle PCR-Sequenzierung sequenziert und an einem ABI Prism^R-377-DNA-Sequenziergerät analysiert. Zur Analyse der Sequenz der HCV-Replicon-3'- und 5'-Enden wurde ein RNA-Ligations/RT-PCR-Verfahren gemäß Kolykhalov et al., 1996, eingehalten. Die Nucleotidsequenz von S22.3 ist als SEQ ID NO: 2 aufgeführt.
Beispiel 5
Serielle Passage von HCV-Replicon-RNA

Die gesamte zelluläre RNA aus der S22.3-Zelllinie wurde gemäß den vorstehenden Angaben präpariert. Die HCV-Replicon-RNA-Kopienzahl wurde durch Taqman^R RT-PCR-Analyse bestimmt und 20 μg gesamte zelluläre S22.3-RNA (mit einem Gehalt an 1 × 10⁹ Kopien an HCV-RNA) wurden durch Elektroporation in 8 × 10⁶ naive Huh-7-Zellen transfiziert. Transfizierte Zellen wurden anschließend in 10 cm-Gewebekulturplatten mit einem Gehalt an DMEM, das mit 10 % fötalem Kälberserum (10 % FCS) ergänzt war, gezüchtet. Das Medium wurde 24 Stunden nach der Transfektion gegen DMEM (10 % FCS), das mit 1 mg/ml G418 ergänzt war, ausgetauscht und sodann alle 3 Tage erneuert. 3 bis 4 Wochen nach der Transfektion und G418-Selektion bildeten sich 23 sichtbare Kolonien. G418-resistente Kolonien wurden zu Zelllinien der zweiten Generation expandiert, die die ersten Zelllinien mit einem Gehalt an seriell passagierter HCV-Replicon-RNA darstellten. Drei dieser Zelllinien, nämlich R3, R7 und R16, wurden weiteren Analysen unterzogen. Erstens wurde der Transduktionswirkungsgrad von jedem der adaptierten Replicons durch Elektroporation der gesamten zellulären RNA (extrahiert aus R3, R7 und R16) in naive Huh-7-Zellen bestimmt. Im Anschluss an die Elektroporation wurde der Transduktionswirkungsgrad auf die vorstehend beschriebene Weise durch Zählen der sichtbaren, G418-resistenten Kolonien, die nach 3- bis 5-wöchiger G418-Selektion auftraten, bestimmt (Tabelle 1). Zweitens wurde die Sequenz der seriell passagierten, adaptierten Replicons aus der gesamten zellulären RNA, die aus jeder der R3-, R7- und R16-Replicon-Zelllinien gemäß Beispiel 4 extrahiert worden war, bestimmt (SEQ ID NO: 4, 5, 6). Unter Verwendung von pAPGK12 als Referenzsequenz (SEQ ID NO: 1) sind die Nucleotid-Änderungen, die im HCV-Segment der adaptierten Replicons ausgewählt wurden, in 5A wiedergegeben. Einige dieser Nucleotid-Änderungen sind stumm und verändern die kodierte Aminosäure nicht, während andere zu einer Aminosäuresubstitution führen. In 5B sind die Aminosäureänderungen, die durch die adaptierten Replicons kodiert werden, unter Verwendung der Aminosäuresequenz von pAPGK12 als Referenz zusammengestellt. Die Feststellung ist wichtig, dass die Referenzsequenz APGK-12 (SEQ ID NO: 1) ein zusätzliches G am 5'-Ende (5'-GG) enthält, das in der replizierenden RNA der gebildeten Zelllinien nicht aufrechterhalten wird. Ferner ist es bemerkenswert, dass zusätzlich zu G → A am Nucleotid 1 in sämtlichen analysierten Klonen sich eine adaptierte Mutation von G → C/R an der Aminosäure 2042 feststellen lässt (angegeben als Aminosäure 1233 in der Sequenzliste, da die Aminosäure 810 von NS2 in SEQ ID als Aminosäure 1 nummeriert wird). Tabelle 1 Transfektion von Huh-7-Zellen

RNA	Replicon-Kopien	# Kolonien	SEQ ID
5 ng APKG12-Replicon in 20 μg gesamter Huh-7-RNA	1,2 × 10⁹	0
15 μg APKG12-Replicon-RNA	3 × 10¹²	1 (S22.3)	1
20 μg gesamte zelluläre S22.3-RNA	3 × 10⁹	23 (3 analysierte Klone)	2
zelluläre R3-RNA	1 × 10⁹	200	4
zelluläre R7-RNA	1 × 10⁹	20	5
zelluläre R16-RNA	3 × 10⁸	100	6
klonierte R3rep-RNA	2,3 × 10⁸	2000	7

Beispiel 6
Konstruktion von ARGK12 mit einer 5'-G → A-Substitution (APGK12-5'A, SEQ ID NO: 24)
Die pAPGK12-DNA wurde so modifiziert, dass das erste Nucleotid in der Sequenz so abgeändert ist, dass 5'-GG durch 5'-A ersetzt ist. Die Veränderung im pAPGK12 wurde durch Ersatz eines EcoRI/Agel-Bereiches der Sequenz durch ein PCR-erzeugtes EcoRI/Agel-Fragment, das die Mutation umfasst, eingeführt.
