DE60128011T2

DE60128011T2 - Abgabesystem für antineoplastische arzneistoffe auf basis dendritischer polymere

Info

Publication number: DE60128011T2
Application number: DE60128011T
Authority: DE
Inventors: Navid Malik; Ruth Duncan; Donald A. Midland TOMALIA; Roseita Esfand
Original assignee: Dendritic Nanotechnologies Inc
Current assignee: Dendritic Nanotechnologies Inc
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2021-10-30
Also published as: EP1439859A1; CN1558777A; JP2005507933A; DE60128011D1; WO2003037383A1; ATE359828T1; EP1439859B1

Description

Diese Erfindung betrifft die Behandlung von Krebs in Tieren, insbesondere in Menschen, unter Verwendung dendritischer Polymerkonjugate, in welchen ein antineoplastisches Arzneimittel zugegen ist.
Die Verwendung von Polymeren als Träger für Arzneimittel, insbesondere für jene Arzneimittel, welche bei physiologischem pH-Wert eine geringe Wasserlöslichkeit besitzen, für normales Gewebe toxisch sind, oder nicht in ausreichender Dosis verabreicht werden können, hat in den vergangenen Jahren Interesse erweckt [z. B. H. Ringsdorf, J. Polymer Sci.: Symp. 51, 135–153 (1975)]. Ein Polymerträger für antineoplastische Arzneimittel würde im Hinblick auf deren Löslichkeit, Toxizität und höhere Dosierung bei Zuführbedingungen ein nützliches System zur Verabreichung dieser Arzneimittel bereitstellen. Verschiedene Versuche im Hinblick auf eine Zuführung von Doxorubicin veranschaulichen diese Anstrengungen [z. B. R. Duncan et al., "Preclinical Toxicology of a Novel Polymeric Antitumor Agent: I-copolymerdoxorubicin (PK1)", Hum. Exp. Toxiocol. 17(2), 93–104 (1998); P.A. Vassey et al., "Phase I Clinical and Pharmacokinetic Study of PK1 [N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide Copolymer Doxorubicin]: First Member of a New Class of Chemotherapeutic Agents – Drug-Polymer Conjugates", Clin. Cancer Res. 5, 83–94 (1999); L.W. Seymour et al., "N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide Copolymers Targeted to the Hepatocyte Galactose-receptor; Pharmacokinetics in DBA₂ Mice", Br. J. Cancer 63, 859–866 (1991)].
Die Aussicht auf eine Verwendung dendritischer Polymere als Abgabesystem oder Träger im Rahmen der Arzneimittelzuführung wurde vor kurzem aufgrund der einzigartigen Struktur und Eigenschaften dieser Polymermoleküle vorgeschlagen [R. Esfand und D.A. Tomalia, "Poly(amidoamine) (PAMAM) Dendrimers: from Biomimicry to Drug Delivery and Biomedical Applications", Research Focus, DDT 6(8), 427–436 (8. April 2001); US Patente 5,338,532 und 5,527,524; Kojima et al., Bioconjugate Chemistry 11(6): 910–917 (2000); WO 01/07469; Uhrich, K., Trends in Polymer Science 5(12), 388–393 (1997)]. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass die Funktionalität der äußeren Oberfläche und die inneren morphologischen Eigenschaften dendritischer Polymermoleküle im Hinblick auf die Entwicklung neuer Verfahren zur kontrollierten Arzneimittelfreisetzung sowie zielgerichteter Arzneimittelzuführsysteme äußerst vielversprechend zu sein scheinen. Allerdings wurde in spezifischen Bereichen der Arzneimittelzuführung relativ wenig Arbeitsaufwand betrieben. Insbesondere wurde die Verwendung dendritischer Polymere als effektive Abgabesysteme für spezifische Antitumormittel bislang nicht demonstriert.
Bestimmte Platin-enthaltende Verbindungen, insbesondere Carboplatin (cis-Diammin(1,1-cylobutandicarboxylato)platin (II) und Cisplatin (cis-Diammindichlorplatin), wurden zur Behandlung von Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Hodenkrebs, Brustkrebs, Magenkrebs und Lymphom verwendet. Allerdings war die Verwendung von Carboplatin und Cisplatin aufgrund der unspezifischen Toxizität und schlechten Wasserlöslichkeit dieser Platin-enthaltenden Verbindungen relativ beschränkt.
Um die mit Cisplatin und Carboplatin assoziierten Probleme in Bezug auf unspezifische Toxizität und Wasserlöslichkeit zu überwinden, wurde die Verwendung linearer Polymere als Träger für diese Arzneimittel vorgeschlagen. Allerdings besitzt die Verwendung linearer Polymere als Abgabesystem in Arzneimittelzuführsystemen verschiedene Nachteile. Ein Hauptnachteil der linearen polymeren Arzneimittelträger ist, dass sie heterogen sind und polydisperse Zusammensetzungen darstellen, welche Pofymermoleküle mit einer Vielzahl an unterschiedlichen Molekulargewichten enthalten, die eine beschränkte Anzahl an funktionellen Gruppen und/oder reaktiven Stellen aufweisen. Da lineare Polymerzusammensetzungen nicht aus Molekülen mit einer exakt definierten Struktur bestehen, bereitet es größere Schwierigkeiten, einheitliche Polymereigenschaften, einheitliche Arzneimittelzuführeigenschaften und eine einheitliche therapeutische Wirksamkeit aufrechtzuerhalten. Infolgedessen gestaltet es sich relativ schwierig, eine behördliche Zulassung für die Verbundstoffe aus linearem Polymer und Arzneimittel zu erhalten. Ein weiterer mit der Verwendung linearer Polymere als Arzneimittelträger verbundener Nachteil ist, dass der Ort, und damit die Verfügbarkeit des Arzneimittels schwer zu kontrollieren ist. Insbesondere muss das Arzneimittel entweder kovalent oder nicht-kovalent in statistisch unberechenbarer Art und Weise gebunden sein, wobei der linearen Polymerstruktur wohldefinierte Frachträume für das Arzneimittel fehlen. Die Tendenz des Arzneimittels in Richtung einer Einlagerung in das lineare Polymer führt aufgrund der uneinheitlichen oder heterogenen Eigenschaften der linearen Polymermoleküle zu einer größeren Unberechenbarkeit, und führt zu einer verringerten Arzneimittelwirksamkeit, da ein signifikanter Anteil der Arzneimittelmoleküle der behandelten Zelle nicht effektiv dargebracht wird. In einigen Fällen kann die statistische Knäuelstruktur der linearen Polymere sogar eine erfolgreiche Bindung des Arzneimittels innerhalb des Knäuels verhindern und zu passivem Einschluss führen, was zu unkontrollierter Arzneimittelfreisetzung (z. B. statistisch diffuses System), d. h. zu mangelnder Einheitlichkeit in Bezug auf den Zeitpunkt der Arzneimittelfreisetzung, führt.
Demzufolge wäre es überaus wünschenswert, ein genau definiertes Arzneimittelzuführsystem für Cisplatin und Carboplatin sowie für hiermit in Beziehung stehende antineoplastische Mittel bereitzustellen, welches eine hohe Arzneimittelwirksamkeit, eine hohe Arzneimitteltragfähigkeit, eine gute Wasserlöslichkeit, eine gute Lagerstabilität, eine verringerte Toxizität und in vivo eine verbesserte Antitumoraktivität aufweist.
US Patent 5,338,532 lehrt Polymerkonjugate, welche dichte Polymere umfassen, die mit einem geträgerten Material assoziiert sind. [Eine Art dichter Sternpolymere sind Starburst^®-Polymere (Warenzeichen von The Dow Chemical Company), in welchen das Dendrimer ein Polyamidoamin (PAMAM) ist.] Eine Vielzahl geeigneter Anwendungen für derartige Konjugate wird in US Patent 5,332,532 ausführlich erläutert, umfassend die Verwendung dieser Konjugate als Zuführvehikel für biologisch aktive Mittel. Die Verwendung von Polymerkonjugaten als Zuführvehikel für Cisplatin, Carboplatin, Titanocendichlorid und Diorganozinndihalogenide oder andere antineoplastische Mittel lehrt, beansprucht oder auch erwähnt US Patent 5,338,532 allerdings nicht spezifisch. US Patent 5,338,532 nennt beispielhaft lediglich die Verwendung von Metallen mit einer Wertigkeit von Null sowie von ionischen oder radioaktiven Metallen, wobei insbesondere Fe, Rh, Pd, Y, Fn, Pb, Gd, Mn und Gd als Beispiele angegeben sind.
Eine vor kurzem erschienene Publikation offenbarte die Verwendung von Dendrimeren als Träger für die Zuführung von Cisplatin, d. h. „Dendrimer-platinate: a Novel Approach to Cancer Chemotherapy", Anti-Cancer Drugs, 10, 767–776 (1999). Diese Publikation befasst sich insbesondere mit der Bildung eines Dendrimer-Cisplatin-Konjugats, d. h. eines Dendrimer-Platinats. Gemäß dieser Publikation wird das Dendrimer-Cisplatin-Konjugat durch eine kovalente oder ionische Wechselwirkung zwischen der Oberfläche des Dendrimers und dem Platin des Cisplatins gebildet, wobei in dem Prozess ein Chloridion freigesetzt wird. Dieses Assoziationsverfahren unterscheidet sich von jenem der vorliegenden Erfindung, welches die Konjugation des dendritischen Polymers mit einem antineoplastischen Mittel (z. B. Cisplatin, Carboplatin und anderen metallhaltigen Analoga hiervon) durch Verkapselung des antineoplastischen Mittels im Inneren des dendritischen Polymers umfasst. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erweist sich gegenüber jenem dieser Publikation als vorteilhaft, da das verkapselte Konjugat der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitstellt, welches eine höhere Zuführdosis eines antineoplastischen Mittels einer im Vergleich zu Cisplatin breiteren Klasse in Kombination mit einer Verringerung der Toxizität koppelt.
