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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine mit hämolytischer
Aktivität
und Gene, die dafür
codieren. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung neue Proteine
mit hämolytischer
Aktivität,
ein Verfahren zu ihrer Herstellung, Reagenzien, Pestizide und Medikamente,
die physiologische Aktivitäten
davon nutzen.
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STAND DER TECHNIK
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Die
Stichverletzung durch die Qualle beim Baden im Meer ist in verschiedenen
Teilen der Welt aufgetreten. Die Stichverletzung durch Carybdea
rastonii oder Physalia physalis ist in Japan jedes Jahr in der Meeresbadesaison
der Sommerzeit häufig
aufgetreten. Der Grad des Symptoms durch den Stich unterscheidet sich
je nach Quallenart und den individuellen Unterschieden der Patienten.
Das erste Symptom sind Dermatosen, wie zum Beispiel Schmerz, flächenhafte
Hautrötung
(„flare"), Papeln, Vesikel
usw., an der Stichstelle. Bei einer schweren Erkrankung können Patienten
sterben, wobei sie hämorrhagische
Flecken und Necrose und auch konstitutionelle Symptome, wie zum
Beispiel Kopfschmerz, hohes Fieber, Übelkeit, Dyspnoe und schwankenden
Puls, entwickeln. Obwohl eine derartige Stichverletzung häufig auftritt,
sind die Bestimmung und pharmakologischen Eigenschaften der toxischen
Komponenten der Qualle noch nicht intensiv untersucht worden. Daher
ist die Entwicklung von Medikamenten für die Behandlung des Stichs
durch die Qualle vor der vorliegenden Erfindung kaum erfolgt.
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Zum
Beispiel ist die schwere Stichverletzung durch Carybdea alata in
Hawaii oder an anderen Orten berichtet worden (R. H. Tamanaha et
al., J. Am. Acad. Dermatol., 1996, 35, 991–993); jedoch sind die Bestimmung
und die pharmakologischen Eigen schaften der toxischen Komponenten
dieser Qualle nicht untersucht worden. Im Gegensatz dazu sind die
Studien an den toxischen Komponenten von Carybdea rastonii, die
in familiärer
Beziehung zu Carybdea alata steht, gut studiert worden und die chemischen
und physiologischen Eigenschaften der toxischen Komponente von Carybdea
rastonii sind aufgeklärt
worden (Akihiko Sato, „Research
on the toxic component of Carybdea rastonii", The Journal of the Ochanomizu Medico-dental
Society, Bd. 33, Nr. 2, 131–151,
Juni 1985; international offengelegtes Patent, Veröffentlichungsnummer
WO 99/50294).
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Da
andererseits die bekannten Gifte aus der Nematocyste einer Qualle
ein nicht-dialysierbares Hochpolymer bzw. Makromolekül waren
und durch Behandlung mit Säure
oder Alkali oder durch Hitzebehandlung, Bearbeitung bzw. Prozessierung
mit organischem Lösungsmittel,
Proteasebehandlung usw. inaktiviert wurden, wurde angenommen, dass
die Hauptkomponenten des Gifts Proteine seien.
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Darüber hinaus
ist auch die Reinigung des von einer Qualle stammenden Proteintoxins
versucht worden; jedoch wurden die Isolierung und die Reinigung
der aktiven bzw. wirksamen Komponenten unter Erhaltung der hämolytischen
Aktivität
nicht durchgeführt,
da das Toxin einer Qualle selbst sehr leicht zu deaktivieren bzw.
inaktivieren war. Deshalb sind die physikalischen und chemischen
Eigenschaften des Toxins aus Quallen bis heute niemals aufgeklärt worden.
Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der instabilen toxischen Komponenten
von Quallen bei guten Ausbeuten ist jedoch vor kurzem in der internationalen
Offenlegungsschrift, Veröffentlichungsnummer
WO 99/50294 beschrieben worden.
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Daneben
betrifft auch die
EP
1 067 140 A hämolytisch
aktive Proteine und Gene, die dafür codieren. Dieses Dokument
ist ein Stand der Technik gemäß Art. 54(3)
EPÜ. Weiterhin
offenbaren Rottini G. et al., in Toxicon (1995), Bd. 33, Nr. 3,
Seiten 315–326,
die Reinigung und Eigenschaften eines cytolytischen Toxins im Venom
der Qualle Carybdea marsupialis.
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Darüber hinaus ähneln die
folgenden Artikel von Nagai, H. et al. nachveröffentlichten Dokumenten:
„Novel
proteinaceous toxins from the box jellyfish (sea wasp) Carybdea
rastoni" und „Isolation
and characterization of a novel Protein toxin from the Hawaiian
box jellyfish (sea wasp) Carybdea alata", Biochem Biophys Res Commun. 2000 Aug.
28; 275(2); Seiten 582–8
bzw. 589–94; „Hajimete
Akirakani sareta Kurgae Doku no Kagakuteki Seijo", Bioscience to Industry, (1. November
2000), Bd. 58, Nr. 11, Seiten 1797 bis 798.
