DE60126757T2

DE60126757T2 - Quervernetzte kollagen-matrices und methoden zu deren herstellung

Info

Publication number: DE60126757T2
Application number: DE60126757T
Authority: DE
Inventors: Matitiau Noff; Shahar. Pitaru
Original assignee: ColBar R and D Ltd
Current assignee: ColBar R and D Ltd
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2021-04-18
Also published as: US20020019516A1; CA2406972A1; WO2001079342A2; AU5250001A; DE60126757D1; ATE354368T1; JP2004515451A; CA2406972C; AU784758B2; BRPI0110312B8; EP1280545B1; BRPI0110312B1; US6682760B2; BRPI0110312A; JP4664568B2; WO2001079342A3; EP1280545A4; EP1280545A2; MXPA02010343A

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft vernetzte Kollagenmatrices und Verfahren zu ihrer Herstellung. Sie betrifft insbesondere ein neues Verfahren zur Vernetzung von Kollagen unter Einsatz reduzierender Zucker und vernetzte Kollagenmatrices und Zubereitungen, die nach diesem Verfahren erhalten wurden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kollagene sind Schlüsselmoleküle im Tierreich, die nahezu 25-30% aller Proteine der Säugetierorganismen ausmachen. Kollagene sind natürliche Biopolymere, die als fibrilläre Netzwerke und andere Formen von Überstrukturen organisiert sind. Die fibrillären Kollagene, und insbesondere das Kollagen vom Typ I, machen mit der größten Häufigkeit 80% der Bindegewebsproteine aus. Dieses hohe Vorkommen der fibrillären Kollagene, deren Verfügbarkeit aus tierischen Quellen und die Möglichkeit, Monomerlösungen aus gereinigtem Kollagen herzustellen, die zu dreidimensionalen fibrillären Matrices polymerisiert werden können, machen diese Kollagene zu idealen Ausgangsstoffen für natürliche Biomaterialien. Darüber hinaus zeigen die fibrillären Kollagene einen hohen Konservierungsgrad und sind aus diesem Grund schwache Antigene. Die wichtigsten antigenen Stellen der fibrillären Kollagenmoleküle befinden sich im Innern der nicht-helikalen Telopeptide, welche den helikalen Teil des Moleküls flankieren.
Im lebenden Organismus wird die Polymerstruktur der fibrillären Kollagene durch intermolekulare Vernetzungen stabilisiert, die durch einen enzymatischen Prozess gebildet werden. Wegen der gestaffelten Anordnung der Kollagenmoleküle verbrücken die meisten Vernetzungen die Telopeptiddomäne des einen Moleküls und die helikale Domäne eines angrenzenden Moleküls. Eine zusätzliche Vernetzung tritt als Teil der Alterung von Kollagen und Bindegewebe durch den Prozess der Glykation ein.
Die Glykation von Proteinen, einschließlich dem Kollagen, findet als physiologischer Prozess des Alterns im Laufe eines Lebens statt, nachdem die Proteine mit Glukose in Berührung kommen. Es hat sich herausgestellt, dass glykierte fibrilläre Kollagene einen erhöhten Vernetzungsgrad aufweisen und deshalb beständiger gegen einen Abbau durch Kollagenasen, den spezifischen Enzymen, die Kollagen zersetzen, sind.
Der Prozess der Glykation durch Glukose verläuft langsam, da deren physiologische Konzentration im Serum relativ niedrig ist und nur geringe Mengen davon in der acyclischen Aldehydform vorliegen, welche die reaktive Form darstellt. Wie man festgestellt hat, ist D(-)Ribose 1000 mal reaktiver als Glukose bei der Veranlassung der Glykation und der Vernetzung von Kollagenmolekülen zu fibrillären Kollagenen. So ist beispielsweise die 5-tägige Inkubation von nativem fibrillären Kollagen in 0,2 M D(-)-Ribose gleichzusetzen mit einer 20-jährigen Einwirkung einer physiologischen Glucosekonzentration. Die Vernetzungen, die durch die Glykati on gebildet werden, verbrücken hauptsächlich die Domänen der Dreifachhelices benachbarter Moleküle.
Die Wirksamkeit kollagenbasierender Bioprodukte hängt einerseits von der Kontrolle ihrer funktionellen Langlebigkeit innerhalb des Körpers ab und andererseits von der Bewahrung der biologischen Eigenschaften der nativen Kollagenkomponente. Die funktionelle Langlebigkeit der Kollagenkomponente hängt ihrerseits wiederum von ihrem Vermögen ab, spezifischen enzymatischen Abbauvorgängen durch Kollagenasen (Metalloproteinasen) standzuhalten. Dieses Vermögen steht in direkter Beziehung zur Anzahl der intramolekularen und intermolekularen Vernetzungen im Kollagenpolymer. Je höher die Anzahl der Vernetzungen ist, desto größer ist die Beständigkeit gegenüber den Abbau durch Kollagenase.
Beispielhafte Vernetzungsmittel, die im Stand der Technik zur Auswahl stehen, sind Glutaraldehd und andere ähnliche nichtphysiologische Agenzien. Diese Vernetzungsmittel reagieren mit den Aminosäureresten des Kollagenmoleküls und bilden intermolekulare Vernetzungen aus. Diese scharten Mittel können aber auch negative Einflüsse auf die Bioverträglichkeit und die biologische Aktivität vernetzter kollagenbasierender Bioprodukte ausüben, die in Veränderungen in der Konformation des Kollagenmoleküls und dem Auswaschen von Vernetzungsmittel begründet liegen. Aus diesem Grund werden Kollagenprodukte, die durch nichtphysiologische Mittel vernetzt wurden, schlecht vom Wirtsgewebe angenommen und darin integriert. Darüber hinaus stellen lokale Entzündungen und komplexere systemische Reaktionen unerwünschte Nebeneffekte von Kollagenprodukten dar, die mit Glutaraldehyd vernetzt wurden.
U.S.-Patent 4,971,954 von Brodsky et al. offenbart den Einsatz von D(-)Ribose oder anderen reduzierenden physiologischen Zuckern als physiologische Mittel zur Vernetzung von Kollagenmatrices durch das Verfahren der Glykation. Die durch Brodsky et al. offenbarte Methode ist allerdings nur wirksam, wenn das Kollagensubstrat aus nativen Kollagenfasern besteht, und ist nur zum Teil effizient bei Kollagenmatrices, die aus rekonstituiertem fibrillären Kollagen bestehen, insbesondere dann, wenn es sich bei dem Kollagen um ein Atelopeptid handelt. Atelopeptidkollagen wird durch Pepsin-Solubilisation von nativem Kollagen hergestellt. Da das Pepsin die Telopeptide des Kollagenmoleküls abtrennt, die antigen sind, stellt das pepsinsolubilisierte Kollagen die am häufigsten eingesetzte Kollagenform in der biomedizinischen Industrie dar.
In der Methode, die durch Brodsky et al. in U.S.-Patent 4,971,954 offenbart ist, erfolgt die Vernetzung über ein Glykationsverfahren. In diesem Verfahren kondensiert die acyclische Form der D(-)Ribose spontan mit den ε-Aminogruppen der Lysyl- und Hydroxylysyl-Reste, die sichin der Domäne der Dreifachhelix des Kollagenmoleküls befinden. Das Kondensationsprodukt ist eine Schiffsche Base, die eine Amadori-Umlagerung zu einem Ketoamin-Addukt durchmacht. Die Ketoamine benachbarter Kollagenmoleküle kondensieren unter Ausbildung kovalenter Verknüpfungen, deren exakte Struktur bislang noch nicht aufgeklärt werden konnte, obwohl neuerdings fluoreszierende heterozyklische Strukturen und andere Strukturtypen vorgeschlagen wurden.
Brodsky et al. offenbaren das Glykationsverfahren für natives fibrilläres Kollagen vom Typ I, wie beispielsweise dem nativen fibrillären Kollagen vom Typ I einer Rattensehne. Allerdings ist die Vernetzung über das Glykationsverfahren nach Brodsky et al. reversibel. So zeigt zum Beispiel Tanaka et al. in einem Artikel mit dem Titel „ISOLATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF COLLAGEN CHAINS DIMERIZED BY SHUGAR-DERIVED CROSSLINKS", veröffentlicht im „The Journal of Biological Chemistry Bd. 263 (33), S. 17650-17657, 1988, dass Rattensehnen-Kollagen, das einen Tag lang mit D(-)Ribose vernetzt wurde, nach einem Zeitraum von 5 Tagen zu 50% reversibel ist.
U.S.-Patent 5,955,438 von Pitaru et al. offenbart unter anderem ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenmatrices und Membranen aus Atelopeptid-rekonstruierten Kollagenfibrillen, die zu einer Membran geformt und anschließend durch einen reduzierenden Zucker, wie D(-)-Ribose vernetzt werden. Membranen oder Implantate, die daraus hergestellt werden, werden danach einer Kritischen-Punkt-Trocknung zur Trocknung und Sterilisation unterworfen, während die dreidimensionale Struktur des Implantats bewahrt wird. Das Verfahren der Kritischen-Punkt-Trocknung verbessert die Widerstandsfähigkeit der Kollagenmatrix gegenüber Abbaureaktionen durch Kollagenase.
Die Vernetzung von nativem Kollagen mit D(-)-Ribose macht die nativen Kollagenfasern widerstandsfähig gegenüber Kollagenaseabbau. Allerdings führt die Vernetzung von Atelopeptid-rekonstituierten Kollagenfibrillen durch D(-)-Ribose kaum zur Erhöhung ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Abbau durch Kollagenase. Der Grund dafür ist nicht klar. Da durch Arbeiten von Tanaka et al. (siehe Referenzliste) gezeigt werden konnte, dass riboseinduzierte Vernetzungen zwischen nativen Kollagenmolekülen hauptsächlich zwischen den Dreifachhelix-Abschnitten benachbarter Kollagenmoleküle auftreten, sollte die Entfernung der Telopeptide nicht den Vernetzungsgrad von Atelopeptidkollagen beeinträchtigen. Eine mögliche Erklärung ist, dass sich die Packung der Atelopeptid-Kollagenmoleküle in rekonstituierten Kollagenfibrillen von der in nativen Kollagenfibrillen unterscheidet (wie in Ref. 16 der Referenzliste diskutiert). Dieser Unterschied in der Packung kann wiederum zu einer Veränderung des intermolekularen Abstandes oder der Anordnung führen, die eine Abnahme der Stärke oder Anzahl der kovalenten Vernetzungen, die durch D(-)-Ribose gebildet werden, zur Folge hat.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung wird demnach in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst den Schritt, Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen reduzierenden Zucker umfasst, um vernetztes Kollagen zu bilden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem polaren Lösungsmittel um ein organisches polares Lösungsmittel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem organischen polaren Lösungsmittel um einen Alkohol.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das organische polare Lösungsmittel ausgewählt unter Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Kombinationen davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das polare Lösungsmittel mischbar mit Wasser.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Lösung um eine einen Puffer umfassende gepufferte Lösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Posphat-gepufferte Kochsalzlösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Wasser in einer Menge von 15%-95% (Vol./Vol.), wenigstens ein polares Lösungsmittel in einer Menge von 5%-85% (Vol./Vol.) und einen Puffer.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Kollagen ausgewählt unter nativem Kollagen, fibrillärem Kollagen, fibrillärem Atelopeptid-Kollagen, lyophilisiertem Kollagen, Kollagen aus tierischen Quellen, humanem Kollagen, rekombinantem Kollagen, pepsinverdautem Kollagen, rekonstituiertem Kollagen und Kombinationen davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst das Kollagen fibrilläres Kollagen, das aus monomolekularem Atelopeptid-Kollagen rekonstituiert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Kollagen durch Rekonstitution von monomolekularem Atelopeptid-Kollagen erhalten, das durch proteolytischen Verdau von nativem Kollagen erhalten ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Zucker wenigstens durch eine der folgenden Formeln I oder II dargestellt:
worin R¹ für H oder niederes Alkyl oder Alkylen, eine Aminosäure, ein Peptid, ein Saccharid, eine Purin- oder eine Pyrimidinbase, eine phosphorylierte Purin- oder Pyrimidinbase steht;
n für eine ganze Zahl von 2 bis 9 steht, und
p und q unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 0 bis 8 stehen, und die Summe von p und q wenigstens 2 und nicht mehr als 8 beträgt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Zucker um einen natürlich vorkommenden reduzierenden Zucker.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Zucker um eine Diose, eine Triose, eine Tetrose, eine Pentose, eine Hexose, eine Septose, eine Octose, eine Nanose oder eine Decose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Zucker ausgewählt unter Glycerose, Threose, Erythrose, Lyxose, Xylose, Arabinose, Ribose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose und Talose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Zucker um ein Disaccharid.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Disaccharid ausgewählt unter Maltose, Lactose, Cellobiose, Gentiobiose, Melibiose, Turanose und Trehalose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eine Verbindung zur Lösung zugegeben, in der der Inkubationsschritt erfolgt, und die wenigstens eine Verbindung wird in einer Matrix aus dem vernetzten Kollagen immobilisiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Substanz ausgewählt unter einem antimikrobiellen Mittel, einem entzündungshemmenden Mittel, einem Faktor mit gewebeinduzierenden Eigenschaften und Kombinationen davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Zucker um D(-)-Ribose und bei dem polaren Lösungsmittel um Ethanol.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Wasser in einer Menge von 15%-95% (Vol./Vol.) und Ethanol in einer Menge von 5%-85% (Vol./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Wasser in einer Menge von 25%-50% (Vol./Vol.) und Ethanol in einer Menge von 50%-75% (Vol./Vol.)
