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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
neuronalen Zeroidlipofuszinosen (NCLs) sind eine Gruppe von engverwandten
erblich neurodegenerativen Störungen,
die Säuglinge,
Kinder und Erwachsene betreffen, und die mit einer Häufigkeit zwischen
2 und 4 pro 100.000 Lebendgeburten auftreten. Die meisten Formen
von NCL betreffen Kinder, und ihre frühen Symptome und der Krankheitsverlauf
scheinen ähnlich
zu sein. Die Anfangsdiagnose basiert häufig auf visuellen Problemen,
Verhaltensänderungen
und Anfällen.
Der Verlauf spiegelt sich in einem Rückgang mentaler Fähigkeiten,
zunehmend schwereren und nicht behandelbaren Anfällen, Blindheit und Verlust
von motorischen Fertigkeiten, wobei der weitere Verlauf zu Demenz
oder einen vegetativen Zustand führen
kann. Es gibt keine wirksame Behandlung für NCL, und alle Kinderformen
sind schließlich
tödlich.
Man unterscheidet mehrere Formen von NCL gemäß dem Alter zum Zeitpunkt des
Ausbruchs, der klinischen Pathologie und der genetischen Verknüpfung. Diese
umfassen infantile NCL (INCL, CLN1), klassische spätinfantile
NCL (LINCL, CLN2), juvenile NCL (JNCL, CLN3), erwachsene NCL (CLN4),
zwei Variantenformen von LINCL (CLN5 und CLN6) und möglicherweise
andere atypische Formen.
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CLN2-Gen
und -Protein (beschrieben in
US-Patent
Nr. 6,302,685 , erteilt am 16. Oktober 2001, und von Sleat
et al. (1997) Science 277: 1802–1805)
führen,
wenn mutiert, zu der autosomalen rezessiven Krankheit, der klassischen
spätinfantilen
neuronalen Zeroidlipofuszinose (LINCL, OMIM 204500). CLN2 kodiert
das Protein Lysozymtripeptidylpeptidase I (ebenso als CLN2-Protein, CLN2-Genprodukt,
TPP-1, EC3.4.14.9 bezeichnet) (Sleat et al., Vines and Warburton
(1999), FEBS Lett. 443 131–135),
das ein 46 kDa lysosomales Protein ist, das abwesend oder in LINCL
mutiert ist. Bei seiner Abwesenheit akkumuliert sich Speichermaterial, dessen
identifizierbare Hauptkomponente Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit
c ist, in den Lysosomen von betroffenen Patienten in Neuronen und
anderen Zelltypen (Palmer et al. (1995) Am. J. Med. Genet. 57: 260–265). Es
besteht die Notwendigkeit, therapeutische Anwendungen, die auf CLN2
basieren, für
die Behandlung von LINCL und verwandten Krankheiten zu entwickeln.
Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung für die Krankheit und der Tod
tritt typischerweise zwischen dem Alter von 6 und 15 ein (Mole (1998)
Neurobiol. Dis. 5: 287–303).
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Enzymsubstitutionstherapie
ist eine wünschenswerte
Behandlung für
lysosomale Speicherkrankheiten wie LINCL, die durch eine unzureichende
Menge an funktionellem CLN2-Protein in den befallenen Zellen gekennzeichnet
sind. Bei der Enzymsubstitutionstherapie wird rekombinantes (oder
natürliches)
Enzym an die befallenen Zellen verabreicht, um die Stoffwechselstörung zu
korrigieren, ein Ansatz, der sich bei der Gaucher-Krankheit als
erfolgreich erwies. Die Verabreichung von Glucocerebrosidase erwies
sich beim Behandeln von vielen Patienten mit Gaucher-Krankheit als
bemerkenswert wirksam (Brady, R. O. und Barton, N. W. (1994) Biochem
Med Metab Biol 52, 1–9),
und es gibt laufende klinische Versuche für eine Vielzahl von anderen
lysosomalen Speicherkrankheiten (Schiffmann et al. (2000) Proc Natl
Acad Sci USA 97, 365–370;
Bijvoet et al. (1999) Hum Mol Genet 8, 2145–2153; Chen, Y. T. und Amalfitano,
A. (2000) Mol Med Today 6, 245–251;
Downs-Kelly et al. J. Mol. Neurosci. (2000); Kaye (2001) in Current
Treatment Options in Neurology 3: 249–256; Kakkis et al. (2001)
Mol. Genet. Metab. 72: 199–208;
Byers et al. (2000) Pediatr. Res. 47: 743–749; Brady und Schiffman (2000)
JAMA 284: 2771–2775;
Vogler et al. (1999) Pediatr. Res. 45: 838–844; Zirzow et al. (1999)
Neurochem. Res. 24: 301–305;
Platt und Butters ((1998) Biochem. Pharmacol. 56: 421–430; Crawley
et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 651–662; Brady und Barton (1997)
Lipids March 31 Suppl. S137–139;
Barton et al. (1993) New Eng. J. Med. 328: 1564,1567,1568).
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG.
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Es
ist ein Gegenstand der Erfindung, eine Therapie bereitzustellen,
durch die ein Patient mit einer Krankheit, die durch eine unzureichende
Menge an funktionellem CLN2-Protein in den befallenen Zellen gekennzeichnet
ist, durch Verabreichen an den Patienten einer Menge an CLN2-Protein
behandelt werden kann, welche wirksam ist, um die Symptome, die
durch den Mangel in dem CLN2-Protein verursacht wird, zu verringern
oder zu beseitigen, wobei das CLN2-Protein ein inaktives Proenzym
ist.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1.
Vergleich von CLN2-Protein-Expressionsniveaus in CHO-Zellen. Adhärente Zellen
wuchsen zur Konfluenz in DMEM/F12, enthaltend 10% FKS. Die Medien
wurden durch serumfreies DME/F12 an Tag 0 ersetzt. Konditionierte
Medien wurden an Tag 2 gesammelt und hinsichtlich der TPP-I-Aktivität nach der
Ansäuerung
analysiert, um proCLN2-Protein in aktives Enzym umzuwandeln.
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2.
Vergleich der CLN2-Protein-Sekretion in unterschiedlichen Kulturmedien.
Adhärente
Zellen in 6-Lochplatten wuchsen zur Konfluenz in DMEM/F12, enthaltend
10% FKS. Die Medien wurden durch 5 ml der angegebenen Kulturmedien
an Tag 0 ersetzt und 0,1 ml für
die Enzymaktivitätsmessungen,
wie angegeben, entfernt.
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3.
Anionenaustauschchromatographie von rekombinantem CLN2-Protein.