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Die
detaillierten Studien an den toxischen Komponenten einer Qualle
sind sehr wichtig für
die Entwicklung von Wirkstoffen bzw. Arzneimitteln, die ihre verschiedenen
physiologischen Aktivitäten,
insbesondere spezifische hämolytische
Aktivität
und die cytotoxische Wirkung, anwenden, und für die Entwicklung von Medikamenten
zur Behandlung der Stichverletzung durch die Qualle.
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Daher
sind die durch die vorliegende Erfindung zu lösenden Aufgaben die Bereitstellung
eines Ansatzes für
die Entwicklung der Wirkstoffe zur Behandlung der Stichverletzung
durch die Qualle mittels Isolieren der Proteine oder Peptide, die
eine hämolytische
Aktivität
besitzen, die so stark ist wie möglich,
in dem Zustand, in dem die physiologische Aktivität erhalten
bleibt bzw. beibehalten wird. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin
den Ansatz zum Untersuchen von Ähnlichkeiten
in der Embryologie oder Struktur und der Artspezifität des Proteins
mit hämolytischer
Aktivität
zum Bewerten von dessen Struktur-Aktivität-Beziehung bereit.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben ausgiebige Untersuchungen zum Isolieren der Proteine
mit der hämolytischen
Aktivität
aus der Nematozyste von Carybdea alata durchgeführt, wobei die hämolytische
Aktivität
als Parameter verwendet wurde, und wobei diese hämolytischen Aktivitäten beibehalten
wurden. Im Ergebnis haben sie das Verfahren zum Isolieren und Reinigen
der Proteine unter Beibehaltung hämolytischer Aktivitäten erfunden
und das Protein aus Carybdea alata aufgeklärt, das die chemische Teilstruktur,
die aus den nachstehenden Aminosäuresequenzen
(1) und (2) besteht, und das molekulare Gewicht von näherungsweise
50.000 Da (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese) aufweist.
Aminosäuresequenz
(1):
Tyr-Arg-Asp-Gln-Glu-Leu-Glu-Asp-Asn-Val-Lys (SEQ ID NO:1)
Aminosäuresequenz
(2):
Lys-Trp-Pro-Asp-Tyr-Phe-Val-Tyr-Met-Glu-Ser-Ser-Ala-His-Gly-Tyr-Ile-Arg (SEQ
ID NO:2)
(wobei ein Aminosäurerest
mittels der Drei-Buchstaben-Notierung,
wie sie durch die IUPAC und die IUB definiert ist, geschrieben wird)
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Weiterhin
haben sie auf der Grundlage der chemischen Teilstrukturen des Proteins
Primer hergestellt und die Gensequenz von näherungsweise 900 Basenpaaren
dieses Proteins untersucht, und zwar durch Durchführung der
RT-PCR an Gesamt-RNA, die aus der Tentakel von Carybdea alata hergestellt
wurde, und wobei diese Primer verwendet wurden. Folglich haben sie
weiterhin die vollständige
primäre
Aminosäuresequenz
des hä molytisch
aktiven Proteins von Carybdea alata mittels Untersuchung der Gensequenz
am 5'-Ende und am
3'-Ende unter Verwendung
des 5'-RACE-Verfahrens
und des 3'-RACE-Verfahrens
bestimmt.
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Deshalb
stellt eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung das spezifische Protein mit der Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird, bereit.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt auch das Verfahren zum Herstellen derartiger
Proteine bereit.
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Weiterhin
stellt eine weitere Ausführungsform
das Gen, das für
derartige Proteine codiert, das Verfahren zur Herstellung der spezifischen
Proteine unter Verwendung des Gens und die Arzneimittel bzw. Wirkstoffe oder
Pestizide, die dieses verwenden, bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen,
enthaltend die Proteine, unter Verwendung dieser Eigenschaften etc.,
oder Pestizide, die die cytotoxischen Eigenschaften des Proteins
nutzen, bereit.
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Da
ein spezifischer Antikörper
auch aus diesem hämolytisch
aktiven Protein nach einem herkömmlichen
Verfahren erhalten werden kann (Cell Technology, Einzelband, „Experimental
protocol of antipeptide antibody",
Shujunsha Co.), offenbart die vorliegende Erfindung auch die pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die diesen Antikörper enthalten.
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BESTE WEISE ZUR AUSFÜHRUNG DER
ERFINDUNG
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Die
Isolierung und Reinigung der Proteine mit der spezifischen physiologischen
Aktivität,
die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, kann
wie folgt spezifisch durchgeführt
werden. Beispielsweise wird die Ultraschallbehandlung der Nematozyste
von Carybdea alata in Phosphorsäurepufferlösung durchgeführt und
dann werden die Überstände durch
Zentrifugalabscheidung bzw. -trennung gesammelt, um einen Rohextrakt
zu erhalten. Diese Zielproteine („object proteins") können gereinigt
und getrennt werden, indem dieser Rohextrakt Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
unter Verwendung einer Ionenaustauschsäule, wie zum Beispiel TSK-GEL
(Toso Co.), und der Gelfiltrations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
mit einer Gelfiltrationssäule,
wie zum Beispiel Superdex-75 (Pharmacia Co.), unterworfen wird.