Diese Erfindung betrifft dendritische Polymerkonjugate, welche nützliche Arzneimittelzuführsysteme für einen Transport von Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin, Teraplatin, Platin-DACH, Ormaplatin, Titanocendichlorid, Vanadocendichlorid, Niobocendichlorid, Molybdänocendichlorid, Rhenocendichlorid, sowie von Diorganozinndihalogeniden oder anderen metallhaltigen antineoplastischen Mitteln (im Folgenden „antineoplastische dendritische Polymerkonjugate"), bevorzugt von Cisplatin und Carboplatin sowie anderen auf Platin basierenden Analoga (im Folgenden „Konjugate aus dendritischem Polymer und auf Platin basierendem Analogon"), stärker bevorzugt von Cisplatin (im Folgenden „Konjugate aus dendritischem Polymer und Cisplatin") als antineoplastische Mittel zu malignen Tumoren darstellen und als Antitumormittel fungieren. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Behandlung maligner Tumore unter Verwendung dieser antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate sowie ein Verfahren zur Herstellung eines antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugats, welches für einen Transport von Platin (Pt)-, Titan (Ti)-, Zinn (Sn)-, Vanadium (V)-, Niobium (Nb)-, Molybdän (Mo)- oder Rhenium (Re)-enthaltenden Verbindungen, wie den vorstehend genannten Mitteln (kollektiv „antineoplastische Mittel"), zu malignen Tumoren von Nutzen ist.
Die antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate umfassen ein dendritisches Polymer, welches mit einem antineoplastischen Mittel konjugiert ist, wobei ein antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat gebildet wird, z. B. ein auf Platin basierendes dendritisches Polymerkonjugat. Diese antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate werden durch Bereitstellen eines dendritischen Polymers mit funktionellen Gruppen oder Chelatgruppen, welche für das antineoplastische Mittel zugänglich sind und mit den funktionellen Gruppen oder Chelatgruppen wechselwirken können (über einen Linker an die Oberfläche des Dendrimers oder bevorzugt im Inneren des Dendrimers chelatisiert – „Frachtraum"), Inkontaktbringen des dendritischen Polymers mit dem antineoplastischen Mittel, wodurch die Aufnahme und Verkapselung des antineoplastischen Mittels durch das dendritische Polymer über kovalente und/oder nicht-kovalente Wechselwirkungen, z. B. eine physikalische Verkapselung im Inneren des Dendrimers, eine partielle oder vollständige Verteilung in allen Teilen des Dendrimers, oder eine Verknüpfung mit dem Dendrimer über eine Chelatgruppe, oder eine beliebige Kombination hiervon, ermöglicht wird, wobei die Bindung oder Verknüpfung mittels kovalenter Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, Adsorption, Adsorption, Metallbindung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung, van der Waals-Kräfte, oder Ionenbindung, oder eine beliebige Kombination hiervon erfolgt. Diese antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate werden einem Tier, welches einen malignen Tumor aufweist, in einer zur effektiven Hemmung des Wachstums des malignen Tumors wirksamen Menge bevorzugt intravenös (I.V.) verabreicht, obwohl andere Verfahren, wie beispielsweise eine orale, parentale (I.P.), subkutane (S.C.), intramuskuläre, intraarterielle oder topische Verabreichung, ebenfalls möglich sind.
Das antineoplastische dendritische Polymerkonjugat führt zu einem Antitumormittel, welches eine unerwartete und überraschend hohe Wirksamkeit und Arzneimittelträgfähigkeit, sowie ein unerwartetes und überraschend hohes Dosierungsvermögen aufweist. Das antineoplastische dendritische Polymerkonjugat zeigt darüber hinaus eine überraschende und unerwartete Verringerung der Toxizität, eine gute Wasserlöslichkeit, eine gute Lagerstabilität, sowie in vivo eine verbesserte Antitumoraktivität. Am bedeutendsten ist jedoch die Feststellung, dass diese antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate in B16F10-Tumormodellen wirksam sind, von welchen bekannt ist, dass sie gegenüber Cisplatin bei dessen maximal tolerabler Dosis bei I.V. Verabreichung (etwa 1 mg/kg) resistent sind.
1 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt kationischer Dendrimere auf die Hämolyse von Rattenerythrozyten nach 1 Stunde zeigt;
2 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt anionischer Dendrimere auf die Hämolyse von Rattenerythrozyten nach 1 Stunde zeigt;
3 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt anionischer Dendrimere auf B16F10-Zellen nach 72 Stunden zeigt;
4 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt kationischer Dendrimere auf B16F10-Zellen nach 72 Stunden zeigt;
5 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt kationischer Dendrimere auf CCRF-CEM-Zellen nach 72 Stunden zeigt;
6 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt anionischer Dendrimere auf CCRF-CEM-Zellen nach 72 Stunden zeigt;
7 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt anionischer Dendrimere auf HepG2-Zellen nach 72 Stunden zeigt;
8 ist eine graphische Darstellung, welche den Effekt kationischer Dendrimere auf HepG2-Zellen nach 72 Stunden zeigt;
11 ist eine graphische Darstellung, welche die Freisetzung von Cisplatin aus einem Dendrimer-Platinat bei zwei physiologischen pH-Bedingungen nach 72 Stunden und 37°C zeigt;
10 ist ein Balkendiagramm, welches den Effekt einer intraperitonealen Injektion einer Behandlung mit Dendrimer-Platin-Konjugat auf intraperitoneal injizierte Tumore zeigt;
11 ist ein Balkendiagramm, welches den Effekt eines Dendrimer-Platin-Konjugats auf etabliertes B16-Melanom zeigt;
12 ist eine graphische Darstellung, welche die Anreicherung von Dendrimer-Platin und Platin, welche intravenös in C57-Mäuse mit subkutan implantiertem B16F10-Tumor injiziert wurden, zeigt.
Die dendritischen Polymere, welche zur Bildung antineoplastischer dendritischer Polymerkonjugate verwendet werden können, umfassen im Allgemeinen eine beliebige der bekannten dendritischen Strukturen, umfassend Dendrimere, kontrolliert hyperverzweigte Polymere, Dendrigrafts und statistisch hyperverzweigte Polymere. Dendritische Polymere sind Polymere mit dicht verzweigten Strukturen, welche eine große Anzahl an reaktiven Gruppen aufweisen. Ein dendritisches Polymer umfasst verschiedene Schichten oder Generationen sich wiederholender Einheiten, welche allesamt einen oder mehrere Verzweigungspunkte enthalten. Dendritische Polymere, umfassend Dendrimere und hyperverzweigte Polymere, werden durch Kondensationsreaktionen monomerer Einheiten hergestellt, welche nach der Verknüpfung mindestens zwei reaktiven Gruppen aufweisen. Die Dendrimere, welche verwendet werden können, umfassen jene, welche aus einer Vielzahl von Dendronen bestehen, die aus einem gemeinsamen Kern hervorgehen, bei welchem es sich um ein einzelnes Atom oder um eine Gruppe von Atomen handeln kann. Jedes Dendron besteht im Allgemeinen aus an der Oberfläche befindlichen Endgruppen, im Inneren liegenden Verzeigungspunkten mit Verzweigungsfunktionalitäten von größer oder gleich zwei, sowie zweibindigen Verbindungselementen, welche benachbarte Verzweigungspunkte kovalent miteinander verbinden. Für einen Übersichtsartikel auf diesem Gebiet siehe beispielsweise Donald A. Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Engl. 29, 138–175 (1990).
Dendronen und Dendrimere können durch konvergente oder divergente Synthese hergestellt werden
Die divergente Synthese von Dendronen und Dendrimeren umfasst einen molekularen Wachstumsprozess, welcher in einer aufeinander folgenden Serie geometrisch fortschreitender, schrittweiser Additionen von Ästen auf Ästen in radial nach außen führender molekularer Richtung erfolgt, wobei eine geordnete Anordnung geschichteter verzweigter Zellen erzeugt wird. Jedes dendritische Makromolekül umfasst eine als Kern fungierende Verzweigungszelle, eine oder mehrere Schichten von im Inneren liegenden Verzweigungszellen, sowie eine äußere Schicht von an der Oberfläche befindlichen Verzweigungszellen, wobei jede der Zellen einen einzelnen Verzweigungspunkt umfasst. Die Zellen können in Bezug auf ihre chemische Struktur und ihre Verzweigungsfunktionalität gleich oder verschieden sein. Die an der Oberfläche befindlichen Verzweigungszellen können entweder chemisch reaktive oder passive funktionelle Gruppen enthalten. Chemisch reaktive Oberflächengruppen können für eine weitere Ausdehnung des dendritischen Wachstums oder für eine Modifizierung der Oberflächen der dendritischen Moleküle verwendet werden. Die chemisch passiven Gruppen können zur physikalischen Modifizierung des dendritischen Inneren oder der dendritischen Oberflächen verwendet werden, um auf diese Weise das Verhältnis von hydrophoben zu hydrophilen Enden anzupassen. Auf diese Weise kann man die Löslichkeit eines Gastmoleküls im Inneren des dendritischen Polymers oder die Solubilisierung des dendritischen Behälters in einem bestimmten Lösungsmittel verbessern. (Siehe beispielsweise für dichte Sternpolymere US Patente 4,507,466; 4,588,120; 4,568,737; 4,631,337; 4,587,329; und 4,737,550; WO 84/02705; EP 0 115 771 ; und EP 0 608 908 ; für stäbchenförmige dichte Sternpolymere US Patent 4,694,064; EP 0 234 4008 ; und EP 0 556 871 ; für dichte Sternpolymere mit hydrophober äußerer Hülle US Patent 5,560,929 und EP 0 680 495 ).
Die konvergente Synthese von Dendrimeren und Dendronen umfasst einen Wachstumsprozess, welcher dort seinen Anfang nimmt, wo einmal die Oberfläche des Dendrons oder Dendrimers ausgebildet wird, und welcher in molekularer Richtung betrachtet radial in Richtung eines Schwerpunkts oder Kerns fortschreitet. (Siehe beispielsweise US Patent 5,041,516). Die dendritischen Polymere können ideal oder nicht-ideal, d. h. unvollkommen oder fehlerhaft, sein. Fehler sind normalerweise eine Folge von entweder unvollständigen chemischen Reaktionen oder von unvermeidbaren, konkurrierenden Nebenreaktionen. In der Praxis sind reale dendritische Polymere im Allgemeinen nicht-ideal, d. h. sie enthalten bestimmte Mengen an strukturellen Fehlern.
Die hyperverzweigten Polymere, welche verwendet werden können, repräsentieren eine Klasse dendritischer Polymere, welche, verglichen mit der nahezu perfekten, regelmäßigen Struktur von Dendronen und Dendrimeren, ein hohes Ausmaß an nicht-idealen, unregelmäßigen Verzweigungen enthalten. Insbesondere enthalten hyperverzweigte Polymere eine relativ hohe Anzahl an unregelmäßigen Verzweigungsbereichen, in welchen nicht jede Wiederholungseinheit einen Verzweigungspunkt enthält.