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst die Lösung etwa 30% (Vol./Vol.) Wasser und etwa 70% (Vol./Vol.) Ethanol.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, liegt die Konzentration der D(-)-Ribose in der Lösung im Bereich von 0,1% bis 5% (Gew./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, liegt die Konzentration der D(-)-Ribose in der Lösung im Bereich von 0,5% bis 3% (Gew./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren den Schritt, dass man das vernetzte Kollagen nach dem Inkubationsschritt wäscht, um das polare Lösungsmittel und den Überschuss des reduzierenden Zuckers zu entfernen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren den Schritt, dass man das vernetzte Kollagen entwässert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren den Schritt, dass man das vernetzte Kollagen einer Kritischen-Punkt-Trocknung unterzieht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man das Kollagen vor dem Inkubationsschritt trocknet oder gefriertrocknet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man das Kollagen trocknet oder gefriertrocknet. Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine vernetzte Kollagenzubereitung zur Verfügung gestellt, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt ist.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst den Schritt, Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein hydrophiles Lösungsmittel und wenigstens einen reduzierenden Zucker umfasst, um vernetztes Kollagen zu bilden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man die Zeitdauer der Inkubation beim Inkubationsschritt steuert, um den Vernetzungsgrad des vernetzten Kollagens zu steuern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man die Konzentration des Zuckers steuert, der beim Inkubationsschritt eingesetzt wird, um den Vernetzungsgrad des vernetzten Kollagens zu steuern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man die Konzentration des hydrophilen Lösungsmittels steuert, der beim Inkubationsschritt eingesetzt wird, um den Vernetzungsgrad des vernetzten Kollagens zu steuern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man zumindest einen Teil des nicht umgesetzten Zuckers entfernt und zumindest einen Teil des hydrophilen Lösungsmittels entfernt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren den Schritt, dass man außerdem das vernetzte Kollagen wäscht, um zumindest einen Teil des nicht umgesetzten Zuckers und zumindest einen Teil des hydrophilen Lösungsmittels zu entfernen.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst den Schritt, Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und D(-)-Ribose umfasst.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das organische polare Lösungsmittel ausgewählt unter Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Kombinationen davon.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Kollagen ausgewählt unter nativem Kollagen, fibrillärem Kollagen, fibrillärem Atelopeptid-Kollagen, lyophilisiertem Kollagen, Kollagen aus tierischen Quellen, humanem Kollagen, rekombinantem Kollagen, pepsinverdautem Kollagen, rekonstituiertem Kollagen, und Kombinationen davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Kollagen fibrilläres Kollagen, das aus monomolekularem Atelopeptid-Kollagen rekonstituiert ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Kollagen durch Rekonstitution von monomolekularem Atelopeptid-Kollagen erhalten, das durch proteolytischen Verdau von nativem Kollagen erhalten ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Konzentration der D(-)-Ribose in der Lösung im Bereich von 0,1% bis 5% (Gew./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Konzentration der D(-)-Ribose in der Lösung im Bereich von 0,5% bis 3% (Gew./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Wasser in einer Menge von 15%-95% (Vol./Vol.) und wenigstens ein polares Lösungsmittel in einer Menge von 5%-85% (Vol./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Posphat-gepufferte Kochsalzlösung in einer Menge von 15%-95% (Vol./Vol.) und wenigstens ein polares Lösungsmittel in einer Menge von 5%-85% (Vol./Vol.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Lösung um eine einen Puffer umfassende gepufferte Lösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Posphat-gepufferte Kochsalzlösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lösung Wasser in einer Menge von 15%-95% (Vol./Vol.), wenigstens ein polares Lösungsmittel in einer Menge von 5%-85% (Vol./Vol.) und einen Puffer.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt, das außerdem den Schritt umfasst, rekonstituiertes fibrilläres Atelopeptid-Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen reduzierenden Zucker umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Lösung um eine gepufferte Lösung.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt, das eine erwünschte Beständigkeit gegen Abbau aufweist. Das Verfahren umfasst den Schritt, Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen Zucker umfasst, und die Zeitdauer der Kollageninkubation so auszuwählen, dass vernetztes Kollagen mit einer erwünschten Beständigkeit gegen Abbau erhalten wird.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt, das eine erwünschte Beständigkeit gegen Abbau aufweist. Das Verfahren umfasst den Schritt, Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen Zucker umfasst, und die Konzentration des polaren Lösungsmittels so auszuwählen, dass vernetztes Kollagen mit einer erwünschten Beständigkeit gegen Abbau erhalten wird.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen zur Verfügung gestellt, das eine erwünschte Beständigkeit gegen Abbau aufweist. Das Verfahren umfasst den Schritt, Kollagen in einer Lösung zu inkubieren, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen Zucker umfasst, und außerdem die Konzentration des Zuckers, der beim Inkubationsschritt eingesetzt wird, so auszuwählen, dass vernetztes Kollagen mit einer erwünschten Beständigkeit gegen Abbau erhalten wird.
Weiterhin wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen zur Verfügung gestellt, die durch ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus fibrillärem Kollagen erhalten wird. Das Verfahren umfasst die Schritte, bei denen man: eine Matrix bereitstellt, die rekonstituiertes fibrilläres Kollagen umfasst; und die Matrix in einer Lösung inkubiert, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen Zucker umfasst, um das fibrilläre Kollagen unter Bildung einer Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen zu vernetzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Matrix in Form einer implantierbaren Vorrichtung vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der implantierbaren Vorrichtung um eine Kollagen-basierte Membranbarriere für die gesteuerte Geweberegeneration.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung der Matrix außerdem den Schritt, dass man die Matrix aus vernetztem Kollagen nach dem Inkubationsschritt wäscht, um zumindest einen Teil des polaren Lösungsmittels und des nicht umgesetzten Überschusses des reduzierenden Zuckers zu entfernen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man die Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen entwässert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren den Schritt, dass man außerdem die Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen einer Kritischen-Punkt-Trocknung unterzieht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren außerdem den Schritt, dass man die Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen trocknet oder gefriertrocknet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das fibrilläre Kollagen fibrilläres Kollagen, das aus monomolekularem Atelopeptid-Kollagen rekonstituiert ist.
Schließlich ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das fibrilläre Kollagen durch Rekonstitution von monomolekularem Atelopeptid-Kollagen hergestellt, das durch proteolytischen Verdau von nativem Kollagen erhalten ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Um die vorliegende Erfindung besser zu verstehen und ihre Ausführbarkeit aufzuzeigen, werden mehrere bevorzugte Ausführungsformen im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen beispielhaft erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken:
1A ist ein schematisches Balkendiagramm, das den Glykationsgrad von 4 Proben einer bestimmten Kollagenzusammensetzung zeigt, die unterschiedlichen experimentellen Bedingungen ausgesetzt waren;
1B ist ein schematisches Balkendiagramm, das den prozentualen Abbau von 4 Proben einer bestimmten Kollagenzusammensetzung durch bakterielle Kollagenase zeigt, die denselben 4 unterschiedlichen experimentellen Bedingungen ausgesetzt waren, wie die entsprechenden Proben aus 1A;
2A und 2B sind schematische Diagramme, die den Effekt der Inkubationszeit von Kollagenmatrices, inkubiert in einer Lösung umfassend Ethanol und D(-)-Ribose, auf den Glykationsgrad und auf die Beständigkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase zeigen.
3 ist ein schematisches Balkendiagramm, das den Effekt der Ethanolkonzentration während der Vernetzung von Kollagenmatrices durch D(-)-Ribose-Lösungen, enthaltend Ethanol, auf den Abbau durch bakterielle Kollagenase zeigt.
4 ist ein schematisches Diagramm, das den Effekt der D(-)-Ribose-Konzentration während der Vernetzung von Kollagenmatrices durch D(-)-Ribose-Lösungen, enthaltend Ethanol, auf den Abbau durch bakterielle Kollagenase zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung offenbart ein neues Verfahren zur Herstellung von rekonstituiertem Atelopeptid-Kollagen, das mit reduzierenden Zuckern, wie D(-)-Ribose, vernetzt ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, dass D(-)-Ribose eine stabile Vernetzung von rekonstituierten Atelopeptid-Kollagenmatrices bewirkt, und verbessert das Vermögen von D(-)-Ribose, native oder rekonstituierte Atelopeptid-Kollagenmatrices zu vernetzen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine präzise Kontrolle der Geschwindigkeit des biologischen Abbaus von Kollagenmatrices, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit D(-)-Ribose vernetzt wurden.
In der Methode, die durch Pitaru et al. im U.S.-Patent 5,955,438 offenbart ist, haben die Erfinder das Vernetzen von fibrillären Kollagenmatrices in gepufferten wässrigen Riboselösungen offenbart, gefolgt von dem Verfahren der Kritischen-Punkt-Trocknung, damit die dreidimensionale Gestalt von Implantaten auf der Basis von Kollagenmatrices, die durch D(-)-Ribose vernetzt wurden, erhalten bleibt. Es hat sich herausgestellt, das der Einsatz des Kritischen-Punkt-Trocknungsschrittes nach dem Vernetzungsschritt, der durch Inkubation in wässriger Riboselösung erfolgt, die Beständigkeit der resultierenden vernetzten Kollagenmatrices gegenüber Kollagenase verbessert.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass, falls ein polares Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, in einer Menge von 30 – 85% (Vol/Vol) zur gepufferten D(-)-Riboselösung zugesetzt wird, in der Kollagen während des Vernetzungsschrittes inkubiert wurde, die Beständigkeit der resultierenden vernetzten Kollagenmatrices gegenüber Abbau überraschend und unerwartet verbessert wurde, verglichen mit der Widerstandsfähigkeit vernetzter Kollagenmatrices, wie sie durch Inkubation von Kollagenmatrices in D(-)-Ribose in Phospat-gepufferten Kochsalzlösungen (PBS) resultieren.
Ein weiteres unerwartetes Resultat war, dass Kollagen, das durch Inkubation in alkoholischer D(-)-Riboselösung vernetzt wurde und nachfolgend der Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen wurde, gegenüber Abbaureaktionen signifikant beständiger ist als vernetzte Kollagenmatrices, die durch Inkubation von Kollagenmatrices in D(-)-Ribose in Phospat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resultieren (hergestellt nach der Offenbarung in U.S.-Patent 5,955,438).
Beispiel 1
Kollagenmatrices wurden aus Kollagen gemäß der Methode hergestellt, wie sie in U.S.-Patent 5,955,438 offenbart ist. Zusammenfassend erläutert, wurde eine Lösung von molekular gereinigtem pepsinverdauten Rinderkollagen vom Typ I (1-10 mg/ml), hergestellt aus Rindersehnen, die kommerziell von Pel-Freez, AR, U.S.A erhältlich sind, in 0,01 M HCl gelöst und bei 4°C gehalten, bis zu einem pH-Wert im Bereich zwischen 7,2 und 7,4 durch 0,1 M NaOH neutralisiert, in eine passende Form gegossen und über einen Zeitraum von 24 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 38°C inkubiert. Die auf diese Weise hergestellte Matrix wur de dann mittels einer Presse komprimiert, um die überschüssige Lösung zu entfernen. Die resultierenden Kollagenmembranen wurden daraufhin den folgenden fünf unterschiedlichen Behandlungsarten unterworfen:

Behandlungsgruppe Nr. 1 – die Membranen dieser Gruppe wurden 11 Tage in PBS inkubiert.
Behandlungsgruppe Nr. 2 – die Membranen dieser Gruppe wurden 11 Tage in einer 3 %igen Lösung von D(-)-Ribose in PBS inkubiert.