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Die
Struktur des erfindungsgemäß bereitgestellten
Proteins, das auf diesem Wege erhalten wird, kann durch Kombinieren
der Analysenvorgehensweisen der Aminosäuresequenz durch den selektiven
Abbau unter Verwendung des bzw. eines Enzyms und der Analysenverfahrensweise
einer Gensequenz unter Verwendung des PCR-Verfahrens etc. bestimmt
werden. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz bestimmt werden, indem
das Protein, wie oben stehend erwähnt, abgetrennt und gereinigt,
mit einer Lysyl-Endopeptidase bearbeitet wird, das Fragment unter
Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
fraktioniert wird und es unter Verwendung eines Aminosäuresequenziergeräts analysiert
wird usw. Als Nächstes
kann die Gensequenz des Proteins durch RT-PCR-Verfahren etc. bestimmt
werden, wobei die auf der Grundlage der Aminosäuresequenz hergestellten Primer
verwendet werden. Schließlich
kann die vollständige
primäre
Aminosäuresequenz
des Proteins durch Bestimmung der Aminosäuresequenz auf der Grundlage
der Gensequenz aufgeklärt
werden.
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Durch
eine derartige Analyse bzw. Untersuchung wurde bestätigt, dass
das gemäß der vorliegenden Erfindung
bereitgestellte Protein ein Molekulargewicht von ungefähr 50.000
Da (gemessen durch SDS-Gelelektrophorese) hat und die partiellen
Aminosäuresequenzen,
die oben stehend erwähnt
sind, Aminosäuresequenzen
(1) und (2) haben.
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Als
Ergebnis einer Homologierecherche anhand der partiellen Aminosäuresequenzen
wurde festgestellt, dass die Homologie zwischen dem erfindungsgemäßen Protein
und den bekannten anderen Proteinen sehr gering war, abgesehen davon,
dass es eine näherungsweise
40%-ige Homologie zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und den hämolytisch
aktiven Proteinen aus Carybdea rastonii, die in familiärer Beziehung
zu Carybdea alata steht, aufwies. Deshalb wurde nahegelegt, dass
das erfindungsgemäße Protein,
das die hämolytische
Aktivität
besitzt, ein vollständig
neues Protein ist, das zu den bekannten Proteinen nicht ähnlich ist.
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Als
nächstes
wurden die Bestimmung der Gensequenz von näherungsweise 1.000 Basenpaaren durch
Durchführung
von RT-PCR an Gesamt-RNA, die aus der Tentakel von Carybdea alata
hergestellt wurde, unter Verwendung der auf der Grundlage der partiellen
Aminosäuresequenz
hergestellten Primer, und die Bestimmung der Gensequenzen des 5'-Endes und des 3'-Endes unter Verwendung
des 5'-RACE-Verfahrens
und des 3'-RACE-Verfahrens
durchgeführt.
Es wurde daher gefolgert, dass das hämolytisch aktive Protein von
Carybdea alata die vollständige
primäre
Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird, hat, und dass das Gen,
das dafür
codiert, die Basensequenz hat, die von SEQ ID NO:4 wiedergegeben
wird.
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Das
Verfahren zur Herstellung des spezifischen Proteins der vorliegenden
Erfindung durch Abtrennung und Reinigung ist gekennzeichnet dadurch,
dass es die hämolytische
Aktivität
beibehält.
Die Auftrennung und Reinigung im Zustand der Erhaltung solcher hämolytischer
Aktivität
werden zum Beispiel er reicht, indem die Prozessierung, wie zum Beispiel
Ultraschallbehandlung unter Verwendung der oben stehend erwähnten Phosphorsäurepufferlösung oder
verschiedenartiger Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in
10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0), enthaltend über
0,1 M NaCl, bevorzugt über
0,3 M und stärker
bevorzugt über
0,5 M, bei unter 10°C,
bevorzugt unter 5°C,
durchgeführt
wird.
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Deshalb
stellt die vorliegende Erfindung das Verfahren zur Herstellung des
Proteins durch Extraktion und Reinigung aus der Nematozyste von
Carybdea alata im Zustand der Beibehaltung der physiologischen Aktivität bereit.
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Das
spezifische erfindungsgemäße Protein
kann auch durch das Genrekombinationsverfahren hergestellt werden.
Die Herstellung durch das Genrekombinationsverfahren kann gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren durchgeführt
werden. Es kann beispielsweise erhalten werden durch Herstellen
des Vektors, in den das von SEQ ID NO:4 wiedergegebene Gen integriert
ist, Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, Inkubieren
oder Wachsenlassen der Zelle und Isolieren und Reinigen der Proteine
mit der hämolytischen
Aktivität
von Interesse aus der Wirtszelle oder Kulturlösung.
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Da
das gemäß der vorliegenden
Erfindung bereitgestellte Protein eine hämolytische Aktivität besitzt, kann
es beispielsweise für
Medikamente, die Zytolysewirkung haben, und für Reagenzien für die Forschung an
Hämolyse
verwendet werden. Weiterhin stellt es einen neuen Ansatz für die Entwicklung
von Wirkstoffen, wie zum Beispiel einem Wirkstoff für die Behandlung
des Stichs durch die Qualle, und die Entwicklung von Pestiziden,
wie zum Beispiel einem Insektizid, unter Verwendung der hämolytischen
oder cytotoxischen Aktivität bereit.
