DE60120500T2

DE60120500T2 - In Knorpelgeweben stark exprimiertes Gen

Info

Publication number: DE60120500T2
Application number: DE60120500T
Authority: DE
Inventors: Ellen San Francisco FILVAROFF; Audrey San Francisco Goddard; Christopher J. San Francisco GRIMALDI; I. William Hillsborough WOOD
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2021-12-08
Also published as: AU2002246633B2; EP1364023A2; IL155567A0; CA2426102A1; ES2269509T3; EP1364023B1; IL155567A; DK1364023T3; JP2005501513A; CY1105204T1; DE60120500D1; US20070160594A1; ATE329026T1; WO2002059308A2; WO2002059308A3; PT1364023E

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifikation und Isolation von neuer DNA und die rekombinante Produktion neuer Polypeptide mit Sequenzähnlichkeit zu menschlichem Inter-alpha-Trypsininhibitor (ITI), hierin als "PRO21074"-Polypeptide bezeichnet. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner allgemein die Diagnose und Behandlung von Knorpelerkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Extrazelluläre Proteine spielen wichtige Rollen bei u.a. der Bildung, Differenzierung und Aufrechterhaltung von multizellulären Organismen. Das Schicksal zahlreicher einzelner Zellen, z.B. Proliferation, Migration, Differenzierung oder Wechselwirkung mit anderen Zellen, wird typischerweise durch Information gesteuert, die von anderen Zellen und/oder der unmittelbaren Umgebung erhalten wird. Diese Information wird häufig durch sekretierte Polypeptide (beispielsweise mitogene Faktoren, Überlebensfaktoren, zytotoxische Faktoren, Differenzierungsfaktoren, Neuropeptide und Hormone) übertragen, die wiederum von diversen Zellrezeptoren oder membrangebundenen Proteinen aufgenommen und interpretiert werden. Diese sekretierten Polypeptide oder Signalgebungsmoleküie wandern normalerweise durch den zellulären Sekretionsstoffwechselweg, um ihren Wirkungsort in der extrazellulären Umgebung zu erreichen.
Sekretierte Proteine haben verschiedene gewerbliche Anwendungsbereiche, einschließlich als Pharmazeutika, Diagnostika, Biosensoren und Bioreaktoren. Die meisten Proteinwirkstoffe, die zur Zeit erhältlich sind, wie z.B. thrombolytische Mittel, Interferone, Interleukine, Erythropoietine, Koloniewachstum stimulierende Faktoren und verschiedene andere Cytokine, sind Sekretionsproteine. Ihre Rezeptoren, die Membranproteine sind, haben ebenfalls Potenzial als therapeutische oder diagnostische Mittel. Sowohl im Bereich der Industrie als auch der universitären Forschung werden Anstrengungen unternommen, um neue, native sekretierte Proteine zu identifizieren. Zahlreiche Anstrengungen konzentrierten sich auf das Screenen von re kombinanten Säugetier-DNA-Bibliotheken, um die Kodiersequenzen für neue sekretierte Proteine zu identifizieren. Beispiele für Screeningverfahren und -techniken sind in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7108–7113 (1996); US-Patent Nr. 5.536.637).
Inter-alpha-Trypsininhibitor (ITI) ist ein menschliches Plasmaglykoprotein, das in einem Komplex drei verschiedener Proteine enthalten ist: Bikunin und den Schwerketten H1 und H2. Morelle et al. zeigten, dass diese drei Ketten über eine Chondrotinsulfatkette kovalent gebunden sind (Eur. J. Biochem. 221 (2), 881–888 (1994)). Siehe auch J. J. Enghild et al., J. Biol. Chem. 268 (12), 8711–8716 (1993). Bost et al. berichten, dass mRNA für die ITI-Schwerkette H1 ausschließlich in Lebergewebe zu finden ist. F. Bost et al., Eur. J. Biochem. 218 (2), 283–291 (1993).
Es wurde auch erkannt, dass menschlicher ITI menschliches Trypsin, Chymotrypsin, neutrophile Elastase und Cathepsin G deaktiviert. M. Morii & J. Travis, Biol. Chem. Hoppe Seyler 366 (1), 19–21 (1985). Es wurde berichtet, dass die Schwerketten potenzielle Calcium-Bindungsstellen und Regionen, die zu der vorgeschlagenen reaktiven Stelle für Thiolproteinase-Inhibitoren homolog sind, enthalten, was darauf hinweist, dass ITI ein komplexes, multifunktionelles Protein ist. J. P. Salier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (23), 8272–8276 (1987). Darüber hinaus wird angenommen, dass die Wechselwirkung von ITI mit Hyaluronsäure eine maßgebliche Rolle bei der Organisation und Stabilisierung der extrazellulären Matrix spielt. H. Kobayashi et al., Cell Tissue Res. 296, 587–597 (1999).
Auch wurde vorgeschlagen, dass ITI als ein Träger von Hyaluronan in Serum wirken kann oder als ein Bindungsprotein zwischen Hyaluronan und anderen Matrixproteinen und dass er eine Rolle bei der Stimulierung von phagozytischen Zellen spielen kann.
Weiters wurde vorgeschlagen, dass ITI, ein Inhibitor von Serinproteasen, Gelenkschondrozyten schützen und Knorpelschädigung bei Knorpelerkrankungen unterbinden kann. D. C. Fischer et al., Arthritis Rheum. 42 (9), 1936–1945 (1999).
Die Erfinder beschreiben hierin die Identifizierung und Charakterisierung neuer Polypeptide mit Sequenzähnlichkeit zu menschlichem Inter-alpha-Trypsininhibitor (ITI), hierin als PRO21074-Polypeptide bezeichnet, sowie ihre mögliche Verwendung bei der Diagnose und Behandlung von Knorpelerkrankungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Anmeldung beschreibt Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Knorpelerkrankungen. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung einen cDNA-Klon (hierin als DNA153576-2925 bezeichnet) – hierin als ein Klon identifiziert, der Homologie zur Nucleinsäure aufweist, die für menschlichen Inter-alpha-Trypsininhibitor (ITI) kodiert – bereit, der für ein neues Polypeptid kodiert, das in der vorliegenden Anmeldung als "PRO21074" bezeichnet wird.
in einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein PRO21074-Polypeptid kodiert.
In einem Aspekt umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99 Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a).
In einem anderen Aspekt umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül (a) eine Nucleotidsequenz, die für ein PRO21074-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder (b) das Komplement zu der Nucleotidsequenz aus (a).
Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann eine Nucleotidsequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86 Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98 Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül mit der Nucleotidsequenz von 31 oder 100 bis 3969 (Grenzen eingeschlossen) aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfassen.
Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann (a) die Nucleotidsequenz von 31 oder 100 bis 3969 (Grenzen eingeschlossen) aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a) umfassen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, mit (a) einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche cDNA, hinterlegt bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA (DNA153576-2925), kodiert, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül (a) eine Nucleotidsequenz, die für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche cDNA, hinterlegt bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA (DNA153576-2925), kodiert, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a).
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ da zu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, mit (a) der Polypeptid-Kodiersequenz voller Länge der menschlichen cDNA, hinterlegt bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA (DNA153576-2925), oder (b) dem Komplement der Nucleotidsequenz aus (a) umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül (a) die Polypeptid-Kodiersequenz voller Länge der DNA, hinterlegt bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA (DNA153576-2925), oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a).
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das für ein aktives PRO21074-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das eine Nucleotidsequenz mit zumindest 2036 Nucleotiden umfasst, die an das Komplement einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für die Aminosäuren 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert. Hybridisierung tritt unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein.
Die Anmeldung beschreibt auch ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO21074-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das eine Nucleotidsequenz umfasst, die an das Komplement der Nucleinsäuresequenz zwischen etwa den Nucleotiden 31 oder 100 und 3969 (Grenzen eingeschlossen) aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) hybridisiert. Vorzugsweise tritt Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül mit zumindest 2036 Nucleotiden bereit, das durch Hybridisieren eines Test-DNA-Moleküls unter stringenten Bedingungen an (a) ein DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder (b) das Komple ment des DNA-Moleküls aus (a) und, sofern das Test-DNA-Molekül zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, zu (a) oder (b) aufweist, durch Isolieren des Test-DNA-Moleküls produziert wird.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das DNA, die für ein PRO21074-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Initations-Methionin kodiert, umfasst oder zu solch einem kodierenden Nucleinsäuremolekül komplementär ist. Das Signalpeptid wurde vorläufig als eines identifiziert, das sich von etwa Aminosäureposition 1 bis etwa Aminosäureposition 23 in der Sequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) erstreckt. Es gilt jedoch anzumerken, dass die C-terminale Grenze des Signalpeptids variieren kann, sehr wahrscheinlich jedoch nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Signalpeptidgrenze wie anfänglich hierin identifiziert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß Kriterien identifiziert werden kann, die üblicherweise auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelement verwendet werden (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1–6 (1997); und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14, 4683–4690 (1986)). Darüber hinaus wird auch erkannt, dass in manchen Fällen Abspaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht vollständig gleichförmig erfolgt, was zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Diese Polypeptide, und die dafür kodierenden Poly nucleotide, werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Als solches erstreckt sich für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung das Signalpeptid des PRO21074-Polypeptids, gezeigt in 2 (Seq.-ID Nr. 2), von den Aminosäuren 1 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X für jede beliebige Aminosäure von 18 bis 28 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht. Daher umfassen reife Formen des PRO21074-Polypeptids, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, jene, die die Aminosäuren X bis 1313 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfassen, worin X jede beliebige Aminosäure von 18 bis 28 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, und Varianten davon, wie nachstehend beschrieben. Isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für diese Polypeptide kodieren, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch Polynucleotidfragmente einer Kodiersequenz für PRO21074-Polypeptid, die beispielsweise als Hybridisierungssonden oder zur Kodierung von Fragmenten eines PRO21074-Polypeptids, die gegebenenfalls für ein Polypeptid kodieren können, das eine Bindungsstelle für einen Anti-PRO21074-Antikörper umfasst, Verwendung finden. Solche Nucleinsäurefragmente können eine Länge von zumindest etwa 20 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 30 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 40 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 50 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 60 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 70 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 80 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 90 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 100 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 110 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 120 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 130 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 140 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 150 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 160 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 170 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 180 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 190 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 200 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 250 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 300 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 350 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 400 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 450 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 500 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 600 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 700 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 800 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 900 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 1000 Nucleotiden, aufweisen, worin in diesem Zusammenhang die Bezeichnung "etwa" die genannte Nucleotidsequenzlänge plus oder minus 10% der genannten Länge bedeutet. Das Nucleotidsequenzfragment kann aus jedem beliebigen, in 1 gezeigten Segment (Seq.-ID Nr. 1) abgeleitet sein, z.B. Kodier- und untranslatierte Regionen. In einer alternativen Ausführungsform stammt das Nucleotidsequenzfragment aus jeder beliebigen Kodierregion der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1). Es gilt anzumerken, dass neue Fragmente einer für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz auf routinemäßige Weise durch Abgleichen der für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz mit anderen bekannten Nucleotidsequenzen unter Verwendung jeder beliebigen Anzahl an bekannten Sequenzabgleichprogrammen und durch Bestimmen, welche(s) für PRO21074-Polypeptid kodierende(n) Nucleotidsequenzfragment(e) neu ist/sind, bestimmt werden können. Alle solche für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenzen werden hierin in Betracht gezogen und können ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Ebenfalls in Betracht gezogen werden PRO21074-Polypeptidfragmente, für die diese Nucleotidmolekülfragmente kodieren, vorzugsweise jene PRO21074-Polypeptidfragmente, die eine Bindungsstelle für einen Anti-PRO21074-Antikörper umfassen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die für PRO21074 kodiert. Der Vektor kann jedes beliebige, hierin zuvor identifizierte isolierte Nucleinsäuremolekül umfassen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die einen Vektor umfasst, der für PRO21074 oder seine Varianten kodiert. Die Wirtszellen können beispielsweise CHO-Zellen, E. coli oder Hefe sein.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von PRO21074-Polypeptiden bereit, umfassend das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Expression von PRO21074 geeignet sind, und das Gewinnen von PRO21074 aus der Zellkultur.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung isoliertes PRO21074-Polypeptid bereit, für das jede beliebige der hierin zuvor identifizierten, isolierten Nucleinsäuresequenzen kodiert.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung isoliertes Nativsequenz-PRO21074-Polypeptid bereit, das in bestimmten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz umfasst, die die Reste von etwa 1 oder etwa 24 bis etwa 1313 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO21074-Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, zur Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO21074-Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88 Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91 Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, zu einer Aminosäuresequenz, für die die menschliche cDNA, hinterlegt bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA (DNA153576-2925), kodiert, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte PRO21074-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, für die die menschliche cDNA, hinterlegt bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA (DNA153576-2925), kodiert.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO21074-Polypeptid ohne die N-terminate Signalsequenz und/oder das Initations-Methionin bereit, für das eine Nucleotidsequenz kodiert, die für solche eine Aminosäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben kodiert. Verfahren zur Herstellung desselben werden ebenfalls hierin beschrieben, worin jene Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, unter Bedingungen, die zur Expression des PRO21074-Polypeptids geeignet sind, und das Gewinnen des PRO21074-Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
In wiederum einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes PRO21074-Polypeptid bereit, das die Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Die Identifizierung von PRO21074-Polypeptidfragmenten, die biologische Aktivität besitzen oder eine Bindungsstelle für einen Anti-PRO21074-Antikörper bereitstellen, kann auf routinemäßige Weise unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, erfolgen. Vorzugsweise behält das PRO21074-Fragment eine qualitative biologische Aktivität eines nativen PRO21074-Polypeptids bei.