Material aus 12 150-cm2-Schalen, enthaltend
konfluente adhärente CHO-Zellen,
die das CLN2-Protein überexprimieren, wurden
für 8 Tage
in DMEM/F12 (82 ml/Loch) kultiviert. Die Medien wurden entfernt,
durch eine 0,2-μm-Celluloseacetatmembran
filtriert und in eine Rührzellvorrichtung,
ausgestattet mit einer YM-30-Membran (Amicon), gegegeben. Die Probe wurde
konzentriert der Puffer gegen 50 mM NaCl/20 mM Tris pH 8,0 auf ein
Endvolumen von 40 ml ausgetauscht. Die Probe wurde auf eine 15 × 68 mm
UnoQ-12-Säule
bei einer Fließgeschwindigkeit
von 2 ml/min aufgebracht. Die Säule
wurde mit 50 mM NaCl/20 mM Tris pH 8,0 gewaschen und mit 40 Säulenvolumen
eines linearen Gradienten von 50 bis 525 mM NaCl eluiert. Fraktionen
(4 ml während
der Beladung und Waschung, 2 ml während der Gradientenelution)
wurden gesammelt und hinsichtlich der TPP-I-Enzymaktivität analysiert.
Die zusammengefaßten
Fraktionen, die aus 200–225
ml eluierten, enthielten 17 mg proCLN2, was aus der Extinktion bei 280
unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,345 ml/mg/cm
berechnet wurde. Die Chromatographie wurde bei 4°C unter Verwendung eines Akta
Explorer Systems (Amersham Pharmacia) durchgeführt.
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4.
Gelelektrophorese von mit transfektierten CHO-Zellen konditionierten
Medien vor und nach der Anionenaustauschchromatographie. Die mit „Load" und „AEX" gekennzeichneten
Spuren geben 7,5 Mikroliter der 40 ml Ausgangsmaterial bzw. der
2 ml Peakfraktion, die bei 208 bis 209 ml eluiert, der in 3 angegebenen
Anionenaustauschsäule wieder.
Die Gele (10% NuPAGE, Novex) wurden mit Coomassie-Brilliantblau
angefärbt.
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5.
Analytische Gelfiltration von proCLN2-Protein. Anionenaustauschgereinigtes proCLN2
(0,14 ml von 0,59 mg/ml Protein) wurde auf eine Superose-12HR-10/30-Säule (Pharmacia)
aufgebracht. Die Säule
wurde bei einer Rate von 0,5 ml/min mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung eluiert.
Die Säule
wurde unter denselben Bedingungen unter Verwendung von Dextranblau
kalibriert, um das Hohlraumvolumen und die Globulärproteinstandards Rinderserumalbumin
(67 KDa), Hühnerovalbumin (43
KDa), Chymotrypsinogen (28 KDa) und Cytochrom c (12,4 KDa) zu bestimmen.
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6.
Mannose-6-phosphat-Rezeptor-Chromatographie von proCLN2-Protein.
Die Probe (0,2 ml von 0,58 mg/ml Anionenaustausch-gereinigtem proCLN2-Protein)
wurde auf einen 1,5 cm3 Affigel 10 (BioRad)-immobilisierten,
von löslichen
Kationen unabhängigen
Mannose-6-phosphat-Rezeptor aufgebracht (– 2,5 mg Rezeptor/cm3 Harz). Die Säule wurde mit 5 × 1,5 ml
Puffer A (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthaltend 0,2% Tween-20
und 5 mM β-Glycerophosphat),
5 × 1
ml Puffer A, enthaltend 100 mM Glucose-6-phosphat, 5 × 1 ml Puffer
A, enthaltend 10 mM Mannose-6-phosphat,
und 4 × 1 ml
0,1 M Glycin pH 2,5 gewaschen. Fraktionen wurden hinsichtlich der
TPP-I-Aktivität
analysiert.
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7. Autoaktivierung von rekombinantem menschlichem
CLN2-Protein. Darstellung A. Rekombinantes menschliches CLN2-Protein,
hergestellt aus CHO-Zellen,
wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gehalten oder in 150 mM
NaCl/50 mM Formiatpuffer pH 3,5 gelöst und 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Proben wurden auf ein reduzierendes denaturierendes Gel aufgebracht
(Novex Nu-PAGE Bis-tris-Gel
mit MES-Laufpuffer) und Proteine durch Coomassie-Blau-Färbung visualisiert.
Die Größe der vorgefärbten Molekulargewichtsstandards,
die in der lin ken Spur gezeigt sind, wird gemäß dem korrigierten Molekulargewicht,
das durch den Lieferanten zugeordnet worden ist (Novex), aufgegeben.
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Darstellung
B. Rekombinantes menschliches CLN2-Protein, hergestellt durch Insektenzellen
in 150 mM NaCl/20 mM Tris pH 8/0,2% Tween 20, wurde in Säurepuffer
(150 mM NaCl/0,1% Triton X-100/Natriumacetat pH 4,0) bei Raumtemperatur verdünnt. Die
Proben wurden in SDS-PAGE-Puffer verdünnt, auf einem 10% SDS-PAGE-Gel
(Novex) getrennt und durch Silberfärbung analysiert (obere Darstellung).
Spur 1 stellt den Null-Zeitpunkt dar (Probe, direkt verdünnt in SDS-PAGE-Probenpuffer, ohne
daß sie
den sauren Bedingungen ausgesetzt wird), während die Spuren 2 bis 10 Proben
darstellen, entnommen 0,5, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 und 122
Minuten nah der Verdünnung
in Säurepuffer.
Die Größe der Molekulargewichtsstandards
wird auf der rechten Seite angegeben. Die Gele wurden gescannt und
die Umwandlung in reife Form berechnet (Intensität des unteren Bandes, normalisiert
auf die Summe der Intensitäten
der oberen und unteren Bänder) (Diagramm,
leere Kreise). Proben wurden auch in TPP-I-Assaypuffer verdünnt und
die anfängliche Rate
der Substrathydrolyse bestimmt (Diagramm, quadratische Symbole).
Das gereinigte CLN2-Protein, das in diesem Experiment verwendet
wird, unterschied sich von dem, das in CHO-Zellen erzeugt wird,
dahingehend, daß es
eine C-terminale Hexahistidinmarkierung enthielt. Dies und die Unterschiede in
der Glycosylierung sind für
die leicht unterschiedlichen scheinbaren Molekulargewichte der zwei
Präparate
verantwortlich. Jedoch war der Aminoterminus des Pro- und des reifen
CLN2-Proteins aus den zwei Präparaten
identisch.
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8.
Aufnahme von rekombinantem menschlichem CLN2-Protein durch LINCL-Fibroblasten. Konfluente
LINCL-Fibroblasten in 48-Lochplatten wurden mit 1 ml RPMI1640/10%
FKS, enthaltend die angegebenen Konzentrationen von Anionenaustausch-
und Gelfiltrations-gereinigtem proCLN2-Protein, inkubiert. Wenn
angegeben, enthielt das Medium ebenso 10 mM Mannose-6-phosphat.
Bei den angegebenen Zeiten wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
gespült
und mit 1% Nonidet P-40/150 mM NaCl/10 mM Tris pH 7,5 bei 4°C lysiert.
Die Lysate wurden hinsichtlich der TPP-I-Aktivität analysiert. Die Aktivität wird auf
Löcher
normalisiert, die mit einem normalen Kontrollfibroblasten plattiert
sind.
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9.