Die Herstellung und Charakterisierung von Dendrimeren, Dendronen, statistisch hyperverzweigten Polymeren, kontrolliert hyperverzweigten Polymeren und Dendrigrafts (kollektiv „dendritische Polymere") ist wohlbekannt. Beispiele für Dendrimere und Dendronen sowie Verfahren zu deren Synthese sind in den US Patenten 4,410,688, 4,507,466; 4,558,120; 4,568,737; 4,587,329; 4,631,337; 4,694,064; 4,713,975; 4,737,550; 4,871,779 und 4,857,599 dargelegt. Beispiele für hyperverzweigte Polymere und Verfahren zu deren Herstellung sind beispielsweise in den US Patenten 5,418,301 und 5,514,764 dargelegt. Beispiele für Dendrigrafts und Verfahren zu deren Herstellung sind beispielsweise in einem Artikel von D.A. Tomalia und R. Esfand, Chem. & Ind., 416–420 (2. Juni 1997) dargelegt.
Die dendritischen Polymere oder Makromoleküle, welche in der Praxis dieser Erfindung von Nutzen sind, sind durch einen relativen hohen Verzweigungsgrad gekennzeichnet, welcher als zahlengemittelter Anteil der Verzweigungsgruppen pro Molekül definiert ist, d. h. dem Verhältnis von Endgruppen plus Verzweigungsgruppen zur Gesamtzahl an Endgruppen, Verzweigungsgruppen und linearen Gruppen (Linergruppen). Für ideale Dendronen und Dendrimere beträgt der Verzweigungsgrad 1, während der Verzweigungsgrad für lineare Polymere 0 ist. Hyperverzweigte Polymere weisen einen Verzweigungsgrad auf, welcher zwischen jenem von linearen Polymeren und jenem von idealen Dendrimeren liegt, bevorzugt von mindestens etwa 0.5 oder höher. Der Verzweigungsgrad wird wie folgt angegeben:
wobei N_x die Anzahl der Einheiten des Typs x in der Struktur ist. Sowohl terminate (Typ t) als auch verzweigte (Typ b) Einheiten tragen zur vollverzweigten Struktur bei, während lineare (Typ 1) Einheiten den Verzweigungsfaktor verringern, womit 0 ≤ fbr ≤ 1ist, wobei f_br = 0 den Fall eines linearen Polymers darstellt und f_br = 1 den Fall eines vollverzweigten Makromoleküls darstellt.
Dendritische Polymere umfassen darüber hinaus Makromoleküle, welche im Allgemeinen als Kaskadenmoleküle [z. B. E. Buhleier et al., Synthesis 155–158 (Feb. 1978)], Arborole [z. B. US Patente 5,376,690 und 5,210,309], arboreszente Pfropfmoleküle, Tektodendrimere [z. B. Srinivas Uppuluri et al., "Tecto(dendrimer) Core-shell Molecules: Macromolecular Tectonics for the Systematic Synthesis of Larger Controlled Structure Molecules" PMSE, Frühjahrstreffen (21.–25. März 1999), 55–56], und dergleichen bezeichnet werden. Geeignete dendritische Polymere umfassen darüber hinaus verbrückte dendritische Polymere, d. h. dendritische Makromoleküle, welche entweder an auf der Oberfläche befindliche funktionelle Gruppen oder über ein verknüpfendes Molekül, das an der Oberfläche befindliche funktionelle Gruppen miteinander verbindet, miteinander verknüpft sind, sowie dendritische Polymeraggregate, welche mittels physikalischer Kräfte zusammengehalten werden. Ebenfalls umfasst sind sphärisch geformte dendritische Polymere (z. B. US Patente 4,507,466; 4,588,120; 4,568,737; 4,631,337; 4,587,329 und 4,737,550) sowie stäbchenförmige dendritische Polymere (z. B. US Patent 4,694,064), welche aus einem polymeren Kern erwachsen. Weitere dendritische Polymere, welche für eine Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen alle grundlegenden dendritischen Strukturen, in welchen sich spezifische chelatisierende Gruppen oder Einheiten entweder im zentralen Kern des Dendrimers befinden und/oder in der inneren Struktur auf den Armen der Dendronen lokalisiert sind und/oder auf der Oberfläche des Dendrimers lokalisiert sind. Alle der vorstehend genannten Dendrimerbezeichnungen sind dahingehend auszulegen, dass sie von dem Begriff „dendritische Polymere" umfasst sind.
Die dendritischen Polymere können in Bezug auf die Generationen monodispers oder polydispers sein. Dendritische Polymere in einer monodispersen Lösung sind im Wesentlichen alle von der gleichen Generation, und weisen daher eine einheitliche Größe und Form auf. Die dendritischen Polymere in einer polydispersen Lösung umfassen eine Verteilung von Polymeren unterschiedlicher Generationen. Die dendritischen Polymermoleküle, welche verwendet werden können, umfassen Gemische unterschiedlicher innerer und äußerer Zusammensetzungen oder Funktionalitäten. Beispiele geeigneter dendritischer Polymere umfassen Poly(ether)-Dendronen, -Dendrimere und -hyperverzweigte Polymere, Poly(ester)-Dendronen, -Dendrimere und -hyperverzweigte Polymere, Poly(thioether)-Dendronen, -Dendrimere und -hyperverzweigte Polymere, Poly(aminosäure)-Dendronen, -Dendrimere und -hyperverzweigte Polymere, dendritische Poly(arylalkylenether)-Polymere sowie Poly(propylenimin)-Dendronen, -Dendrimere und -hyperverzweigte Polymere. Es wurde festgestellt, dass insbesondere Poly(amidoamin)(PAMAM)-Dendrimere zur Herstellung der metallhaltigen antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate dieser Erfindung von Nutzen sind.
Dendritische Poymere, welche von Nutzen sind, umfassen jene mit symmetrischen Verzweigungszellen (Arme gleicher Länge, z. B. PAMAM-Dendrimere; beispielsweise beschrieben in US Patent 5,527,524) und jene mit unsymmetrischen Verzweigungszellen (Arme unterschiedlicher Länge, z. B. Lysin-verzweigte Dendrimere; beispielsweise beschrieben in US Patent 4,410,688), verzweigte Dendrimere, Kaskadenmoleküle [z. B. E. Buhleier et al., Synthesis 155–158 (Feb. 1978)], Arborole [z. B. US Patente 5,376,690 und 5,210,309], und dergleichen.
* Der Begriff „dendritisches Polymer" umfasst darüber hinaus sogenannte „hyperkammverzweigte" Polymere. Diese umfassen nicht-vernetzte polyverzweigte Polymere, welche hergestellt werden durch (1) Erzeugen einer erstes Satzes linearer Polymeräste durch Initiieren der Polymerisation eines ersten Satzes von Monomeren, welche während der Polymerisation gegenüber Verzweigung und Aufpfropfung entweder geschützt oder nicht-reaktiv sind, wobei jede der Verzweigungen nach Beendigung der Polymerisation eine reaktive terminale Einheit aufweist, und wobei die reaktiven terminalen Einheiten nicht miteinander reagieren können; (2) Aufpfropfen der Äste auf ein Kernmolekül oder ein Kernpolymer, welches eine Vielzahl an zur Reaktion befähigten reaktiven Stellen aufweist, wobei sich die reaktiven Endgruppen auf den Ästen befinden; (3) entweder Entschützen oder Aktivieren einer Vielzahl monomerer Einheiten auf jedem der Äste, um reaktive Stellen zu erzeugen; (4) getrenntes Erzeugen eines zweiten Satzes linearer Polymeräste durch Wiederholen von Schritt (1) mit einem zweiten Satz von Monomeren; (5) Anbringen des zweiten Satzes von Ästen an den ersten Satz von Ästen durch Umsetzen der reaktiven Endgruppen des zweiten Satzes von Ästen mit den reaktiven Stellen auf dem ersten Satz von Ästen, und anschließend Wiederholen der vorstehend genannten Schritte (3), (4) und (5), um einen oder mehrere nachfolgende Sätze von Ästen hinzuzufügen. Derartige hyper-kammverzweigte Polymere sind in der europäischen Patentveröffentlichung 0 473 088 A2 offenbart und werden im Allgemeinen als „Dendrigraft-Polymere" bezeichnet. Eine repräsentative Formel derartiger hyper-kammverzweigter Polymere ist:
wobei C ein Kernmolekül ist; jedes R die Restgruppe eines Initiators ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Initiatoren freier Radikale, kationischen Initiatoren, anionischen Initiatoren, Initiatoren einer Koordinationspolymerisation und Gruppentransferinitiatoren ist; A und B polymerisierbare Monomere oder Comonomere darstellen, welche in der Lage sind, den für eine Verzweigung hiervon oder ein Aufpfropfen hierauf erforderlichen Bedingungen zumindest während der Polymerisation der linearen {(A)-(B)}-Polymerkette und während deren Aufpfropfen auf einen vorherigen {(A)-(B)}-Ast des {(A)-(B)}-Kernastes zu widerstehen; jedes G eine Pfropfkomponente darstellt und die Bezeichnung
darauf hindeutet, dass G entweder an eine (A)-Einheit oder an eine (B)-Einheit binden kann; n der Polymerisationsgrad der Kammäste der angegebenen Generation ist; y der Anteil an B-Einheiten in dem Ast der angegebenen Generation ist und einen Wert von .01 bis 1 aufweist; die hochgestellten Zahlen 0, 1 und i die Generationsebene des Kammastes darstellen, wobei i bei „2" beginnt und sich bis zur Anzahl der sich wiederholenden Generationen von Ästsätzen in dem Polymer fortsetzt; und wobei zumindest n⁰ und n' ≥ 2 sind.
Zum Zwecke der Klarstellung der Terminologie sollte angemerkt werden, dass dichte Sterndendrimere durch wiederholte terminate Verzweigung aufgebaut werden, während hyper-kammverzweigte Dendrimere durch wiederholte Kammverzweigung aufgebaut werden. In dichten Sterndendrimeren werden die Äste einer nachfolgenden Generation an die terminalen Einheiten einer vorherigen Generation angebracht, womit der Verzweigungsgrad auf die Funktionalität der terminalen Einheit der vorherigen Generation beschränkt ist, welche typischerweise zwei oder drei ist. Im Gegensatz hierzu kann in Übereinstimmung mit einem hyperkammverzweigten Dendrimer durch Verzweigen von Oligomeren auf Oligomerästen einer vorherigen Generation der Verzweigungsgrad von Generation zu Generation dramatisch erhöht werden, wobei der Verzweigungsgrad in der Tat von Generation zu Generation variieren kann.
Die dendritischen Polymere, von welchen angenommen wird, dass sie den größten Nutzen besitzen, sind annährend monodispers. Dies bedeutet, dass dendritische Polymere in einer monodispersen Lösung, in welcher alle dendritischen Polymermoleküle im Wesentlichen von der gleichen Generation sind und folglich eine einheitliche Größe und Form aufweisen, bevorzugt sind. Monodisperse Lösungen von Dendrimeren sind besonders bevorzugt.