In wiederum einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das durch (i) Hybridisieren eines Test-DNA-Moleküls unter stringenten Bedingungen an (a) ein DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder 24 bis 1313 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder (b) das Komplement des DNA-Moleküls aus (a) und, sofern das Test-DNA-Molekül zumindest 80% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Sequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Sequenzidentität, zu (a) oder (b) aufweist (ii) Kultivieren einer Wirtszelle, die das Test-DNA-Molekül umfasst, unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, und (iii) Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur produziert wird.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, die ein PRO21074-Polypeptid, fusioniert an ein heterologes Polypeptid oder eine hetero loge Aminosäuresequenz, umfasst, worin das PRO21074-Polypeptid jegliches PRO21074-Polypeptid, jegliche Variante oder jegliches Fragment davon, wie hierin zuvor beschrieben, umfassen kann. Ein Beispiel für ein solches chimäres Molekül umfasst ein PRO21074-Polypeptid, fusioniert an eine Epitop-Tag-Sequenz oder eine Fc-Region eines Immunglobulins.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper wie nachstehend definiert bereit, der sich spezifisch an ein PRO21074-Polypeptid wie hierin zuvor beschrieben bindet. Gegebenenfals ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein einkettiger Antikörper.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch Agonisten und Antagonisten eines nativen PRO21074-Polypeptids wie nachstehend definiert. Der Agonist oder Antagonist kann ein Anti-PRO21074-Antikörper oder ein kleines Molekül sein.
Die Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten eines PRO21074-Polypeptids, das das Kontaktieren des PRO21074-Polypeptids mit einem Kandidatenmolekül und das Beobachten einer biologischen Aktivität, vermittelt durch das PRO21074-Polypeptid, umfasst. Vorzugsweise ist das PRO21074-Polypeptid ein natives PRO21074-Polypeptid.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Materialzusammensetzung bereit, die ein PRO21074-Polypeptid oder einen Anti-PRO21074-Antikörper in Kombination mit einem Träger umfasst. Der Träger ist ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.
Die vorliegende Anmeldung stellt auch die Verwendung eines PRO21074-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon wie hierin beschrieben oder eines Anti-PRO21074-Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments bereit, das zur Behandlung einer Erkrankung nützlich ist, die auf das PRO21074-Polypeptid, einen Agonisten oder Antagonisten davon oder einen Anti-PRO21074-Antikörper reagiert.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Verwendung eines PRO21074-Polypeptids für ein Verfahren zur Diagnose oder Beobachtung des Fortschritts einer Knorpelerkrankung. Dieses Verfahren kann das Messen der Konzentration des PRO21074-Polypeptids in Serum oder Synovialflüssigkeit umfassen, worin eine Änderung der Konzentration des obigen Polypeptids in Bezug auf normales Gewebe mit dem relativen Ausmaß oder der Prognose der jeweiligen Erkrankung korreliert. Das PRO21074-Polypeptid kann im Urin oder in der Knorpelmatrix gemessen werden.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers, das an einer Knorpelerkrankung leidet, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines PRO21074 an das Säugetier. Gegebenenfalls ist die Knorpelerkrankung eine degenerative Knorpelerkrankung. Die degenerative Knorpelerkrankung kann Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, sein. Gegebenenfalls ist der Knorpel ein Gelenksknorpel. Das Verfahren kann ferner die Kombination von PRO21074 mit einem chirurgischen Standardverfahren und/oder einer wirksamen Menge an zumindest einem Knorpelmittel umfassen. Gegebenenfalls umfasst das PRO21074 ferner einen Träger, Exzipienten oder Stabilisator.
Die Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers, das an einer Knorpelerkrankung leidet, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines PRO21074-Antagonisten an das Säugetier. Gegebenenfalls ist die Knorpelerkrankung eine degenerative Knorpelerkrankung. Die degenerative Knorpelerkrankung kann Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, sein. Der PRO21074-Antagonist kann ein Anti-PRO21074-Antikörper sein. Gegebenenfalls ist der Knorpel Gelenksknorpel. Das Verfahren kann ferner die Kombination von PRO21074-Antagonist mit einem chirurgischen Standardverfahren und/oder einer wirksamen Menge an zumindest einem Knorpelmittel umfassen. Gegebenenfalls umfasst der PRO21074-Antagonist ferner einen Träger, Exzipienten oder Stabilisator.
Die Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung von geschädigtem Knorpel oder zur Prävention von Schädigung am Knorpel, umfassend das Kontaktieren des Knorpels mit einer wirksamen Menge eines PRO21074 oder eines Antagonisten davon. Der PRO21074-Antagonist kann ein Anti-PRO21074-Antikörper sein. Der Knorpel kann Gelenksknorpel sein. Insbesondere resultiert die Knorpelschädigung aus einer Knorpelerkrankung, noch spezifischer aus einer degenerativen Knorpelerkrankung. Noch spezifischer ist die Knorpelerkrankung Arthritis, einschließlich z.B. rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis. Alternativ dazu kann die Schädigung aus einer Verletzung, z.B. Mikroschädigung oder einem stumpfen Trauma, einer chondralen Fraktur, einer osteochondralen Fraktur, Schädigung an Sehnen, Menisken oder Bändern, resultieren oder das Resultat von übermäßiger mechanischer Belastung oder einer anderen biomechanischen Instabilität sein, die aus einer Verletzung oder aus Adipositas resultiert. Der Knorpel kann innerhalb eines Säugetiers, einschließlich Menschen, enthalten sein, und die Menge, die dem Säugetier verabreicht wird, ist eine therapeutisch wirksame Menge. PRO21074-Polypeptid oder -Antagonist kann über Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, intraläsionale, intraartikuläre oder topische Verabreichung zugeführt werden. Alternativ dazu kann die Zusammensetzung direkt in die beeinträchtigte Knorpelregion oder das Gelenk injiziert werden. Das Verfahren kann ferner eine wirksame Menge eines Knorpelmittels und/oder ein chirurgisches Standardverfahren einbinden. Das PRO2074-Polypeptid oder der PRO21074-Antagonist kann entweder vor, nach und/oder gleichzeitig mit dem standardmäßigen Knorpelchirurgieverfahren verabreicht werden. Die wirksame Menge an PRO21074-Polypeptid oder -Antagonist kann ferner eine wirksame Menge an Knorpelmittel umfassen.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung von geschädigtem Knorpel oder zur Prävention anfänglicher oder dauerhafter Schädigung, umfassend das Kontaktieren des Knorpels mit einer wirksamen Menge eines PRO21074-Polypeptids in Kombination mit einer wirksamen Menge an einem Knorpelmittel. Gegebenenfalls ist der Knorpel innerhalb eines Säugetiers vorhanden und ist die verabreichte Menge eine therapeutisch wirksame Menge.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Aufrechterhaltung, Steigerung oder Förderung des Wachstums von Chondrozyten in serumfreier Kultur durch Kultivieren von Chondrozyten mit einer wirksamen Menge an PRO21074-Polypeptid. Alternativ dazu stellt das Verfahren das Kontaktieren der Chondrozyten mit einer wirksamen Menge an PRO21074-Polypeptid in einer Retard- oder Depot-Formulierung bereit.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung geschädigten Knorpels oder zur Prävention von anfänglicher oder dauerhafter Schädigung, umfassend das Behandeln von Zellen in und rund um die Gelenke mit einer wirksamen Menge an PRO21074-Polypeptid. Diese Behandlung kann durch exogene Anwendung des PRO21074-Polypeptids oder alternativ dazu durch Einführen von Nucleinsäure, die für PRO21074 oder Fragmente davon kodiert, in die Zellen über Transfektion, Infektion oder andere standardmäßige In-vitro- oder In-vivo-Verfahren erfolgen. Ein In-vitro-Therapieverfahren kann das Entfernen einer "Zelle in und rund um das Gelenk", das Einführen der Nucleinsäure in die Zelle und das Transplantieren der behandelten Zelle zurück in das Gewebe, aus dem sie anfänglich entfernt wurde, umfassen. Die mit Knorpel verwandten Zellen können Chondrozyten, Synovialzellen, Fibroblasten, Zellen innerhalb von Sehnen oder Bändern, Osteobiasten oder Myoblasten sein.
Alternativ dazu beschreibt die Anmeldung ein Verfahren zur Förderung der Adhäsion von Chondrozyten aneinander oder an Knorpelmatrix. In einem spezifischen Aspekt tritt die Adhäsion in einer serumfreien In-vitro-Kultur ein. Die Adhäsion kann auch in vivo eintreten.
Die Anmeldung beschreibt auch ein therapeutisches Set, umfassend PRO21074 und einen Träger, Exzipienten und/oder Stabilisator (z.B, einen Puffer) in einer geeigneten Verpackung. Das Set enthält vorzugsweise Anweisungen zur Verwendung von PRO21074 zur Behandlung von geschädigtem Knorpel oder zur Prävention von anfänglicher oder dauerhafter Schädigung an Knorpel infolge von Verletzung oder einer Knorpelerkrankung. Alternativ dazu kann das Seit Anweisungen zur Verwendung von PRO21074 zur Behandlung einer Knorpelerkrankung enthalten.
Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Herstellungsartikel, umfassend:
ein Behältnis;
eine Anweisung am Behältnis; und
eine Zusammensetzung, die einen Wirkstoff umfasst und die innerhalb des Behältnisses vorliegt;
worin die Zusammensetzung zur Behandlung einer Knorpelerkrankung wirksam ist, die Anweisung am Behältnis angibt, dass die Zusammensetzung verwendet werden kann, um eine Knorpelerkrankung zu behandeln, und der Wirkstoff in der Zusammensetzung ein PRO21074-Polypeptid ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer cDNA, die eine Nucleotidsequenz (Nucleotide 31-3969) enthält, die für Nativsequenz-PRO21074 kodiert, worin die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) ein Klon ist, der hierin als "DNA153576-2925" bezeichnet wird. Ebenfalls in Fettdruck und unterstrichen dargestellt sind die Positionen der jeweiligen Start- und Stoppcodons.
2A–B zeigen die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) eines Nativsequenz-PRO21074-Polypeptids, abgeleitet von der Kodiersequenz aus Seq.-ID Nr. 1. Ebenfalls gezeigt sind die ungefähren Positionen verschiedener anderer wichtiger Polypeptiddomänen.
3 zeigt eine Nucleotidsequenz, die hierin als DNA144306 (Seq.-ID Nr. 3) bezeichnet ist.
4 zeigt eine Analyse der Expression von DNA 153576 in Bibliotheken, die aus zahlreichen verschiedenen Geweben erstellt wurde, in Bezug auf die Expression, die in fötalem Gelenksknorpel beobachtet wurde. Wie angegeben schien Expression hoch spezifisch für Knorpel zu sein. Für alle Proben wurden 50 ng cDNA-Bibliothek pro Reaktion verwendet. Alle Proben wurden bezogen auf beta-Actin normalisiert und in Bezug auf DNA153576-Expression in der fötalen Gelenksknorpelbibliothek in Diagrammform dargestellt.
5 zeigt eine Analyse der Expression von DNA 153576 in verschiedenen Geweben in Bezug auf die Expression, die in fötalem Gelenksknorpel beobachtet wurde. Das Diagramm veranschaulicht relative Expression, die bezogen auf Knorpel (gesundes erwachsenes, erkranktes und fötales Gewebe) und Meniskus sehr spezifisch ist. Die Menge an RNA, die pro Gewebeprobe verwendet wurde, betrug je nach Probe 6–50 ng. Alle Proben wurden bezogen auf beta-Actin normalisiert und in Bezug auf DNA153576-Expression in der Gelenksknorpelprobe von degenerativer Gelenkserkrankung (DJD) in Diagrammform dargestellt. Das Expressionsniveau von DNA153576 in der cDNA-Bibliothek 682-3 von fötalem Gelenksknorpel wurde aus der Kategorie "Knorpel" in 4 genommen und eingebunden, um relative Vergleiche zwischen den 4 und 5 zu ermöglichen.
6 zeigt eine erweiterte Logarithmusanalyse von 5, die ferner die Expression von DNA 153576 in Geweben des Gelenks, bezogen auf die Expression, die in fötalem Gelenksknorpel beobachtet wurde, veranschaulicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
1. Definitionen
Die Bezeichnungen "PRO21074-Polypeptid", "PRO21074-Protein" und "PRO21074", wenn hierin verwendet, umfassen Nativsequenz-PRO21074 und PRO21074-Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Das PRO21074-Polypeptid kann aus zahlreichen verschiedenen Quellen isoliert werden, wie beispielsweise aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder kann durch Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein "Nativsequenz-PRO21074" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie ein PRO21074, das aus der Natur abstammt. Solches Nativsequenz- PRO21074 kann aus der Natur isoliert werden oder kann durch Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung "Nativsequenz-PRO21074" umfasst insbesondere natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz einer extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende variable Formen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende Allelvarianten von PRO21074. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Nativsequenz-PRO21074 ein Nativsequenz-PRO21074 voller Länge, das die Aminosäuren 1 bis 1313 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Auch ist es denkbar und möglich, dass, obgleich das in 2 offenbarte PRO21074-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) mit dem Methioninrest, der hierin als Aminosäureposition 1 bezeichnet ist, beginnt, ein anderer Methioninrest, der entweder stromauf oder stromab von Aminosäureposition 1 in 2 (Seq.-ID Nr. 2) angeordnet ist, als Ausgangs-Aminosäurerest für das PRO21074-Polypeptid verwendet werden kann.
"PRO21074-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives PRO21074-Polypeptid, wie nachstehend definiert, mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von (a) den Resten 1 oder etwa 24 bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2) oder (b) X bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X für jeden beliebigen Aminosäurerest von 18 bis 28 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, oder (c) einem anderen, spezifisch abgeleiteten Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2). Solche PRO21074-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise PRO21074-Polypeptide, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste am N- und/oder C-Terminus sowie innerhalb einer oder mehrerer innerer Domänen der Sequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) zugesetzt oder deletiert ist/sind. Üblicherweise weist eine PRO21074-Polypeptidvariante zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest et wa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität und am meisten bevorzugt zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, mit (a) den Resten 1 oder etwa 24 bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), (b) X bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X für jeden beliebigen Aminosäurerest von 18 bis 28 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, oder (c) einem anderen, spezifisch abgeleiteten Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) auf. PRO21074-Polypeptidvarianten umfassen nicht die native PRO21074-Polypeptidsequenz. Üblicherweise weisen PRO21074-Polypeptidvarianten eine Länge von zumindest etwa 10 Aminosäuren, oft zumindest eine Länge von etwa 20 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 30 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 40 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 50 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 60 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 70 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 80 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 90 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 100 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 150 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 200 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 250 Aminosäuren, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 300 Aminosäuren oder mehr, auf.
"Prozent-(%)Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten PRO21074-Polypeptidsequenzen ist als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in einer PRO21074-Polypeptidsequenz nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, so fern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind. Abgleichen zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die innerhalb des Gebiets der Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN2- oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch werden % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Computerprogramms zum Sequenzvergleich ALIGN-2 wie nachstehend beschrieben ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 2 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der in Tabelle 2 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in Tabelle 2 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
Für die vorliegenden Zwecke wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in dieser Abgleichung des Programms von A und B als identische Übereinstimmungen verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiele für % Aminosäuresequenzidentität-Berechnungen zeigen Tabelle 1A und 1B, wie die % Aminosäuresequenzidentität der Aminosäuresequenz, die als "Vergleichsprotein" bezeichnet wird, zur Aminosäuresequenz, die als "PRO" bezeichnet wird, berechnet wird.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie oben beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentität kann jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nig.gov heruntergeladen werden oder ist sonst bei den National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA 20892, erhältlich. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch X/Y
worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die als identische Übereinstimmungen des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verständlich sein, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
"PRO21074-Polynucleotidvariante" oder "PRO21074-Nucleinsäuresequenzvariante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives PRO21074-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität mit (a) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Reste 1 oder etwa 24 bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, (b) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuren X bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X für jeden beliebigen Aminosäurerest von 18 bis 28 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, kodiert, oder (c) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein anderes, spezifisch abgeleitetes Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, aufweist. Üblicherweise hat eine PRO21074-Polynucleotidvariante zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäurese quenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität und alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität mit entweder (a) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Reste 1 oder etwa 24 bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, (b) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuren X bis 1313 des in 2 gezeigten PRO21074-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X für jeden beliebigen Aminosäurerest von 18 bis 28 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) steht, kodiert, oder (c) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein anderes, spezifisch abgeleitetes Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert. PRO21074-Polynucleotidvarianten umfassen nicht die native PRO21074-Nucleotidsequenz.
Üblicherweise weisen PRO21074-Polynucleotidvarianten eine Länge von zumindest etwa 30 Nucleotiden, oft zumindest eine Länge von zumindest etwa 60 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 90 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 120 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 150 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 180 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 210 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 240 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 270 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 300 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 450 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 600 Nucleotiden, noch häufiger eine Länge von zumindest etwa 900 Nucleotiden, oder mehr auf.
"Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf hierin identifizierte PRO21074-Polypeptid-kodierende Nucleinsäuresequenzen ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in einer für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nucleinsäuresequenz, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler Prozent-Sequenzidentität erforderlich, identisch sind. Abgleichung zum Zweck der Bestimmung von Prozent-Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die in den Bereich des Gebiets der Erfindung fallen, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können die geeigneten Parameter zur Messung von Sequenzabgleich festlegen, einschließlich jeglicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximalen Abgleich über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin jedoch werden % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramm ALIGN-2 wie nachstehend beschrieben ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 2 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech, Inc., entwickelt, und der in Tabelle 2 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der Tabelle 2 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.0D, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
Für die Zwecke hierin wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet;
100 mal den Bruch W/Z
worin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet sind, und worin Z die Gesamtzahl an Nucleotiden in D ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht der Länge von Nucleinsäuresequenz D entspricht, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist. Als Bei spiele für % Nucleinsäuresequenzidentitäts-Berechnungen zeigen die Tabellen 1C–D, wie die % Nucleinsäuresequenzidentität der Nucleinsäuresequenz, die als "Vergleichs-DNA" bezeichnet wird, zur Nucleinsäuresequenz, die als "PRO-DNA" bezeichnet ist, berechnet wird.
Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorangehenden Absatz beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erhalten.% Nucleinsäuresequenzidentität kann jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen werden oder ist sonst bei den National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA 20892, erhältlich. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
100 mal den Bruch W/Z
worin W für die Anzahl an Nucleotiden steht, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichprogramm NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet wurden, und worin Z für die Gesamtzahl an Nucleotiden in D steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäurese quenz C nicht gleich der Länge von Nucleinsäuresequenz D ist, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C entspricht.
In anderen Ausführungsformen sind PRO21074-Polynucleotidvarianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives PRO21074-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, sich, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen, an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für das in 2 gezeigte Volllängen-PRO21074-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) kodieren. PRO21074-Polypeptidvarianten können jene sein, für die eine PRO21074-Polynucleotidvariante kodiert.
"Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Assoziation mit jeglichen Komponenten, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad gereinigt, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO21074-Polypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül, das für PRO21074-Polypeptid kodiert, ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und aus zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für das PRO21074 kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Vorzugsweise ist das isolierte Nucleinsäuremolekül frei von Assoziation mit jeglichen Komponenten, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Ein isoliertes, für PRO-21074 kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor, als es in der Natur zu finden ist. Isolierte Nucleinsäuremoleküle werden daher vom für das PRO21074 kodierenden Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert, unterschieden. Ein für ein PRO21074-Polypeptid kodierendes isoliertes Nucleinsäuremolekül schließt jedoch für PRO21074 kodierende Nucleinsäuremoleküle ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise PRO21074 exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthe tischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Anti-PRO21074-Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierender Antikörper), Anti-PRO21074-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, einkettige Anti-PRO21074-Antikörper und Fragmente von Anti-PRO21074-Antikörpern ab (siehe unten). Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
"Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homogenität zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Stringente Bedingungen" oder "Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natrium chlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C, verwenden.
"Moderat stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen anzupassen.