Folgende Oligonucleotide wurden für die Amplifikation verwendet: (SEQ ID NO: 20): 5'-GTG GAC GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAA CCA GCC CCC GAT TGG-3'; und (SEQ ID NO: 21): 5'-GGA ACG CCC GTC GTG GCC AGC CAC GAT-3'. Es wurde ein 195 bp-DNA-Fragment erzeugt, das dann mit EcoRI und Agel verdaut wurde. Das erhaltene 178 bp-Restriktionsfragment wurde als Ersatz für das EcoRI/Agel-Fragment in pAPGK12 verwendet, um das pAPGK12-5'A-Plasmid zu erzeugen.
Beispiel 7
cDNA-Klonierung des R3-Replicons (R3REP)
Der cDNA-Klon des R3-Replicons wurde durch RT-PCR von aus der R3-Zelllinie extrahierter RNA erzeugt. Die folgenden beiden Oligonucleotide wurden verwendet: (SEQ ID NO: 22): 5'-GTC GTC TTC TCT GAC ATG GAG AC-3'; und (SEQ ID NO: 23): 5'-GAG TTG CTC AGT GGA TTG ATG GGC AGC-3'. Das 4400 nt-PCR-Fragment, das innerhalb der NS2-Kodierungsregion beginnt und sich bis zum 5'-Ende der NS5B-Kodierungsregion erstreckt, wurde in das Plasmid pCR3.1 durch TA-Klonierung (Invitrogen) kloniert. Der SaclI/XhoI-Bereich dieser R3-Sequenz wurde sodann als Ersatz für das SacII/XhoI-Fragment, das in pAPGK12 und pAPGK12-5'A, die vorstehend beschrieben wurden, vorhanden ist, verwendet. Infolgedessen wurden zwei R3-cDNA-Sequenzen erzeugt: (I) R3-Rep-5'G mit einem 5'G zu Beginn (SEQ ID NO: 7) und R3-Rep-5'A (SEQ ID NO: 25) mit einem 5'A zu Beginn. Die Sequenzierung der R3 rep-cDNA führte zur Identifizierung besonderer Nucleotid-Änderungen, die einen Unterschied zur ursprünglichen pAPGK12-Sequenz darstellen (vergl. 5A). Einige dieser Änderungen sind stumm und verändern die kodierte Aminosäure nicht, während andere zu einer Aminosäureänderung führen (vergl. 5B). Die Unterschiede zwischen R3 und dem R3-rep spiegeln die Isolierung eines besonderen R3-rep-cDNA-Klons wider, der für Nucleotid-Änderungen kodiert, die aus der Sequenzierung der gesamten RNA, die aus der R3-Zelllinie extrahiert worden war, nicht festgestellt wurden.