Die verwendeten dendritischen Polymere weisen im Inneren liegende und/oder terminate funktionelle Gruppen oder Chelatgruppen auf, welche für ein antineoplastisches Mittel, das in der Lage ist, mit den funktionellen Gruppen oder Chelatgruppen zu assoziieren, zugänglich sind, wodurch die Aufnahme des antineoplastischen Mittels durch das dendritische Polymer ermöglicht wird. Dendritische Polymere mit anionischen funktionellen Endgruppen sind bevorzugt. Beispiele für anionische funktionelle Endgruppen umfassen Sulfonate, Sulfate sowie Carboxylatgruppen, wobei Carboxylat- oder Carbonsäuregruppen, umfassend die Natrium- und Kaliumsalze hiervon, besonders bevorzugt sind. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die vorteilhaften Ergebnisse aufgrund dessen erhalten werden, dass die Platinform des Pt es diesem gestattet, gewöhnlich in seiner hydrierten Form, im Inneren des Dendrimers aktiv zu sein, wobei es am Ort der Krebszelle in seiner aktiven Form aus dem Dendrimer entladen oder freigesetzt wird, wobei angenommen wird, dass es noch immer in der hydrierten Form vorliegt, und wobei das Pt anschließend in der Lage ist, mit der DNA der Krebszelle zu vernetzen und hierdurch die Proliferation der Krebszellen zu hemmen. Wenn das antineoplastische dendritische Polymerkonjugat mit EPR stromaufwärts der Tumormasse injiziert wird, so dringt es leicht in diese ein, da seine Größe durch das Dendrimer bestimmt wird und der Tumor über einen beträchtlichen, in den Tumor eintretenden Blutfluss verfügt, wobei es nicht in die umliegenden Bereiche ausströmt, da die Größe der aus dem Tumor austretenden Gefäße stärker beschränkt und die Größe des Dendrimers für jene Gefäße zu groß ist. Folglich bleibt eine hohe Konzentration des Arzneimittels in dem Tumor zurück. [Siehe beispielsweise UM. Ohndorf et al., Nature 399, 708–712 (17. Juni 1999).] Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die vorteilhaften Ergebnisse aufgrund dessen erhalten werden, dass die antineoplastischen Mittel positiv geladen sind und von der negativen Ladung der Carbonsäuregruppen des Dendrimers angezogen werden, wobei aufgrund eines höheren osmotischen Drucks außerhalb des Dendrimers gegenüber dessen Innerem eine Verlagerung des antineoplastischen Mittels erfolgt und sich letzteres in das Innere des Dendrimers bewegt.
Verkapselung oder Einschluss stellt eine chemische oder physikalische Wechselwirkung dar, welche auf einer ionischen oder einer beliebigen anderen Form von Assoziation zwischen zwei Verbindungen basiert (z. B. kovalente Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, Adsorption, Absorption, Metallbindung, van der Vaals-Kräfte zwischen einem Wirtsmolekül (dendritisches Polymer) und einem Gastmolekül (einem antineoplastischen Mittel). Die Verkapselung kann reversibel oder irreversibel sein. Die Verkapselung von Dendrimer und antineoplastischem Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung definiert das Dendrimer dahingehend, dass es als Wirt, Einstellplatz oder Stelle für das antineoplastische Mittel, d. h. insbesondere für Cisplatin oder Carboplatin, fungiert. Im Bereich der Polymerchemie stellt Verkapselung, da Dendrimere spezifische, mit der Struktur in Beziehung stehende Eigenschaften aufweisen, einen stärker definierten und präzisen Begriff dar. Im Gegensatz hierzu wird bei linearen Polymeren, bei welchen nicht wirklich klar ist, wo das Arzneimittel an das Polymer gebunden oder mit diesem assoziiert ist, häufiger der Begriff Einschluss verwendet.
Es ist darüber hinaus möglich, ein antineoplastisches Mittel kovalent an das Dendrimer zu binden. Diese kovalente Bindung kann direkt zwischen der inneren Oberfläche des Dendrimers und dem antineoplastischen Mittel oder unter Verwendung einer Linkergruppe zwischen der Oberfläche des Dendrimers und dem antineoplastischen Mittel ausgebildet sein. Einige Linker, welche verwendet werden können, sind in US Patent 5,527,524; EP 0 353 450 ; EP 0 570 575 und EP 0 296 522 beschrieben.
Jegliche Oberflächenassoziation zwischen dem antineoplastischen Mittel und dem dendritischen Polymer bildet sich über eine kovalente oder ionische Wechselwirkung aus, wodurch es dem antineoplastischen Mittel ermöglicht wird, mit der Oberfläche des dendritischen Polymers lange genug assoziiert zu sein, dass zwischen den im Inneren liegenden Amingruppen des Dendrimers und dem antineoplastischen Mittel eine zweite Wechselwirkung auftritt. Dies führt über einen geladenen Shuntmechanismus zu einem verkapselten Konjugat und zur Verkapselung oder zur Aufnahme des antineoplastischen Mittels durch das dendritische Polymer. Folglich sind dendritische Polymere mit anionischen funktionellen Endgruppen bevorzugt. Beispiele anionischer funktioneller Endgruppen umfassen Sulfonate, Sulfate, Carboxylatgruppen, wobei Carboxylat- oder Carbonsäuregruppen und ihre Salze besonders bevorzugt sind.
Beispiele geeigneter dendritischer Polymere, welche verwendet werden können, umfassen Poly(amidoamin)-Dendrimere, insbesondere Poly(amidoamin)-Dendrimere mit Carboxylatenden und Poly(propylenimin)-Dendrimere mit Carboxylatenden, insbesondere wenn diese Carbonsäuregruppen Salze, insbesondere von Natrium oder Kalium, gebildet haben.
Die Generation des dendritischen Polymers, und damit die Größe des dendritischen Polymers, welche verändert werden kann, kann beträchtlich variieren. So sind beispielsweise Poly(amidoamin)-Dendrimere der Generation 3.5 (3.5 PAMAM) für diese Verwendung annehmbar. Allerdings wird angenommen, dass auch höhere und niedrigere Generationen von Nutzen sind, insbesondere jedoch der Bereich von Generation 3.5 bis 7.5 für PAMAM-Dendrimere mit Ethylendiamin (EDA)-Kern.
Das antineoplastische Mittel kann im Allgemeinen ein beliebiges antineoplastisches Mittel, insbesondere ein auf Platin basierendes Analogon, sein, welches in dem dendritischen Polymer reversibel verkapselt werden oder mittels eines Linkers an die Oberfläche des dendritischen Polymers chelatisiert werden kann, und welches eine Antitumoraktivität aufweist, wenn es aus dem dendritischen Polymer freigesetzt wird. Bei einem antineoplastischen Mittel handelt es sich um eine therapeutische Verbindung, welche zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen, wie beispielsweise Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Hodenkrebs, Brustkrebs, Magenkrebs und Lymphom verwendet wird. Beispiele antineoplastischer Mittel, wie sie hierin verwendet werden, sind wie vorstehend definiert. Das bevorzugte antineoplastische Mittel ist eine Platin-enthaltende Verbindung, z. B. ein auf Platin basierendes Analogon. Stärker bevorzugt sind Cisplatin (cis-Diammindichlorplatin) [siehe Rosenberg et al., Nature 205, 698 (1965), Deutsche Patente 2,318,020 und 2,329,485] und Carboplatin (cis-Diammin(1,1-cyclobutandicarboxylato)platin) [siehe US Patent 4,140,707]. Andere geeignete Platin-enthaltende Verbindungen umfassen jene, in welchen ein vierbindiges Platinatom an den Stickstoff zweier Aminliganden, welche gleich oder verschieden sein können, gebunden ist, wobei die Aminliganden in cis-Konformation zueinander vorliegen, und wobei die verbleibenden Liganden in der Lage sein können, mit einer funktionellen Gruppe des dendritischen Polymers wechselzuwirken oder durch diese ersetzt zu werden. Ein Beispiel einer derartigen Verbindung ist cis-Diammindichlorplatin. Es wurde eine große Anzahl an unterschiedlichen Analoga von Cisplatin untersucht [siehe beispielsweise J. Respondek und J. Engel, Drugs Of The Future 21(4), 391–408 (1996) und R.B. Weiss und M.C. Christian, Drugs 46, 360–377 (1993)], wobei viele dieser unterschiedlichen Platinderivate wahrscheinlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind und von dem Begriff „auf Platin basierende Analoga" umfasst sind.
Antineoplastische dendritische Polymerkonjugate können durch Auflösen eines dendritischen Polymers in einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser und Inkontaktbringen des gelösten dendritischen Polymers mit einem gelösten antineoplastischen Mittel unter Bedingungen, welche ausreichend sind, um eine Assoziation des antineoplastischen Mittels mit dem dendritischen Polymer zu bewirken und um ein antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat zu bilden, hergestellt werden. In vielen der in den Beispielen beschriebenen Experimente wurde ein Molverhältnis von Cisplatin zu Dendrimer (PAMAM der Generation 3.5, EDA-Kern, Dendrimer) von 35:1 verwendet. Das Verhältnis von Cisplatinmolekülen zu dendritischen Polymermolekülen kann beträchtlich variieren. Es wurden dendritische Polymer-Platinate mit einem Molverhältnis von Cisplatin zu dendritischem Polymer von etwa 100:1 bis etwa 1:1 ausgewertet, wobei angenommen wird, dass diese praktische Vorteile bereitstellen. Die verwendeten antineoplastischen Mittel sind in dem Dendrimer verkapselt, wobei angenommen wird, dass diese Verkapselung über einen Shuntmechanismus verläuft, wobei die anionischen Gruppen (z. B. Carboxylatgruppen) der Dendrimeroberfläche für eine schwache Wechselwirkung zwischen Dendrimer und antineoplastischem Mittel verantwortlich sind, welche es dem antineoplastischen Mittel ermöglicht, von dem Dendrimer aufgenommen zu werden (d. h. primäre Wechselwirkung), und welcher möglicherweise über eine Reaktion zwischen den im Inneren liegenden Stickstoffgruppen des Dendrimers und dem antineoplastischen Mittel verläuft (d. h. sekundäre Wechselwirkung). Dieser ionische Shuntmechanismus führt zur Verkapselung des antineoplastischen Mittels in dem dendritischen Polymer. Es wird angenommen, dass neben der Verkapselung eine gewisse Oberflächenassoziation des antineoplastischen Mittels mit dem dendritischen Polymer auftreten kann.