Behandlungsgruppe Nr. 3 – die Membranen dieser Gruppe wurden 11 Tage in einer 3 %igen Lösung von D(-)-Ribose in PBS inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Membranen mehrfach in PBS gewaschen, um die D(-)-Ribose zu entfernen. Die Membranen wurden dann in einer Serie von Ethanollösungen, deren Konzentration fortlaufend anstieg (30% bis 100% Ethanol), entwässert, und anschließend der Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen, wie sie im Detail in Spalte 7, Zeilen 4-15 im U.S.-Patent 5,955,438 offenbart ist.
Behandlungsgruppe Nr. 4 – die Membranen dieser Gruppe wurden 11 Tage in einer Lösung inkubiert, die 30% (Vol/Vol) PBS, 70% (Vol/Vol) Ethanol, und 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose umfasste.
Behandlungsgruppe Nr. 5 – die Membranen dieser Gruppe wurden 11 Tage in einer Lösung inkubiert, die 30% (Vol/Vol) PBS, 70% (Vol/Vol) Ethanol, und 3% (w/Vol) D(-)Ribose umfasste. Nach der Inkubation wurden die Membranen mehrfach in PBS gewaschen, um die D(-)Ribose zu entfernen. Die Membranen wurden dann in einer Serie von Ethanollösungen, deren Konzentration fortlaufend anstieg (30% bis 100% Ethanol), entwässert, und anschließend der Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen, wie sie oben bei der Behandlungsgruppe Nr. 3 offenbart ist.

Nachdem die oben offenbarten Behandlungen abgeschlossen waren, wurden alle Membranen auf ihre Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase untersucht. Der Test erfolgte, indem man die Testmembranen in einer Lösung inkubierte, die 350 Einheiten bakterielle Kollagenase pro Milliliter Abbaupuffer enthielt. Der Abbaupuffer umfasste 111 mM NaCl; 5,4 mM KCl; 1,3 mM MgCl₂; 0,5 mM ZnCl₂ und 21,3 mM Tris-Base bei einem pH-Wert von 7,45. Bei der bakteriellen Kollagenase handelt es sich um die Kollagenase Kat. Nr. C-9891, die von Sigma Chemical Col, MO, U.S.A kommerziell erhältlich ist. Im Anschluss an den Kollagenase-Test wurde die Menge des verdauten und nicht-verdauten Kollagens im Überstand und im Pellet mittels einer modifizierten Lowry-Methode bestimmt, wie sie in der Schrift von Komsa-Penkova R. et al. mit dem Titel „Modification of Lowry's Method for Collagen Concentration Measurement", veröffentlicht in J. Biochem. Methods Bd. 32, S. 33-43, 1996, offenbart ist. Die Menge des verdauten Kollagens wird als prozentualer Anteil der gesamten Proteinmenge einer jeden Probe angegeben.
Die Ergebnisse dieser oben beschriebenen fünf Behandlungen sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
Die in Tabelle 1 angegebenen Werte repräsentieren die Menge des verdauten Kollagens als prozentualen Anteil der gesamten Proteinmenge jeder getesteten Probenmembran nach der Inkubation mit Kollagenase nach den angegebenen Zeiträumen (100% bedeutet vollständigen Verdau der Probe, und 0% bedeutet, dass über den angegebenen Zeitraum kein Verdau stattgefunden hat).
Die Ergebnisse zeigen, dass die Abbaubeständigkeit bei den Membranen, die durch die Inkubation mit 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Mischung aus 70% Ethanol und 30% PBS (Behandlungsgruppe Nr. 4) vernetzt wurden, höher war als die Abbaubeständigkeit von Membranen, die durch Inkubation mit D(-)-Ribose in PBS (Behandlungsgruppe Nr. 2) vernetzt wurden, und höher war als die Abbaubeständigkeit von Membranen, die durch Inkubation mit D(-)-Ribose in PBS vernetzt wurden, anschließend entwässert und der Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen wurden (Behandlungsgruppe Nr. 3).
Es wurde außerdem festgestellt, dass Membranen, die durch Inkubation mit 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Mischung aus 70% Ethanol und 30% PBS vernetzt wurden, anschließend entwässert und der Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen wurden (Behandlungsgruppe Nr. 5) eine noch verbesserte Abbaubeständigkeit aufwiesen.
Demnach werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Kollagen oder eine Kollagenmatrix oder Strukturen, die Kollagen oder Kollagenmatrices enthalten, in einer gepufferten Lösung inkubiert, die einen reaktiven (reduzierenden) Zucker und einen Alkohol und/oder andere hydrophile organische Lösungsmittel umfasst. Bevorzugt wird die Inkubation bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Die Inkubationstemperatur kann jedoch im Bereich zwischen 4°C und 60°C variieren. Bevorzugt beträgt die Inkubationszeit zwischen 1 und 28 Tage, abhängig vom erwünschten Vernetzungsgrad. Es können jedoch auch andere unterschiedliche Inkubationszeiten eingesetzt werden, in Abhängigkeit unter anderem vom erforderlichen Beständigkeitsgrad gegen Abbaureaktionen.
Bevorzugt wird der Zucker der Inkubationsmischung zugefügt, indem er in einer gepufferten Kochsalzlösung, wie beispielsweise PBS, aufgelöst wird. Es ist jedoch auch möglich, andere geeignete Puffer oder gepufferte Salzlösungen aus dem Stand der Technik einzusetzen, um den pH-Wert und/oder die Ionenstärke der Inkubationslösung zu kontrollieren.
Bevorzugt liegt die Alkoholkonzentration der Inkubationsmischung oder -lösung zwischen 50% und 75% (Vol/Vol). Die Alkoholkonzentration kann jedoch zwischen 5% und 85% (Vol/Vol) variieren. Die bevorzugte Konzentration an reduzierendem Zucker liegt zwischen 0,5 % und 3% (Gew/Vol). Die Konzentration an reduzierendem Zucker kann jedoch zwischen 0,15 % und 6% (Gew/Vol) variieren. Gleichwohl können andere unterschiedliche Konzentration an Alkohol und/oder reduzierendem Zucker eingesetzt werden, in Abhängigkeit unter anderem von der Inkubationstemperatur und weiteren Reaktionsbedingungen, wie dem pH-Wert und dergleichen, und vom erwünschten Beständigkeitsgrad gegen Abbaureaktionen.
Im Allgemeinen wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäße Vernetzung von Kollagen wie nachfolgend beschrieben durchgeführt. Zunächst wird eine fibrilläre Kollagenzubereitung oder Matrix nach einer bekannten Methode zur Herstellung von Kollagenmatrices oder fibrillären Kollagenzubereitungen hergestellt. Das Kollagen kann durch eine beliebige bekannte Methode oder durch eine der in den obigen U.S.-Patentschriften offenbarten Methode zur Herstellung von Kollagen generiert werden, einschließlich der unten in den Beispielen angeführten Herstellungsmethoden. Die Kollagenmatrix wird in einer wässrigen neutral gepufferten Lösung inkubiert, die Ethanol und D(-)-Ribose enthält. Die Ethanolkonzentration liegt bevorzugt bei etwa 70% (Vol/Vol), kann jedoch zwischen etwa 30% und 85% (Vol/Vol) variieren; und die D(-)-Ribose-Konzentration liegt bevorzugt bei 1% (Gew/Vol), kann jedoch im Bereich von etwa 0,5% und 3% (Gew/Vol) variieren. Die Inkubationszeit wird durch den erwünschten Vernetzungsgrad festgelegt. Typischerweise kann die Inkubationszeit 14 Tage betragen; die Inkubationszeit kann jedoch im Bereich von etwa einem Tag bis 21 Tagen variieren.
Beispiel 2
Dieses Beispiel offenbart die Herstellung von injizierbaren Kollagenmatrices, die mit einer Ethanol-Ribose-Lösung vernetzt wurden.
Eine fibrilläre Kollagenmatrix wurde aus pepsinverdautem Rindersehnenkollagen vom Typ I hergestellt, wie oben detailliert in Beispiel 1 beschrieben. Die kalte saure Kollagenlösung (bei pH 3 und einer Konzentration von 3 mg/ml) wurde mit einem Alkaliphosphatpuffer neutralisiert, auf 37°C erwärmt und 24 Stunden kräftig gerührt. Das kräftige Rühren hat zur Folge, dass sich kleine Teilchen im Bereich von 150 μm bilden. Die nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C erhaltene fibrilläre Kollagenmatrix wurde zur Abtrennung der Kollagenpartikel zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde mehrfach in Posphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, indem man die Probe wiederholt zentrifugierte und re-suspendierte.
Die Proben der partikulären Kollagenmatrix wurden wie oben beschrieben in vier Gruppen unterteilt. Jede Gruppe wurde einer der vier unterschiedlichen Behandlungen unterworfen.

Gruppe A – Die partikuläre Kollagenmatrix wurde 14 Tage in einer Lösung inkubiert, die 70% (Vol/Vol) Ethanol, 30% (Vol/Vol) PBS und 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose enthielt.
Gruppe B – Die partikuläre Kollagenmatrix wurde 14 Tage in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose, gelöst in PBS, inkubiert.
Gruppe C – Die partikuläre Kollagenmatrix wurde 14 Tage in einer Lösung inkubiert, die 70% (Vol/Vol) Ethanol und 30% (Vol/Vol) PBS enthielt.
Gruppe D – Die partikuläre Kollagenmatrix wurde über einen Zeitraum von 14 Tagen in einer PBS-Lösung inkubiert.

Nach der Inkubationszeit wurden die Proben auf den Grad der Glykation untersucht. Die Anzahl der Ribosereste repräsentiert die angenommene Anzahl der intermolekularen Vernetzungen und wird durch die Formaldehydmenge ausgedrückt, die durch die Reduktion von 1 mg vernetztem Kollagen freigesetzt wird. Die eingesetzte Testmethode ist beschrieben von Tanaka S., Avigad G., Eigenberry E.F., und Brodsky B., in der Schrift mit dem Titel „ISOLATION UND PARTIAL CHARACTERIZATION OF COLLAGEN CHAINS DIMERIZED BY SUGARDERIVED CROSS-LINKS", veröffentlicht in J. Biol. Chem. Bd. 263, S. 17650 – 17657 (1988) und von Avigad G. in der Schrift mit dem Titel „A SIMPLE SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF AND OTHER FORMALDEHYDE ALDEHYDES: APPLICATION TO PERIODATE-OXIDIZED GLYCOL SYSTEMS" veröffentlicht in Anal. Biochem. Bd. 134, S. 499 – 504 (1983).
Die gleichen Proben wurden auch auf den Abbau durch bakterielle Kollagenase untersucht, wie oben detailliert in Beispiel 1 offenbart. Die im Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 300 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit in Kollagenase betrug 3 Stunden.
Es wird nun auf das Balkendiagramm von 1A verwiesen, das den Effekt der vier unterschiedlichen Inkubationsbehandlungen der Gruppen A bis D auf die Anzahl der intermolekularen Vernetzungen in den Proben verdeutlicht, ausgedrückt in Nanomol Formaldehyd, der pro Milligramm Probe gebildet wurde. Der vertikale Balken mit der Nummer 1 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe A von Beispiel 2, der vertikale Balken mit der Nummer 2 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe B von Beispiel 2, der vertikale Balken mit der Nummer 3 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe C von Beispiel 2, und der vertikale Balken mit der Nummer 4 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe D von Beispiel 2. Jeder Balken in 1A repräsentiert den Mittelwert von 3 einzelnen Messungen und die Markierungen an den Balkenenden repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert.
Die Zahl der Vernetzungen der partikulären Kollagenmatrix, die in Ethanol inkubiert wurde (Gruppe C von Beispiel 2), war fast gleich der Zahl der Vernetzungen, die bei der Vergleichsprobe gefunden wurden, die in nur PBS inkubiert wurde (Gruppe D von Beispiel 2). Die Zahl der Vernetzungen der partikulären Kollagenmatrix, die in einer Lösung von 3% D(-)-Ribose, gelöst in PBS, inkubiert wurde (Gruppe B von Beispiel 2), war etwa zweimal höher als die Zahl der Vernetzungen der partikulären Kollagenmatrix, die nur in PBS inkubiert wurde (Gruppe D von Beispiel 2). Die Zahl der Vernetzungen der partikulären Kollagenmatrix, die mit 3 D(-)-Ribose, gelöst in 70% Ethanol und 30% PBS behandelt wurde (Gruppe A von Beispiel 2), war annähernd viermal höher als die Zahl der Vernetzungen der partikulären Kollagenmatrix, die nur in PBS oder in 70% Ethanol und 30% PBS ohne Ribose inkubiert wurde (Gruppe D bzw. C von Beispiel 2), und war 2,26 mal höher als die Zahl der Vernetzungen des partikulären Kollagens, das in 3% D(-)-Ribose, gelöst in PBS, inkubiert wurde (Gruppe B von Beispiel 2) Es wird nun auf das schematische Balkendiagramm von 1B verwiesen, das den Effekt der vier unterschiedlichen Inkubationsbehandlungen der Gruppen A bis D aus dem oben offenbarten Beispiel 2, auf die Beständigkeit der partikulären Kollagenmatrix gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase veranschaulicht. Die Beständigkeit gegenüber Kollagenaseabbau wurde so ermittelt, wie es oben in Beispiel 1 offenbart ist.