Beispiel 8
Wirkungsgrad der Kolonienbildung mit modifizierten Konstrukten
RNA aus pAPGK12, pAPGK12-5'A, pR3-Rep und pR3-Rep-5'A wurde durch in vitro-Transkription unter Verwendung des T7-Ribomax^R-Kits (Promega) gemäß den Angaben im vorstehenden Beispiel 1 erzeugt. Die Reaktionen mit einem Gehalt an den pAPGK12-5'A- und pR3-Rep-5'A-Matrizen wurden aufgrund der Beschränkung von handelsüblicher RNA-Polymerase bei der Initiierung von Transkripts mit 5'-A im 10-fachen Maßstab durchgeführt. Die RNAs von voller Länge und die geschnittene Kontroll-RNA für jeden Klon wurden durch Elektroporation gemäß den Angaben in Beispiel 2 in 8 × 10⁶ naive Huh-7-Zellen eingeführt. Replicon-RNA wurde mit gesamter zellulärer Huh-7-Träger-RNA ergänzt, um eine endgültige Menge von 15–20 μg zu erzielen. Die Zellen wurden sodann in DMEM-Medium, das mit 10 % fötalem Kälberserum und 0,25 mg/ml G418 ergänzt war, in zwei 150 mm-Platten gezüchtet. Die geringere Konzentration von 0418 reichte aus, um repliconhaltige Zelllinien zu isolieren und zu selektieren, da keine der Transfektanten mit der geschnittenen Kontroll-RNA resistente Kolonien bildete. Im Gegensatz dazu bilden in vitro-transkribierte APGK-12-RNAs, die entweder ein 5'G oder ein 5'A beinhalten, Kolonien mit dem gleichen Wirkungsgrad (etwa 80 cfu/μg in 6, Felder A und B) im Anschluss an eine Selektion mit G418. Verschiedene Mengen (von 0,1 ng bis 1 μg) der R3-rep-5'A-RNA wurden in naive Huh-7-Zellen transfiziert, um den Wirkungsgrad der Kolonienbildung von 1,2 × 10⁶ cfu/μg RNA zu bestimmen (6, Feld C, stellt die Transfektion mit 1 μg RNA dar). Verschiedene Mengen (von 0,1 ng bis 1 μg) an R3-rep [5'G] wurden gleichermaßen transfiziert, was zu einem Wirkungsgrad der Kolonienbildung von 2 × 10⁶ cfu/μg RNA führte (6. Feld D stellt die Kolonienbildung mit 1 μg RNA dar). Es ist darauf hinzuweisen, dass erstmals gezeigt wurde, dass subgenomische HCV-Replicons mit einem 5'A-Nucleotid anstelle von 5'-G ebenso wirksam replizieren. APGK12 mit 5'-A- oder 5'-G-RNA weisen ähnliche Transduktionswirkungsgrade auf. Gleichermaßen erhöhten R3-Rep-RNAs entweder mit 5'-A oder 5'-G in ausgeprägter Weise den Transduktionswirkungsgrad. Bemerkenswerterweise sorgen die adaptiven Mutanten innerhalb des nicht-strukturellen HCV-Segments, das durch das R3-Rep kodiert wird, für eine wesentliche Zunahme des Transduktionswirkungsgrads, wie durch die drastische Zunahme der kolonienbildenden Einheiten pro μg an transfizierter RNA gezeigt wird.