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BEISPIELE
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele
im Detail beschrieben; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht
auf die Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1
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1) Extraktion aus der
Nematozyste von Carybdea alata
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200
mg der Nematozyste von Carybdea alata, erhalten am Waikiki-Strand,
Hawaii, und kältekonserviert
bei –80°C, wurden
in 8 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0) getaucht und 15 Minuten lang mit Ultraschallwellen (Ultraschallreiniger
VS150, Iuchi Co.) behandelt. Die überstehenden Flüssigkeiten
wurden durch Zentrifugalabscheidung (3.000 U/min für 20 Minuten)
gesammelt. Dieser Arbeitsvorgang wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Weiterhin
wurde der gleiche Extraktionsarbeitsgang dreimal mit 8 ml 10 mM
Phosphorsäurepufferlösungen (pH
6,0), enthaltend 1 M NaCl, wiederholt und dann wurden alle überstehenden
Flüssigkeiten
gesammelt. Nach dem Extraktionsarbeitsgang wurde unverzüglich die
Ionenaustausch-HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) der
folgenden Reinigungsstufe durchgeführt.
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2) Die Reinigung durch
Ionenaustausch-HPLC (Säule:
TSK-GEL CM650S, Säulengröße: 20 × 220 mm,
Toso Co.)
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Die
oben genannte Säule
wurde mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0), enthaltend 0,3 M NaCl, äquilibriert.
Nach der Äquilibrierung
wurden die durch Extraktion im oben genannten Arbeitsgang 1) erhaltenen überstehenden
Flüssigkeiten
kombiniert bzw. vereinigt und mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0) vierfach verdünnt.
Die Lösung
wurde bei einer Flussrate von 3 ml/min auf die oben genannte Säule geladen.
Die Säule
wurde mit 100 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösungen (pH
6,0) nach der Aufbringung der Probe gewaschen. Die Elution wurde
durch einen 60-minütigen
Gradienten von 0 bis 0,7 M NaCl-Konzentration (in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung: pH 6,0)
durchgeführt.
Die hämolytische
Aktivität
wurde in vielen Fraktionen gezeigt, die zwischen 45 und 65 Minuten
nach dem Beginn des Gradienten eluierten. Zusätzlich wurde die hämolytische
Aktivität über die
hämolytische
Wirkung auf Schaf-Hämatozyten
untersucht (siehe nachstehendes Beispiel 2).
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3) Reinigung durch Ionenaustausch-HPLC
(Säule:
TSK-GEL CM5PW, Säulengröße: 7,5 × 75 mm,
Toso Co.)
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Die
oben genannte Säule
wurde gut mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0), enthaltend 0,3 M NaCl, äquilibriert.
Die hämolytisch
aktiven Fraktionen, die durch den oben genannten Reinigungsarbeitsgang
2) erhalten wurden, wurden mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) vierfach verdünnt. Die
Lösung
wurde auf die oben genannte Säule
bei einer Flussrate von 2 ml/min geladen. Die Säule wurde mit 30 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösungen (pH
6,0) nach der Aufbringung der Probe gewaschen. Nach dem Waschen
wurde die Elution durch einen 60-minütigen Gradienten von 0 bis
0,8 M NaCl-Konzentration (in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung: pH 6,0) durchgeführt. Fraktionen
mit hämolytischer
Aktivität
wurden zwischen 25 und 35 Minuten nach dem Beginn des Gradienten
eluiert und jede Fraktion wurde auf SDS-PAGE aufgebracht. Die Trennbedingungen
der aktiven Komponente wurden verifiziert und die gut getrennten
Anteile wurden gesammelt und in der nächsten Stufe verwendet. Im
Gegensatz dazu wurden die nicht getrennten bzw. abgetrennten Anteile
weiter durch Chromatographie bearbeitet, um die Abtrennung der aktiven
Komponente abzuschließen.
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4) Konzentration der hämolytischen
aktiven Komponente durch Ionenaustausch-HPLC (Säule: TSK-GEL CM5PW, Säulengröße: 7,5 × 75 mm,
Toso Co.)
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Die
Säule wurde
gut mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0), enthaltend 0,3 M NaCl, äquilibriert.
Die hämolytisch
aktiven Fraktionen, erhalten durch den oben stehend unter 3) erwähnten Reinigungsarbeitsgang,
wurden mit 10 mM Phosphor säurepufferlösung (pH
6,0) vierfach verdünnt.
Die Lösung
wurde bei einer Flussrate von 2 ml/min auf die oben genannte Säule geladen.
Nach dem Aufbringen der Probe wurde die Säule mit 30 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0) gewaschen. Nach dem Waschen wurde mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0), enthaltend 0,8 M NaCl, gespült und die in der Säule gebundene
Probe wurde eluieren gelassen. In etwa 5 Minuten nach dem Austausch
des Lösungsmittels
wurde der Anteil der hämolytisch
aktiven Komponente, der sich verdichtete bzw. kondensierte und in
einen Bereich bzw. Zeitraum eluierte, gesammelt.