Stabilität
von rekombinantem menschlichem CLN2-Protein in LINCL-Fibroblasten. Die
Zellen wurden mit entweder 10, 31 oder 100 nM proCLN2-Protein für 24 Stunden
inkubiert, wie in 8 beschrieben. Die Medien wurden
entfernt und die Zellen wurden einmal mit RPMI1640/10% FKS gespült. Frisches
RPMI1640/10% FKS wurde zugegeben und die Inkubation für 1, 3 oder
7 Tage konditioniert und die Zellen verarbeitet, wie in 8 beschrieben.
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10.
Immunfluoreszenzdetektion von CLN2 in normalen und LINCL-Fibroblasten.
LINCL-Zellen wurden auf Deckgläsern
plattiert und in Wachstumsmedium (RPMI1640/10% FKS) allein oder
mit 32 nM CLN2-Protein in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM Mannose-6-phosphat
kultiviert. Die Zellen wurden in Bouin-Fixiermittel fixiert, mit 0,5% Triton
X-100/phosphatgepufferter Kochsalzlösung permeabilisiert, mit Blockierungspuffer
(3% BSA/0,2% Tween 20/500 mM NaCl/phosphatgepufferte Kochsalzlösung) blockiert
und mit Kaninchen-Anti-CLN2-Protein-Antisera (1:100-Verdünnung in Blockierungspuffer)
inkubiert. Gebundener Antikörper
wurde unter Verwendung von FITC-Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörpern detektiert.
Normale Kontrollzellen, die in RPMI1640/10% FKS wuchsen, wurden
parallel sondiert.
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11.
Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit c in normalen und LINCL-Fibroblasten. Konfluente
Fibroblasten wurden in RPMI1640/10% FKS, enthaltend 30 nM CLN2-Protein,
wenn angegeben, für
7 Tage kultiviert. Die Zellen wurden in Lithiumdodecylsulfatprobenpuffer
löslich
gemacht und Proteine durch SDS-PAGE auf vorgefertigtem NuPAGE 10% Bis-Tris-Gel
unter Verwendung von MES-Laufpuffer (Invitrogen) abgetrennt. Western-Blot
wurde unter Verwendung von Kaninchenantikörpern gegen Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit
c [4] und erhöhter
Chemilumineszenz (Renaissance, NEN) durchgeführt.
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12.
Aufnahme von rekombinantem CLN2-Protein durch Rattenkleinhirn-Granulumneuronen.
Kleinhirngranulumneuronen wurden in 48-Lochplatten für einen
Tag in Medium, enthaltend die angegebenen Konzentrationen von CLN2-Protein,
in Gegenart (gefüllten
Symbole) oder Abwesenheit (leere Symbole) von 10 mM M6P kultiviert.
Die Zellen wurden lysiert, wie in den experimentellen Verfahren
beschrieben, und dann hinsichtlich der TPP-I-Aktivität unter
Verwendung des kinetischen Assays (siehe 3) nach
einer 30minütigen
Vorinkubation bei 37°C
in Puffer mit pH 3,5, um das Proenzym (Kreise) zu aktivieren, oder
bei 0°C
in Puffer mit pH 7,5, um die Proenzymaktivierung zu verhindern (Dreiecke),
analysiert. Die gestrichelte Linie stellt das endogene TPP-I-Aktivitätsniveau
dar. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardfehler von dreifachen
Bestimmungen dar. Die Daten wurden an das S-förmige Dosis-Wirkungs-Modell
unter Verwendung von Prism 3.0 angepaßt. Das Nebenbild zeigt den
Unterschied zwischen der Aktivität,
die mit den Zellen verbunden ist, die in Abwesenheit und Gegenwart
von M6P inkubiert wurden, wobei die Kreise die voraktivierten Proben
darstellen und die Dreiecke die nicht-voraktivierten Proben darstellen.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung eines CLN2-Proteins
bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten
mit spätinfantiler
neuronaler Lipofuszinose (LINCL) gerichtet, wobei das CLN2-Protein
ein inaktives Proenzym ist.
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Ein
Patient, bei dem die Verabreichung von CLN2 ein wirksames therapeutisches
Regime ist, ist bevorzugt ein Mensch, kann aber jedes Lebewesen sein.
Daher sind, wie ohne weiteres durch den Fachmann erkannt werden
kann, die Verwendung und die pharmazeutische Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung für
die Verabreichung an jedes Lebewesen, insbesondere einen Säuger, einschließlich, aber
nicht darauf beschränkt,
Haustiere, wie Katzen oder Hunde, landwirtschaftliche Nutztiere,
wie, aber nicht darauf beschränkt,
Rinder, Pferde, Ziegen, Schafe und Schweine, wilde Tiere (ob in
der Wildnis oder in Gefangenschaft), Forschungstiere, wie Mäuse, Ratten,
Kaninchen, Ziegen, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen usw., Vögel, wie
Hühner,
Truthähne, Singvögel usw.,
d. h. zur veterinären
medizinischen Verwendung, besonders geeignet.
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Bei
einer solchen Störung
haben bestimmte Zellen des Patienten kein ausreichendes funktionelles
CLN2-Protein. Unter funktionell ist zu verstehen, daß das CLN2- Protein beispielsweise
abwesend, oder inaktiv oder in inadäquaten Niveaus vorliegen kann.
Die Störung
kann durch Entnahme von Proben von verschiedenen Zelltypen und Detektieren
durch bekannte Verfahren, ob das CLN2-Protein nicht exprimiert wird
oder anderweitig nicht funktionell ist, wie definiert, bestimmt
werden. Diese Verfahren können Enzymaktivitätsassays,
Mikroskopie, Immunfluoreszenz und Nukleinsäurehybridisierung (unter Verwendung
von beispielsweise Proteinen und Nukleinsauren, beschrieben von
Sleat et al. (1997)) umfassen. Die betroffenen Zellen können zu
jedem Zell- oder Gewebetyp gehören,
aber sind bevorzugt Neuronen. Die Gegenwart von einer solchen Störung kann ebenso
durch physische Symptome, wie Anfälle oder den Verlust der motorischen
Fertigkeiten detektiert werden.
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Bevorzugt
ist die Störung
durch Akkumulation von ein oder mehreren Speicherprodukten in den Lysosomen
der betroffenen Zellen, insbesondere Neuronen gekennzeichnet. Eine
Möglichkeit
zum Bestimmen der Störung
ist die Feststellung, daß die
Lysosomen akkumuliertes Speichermaterial aufweisen, was durch bekannte
Verfahren durchgeführt
werden kann, wie Mikroskopie oder Immunfluoreszenz. Ein Beispiel
eines Speichermaterials, das in Lysosomen detektiert werden würde, ist
Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit c. Die erfolgreiche Behandlung
mit CLN2-Protein wird die Mitochondrien-ATP-Synthase, insbesondere
Untereinheit c in den Lysosomen der betroffenen Zellen, wie Neuronen,
verringern oder beseitigen. Das Detektieren der Beseitigung von Speichermaterial,
wie Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit c in den Lysosomen von
betroffenen Zellen, kann durch bekannte Verfahren, wie oben beschrieben,
durchgeführt
werden. Ein Beispiel einer solchen Störung ist LINCL.