Beispiel 9
Quantitative Bestimmung der HCV-Replicon-RNA-Konzentrationen in Zelllinien
S22.3-Zellen oder Zelllinien mit anderen adaptierten Replicons wurden auf DMEM, das mit 10 % FBS, PenStrep und 1 μg/ml Geneticin ergänzt war, überimpft. Am Ende der Inkubationsperiode wird die Replicon-Kopienanzahl durch Echtzeit-RT-PCR mit dem ABI Prism 7700-Sequenz-Nachweissystem bewertet. Das TAQMAN^R EZ-RT-PCR-Kit sorgt für ein System zum Nachweis und zur Analyse von HCV-RNA (erstmals gezeigt von Martell et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 37 (19q99), S. 327–332). Ein direkter Nachweis des Produkts der reversen Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ohne strangabwärtige Prozessierung wird durch Überwachung der Zunahme der Fluoreszenz einer mit einem Farbstoff markierten DNA-Sonde erreicht (6). Die Nucleotidsequenz von beiden Primern (adaptiert gemäß B. Ruster, S. Zeuzem und W. K. Roth, Analytical Biochemistry, Bd. 224 (1995), S. 597–600) und der Sonde (adaptiert gemäß M. Hohne, H. Roeske und E. Schreier, Poster Presentation: P297 beim Fifth International Meeting an Hepatitis C Virus and Related Viruses Molecular Virology and Pathogenesis, Lido von Venedig, Italien, 25./28. Juni 1998) in der 5'-Region des HCV-Genoms sind nachstehend angegeben:
HCV-Vorwärtsprimer:
5'-ACG CAG AAA GCG TCT AGC CAT GGC GTT AGT-3' (SEQ ID NO: 17)
HCV-Rückwärtsprimer:
5'-TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC AGG-3' (SEQ ID NO: 18)
HCV-Sonde:
5'-FAM-TGG TCT GCG GAA CGG GTG AGT ACA CC-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 19)
FAM: Fluoreszenz-Reporterfarbstoff
TAMRA: Quencher-Farbstoff

Unter Verwendung des TAQMAN^R EZ-RT-PCR-Kits wurde die folgende Reaktion durchgeführt:

Komponente	Volumen pro Probe (μl)	Endgültige Konzentration
RNase-Freies Wasser	16	–
5X Taqman-EZ-Puffer	10	1X
Manganacetat, 25 mM	6	3 mM
dATP, 10 mM	1,5	300 μM
dCTP, 10 mM	1,5	300 μM
dGTP, 10 mM	1,5	300 μM
dUTP, 20 mM	1,5	300 μM
HCV-Vorwärtsprimer 10 μM	1	200 nM
HCV-Rückwärtsprimer, 10 μM	1	200 nM
HCV-Sonde, 5 μM	2	200 nM
rTth-DNA-Polymerase, 2,5 U/μl	2	0,1 U/μl
AmpErase UNG, 1 U/μl	0,5	0,01 U/μl
Gesamtes Gemisch	45	–

Dieses Reaktionsgemisch wurde mit 5 μl gesamter RNA, die aus S22.3-Zellen extrahiert worden war, in einer Verdünnung auf 10 ng/μl mit insgesamt 50 ng RNA pro Reaktion versetzt. Die Replicon-Kopienzahl wurde mit einer Eichkurve ermittelt, die mit bekannten Werten von Replicon-Kopien (ergänzt mit 50 ng Wildtyp-Huh-7 RNA) aufgestellt und in einem identischen Reaktionsgemisch getestet worden war (7).

Die Thermocycler-Parameter, die für die RT-PCR-Reaktion am ABI Prism 7700-Sequenznachweissystem angewandt wurden, wurden für den HCV-Nachweis optimiert:

Zyklus	Temperatur (°C)	Zeit (Minuten	Wiederholungen	Reaktion
Halten	50	2		Anfangsstufe
Halten	60	30		Reverse Transkription
Halten	95	5		UNG-Desaktivierung
Zyklus	95	0:15	2	Schmelzen
	60	1		Anlagern/Erweitern
Zyklus	90	0:15	40	Schmelzen
	60	1		Anlagern/Erweitern

Die quantitative Bestimmung beruht auf dem Schwellenzyklus, an dem das Amplifikationsdiagramm eine definierte Fluoreszenzschwelle überschreitet. Ein Vergleich der Schwellenzyklen ergibt ein hochgradig empfindliches Maß für eine relative Matrizenkonzentration in verschiedenen Proben. Durch Überwachung während der frühen Zyklen, bei denen die PCR-Zuverlässigkeit am höchsten ist, ergeben sich genaue Daten für die exakte quantitative Bestimmung. Die relative Matrizenkonzentration kann in RNA-Kopienzahlen umgewandelt werden, indem man sich einer Eichkurve von HCV-RNA mit einer bekannten Kopienzahl bedient (7).