Die Bezeichnung "epitopmarkiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein "Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO21074-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Immunoadhäsin" auf antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines "Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion zwischen einer Aminosäuresequenz mit der erwünschten Bindungsspezifität, die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d.h. "heterolog" ist), und einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Der Adhäsinteil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann aus einem Immunglobulin wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erhalten werden.
"Aktiv" oder "Aktivität" für die Zwecke hierin bezieht sich auf Formen) eines PRO21074-Polypeptids, das eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität von nativem oder natürlich auftretendem PRO21074 in sich trägt, worin sich "biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder inhibitorisch oder stimulatorisch) bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes PRO21074 verursacht wird und nicht die Fähigkeit ist, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO21074 aufgewiesen wird, und eine "immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden PRO21074 aufgewiesen wird. Bevorzugte biologische Aktivitäten können beispielsweise Regulation von Peptidabbau und Regulation der Bindung von Matrixproteinen umfassen.
Die Bezeichnung "Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines nativen, hierin offenbarten PRO21074-Polypeptids teilweise oder gänzlich blockiert, hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche Weise wird die Bezeichnung "Agonist" im weitesten Sinn verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten, nativen PRO21074-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen insbesondere Agonisten- oder Antagonistenantikörper oder Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO21074-Polypeptiden, Peptiden, kleinen organischen Molekülen usw. Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten eines PRO21074-Polypeptids können das Kontaktieren eines PRO21074-Polypeptids mit einem Kandidatenagonisten- oder -antagonistenmolekül und das Messen einer nachweisbaren Veränderung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten, die normalerweise mit dem PRO21074-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
"Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel die Prävention oder Verlangsamung (Abschwächung) des betreffenden pathologischen Leidens oder der Störung ist. Jene, die solch einer Behandlung bedürfen, schließen jene ein, die bereits erkrankt sind, als auch jene, die eine Neigung zeigen, diese Erkrankung zu erleiden, oder jene, in denen es die Erkrankung zu unterbinden gilt.
"Chronische" Verabreichung bezieht sich im Gegensatz zu einem akuten Modus auf die Verabreichung des Mittels/der Mittel auf kontinuierliche Weise, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über eine längere Zeitspanne aufrechtzuerhalten. "Diskontinuierliche" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht in Serie ohne Unterbrechung erfolgt, sondern eher auf zyklische Weise durchgeführt wird.
"Säugetier" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Mensch, Haus- und Nutztiere, Zoo-, Sport- und Haustiere, wie beispielsweise Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kaninchen usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Verabreichung "in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln schließt simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in jeder beliebigen Reihenfolge ein.
"Träger" wie hierin verwendet schließen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren ein, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, die/das ihnen ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulares Polypeptid (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEEN^TM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^TM.
"Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10), 1057–1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt "Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle und einem verbleibenden "Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
"Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen sind für Antikörperfragmente bekannt.
Die "leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa und lambda, basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
"Einkettige Fv"- oder "sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was dem sFv die Möglichkeit gibt, die erwünschte Struktur für Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick zum Thema sFv liefert Pluckthun in The Parmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269–315 (1994).
Die Bezeichnung "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) umfassen. Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
Ein "isolierter" Antikörper ist einer, der identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu einer Reinheit von über 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit von über 99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist.
Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein Antikörper, der sich "spezifisch an" ein bestimmtes Polypeptid oder ein Epitop an einem bestimmten Polypeptid "bindet" oder "dafür spezifisch ist", ist ein Antikörper, der sich an dieses bestimmte Polypeptid oder Epitop an einem bestimmten Polypeptid bindet, ohne sich an ein anderes Polypeptid oder Polypeptidepitop wesentlich zu binden.
Das Wort "Markierung", sofern hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen "markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Änderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die wiederum nachweisbar ist.
Unter "Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierzu gehören, schließen jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen, wie z.B. jene, die um US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
Ein "Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z.B. eines PRO21074-Polypeptids oder Antikörpers dazu) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Ein "kleines Molekül" ist hierin als ein Molekül definiert, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist.
Die Bezeichnung "Knorpelerkrankung" bezieht sich Knorpel, der zumindest ein pathologisches Leiden wie Stoffwechselstörung, erhöhten Matrix-Proteoglykanabbau und/oder reduzierte Proteoglykanmatrixsynthese aufweist, das infolge von Erkrankung oder Verletzung auftritt. In den Bereich der "Knorpelerkrankungen" fallen "degenerative Knorpelerkrankungen", eine Reihe von Erkrankungen, die zumindest teilweise durch die Degeneration oder durch Störungen im Stoffwechsel von Knorpelbindegeweben des Körpers gekennzeichnet sind, die nicht nur die Gelenke oder damit verwandte Strukturen, sondern auch Muskel, Bursae (Synovialmembran), Sehnen und Fasergewebe sowie die Epiphysenfuge umfassen. In einer Ausführungsform umfasst die Bezeichnung "Gelenksknorpelerkrankungen", die durch den Aufbruch der glatten Gelenksknorpeloberfläche und den Abbau der Knorpelmatrix gekennzeichnet sind. In einem Säugetier zeigen sich "Gelenksknorpelerkrankungen" ferner durch Symptome wie Schmerz, Steifigkeit und/oder Einschränkung der Bewegung von betroffenen Körperteilen.
In den Bereich von "Gelenksknorpelerkrankungen" fallen Osteoarthritis (OA) und rheumatoide Arthritis (RA). OA definiert nicht eine einzelne Erkrankung, sondern den endgültigen üblichen Vorgang von Gelenksabbau, der aus vielfachen Prozessen resultiert. OA ist durch örtlichen asymmetrischen Abbau von Knorpel gleichzeitig mit spürbaren Knochenvergrößerungen an den Rändern der Gelenke gekennzeichnet. OA befällt typischerweise die Articulationes interphalangeales manus, die ersten Articulationes carpometacarpales, die Hüften, das Knie, die Wirbelsäule und manche Gelenke im Mittelfuß, während große Gelenke, wie die Sprunggelenke, Ellbogen und Schultern, davon im Allgemeinen nicht betroffen sind. OA kann mit Stoffwechselerkrankungen wie Hämochromatose und Alkaptonurie, Anomalien in der Entwicklung wie Entwicklungsdysplasien der Hüften (kongenitale Hüftluxation), Unterschieden in den Beinlängen, einschließlich Traumata und entzündlichen Arthritisarten wie Gicht, septischer Arthritis und neuropathischer Arthritis, assoziiert sein. OA kann sich auch nach ausgedehnter biomechanischer Instabilität entwickeln, beispielsweise als Resultat von einer Sportverletzung oder von Adipositas.
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine systemische chronische Autoimmun-Entzündungserkrankung, gekennzeichnet durch symmetrische Synovitis der Gelenke, und befällt typischerweise kleine und große Diarthrosen gleichermaßen. im Verlauf von RA können die Symptome von RA Fieber, Gewichtsverlust, Ausdünnung der Haut, Einbindung mehrerer Organe, Skleritis, Hornhautgeschwüre, die Bildung von subkutanen oder subperiostealen Knötchen umfassen und sogar zu verfrühtem Tod führen. Die Symptome von RA treten häufig während der Jugend auf und können Vaskulitis, Atrophie der Haut und Muskeln, subkutane Knötchen, Lymphadenopathie, Splenomegalie, Leukopenie und chronische Anämie umfassen.
Darüber hinaus kann die Bezeichnung "degenerative Knorpelerkrankung" systemischen Lupus erythematodes und Gicht, Amyloidose oder Felty-Syndrom umfassen. Zusätzlich umfasst die Bezeichnung den Knorpelabbau und die Knorpelzerstörung, die mit Arthritis psoriatica, akuter Entzündung (z.B. Yersinia-Arthritis, Pyrophosphat-Arthritis, Gicht-Arthritis (Arthritis urica), septischer Arthritis) einhergehen, Arthritis in Verbindung mit Trauma, entzündliche Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa, Crohn-Krankheit, Enteritis regionalis, Ileitis distalis, Enteritis terminalis, Ileitis regionalis, Ileitis terminalis), multiple Sklerose, Diabetes (insulinabhängigen und nicht-insulinabhängigen Diabetes), Adipositas, Riesenzellarthritis und Sjögren-Syndrom.
Beispiele für andere Immun- und Entzündungserkrankungen, von denen zumindest manche durch die Verfahren der Erfindung behandelt werden können, umfassen juvenile chronische Arthritis, Spondylarthropathien, systemische Sklerose (Sklerodermie), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis), systemische Vaskulitis, Sarkoidose, autoimmune hämolytische Anämie (Immunpanzytopenie, paroxysmale nächtliche Hämogiobinurie), Autoimmunthrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpura, immunvermittelte Thrombozytopenie), Thyreoiditis (Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoiditis, atrophische Thyreoiditis), Autoimmun-Entzündungskrankheiten (z.B. Enzephalomye lltis allergica, multiple Sklerose, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Autoimmun-Uveoretinitis, Thyreotoxikose, Autoimmun-Schilddrüsenerkrankung, perniziöse Anämie, Autotransplantatabstoßung, Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankungen (Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis)), Entmarkungskrankheiten des zentralen und peripheren Nervensystems wie z.B. multiple Sklerose, idiopathische demyelinisierende Polyneuropathie oder Guillain-Barré-Syndrom und chronische inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie, hepatobiliäre Erkrankungen wie z.B. infektiöse Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht hepatotrope Viren), chronische aktive Autoimmunhepatitis, primäre biliäre Zirrhose, granulomatöse Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, glutensensitive Enteropathie und Whipple-Krankheit, Autoimmun- oder immunvermittelte Hautkrankheiten einschließlich bullösen Hautkrankheiten, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, Allergosen wie z.B. Asthma, Rhinitis allergica, atopische Dermatitis, Überempfindlichkeit gegen Nahrungsmittel und Urtikaria, immunologische Erkrankungen der Lunge wie z.B. eosinophile Pneumonien, idiopathische Lungenfibrose und hypersensitive Pneumonitis, mit Transplantationen zusammenhängende Erkrankungen einschließlich Transplantatabstoßung und Erkrankungen aufgrund von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen. Infektionserkrankungen einschließlich Viruserkrankungen wie AIDS (HIV-Infektion), Hepatitis, Herpes und dergleichen, Bakterieninfektionen, Pilzinfektionen, Protozoeninfektionen, Parasiteninfektionen und Respiratory-Syncytial-Virus, humanes Immunschwächevirus und dergleichen und Allergieerkrankungen wie anaphylaktische Überempfindlichkeiten, Asthma, Rhinitis allergica, Neurodermitis atopica, Conjunctivitis vernalis, Ekzem, Umikaria und Lebensmittelallergien und dergleichen.
"Behandlung" ist ein Eingriff, der mit der Absicht vorgenommen wird, die Entwicklung oder Veränderung der Pathologie einer Erkrankung zu unterbinden. Folglich bezieht sich "Behandlung" sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel die Prävention oder Verlangsamung des Fortschritts des betreffenden pathologischen Leidens oder der Störung oder Milderung des Ausmaßes dieses Leidens oder dieser Störung ist. Jene, die solch einer Behandlung bedürfen, schließen jene ein, die bereits erkrankt sind, als auch jene, in denen es die Erkrankung zu unterbinden gilt. Bei der Behandlung einer Knorpelerkrankung kann ein therapeutisches Mittel direkt das Reaktionsausmaß auf eine pathologische Komponente der Erkrankung reduzieren oder steigern oder die Erkrankung für andere therapeutische Mittel, z.b. Antibiotika, Antimykotika, entzündungshemmende Mittel, Chemotherapeutika und dergleichen, empfänglicher zu machen.