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Das
CLN2-Protein liegt in einer inaktiven Proenzymform (oder Prodrugform)
vor. Es kann natürlich
isoliert oder rekombinant sein. Das CLN2-Protein wird in seiner
Proenzymform erhalten, wenn es beispielsweise in Ovarialzellen des
chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) hergestellt wird. Diese Form wandelt
sich in die aktive Form nach der Säuerung um. Das Proenzym ist
deshalb ein besonders geeignetes Prodrug, das inaktiv bleibt, bis
es zu den Lysosomen geführt
wird, deren saure Umgebung es aktivieren wird. Der Erhalt von CLN2-Protein
in jeder dieser Formen wird nachstehend ausführlich und von Sleat et al.
(1997) beschrieben. Kurz, das CLN2- Protein wird unter Verwendung bekannter
Verfahren aus menschlichen Gehirnproben durch Reinigen von Mannose-6-phosphat-enthaltenden
Glycoproteinen aus normalen und LINCL-Gehirnproben und Isolieren der
Proteinbande, die in den normalen, aber nicht in den LINCL-Proben
vorliegt, isoliert. Sobald das Protein einmal erhalten wird, werden
das entsprechende Gen und die cDNA ebenso unter Verwendung bekannter
Verfahren isoliert. Rekombinantes Protein wird dann aus der cDNA
unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt. Das CLN2-Protein
in jeder der obigen Formen kann Mannose-6-phosphoryliert sein oder
nicht.
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Das
CLN2-Protein kann allein oder mit anderen aktiven Wirkstoffen verwendet
werden. Es kann mit einer Polyalkylenglycolkomponente durch bekannte
Verfahren konjugiert werden, oder kann als Teil eines chimären Proteins
verwendet werden, beispielsweise verbunden mit einem Antikörper oder Teilen
davon, einem Transferrin, einem Hormon oder einem Wachstumsfaktor.
Das CLN2-Protein kann in Form eines Prodrugs bereitgestellt werden,
d. h. einer stabilen inaktiven Form, die aktiv wird, wenn sie verabreicht
wird (beispielsweise wie oben beschrieben). Die vorliegende Erfindung
stellt das Konjugieren targetierender Moleküle mit CLN2, DNA-Vektoren (einschließlich Viren),
die CLN2 kodieren, und Trägern
(d. h. Liposomen) zum Targetieren zu einer gewünschten Zelle oder Gewebe,
z. B. das Gehirn, bereit. „Targetierendes
Molekül", wie hierin verwendet,
soll ein Molekül
bedeuten, das sich, wenn es in vivo verabreicht wird, an (einer)
gewünschten
Lokation(en) lokalisiert. In verschiedenen Ausführungsformen kann das targetierende
Molekül
ein Peptid oder Protein, Antikörper,
Lectin, Kohlenhydrat oder Steroid sein. In einer Ausführungsform
ist das targetierende Molekül
ein Protein- oder Peptidligand eines internalisierten Rezeptors
auf der Targetzelle. In einer speziellen Ausführungsform ist das targetierende Molekül ein Peptid,
das die allgemein bekannte RGD-Sequenz umfaßt, oder Varianten davon, die RGD-Rezeptoren
auf der Oberfläche
von Zellen, wie Krebszellen, z. B. menschliche Eizellen, die Rezeptoren
aufweisen, die die RGD-Sequenz erkennen, binden. Andere Liganden
umfassen Transferrin, Insulin, Amylin und dergleichen, sind aber
nicht darauf beschränkt.
Rezeptorinternalisierung ist bevorzugt, um die intrazelluläre Abgabe
von CLN2-Protein zu erleichtern. In einer anderen Ausführungsform
ist das targetierende Molekül
ein Antikörper.
Bevorzugt ist das targetierende Molekül ein monoklonaler Antikörper. In
einer Ausführungsform
kann, um die Vernetzung zu erleichtern, der Antikörper auf
zwei Schwer- und Leichtketten-Heterodimere
reduziert werden, oder das F(ab)2-Fragment
kann reduziert werden, und mit dem CLN2 über das reduzierte Sulfhydryl vernetzt
werden. Antikörper
zur Verwendung als targetierendes Molekül sind für Zelloberflächenantigen spezifisch.
In einer Ausführungsform
ist das Antigen ein Rezeptor. Beispielsweise kann ein Antikörper, der für einen
Rezeptor auf Krebszellen, wie Melanomzellen, spezifisch ist, verwendet
werden. Diese Erfindung stellt ferner die Verwendung von anderen
targetierenden Molekülen,
wie Lectinen, Kohlenhydraten, Proteinen und Steroiden, bereit.
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Das
CLN2-Protein kann in einer Zusammensetzung mit pharmazeutisch akzeptablen
Trägern und/oder
Hilfsstoffen verabreicht werden. Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare
Einheiten und Zusammensetzungen, die physiologisch verträglich sind
und typischerweise keine unerwünschte
Reaktion erzeugen, wie Magenverstimmung, Schwindel, allergische
Reaktionen und dergleichen, wenn sie verabreicht werden. Bevorzugt bedeutet,
wie hierin verwendet, der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabel" die Zulassung durch
eine Überwachungsbehörde der
Bundes- oder Staatsregierung oder die Auflistung in dem US-Arzneimittelverzeichnis
oder anderen allgemein anerkannten Arzneimittelverzeichnissen zur
Verwendung bei Tieren und spezieller bei Menschen, obwohl ein pharmazeutisch
akzeptabler Träger
der Erfindung die Merkmale eines solchen zugelassenen Trägers aufweisen kann,
ohne selbst zugelassen zu sein. Der Ausdruck „Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel,
ein Adjuvans, einen Hilfsstoff oder ein Vehikel, mit dem die Verbindung
verabreicht wird. Diese pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten,
wie Wasser und Öle,
einschließlich
denen vom Petroleum-, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen
Ursprung, wie Erdnußöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen,
sein. Wasser oder wässerige
Kochsalzlösungen
und wässerige
Dextrose- und Glycerollösungen
werden bevorzugt als Träger,
insbesondere für
injizierbare Lösungen
eingesetzt. Geeignete pharmazeutische Träger werden in „Remington's Pharmaceutical
Sciences" von E.
W. Martin beschrieben.
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Eine
Zusammensetzung dieser Erfindung umfaßt bevorzugt einen Aufnahmeinhibitor,
der die lokale Clearance von CLN2-Protein durch Zelloberflächenrezeptoren
verringert. Dies dient der Sicherstellung, daß das CLN2-Protein gleichmäßig verabreicht wird,
so daß eher
mehr Zellen einen geringen Teil des CLN2-Proteins erhalten, als
daß die
wenigen Zellen nahe der Verabreichungsstelle den größten Teil
des CLN2-Proteins
erhalten. Der Clearance-Mechanismus umfaßt Endozytose durch Zelloberflächenrezeptoren,
wie den Mannoserezeptor, den Asialoglykoproteinrezeptor und den
Mannose-6-phospat-Rezeptor. Daher ist ein bevorzugter Aufnahmeinhibitor
Mannose-6-phosphat. Der Aufnahmeinhibitor kann in einer Zusammensetzung
mit CLN2-Protein verabreicht werden, oder kann separat, aber gleichzeitig
verabreicht werden, oder die zwei können zu unterschiedlichen Zeiten
verabreicht werden, so lange wie der Aufnahmeinhibitor die gewünschte Wirkung
haben kann.