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5) Die Reinigung durch
Gelfiltrations-HPLC (Säule:
Superdex-75, Säulengröße: 16 × 600 mm,
Pharmacia Co.)
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Jeweils
0,5–1,0
ml der durch Ionenaustausch-HPLC, oben unter 4), verdichteten Probe
wurden auf die oben genannte Säule, äquilibriert
mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH
6,0), die 0,8 M NaCl enthielt, aufgebracht und bei einer Flussrate
von 1 ml/min eluieren gelassen. Eine starke hämolytische Aktivität wurde
in der Fraktion gefunden, die zwischen 50 und 60 Minuten nach der
Injektion der Probe eluierte. Nach Bestätigung der Trennungsbedingungen
durch SDS-PAGE wurde das Protein der vorliegenden Erfindung, ein
hämolytisches
Toxin, durch Sammeln der aktiven Fraktionen abgetrennt (näherungsweise
10 μg).
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Beispiel 2: Messung der
hämolytischen
Aktivität
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Die
Messung der hämolytischen
Aktivität
in jeder Reinigungsstufe im oben genannten Beispiel 1 und die Messung
der hämolytischen
Aktivität
des schließlich
erhaltenen erfindungsgemäßen Proteins
wurden wie folgt durchgeführt.
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1) Methode
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Die
hämolytische
Aktivität
wurde durch Hämolyse
an Schaf-Erythrozyten
gemessen. Das heißt,
je 200 μl
PBS(+)- Pufferlösung, enthaltend
0,8% Schaf-Erythrozyten, wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten bzw. Wells
(Rundbodentyp) gegeben. 10 μl
der Lösung
der Fraktion, die in jeder Reinigungsstufe des oben genannten Beispiels
1 erhalten wurde, wurde in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) gelöst zu der
Platte gegeben. Sie wurde bei Raumtemperatur drei Stunden lang stehen
gelassen und dann wurde der Hämolysezustand
bzw. der hämolytische
Zustand der Schaf-Erythrozyten jeder Platte beobachtet. Zusätzlich wurde
das Vorhandensein oder das Fehlen der Retention der hämolytischen
Aktivität
dadurch bestimmt, ob die Fraktionen, die in jeder Reinigungsstufe
erhalten wurden, eine perfekte bzw. vollständige Hämolyse aufwiesen.
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2) Ergebnisse
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- 2-1) Die in jeder Reinigungsstufe des oben genannten Beispiels
1 erhaltene Fraktion wies die vollständige Hämolyse an den Schaf-Erythrozyten
auf und es wurde deshalb deutlich bzw. klar, dass sie die hämolytische
Aktivität
beibehält.
- 2-2) Darüber
hinaus bewirkte das erfindungsgemäße Protein mit der hämolytischen
Aktivität,
endgültig
erhalten durch den Reinigungsarbeitsgang der oben stehend in 5)
von Beispiel 1 erwähnt
ist, die vollständige
Hämolyse
an den Schaf-Erythrozyten bei einer Konzentration von weniger als
100 ng/ml (näherungsweise
2 nM).
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Beispiel 3: Bestimmung
des Molekulargewichts und der Partial- bzw. Teilstruktur der Proteine
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3-1) Bestimmung des Molekulargewichts
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Die
einzelne Bande, die durch Aufbringen des erfindungsgemäßen Proteins,
das die hämolytische
Aktivität
besitzt, das durch den Reinigungsarbeitsgang von 5) in Beispiel
1 erhalten wurde, auf SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gemäß dem herkömmlichen
Verfahren visualisiert worden war, wurde mit dem Proteinmolekulargewichtsmarker
(Pharmacia Co.) verglichen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass
das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Proteins näherungsweise
50.000 Da beträgt.
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3-2) Abbau mit der Lysylendopeptidase
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Das
Protein wurde durch Zugabe von 3 pM Achromobacter-Protease I (stammend
von Achromobacter lyticus M497-1: Takara Shuzo Co.) zu 10 μg erfindungsgemäßem Protein,
das die hämolytische
Aktivität
besitzt und durch den Reinigungsarbeitsgang, der oben unter 5) in
Beispiel 1 genannt ist, erhalten wurde, und Inkubieren in 10 mM
Tris-HCl-Pufferlösung
(pH 9,0) bei 30°C
für 20
Stunden abgebaut bzw. gespalten. Das mit dem Enzym verdaute Protein
wurde auf die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(Säule:
Bakerbond wide pore ODS) aufgebracht und mit einem 60-minütigen Gradienten
von 10 bis 62% Acetonitrilkonzentration (in Wasser, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt)
bei einer Flussrate von 0,7 ml/min aufgetrennt. In der Folge wurden
zwei Peptidfragmente, die jeweils bei einer Retentionszeit von 25
bis 49 Minuten eluierten, erhalten.
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3-3) Bestimmung der Aminosäuresequenz
von jedem der Fragmente durch das Aminosäuresequenzierungsgerät
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Die
Aminosäuresequenz
der drei Peptidfragmente, die erhalten wurden wie es oben stehend
erwähnt ist,
wurde gemäß den herkömmlichen
Verfahren unter Verwendung eines Proteinsequenziergeräts vom Typ Shimadzu
PSQ-1 (Shimadzu Co.) bestimmt.