Beispiel 10
Eine spezifische antivirale HCV-NS3-Protease-Verbindung hemmt die Replikation des HCV-Replicons in S22.3-Zelllinien
Um den Einfluss einer spezifischen, antiviralen HCV-NS3-Protease-Verbindung auf die Repliconkonzentrationen in S22.3-Zellen zu bestimmen, wurden die Zellen auf Zellkulturciuster mit 24 Vertiefungen in einer Menge von 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 500 μl DMEM, das mit 10 % FBS, PenStrep und 1 μg/ml Geneticin ergänzt war, überimpft. Die Zellen wurden bis zur Zugabe der Verbindung in einem 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Die Dosis-Wirkungs-Kurve des Inhibitors zeigte 11 Konzentrationen, die sich aus seriellen Zweifachverdünnungen (1:1) ergaben. Die Ausgangskonzentration der Verbindung A betrug 100 nM. Eine Kontrollvertiefung (ohne Verbindung) wurde in den Versuchsverlauf aufgenommen. Die Platten mit 24 Vertiefungen wurden 4 Tage in einem 5 % CO₂-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Nach einer Inkubationsdauer von 4 Tagen wurden die Zellen 1-mal mit PBS gewaschen und die RNA wurde mit den RNeasy^R Mini-Kit und mit Qiashredder^R der Fa. Qiagen extrahiert. Die RNA einer jeden Vertiefung wurde in 50 μl H₂O eluiert. Die RNA wurde quantitativ aufgrund der optischen Dichte bei 260 nm mit einem Cary 1 E-Spektrophotometer für den UV- und sichtbaren Bereich bestimmt. 50 ng RNA aus jeder Vertiefung wurden zur quantitativen Bestimmung der HCV-Replicon-RNA-Kopienzahl gemäß den ausführlichen Angaben in Beispiel 6 verwendet. Der Hemmgrad (% Hemmung) einer jeden Vertiefung mit einem Gehalt an Inhibitor wurde gemäß folgender Gleichung berechnet (CN = HCV-Replicon-Kopienzahl):
Die berechneten prozentualen Hemmwerte wurden sodann zur Bestimmung der IC₅₀-Werte, des Steigungsfaktors (n) und der maximalen Hemmung (I_max) unter Anwendung des nicht-linearen Regressionsroutine-NLIN-Verfahrens von SAS unter Verwendung der folgenden Gleichung eingesetzt:
Die Verbindung A wurde mindestens 4-mal getestet. Die IC₅₀-Kurven wurden individuell mit der nicht-linearen SAS-Regressionsanalyse analysiert. 8 zeigt eine typische Kurve und Tabelle 2 zeigt die individuellen und durchschnittlichen IC₅₀-Werte der Verbindung A. Der durchschnittliche IC₅₀-Wert der Verbindung A beim Replikationstest betrug 1,1 nM. Tabelle 2 IC₅₀-Wert der Verbindung A beim Replicontest der S22.3-Zelllinie

Verbindung IC₅₀ (nM) Mittelwert von IC₅₀ (nM)

A 1,2 1,2 1,0 0,9

1,1 ± 0,2
Diskussion
Die reproduzierbare und robuste ex vivo-Vermehrung von Hepatitis C-Virus auf Konzentrationen, die für das genaue Testen von potentiellen antiviralen Verbindungen erforderlich sind, wurde bisher mit keinem System erreicht. Als ein alternativer Weg zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Hepatitis C-Virus-RNA-Replikation wurden selektierbare, selbstreplizierende, bi-cistronische RNAs entwickelt (Lohman et al., Science, Bd. 285 (1999), S. 110-113; Gartenschlager, CA-2 303 526 ). Minimal kodieren diese Replicons für einen Teil oder die Gesamtheit der nicht-strukturellen Proteine und tragen ferner einen selektierbaren Marker, wie die Neomycin-Phosphotransferase. Obgleich die intrazellulären Konzentrationen im stationären Zustand dieser subgenomischen Replicon-RNAs unter den gewählten Klonen mäßig bis hoch sind, ist die Frequenz der Erzeugung von G418-resistenten Kolonien bei der Transfektion der Konsensus-RNA gemäß Lohman et al. oder Gartenschlager sehr gering. Weniger als 100 Kolonien werden erzeugt, wenn 8 Millionen Zellen mit 1 μg von in vitro-transkribierter, bi-cistronischer Replicon-RNA transfiziert werden. Ein geringer Wirkungsgrad der Kolonienbildung wurde erstmals von Lohmann et