Das antineoplastische dendritische Polymerkonjugat kann an Tiere, insbesondere an Menschen, in einer zur Behandlung eines malignen Tumors in dem Tier therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden. Das antineoplastische dendritische Polymer kann oral oder topisch verabreicht werden, wird jedoch bevorzugt parental, wie beispielsweise durch subkutane (S.C.) Injektion, intraperitoneale (I.P.) Injektion, intravenöse (I.V.) Injektion, intraarterielle Injektion oder intramuskuläre Injektion, verabreicht. Es wurde festgestellt, dass eine wirksame Menge eines Poly(amidoamid)-Dendrimer-Cisplatin-Konjugats der Generation 3.5, in welchem die Cisplatinbeladung etwa 25 Gew.-% (d. h. 25 Gew.-% des Konjugats sind Cisplatin) ist, für eine Maus (DBA2 oder C57) bei intraperitonealer Injektion von etwa 1 Milligramm pro Kilogramm (1 mg/kg) Körpergewicht bis etwa 15 Milligramm pro Kilogramm (15 mg/kg) Körpergewicht beträgt. Geeignete Mengen verschiedener antineoplastischer dendritischer Polymerkonjugate, welche zur Behandlung verschiedener maligner Tumore in anderen Tieren therapeutisch wirksam sind, können unter Verwendung von Routineexperimenten und Routineuntersuchungen bestimmt werden.
Es ist davon auszugehen, dass die antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate im Rahmen der Behandlung verschiedener maligner Erkrankungen, für welche festgestellt wurde, dass Cispatin, Carboplatin und andere antineoplastische Mittel als Antitumormittel therapeutisch wirksam sind, umfassend Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Hodenkrebs, Brustkrebs, Magenkrebs und Lymphom, wirksam sind. Es ist darüber hinaus davon auszugehen, dass die antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate in einer Kombinationstherapie mit anderen Antikrebsmitteln verwendet werden können (d.h. synergistische Anwendung). In vitro-Untersuchungen und in vivo-Untersuchungen an Mäusen lassen darauf schließen, dass die antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugate, insbesondere die auf Platin basierenden Analoga, auch im Rahmen der Behandlung von Melanom und humaner lymphoblastischer Leukämie therapeutisch wirksam sind.
Glossar der in den Beispielen verwendeten Begriffe

AAS bedeutet Atomabsorptionsspektroskopie
AUC bedeutet Fläche unter der Kurve
BDH bedeutet BDH Laboratory Supplies in Dorest, England
Cisplatin bedeutet cis-Diammindichlorplatinat (II)
Carboplatin bedeutet cis-Diammin(1,1-cyclobutandicarboxylato)platinat (II)
DDW bedeutet doppelt deionisiertes Wasser
DMSO bedeutet Dimethylsulfoxid
EDA bedeutet Ethylendiamin
EPR bedeutet erhöhte Permeabilität und Retention
FCS bedeutet fötales Kälberserum
GPC bedeutet Gelpermeationschromatographie
I.P. bedeutet intraperitoneal
IR bedeutet Infrarotspektroskopie
sI.V. bedeutet intravenös
MEM bedeutet minimales essentielles Medium
MTT bedeutet 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (ein koforimetrischer Farbstoff, welcher ein blassgelbes Substrat darstellt, das von lebenden Zellen unter Bildung eines dunkelblauen Formazanprodukts gespalten wird)
MWCO bedeutet Molekulargewichtsausschlussgrenze
NMR bedeutet kernmagnetische Resonanzspektroskopie
OD bedeutet optische Dichte
OPDA bedeutet o-Phenylendiamin-Assay (zugesetzt, um einen photometrischen Assay für Metalle durchzuführen)
PAMAM bedeutet Poly(amidoamin)-Dendrimere
PBS bedeutet Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
POPAMS bedeutet Poly(propylenimin)-Dendrimere
PSC bedeutet Partikelgrößenverteilung gemäß Photonenkorrelationsspektroskopie
RPMI-Medium bedeutet Roswell Park Memorial Institute-Medium, gewöhnlich RPMI 1640, siehe G.E. Moore und L.K. Woods, „Culture Media for Human Cells – RPMI 1603, RPMI 1634, RPMI 1640 and RPMI GEM 1717", Tissue Culture Assoc. ManuaL 3, 503–508 (1976)
S.C. bedeutet subkutan

Experimentelle Verfahren
Synthese und Charakterisierung
Poly(amidoamin)-Dendrimere (PAMAM, EDA-Kern) (Sigma) wurden gemäß dem Verfahren von Tomalia et al., Polymer J., 17, 117–132(4) (1985) synthetisiert. Man ließ Dendrimere der Generation 3.5 (COONa) und 4 (NH₂) mit Cisplatin für 4 Stunden unter Rührbedingungen bei Raumtemperatur wechselwirken.
Das Dendrimer-Platin (Pt) wurde unter Verwendung des (kolorimetrischen) OPDA-Assays und AAS (Gesamt-Pt), GPC (MW und freies Pt), IR und NMR charakterisiert.
Pt-Freisetzung
Um die Rate der Pt-Freisetzung und darüber hinaus die Biozersetzung des Dendrimers zu untersuchen, wurde das Konjugat in Puffern bei pH 7.4 und 5.5 sowie darüber hinaus in Gegenwart von Serum und lyosomalen Enzymen inkubiert.
Biologische Evaluierung
Die in vitro-Zytotoxizität wurde unter Verwendung des MTT-Assays gegenüber B16F10-Melanomzellen, CCRF-Zellen (humane lymphoblastische Leukämie) und Cor-L23-Zellen (humane Lunge) bestimmt. Dendrimer-Pt und freies Cisplatin wurden I.P. (Tage 1, 2, 3 oder ausschließlich Tag 1) an DBA2- oder C57-Mäuse, welche I.P.-inokulierte L1210- oder B16F10-Tumore (beziehungsweise) trugen, verabreicht. Alternativ wurde das Arzneimittel I.V. an Mäuse, welche S.C. implantierte B16F10 trugen, verabreicht, wenn der Tumor eine tastbare Größe (50–100 mm²) erreicht hatte. Das Gewicht der Tiere, die Tumorgröße und das Überleben der Tiere wurden überwacht (die UK-Richtlinien für Tierexperimente, welche Neoplasien umfassen, wurden befolgt).
Materialien
Polyamidoamin (PAMAM, EDA-Kern)-Starburst^®-Dendrimere (Warenzeichen von The Dow Chemical Company) wurden von Aldrich (UK) Ltd. erworben.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter, werden jedoch nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung angesehen.
BEISPIELE
Beispiel 1 Effekt von PAMAM-Dendrimer auf die Stabilität von Rattenerythrozyten, welche in vitro inkubiert wurden.
Verfahren
Poly(amidoamin)-Dendrimere (kationisch und anionisch) steigender Generationen wurden mit Rattenerythrozyten, welche aus einer adulten Wistar-Ratte erhalten worden waren, inkubiert. Die Wechselwirkung des Dendrimers mit den Erythrozyten wurde spektrophotometrisch durch Detektion von freigesetztem Hämoglobin, welche durch Lyse induziert wird, mit einem Spektrophotometer bei 550 nm bestimmt. Verschiedene Konzentrationen an Dendrimer, Kontrollen (Methanol (BDH)), Poly-L-Lysin (HBr-Salz; 56.5 KD MW (Sigma)) und Dextran (74 KD MW (Sigma)) (gelöst in physiologisch gepufferter Kochsalzlösung) wurden zusammen mit den Rattenerythrozyten (2% w/v-Lösung) für eine Stunde bei 37°C und bei 10 Upm (Schüttelwasserbad) inkubiert. Nach Beendigung wurden die Erythrozyten zur Pelletierung der Zellen in einer Zentrifuge bei 1500 × g für 10 Minuten verwirbelt, und wurden 100 μl des Überstandes entfernt und nach Abgleich gegen PBS in dem Spektrophotometer analysiert. Die Ergebnisse sind in 1 und 2 als prozentualer Wert an freigesetztem Hämoglobin verglichen mit einer intrinsischen Kontrolle (Triton × 100 (1% v/v-Lösung (Sigma)), welche eine 100%-ige Lyse ergab, angegeben.
Ergebnis
Kationische Dendrimere, mit Ausnahme der Generation 1, zeigten lytische Eigenschaften, während lösliche anionische Dendrimere (umfassend PAMAM der Generation 3.5) keine lytischen Eigenschaften zeigten.
Beisgiel 2 Zellzytotoxizität nicht-modifizierter Dendrimere gegenüber B16F10-Zellen
Verfahren
B16F10-Zellen stellen eine adhärente murine Melanomzelllinie dar. B16F10-Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro ml (1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) in einer flachbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Costar) in RPMI 1640-Gewebekulturmedium (Gibco), welches mit 10% FCS (Gibco) ergänzt war, ausgesät. Das gesamte zelluläre Wachstum sowie die zytotoxischen Inkubationen wurden in einem Zellinkubator bei 37°C und einer Atmosphäre von 5% CO₂ durchgeführt.
Die Zelldichte wurde unter Verwendung eines verbesserten Neurenbrow-Hämozytometers (Sigma) bestimmt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit frischem RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) versetzt, und die Zellen wurden anschließend in einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen wurden für 24 Stunden in diesem Zustand belassen, um zu regenerieren und um erneut anzuhaften.
Alle Polymere und Kontrollen wurden in RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) gelöst und anschließend über einen 0.2 μm-Sterilfilter (Acrodisk) sterilisiert, wobei die ersten paar Mikroliter der Lösung im Falle eines Anhaftens des Polymers an die Filtermembran verworfen wurden. Das Polymer und die Kontrollen wurden den Zellen in der Mikrotiterplatte anschließend in steigenden Konzentrationen hinzugefügt. Einige Zellen wurden in reinem Medium belassen, um als zelluläre Kontrollen zu fungieren. Methanol und Poly-L-Lysin dienten als Negativkontrollen, und Dextran war eine Positivkontrolle. Die Zellen wurden für 72 Stunden in dem Inkubator belassen und gelegentlich auf Hefe oder eine bakterielle Kontamination untersucht. Fünf Stunden vor dem Endpunkt der Inkubationszeit, nach 67 Stunden, wurden 20 μl MTT hinzugefügt und wurden die Zellen für die letzten fünf Stunden in diesem Zustand belassen. Anschließend wurde das Zellmedium entfernt, wurden 100 μl DMSO in optischer Qualität (Sigma) hinzugefügt, und wurden die MTT-Kristalle gelöst. Die Platten wurden in einer Titerteck-Plattenauslesevorrichtung ausgelesen. Die Ergebnisse (OD) sind in 3 und 4 als prozentualer Wert des OD angegeben, welcher in Vertiefungen mit Zellen beobachtet wurde, die kein Polymer oder keine Kontrolle enthielten.