Die Bezeichnung "wirksame Menge" ist zumindest die minimale Konzentration an PRO21074 oder dem Antagonisten davon, die entweder eine nachweisbare Verbesserung oder Wiederherstellung an geschädigtem Knorpelgewebe auslöst, induziert oder dazu führt oder einen messbaren Schutz vor fortlaufendem oder induziertem Knorpelabbau (z.B. Retention von Proteoglykanen in der Matrix, Inhibierung von Proteoglykan-Freisetzung aus der Matrix, Stimulierung von Proteoglykan-Synthese) bietet. Alternativ dazu kann biologische Aktivität durch Messen der Wirkung von PRO21074 oder von Antagonisten davon auf Knorpelzellkultur und Vergleichen von Zell- und Gewebephysiologie (z.B. Zellwachstum, -überleben, -anhaftung, Matrixassemblierung und dergleichen) mit nicht behandelten Kontrollen quantifiziert werden. Weiters ist eine "therapeutisch wirksame Menge" zumindest die minimale Konzentration (Menge) an PRO21074 oder Antagonist davon, die einem Säugetier verabreicht wird, die zumindest zur Abschwächung eines pathologischen Symptoms wirksam ist (z.B. entweder eine nachweisbare Verbesserung oder Wiederherstellung an geschädigtem Gelenksknorpelgewebe auslöst, induziert oder dazu führt oder einen messbaren Schutz vor kontinuierlichem oder anfänglichem Knorpelabbau, eine Verbesserung der Bewegungsamplitude, eine Reduktion der Schmerzen und dergleichen auslöst, induziert oder dazu führt), das infolge einer Verletzung oder einer Knorpelerkrankung auftritt.
"Knorpelmittel" kann ein Wachstumsfaktor, Cytokin, kleines Molekül, Antikörper, Stück von RNA oder DNA, Viruspartikel, Peptid oder eine Chemikalie mit einer positiven Wirkung auf den Knorpel sein, umfassend Peptidwachstumsfaktoren, Katabolismus-Antagonisten, entzündungshemmende Faktoren und jene, die Knochen und/oder die Membrana synovialis beeinflussen. Alternativ dazu kann ein "Knorpel mittel" ein Peptidwachstumsfaktor, wie beispielsweise jeder beliebige der Fibroblastenwachstumsfaktoren (z.B. FGF-1, FGF-2, ..., FGF-21 usw.), IGFs (I und II), TGFβs (1-3), BMPs (1-7) oder Elemente der Epidermiswachstumsfaktoren-Familie wie EGF, HB-EGF, TGF-α, sein, der die intrinsische Wiederherstellungsfunktion von Knorpelgewebe, beispielsweise durch Veränderung von Proliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion oder Matrixproduktion durch Chondrozyten, fördern würde. Alternativ dazu kann ein "Knorpelmittel" ein Faktor sein, der den Katabolismus von Knorpel antagonisiert (z.B. IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra), NO-Inhibitoren, IL1-β-Convertase-(ICE-)Inhibitoren, Faktoren, die Aktivität von IL-6, IL-8, LIF, IFNγ, TNFα, Tetracyclinen und Varianten davon inhibieren, Inhibitoren von Apoptose, MMP-Inhibitoren, Aggrecanase-Inhibitoren, Inhibitoren von Serin- und Cystein-Proteinasen wie Cathepsinen und Urokinase- oder Gewebeplasminogenaktivator (uPA und tPA)). Wiederum alternativ dazu umfassen "Knorpelmittel" Faktoren, die auf Knorpel durch Beeinflussung des darunter liegenden Knochens (d.h. Osteofaktoren, z.B. Bisphosphonate, Osteoprotegerin) oder der umgebenden Membrana synovialis (d.h. Synovialfaktoren) indirekt wirken können, oder entzündungshemmende Faktoren (z.B. Anti-TNF-α, IL1ra, IL-4, IL-10, NSAIDs). Einen Überblick über Beispiele für Knorpelmittel gibt Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703 (1999); T. M. Hering, Front. Biosci. 4, d743–761 (1999).
"Herkömmliche chirurgische Verfahren" sind chirurgische Vorgehensweisen, die üblicherweise für therapeutische Manipulationen von Knorpel verwendet werden, umfassend: Knorpelabschaben, Abrasionschondroplastik, Laserreparatur, Wundexzision, Chondroplastik, Mikrofraktur mit oder ohne subchondrale(r) Knochenpenetration, Mosaikplastik, Knorpelzellen-Allotransplantate, Stammzellen-Autotransplantate, Rippenknorpeltransplantate, chemische Stimulierung, elektrische Stimulierung, Knorpelhaut-Autotransplantate, Knochenhaut-Autotransplantate, Knorpelgerüste, Hüll(osteoartikuläre) Autotransplantate oder Allotransplantate oder Osteotomie. Diese Verfahren werden in Frenkel et al., Front. Bioscience 4, d671-685 (1999), zusammengefasst und im Detail beschrieben.
"Chronische" Verabreichung bezieht sich auf die Verabreichung in kontinuierlicher Weise, im Gegensatz zum akuten Modus, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über einen längeren Zeitraum hinweg aufrechtzuerhalten. "Intermittierende" Verabreichung ist die Behandlung, die nicht kontinuierlich ohne Unterbrechung, sondern eher zyklisch erfolgt.
Die "Pathologie" einer Knorpelerkrankung umfasst jegliches physiologisches Phänomen, das den guten Gesundheitszustand des betroffenen Körperteils beeinträchtigt. Dies umfasst, ohne Einschränkung, Knorpelabbau, eingeschränkte Knorpelwiederherstellung, anormales) oder unkontrollierbares) Zellwachstum oder Zelldifferenzierung, Antikörperproduktion, Auto-Antikörperproduktion, Komplementproduktion und -aktivierung, Störung der normalen Funktion von benachbarten Zellen, Produktion von Cytokinen oder anderen Sekretionsprodukten in anormalen Konzentrationen, Suppression oder Aggravation jeglicher Entzündungs- oder Immunreaktion, Infiltration von Entzündungszellen (neutrophilen, eosinophilen, monozytischen, lymphozytischen) in Gewebezwischenräume, Auslösung von Schmerz oder jegliche Gewebewirkung, die zu einer Behinderung der Gelenksfunktion oder der Mobilität führt, und dergleichen.
"Biologische Aktivität" für den vorliegenden Zweck bezieht sich auf die Fähigkeit von PRO21074-Polypeptid oder Antagonisten davon, die Regeneration von Knorpel zu fördern und/oder den Abbau von Knorpel zu unterbinden. Gegebenenfalls ist der Knorpel Gelenksknorpel und die Regeneration und/oder der Abbau des Knorpels steht mit einer Verletzung oder einer Knorpelerkrankung in Verbindung. Biologische Aktivität kann beispielsweise durch Messen der Wirkung von PRO21074 auf Knorpelzellkultur und Vergleichen von Zell- und Gewebephysiologie (z.B. Zellwachstum, Überleben, Anhaftung, Matrixassemblierung und dergleichen) mit nicht behandelten Kontrollen quantifiziert werden. Alternativ dazu kann biologische Aktivität durch die Inhibierung von Proteoglykan-(PG-)Freisetzung aus Knorpel, die Steigerung von PG-Synthese in Knorpel, die Inhibierung der Produktion von Stickstoffoxid NO und dergleichen quantifiziert werden.
Das Verb "modulieren" bedeutet, die Reaktion eines Signalstoffstoffwechselweges zu beeinflussen (z.B. hinaufzuregulieren, herabzuregulieren oder in anderer Weise zu steuern). Zelluläre Prozesse unter der Steuerung von Signaltransduktion umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Transkription spezifischer Gene, normale Zellfunktionen wie Stoffwechsel, Proliferation, Differenzierung, Adhäsion, Apoptose und Überleben sowie anormale Prozesse wie Transformation, Entdifferenzierung und Metastasenbildung.
Die Bezeichnung "Zellen in und rund um Gelenke(n)" umfasst Zellen, die die Bildung, Wiederherstellung, Regeneration oder Unterstützung von Knorpelgewebe beeinflussen oder verursachen könnten oder dabei eine Rolle spielen könnten. Von diesem Begriff abgedeckt sind Chondrozyten, Synovialzellen, Fibroblasten, Zellen innerhalb von Sehnen oder Bändern, Osteoblasten oder Myoblasten.
Die Tabellen 1A–D zeigen hypothetische Beispiele für die Verwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens, um die % Aminosäuresequenzidentität (Tabellen 1A–B) und die % Nucleinsäuresequenzidentität (Tabellen 1C–D) unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramms zu bestimmen, worin "PRO" für die Aminosäuresequenz eines hypothetischen PRO21074-Polypeptids von Interesse steht, "Vergleichsprotein" für die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, mit dem das "PRO"-Polypeptid von Interesse verglichen wird, steht, "PRO-DNA" für eine hypothetische, für "PRO21074" kodierende Nucleinsäuresequenz von Interesse steht, "Vergleichs-DNA" für die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls steht, mit dem das "PRO-DNA"-Nucleinsäuremolekül von Interesse verglichen wird, "X", "Y" und "Z" jeweils für verschiedene hypothetische Aminosäurereste stehen und "N", "L" und "V" jeweils für verschiedene hypothetische Nucleotide stehen. Tabelle 1A

PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Länge = 15 Aminosäuren)

Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYY (Länge = 12 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität =
(die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) =
5 dividiert durch 15 = 33,3% Tabelle 1B

PRO XXXXXXXXXX (Länge = 10 Aminosäuren)

Vergleichsprotein XXXXXYYYYYYZZYZ (Länge = 15 Aminosäuren)

% Aminosäuresequenzidentität =
(die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) =
5 dividiert durch 10 = 50% Tabelle 1C

PRO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Länge = 14 Nucleotide)

Vergleichs-DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (Länge = 16 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität =
(die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) =
6 dividiert durch 14 = 42,9 Tabelle 1D

PRO-DNA NNNNNNNNNNNN (Länge = 12 Nucleotide)

Vergleichs-DNA NNNNLLLVV (Länge = 9 Nucleotide)

% Nucleinsäuresequenzidentität =
(die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) =
4 dividiert durch 12 = 33,3%
Tabelle 2 stellt den vollständigen Quellcode für das Computerprogramm ALIGN-2 für Sequenzvergleich bereit. Dieser Quellcode kann routinemäßig zur Verwendung an einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, um das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm bereitzustellen.