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Als
Ergebnis besitzen die zwei Fragmente die folgenden Aminosäuresequenzen
(1) bzw. (2).
Aminosäuresequenz
(1):
Tyr-Arg-Asp-Gln-Glu-Leu-Glu-Asp-Asn-Val-Lys
Aminosäuresequenz
(2):
Lys-Trp-Pro-Asp-Tyr-Phe-Val-Tyr-Met-Glu-Ser-Ser-Ala-His-Gly-Tyr-Ile-Arg
(wobei
ein Aminosäurerest
mittels der Drei-Buchstaben-Notierung,
wie sie durch die IUPAC und die IUB definiert ist, geschrieben wird).
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Die
Homologierecherche über
jedes Fragment, für
das die Aminosäuresequenz
bestimmt wurde, wurde wie oben stehend erwähnt durchgeführt und
zeigte, dass die Homologie zwischen diesen Fragmenten und den bekannten
Proteinen sehr niedrig war, abgesehen davon, dass eine näherungsweise
40%-ige Homologie mit hämolytisch
aktiven Proteinen von Carybdea rastonii gezeigt wurde. Es wurde
deshalb vorgeschlagen, dass das spezifische Protein der vorliegenden
Erfindung, das unter Beibehaltung der hämolytischen Aktivität aus der
Nematozyste von Carybdea alata fraktioniert bzw. abgetrennt wurde,
ein vollständig
neues Protein ist.
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Beispiel 4: Bestimmung
der vollständigen
Aminosäuresequenz
des Proteins und des Gens, das für
die Aminosäuren
codiert
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4-1) Herstellung von Gesamt-RNA
aus Carybdea alata
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Die
Tentakel (näherungsweise
0,5 g Nassgewicht) von Carybdea alata wurde in flüssigem Stickstoff zerdrückt und
in 5 ml TRIzol (registrierte Marke)-Reagenz (GIBCO BRL Co.) homogenisiert.
Zu diesem Gemisch wurde 1 ml Chloroform zugesetzt und das Gemisch
wurde gerührt
bzw. geschüttelt
und mit einer Kühlzentrifuge
(Sakuma Co.) zentrifugiert [13.000 U/min für 15 Minuten bei 4°C]. Die obere
wässrige
Schicht wurde fraktioniert und zu dieser Lösung wurden 2,5 ml Isopropanol
zugegeben. Dann wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 10 Minuten
lang stehen gelassen. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde nach der Zentrifugationsabscheidung (13.000 U/min für 10 Minuten bei
4°C) unter
Verwendung der Kühlzentrifuge
entfernt und dann wurden dem Rückstand
5 ml 75% Ethanol zugegeben. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde nach dem Zentrifugieren (10.000 U/min für 5 Minuten bei 4°C) entfernt,
um den Rückstand
zu erhalten. Dann wurde eine Lufttrocknung des Rückstands für näherungsweise 10 Minuten durchgeführt. 100 μl RNase-freies
Wasser wurden zu dem resultierenden Rückstand zugegeben und das Gemisch
wurde 10 Minuten lang bei 60°C
inkubiert, um die RNA zu lysieren. Näherungsweise 0,5 mg Gesamt-RNA
wurden gemäß dem oben
stehenden Verfahren erhalten.
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4-2) Klonierung einer
partiellen cDNA
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Auf
der Basis der Aminosäuresequenz
(1) und der Aminosäuresequenz
(2) wurden die folgenden degenerierten Primer entworfen und mittels
des herkömmlichen
Verfahrens synthetisiert:
Vorwärtsprimer; GAY CAR GAR YTI
GAR GAY AA (SEQ ID NO:5)
Rückwärtsprimer;
ATR TAI CCR TGI GCI SWI SWY TCC (SEQ ID NO:6)
(wobei die obigen
alphabetischen Zeichen basierend auf der „Nucleotide Abbreviation List" (Cell Technology, Einzelband, „Biotechnology
Experiment Illustrated":
Shujunsha Co.) geschrieben wurden).
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Als
Nächstes
wurde gemäß der nachstehenden
Verfahrensweise einzelsträngige
cDNA synthetisiert, wobei das SUPERSCRIPT (eingetragene Marke) Preamplifikationssystem
für die
Erststrang-cDNA-Synthese verwendet wurde. Das heißt, 1 μg Gesamt-RNA, oligo(dT)12–18 und
DEPC-behandeltes Wasser wurden gemischt und das Gemisch wurde 10
Minuten lang bei 70°C
stehen gelassen. Dann wurden PCR-Puffer, 25 mM MgCl2,
10 mM dNTP-Gemisch
und 0,1 M DTT zu diesem Gemisch zugegeben und das resultierende
Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 42°C präinkubiert. Superscript II RT
(200 Units/μl)
wurde zu diesem Ge misch zugegeben und das Gemisch wurde 50 Minuten
lang bei 42°C
und 15 Minuten lang bei 70°C
inkubiert. Die RNase H wurde zu dem Gemisch zugegeben und dann wurde
das resultierende Gemisch 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, um ErststrangcDNA
zu erhalten.