al. (Science, Bd. 285 (1999), S. 110-113) festgestellt. Anschließend isolierten Lohmann et al. (2001), Blight et al. (2000) und Guo et al. (2001) subgenomische RNAs mit deutlich verbesserten Wirkungsgraden beim Kolonienbildungstest. Lohmann et al. (1999) berichtete ursprünglich, dass die Selektion von subgenomischen Replicons möglicherweise nicht die Selektion von adaptiven Mutanten beinhaltet, da seriell passagierte RNA keinen verbesserten Wirkungsgrad der Transfektion zeigte. Trotzdem führten wir in dem Bemühen, die Funktion und die Fähigkeit zur Replikation von HCV-RNA zu charakterisieren, serielle Passagen der Replicon-RNA durch, die aus der ersten selektierten Zelllinie isoliert worden war. Bemerkenswerterweise wurde ein erheblicher Anstieg des Wirkungsgrads der Kolonienbildung bei diesem Experiment erreicht, obgleich die Menge an Replicon-RNA um Größenordnungen geringer war als die Menge, die ursprünglich zur Transfektion der in vitro transkribierten RNA verwendet wurde. Ferner ergab eine zweite Runde der seriellen Passage von Replicon-RNA aus diesem Klon der ersten Generation in naive Huh-7-Zellen einen weiteren Anstieg des Wirkungsgrads der Kolonienbildung (Tabelle 1).
Unsere Analyse von replizierenden HCV-RNAs identifizierte mehrere adaptive Mutationen, die den Wirkungsgrad der Kolonienbildung um bis zu 4 Größenordnungen erhöhen. Adaptive Mutationen wurden in zahlreichen nicht-strukturellen Proteinen sowie in der 5'-nicht-translatierten Region gefunden. Die Substitution des 5'-GG-Dubletts anstelle von 5'-A als Anfangsnucleotid der HCV-5'-UTR stellt eine Variante des HCV-Genoms dar, die bisher nicht beschrieben wurde, und zwar trotz der Tatsache, dass weltweit zahllose Genotypen und Subtypen sequenziert wurden. Unser ursprüngliches Replicon, das eine 5'-GG-Gruppe trug, entwickelte Varianten mit entweder einem einzelnen 5'-A oder 5'-G, die beide einen gleichen Wirkungsgrad der Transduktion zeigten. Wir beschreiben hier erstmals ein HCV-Genom, das eine 5'A-Extremität tolerieren und stabil aufrechterhalten kann. Außerdem waren wir bei der Wiedereinführung dieser definierten, einzelnen Nucleotidsubstitution in unseren cDNA-Klon und bei der Erzeugung einer in vitro-transkribierten RNA, die eine derartige Extremität beinhaltet, erfolgreich, wodurch bestätigt wurde, dass 5'A ebenso wirksam funktioniert wie 5'G.
Wir identifizierten adaptive Aminosäuresubstitutionen in den nicht-strukturellen HCV-Proteinen NS3, NS4A und NS5A im R3-Replicon und eine Substitution in NS5B im R7-Klon (vergl. 5B). Diese Mutationen, insbesondere die durch das R3-rep definierte Kombination (SEQ ID NO: 7) führen bei Rekonstitution in einen cDNA-Klon und bei Transkription auf ein RNA-Replicon zu einem erheblich erhöhten Wirkungsgrad der Transduktion bis zum 20 000-fachen, verglichen mit der ursprünglichen Wildtyp-APGK12-Replicon-RNA. Jedoch waren die Konzentrationen an intrazellulärer Replicon-RNA im stationären Zustand aus jedem der unterschiedlichen isolierten Klone vergleichbar. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass die Zunahme des Replikationswirkungsgrads durch die adaptiven Mutationen nicht zu höheren stabilen, intrazellulären RNA-Konzentrationen aufgrund einer höheren RNA-Replikation führt, sondern vielmehr zu einer erhöhten Möglichkeit beiträgt, das Replicon in einer größeren Anzahl von Huh7-Zellen bereitzustellen. Ein derartiger Phänotyp kann sich vorübergehend manifestieren, und zwar durch eine anfängliche Zunahme des Betrags der de novo-Replikation, die erforderlich ist, um eine definierte Schwelle zu überwinden, um beständig replizierende RNAs innerhalb einer Population von sich teilenden Zellen bereitzustellen.