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Die
Menge an CLN2-Protein, die wirksam ist, die Symptome zu verringern
oder zu beseitigen, die durch den Mangel an CLN2-Protein verursacht
werden, wird ohne weiteres durch den Fachmann bestimmt. Wie oben
erläutert,
kann die Linderung (d. h. Verringerung oder Beseitigung) von Symptomen
auf Basis des physischen Zustands des Patienten, beispielsweise
dem Einstellen von Anfällen
oder der Reduktion der Menge oder Intensität von Anfällen bestimmt werden. Oder
die Messung kann an Zellproben, beispielsweise Hirnneuronen, durch
Bestimmen der Menge an Speicherprodukten, die in Lysosomen vorliegen,
und Vergleichen mit normalen Kontrollzellen, um die Linderung des
Zustandes zu bestätigen, durchgeführt werden.
Daher kann die Dosis durch einen Fachmann in Abhängigkeit des Alters, der Größe und des
Zustandes des Patienten bestimmt werden. Alternativ kann die Menge
an verabreichtem CLN2-Protein so sein, daß normale Niveaus von CLN2-Protein
in der Zelle wiederhergestellt werden, wie beispielsweise durch
den Vergleich mit normalen Zellen bestimmt wird. Bei einer bevorzugten
Behandlung ist die wirksame Menge an CLN2-Protein so, daß die betroffenen
Zellen etwa 1,0 nM bis etwa 100 nM CLN2-Protein erhalten. Die Dosis,
die verwendet wird, um sicherzustellen, daß die betroffenen Zellen etwa
1,0 bis 100 nM CLN2-Protein erhalten, kann durch den Fachmann bestimmt
werden, beispielsweise durch eine Biopsie nach der Verabreichung und
Analyse der behandelten Zellen durch bekannte Verfahren, um zu bestimmen,
wieviel (beispielsweise) injiziertes oder orales oder inhaliertes
CLN2 erforderlich ist, um die gewünschten Zellniveaus bereitzustellen.
Wenn es mit einem Aufnahmeinhibitor verabreicht wird, sollte der
Aufnahmeinhibitor in einer Konzentration vorliegen, die die sofortige
Clearance des CLN2-Proteins nahe der Verabrei chungsstelle inhibieren
würde.
Eine solche Dosis kann durch einen Fachmann bestimmt werden. Wenn
der Aufnahmeinhibitor Mannose-6-phosphat ist, sind 5 mM eine bevorzugte
Dosis.
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Gemäß der Erfindung
kann das CLN2-Protein oder eine Zusammensetzung, die das CLN2-Protein
umfaßt,
parenteral, transmukosal, z. B. oral, nasal oder rektal, oder transdermal
eingeführt
werden. Die Verabreichung erfolgt bevorzugt durch Injektion, speziell
parenteral, z. B. über
intravenöse
Injektion, und umfaßt
ebenso, ohne darauf beschränkt
zu sein, intraarterielle, intramuskuläre, intradermale, subkutane,
intraperitoneale, intraventrikuläre
und intrakraniale Verabreichung.
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Das
CLN2-Protein oder die Zusammensetzung kann in einem Vesikel, insbesondere
einem Liposom verabreicht werden (siehe Langer, Science 249: 1527–1533 (1990);
Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease
and Cancer, Lopez-Berestein
und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, S. 353–365 (1989); Lopez-Berestein,
ebenda, S. 317–327;
siehe im allgemeinen ebenda). Um die systemischen Nebenwirkungen
zu verringern und zelluläre
Penetration zu erhöhen,
kann dies ein bevorzugtes Verfahren zur Einführung von CLN2 sein.
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Das
CLN2-Protein oder die Zusammensetzung kann in einem System mit kontrollierter
Freisetzung abgegeben werden. Beispielsweise kann es unter Verwendung
von intravenöser
Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, einem transdermalen
Pflaster, Liposomen oder anderen Verabreichungsweisen verabreicht
werden. In einer Ausführungsform
kann eine Pumpe verwendet werden (siehe Langer, oben; Sefton, CRC
Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery
88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)).
In einer anderen Ausführungsform
können polymere
Materialien verwendet werden (siehe Medical Applications of Controlled
Release, Langer and Wise (Hrsg.), CRC Pres., Boca Raton, Florida
(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and
Performance, Smolen and Ball (Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger
and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983);
siehe ebenso Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al.,
Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105
(1989)). In noch einer anderen Ausführungsform kann ein System
mit kontrollierter Freisetzung in der Nähe des therapeutischen Target plaziert
werden, wodurch nur ein Bruchteil der systemischen Dosis erforderlich
ist (siehe z. B. Goodson, in Medical Applications of Controlled
Release, oben, Bd. 2, S. 115–138
(1984)). Bevorzugt wird eine Vorrichtung mit kontrollierter Freisetzung
in einen Patienten in der Nähe
des LINCL-betroffenen Gewebes eingeführt. Andere Systeme mit kontrollierter
Freisetzung werden in dem Überblick
von Langer (Science 249: 1527–1533
(1990)) erläutert.
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Die
folgenden Beispiele sind illustrativ und sollen die Erfindung nicht
einschränken.
Verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denen, die hierin
beschrieben sind, werden dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung
und den beiliegenden Figuren offensichtlich. Diese Modifikationen
sollen innerhalb des Umfangs der Erfindung und der anhängenden
Ansprüche
liegen.
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BEISPIELE
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Plasmidkonstruktion, Zellselektion und
Genamplifikation
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CHO-Zellen
wurden mit Pvul-linearisiertem pMSXNDI-CLN2 (ein Fragment, das den
Nucleotiden 1–1707
von menschlicher CLN2-cDNA (Genbank-Zugangs-Nr. AF017456, 175 Arg
Variante) in dem Expressionsvektor pMXNS [8] entspricht) unter Verwendung
der Lipofectaminverfahrensweise transfektiert (Gibco). Stabile Transfektanten
wurden durch Selektion mit 700 Mikrogramm/ml G418 isoliert, und einzelnen
Kolonien wurden unter Verwendung von Klonungszylindern isoliert.
Selektierte Kolonien wurden mit 0,2 Mikromolar MTX in α-MEM ohne
Nukleotide/10% dialysiertem FKS behandelt, um Zellen zu selektieren,
die der Genamplifikation unterlagen. Wenn Zellen resistent werden,
wurde die MTX-Konzentration erhöht
und die Verfahrensweise wiederholt. Nach zwölf Kreisläufen der Selektion wurden Zellen,
die gegen 400 Mikromolar Methotrexat resistent sind, erhalten.