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Nachfolgend
wurde gemäß den nachstehenden
Bedingungen PCR unter Verwendung eines Thermocyclers vom Typ GeneAmp
PCR System 2400 (Perkin-Elmer Co.) durchgeführt. Das heißt, dass
Erststrang-cDNA-PCR-Puffer, dNTP-Gemisch, Vorwärtsprimer, Rückwärtsprimer,
TaKaRa Ex Taq (eingetragene Marke, Takara Shuzo Co.) und Wasser
gemischt wurden. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs auf
94°C für 5 Minuten,
dann Wiederholen von 3 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden
bei 45°C und
2 Minuten bei 72°C
und weitere 27 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten
bei 72°C
durchgeführt.
Der Reaktant wurde dann für
5 Minuten bei 72°C
behandelt.
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Die
erhaltene Reaktionslösung
wurde an einem 0,8%-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt,
um das amplifizierte PCR-Produkt
in der Kombination von Vorwärtsprimer
und Rückwärtsprimer
zu bestätigen.
Die Größe des PCR-Produkts
betrug näherungsweise
900 bp.
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4-3) Sequenzierung der
partiellen cDNA
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Das
PCR-Produkt wurde in den TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogene
Co.) inseriert und Escherichia coli JM109 wurde mit der Rekombination
transformiert. Die Transformante wurde auf LB-Agarmedium (enthaltend
50 μg/μl Ampicillin)
kultiviert. Gemäß den nachstehenden
Bedingungen wurde Kolonie-PCR an den erhaltenen Kolonien als Matrize
unter Verwendung des M13-Universalprimers
durchgeführt.
Der Escherichia-coli-Stamm, PCR-Puffer, dNTP-Gemisch, M13-Vorwärtsprimer,
M13-Rückwärtsprimer,
TaKaRa Ex Taq (eingetragene Marke, Takara Shuzo Co.) und Wasser
wurden gemischt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs
auf 90°C
für 10
Minuten, dann Wiederholen von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden
bei 55°C
und 2 Minuten bei 72°C
und weiteres Erhitzen auf 72°C
für 5 Minuten
durchgeführt.
Die Reaktionslösung
wurde an einem 0,3%-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt
und das Ziel-Kolonie-PCR-Produkt
wurde an der Zentrifugensäule
(„spin
column") vom Typ
MicroSpin (eingetragene Marke) 5-400 (Amersham Pharmacia Co.) gereinigt.
Dann wurde die Sequenzierung des erhaltenen Produkts unter Verwendung
eines Gensequenzierungsgeräts
mit der Bezeichnung ABI PRISM 310 (Applied Biosystems Co.) durchgeführt.
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Die
erhaltene Sequenz wurde unter Verwendung der Genanalyse-Software GENETYX-MAC
(Software Development Co.) untersucht. Als Ergebnis wurde die partielle
cDNA-Sequenz von näherungsweise
900 bp untersucht.
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4-4) Sequenzierung der
Volllängen-cDNA
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Die
folgenden Primer wurden basierend auf der Basensequenz der partiellen
cDNA synthetisiert:
5'-RACE-1-Rückwärtsprimer;
ACA GCA TCT CTG ACC GAA TC (SEQ ID NO:7)
5'-RACE-2-Rückwärtsprimer; AAT GGA CCT CGG
TCA GAT TC (SEQ ID NO:8)
5'-RACE-3-Rückwärtsprimer;
CAC TGT TGA CGA AGG TGA TG (SEQ ID NO:9)
3'-RACE-1-Vorwärtsprimer; GGA ACA GCT GAT
GAA GAT CC (SEQ ID NO:10)
3'-RACE-2-Vorwärtsprimer;
GGT GAG CAA GGT TAC TTC RC (SEQ ID NO:11)
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Anschließend wurden
gemäß der nachstehenden
Verfahrensweise 5'-RACE
und 3'-RACE durchgeführt, wobei
der 5'/3'-RACE-Kit (Boehringer
Mannheim Co.) verwendet wurde.
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(a) 5'-RACE
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1 μg Gesamt-RNA,
cDNA-Synthesepuffer, dNTP-Gemisch, 5'-RACE-1-Rückwärtsprimer,
AMV-Reversetranskriptase und DEPC-behandeltes Wasser wurden gemischt
und das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei 55°C und 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert,
um Erststrang-cDNA zu erhalten.
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Anschließend wurde
die so erhaltene Erststrang-cDNA an der Zentrifugensäule gereinigt
und dann wurden Reaktionspuffer und 2 mM dATP zu der Erststrang-cDNA
zugegeben und das Gemisch wurde drei Minuten lang bei 94°C stehen
gelassen. Terminale Transferase (10 Units/μl) wurde zu dem Gemisch zugegeben und
das resultierende Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden Erststrang-cDNA, PCR-Puffer, dNTP-Gemisch,
5'-RACE-2-Rückwärtsprimer,
oligo(dT)-Ankerprimer und Wasser zu dem obigen Gemisch zugegeben.
Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs auf 94°C für 5 Minuten, dann
Wiederholen von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und eine
Minute bei 72°C und
weiterhin Erhitzen auf 72°C
für 5 Minuten
durchgeführt.