Vor kurzen identifizierten ferner drei weitere Gruppen andere unterschiedliche adaptive Mutanten. Lohmann et al. (2000) berichtete über erhöhte Wirkungsgrade der Transduktion bis zum 10 000-fachen bei Mutationen in NS3, NS4B, NS5A und NS5B. Blight et al. (2000) berichtete über eine Erhöhung der Transduktionswirkungsgrade bis zum 20 000-fachen mit einer einzigen Mutation in NS5A, während Guo et al. (2001) über eine Zunahme der Transduktionswirkungsgrade um einen Faktor von 5 000–10 000 bei einer Deletion einer einzigen Aminosäure in NS5A berichteten. Die von uns hier beschriebenen Aminosäuresubstitutionen wurden bisher nicht als adaptive Mutanten identifiziert, die den Wirkungsgrad der RNA-Transfektion und/oder -Replikation verstärken. Eine Ausnahme stellt die Mutation E1202G in NS3 dar, die wir sowohl in R7- als auch R16-Replicons fanden. Diese Adaptation wurde früher von Guo et al. (2001) und von Krieger et al. (2001) beschrieben. Sämtliche übrigen adaptiven Mutationen, die hier beschrieben werden, sind ausnahmslos unveröffentlicht.
Die Entwicklung von selektierbaren subgenomischen HCV-Replicons eröffnet potentielle Wege zur Erforschung der HCV-RNA-Replikation, -Beständigkeit und -Pathogenese in gezüchteten Zellen. Jedoch zeigte der geringe Transduktionswirkungsgrad bei HCV-RNA enthaltenden Replicons, der ursprünglich beschrieben wurde (Lohmann et al., 1999), dass es sich um kein praxisgerechtes System für reverse genetische Studien handelte. Die hier beschriebenen adaptiven Mutanten überwinden den geringen Transduktionswirkungsgrad. Im Hinblick auf neuere Beschreibungen von adaptiven Mutanten, die von anderen Arbeitsgruppen veröffentlicht wurden, stellen wir fest, dass die Adaptation durch bestimmte Mutationen in verschiedenen HCV-NS-Proteinen erreicht werden kann, obgleich der Adaptationsgrad drastisch variieren kann. Die Replicons, die für die hier beschriebenen adaptiven Mutanten kodieren, sind in idealer Weise für reverse genetische Studien geeignet, um neue HCV-Ziele oder Wirtszellziele zu identifizieren, die die HCV-RNA-Replikation oder die HCV-Replicon-RNA-Kolonienbildung modulieren können. Die adaptierten und hochgradig wirksamen Replicons eignen sich als Werkzeuge zur Charakterisierung von geringfügigen genotypischen oder phänotypischen Veränderungen, die einen leicht quantifizierbaren Transduktionswirkungsgrad beeinflussen können.
Kürzlich untersuchten wir unsere adaptierte subgenomische HCV-Replicon-Zelllinie, um die wirksame Hemmung der HCV-RNA-Replikation durch einen spezifischen Inhibitor der HCV-NS3-Protease in Form eines kleinen Moleküls nachzuweisen. Es handelt sich um den ersten Nachweis, dass ein antivirales Mittel, das zur spezifischen Hemmung eines der nicht-strukturellen HCV-Proteine konzipiert ist, die HCV-RNA-Replikation in Zellkultur hemmt. Außerdem bestätigen diese Verbindung und unsere S22.3-Zelllinie die Vermutung, dass die RNA-Replikation durch die nicht-strukturellen HCV-Proteine NS3 bis NS5B dirigiert wird. Der von uns beschriebene und bestätigte Test wird sich zukünftig als äußerst wertvoll bei der Charakterisierung weiterer Inhibitoren der Funktion von nicht-strukturellen HCV-Proteinen in Zellkultur unter Erzielung eines hohen Durchsatzes erweisen.