Tabelle 2
Tabelle 2 (Fortsetzung)
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II. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Osteoarthritis gegenüber rheumatoider Arthritis:
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine systemische, degenerative Autoimmunerkrankung, die Aufbrucherscheinungen in der Membrana synovialis sowohl der großen als auch der kleinen Diarthrosen gleichermaßen verursacht. Im Verlauf der Erkrankung können die Symptome von RA Fieber, Gewichtsverlust, Ausdünnung der Haut, Einbindung mehrerer Organe, Skleritis, Hornhautgeschwüre, die Bildung von subkutanen oder subperiostealen Knötchen umfassen und zu verfrühtem Tod führen. Im Gegensatz zu OA treten die Symptome von RA während der Jugend auf, extraartikuläre Manifestationen der Erkrankung können auf jegliches Organsystem übergreifen, und der Gelenksabbau ist symmetrisch und tritt sowohl in kleinen wie auch in großen Gelenken gleichermaßen auf. Extraartikuläre Symptome können Vaskulitis, Atrophie der Haut und Muskeln, subkutane Knötchen, Lymphadenopathie, Splenomegalie, Leukopenie und chronische Anämie umfassen. Weiters ist RA in seiner Natur heterogen, mit variabler Manifestation der Erkrankung, und ist bei 90% der Patienten mit der Bildung von Serumrheumafaktor assoziiert, die manchmal während des Verlaufs der Erkrankung auftritt.
Interessanterweise weisen Patienten mit RA auch ein hyperaktives Immunsystem auf. Der Großteil der Menschen mit RA haben eine genetisch bedingte Empfindlichkeit in Verbindung mit erhöhter Aktivierung von Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex-Molekülen an Monozyten und Makrophagen. Diese Histokompatibilitätskomplex-Moleküle sind in die Präsentation von Antigen an aktivierten T-Zellen, die Rezeptoren für diese Klasse-II-Moleküle tragen, eingebunden. Die genetische Prädisposition zu RA wird durch die Häufigkeit der hoch konservierten Leukozyten-Antigen-DR-Subtypen Dw4, Dw14 und Dw15 in menschlichen Patienten mit einer sehr schweren Erkrankung unterstützt.
Die aktivierten Monozyten und Makrophagen stimulieren in Wechselwirkung mit den geeigneten T-Zellen eine Reihe von Ereignissen, einschließlich weiterer Aktivierung zusätzlicher Monozyten und Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen und Endothelzellen. Mit der Hinaufregulierung von Adhäsionsmolekülen werden zusätzliche mononukleare Zellen und polymorphnukleare Zellen zum entzündeten Gelenk hin angezogen. Dieser Zustrom stimuliert Sekretion von zusätzlichen chemotaktischen Cytokinen, wodurch der Zustrom entzündungshemmender Zellen in die Membrana synovialis und die Synovialflüssigkeit gesteigert wird.
Osteoarthritis (OA) ist eine örtliche degenerative Erkrankung, die Gelenksknorpel und -knochen beeinträchtigt und zu Schmerzen und eingeschränkter Gelenksfunktion führt. OA kann in zwei Typen eingeteilt werden: primäre und sekundäre OA. Primäre OA bezieht sich auf das Spektrum degenerativer Gelenkserkrankungen, für die bisher keine zugrundeliegende Ätiologie bestimmt wurde. Typischerweise sind die Gelenke, die durch primäre OA beeinträchtigt werden, die Articulationes interphalangeales manus, die ersten Articulationes carpometacarpales, die Hüften, das Knie, die Wirbelsäule und manche Gelenke im Mittelfuß. Interessanterweise scheint es, dass große Gelenke, wie die Sprunggelenke, Ellbogen und Schultern, im Allgemeinen von primärer OA nicht betroffen sind. Dahingegen tritt sekundäre OA häufig als Resultat definierter Verletzungen oder Traumata auf. Sekundäre Arthritis kann auch in Personen mit Stoffwechselerkrankungen wie Hämochromatose und Alkaptonurie, Anomalien in der Entwicklung wie Entwicklungsdysplasien der Hüften (kongenitale Hüftluxation) und Unterschieden in den Beinlängen, Adipositas, entzündlichen Arthritisarten wie rheumatoider Arthritis oder Gicht, septischer Arthritis und neuropathischer Arthritis gefunden werden.
OA ist eine progressive degenerative Erkrankung. Der mit OA in Verbindung stehende Abbau tritt anfänglich als Faserung und Fibrillenbildung der Gelenksknorpeloberfläche auf, da Proteoglykane aus der Matrix verloren gehen. Bei kontinuierlicher Gelenksabnutzung schreitet die Oberflächenfibrillation fort, Mängel dringen tiefer in den Knorpel ein, und Teile des Knorpelgewebes gehen verloren. Darüber hinaus verdickt sich der unter dem Knorpel liegende Knochen (subchondrale Knochen), und der Knochen wird, da Knorpelgewebe abgebaut wird, langsam freigelegt. Bei asymmetrischem Knorpelabbau kann es zu Verunstaltungen kommen. Knochenknötchen, die als Osteophyten bezeichnet werden, bilden sich häufig an der Peripherie der Knorpeloberfläche und wachsen gelegentlich über die benachbarten erodierten Bereiche. Wird die Oberfläche dieser knöchernen Auswüchse durchdrungen, so kann es zu Gefäßauswuchs kommen und die Bildung von Gewebepfropfen, die Faserknorpel enthalten, verursachen.
Da Knorpelgewebe avaskulär ist, überlässt eine Schädigung, die an der Knorpelschicht auftritt, jedoch nicht zum subchondralen Knochen vordringt, die Arbeit zur Wiederherstellung den umliegenden Chondrozyten, die nur geringes, ihnen innewohnendes Potenzial zur Vermehrung haben. Wenn jedoch der subchondrale Knochen durchdrungen wird, ermöglicht seine Gefäßversorgung, dass ein dreiphasiger Reparaturprozess stattfindet. Der suboptimale Knorpel, der in Reaktion auf diese Art von Schädigung synthetisiert wird, hierin aufgrund seiner faserartigen Matrix als "Faserknorpel" bezeichnet, weist suboptimale biochemische und mechanische Eigenschaften auf und ist somit von weiterer Abnutzung und weiterem Abbau betroffen. In einem erkrankten oder geschädigten Gelenk führt erhöhte Freisetzung von Metalloproteinasen (MMPs) wie Collagenasen, Gelatinasen, Stromelysinen, Aggrecanasen und anderen Proteasen zu weiterer Ausdünnung und zum Schwund von Knorpelgewebe. In-vitro-Untersuchungen zeigten, dass Cytokine wie IL-1α, IL-1β, TNF-α, PDGF, GM-CSF, IFN-γ, TGF-β, LIF, IL-2, IL-6 und IL-8 die Aktivität von synovialen, Fibroblasten-ähnlichen Zellen, Makrophagen, T-Zellen und/oder Osteoklasten verändern können, und diese Cytokine können somit indirekte Wirkungen auf Knorpelmatrixumsetzung in vivo haben. Als solches könnte jegliches dieser Cytokine den zerstörenden Zyklus des Gelenkabbaus in vivo amplifizieren und immerwährend fortsetzen. Tatsächlich erwies sich die Inhibierung von IL-1- oder TNF-α-Aktivität in arthritischen Tieren und Menschen als eine wirksame Weise, den Fortschritt von Arthritis zumindest zu verlangsamen. Während sich die anfänglichen Manifestationen bei RA und OA eindeutig unterscheiden, scheint der darauf folgende Knorpel- und Knochenschwund in diesen zwei degenerativen Erkrankungen zahlreiche gleiche Cytokine und Proteinasen einzubinden.
Die mechanischen Eigenschaften von Knorpelgewebe sind durch seine biochemische Zusammensetzung festgelegt. Während der Collagenaufbau zur Zugfestigkeit und Steifigkeit von Knorpelgewebe beiträgt, ist die Verdichtbarkeit (oder Elastizität) auf seine Proteoglykankomponente zurückzuführen. In gesundem Gelenksknorpel ist vorwiegend Collagen vom Typ II vorhanden (umfassend etwa 90–95%), wobei jedoch kleinere Mengen an Collagen der Typen V, VI, IX und XI auch vorhanden sind. Knorpel-Proteoglykane (PG) umfassen hydrodynamisch große, aggregierende PG mit kovalent gebundenen, sulfatierten Glykosaminoglykanen sowie hydrodynamisch kleinere, nicht-aggregierende PG wie Decorin, Biglykan und Lumican.
Typen von Knorpelverletzungen
Knorpelverletzungen können drei Kategorien zugeteilt werden: (1) Mikroschädigung oder stumpfes Trauma, (2) chondrale Frakturen und (3) osteochondrale Frakturen.
Mikroschädigung an Chondrozyten und Knorpelmatrix kann durch eine einzelne Einwirkung, durch wiederholte stumpfe Traumata oder durch kontinuierliche Nutzung eines biomechanisch instabilen Gelenks verursacht werden. Tatsächlich können metabolische und biochemische Änderungen wie jene, die in den frühen Phasen von degenerativer Arthritis zu finden sind, in Tiermodellen durch wiederholte Belastung von Gelenksknorpel repliziert werden. Radin et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 131, 288–293 (1978). Solche Versuche zeigen, gemeinsam mit dem spezifischen Muster von Knorpelschwund, das in arthritischen Gelenken zu finden ist, die Rolle auf, die biomechanische Belastung beim Verlust von Homöostase und der Integrität von Gelenksknorpeln im Rahmen einer Erkrankung spielt. Radin et al., J. Orthop. Res. 2, 221–234 (1984); Radin et al., Semin. Arthritis Rheum. (Beilage 2) 21, 12–21 (1991); Wei et al., Acta Orthop. Scand. 69, 351–357 (1998). Während Chondrozyten anfänglich in der Lage sein können, Knorpelmatrix mit Proteoglykanen bei einer Grundrate aufzufüllen, kann gleichzeitige Schädigung des Collagennetzwerks die Schwundrate steigern und zu irreversiblem Abbau führen. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2, 192–201 (1994).
Chondrale Frakturen sind durch das Aufbrechen der Gelenksoberfläche ohne Verletzung der subchondralen Platte gekennzeichnet. Chondrozytennekrose an der Verletzungsstelle tritt ein, gefolgt von einer Steigerung der mitotischen und metabolischen Aktivität der überlebenden Chondrozyten, die die Verletzungsstelle umgeben, was zu einem Auskleiden der Risse der Gelenksoberfläche mit faserigem Gewebe führt. Die Steigerung der Chondrozytenaktivität ist vorübergehend, und die Wiederherstellungsreaktion führt zu unzureichender Menge und Qualität der neuen Matrixkomponenten.
Osteochondrale Frakturen, die schwerwiegendste Art dieser drei Verletzungstypen, sind Läsionen, die über die Grenzschicht hinweg in die darunter liegende, subchondrale Platte reichen. Bei diesem Typ von Verletzung ruft die Gegenwart subchondraler Vaskulatur die dreiphasige Reaktion hervor, die typischerweise in Leitgeweben zu finden ist: (1) Nekrose, (2) Entzündung und (3) Wiederherstellung. Anfänglich füllt sich die Läsion mit Blut und Blutgerinnseln. Das daraus entstehende Fibringerinnsel aktiviert eine Entzündungsreaktion und wird zu vaskularisiertem Reparaturgewebe, und die verschiedenen Zellkomponenten setzen Wachstumsfaktoren und Cytokine, umfassend transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β), aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF), Knochen-morphogenetische Proteine und insulinähnliche Wachstumsfaktoren I und II, frei. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2, 191–201 (1994).