Ergebnis
Kationische Dendrimere waren gegenüber der Zelllinie zytotoxisch (ähnlich wie Poly-L-Lysin), während anionische Dendrimere (umfassend PAMAM der Generation 3.5, EDA-Kern) nicht zytotoxisch waren (ähnlich wie Dextran).
Beispiel 3 Zellzytotoxizität nicht-modifizierter Dendrimere gegenüber CCRF-CEM-Zellen
Verfahren
CCRF-CEM-Zellen stellen eine lymphoblastische Leukämie- und Suspensionszelllinie dar, d. h. sie wächst in Suspension. CCRF-CEM-Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen pro ml (5 × 10³ Zellen pro Vertiefung) in einer V-förmigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Costar) in RPM11640-Gewebekulturmedium (Gibco), welches mit 10% FCS (Gibco) ergänzt war, ausgesät. Das gesamte zelluläre Wachstum sowie die zytotoxischen Inkubationen wurden in einem Zellinkubator bei 37°C und einer Atmosphäre von 5% CO₂ durchgeführt.
Die Zelldichte wurde unter Verwendung eines verbesserten Neurenbrow-Hämozytometers (Sigma) bestimmt. Die Zellen wurden bei 1000 × g zentrifugiert und in frischem Medium (ergänzt mit FCS) resuspendiert, bevor die Zelldichte bestimmt wurde. Die Zellen wurden anschließend in einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen wurden für 24 Stunden in diesem Zustand belassen, um zu regenerieren und um erneut anzuhaften.
Alle Polymere und Kontrollen wurden in RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) gelöst und anschließend über einen 0.2 μm-Sterilfilter (Acrodisk) sterilisiert, wobei die ersten paar Mikroliter der Lösung im Falle eines Anhaftens des Polymers an die Filtermembran verworfen wurden. Das Polymer und die Kontrollen wurden den Zellen in der Mikrotiterplatte anschließend in steigenden Konzentrationen hinzugefügt. Einige Zellen wurden in reinem Medium belassen, um als zelluläre Kontrollen zu fungieren. Methanol und Poly-L-Lysin dienten als Negativkontrollen, und Dextran war eine Positivkontrolle. Die Zellen wurden für 72 Stunden in dem Inkubator belassen und gelegentlich auf Hefe oder eine bakterielle Kontamination untersucht. Fünf Stunden vor dem Endpunkt der Inkubationszeit, nach 67 Stunden, wurden 20 μl MTT hinzugefügt, und wurden die Zellen für die letzten fünf Stunden in diesem Zustand belassen. Anschließend wurde das Zellmedium entfernt, wurden 100 μl DMSO in optischer Qualität (Sigma) hinzugefügt, und wurden die MTT-Kristalle gelöst. Die Platten wurden in einer Titerteck-Plattenauslesevorrichtung ausgelesen. Die Ergebnisse (OD) sind in 5 und 6 als prozentualer Wert des OD angegeben, welcher in Vertiefungen mit Zellen beobachtet wurde, die kein Polymer oder keine Kontrolle enthielten.
Ergebnis
Kationische Dendrimere waren gegenüber der Zelllinie zytotoxisch (ähnlich wie Poly-L-Lysin), während anionische Dendrimere (umfassend PAMAM der Generation 3.5) nicht zytotoxisch waren (ähnlich wie Dextran).
Beispiel 4 Zellzytotoxizität nicht-modifizierter Dendrimere gegenüber HepG2-Zellen
Verfahren
HepG2 stellt ein hepatozelluläres Karzinom und eine adhärente Zelllinie dar, d. h. sie wächst in Monolage. HepG2-Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro ml (1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) in einer flachbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Costar) in MEM-Gewebekulturmedium (Gibco), welches mit 10% FCS (Gibco) ergänzt war, ausgesät. Das gesamte zelluläre Wachstum und die zytotoxischen Inkubationen wurden in einem Zellinkubator bei 37°C und einer Atmosphäre von 5% CO₂ durchgeführt.
Die Zelldichte wurde unter Verwendung eines verbesserten Neurenbrow-Hämozytometers (Sigma) bestimmt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit frischem RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) versetzt. Anschließend wurden die Zellen in einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen wurden für 24 Stunden in diesem Zustand belassen, um zu regenerieren und um erneut anzuhaften.
Alle Polymere und Kontrollen wurden in RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) gelöst und anschließend über einen 0.2 μm-Sterilfilter (Acrodisk) sterilisiert, wobei die ersten paar Mikroliter der Lösung im Falle eines Anhaftens des Polymers an die Filtermembran verworfen wurden. Das Polymer und die Kontrollen wurden den Zellen in der Mikrotiterplatte anschließend in steigenden Konzentrationen hinzugefügt. Einige Zellen wurden in reinem Medium belassen, um als zelluläre Kontrollen zu fungieren. Methanol und Poly-L-Lysin dienten als Negativkontrollen, und Dextran war eine Positivkontrolle. Die Zellen wurden für 72 Stunden in dem Inkubator belassen und gelegentlich auf Hefe oder eine bakterielle Kontamination untersucht. Fünf Stunden vor dem Endpunkt der Inkubationszeit, nach 67 Stunden, wurden 20 μl MTT hinzugefügt und wurden die Zellen für die letzten fünf Stunden in diesem Zustand belassen. Das Zellmedium wurde entfernt, es wurden 100 μl DMSO in optischer Qualität (Sigma) hinzugefügt, und die MTT-Kristalle wurden gelöst. Die Platten wurden in einer Titerteck-Plattenauslesevorrichtung ausgelesen. Die Ergebnisse (OD) sind in 7 und 8 als prozentualer Wert des OD angegeben, welcher in Vertiefungen mit Zellen beobachtet wurde, die kein Polymer oder keine Kontrolle enthielten.
Ergebnis
Kationische Dendrimere waren gegenüber der Zelllinie zytotoxisch (ähnlich wie Poly-L-Lysin, MW 56 kDa), während anionische Dendrimere (umfassend PAMAM der Gen. 3.5) nicht zytotoxisch waren (ähnlich wie Dextran, MW 78 kDa).
Beisgiel 5A Synthese eines Konjugats aus dendritischem Polymer und verkapseltem Cisplatin
Verfahren
0.8207 Gramm (6.40 × 10^–5 Mol) Poly(amidoamin)-Starburst^®-Dendrimer (Generation 3.5, EDA-Kern mit an der Oberfläche befindlichen Carboxylatgruppen) wurden in 20 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst. 0.6601 Gramm (2.22 × 10^–3 Mol) Cisplatin wurden in 300 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst. Sobald sich das Cisplatin vollständig im Wasser gelöst hatte, wurde das Dendrimer unter Stickstoff über einen Zeitraum von 45 Minuten tropfenweise zu der gerührten Lösung von Cisplatin hinzugefügt (ein Molverhältnis von Cisplatin zu Dendrimer von etwa 35:1). Die Lösung wurde unter Lichtausschluss und unter Stickstoff für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nicht umgesetzte Cisplatin oder ein Überschuss an Cisplatin wurde unter Verwendung eines Centricon Plus-80 MWCO 5000 (Millipore, Bioseparations) entfernt. Nach Gewinnung des Retentats wurde die isolierte Lösung für 48 Stunden lyophilisiert (The Labconco FreeZone 4.5 Lit.), wobei das hygroskopische Dendrimer-Platinat als feines weißes Pulver erhalten wurde.
Ergebnis
Die Bestimmung des prozentualen Gewichtsanteils ergab 19.25 Gew.-% Pt.
Beispiel 5B Synthese eines Konjugats aus dendritischem Polymer und verkapseltem Carboplatin
Verfahren
0.6964 Gramm (5.39 × 10^–5 Mol) Poly(amidoamin)-Starburst^®-Dendrimer (Generation 3.5, EDA-Kern) wurden in 20 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst. 0.666 g (1.79 × 10^–3 Mol) Carboplatin wurden in 300 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst. Dieses Gemisch wurde vorsichtig erwärmt (35°C), bis das Carboplatin vollständig in Lösung war. Sobald sich das Carboplatin vollständig im Wasser gelöst hatte, wurde das Dendrimer unter Stickstoff tropfenweise hinzugefügt und über einen Zeitraum von 45 Minuten gerührt (ein Molverhältnis von Carboplatin zu Dendrimer von 33:1). Die Lösung wurde unter Lichtausschluss und unter Stickstoff für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nicht umgesetzte Carboplatin oder ein Überschuss an Carboplatin wurde unter Verwendung eines Centricon Plus-80 MWCO 5000 (Millipore, Bioseparations) entfernt. Nach Gewinnung des Retentats wurde die isolierte Lösung für 48 Stunden lyophilisiert (The Labconco FreeZone 4.5 Lit.), wobei das hygroskopische Dendrimer-Platinat als feines weißes Pulver erhalten wurde.
Ergebnis
Die Bestimmung des prozentualen Gewichtsanteils ergab 20.47 Gew.-% Pt.
Beispiel 6 Einfluss der Generation
Verfahren
Poly(amidoamin)-Starburst^®-Dendrimere der Generation 3.5, 4.5 und 5.5 mit EDA-Kern und an der Oberfläche befindlichen Natriumcarboxylatgruppen wurden jeweils in 20 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst und anschließend mit Cisplatin umgesetzt. Es wurde ein Molverhältnis von Cisplatin zu Dendrimer von 33:1, 74:1 bzw. 127:1 verwendet. Das Cisplatin wurde in 300 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst und vorsichtig erwärmt (35°C), bis das Cisplatin vollständig in Lösung war. Sobald sich das Cisplatin vollständig im Wasser gelöst hatte, wurde das Dendrimer unter Stickstoff tropfenweise hinzugefügt und über einen Zeitraum von 45 Minuten gerührt. Die Lösung wurde unter Lichtausschluss und unter Stickstoff für eine Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nicht umgesetzte Cisplatin oder ein Überschuss an Cisplatin wurde unter Verwendung eines Centricon Plus-80 MWCO 5000 (Millipore, Bioseparations) entfernt. Nach Gewinnung des Retentats wurde die isolierte Lösung für 48 Stunden lyophilisiert (The Labconco FreeZone 4.5 Lit.), wobei das hygroskopische Dendrimer-Platinat-Verkapselungsprodukt als feines weißes Pulver erhalten wurde.