In der Folge wurde geschachtelte PCR bzw. Nested-PCR mit dem ersten
PCR-Produkt als Matrize, wobei die Kombination von 5'-RACE-3-Rückwärtsprimer und PCR-Ankerprimer
unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten PCR verwendet
wurde, durchgeführt.
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Das
erste PCR-Produkt und das Nested-PCR-Produkt wurden an einem 1,5%-igen
Agarosegel elektrophoretisch getrennt, um die Bande von näherungsweise
600 bp zu bestätigen.
Dieses Nested-PCR-Produkt wurde
in den TA-Klonierungsvektor inseriert und die Sequenzierung wurde
gemäß der Bestimmung
der Basensequenz von cDNA, die oben stehend unter 4-3) beschrieben
ist, durchgeführt
und dann wurde die Sequenz analysiert.
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(b) 3'-RACE
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1 μg Gesamt-RNR,
cDNA-Synthesepuffer, dNTP-Gemisch, oligo(dT)-Ankerprimer, AMV-Reversetranskriptase
und DEPC-behandeltes Wasser wurden gemischt und das Gemisch wurde
60 Minuten lang bei 55°C inkubiert.
Nachfolgend wurde der Reaktant 10 Minuten lang bei 65°C behandelt,
um Erststrang-cDNA zu erhalten.
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Anschließend wurde
die so erhaltene erste PCR unter den nachfolgenden Bedingungen durchgeführt. Erststrang-cDNA,
PCR-Puffer, dNTP-Gemisch,
3'-RACE-1-Vorwärtsprimer,
PCR-Ankerprimer, TaKaRa Ex Taq (eingetragene Marke, Takara Shuzo
Co.) und Wasser wurden gemischt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des
Gemischs auf 94°C
für 5 Minuten,
dann Wiederholen von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden
bei 55°C
und 2 Minuten bei 72°C
und weiteres Erhitzen auf 72°C
für 5 Minuten
durchgeführt.
Die Nested-PCR wurde am ersten PCR-Produkt als Matrize durchgeführt, wobei
die Kombination von 3'-RACE-2-Vorwärtsprimer
und PCR-Ankerprimer unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten
PCR verwendet wurde.
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Das
erste PCR-Produkt und das Nested-PCR-Produkt wurden an einem 1,5%-igen
Agarosegel elektrophoretisch getrennt, um die Bande von näherungsweise
600 bp zu bestätigen.
Das Nested-PCR-Produkt wurde
in den TA-Klonierungsvektor inseriert und die Sequenzierung wurde
gemäß der Bestimmung
der Basensequenz von cDNA, die oben stehend unter 4-3) beschrieben
ist, durchgeführt
und die Sequenz wurde analysiert.
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Als
Ergebnis wurde die Größe (2000
bp) und die Sequenz von cDNA, die für das neue hämolytisch aktive
Protein von Carybdea alata codiert, und die Anzahl (463 AS) und
die Sequenz der Aminosäuren
des Proteins ermittelt. Das bedeutet, dass das hämolytisch aktive Protein von
Carybdea alata die Aminosäuresequenz
besitzt, die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird und das Gen, das
dafür codiert,
die Basensequenz besitzt, die durch SEQ ID NO:4 wiedergegeben wird.
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Das
neue Protein der vorliegenden Erfindung, das wie oben stehend erwähnt erhalten
wurde, ist das spezifische Protein, das die folgende physiologische
Aktivität
und physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzt, wie sie
durch das Beispiel angegeben werden:
- (a) hämolytische
Aktivität;
- (b) ein Molekulargewicht von näherungsweise 50.000 Da (bestimmt
durch SDS-Gelelektrophorese);
- (c) die oben stehend beschriebenen Aminosäuresequenzen 1 und 2 als eine
partielle Aminosäuresequenz; und
- (d) die durch SEQ ID NO:3 wiedergegebene Aminosäuresequenz
als die vollständige
Aminosäuresequenz.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Da
das hämolytische
Aktivität
besitzende Protein, das von der Nematozyste von Carybdea alata stammt,
und erfindungsgemäß bereitgestellt
wird, ein neues Protein ist, das als Ergebnis der Homologierecherche
anhand der partiellen Aminosäuresequenz
und den vollständigen
primären
Aminosäuresequenzen
zu bekannten Proteinen nicht ähnlich
ist, ist es als biochemisches Reagenz zum Beispiel zur Aufklärung des
Mechanismus einer Hämolyse
etc. verwendbar.
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Es
stellt auch einen neuen Ansatz bereit, der gerichtet ist auf die
Entwicklung von Wirkstoffen, wie zum Beispiel dem Medikament zur
Behandlung des Stichs durch die Qualle, auf der Basis der Untersuchung
der Korrelation der strukturellen Aktivität auf einer molekularen Ebene,
und dem Antikörper
am Protein oder dem partiellen Peptid etc. Weiterhin ist es verwendbar
als Wirkstoff, der eine Blutplättchen
agglutinierende Wirkung usw. besitzt und als Pestizide, wobei eine
hämolytische
Aktivität
genutzt wird. SEQUENZPROTOKOLL