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Enzymassay
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Der
TPP-I-Aktivitätsassay
wurde unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Vines
and Warburton durchgeführt
(Biochem. Biphys. Acta. 1998 1384 S. 233–42). Wenn nicht anderweitig angegeben,
wurden die Proben in 150 mM Na Cl/0,1% Triton X-100/50 mM Formiat
pH 3,5 für
30 Minuten bei 37°C
vorinkubiert, um proCLN2 in das aktive Enzym umzuwandeln.
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Produktion von rekombinantem CLN2-Protein
in CHO-Zellen.
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Menschliche
Voll-Längen-CLN2-cDNA
wurde in den pMSXND1-Vektor geklont (S-J Lee und D Nathans, 1988
J. Biol. Chem. 263 3521-7). Das resultierende Plasmid enthält eine
CLN2-Expressionskassette, angetrieben durch den Metallothion-I-Promotor, eine Neomycin-Resistenzkassette
zur G418-Selektion und eine Dihydrofolat-Reductase-Expressionskassette
für Methotrexatresistenz
(MTX-Resistenz). CHO-Zellen
wurden mit linearisiertem Plasmid unter Verwendung von Lipofectamin
(Gibco) transfektiert und stabil transfektierte Klone wurden nach der
G418-Selektion isoliert. Die TPP-I-Aktivität in konditioniertem Medium
wurde analysiert, und der höchste
Expressor wurde mit MTX behandelt, um Klone zu selektieren, die
der Genamplifikation unterlagen. Das TPP-I-Aktivitätsniveau
in konditioniertem Medium war um das 15fache gegenüber dem
endogenen Niveau nach der Transfektion und G418-Selektion erhöht und weiter um das > 1000fache gegenüber nicht-transfektierten
Zellen nach der MTX-Amplifikation erhöht (1).
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Die
Kulturbedingungen wurden in einem Ansatz zur Optimierung des Produktionssystems
bewertet. Wir verglichen verschiedene Wachstumsmedien, einschließlich unterschiedlichen
Typen von Standardmedien mit oder ohne fetalem Rinderserum, reduziertem
Serummedium und spezialisierten proteinarmen Formulierungen für CHO-Zelle. Ein repräsentatives
Experiment wird in 2 gezeigt. Gibco CHO-S-SFM-II-Medien führten zur
besten Ausbeute. Jedoch enthalten diese Medien Proteinkomponenten,
die mit der Stromabwärtsreinigung
interferieren können.
Daher entschieden wir uns, selbst wenn das proteinfreie Medium DMEM/F12
eine ungefähr
zweifache niedrigere Ausbeute ergab, dieses Medium für die Herstellungszwecke
zu verwenden.
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Reinigung und Charakterisierung von rekombinantem
CLN2-Protein.
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CHO-Zellkulturmedium
wurde durch Ultrafiltration durch eine YM-30-Membran konzentriert
und der Puffer gegen eine salzarme Lösung ausgetauscht. Das Material
wurde der Anionenaustauschchromatographie auf einer Uno-Q12-Säule (BioRad) unterzogen.
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Das
TPP-I-Aktivitätsprofil
offenbart, daß das CLN2-Protein
den Hauptpeak bei einer Extinktion von 280 darstellt, der bei etwa
150 mM NaCl eluiert (3). Der Vergleich der Proteine,
die in dem Quellmaterial und den Peakanionenaustauschfraktionen vorliegen,
durch denaturierende PAGE (10% NuPAGE, Novex) und Coomassie-Blau-Färbung zeigt,
daß das
65 KDa CLN2-Protein das Hauptprotein in den konditionierten Medien
ist, und daß die
meisten Nebenkomponenten durch Ionenaustauschchromatographie entfernt
werden (4).
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Peakfraktionen
wurden zusammengefaßt und
auf eine Superose-12-Gelfiltrationssäule aufgebracht. Das Protein
eluiert als ein Einzelpeak, der im Vergleich zu Gelfiltrationsstandards
als ein globuläres
Protein von 65 kDa eluiert (5). Dies
gibt an, daß der
CLN2-Proteinpräkursor
als ein Monomer in Lösung
bei pH 7,4 existiert. Man beachte, daß die gesamte Chromatographie
bei leicht alkalischem pH (pH 7,4 bis 8,0) durchgeführt wird,
da der inaktive CLN2-Präkursor
der Autoaktivierung unterliegt, so daß das 46 KDa CLN2-Protein bei
saurem pH aktiviert wird (siehe nachstehend).
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Idealerweise
sollte das rekombinante CLN2-Protein, das für die Enzymsubstitutionstherapie
verwendet wird, Man nose-6-phosphat enthalten, um seine Endozytose
und Abgabe an das Lysosom zu ermöglichen.
Um sein Mannose-6-phosphorylierungsstadium zu untersuchen, wurde
rekombinantes proCLN2 auf eine Säule
eines immobilisierten, von löslichen
Kationen unabhängigen
Mannose-6-phosphat-Rezeptors aufgebracht. Die Säule wurde mit Säulenpuffer
gewaschen, wobei der Säulenpuffer Glucose-6-phosphat
(das nicht an den Mannose-6-phosphat-Rezeptor bindet und möglicherweise etwas
nicht-spezifisch gebundenes Material freisetzen könnte), Mannose-6-phosphat
und Glycinpuffer enthält
(um stark oder nicht-spezifisch gebundenes Material zu eluieren).
Die Fraktionen wurden durch den TPP-I-Aktivitätsassay nach der Autoaktivierung (6)
oder durch SDS-PAGE (Daten nicht gezeigt) analysiert. Im wesentlichen
wurde das gesamte CLN2-Protein auf der Säule zurückgehalten und spezifisch mit
Mannose-6-phosphat eluiert. Dies zeigt, daß rekombinantes CLN2-Protein,
hergestellt in CHO-Zellen, Mannose-6-phosphoryliert ist.
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Autokatalytisches Processing von CLN2-Protein/TPP-I.
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Wenn
es bei neutralem oder alkalischem pH gehalten wird, weist das gereinigte,
von CHO-Zellen produzierte, menschliche, rekombinante CLN2-Protein
eine scheinbare Größe von etwa
65 KDa durch denaturierende PAGE auf (4 und 7a).
Der Edman-Abbau offenbarte, daß der
Aminoterminus (SYSPE ...) dem Rest 20 der translatierten CLN2-Message
entspricht. Dies gibt an, daß das CLN2-Protein
als ein Präproprotein
synthetisiert wird, dessen Signalsequenz nach Rest 19 gespalten
wird, so daß das
proCLN2-Protein
erzeugt wird. Bei der Inkubation bei saurem pH wird das 65 KDa Protein
in eine 46 KDa Spezies umgewandelt, deren Aminoterminus (LHLGV)
dem Rest 196 der translatierten CLN2-Message entspricht. Dieser
Aminoterminus ist identisch mit endogenem CLN2-Protein, das aus menschlichem
Gehirn isoliert ist (Sleat et al 1997, Science 277 S. 1802–1805).
Die kinetische Analyse von stark gereinigtem rekombinantem CLN2-Protein, das
in Insektenzellen produziert wurde, zeigt, daß das proteolytische Processing
von dem Erwerb von enzymatischer Aktivität begleitet wird (7b).