Ergebnise
Die Bestimmung des prozentualen Gewichtsanteils ergab 19.25, 16.82, 16.81 Gew.-% Pt für die Poly(amidoamin)-Dendrimere der Generation 3.5, 4.5 bzw. 5.5. Die Daten scheinen darauf schließen zu lassen, dass höhere Generationen den Grad der Platinbeladung in den Dendrimer-Platin-Konjugaten, möglicherweise aufgrund der kompakten (physikalisch gedrängten) Oberflächengruppen, leicht verringern. Allerdings wird selbst bei Verwendung eines Poly(amidoamin)-Dendrimers der Generation 5.5 mit an der Oberfläche befindlichen Natriumcarboxylatgruppen eine Beladung von 16.81 Gew.-% Pt erhalten. Unter Berücksichtigung des Molekulargewichts der PAMAM-Dendrimere (Generation 3.5: MW 12931; 4.5: MW 26252; und 5.5: MW 52913) deutet der prozentuale Gewichtsanteil, bezogen auf das Molverhältnis, auf eine erhöhte Aufnahme von Platin ausgehend von niedrigeren zu höheren Generationen hin.
Beispiel 7 Kinetische Studie des Reaktionsverlaufs
Verfahren
Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem ein Poly(amidoamin)-Starburst^®-Dendrimer der Generation 3.5 mit an der Oberfläche befindlichen Natriumcarboxylatgruppen in 20 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst und mit Cisplatin in einem Molverhältnis von 32:1 umgesetzt wurde. Das Cisplatin wurde in 300 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst und vorsichtig erwärmt (35°C), bis das Cisplatin vollständig in Lösung war. Sobald sich das Cisplatin vollständig im Wasser gelöst hatte, wurde das Dendrimer unter Stickstoff tropfenweise hinzugefügt und für einen Zeitraum von 45 Minuten gerührt. Die Lösung wurde unter Lichtausschluss und unter Stickstoff für Reaktionszeiten von 4 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nicht umgesetzte Cisplatin oder ein Überschuss an Cisplatin wurde unter Verwendung eines Centricon Plus-80 MWCO 5000 (Millipore, Bioseparations) entfernt. Nach Gewinnung des Retentats wurde die isolierte Lösung für 48 Stunden lyophilisiert (The Labconco FreeZone 4.5 Lit.), wobei das hygroskopische Dendrimer-Platinat-Verkapselungsprodukt als feines weißes Pulver erhalten wurde.
Ergebnise
Die Bestimmung des prozentualen Gewichtsanteils ergab 5.81, 19.25, 20.26 Gew.-% Pt bei Reaktionszeiten von 4, 24 bzw. 48 Stunden. Die Daten scheinen darauf schließen zu lassen, dass längere Reaktionszeiten (d. h. 24 Stunden im Vergleich zu 4 Stunden) eine höhere Platinbeladung in den Dendrimer-Platin-Konjugaten begünstigen. Allerdings blieb, wenn die Reaktionszeit auf 48 Stunden erhöht wurde, die Platinbeladung im Wesentlichen unverändert. Dies deutet darauf hin, dass die optimale Beladung bei Anwendung einer 24-stündigen Reaktionszeit erreicht wird.
Beispiel 8 Modifizierung der Oberflächenfunktionalitäten
Verfahren
Poly(amidoamin)-Starburst^®-Dendrimere der Generation 3.5 mit variierenden Oberflächengruppen wurden in 20 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst und mit Cisplatin umgesetzt. Es wurde ein Molverhältnis von Cisplatin zu Dendrimer von 32:1, 16:1 bzw. 32:1 verwendet, wobei die Oberflächengruppen aus Amingruppen, Acetamidgruppen bzw. verlängerten Carbonsäuregruppen bestanden. Die verlängerten Carbonsäuregruppen wurden durch Umsetzen der Amingruppen der Generation 3 mit Bernsteinsäureanhydrid in DMSO hergestellt. Dies umfasste die Bildung einer Amidgruppe am Oberflächenamin (z. B. aus Methylmethacrylat) bei gleichzeitiger Ringöffnung des Bernsteinsäureanhydrids, wobei verlängerte Carbonsäuregruppen erzeugt wurden (z. B. carboxylierte Oberfläche). Das Cisplatin wurde in 300 ml 18Ω-Wasser (Barnstead-Nanopure) gelöst und vorsichtig erwärmt (35°C), bis das Cisplatin vollständig in Lösung war. Sobald sich das Cisplatin vollständig im Wasser gelöst hatte, wurde das Dendrimer unter Stickstoff tropfenweise hinzugefügt und für einen Zeitraum von 45 Minuten gerührt. Die Lösung wurde unter Lichtausschluss und unter Stickstoff für eine Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nicht umgesetzte Cisplatin oder ein Überschuss an Cisplatin wurde unter Verwendung eines Centricon Plus-80 MWCO 5000 (Millipore, Bioseparations) entfernt. Nach Gewinnung des Retentats wurde die isolierte Lösung für 48 Stunden lyophilisiert (The Labconco FreeZone 4.5 Lit.), wobei das hygroskopische Dendrimer-Platinat-Verkapselungsprodukt als feines weißes Pulver erhalten wurde.
Ergebnise
Diese Konjugate führten zu einer sehr geringen Platinbeladung von 6.25, 0.98 bzw. 0.01 Gew.-% Pt. Diese Daten lassen darauf schließen, dass die im Inneren befindlichen ersten Amingruppen sowie die an der Oberfläche befindlichen Carboxylatgruppen des Dendrimers eine signifikante Rolle bei der Aufnahme des Platinats spielen können.
Beispiel 9 Reinigung und Reproduzierbarkeit
Verfahren
Die Reaktion von Cisplatin mit Dendrimeren scheint selbst nach mehreren Stunden Reaktionszeit noch ungebundenes Cisplatin zu enthalten. Daher muss das ungebundene Cisplatin als Teil des synthetischen Verfahrens im Rahmen der Herstellung von Dendrimer-Platinaten entfernt werden. Unter Berücksichtigung der allgemeinen Prämisse, dass das Cisplatin kovalent an das Dendrimer gebunden war (wobei allerdings später festgestellt wurde, dass dies bei verschiedenen Zubereitungen nicht der Fall ist), wurden eine Reihe kommerziell erhältlicher Ultrafiltrationsvorrichtungen als Mittel zur Entfernung des ungebundenen Cisplatins getestet. Insbesondere wurden getestet: (1) eine Amicon-Rührzelle mit einer 3000 MWCO- oder 10000 MWCO-Membran, in welcher das Fluid unter Stickstoffdruck durch die Membran getrieben wird, (2) Amicon Centriprep-Vorrichtungen mit 3000 MWCO-Filtern, bei welchen das Fluid mittels Zentrifugation durch die Membran getrieben wird, und (3) Amicon Centricon Plus-Vorrichtungen mit 5000 MWCO-Filtern, bei welchen das Fluid mittels Zentrifugation durch die Membran getrieben wird. Theoretisch kann das Retenat in diesen Vorrichtungen wiederholt gewaschen werden, womit verbleibendes Cisplatin kontinuierlich herabverdünnt wird.
Die Dendrimer-Cisplatin-Konjugate dieses Beispiels wurden auf ähnliche Art und Weise wie zuvor beschrieben synthetisiert, wobei im Rahmen der gesamten angegebenen Reaktion die gleiche Charge des Dendrimers, das gleiche Verhältnis von Cisplatin zu Dendrimer und die gleichen Reaktionszeiten verwendet wurden.
Ergebnisse
Die Retention von Cisplatin durch das Dendrimer verringerte sich mit steigenden Reinigungszeiten und steigenden Waschvolumina. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der im Endprodukt vorgefundene prozentuale Gewichtsanteil an Platin von der Filtrationstechnik sowie dem Volumen an Lösungsmittel abhängig ist, welches im Rahmen der Reinigungstechnik zum Waschen des Retenats verwendet wurde. Die praktische Bedeutung dieser Daten ist wie folgt: (1) die Daten lassen stark darauf schließen, dass während des Reinigungsprozesses ein signifikanter Verlust an Platin aus dem Konjugat auftritt, was darauf hindeutet, dass das Platin nicht irreversibel oder kovalent an das Dendrimer gebunden ist, und (2) der Verlust an Platin während der Filtration in etwa grob der Freisetzungsrate entsprechen kann. Dieses Ergebnis steht eher mit einer reversiblen Verkapselung des Cisplatins als mit einer Oberflächenbindung im Einklang. Einfluss der Reinigungstechnik auf die Pt-Beladung des Dendrimer-Platinats

SC = Rührzelle, CTP = Centriprep

Aus diesen Daten zeigt sich darüber hinaus, dass ein schnelles Waschen des Konjugats das auf der Oberfläche befindliche ungebundene Pt und möglicherweise auch einen Teil des auf der Oberfläche befindlichen gebundenen Pt entfernt; allerdings führt ein langes Waschen dazu, dass das verkapselte Pt aus dem Inneren des Dendrimers entfernt wird.
Beispiel 13A In vitro-Freisetzung von Platin aus dem Dendrimer-Platinat in biologischen Fluiden
Verfahren
Bekannte Mengen an Cisplatin und Dendrimer wurden in zwei gepufferte Lösungen 25 (PBS bei pH 7.4 und Zitratphosphat bei pH 5.5) platziert, um unterschiedliche biologische Kompartimente (die Plasmakompartimente/extrazellulären Kompartimente bzw. die lysosomalen Kompartimente) zu simulieren. Die Lösung wurde in einem Dialysebeutel mit einem MWCO von 10 KD versiegelt. Anschließend wurde der Beutel in einen Behälter platziert, welcher mit der entsprechenden Pufferlösung befüllt war. Die Lösungen wurden anschließend bei 37°C in ein beheiztes Wasserbad platziert. In regelmäßigen Abständen wurden Proben aus den Pufferlösungen entnommen und in dreifacher Ausführung analysiert (über einen Zeitraum von 74 Stunden). Am Ende des Experiments wurde eine Probe aus dem Beutel entnommen. Alle Proben wurden unter Verwendung von Atomabsorptionsspektroskopie, wie zuvor beschrieben, analysiert.
Ergebnis
Die Menge an Platin, welches bei pH 5.5 freigesetzt wurde, war geringfügig höher als jene, welche bei pH 7.4 freigesetzt wurde. Allerdings blieb die über den Zeitraum freigesetzte Gesamtmenge, wie in 11 dargestellt ist, unter 1% der Gesamtmenge.