In 1B repräsentiert der vertikale Balken mit der Nummer 5 die Ergebnisse für die Gruppe A von Beispiel 2, der vertikale Balken mit der Nummer 6 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe B von Beispiel 2, der vertikale Balken mit der Nummer 7 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe C von Beispiel 2, und der vertikale Balken mit der Nummer 8 repräsentiert die Ergebnisse für die Gruppe D von Beispiel 2. Jeder Balken in 1A repräsentiert den Mittelwert von 3 einzelnen Messungen und die Markierungen an den Balkenenden repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert.
Die Ergebnisse, wie sie in 1B verdeutlicht sind, zeigen, dass die Inkubation in 70 Ethanol und 30% PBS (Gruppe C von Beispiel 2) keinen signifikanten Einfluss auf die Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase hat, ähnlich wie auch die Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase bei den Vergleichsproben, die nur in PBS inkubiert wurden (Gruppe D von Beispiel 2). Die Ergebnisse zeigen, dass partikuläres Kollagen, das in 3% D(-)-Ribose in Gegenwart von 70% Ethanol und 30% PBS inkubiert wurde (Gruppe A von Beispiel 2), annähernd 20 mal beständiger gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase war als partikuläres Kollagen, das in 3% D(-)-Ribose in Gegenwart von PBS inkubiert wurde (Gruppe B von Beispiel 2), und 35 bis 40 mal beständiger gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase war, als partikuläres Kollagen, das nur in PBS oder in 70% Ethanol und 30% PBS inkubiert wurde (Gruppe D bzw. C von Beispiel 2).
Wenn die Temperatur und die Konzentrationen an reduzierendem Zucker und Alkohol konstant gehalten werden, führt eine Erhöhung der Inkubationszeit zu einer Erhöhung des Vernetzungsgrades und damit zu einer Verbesserung der Beständigkeit der Kollagenmatrix gegenüber dem bakteriellen Abbau durch Kollagenase.
Es wird nun auf die schematischen Diagramme in 2A und 2B verwiesen, die den Effekt der Inkubationszeit auf den Grad der Glykation bzw. den Abbau durch Kollagenase bei Kollagenmatrices verdeutlichen, die in einer Ethanol, PBS und D(-)-Ribose enthaltenden Lösung inkubiert wurden.
Eine partikuläre Kollagenmatrix wurde so hergestellt, wie es oben in Beispiel 2 beschrieben ist. Die vorbereitete Kollagenmatrix wurde dann in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Lösung von 30% (Vol/Vol) PBS und 70% (Vol/Vol) Ethanol 1, 3, 9 und 14 Tage inkubiert. Nach jedem Zeitabschnitt wurde die Matrix auf den Grad der Glykation (2A) und die Beständigkeit der Probe gegen den Abbau durch bakterielle Kollagenase (2B) unter Anwendung der oben offenbarten Testmethode zur Bestimmung des Glykations-Grades und dem Abbau durch Kollagenase untersucht.
In den 2A und 2B repräsentiert die horizontale Achse die Inkubationszeit in Tagen. Die vertikale Achse in 2A repräsentiert den Grad der Glykation (ausgedrückt in Nanomol Formaldehyd, der durch den Abbau von einem Milligramm Kollagen freigesetzt wurde). Die vertikale Achse in 2B repräsentiert die Menge des verdauten Kollagens als prozentualen Anteil an der gesamten Proteinmenge der Probe. Die Punkte in den 2A und 2B repräsentieren die Durchschnittswerte des Glykationsgrades bzw. der Werte des Abbaus durch Kollagenase bei unterschiedlichen Inkubationszeiten. Die Fehlerbalken an den Punkten repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert, gebildet aus 3 Testergebnissen (n=3). Wenn die Temperatur und die Konzentrationen an reduzierendem Zucker und Alkohol konstant gehalten werden, führt eine Erhöhung der Inkubationszeit demnach zu einer Erhöhung des Vernetzungsgrades und somit zu einer Verbesserung der Beständigkeit der Kollagenmatrix gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase.
Es wird nun auf das schematische Diagramm in 3 verwiesen, das den Effekt der Ethanolkonzentration während der Vernetzung auf den Abbau durch bakterielle Kollagenase bei Kollagenmatrices verdeutlicht, die durch D(-)-Ribose in Gegenwart von Lösungen vernetzt wurden, die PBS enthalten und unterschiedliche Ethanolkonzentrationen aufweisen.
Proben partikulärer Kollagenmatrix wurden so hergestellt, wie es oben in Beispiel 2 beschrieben ist, und 6 Tage in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in Gegenwart von 0%, 30 %, 50%, 70% und 85% Ethanol enthaltendem PBS (alle Prozentangaben verstehen sich als Vol/Vol) inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Matrixproben wie oben detailliert beschrieben auf die Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase untersucht. Die horizontale Achse repräsentiert die Ethanolkonzentration (%Vol/Vol) in dem PBS enthaltenden Inkubationsmedium. Die vertikale Achse repräsentiert den prozentualen Abbau, ausgedrückt als prozentuale Menge des verdauten Kollagens vom Gesamtprobenkollagen. Die Ergebnisse zeigen, dass unter den gewählten Vernetzungsbedingungen die größte Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch Kollagenase bei einer Ethanolkonzentration im Bereich zwischen etwa 50 und 85% erreicht wurde. Es ist festzuhalten, dass eine Erhöhung der Ethanolkonzentration über 70% hinaus die Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch Kollagenase verringert, wie aus den Ergebnissen der Probe, die in 85% Ethanol inkubiert wurde, ersehen werden kann. Wenn die Temperatur und die Konzentrationen an Zucker und die Inkubationszeit konstant gehalten werden, führt demnach eine Erhöhung der Ethanolkonzentration bis zu einer bestimmten optimalen Konzentration zu einer Erhöhung des Vernetzungsgrades und damit zu einer Verbesserung der Beständigkeit der Kollagenmatrix gegenüber dem Abbau durch Kollagenase.
Es wird nun auf das schematische Diagramm in 4 verwiesen, das den Effekt der D(-)-Ribose-Konzentration auf den Abbau durch bakterielle Kollagenase während der Vernet zung von Kollagenmatrices durch ethanolische D(-)-Ribose-Lösungen verdeutlicht. Proben partikulärer Kollagenmatrix wurden so hergestellt, wie es oben in Beispiel 2 beschrieben ist, und 14 Tage in Lösungen mit ansteigender D(-)-Ribose-Konzentration in 70% (Vol/Vol) Ethanol und 30% PBS (Vol/Vol) inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Matrixproben wie oben detailliert beschrieben auf die Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase untersucht. Die horizontale Achse repräsentiert die D(-)-Ribose-Konzentration (% Gew/Vol) in den Inkubationslösungen. Die vertikale Achse repräsentiert prozentualen Abbau, ausgedrückt als prozentuale Menge des verdauten Kollagens von der gesamten Kollagenmatrixprobe. Die Ergebnisse zeigen, dass unter den gewählten Vernetzungsbedingungen die Erhöhung der D(-)-Ribose-Konzentration im Bereich von 0,1% und 3% die Beständigkeit der vernetzten Kollagenmatrix gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase erhöht. Wenn die Temperatur, die Inkubationszeit und die Ethanolkonzentrationen konstant gehalten werden, führt demnach eine Erhöhung der Konzentration an reduzierendem Zucker zu einer Erhöhung des Vernetzungsgrads und somit zu einer Verbesserung der Beständigkeit der Kollagenmatrix gegenüber dem Abbau durch Kollagenase.
Die oben offenbarte Vernetzungsmethode kann auch zur Erhöhung des Vernetzungsgrades und zur Verbesserung der Beständigkeit gegenüber Abbau bei einer kommerziell erhältlichen Kollagenzubereitung angewandt werden, die der Hautunterfütterung dient, wie es in nachfolgendem Beispiel 3 verdeutlicht wird.
Beispiel 3
Zyderm^® ist eine injizierbare, hochkonzentrierte pepsinverdaute Atelopeptid-Zubereitung aus Rinderhaut. Das Kollagenmaterial kann injiziert werden und soll nach erfolgter Injektion oder Implantation im Körper Fibrillen ausbilden.
Zyderm^®1 wird hergestellt durch die Collagen Corporation, Palo Alto, CA, U.S.A, und ist kommerziell erhältlich von der Collagen Esthetics, Inc., CA, U.S.A. Das Zyderm^®1-Material (der Konzentration von etwa 35 Milligramm pro Milliliter) wird in drei Probengruppen unterteilt, die nachfolgenden Behandlungen unterworfen wurden:

Gruppe 1: 1 Milliliter Zyderm^®1 wurde mit 20 Milliliter PBS vermischt und 14 Tage inkubiert (dies ist die Vergleichsgruppe).
Gruppe 2: 1 Milliliter Zyderm^®1 wurde mit 20 Milliliter einer Lösung von 3% D(-)-Ribose gelöst in PBS vermischt und 14 Tage inkubiert.
Gruppe 3: 1 Milliliter Zyderm^®1 wurde mit 20 Milliliter einer Lösung umfassend 3% D(-)-Ribose gelöst in einer Lösung von 30% (Vol/Vol) PBS und 70% (Vol/Vol) Ethanol vermischt und 14 Tage inkubiert.

Alle Gruppen wurden bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wurden die Proben wie oben detailliert in Beispiel 2 beschrieben, auf die Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch Kollagenase untersucht. Die Kollage nasekonzentration, die in Versuch eingesetzt wurde, betrug 300 Kollagenase Einheiten/ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit betrug 3 Stunden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt. Die Menge an solubilisiertem (abgebautem) Kollagen ist als prozentualer Anteil des Gesamtproteins jeder Probe dargestellt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte, erhalten aus 3 Versuchen (n=3) ± der Standardabweichung dargestellt.
TABELLE 2
Die Ergebnisse in Tabelle 2 sind als die Menge von verdautem Kollagen als prozentualer Anteil des gesamten Kollagens in der untersuchten Probe angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Inkubation mit einer Lösung von 3% D(-)Ribose in einer 30% PBS und 70% Ethanol umfassenden Lösung annähernd viermal so wirksam ist bei der Vernetzung des Zyderm^®1-Materials wie eine Inkubation in 3%iger D(-)-Ribose-Lösung in PBS.
Die Behandlung von Zyderm^®1 mit 3%iger D(-)Ribose-Lösung in einer 70% Ethanol und 30% PBS umfassenden Lösung erhöhte die Beständigkeit dieses Materials gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase um das Fünffache (Tabelle 2).
Die injizierbaren Kollagenzubereitungen, wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind, wie z.B. das nach der obigen Beschreibung im Beispiel 2 und Beispiel 3 hergestellte injizierbare Material, können, ohne darauf beschränkt zu sein, für eine Vielzahl von Anwendungsbereichen eingesetzt werden, unter anderem bei dem Gewebeaufbau in der Kosmetik, Urologie, Gastroenterologie, Ottolaryngologie, Orthopädie und anderen Bereichen der Medizin, und bei der kontrollierten Freisetzung von Wirkstoffen, Proteinen, Hormonen und Genommaterialien Verwendung finden.
Die vorliegende Erfindung kann auch eingesetzt werden zur Verwendung von Kollagenmatrices, die durch Ethanol-Ribose-Lösungen vernetzt wurden, für die Herstellung geformter implantierbarer Kollagenmatrices.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt die Anwendung der erfindungsgemäßen Vernetzungsmethode zur Herstellung vorgeformter Flächengebilde aus Kollagenmatrices. Kollagenflächengebilde wur den aus pepsinverdauter Rinder-Atelopeptid-Kollagen-Monomerlösung hergestellt, wie oben offenbart. Zusammenfassend erläutert, wurde eine fibrilläre Kollagenmatrix durch Neutralisation einer kalten sauren Kollagenlösung (pH 3; 3 mg/ml) mit einem Alkaliphosphat-Puffer und Erwärmen der Lösung auf 37°C in einer geeigneten Form hergestellt. Das fibrilläre Kollagennetz, das durch die Polymerisation der Monomerlösung entstand, wurde dann mittels einer Presse oder beliebigen anderen Kompressionsvorrichtung in die gewünschte Form und den erwünschten Kollagengehalt pro Volumeneinheit komprimiert, während die Lösung aus dem Netz gepresst wird. Auf diese Weise wurden Kollagenscheiben mit einem Durchmesser von etwa 3 cm und einer Dicke von etwa 0,5 mm geformt und in drei unterschiedlichen Inkubationslösungen über 11 Tagen inkubiert. Eine erste Gruppe vorgeformter Kollagenflächengebilde wurde in PBS inkubiert. Eine zweite Gruppe vorgeformter Kollagenflächengebilde wurde in einer Lösung von 3% D(-)-Ribose in PBS inkubiert. Eine dritte Gruppe vorgeformter Kollagenflächengebilde wurde in einer Lösung von 3% D(-)-Ribose, gelöst in 30% (Vol/Vol) PBS und 70 % (Vol/Vol) Ethanol, inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die drei Gruppen vorgeformter Kollagenflächengebilde entwässert und der Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen, wie sie oben offenbart ist, und auf ihre Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase hin untersucht, wie oben in Beispiel 1 offenbart. Die Kollagenasekonzentration im Test betrug 350 Kollagenase Einheiten/ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit betrug 5 Stunden.
Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefasst und zeigen, dass die Flächengebilde, die in einer Lösung von D(-)-Ribose in einer Ethanol/PBS-Mischung vernetzt wurden, eine wesentlich höhere Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase aufwiesen, als die Flächengebilde, die durch Inkubation in D(-)-Ribose-Lösung in PBS hergestellt wurden.
TABELLE 3
Im Allgemeinen kann erfindungsgemäß aus einer fibrillären Kollagenmatrix ein geformter Artikel hergestellt werden, wie zum Beispiel ein Flächengebilde oder ein Schlauch oder ein beliebiger anderer Formkörper. Die Kollagenmatrix wird schrittweise entwässert in einer Reihe von wässrigen Ethanollösungen mit ansteigendem Ethanolgehalt bis hin zu einer Ethanolkonzentration von 70%. Der formgefertigte oder auf andere Weise geformte Kollagenmatrix-Artikel wird anschließend in einer wässrigen Lösung von 3% D(-)-Ribose inkubiert, die 70% Ethanol enthält. Der gewünschte Vernetzungsgrad wird durch Variation der Inkubationszeit erreicht. Wie vorstehend offenbart und in den 2A und 2B dargestellt, steigt der Beständigkeitsgrad der Kollagenmatrix gegenüber Abbau durch bakterielle Kollagenase mit zunehmen der Inkubationszeit. Nachdem der erwünschte Vernetzungsgrad erreicht ist, kann die Matrix entweder in einer Reihe von wässrigen Ethanollösungen mit ansteigendem Ethanolgehalt entwässert werden, oder aber die Matrix wird weiter entwässert und einer Kritischen-Punkt-Trocknung unterworfen, wie es detailliert in U.S.-Patent 5,955,438 von Pitaru et al. offenbart ist. Wird die erste Alternative gewählt, sollte die Matrix vor der Implantation oder anderen Einsatzzwecken in einer feuchten Atmosphäre gelagert und aufbewahrt werden. Im Falle der zweiten Alternative sollte die Matrix in einer trockenen Umgebung gelagert und aufbewahrt werden.
Die Kollagenmatrix, die gemäß der vorliegenden Erfindung vernetzt werden kann, kann jede dem Fachmann bekannte Form annehmen. So können beispielsweise Flächengebilde, Schläuche, Schwämme, Flocken, Gele, Perlen, Mikrokugeln und andere ähnliche geometrische Formen, die aus den vorstehend offenbarten Kollagensorten gebildet sind, mit der erfindungsgemäßen Methode vernetzt werden. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Kollagenmatrix mit Zusatzstoffen wie Pharmazeutika, weiteren Proteinen oder synthetischen Polymeren chemisch und/oder physikalisch modifiziert werden.
Es ist anzumerken, dass die exakte Konzentration von D(-)-Ribose, die Ethanolkonzentration und die einzelnen Vernetzungsbedingungen, wie beispielsweise die Inkubationszeit und Inkubationstemperatur, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, im Bedarfsfall variiert werden können, um das resultierende Abbauverhalten des Implantats oder des Artikels zu steuern, der aus der Kollagenmatrix generiert wurde. Derartige gesteuerte Variationen ermöglichen unter anderem die Herstellung von Implantaten oder anderen kollagenbasierten Artikeln mit einer definierten Beständigkeit im lebenden Organismus gegenüber Abbau.
Beispiel 5
Obwohl bei den obigen Beispielen von vernetztem Kollagen, das unter Einsatz der erfindungsgemäßen Vernetzungsmethode hergestellt wurde, Rinderkollagen-Zubereitungen eingesetzt wurden, kann das erfindungsgemäße vernetzte Kollagen auch auf Kollagen von anderen unterschiedlichen Quellen angewendet werden. In den nachfolgenden beiden Beispielen wird die erfindungsgemäße Vernetzungsmethode auf zwei unterschiedliche Formen von humanem Kollagen angewandt.
Versuch 1
Eine humane Achillessehne wurde mit Ficin behandelt, um nicht-kollagenöse Proteine zu entfernen, wie es Stand der Technik ist. Die Sehne wurde in kleine Stücke (1-2 mm²) geschnitten und dann in vier Probengruppen unterteilt. Die erste Probengruppe wurde 14 Tage als Vergleichsgruppe in PBS inkubiert. Die zweite Probengruppe wurde in einer Lösung von 3 D(-)-Ribose in PBS über 14 Tage inkubiert. Die dritte Probengruppe wurde in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Mischung von 30% (Vol/Vol) PBS und 70% (Vol/Vol) Ethanol 6 Tage inkubiert. Die vierte Probengruppe wurde in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Mischung von 30% (Vol/Vol) PBS und 70% (Vol/Vol) Ethanol 14 Tage inkubiert.
Versuch 2
Kommerziell von Collagenesis Inc, MA, USA, erhältliches Dermalogen^TM ist eine injizierbare Kollagenmatrix, die aus humaner Haut nach Entfernung der nicht-kollagenösen Proteine erhalten und als serienmäßig produziertes allogenes Implantat verwendet wird. Dermalogen^TM-Kollagenmatrix wurde in vier Probengruppen unterteilt. Die erste Gruppe der Dermalogen^TM-Proben wurde 14 Tage als Vergleichsgruppe in PBS inkubiert. Die zweite Gruppe der Dermalogen^TM-Proben wurde 14 Tage in einer Lösung von 3% D(-)-Ribose in PBS inkubiert. Die dritte Gruppe der Dermalogen^TM-Proben wurde 6 Tage in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Mischung von 30% (Vol/Vol) PBS und 70% (Vol/Vol) Ethanol inkubiert. Die vierte Probengruppe wurde 14 Tage in einer Lösung von 3% (Gew/Vol) D(-)-Ribose in einer Mischung von 30% (Vol/Vol) PBS und 70% (Vol/Vol) Ethanol inkubiert.
Nach dem Vernetzungszeitraum wurden alle Proben aus Versuch 1 und Versuch 2 auf ihre Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase untersucht, wie oben in Beispiel 1 offenbart. Die Kollagenasekonzentration im Test betrug 350 Kollagenase Einheiten/ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit betrug 5 Stunden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 zusammengestellt.
TABELLE 4
Die Ergebnisse des Kollagenase-Abbaus sind in Tabelle 4 angegeben als prozentualer Anteil der Menge an solubilisiertem Kollagen vom Gesamtproteingehalt jeder Probe. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte aus 3 Versuchen (n=3) ± Standardabweichung dargestellt. Die Ergeb nisse in Tabelle 4 zeigen, dass die erfindungsgemäße Vernetzungsmethode auf Kollagen anderer Quellen anwendbar ist. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen weiterhin, dass die Inkubation des humanen Kollagens in 3% D(-)-Ribose in 70% Ethanol und 30% PBS die Beständigkeit der vernetzten entproteinisierten humanen Kollagenproben gegenüber kollagenolytischen Abbau um ein Mehrfaches erhöht, verglichen mit den Kollagenpraben humanen Ursprungs, die über den selben Zeitraum in 3% D(-)-Ribose in PBS inkubiert wurden. Die Menge des abgebauten Kollagens in den Proben der humanen Achillessehne, die in 3% D(-)-Ribose in 70% Ethanol und 30% PBS inkubiert wurden, war etwa 16 mal kleiner als die Menge an abgebautem Kollagen in den Proben der humanen Achillessehne, die in 3% D(-)-Ribose in PBS inkubiert wurden. Ebenso war auch die Menge des abgebauten Kollagens in den Dermalogen^TM-Proben, die in 3% D(-)-Ribose in 70% Ethanol und 30% PBS inkubiert wurden, etwa 7 mal kleiner als die Menge an abgebautem Kollagen Dermalogen^TM-Proben, die in 3% D(-)-Ribose in PBS inkubiert wurden.
Im Allgemeinen kann die erfindungsgemäße Vernetzungsmethode auf verschiedene Arten von Kollagenmatrices aus unterschiedlichen Quellen angewendet werden, die aus molekularen Kollagenlösungen durch Rekonstruktion hergestellt wurden, wie oben detailliert beschrieben, oder durch Entfernung nicht-kollagenöser Proteine und der Proteoglycane aus Gewebe erhalten wurden, die Kollagenmatrices enthalten. Beispiele derartiger Gewebe sind Blutgefäße, Haut, Herzbeutel, Sehnen, Wurzelhäute, Knochen, Bindegewebe, Kapselgewebe, Hornhaut, Augengewebe, Eingeweide und ähnliche. Diese Gewebe können von verschiedenen Lebewesen gewonnen werden, einschließlich Rind, Schwein, Mensch und ähnliche, ohne sich jedoch darauf zu beschränken. Die Entfernung nicht-kollagenöser Proteine und der Proteoglycane kann durch enzymatischen Abbau oder durch Extraktionen erfolgen, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist. Nach dem Deproteinierungsschritt wird die verbleibende Kollagenmatrix in einer gepufferten wässrigen ethanolhaltigen D(-)Riboselösung gemäß der Methodik, die in den obigen Beispielen beschrieben ist, vernetzt.
Bei dem Kollagen, das durch die erfindungsgemäße Methode vernetzt werden kann, kann es sich um native Kollagenfasern handeln, die durch vollständige oder teilweise Extraktion zellulärer Bestandteile und/oder nicht-kollagenöser Proteine aus kollagenhaltigen Geweben gewonnen werden. Die Methode kann ebenso zur Vernetzung rekonstituierter Fibrillen von nativen (nicht pepsin-verdauten) Kollagenmolekülen eingesetzt werden. Die Methode kann weiterhin ebenso zur Vernetzung rekonstituierter Atelopeptid-Kollagenfibrillen eingesetzt werden. Darüber hinaus können auch Kombinationen aus den oben offenbarten Kollagenarten mit der erfindungsgemäßen Methode vernetzt werden.
Gemäß den unterschiedlichen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Kollagenmatrices der Vernetzung unterworfen werden, damit sie für unterschiedliche Anwendungsbereiche einsetzbar sind, wie beispielsweise, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, als außerzelluläres Matrixgerüst bei der Gewebeerneuerung, gesteuerte Wirkstoff freisetzung von Pharmazeutika oder biologischen Wirkstoffen (aktive Proteine, Gene und Genüberträger), Membranen für Gewebeträger und Knochenerneuerung, injizierbare oder implantierbare Stoffe zur Gewebevergrößerung, Hüllen zur Verankerung natürlicher und/oder rekonstruierter und/oder künstlicher Organe, Füllstoffe zur Herstellung künstlicher Gewebe oder Organe, wie zum Beispiel künstliche Brüste, und als Komponente von Kompositmaterialien, die Kollagen und/oder andere natürliche oder künstliche Polymerstrukturen oder andere natürliche oder künstliche organische und anorganische Komponenten oder Kombinationen daraus, enthalten.
Beispiele von Ursprungsmaterialien zur Herstellung von Kollagenmatrices und -zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind tierische und humane kollagenreiche Gewebe, wie zum Beispiel Haut, Knochen, Sehnen, Wurzelhäute, Plazenta und ähnliche, und rekombinante Kollagene, die künstlich oder in transgenen Organismen hergestellt wurden. Die Kollagenmatrix kann eine einzige Kollagensorte enthalten, sie kann allerdings auch eine Mischung aus unterschiedlichen Kollagentypen enthalten, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Beispiele von Kollagentypen, die zur Herstellung vernetzter Kollagenzubereitungen und/oder Kollagenmatrices gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind die Kollagentypen I bis XVIII, die im Stand der Technik bekannt sind.