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Claims

Selbstreplizierendes Hepatitis C-Virus (HCV)-Polynucleotidmolekül, umfassend eine 5'-nicht-translatierte Region (NTR), in der Guanin in Position 1 des 5'-NTR durch Adenin ersetzt ist.
Selbstreplizierendes HCV-Polynucleotid nach Anspruch 1, umfassend: – eine 5'-NTR, umfassend ACCAGC (SEQ ID NO: 8), wobei das erste A dieser Sequenz das Nucleotid in Position 1 von 5'-NTR ist; – eine HCV-Polyproteinregion, die für ein HCV-Polyprotein kodiert; und – eine 3'-NTR-Region.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 2, wobei das Polyprotein eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: R(1135)K; S(1148)G; S(1560)G; K(1691)R; L(1701)F; I(1984)V; T(1993)A; G(2042)C; G(2042)R; S(2404)P; L(2155)P; P(2166)L und M(2992)T.
HCV-Polynucleotid, kodierend für ein Polyprotein, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen gemäß der Definition in Anspruch 3 umfasst und ferner die Aminosäuresubstitution E(1202)G umfasst.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei es sich bei der Substitution um eine G2042C- oder G2042R-Mutation handelt.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei die Substitution aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: K(1691)R und G(2042)C.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei die Substitution aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: R(1135)K; S(1560)G; K(1691)R; T(1993)A; G(2042)C und P(2166)L.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei die Substitution aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: R(1135)K; S(1560)G; K(1691)R; T(1993)A; G(2042)C; L(2155)P und P(2166)L.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei die Substitution aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: E(1202)G; I(1984)V; G(2042)C und M(2992)T.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei die Substitution aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: S(1148)G; E(1202)G; L(1701)F; G(2042)R und S(2404)P.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 2, wobei es sich beim Polynucleotid um ein RNA-Molekül handelt, das durch das DNA-Molekül kodiert wird, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 24 und 25.
HCV-Polynucleotid nach Anspruch 2, wobei es sich beim Polynucleotid um ein DNA-Molekül handelt, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 24 und 25.
Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Form des Polynucleotids nach Anspruch 2 in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor.
Wirtszelle, transfiziert mit dem selbstreplizierenden Polynucleotidmolekül nach Anspruch 2.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Wirtszelle um eine eukaryontische Zelllinie handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei es sich bei der eukaryontischen Zelllinie um eine hepatische Zelllinie handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei es sich bei der hepatischen Zelllinie um Huh-7 handelt.
RNA-Replikationstest, umfassend die folgenden Schritte: a) das Inkubieren der Wirtszelle nach Anspruch 14 unter Bedingungen, die sich für die RNA-Replikation eignen; b) das Isolieren der gesamten zellulären RNA aus den Zeilen; und c) das Analysieren der RNA, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen.
Test nach Anspruch 18, wobei die Analyse der RNA-Konzentrationen in Schritt c) durchgeführt wird, indem man die RNA durch Echtzeit-RT-PCR-Analyse unter Verwendung von HCV-spezifischen Primern amplifiziert, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen.
Test nach Anspruch 18, wobei das Polynucleotid für ein Reportergen kodiert und die Analyse der RNA-Konzentrationen in Schritt c) durch Bestimmung der Konzentration des exprimierten Reporters vorgenommen wird.
Verfahren zum Testen einer Verbindung auf Hemmung der HCV-Replikation, umfassend die folgenden Schritte: a) das Durchführen von Schritt a) nach Anspruch 18 in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung; b) das Isolieren der gesamten zellulären RNA aus den Zellen; und c) das Analysieren der RNA, um die Menge an replizierter HCV-RNA zu messen; d) das Vergleichen der Konzentrationen an HCV-RNA in Zellen in Abwesenheit und Gegenwart des Inhibitors, wobei verringerte RNA-Konzentrationen ein Anzeichen für die Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Replikation darstellen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Zelllinie mit der Testverbindung etwa 3–4 Tage bei einer Temperatur von etwa 37 °C inkubiert wird. Sequenzprotokoll