Beispiel 13B Zellzytotoxyzität des Dendrimer-Platinats (B16F10, L1210, CorL23)
Verfahren
Die Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro ml (1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) in einer flachbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Costar) in RPMI 1640-Gewebekulturmedium (Gibco), welches mit 10% FCS (Gibco) ergänzt war, ausgesät. Das gesamte zelluläre Wachstum und die zytotoxischen Inkubationen wurden in einem Zellinkubator bei 37°C und einer Atmosphäre von 5% CO₂ durchgeführt.
Die Zelldichte wurde unter Verwendung eines verbesserten Neurenbrow-Hämozytometers (Sigma) bestimmt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit frischem RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) versetzt. Anschließend wurden die Zellen in einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen für 24 Stunden in diesem Zustand belassen, um zu regenerieren und um erneut anzuhaften. Wenn sich die Zellen in Suspension befanden, wurden sie bei 1000 × g verwirbelt und in frischem Medium resuspendiert.
Das Dendrimer-Platinat und Cisplatin wurden in RPMI-Medium (ergänzt mit FCS) gelöst und anschließend über einen 0.2 μm-Sterilfilter (Acrodisk) sterilisiert, wobei die ersten paar Mikroliter der Lösung im Falle eines Anhaftens des Polymers an die Filtermembran verworfen wurden. Anschließend wurden Dendrimer und Cisplatin den Zellen in der Mikrotiterplatte in steigenden Konzentrationen hinzugefügt. Einige Zellen wurden in reinem Medium belassen, um als zelluläre Kontrollen zu fungieren. Die Zellen wurden für 72 Stunden in dem Inkubator belassen und gelegentlich auf Hefe oder eine bakterielle Kontamination untersucht. Fünf Stunden vor dem Endpunkt der Inkubationszeit, nach 67 Stunden, wurden 20 μl MTT hinzugefügt und wurden die Zellen für die letzten fünf Stunden in diesem Zustand belassen. Anschließend wurde das Zellmedium entfernt, wurden 100 μl DMSO in optischer Qualität (Sigma) hinzugefügt, und wurden die MTT-Kristalle gelöst. Die Platten wurden in einer Titerteck-Plattenauslesevorrichtung ausgelesen. Die Ergebnisse (OD) sind in 12, 13 und 14 als prozentualer Wert des OD angegeben, welcher in Vertiefungen mit Zellen beobachtet wurde, die kein Dendrimer-Platinat oder Cisplatin enthielten.
Ergebnis
Das Dendrimer-Platinat war im Vergleich zu Cisplatin alleine betrachtet um mehrere Größenordnungen weniger zytotoxisch.
Beispiel 14 Phamakologie (I.P. Tumor in Abhängigkeit von I.P. Injektion)
Verfahren
Li210- oder B16F10-Zellen wurden in einer Zelldichte von 1 × 10⁵ (0.9%-ige Kochsalzlösung) in die intraperitoneale (I.P., 100 μl) Kavität einer Maus (DBA2 bzw. C57, 25 g) injiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden das Dendrimer-Platinat und Cisplatin (an einem Tag oder an drei aufeinander folgenden Tagen) in einer Konzentration entsprechend dem Gewicht der Maus (z. B. 1 mg/kg-15 mg/kg) injiziert. Das Körpergewicht der Maus und die allgemeine Toxizität wurden ebenfalls in Übereinstimmung mit den UK-Richtlinien zur Verwendung von Tieren, welche in Neoplasiestudien eingesetzt werden, überwacht. Am Endpunkt wurde die grobe Morphologie der Organe vermerkt.
Ergebnis
Diese Pharmakologie lieferte die maximal tolerable Dosis des Dendrimer-Platinats (25–50 mg/kg). Wie in 10 dargestellt ist, zeigte eine I.P. Zuführung des Dendrimer-Platinats Antitumoraktivität, welche allerdings nicht wesentlich besser war als jene von Cisplatin alleine betrachtet.
Beispiel 15 Phamakologie (S.C. Tumor in Abhängigkeit von I.V. Injektion)
Verfahren
B16F10-Zellen wurden in einer Zelldichte von 1 × 10⁵ (0.9%-ige Kochsalzlösung) S.C. in die linke oder rechte Flanke einer C57-Maus injiziert. Die Maus wurde anschließend in diesem Zustand belassen, bis der Tumor bei einer tastbaren Größe von zwischen 50–100 mm² sichtbar war. Anschließend wurden das ein Platinbasiertes Analogon umfassende Dendrimer und Cisplatin I.V. in den entsprechenden Dosen in die Schwanzvene injiziert. Das Tier wurde überwacht, wobei die Tumorgröße unter Verwendung von Messschiebern gemessen und täglich aufgezeichnet wurde. Wenn die Größe des tierischen Tumors zwischen 300–400 mm² betrug, wurde das Tier erlegt. Der Tumor wurde operativ entfernt und gewogen, wobei die grobe Morphologie der Organe vermerkt wurde.
Ergebnis
Das ein Platin-basiertes Analogon umfassende Dendrimer war gegen den S.C. Tumor aktiv und zeigte im Hinblick auf das Endgewicht des Tumors sowie die Überlebensdauer einen signifikanten Unterschied, wie in 11 dargestellt ist.
Beispiel 16 Bioverteilung des ein Platin-basiertes Analogon umfassenden Dendrimers in vivo
Verfahren
C57-Mäusen wurden S.C. B16F10-Zellen in einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Maus injiziert. Man ließ den Tumor eine tastbare Größe erreichen, bevor das ein Platin-basiertes Analogon umfassende Dendrimer I.V. injiziert wurde. Zu bestimmten Zeitpunkten (0–24 Stunden) wurde das Tier erlegt und wurden die den Tumor umfassenden Schlüsselorgane (Leber, Nieren und Blut) isoliert und gewogen. Die Organe wurden in konzentrierter Salpetersäure (10 M) gelöst, wobei Wasserstoffperoxid zugesetzt wurde, um die Lösung während des Kochens zu entfärben. Die Lösungen wurden auf ein festes Volumen (25 ml) eingestellt und anschließend unter Verwendung von AAS nach Zugabe von Lanthan (La) (Überschuss), um gebundenes Platin (Pt) freizusetzen, analysiert.
Ergebnis
Verglichen mit Cisplatin alleine betrachtet wurde festgestellt, dass sich das ein Platinbasiertes Analogon umfassende Dendrimer relativ schnell nach der Injektion bevorzugt in dem Tumor in mindestens 3-facher Menge anreichert. Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt.
Fazit
Antineoplastische dendritische Polymerkonjugate besitzen eine größere Wasserlöslichkeit als Cisplatin, waren 3–5-mal weniger toxisch und weisen in vivo eine größere Antitumoraktivität auf.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist sich der Fachmann nach Lesen und Nachvollziehen dieser Offenbarung möglicherweise Veränderungen und Modifizierungen bewusst, welche vorgenommen werden können, ohne dabei vom Schutzumfang der Erfindung, wie sie vorstehend beschrieben oder nachstehend beansprucht ist, abzuweichen.

Claims

Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat, umfassend ein antineoplastisches Mittel, welches ein Platin-, Titan-, Vanadium-, Niobium-, Molybdän-, Rhenium-, oder Zinnmetall enthaltendes Analogon eines antineoplastischen Mittels ist und welches in einem anionische funktionelle Endgruppen enthaltenden dendritischen Polymer verkapselt ist.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 1, wobei das antineoplastische Mittel eine Verbindung ist, in welcher ein vierbindiges Platinatom an das Stickstoffatom zweier Aminliganden, welche gleich oder verschieden sein können, gebunden ist, wobei die Aminliganden in cis-Konformation zueinander vorliegen.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 1, wobei das antineoplastische Mittel Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin, Teraplatin, Platin-DACH, Ormaplatin, Titanocendichlorid, Vanadocendichlorid, Niobocendichlorid, Molybdänocendichlorid, Rhenocendichlorid, ein Diorganozinndihalogenid, oder ein anderes metallhaltiges antineoplastisches Mittel ist.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 1 oder 3, wobei das antineoplastische Mittel ein auf Platin basierendes Analogon ist.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 4, wobei das auf Platin basierende Analogon Cisplatin oder Carboplatin ist.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 1, wobei das antineoplastische Mittel über einen Linker an die Oberfläche des dendritischen Polymers konjugiert sein kann.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 4, wobei das Molverhältnis von auf Platin basierendem Analogon zu dendritischem Polymer etwa 100:1 bis etwa 1:1 beträgt.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 7, wobei das Molverhältnis von auf Platin basierendem Analogon zu Dendrimer etwa 35:1 beträgt.
Antineoplastisches dendritisches Polymer nach Anspruch 1, wobei das dendritische Polymer Carbonsäureendgruppen enthält.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 1, 3, 5, 6 oder 9, wobei das dendritische Polymer ein Dendrimer ist.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 1 oder 9, wobei das Dendrimer ein Poly(amidoamin)- oder Poly(propylenimin)-Dendrimer ist.
Antineoplastisches dendritisches Polymerkonjugat nach Anspruch 11, wobei das Dendrimer ein Poly(amidoamin)-Dendrimer einer Generation von 3.5 bis 7.5 ist.
Verfahren zur Herstellung eines antineoplastischen dendritischen Polymerkonjugats, umfassend: Bereitstellen eines dendritischen Polymers mit funktionellen Gruppen, welche für ein antineoplastisches Mittel zugänglich sind, das mit den funktionellen Gruppen in einem geeigneten Lösungsmittel wechselwirken kann, Inkontaktbringen des dendritischen Polymers mit einem antineoplastischen Mittel in einem geeigneten Lösungsmittel unter Bedingungen, welche ausreichend sind, um eine Assoziation des antineoplastischen Mittels mit dem dendritischen Polymer zu bewirken, und Zugestehen einer ausreichenden Zeitdauer, um eine Verkapselung des antineoplastischen Mittels in dem dendritischen Polymer zu gestatten.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das antineoplastische Mittel ein auf Platin basierendes Analogon ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das auf Platin basierende Analogon Cisplatin oder Carboplatin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13–15, wobei das dendritische Polymer ein Dendrimer ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das dendritische Polymer ein Poly(amidoamin)- oder Poly(propylenimin)-Dendrimer ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die funktionellen Endgruppen Carbonsäuren sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das dendritische Polymer in Wasser gelöst wird und mit einem in Wasser gelösten antineoplastischen Mittel in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das antineoplastische Mittel ein auf Platin basierendes Analogon ist, welches im Konjugat in einem Molverhältnis von etwa 100:1 bis 1:1 zum dendritischen Polymer vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Molverhältnis von auf Platin basierendem Analogon zum dendritischen Polymer im Konjugat etwa 35:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei das auf Platin basierende Analogon Cisplatin oder Carboplatin ist.