Weitere Beispiele anderer Arten von Kollagenmolekülen, die zur Herstellung vernetzter Kollagenzubereitungen und/oder Kollagenmatrices gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind kollagenöse Proteine, wie zum Bespiel das Anbindungsprotein aus dem Cementum (CAP), das die Anbindung und Ausbreitung von Periodontal-Zellarten fördert, wie es in einem Artikel von Komaki et al mit dem Titel „Role of MAP Kinases p42(erk-2)/p44-(erk-1) in cementum-derived attachment protein mediated cell attachment", veröffentlicht im Journal of Dental Research, Vol. 79 (10), S. 1789-1793 (2000) offenbart ist, und andere kollagenöse Proteine, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, oder modifizierte kollagenartige Peptide, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt darauf, die kollagenartigen Peptide, die von Kramer et. al in dem Artikel mit dem Titel „STAGGERED MOLECULAR PACKING IN CRYSTALS OF A COLLAGEN-LIKE PEPTIDE WITH A SINGLE CHARGED PAIR", veröffentlicht in J. Mol. Biol, 301 (5), S. 1191-1205, September 2000, offenbart, oder kollagenartige Peptide, offenbart von Kramer et. al in dem Artikel mit dem Titel „SEQUENCE DEPENDENT CONFORMATIONAL VARIATIONS OF COLLAGEN TRIPLE-HELICAL STRUCTURE", veröffentlicht in Nat. Struct. Biol., 6(5), S. 454-457, Mai 1999.
Die Herstellung von Kollagenlösungen, die für die Vernetzung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ist aus dem Stand der Technik bekannt. Kommerziell erhältliche Kollagenprodukte wie Zyderm^®, Dermalogen^TM, oder andere ähnliche Produkte, die in Form von Kollagenlösungen und/oder nativen und/oder rekonstruierten fibrillären Kollagenmatrices vorliegen, sind ebenso als Ursprungsmaterialien zur Vernetzung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispielhafte Methoden zur Herstellung verschiedener Arten von Kollagenmat rices, die für die Vernetzung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind unter anderem in U.S.-Patent 4,703,108; U.S.-Patent 4,060,081; U.S.-Patent 4,418,691; U.S.-Patent 4,374,121; U.S.-Patent 4,409,332 und U.S.-Patent 4,971,954 offenbart.
Bevorzugt wird D(-)Ribose zur Vernetzung von Kollagen eingesetzt. Andere Beispiele reaktiver Zucker, die für die Vernetzung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Glycerose, Threose, Erythrose, Lyxose, Xylose, Arabinose, Allose, Altose, Glucose, Manose, Gulose, Idose, Galactose, Fructose, Talose oder jede andere Diose, Triose, Tetrose, Pentose, Hexose, Septose, Octose, Nanose oder Decose.
Es bleibt anzumerken, dass andere, vom Ethanol verschiedene Alkohole, und andere polare oder hydrophile organische Lösungsmittel ebenso für die Vernetzung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Beispiel 6
Es wurden zusätzliche Versuche durchgeführt, um den Einfluss mehrerer unterschiedlicher reduzierender Zucker auf die Beständigkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase von Kollagenproben zu ermitteln, die in der Gegenwart von 70% Ethanol vernetzt wurden.
Eine fibrilläre Kollagenmatrix wird aus pepsinverdauter Rindersehne vom Kollagentyp I hergestellt, wie oben in Beispiel 1 detailliert offenbart. Die kalte saure Kollagenlösung (mit pH 3 und einer Kollagenkonzentration von 3 mg/ml) wird mit einem Alkaliphosphatpuffer neutralisiert, auf 37°C erwärmt und 24 Stunden kräftig gerührt. Das kontinuierliche kräftige Rühren hat zur Folge, dass sich Teilchen der Größe im Bereich von 150 μm bilden. Die fibrilläre partikuläre Kollagenmatrix wurde nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei einer Temperatur von 37 °C zum Absetzen der Kollagenpartikel zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde mehrfach in Posphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, indem man es wiederholt zentrifugierte und re-suspendierte.
Es wurden 5 gleiche Portionen, beinhaltend je 5 Milligramm der obigen re-suspendierten partikulären fibrillären Kollagenmatrix, bei einer Temperatur von 37°C 11 Tage in 30 Milliliter einer Lösung, umfassend 70% (Vol/Vol) Ethanol, 30% (Vol/Vol) PBS und 1% (Gew/Vol) eines reduzierenden Zuckers inkubiert. Die unterschiedlichen reduzierenden Zucker, die im Test in der Gegenwart von 70% Ethanol zum Einsatz gelangten, waren D(-)-Ribose, kommerziell erhältlich als Katalog-Nummer R 7500 von Sigma Chemical Co., MO, U.S.A, D(-)-Glukose, kommerziell erhältlich als Katalog-Nummer 10117 von BDH Chemicals, Poole UK, D(-)-Fruktose, kommerziell erhältlich als Katalog-Nummer 47740 von Fluka Chemie, AG, Schweiz, Sucrose (α-D-Glukopyranosyl-β-D-Fruktose), kommerziell erhältlich als Katalog-Nummer 10274 von BDH Chemicals, Poole UK, und Maltose (4-O-α-D-Glukopyranosyl-D-Glukose), kommerziell erhältlich als Katalog-Nummer M5885 von Sigma Chemical Co., MO, U.S.A.
Nach der Inkubationszeit in den Lösungen der unterschiedlichen Zuckerarten wurden die behandelten Kollagenproben durch Zentrifugation abgetrennt, drei mal in PBS gewaschen und auf ihre Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch bakterielle Kollagenase untersucht, wie oben detailliert in Beispiel 2 offenbart. Die im Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 300 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit in Kollagenase betrug 3 Stunden.
Die Ergebnisse des Versuchs sind in der nachfolgenden Tabelle 5 angegeben. Die rechte Spalte in Tabelle 5 zeigt die Art des Zuckers, in der die Kollagenprobe inkubiert wurde. Die Zahlenwerte in der linken Spalte von Tabelle 5 repräsentieren die Menge an solubilisiertem (abgebautem) Kollagen, dargestellt als prozentualer Anteil am Gesamtproteingehalt jeder Probe.
TABELLE 5
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 ersehen werden kann, ist D(-)-Ribose am wirksamsten bei der Erhöhung der Beständigkeit gegenüber den Kollagenaseabbau des fibrillären Kollagens, das durch den Zucker vernetzt wurde. Die Wirksamkeit der anderen Zucker ist geringer als die Wirksamkeit von D(-)-Ribose.
Obwohl in Beispiel 6 nur die Disaccharide Sucrose und Maltose getestet wurden, bleibt anzumerken, dass es möglich ist, zur Vernetzung von Kollagen unter Vorgabe adäquater Inkubationszeiten und Versuchsbedingungen auch andere Disaccharide zu verwenden, wie zum Beispiel, jedoch nicht darauf beschränkt, Laktose, Cellobiose, Gentiobiose, Melibiose, Turanose und Trehalose.
Beispiel 7
Es wurden zusätzliche Versuche durchgeführt, um den Einfluss mehrerer unterschiedlicher organischer Lösungsmittel auf die Vernetzung des Kollagens mit mehreren unterschiedlichen reduzierenden Zuckern zu ermitteln.
Es wurde eine Suspension partikulärer fibrillärer Kollagenmatrix aus pepsinverdauter Rindersehne von Kollagentyp I hergestellt, wie oben in Beispiel 6 detailliert offenbart,. Zehn Kollagenproben (5 Milligramm Kollagen in jeder Probe) wurden vorbereitet. Jede der Kollagenproben wurde bei einer Temperatur von 37°C 11 Tage in 30 Milliliter einer Lösung, umfassend 70% (Vol/Vol) eines organischen Lösungsmittels, 30% (Vol/Vol) PBS und 1% (Gew/Vol) D(-)-Ribose inkubiert. Die untersuchten organischen Lösungsmittel waren: Ethanol, Methanol, 1-Propanol, 2-Propanol (Isopropanol), 1-Butanol, 1-Hexanol, Aceton (Dimethylketon), Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethylacetat und Tetrahydrofuran (THF).
In einem Kontrollversuch wurde eine Probe aus 5 Milligramm Kollagen 11 Tage bei einer Temperatur von 37°C in einer 1% igen Lösung von D(-)-Ribose in PBS (Probennummer 1 der nachfolgenden Tabelle 6) inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wurden die Kollagenproben, die in Gegenwart von 1-Butanol, 1-Hexanol, Aceton und Ethylacetat (Probennummern 6, 7, 8 und 10 der nachfolgenden Tabelle 6) inkubiert wurden, zweimal mit 70% Ethanol in PBS gewaschen, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die Kollagenproben wurden durch Zentrifugation abgetrennt, und alle Proben wurden dreimal in PBS gewaschen. Aliquote aller Kollagenproben wurden auf ihre Beständigkeit gegenüber Abbau durch Trypsin, wie es nachfolgend detailliert offenbart ist, und auf ihre Beständigkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase hin untersucht, wie es oben in Beispiel 2 detailliert offenbart ist. Die im Kollagenase-Abbau-Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 300 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit in Kollagenase betrug 3 Stunden.
TABELLE 6
Der Eintrag ** steht dafür, dass sich bei den Probennummern 6,7 und 10 in Tabelle 6, bei denen die Lösungsmittel 1-Butanol, 1-Hexanol und Ethylacetat eingesetzt wurden, während der Inkubationszeit eine Phase organischen Lösungsmittels von der wässrigen Lösung abtrennte (das fibrilläre Kollagen erschien in den Proben als eine separate wässrige Phase, und etwas Feststoff setzte sich in der Grenzfläche zwischen der organischen Lösungsmittelschicht und der wässrigen Phase ab). In den Proben 6,7 und 10 der Tabelle 6 wurde das Kollagen als eine feste, gelblich gefärbte Ablagerung erhalten, nachdem es mit Ethanol gewaschen und zentrifugiert wurde, im Unterschied zur weißen, emulsionsartigen Erscheinungsform des zentrifugierten Pellets der übrigen Versuchsproben (Probennummern 1-5, 8, 9 und 11 in Tabelle 6), in denen keine Phasenabtrennung der organischen Phase während der Inkubationszeit beobachtet wurde. Es wird angenommen, dass die weniger polaren Lösungsmittel 1-Butanol, 1-Hexanol und Ethylacetat, die eine verringerte Mischbarkeit mit Wasser aufweisen, vermutlich eine Denaturierung des Kollagens bewirkt haben. Diese Annahme wird bestätigt durch die Tatsache, dass sich aus den Untersuchungen zur Beständigkeit gegenüber Trypsinabbau bei den Kollagenproben, die mit 1-Butanol, 1-Hexanol und Ethylacetat (Probennummern 6,7 und 10 in Tabelle 6) behandelt wurden, ergab, dass diese durch Trypsin abgebaut wurden.
Typischerweise sollte natives, nicht-denaturiertes Kollagen gegenüber nichtspezifischem proteolytischen Abbau durch Trypsin beständig sein, während denaturiertes Kollagen durch Verdau mit Trypsin abgebaut wird. Aus diesem Grund zeigen die Untersuchungsergebnisse zur Beständigkeit gegenüber Trypsin offensichtlich den Grad der Denaturierung der untersuchten Kollagenproben an.
Testmethode zum Trypsinverdau
100 Milliiliter einer Reaktionspuffer-Stammlösung wurden hergestellt durch Vermischen von 2 Milliiliter einer 10 mMol HCl mit 98 Milliiliter eines Phosphatpuffers, beinhaltend 67 mM Natriumphosphat, der auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt ist.
Trypsin, kommerziell erhältlich als Katalog-Nummer T 8003 von Sigma Chemical Co., MO, U.S.A, wurde so in der Puffer-Reaktionslösung gelöst, dass eine Trypsinlösung mit einer Aktivität von 2000 Einheiten Trypsin pro Milliliter Reaktionspuffer erhalten wurde.
Der Test zur Beständigkeit gegenüber Trypsin wurde folgendermaßen durchgeführt: Kollagenproben mit einem Volumen von 100 Microliter wurden in vorgewogenen Teströhrchen eingewogen. Das Kollagen wurde zwei Minuten lang bei 13 000 g zentrifugiert und und der Überstand wurde verworfen. Die Teströhrchen wurden erneut gewogen und das Pelletgewicht wurde durch Subtraktion bestimmt. Zusätzlich wurde das Volumen des Pellets grob durch Markierung der Höhe des Pellets mit einem Marker auf dem Teströhrchen bestimmt. Die Abbaureaktion wurde durch Zugabe von 0,5 Milliliter der oben offenbarten Lösung von Trypsin in der Puffer-Reaktionslösung zu den Kollagenpellets in den einzelnen Teströhrchen gestartet, und die Teströhrchen wurden bei einer Temperatur von 25°C über einen Zeitraum von 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Teströhrchen zwei Minuten lang bei 13 000 g zentrifugiert und das Volumen des Pellets wurde, wie oben offenbart, grob durch Markierung der Höhe des Rückstandes bestimmt. Die Teströhrchen wurden erneut gewogen und das Pelletgewicht wurde durch Subtraktion bestimmt. Die Pellets wurden vor und nach der Abbaureaktion ebenso nach ihrer Erscheinungsform und Größe optisch beurteilt.