(Man beachte, daß die
CHO-Zellpräparation
für alle
anderen Experimente, die in dieser Anmeldung beschrieben sind, verwendet
wird. Die Insektenzellpräparation
wurde für
diese Analyse verwendet, bevor die CHO-Zellpräparation verfügbar war.
Vorhergehende Experimente zeigen, daß in bezug auf das autokatalytische
Processing die zwei Präparationen
im wesentlichen identisch waren). Diese Daten zeigen, daß das CLN2-Protein
als ein inaktives Proenzym synthetisiert wird und bei der Säuerung der
Autolyse zu einer enzymatisch aktiven Spezies unterliegt.
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Aufnahme von CLN2-Protein durch LINCL-Fibroblasten.
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Wir
führten
Grundexperimente durch, um zu bestimmen, ob rekombinantes CLN2-Protein
zu LINCL-Zellen targetiert werden konnten. Konfluente LINCL-Fibroblasten
wurden mit zunehmenden Konzentrationen an gereinigtem CLN2-Präkursorprotein
für 1,
2, 4 und 8 Tage inkubiert. Zellen wurden hinsichtlich der TPP-I-Aktivität analysiert.
Die Daten werden in bezug auf die Aktivität eines repräsentativen
normalen menschlichen Kontrollfibroblasten ausgedrückt, der
in Abwesenheit des rekombinanten CLN2-Proteins kultiviert wurde.
Die Aufnahme erhöht sich
als eine Funktion der Zeit und Konzentration an zugegebenem exogenem
Enzym (8). Die Aktivitätsassays zeigen, daß relativ
große
Mengen an CLN2-Protein an LINCL-Zellen abgegeben werden können. Nachdem
sie einen Tag 10 nM oder höheren Konzentrationen
von CLN2-Protein ausge setzt waren, war die Aktivität der LINCL-Fibroblasten äquivalent
zu der der normalen Kontrollfibroblasten. Nach 8 Tagen überschreitet
die intrazelluläre
Akkumulation von CLN2-Protein die der Kontrollfibroblasten um bis zu
einem Faktor von etwa 5. Man beachte, daß die Erhöhung der Aktivität gegenüber der
Zeit angibt, daß das
rekombinante CLN2-Protein in Kulturmedien, enthaltend 10% FKS, stabil
ist. Kontrollexperimente geben an, daß der größte Teil, wenn nicht die gesamte
Aufnahme über
Mannose-6-phosphat-Rezeptor-vermittelte Endozytose erfolgt (8).
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Um
die Stabilität
des endozytosierten Enzyms zu bestimmen, wurden doppelte Löcher mit LINCL-Zellen
einen Tag in Vollmedium, das rekombinantes CLN2-Protein enthält, kultiviert.
Die Medien wurden entfernt und durch Vollmedium ersetzt. Die Löcher wurden
hinsichtlich der TPP-I-Aktivität
entweder direkt (Tag 0) oder nach weiteren 1, 2 oder 7 Tagen der
Kultur in Abwesenheit von exogenem CLN2-Protein analysiert. Es wurde
festgestellt, daß das
intrazelluläre
Aktivitätsniveau
für mindestens
3 Tage stabil blieb und noch 70% des normalen Niveaus 7 Tage nach
Enzymentzug aufrechterhalten wurde (9). Dies
gibt an, daß das
internalisierte CLN2-Protein ziemlich stabil ist und eine Halbwertszeit
von mehr als einer Woche aufweist.
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Immunfluoreszenzanalyse.
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Wir
verwendeten konfokale Mikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung mit
Anti-CLN2-Protein-Antisera zur Bestimmung der intrazellulären Lokation
des rekombinanten CLN2-Proteins, das an LINCL-Zellen abgegeben wurde.
Wenn Zellen analysiert werden, die mit 32 nM CLN2-Protein für einen
Tag inkubiert wurden, war das Färbungsmuster
von LINCL-Fibroblasten von dem der normalen Fibroblasten nicht zu
unterscheiden (10). Das Färbungsmuster ist typisch für lysosomale
Marker, was die korrekte Abgabe von rekombinantem Enzym in das lysosomale
Kompartiment zeigt.
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Aufnahme von CLN2-Protein durch kultivierte
Neuronen.
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Um
die Fähigkeit
des rekombinanten Enzyms, an Neuronen abgegeben zu werden, zu bestimmen,
kultivierten wir Rattenkleinhirn-Granulumneuronen mit zunehmenden
Konzentrationen an CLN2-Protein für einen Tag und analysierten
die intrazelluläre
TPP-I-Aktivität
unter Verwendung des kinetischen Assays.
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Kleinhirngranulumneuronen
wurden wie beschrieben aus postnatalen Tag-8-Sprague-Dawley-Rattenjungtieren hergestellt
(Meiners, et al,. (1999) J Neurosci 19, 8443–8453). Die Zellen wurden in
48-Lochplatten bei einer Dichte von 150.000 Zellen/cm2 plattiert.
Waren die Zellen konfluent, wurden die Medien durch frische Medien
ersetzt, die die angegebenen Konzentrationen von gereinigtem rekombinantem
menschlichem CLN2-Protein (0,5 ml) enthielten. Direkt vor der Verarbeitung
wurden die Zellen dreimal mit PBS (0,5 ml) bei Raumtemperatur gewaschen
und dann schnell durch Plazieren der Schalen in einem Eiswasserbad
abgekühlt.
Die Zellen wurden durch Zugeben von 1% Nonidet P40/10 mM Tris pH 7,5/150
mM NaCl(0,2 ml/Loch) lysiert und für 1 Stunde bei 4°C auf einer
Schüttelplattform
inkubiert. Das Lysat wurde in Mikrofugenröhrchen übertragen und für 20 min
bei 13.000 × g
zentrifugiert. Der Überstand wurde
für Enzymaktivitäts- und
Proteinassays verwendet (Lowry, et al. (1951) J Biol Chem 193, 265–275).
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In
Abhängigkeit
davon, wie die Proben verarbeitet wurden (12, Legende),
spiegelt die TPP-I-Aktivität
entweder das reife CLN2-Protein (Dreiecke) oder sowohl das Präkursor-
als auch das reife CLN2-Protein (Kreise), die innerhalb der Neuronen
vorliegen, wider (12). Bei Konzentrationen an
rekombinantem CLN2-Protein, bei denen es eine signifikante Erhöhung der
TPP-I-Aktivität
gegenüber endogenen
Niveaus gab (> 3 nM
in Abwesenheit von M6P und > 10
nM in Gegenwart von M6P), was eine zuverlässige Berechnung des endozytosierten
Proteins ermöglicht,
lagen ~ 80% des endozytosierten CLN2-Proteins in der reifen Form
vor (12). Dies zeigt, daß das Enzym zu einem sauren
intrazellulären
Kompartment targetiert wird, aber daß dieses Verfahren langsamer
oder weniger effizient ist als in Fibroblasten. Ebenso war im Gegensatz
zu Fibroblasten die Aufnahme bei hohen CLN2-Protein-Konzentrationen nicht
sättigend.