In der rechten Spalte in Tabelle 6 bedeutet das Wort „unversehrt", dass sowohl Gewicht, als auch Volumen des zentrifugierten Kollagenpellets nach 24-stündigem Abbau durch Trypsin nicht mehr als ± 25% von Gewicht und Volumen des Kollagenpellets abweicht, das vor der Zugabe der Trypsinlösung durch Zentrifugation erhalten wurde. Das Wort „abgebaut" bedeutet, dass sowohl Gewicht, als auch Volumen des zentrifugierten Kollagenpellets nach 24-stündigem Abbau durch Trypsin um mehr als – 25% von Gewicht und Volumen des Kollagenpellets abweicht, das vor der Zugabe der Trypsinlösung durch Zentrifugation erhalten wurde.
Es bleibt anzumerken, dass die Kollagenproben, die mit 1-Butanol, 1-Hexanol und Ethylacetat (Probennummern 6, 7 bzw. 10 in Tabelle 6) behandelt wurden, nach 24 Stunden Inkubationszeit in der Trypsinlösung vollständig durch Trypsin abgebaut wurden, so dass nach 24 Stunden in der Trypsinlösung kein optisch erkennbares Pellet abzentrifugiert wurde.
Die Ergebnisse zum Abbau durch Kollagenase in Tabelle 6 zeigen, dass bei den Lösungsmitteln, die keine wesentliche Denaturierung des Kollagens in den Proben verursachten, die Reihenfolge zunehmender Wirksamkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase folgendermaßen aufgestellt werden kann: DMSO ~ Aceton > Ethanol > Methanol > Propanol > Isopropanol > THF.
Es scheint, dass die Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat, 1-Butanol und 1-Hexanol, die weniger polar sind und die sich als zweite Phase von der wässrigen Phase abtrennten, (insbesondere Lösungsmittel, die nicht vollständig mischbar sind mit der wässrigen Phase), Denaturierung von Kollagen verursachen.
Daher sollte(n) das (die) im Vernetzungsmedium eingesetzten Lösungsmittel vorzugsweise polare Lösungsmittel oder eine Mischung polarer Lösungsmittel sein, das/die vollständig mischbar ist/sind in der wässrigen Phase, in der das Kollagen mit dem Zucker umgesetzt wird.
Die in Tabelle 6 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die Inkubation von Kollagen in gepufferten wässrigen Lösungen, die polare Lösungsmittel enthalten, die Beständigkeit des erhaltenen Kollagens gegenüber Abbaureaktionen durch Kollagenase erhöht, verglichen mit Kollagen, das nur in PBS inkubiert wurde. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass neben relativ polaren, wassermischbaren Alkoholen (wie zum Beispiel Ethanol, Methanol, Propanol und Isopropanol), die effektiv sind bei der Erhöhung der Beständigkeit der in D(-)-Ribose inkubierten Kollagenproben gegenüber Abbaureaktionen durch Kollagenase, auch andere polare Lösungsmittel, die sich chemisch von Alkoholen unterscheiden, mit der gleichen oder sogar gesteigerten Wirksamkeit eingesetzt werden können.
Beispiel 8
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um den Einfluss der D(-)-Ribose – Konzentration auf die Beständigkeit des mit D(-)-Ribose in Gegenwart von 70% Aceton (Dimethylketon) vernetzten Kollagens gegenüber Abbaureaktionen durch Kollagenase zu ermitteln.
Es wurde eine Suspension partikulärer fibrillärer Kollagenmatrix aus pepsinverdauter Rindersehne von Kollagentyp I hergestellt, wie oben in Beispiel 6 detailliert offenbart. Fünf Kollagenproben wurden zubereitet, die je 5 Milligramm Kollagen enthielten. Jede der Kollagenproben wurde bei einer Temperatur von 37°C 11 Tage in 30 Milliliter einer Lösung, umfassend 70 % (Vol/Vol) Aceton und 30% (Vol/Vol) PBS, und einer definierten Konzentration an D(-)- Ribose inkubiert. Die Endkonzentrationen an D(-)-Ribose in den fünf unterschiedlichen getesteten Lösungen, betrugen 0,5%; 1%, 2%, 3%, und 5% (die D(-)-Ribose Konzentrationen werden in Gew/Vol angegeben).
Nach der Inkubationszeit wurde das Kollagen durch Zentrifugation abgetrennt, drei mal in PBS gewaschen, um das Aceton zu entfernen, und auf Beständigkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase untersucht, wie oben in Beispiel 2 detailliert offenbart. Die im Kollagenase-Abbau-Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 300 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit in Kollagenase betrug 3 Stunden.
Die Ergebnisse des Versuchs sind in der nachfolgenden Tabelle 7 zusammengestellt.
TABELLE 7
Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, dass unter den eingesetzten spezifischern Inkubationsbedingungen das vernetzte Kollagen in Gegenwart von 70% Aceton bei einer D(-)-Ribose-Konzentration im Bereich von etwa 1 – 3% (Gew/Vol) die maximale Beständigkeit gegenüber Kollagenase-Abbau erreicht.
Beispiel 9
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um den Einfluss der D(-)-Ribose-Konzentration auf die Beständigkeit des mit D(-)-Ribose in Gegenwart von 70% Dimethylsulfoxid (DMSO) vernetzten Kollagens gegenüber Abbaureaktionen durch Kollagenase zu ermitteln.
Es wurde eine Suspension einer partikulären fibrillären Kollagenmatrix aus pepsinverdauter Rindersehne von Kollagentyp I hergestellt, wie oben in Beispiel 6 detailliert offenbart. Fünf Kollagenproben wurden vorbereitet, die je 5 Milligramm Kollagen enthielten. Jede der Kollagenproben wurde bei einer Temperatur von 37°C 11 Tage in 30 Milliliter einer Lösung, umfassend 70% (Vol/Vol) DMSO und 30% (Vol/Vol) PBS, und einer definierten Konzentration an D(-)-Ribose inkubiert. Die Endkonzentrationen an D(-)-Ribose in den fünf unterschiedlichen getesteten Lösungen betrugen 0,5%; 1%, 2%, 3%, und 5% (die D(-)-Ribose-Konzentrationen sind in Gew/Vol angegeben). Nach der Inkubationszeit wurde das Kollagen durch Zentrifugation abgetrennt, dreimal in PBS gewaschen, um das DMSO zu entfernen, und die Proben wurden auf Beständigkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase untersucht, wie oben in Bei spiel 2 detailliert offenbart. Die im Kollagenase-Abbau-Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 300 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit in Kollagenase betrug 3 Stunden.
Die Ergebnisse des Versuchs sind in der nachfolgenden Tabelle 8 zusammengestellt.
TABELLE 8
Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, dass unter den eingesetzten spezifischen Inkubationsbedingungen das vernetzte Kollagen in Gegenwart von 70% DMSO bei einer D(-)-Ribose-Konzentration im Bereich von etwa 0,5 – 2% (Gew/Vol) die maximale Beständigkeit gegenüber Kollagenase-Abbau erreicht.
Beispiel 10
Die Versuche des Beispiels 10 wurden durchgeführt, um den relativen Einfluss unterschiedlicher D(-)-Glukose-Konzentrationen auf die Vernetzung von Kollagen in Gegenwart von vier unterschiedlichen polaren organischen Lösungsmitteln zu ermitteln.
Es wurde eine Suspension partikulärer fibrillärer Kollagenmatrix aus pepsinverdauter Rindersehne von Kollagentyp I hergestellt, wie oben in Beispiel 6 detailliert offenbart. Vier Kollagenproben, die je 5 Milligramm Kollagen enthielten, wurden bei einer Temperatur von 37°C 11 Tage in 30 Milliliter von vier verschiedenen Inkubationsmischungen inkubiert, wobei jede Inkubationsmischung 70% (Vol/Vol) eines spezifischen polaren organischen Lösungsmittels, 30% (Vol/Vol) PBS, und 1% (Gew/Vol) D(-)-Glukose umfasste. Die vier unterschiedlichen organischen Lösungsmittel waren Ethanol, Methanol, Aceton und DMSO.
Es wurden vier zusätzliche Proben hergestellt. Jede Probe enthielt 5 Milligramm Kollagen. Die zusätzlichen Proben wurden bei einer Temperatur von 37°C 11 Tage in 30 Milliliter von vier verschiedenen Inkubationsmischungen inkubiert, wobei jede Inkubationsmischung 70 % (Vol/Vol) eines spezifischen polaren organischen Lösungsmittels, 30% (Vol/Vol) PBS, und 5 (Gew/Vol) D(-)-Glukose umfasste. Die vier unterschiedlichen organischen Lösungsmittel waren Ethanol, Methanol, Aceton und DMSO.
Nach der Inkubationszeit wurden das Kollagen aller acht Proben durch Zentrifugation abgetrennt, drei mal in PBS gewaschen, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, und die Proben wurden auf Beständigkeit gegenüber Abbau durch Kollagenase hin untersucht, wie oben in Beispiel 2 detailliert offenbart. Die im Kollagenase-Abbau-Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 300 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer, und die Inkubationszeit in Kollagenase betrug 3 Stunden.
Die Ergebnisse der Experimente von Beispiel 10 sind in der nachfolgenden Tabelle 9 zusammengestellt.
TABELLE 9
Wie man aus den Ergebnissen in Tabelle 9 erkennen kann, ist D(-)-Glukose bei den Konzentrationen 1% und 5% in Gegenwart von 70% eines der polaren Lösungsmittel Ethanol, Methanol, Aceton und DMSO weniger wirksam bei der Erhöhung der Abbaubeständigkeit von Kollagen als D(-)-Ribose. Es ist allerdings möglich, in Gegenwart von D(-)-Glukose die Inkubationszeit auf mehr als 11 Tage (wie in Beispiel 10 angegeben), zu verlängern, um die Beständigkeit gegenüber des Abbaus durch Kollagenase zu erhöhen.
Beispiel 11
Es wurde eine Lösung von molekular gereinigtem pepsinverdauten Rinderkollagen vom Typ I (2,5 mg/ml), hergestellt aus Rindersehnen, die kommerziell von Pel-Freez, AR, U.S.A erhältlich sind, in 0,01 M HCl gelöst und bei 4°C gehalten. Ein Probenvolumen von 40 Milliliter einer Lösung umfassend 100 Milligramm Kollagen wurde gegen ein Volumen von 4,0 Litern 0,1 M Essigsäure bei einer Temperatur von 4°C 2 Tage dialysiert. Nach der Dialysezeit wurden die dialysierte Kollagenprobe in einem handelsüblichen Lyophilisator lyophilisiert (gefriergetrocknet), wobei eine weiße, schaumartige Masse aus gefriergetrocknetem nicht-fibrillären Kollagen erhalten wurde.
Vier Proben (Probennummer 1 bis 4 unten in Tabelle 10) mit etwa 5 Milligramm gefriergetrocknetem nicht-fibrillären Kollagen wurden in Teströhrchen überführt und folgendermaßen behandelt:

Probe 1 – wurde 12 Tage in einer Lösungsmittelmischung umfassend 70% (Vol/Vol) Ethanol und 30% (Vol/Vol) PBS inkubiert.
Probe 2 – wurde 12 Tage in einer Lösungsmittelmischung umfassend 70% (Vol/Vol) Ethanol, 30% (Vol/Vol) PBS und 1% (Gew/Vol) D(-)-Ribose inkubiert.
Probe 3 – wurde 6 Tage in einer Lösungsmittelmischung umfassend 70% (Vol/Vol) Ethanol, 30% (Vol/Vol) PBS und 1% (Gew/Vol) D(-)-Ribose inkubiert.
Probe 4 – wurde unbehandelt belassen. Diese Probe dient als Vergleichsprobe.

Im Anschluss an die spezifischen Inkubationszeiten wurden die inkubierten Proben entwässert (mit Ausnahme von Probe 4, die nicht zuvor inkubiert wurde), und dreimal mit PBS gewaschen. Jede der vier Proben wurde dann in drei etwa gleich große Teile geteilt, und die drei Teile jeder Probe wurden dann dem Abbau durch Kollagenase bei Inkubationszeiten von 1 Stunde, 3 Stunden und 5 Stunden unterworfen, wie oben in Beispiel 1 detailliert offenbart. Die im Kollagenase-Abbau-Test eingesetzte Kollagenasekonzentration betrug 350 Kollagenaseeinheiten pro ml Abbaupuffer.
Die Ergebnisse der Experimente von Beispiel 11 sind in der nachfolgenden Tabelle 10 zusammengestellt.
TABELLE 10
Die Zahlenwerte in Tabelle 10 repräsentieren die Menge von abgebautem Kollagen als prozentualen Anteil vom anfänglichen Probengewicht.
Die Ergebnisse von Beispiel 11 zeigen, dass auch nicht-fibrilläres Kollagen durch das erfindungsgemäße Verfahren wirksam vernetzt werden kann. Das nach der vorstehenden Beschreibung erhaltene lyophilisierte Kollagen wurde wegen des sauren pH-Wertes der Lösung, der vor der Lyophilisation aufrechterhalten wurde, nicht zu fibrillären Kollagen rekonstruiert (wie es bei den in Beispiel 1 beschriebenen Kollagenmembranen der Fall war). Dennoch wurde das nicht-fibrilläre lyophilisierte Kollagen, wie in Beispiel 11 offenbart, ebenso durch das erfindungsgemäße Verfahren vernetzt, was seine Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch Kollagenase erheblich verbesserte. Dies zeigt, dass die Kollagenfibrillen nicht zwangsläufig vorhanden sein müssen, und dass andere Formen von Kollagen neben der fibrillären Form ebenso durch Einsatz der erfindungsgemäßen Methode behandelt werden können, um deren Beständigkeit gegenüber dem Abbau durch Kollagenase zu erhöhen.
Im Allgemeinen kann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Vielzahl unterschiedlicher reduzierender Zucker oder reduzierender Zuckerderivate ausgeführt werden, wie sie durch eine der folgenden Formeln I oder II dargestellt sind ( wie detailliert offenbart im U.S.-Patent 4,971,954 von Brodsky et al., und im U.S.-Patent 5,955,438 von Pitaru et al.).
worin R¹ für H oder niederes Alkyl oder Alkylen, eine Aminosäure, ein Peptid, ein Saccharid, eine Purin- oder eine Pyrimidinbase, eine phosphorylierte Purin- oder Pyrimidinbase steht; n für eine ganze Zahl von 2 bis 9 steht, und p und q unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 0 bis 8 stehen, vorausgesetzt, dass die Summe von p und q wenigstens 2 und nicht mehr als 8 beträgt.
Es versteht sich, dass unterschiedliche Verbindungen der allgemeinen Formel I oder II unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten bei der Vernetzung von Kollagen besitzen, und dass die vernetzten Produkte in unterschiedlichem Grad gegenüber Abbaureaktionen beständig sind.
Es versteht sich, dass zahlreiche Modifikationsmöglichkeiten zu den oben beschriebenen Ausführungsformen dem Fachmann offenkundig sind. Obige Ausführungsformen dienen der Veranschaulichung und nicht der Limitierung. Obgleich beispielsweise ein einzelnes polares Lösungsmittel in den obigen spezifischen Beispielen und Versuchen eingesetzt wird, ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf den Einsatz eines einzelnen polaren Lösungsmittels beschränkt. Viele unterschiedliche Kombinationen zahlreicher polarer Lösungsmittel können zum Einsatz gelangen. So kann zum Beispiel die Vernetzung von Kollagen in Gegenwart von Wasser und mehr als einem polaren Lösungsmittel durchgeführt werden. In einem nicht-limitierenden Beispiel kann eine wässrige (gepufferte oder nicht-gepufferte) Mischung aus Aceton und Ethanol eingesetzt werden, und in einem anderen nicht-limitierenden Beispiel, eine quaternäre Mischung aus Wasser (oder Puffer, oder Kochsalzlösung), Ethanol, Propanol und DMSO. Der Einsatz wässriger Mischungen einer Vielzahl verschiedener polarer Lösungsmittel kann in den Fällen vorteilhaft sein, in denen man die Beständigkeit der resultierenden vernetzten Kollagenzubereitung gegenüber dem Abbau fein einstellen will, da der Einsatz einer wässrigen Mischung, die mehrere verschiedene polare Lösungsmittel umfasst, die Feineinstellung erleichtern und den Abbaugrad der vernetzten Kollagenzubereitung steuern kann.
Gleichwohl erwartet der Fachmann, dass die vorliegende Erfindung nicht auf den Einsatz eines einzelnen reduzierenden Zuckers oder reduzierenden Zuckerderivates (wie beispielsweise eines oder mehrere der Komponenten die die Formel I oder II aufweisen, wie oben offenbart) zur Durchführung der Vernetzungsreaktion beschränkt ist. So können die vernetzten fibrillären Kollagenzubereitungen der vorliegenden Erfindung ebenso durch Inkubation fibrillären Kollagens mit einer Mischung von einem oder mehreren reduzierenden Zuckern in einer Mischung aus Wasser und einem oder mehrerer polarer Lösungsmittel hergestellt werden. Zum Beispiel kann als nicht-limitierendes Beispiel fibrilläres Kollagen mit einer Lösung aus 70 Ethanol und 30% Wasser, die 1,5% D(-)-Ribose und 3% D(-)-Glukose umfasst, inkubiert werden. Als weiteres nicht-limitierendes Beispiel kann fibrilläres Kollagen mit einer Lösung aus 35% Ethanol, 35% Aceton und 30% PBS, die 1,0% D(-)-Ribose und 3% D(-)-Glukose umfasst, inkubiert werden.
Es bleibt anzumerken, dass der Einsatz von Kombinationen unterschiedlicher reduzierender Zucker vorteilhaft sein kann, weil man dadurch die Beständigkeit der resultierenden vernetzten Kollagenzubereitung gegenüber dem Abbau genauer steuern kann. Daher muss der Einsatz derartiger Zuckermischungen und Lösungsmittelmischungen nicht notwendigerweise eine höhere Beständigkeit der resultierenden vernetzten Kollagenzubereitung gegen Abbau gewährleisten, kann aber eine genauere Einstellung der Produkteigenschaften ermöglichen.
Es bleibt weiterhin anzumerken, dass obwohl Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) als gepufferte Kochsalzlösung zur Vernetzung des Kollagens in den Versuchen eingesetzt wurde, andere unterschiedliche Puffer oder gepufferte Kochsalzlösungen oder Pufferlösungen zur Einstellung des pH-Wertes und/oder der Ionenstärke der Vernetzungs-Inkubationslösungen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenso verwendet werden können.
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Claims

Verfahren zur Herstellung von vernetztem Kollagen, bei dem man Kollagen in einer Lösung inkubiert, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen reduzierenden Zucker umfasst, um vernetztes Kollagen zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das wenigstens eine polare Lösungsmittel wenigstens ein organisches polares Lösungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem wenigstens einen organischen polaren Lösungsmittel um einen Alkohol handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das wenigstens eine organische polare Lösungsmittel unter Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Lösung Wasser in einer Menge von 15%-95% (Vol./Vol.), das wenigstens eine polare Lösungsmittel in einer Menge von 5%-85% (Vol./Vol.) umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei es sich bei der Lösung um eine einen Puffer umfassende gepufferte Lösung handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Lösung Posphat-gepufferte Kochsalzlösung umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Kollagen ausgewählt ist unter nativem Kollagen, fibrillärem Kollagen, fibrillärem Atelopeptid-Kollagen, lyophilisiertem Kollagen, Kollagen aus tierischen Quellen, humanem Kollagen, rekombinantem Kollagen, pepsinverdautem Kollagen, rekonstituiertem Kollagen, und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Kollagen fibrilläres Kollagen umfasst, das aus monomolekularem Atelopeptid-Kollagen rekonstituiert ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Kollagen durch Rekonstitution von monomolekularem Atelopeptid-Kollagen erhalten ist, das durch proteolytischen Verdau von nativem Kollagen erhalten ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, wobei der wenigstens eine Zucker eine Verbindung der folgenden Formel I oder II ist:
worin R¹ für H oder niederes Alkyl oder Alkylen, eine Aminsäure, ein Peptid, ein Saccharid, eine Purin- oder eine Pyrimidinbase, eine phosphorylierte Purin- oder Pyrimidinbase steht; n für eine ganze Zahl von 2 bis 9 steht, und p und q unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 0 bis 8 stehen, und die Summe von p und q wenigstens 2 und nicht mehr als 8 beträgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei der wenigstens eine Zucker eine Diose, eine Triose, eine Tetrose, eine Pentose, eine Hexose, eine Septose, eine Octose, eine Nanose oder eine Decose ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei der wenigstens eine Zucker ausgewählt ist unter Glycerose, Threose, Erythrose, Lyxose, Xylose, Arabinose, Ribose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, D-Ribose, Galactose und Talose.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei der wenigstens eine Zucker ein Disaccharid ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Disaccharid ausgewählt ist unter Maltose, Lactose, Cellobiose, Gentiobiose, Melibiose, Turanose und Trehalose.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 15, wobei man wenigstens eine Verbindung zur Lösung zugibt, in der der Inkubationsschritt erfolgt, und die wenigstens eine Verbindung in einer Matrix aus dem vernetzten Kollagen immobilisiert wird, wobei die wenigstens eine Substanz ausgewählt ist unter einem antimikrobiellen Mittel, einem entzündungs hemmenden Mittel, einem Faktor mit gewebeinduzierenden Eigenschaften und Kombinationen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 bis 11 und 16, wobei der wenigstens eine Zucker D(-)-Ribose und das wenigstens eine polare Lösungsmittel Ethanol ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Lösung Wasser in einer Menge von 25%-50% (Vol./Vol.) und Ethanol in einer Menge von 50%-75% (Vol./Vol.) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Lösung etwa 30% (Vol./Vol.) Wasser und etwa 70% (Vol./Vol.) Ethanol umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 17 bis 19, wobei die Konzentration der D(-)-Ribose in der Lösung 0,1%-5% (Gew./Vol.) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Konzentration der D(-)-Ribose in der Lösung 0,5%-3% (Gew./Vol.) beträgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, bei dem man außerdem das vernetzte Kollagen nach dem Inkubationsschritt wäscht, um das wenigstens eine polare Lösungsmittel und Überschuss des wenigstens einen reduzierenden Zuckers zu entfernen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22, bei dem man außerdem das vernetzte Kollagen entwässert.
Verfahren nach Anspruch 23, bei dem man außerdem das vernetzte Kollagen einer Kritischen-Punkt-Trocknung, Trocknung oder Gefriertrocknung unterzieht.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 24, bei dem man außerdem das Kollagen vor dem Inkubationsschritt trocknet oder gefriertrocknet.
Vernetzte Kollagenzubereitung, hergestellt nach dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 25.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 25, bei dem man außerdem zumindest einen Teil der nicht umgesetzten Menge des wenigstens einen reduzierenden Zuckers entfernt und zumindest einen Teil des wenigstens einen hydrophilen Lösungsmittels entfernt.
Vernetzte fibrilläre Kollagenmatrix, erhalten durch ein Verfahren, bei dem man: eine Matrix bereitstellt, die rekonstituiertes fibrilläres Kollagen umfasst; und die Matrix in einer Lösung inkubiert, die Wasser, wenigstens ein polares Lösungsmittel und wenigstens einen reduzierenden Zucker umfasst, um das fibrilläre Kollagen unter Bildung einer Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen zu vernetzen.
Matrix nach Anspruch 28 in Form einer implantierbaren Vorrichtung.
Matrix nach Anspruch 29, wobei es sich bei der implantierbaren Vorrichtung um eine Kollagen-basierte Membranbarriere für die gesteuerte Geweberegeneration handelt.
Matrix nach den Ansprüchen 28 bis 30, wobei man bei dem Verfahren außerdem die vernetzte Kollagenmatrix nach dem Inkubationsschritt wäscht, um zumindest einen Teil des wenigstens einen polaren Lösungsmittels und des nicht umgesetzten Überschusses des wenigstens einen reduzierenden Zuckers zu entfernen.
Matrix nach den Ansprüchen 28 bis 31, wobei man bei dem Verfahren außerdem die Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen entwässert.
Matrix nach den Ansprüchen 28 bis 32, wobei man bei dem Verfahren außerdem die Matrix aus vernetztem fibrillärem Kollagen einer Kritischen-Punkt-Trocknung, Trocknung oder Gefriertrocknung unterzieht.
Matrix nach den Ansprüchen 28 bis 33, wobei das fibrilläre Kollagen fibrilläres Kollagen umfasst, das aus monomolekularem Atelopeptid-Kollagen rekonstituiert ist.
Matrix nach Anspruch 34, wobei das fibrilläre Kollagen durch Rekonstitution von monomolekularem Atelopeptid-Kollagen hergestellt ist, das durch proteolytischen Verdau von nativem Kollagen erhalten ist.