Jedoch war die M6P-inhibierbare Aufnahme sättigbar (12,
Nebenbild, EC50 6–8
nM), was zeigt, daß es
bei hohen Konzentrationen eine beträchtliche Aufnahme durch MPR-unabhängige Mechanismen
gab. Trotzdem wurden, selbst wenn MPR-unabhängige Mechanismen vorherrschen,
~ 80% des endozytosierten Enzyms in die aktive Form umgewandelt,
was geeignetes lysosomales Targeting des rekombinanten CLN2-Proteins
zeigt.
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Die
hier dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante CLN2-Protein
effizient durch LINCL-Fibroblasten endozytosiert und zu Lysosomen targetiert
wird. Jedoch, wenn eine Enzymsubstitution als eine mögliche Therapie
für LINCL
erwogen wird, ist es wichtig zu zeigen, daß das endozytosierte Enzym
funktionell äquivalent
zu dem nativen Enzym ist, und den biochemischen Phänotyp der
Krankheit korrigieren kann. Ein biochemisches Kennzeichen für LINCL
ist die Akkumulation von Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit
c (Untereinheit c) in Lysosomen. Wir kultivierten LINCL-Fibroblasten
in Gegenwart oder Abwesenheit von CLN2-Protein und bestimmten die
relativen Niveaus an Untereinheit c durch Western-Blot (11).
Die Enzymbehandlung verringerte dramatisch die Untereinheit c auf
Niveaus, die denen der nicht betroffenen Fibroblasten nahe kommen
(11), was zeigt, daß rekombinantes CLN2-Protein
den Stoffwechselfehler in LINCL-Zellen korrigieren kann.
-
Die
obigen Beispiele stellen ein Produktionssystem für rekombinantes menschliches
CLN2-Protein bereit und zeigen, daß dieses Protein an Lysosome
von LINCL-Fibroblasten
mit CLN2-Protein-Mangel abgegeben werden kann und den Stoffwechselfehler
korrigiert. Ähnliche
CHO-basierende Produktionssysteme wurden verwendet, um große Mengen anderer
lysosomaler Enzyme für
die Proteincharakterisierungs- und Enzymsubstitutionsstudien herzustellen
(Kakkis, et al. (1994) Protein Expr Purif 5, 225–232; Ioannou et al. (1992)
J Cell Biol 119, 1137–1150;
Bielicki, J., et al. (1998) Biochem J 329, 145–150; Martiniuk et al. (2000)
Biochem Biophys Res Commun 276, 917–923). Übereinstimmend mit unseren
Ergebnissen führt
die Überexpression
eines gegebenen rekombinanten lysosomalen Enzyms typischerweise
zu seiner unverhältnismäßigen Sekretion
(Kakkis, Ioannou).
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Die
Eigenschaften des CLN2-Proteinpräkursors
unterscheiden sich in einer Vielzahl von Aspekten von denen des
reifen Proteins. Zunächst
ist der Präkursor
enzymatisch inaktiv, aber wird bei der Säuerung autokatalytisch zu der
reifen, aktiven Form verarbeitet. Zweitens wird das reife Enzym
schnell inaktiviert, wenn es bei 37°C bei neutralem pH inkubiert wird
(Sohar et al. (1999) J Neurochem 73, 700–711; Vines, D. and Warburton,
M. J. (1998) Biochim Biophys Acta 1384, 233–242. Im Gegensatz dazu ist
das Proenzym bei neutralem pH (4) stabil
und kann anschließend
in die aktive Form umgewandelt werden (12). Schließlich scheinen
die quartäre Struktur
und physikalischen Eigenschaften des Proenzyms und reifen Enzyms
völlig
unterschiedlich zu sein. Beispielsweise nutzen veröffentlichte
Verfahren zur Reinigung von reifem CLN2-Protein/TPP-I aus Säugergeweben
ein Detergens, um das Protein in Lösung zu halten (Vines and Warburton;
Doebber et al. (1978) Endocrinology 103, 1794–1804; McDonald et al. (1985)
Biochem Biophys Res Commun 126, 63–71; Watanabe et al. (1992)
Biochem Int 27, 869–877;
Page et al. (1993) Arch Biochem Biophys 306, 354–359; Junaid et al. (2000)
J Neurochem 74, 287–294),
und Gelfiltrationsanalyse zeigt, daß das reife Protein Aggregate
von 250 bis 700 KDa bildet (McDonald et al.; Page et al.). Im Gegensatz
dazu zeigen wir hier, daß sich
das Proenzym wie ein lösliches
Monomer verhält.
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Rekombinantes
CLN2-Protein, hergestellt aus CHO-Zellen, wies eine Vielzahl von
Eigenschaften auf, die für
die Enzymsubstitutionstherapie bei LINCL als nützlich erscheinen. Zunächst sollten,
da das Proenzym inaktiv und in einer extrazellulären Umgebung bis zur Abgabe
an das Lysosom stabil ist und die reife Form mit geringer Aktivität bei neutralem pH
instabil ist, Bedenken über
unerwünschte
Proteolyse von extrazellulären
Strukturen durch TPP-I-Aktivität
nach der Enzymverabreichung minimiert werden. Zweitens wird das
Protein effizient an das Lysosom durch M6P-vermittelte Endozytose (Fibroblasten
und Neuronen) und möglicherweise
durch andere endozytische Mechanismen (Neuronen) abgegeben. Drittens
stellt das endozytosierte Enzym die mangelnde TPP-I-Aktivität von LINCL-Fibroblasten
wieder her. Viertens kann das internalisierte CLN2-Protein einen
biochemischen Marker der Krankheit umkehren, d. h. Speicherung von
Mitochondrien-ATP-Synthaseuntereinheit c. Schließlich weist das internalisierte
aktive Protein eine lange Halbwertszeit in dem Lysosom auf, was
bei der Erwägung von
Dosierungsregimes wichtig sein wird.
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Unsere
Ergebnisse zeigen, daß große Mengen
an rekombinantem CLN2-Protein ohne weiteres aus unserem CHO-Zellsystem
erhalten werden können.
Dies wird die Enzymsubstitutionsstudien in Tiermodellen und die
Entwicklung von neuartigen Abgabeverfahren für die Behandlung von LINCL
erleichtern.
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Alle
Basengrößen und
Aminosäuregrößen und
alle Molekulargewichts- und Molekularmassewerte, die für Nukleinsäuren oder
Polypeptide angegeben sind, sind ungefähr und werden für die Beschreibung
bereitgestellt.
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Die
vorliegende Erfindung ist nicht in bezug auf die speziellen Ausführungsformen,
die in dieser Anmeldung beschrieben sind, beschränkt, die als Einzeldarstellungen
von einzelnen Aspekten der Erfindung gedacht sind. Funktionell äquivalente
Verfahren und Vorrichtungen innerhalb des Umfangs der Erfindung
werden zusätzlich
zu den hierin aufgezählten dem
Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung und den beiliegenden
Zeichnungen offensichtlich werden. Diese Modifikationen und Variationen sollen
innerhalb des Umfangs der anhängenden
Ansprüche
liegen.