Die anfängliche mit osteochondralen Frakturen assoziierte Reparaturreaktion ist durch Rekrutierung, Proliferation und Differenzierung von Vorläufern zu Chondrozyten gekennzeichnet. Mesenchymale Stammzellen sind im Fibrinnetzwerk angeordnet, das sich schließlich zu einem Faserknorpelbereich ausbildet. F. Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75, 532–553 (1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58, 230–233 (1976). Diese Stammzellen, von denen angenommen wird, dass sie aus dem darunter liegenden Knochenmark und nicht aus der umgebenden Gelenksoberfläche stammen, differenzieren sich schrittweise zu Chondrozyten. Sechs bis acht Wochen nach der Verletzung enthält das Reparaturgewebe Chondrozyten-ähnliche Zellen in einer Matrix aus Proteoglykanen und vorwiegend Typ-II-Collagen, mit einem gewissen Anteil an Typ-I-Collagen. T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62, 79–89 (1980); J. Cheung et al., Arthritis Rheum. 23, 211–219 (1980); S. O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8, 54–72 (1971). Diese neu abgelagerte Matrix wird jedoch abgebaut, und das Knorpelgewebe wird durch stärker faserartiges Gewebe und Faserknorpel ersetzt, und eine Verschiebung der Synthese von Collagen von Typ II zu Typ I findet statt. H. S. Cheung et al., J. Bone Joint Surg. 60, 1076–1081 (1978); D. Hamerman, "Prospects for medical intervention in cartilage repair", Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, J. F. Woessner et al. (Hrsg.) (1993); Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75, 532–553 (1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58, 230–233 (1976); S. O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8, 54–72 (1971). Frühe degenerative Veränderungen umfassen Oberflächenfibrillation, Verarmung an Proteoglykanen, Chondrozytenklonierung und -sterben und vertikale Rissbildung von, den oberflächlichen in tiefere Schichten. Ein Jahr nach der Verletzung ist das Reparaturgewebe ein Gemisch aus Faserknorpel und hyalinem Knorpel mit einer wesentlichen Mengen an Typ-I-Collagen, das in nennenswerten Mengen in normalem Gelenksknorpel nicht zu finden ist. T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62, 79–89 (1980).
Vom klinischen Standpunkt aus betrachtet kann das faserknorpelartige Reparaturgewebe über einen bestimmten Zeitraum hinweg zufriedenstellend funktionieren. Faserknorpel hat jedoch im Vergleich zu jenen Eigenschaften von normalem hyalinem Knorpel minderwertige biomechanische Eigenschaften. Collagenfasern sind im Faserknorpel in einer zufälligen Ausrichtung mit einem geringeren Elastizitätsmodul als im normalen hyalinen Knorpel angeordnet. J. Colletti et al., J. Bone Joint Surg. 54, 147–160 (1972). Die Permeabilität des Reparaturgewebes ist auch erhöht, was die Kapazität des Gewebes, Flüssigkeitsdruckbelastung standzuhalten, reduziert. H. Mankin et al., "Form and Function of Articular Cartilage", Orthopaedic Basic Science, Simon & Schuster (Hrsg.), American Academy of Orthopeadic Surgeons, Rosemont, IL (1994). Diese Veränderungen führen zu gesteigerter viskoelastischer Verformung, wodurch das Reparaturgewebe weniger in der Lage ist als normaler Gelenksknorpel, wiederholter Belastung standzuhalten. Es wurde berichtet, dass Glykosaminoglykan-(GAG-)Konzentrationen im Knorpel, der Stellen osteochondraler Verletzungen umgibt, bezogen auf die normalen Werte um 42% reduziert waren, was darauf hinweist, dass Verletzung zu Abbau über den anfänglichen Defekt hinaus führt. Osteoarthritis Cartilage 3, 61–70 (1995).
Chondrozytentransplantation und -überleben
Die Transplantation von Chondrozyten, jenen Zellen, die für die Sekretion von Knorpelmatrix verantwortlich sind, wurde auch als Mittel zur Erzielung von Knorpelwiederherstellung vorgeschlagen. Die Nachteile von Allotransplantaten, z.B. die Möglichkeit einer immunogenen Reaktion des Wirts sowie die Übertragung viraler und anderer Infektionskrankheiten, schränkten bisher jedoch den Bereich für allogene Chondrozytentransplantation stark ein. Auch wenn diese Risiken durch die Verwendung von patienteneigenem/n Gewebe oder Zellen minimiert werden können, erfordert dieses Verfahren weitere chirurgische Eingriffe, die Schaffung einer neuen Läsion im Knorpel des Patienten und teureres Kultivieren und Züchten von Patienten-spezifischen Zellen.
Werden isolierte Chondrozyten als Monolayer auf Gewebekulturplatten kultiviert, so differenzieren sie und werden im Laufe der Zeit in der Kultur Fibroblasten immer ähnlicher. Collagenproduktion beispielsweise verschiebt sich vom überwiegenden Typ II zum Typ I, und die Zellen synthetisieren einen höheren Anteil an Hyaluronsäure in Bezug auf den gesamten Glykosaminoglykan-(GAG-)Gehalt. W. Green, Clin. Orthop. Relat. Res. 124, 237–250 (1977). Chondrozyten, die in Collagengelen oder als Aggregatkulturen gezüchtet werden, erhalten jedoch normale Morphologie, Proteoglykan- und Typ-II-Collagensynthese aufrecht und behalten ihre Fähigkeit, metachromatische Matrix in vitro zu akkumulieren, bei. Somit bleiben unter diesen Bedingungen Chondrozyten über mehrere Wochen in vitro hinweg relativ undifferenziert und bezogen auf ihren Phänotyp stabil. T. Kimura et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 186, 231–239 (1984).
Gewebeverarbeitung:
Die Schwierigkeiten und Kosten, die mit dem Kultivieren von Chondrozyten einhergehen, führten dazu, mit Chondrozyten überimpfte oder zellfreie Implantate zur Gelenksknorpelreparatur unter Verwendung zahlreicher Biomaterialien, umfassend: entmineralisierten oder enzymatisch behandelten Knochen, L. Dahlberg et al., J. Orthop. Res. 9, 11–19 (1991); B. C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 41, 244–250 (1998); Polymilchsäure, C. R. Chu et al., J. Biomed. Mat. Res. 29, 1147–1154 (1995); Polyglykolsäure, C. A. Vacanti et al., Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252, 367–374 (1992); Hydroxyapatit/Dacron-Zusammensetzungen, K. Messner & J. Gillquist, Biomaterials 14, 513–521 (1993); Fibrin, D. A. Hendrickson et al., J. Orthop. Res. 12, 485–497 (1994); Collagengele, D. Grande et al., J. Orthop. Res. 7, 208–218 (1989); S. Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. 71, 74–80 (1989); S. Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. 76, 579–592 (1994); und Collagenfasern, J. M. Pachence et al., "Development of a tissue analog for cartilage repair", Tissue inducing biomaterials, L. Cima & B. Ron (Hrsg.), Materials Research Soc. Press, Pittsburgh, PA (1992); B. C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 31, 273–280 (1996), zu entwerfen. Alternative Gewebe, die auch verwendet werden, umfassen Synovialgewebe, A. G. Rothwell, Orthopedics 13, 433–442 (1990); oder Gewebe, die reich an mesenchymalen Stammzellen sind (z.B. Knochenmark oder Knochenhautgewebe), K. Messner & J. Gillquist, Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 252, 367–374 (1992).
Standardmäßige Knorpelchirurgieverfahren:
Das vorliegende Verfahren kann auch in Kombination mit jedem beliebigen Knorpelchirurgieverfahren verwendet werden. Herkömmliche chirurgische Verfahren sind chirurgische Verfahren, die üblicherweise für therapeutische Manipulationen von Knorpelgewebe verwendet werden, umfassend: Knorpelabschaben, Abrasionschondroplastik, Laserreparatur, Wundexzision, Chondroplastik, Mikrofraktur mit oder ohne subchondrale(r) Knochenpenetration, Mosaikplastik, Knorpelzellen-Allotransplantate, Stammzellen-Autotransplantate, Rippenknorpeltransplantate, chemische Stimulierung, elektrische Stimulierung, Knorpelhaut-Autotransplantate, Knochenhaut- Autotransplantate, Knorpelgerüste, Hüll-(osteoartikuläre)Autotransplantate oder Allotransplantate oder Osteotomie. Diese Verfahren werden im Detail in Frenkel et al., Front. Bioscience 4, d671–685 (1999), beschrieben und erörtert.
Knorpelmittel:
In Kombination mit oder anstelle der Gewebebearbeitung wurde die Verabreichung von Knorpelmittel (z.B. Peptidwachstumsfaktoren) als eine Möglichkeit betrachtet, Knorpelwiederherstellung zu steigern. Peptidwachstumsfaktoren sind sehr signifikante Regulatoren von Knorpelzelldifferenzierung, -migration, -adhäsion und -stoffwechsel. F. S. Chen et al., Am. J. Orthop. 26, 396–406 (1997). Da Knorpelmittel lösliche Proteine mit relativ geringer Molmasse sind und rasch absorbiert und/oder abgebaut werden, besteht eine große Herausforderung darin, sie in ausreichender Menge und ausreichend lange verfügbar zu machen. Sekretierte Proteine müssen somit möglicherweise für maximale Wirksamkeit in gefertigte, implantierbare Vorrichtungen inkorporiert werden. Das ideale Zufuhrvehikel ist biokompatibel, resorbierbar, weist die geeigneten mechanischen Eigenschaften auf und zersetzt sich in nicht-toxische Nebenprodukte.
Mehrere sekretierte Peptide weisen das Potenzial auf, Knorpelwiederherstellung im Wirt ohne Transplantation von Zellen zu induzieren. Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-1) stimuliert sowohl Matrixsynthese als auch Zellproliferation in Kultur, K. Osborn, J. Orthop. Res. 7, 35–42 (1989), und unzureichend vorhandenes IGF-1 kann eine ätiologische Rolle in der Entwicklung von Osteoarthritis spielen. R. D. Coutts et al., Amer. Acad. Orthop. Surg., Rosemont, IL, Instructional Course Lect. 47, 487–494 (1997). Manche Studien weisen darauf hin, dass Serum-IGF-1-Konzentrationen bei an Osteoarthritis erkrankten Patienten niedriger als in Kontrollgruppen sind, während andere Studien keinen Unterschied erkennen konnten. Nichtsdestoweniger sinken sowohl Serum-IGF-1-Konzentrationen als auch Chondrozyten-Reaktivität auf IGF-1 mit steigendem Alter. J. R. Florini & S. B. Roberts, J. Gerontol. 35, 23–30 (1980). Somit können sowohl die reduzierte Verfügbarkeit von IGF-1 als auch reduzierte Chondrozyten-Reaktivität auf IGF-1 zur Knorpel-Homöostase beitragen und mit steigendem Alter zu Gewebeabbau führen.
IGF-1 wurde zur Behandlung oder Prävention von Osteoarthritis vorgeschlagen. Tatsächlich führte intraartikuläre Verabreichung von IGF-1 in Kombination mit Natriumpentosanpolysulfat (einem Inhibitor von katabolischer Chondrozytenaktivität) zu verbessertem histologischem Auftreten und beinahe normalen Konzentrationen von abbauenden Enzymen (neutralen Metalloproteinasen und Collagenase), Gewebeinhibitoren von Metalloproteinase und Matrixcollagen. R. A. Rogachefsky et al., Ann. NY Acad. Sci. 732, 889–895 (1994). Die Verwendung von IGF-1 entweder alleine oder als Adjuvans mit anderen Wachstumsfaktoren zur Stimulierung von Knorpelregeneration wurde in der WO 91/19510, der WO 92/13565, der US 5.444.047 und der EP 434.652 beschrieben.
Knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) sind Elemente der großen Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGF-β) der Wachstumsfaktoren. In-vitro- und In-vivo-Studien zeigten, dass BMP die Differenzierung von mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten induziert. K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183, 180–187 (1984). Weiters zeigen Skelettwachstumsfaktor und von Knorpel abstammende Wachstumsfaktoren synergistische Wirkungen mit BMP, da die Kombination dieser Wachstumsfaktoren mit BMP und Wachstumshormon mesenchymale Zelldifferenzierung initiiert. Darauf folgende Proliferation der differenzierten Zellen wird durch andere Faktoren stimuliert. D. J. Hill & A. Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4, 45–68 (1992).
Transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β) wird von Osteoblasten, Chondrozyten, Blutplättchen, aktivierten Lymphozyten und anderen Zellen produziert. R. D. Coutts et al., s.o. TGF-β kann je nach Targetzelle, Dosierung und Zellkulturbedingungen sowohl stimulierende als auch inhibierende Eigenschaften auf Matrixsynthese und Zellproliferation aufweisen. P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158, 476–484 (1994); H. Van Beuningen et al., Ann. Rheum. Dis. 52, 185–191 (1993); P. Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51, 643–647 (1992). Darüber hinaus steigt wie bei IGF-1 die TGF-β-Reaktivität mit dem Alter. P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158, 476–484 (1994). Dennoch ist TGF-β ein potenterer Stimulator von Chondrozytenproliferation als andere Wachstumsfaktoren, einschließlich aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF), bFGF und IGF-1 (Guerne et al., s.o.), und kann Proteoglykanproduktion durch Chondrozyten stimulieren. TGF-β reguliert auch die Wirkungen von Cytokinen herab, die Chondrozyten-Katabolismus stimulieren. Van der Kraan et al., s.o. In vivo induziert TGF-β Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten und fördert die Wiederherstellung von Defekten in Kaninchen-Gelenksknorpeln, die einen Teil der Knorpeldicke beeinträchtigen. E. B. Hunziker & L. Rosenberg, Trans. Orthopaed. Res. Soc. 19, 236 (1994).
Antagonismus von Knorpelkatabolismus
Es wird angenommen, dass Knorpelmatrixabbau auf die Spaltung von Matrixmolekülen (Proteoglykanen und Collagenen) durch Proteasen zurückzuführen ist (siehe J. F. Woessner Jr., "Proteases of the extracellular matrix", in: V. Mow & A. Ratcliffe (Hrsg.): Structure and Function of Articular Cartilage; Boca Raton, FL, CRC Press (1994), und R. L. Smith, Front. In Biosci. 4, d704–712). Während die zentralen Enzyme, die in Matrixabbau eingebunden sind, bisher noch nicht eindeutig identifiziert wurden, scheinen Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und "Aggrecanasen" Schlüsselrollen im Gelenksabbau zu spielen. Darüber hinaus können auch Elemente der Serin- und Cystein-Familie von Proteasen (beispielsweise die Cathepsine und Urokinase- oder Gewebeplasminogenaktivator (uPA und tPA)) eingebunden sein. Plasmin, Urokinaseplasminogenaktivator (uPA) und Gewebeplasminogenaktivator (tPA) können eine wichtige Rolle im Aktivierungsstoffwechselweg der Metalloproteinasen spielen. Beweise stellen eine Verbindung zwischen der eng verwandten Gruppe von Cathepsin B, L und S mit Matrixabbau her, und diese Cathepsine sind bei OA etwas erhöht vorhanden. Zahlreiche Cytokine, einschließlich IL-1, TNF-α und LIF, induzieren MMP-Expression in Chondrozyten. Die Induktion von MMPs kann durch TGF-β antagonisiert werden und wird, zumindest bei Kaninchen, durch FGF und PDGF potenziert. Wie durch Studien an Tieren gezeigt wurde, können Inhibitoren dieser Proteasen (MMPs und Aggrecanasen) Gelenksgewebe zumindest teilweise vor Schädigung in vivo schützen.
Andere Verfahren zur Stimulation von Knorpelwiederherstellung umfassen das Biockieren der Wirkungen von Molekülen, die mit Knorpelabbau assoziiert sind. Beide IL-1(-α und -β) und Stickstoffoxid beispielsweise sind Substanzen mit bekannten katabolischen Wirkungen auf Knorpelgewebe. Das Cytokin IL-1 verursacht Knorpelabbau, einschließlich der Entstehung von synovialer Entzündung und Hinaufregulation von Matrix-Metalloproteinasen und -Aggrecanasen. V. Baragi et al., J. Clin. Invest. 96, 2454–2460 (1995); V. M. Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage 5, 275–282 (1997); C. H. Evans et al., J. Leukoc. Biol. 64, 55–61 (1998); C. H. Evans & P. D. Robbins, J. Rheumatol. 24, 2061–2063 (1997); R. Kang et al., Biochem. Soc. Trans. 25, 533–537 (1997); R. Kang et al., Osteoarthritis Cartilage 5, 139–143 (1997). Da hohe Konzentrationen an IL-1 in erkrankten Gelenken zu finden sind und von IL-1 angenommen wird, dass es eine wichtige Rolle bei der Auslösung und Entwicklung von Arthritis spielt, kann sich die Inhibierung von IL-1-Aktivität möglicherweise als eine erfolgreiche Therapie erweisen. In Säugetieren kann nur eine Protease, bezeichnet als Interleukin-1-β-Convertase (ICE), auf spezifische Weise reifes aktives IL-1β bilden. Es wurde gezeigt, dass Inhibierung von ICE IL-1β-Produktion blockiert und arthritischen Abbau verlangsamen kann (siehe J. Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703). Der lösliche IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra), ein natürlich vorkommendes Protein, das die Wirkungen von IL-1 durch Unterbinden von Wechselwirkung zwischen IL-1 und Chondrozyten inhibieren kann, erwies sich auch in Tiermodellen von Arthritis als wirksam und wird zur Zeit in Menschen auf seine Fähigkeit getestet, das Auftreten oder den Fortschritt von Arthritis zu unterbinden.
Stickstoffoxid (NO) wurde damit in Zusammenhang gebracht, beim Abbau von Knorpelgewebe eine wesentliche Rolle zu spielen. Attur et al., Arthritis & Rheum. 40, 1050–1053 (1997); Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10, 263–268 (1998). Anders als normaler Knorpel, der kein NO produziert, außer wenn er mit Cytokinen wie z.B. IL- 1α stimuliert wird, produziert Knorpel, der aus osteoarthritischen Gelenken abgenommen wird, große Mengen an Stickstoffoxid über 3 Tage hinweg in Kultur trotz Abwesenheit von zugesetzten Stimuli. Weiters wurde gezeigt, dass Inhibierung von NO-Produktion IL-1α-vermittelten Knorpelabbau und das Sterben von Chondrozyten sowie Fortschritt von Osteoarthritis in Tiermodellen unterbindet. Darüber hinaus setzen Gewebeexplantate aus solchen Patienten hohe Konzentrationen an Nitrit in Abwesenheit von Stimulation mit Cytokinen wie z.B. IL-1 frei. Amin et al., Cur. Opin. Rheum. 10, 263–268 (1998). Während bisher noch keine aufschlussreiche Bestimmung der positiven oder negativen Rolle von NO beim Fortschritt von Gelenksbestimmung erzielt wurde, kann die Inhibierung von NO die Wirkungen von IL-1α auf Matrixmetalloproteinase-Produktion, Aggrecan-Synthese und Lactatproduktion durch Chondrozyten abschwächen – somit kann Inhibierung von NO ein Weg sein, Knorpelabbau zu verhindern.
Wie IL-1α und -β wird TNF-α durch Chondrozyten synthetisiert, induziert Knorpelabbau, inhibiert Matrixsynthese und wird in hohen Konzentrationen in arthritischen Gelenken gefunden. TNF-α wirkt bezüglich Knorpelabbau auch mit IL-1 zusammen. Für Inhibierung von TNF-α-Aktivität in arthritischen Tieren und Menschen wurde gezeigt, dass sie den Fortschritt von Arthritis inhibiert.
Leukämie inhibierender Faktor (LIF), der sowohl von Knorpel als auch von der Membrana synovialis synthetisiert wird, ist in menschlichen Synovialflüssigkeiten vorhanden. Da LIF die Synthese von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) durch Chondrozyten induziert, kann er in den Abbau der Knorpelmatrix eingebunden sein.
Interferon-gamma (IFN-γ) inhibiert Proteoglykansynthese durch menschliche Chondrozyten, ohne seinen Abbau zu verstärken. Tatsächlich kann IFN-γ Proteoglykanverlust durch Inhibierung der Induktion von MMPs unterdrücken.
Interleukin 8, ein starkes chemotaktisches Cytokin für polymorphnukleare Neutrophile (PMN), wird von zahlreichen verschiedenen Zellen, einschließlich Monozy ten/Makrophagen, Chondrozyten und Fibroblasten, synthetisiert und wird durch TNF-α induziert. In OA-Patienten sind IL-1β, IL-6, TNF-α und IL-8 in der Synovialflüssigkeit zu finden. IL-8 kann die Freisetzung von Entzündungs-Cytokinen in menschlichen einkernigen Zellen fördern, einschließlich jener von IL-1β, IL-6 und TNF-α, die die Entzündungsreaktion weiter modulieren können (siehe J. Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703).
Für IL-6 wurde auch bereits vorgeschlagen, dass es am pathologischen Prozess von OA durch Steigern der Entzündungszellen im synovialen Gewebe und durch Stimulieren der Proliferation von Chondrozyten beteiligt ist. Darüber hinaus kann IL-6 die Wirkungen von IL-1 auf MMP-Synthese und Inhibierung von Proteoglykanproduktion amplifizieren (siehe J. Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703).
Interleukin 17 reguliert die Produktion von IL-1β, TNF-α, IL-6 und MMPs in menschlichen Makrophagen nach oben. IL-17 induziert auch NO-Produktion in Chondrozyten und wird in arthritischen, jedoch nicht in normalen, Gelenken exprimiert (siehe J. Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703).
Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), der von Chondrozyten synthetisiert wird, kann Gelenkschondrozyten-Replikation induzieren. B. C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res. 41, 244–250 (1998). In Explantaten, die jungen Tieren entnommen wurden, stimuliert bFGF in geringen Mengen (z.B. 3 ng/ml) die Synthese und inhibiert den Abbau von Proteoglykanen, während höhere Konzentrationen (z.B. 30–300 ng/ml) exakt die entgegengesetzte Wirkung zeigen (d.h. Syntheseinhibierung und verstärkten Abbau). In erwachsenen Geweben stimulierten höhere Dosierungen von FGF Proteoglykan-, Protein- und Collagensynthese ohne Zellproliferation. R. L. Sah et al., Arch. Biochem. Biophys. 308, 137–147 (1994). bFGF reguliert auch Knorpel-Homöostase durch Induktion der autokrinen Freisetzung von Interleukin 1 (IL-1), einem potenten Stimulator von katabolischem Verhalten in Knorpelgeweben, aus Chondrozyten. bFGF steigert weiters IL-1-vermittelte Proteasefreisetzung, vielleicht durch seine Fähigkeit, IL-1-Rezeptoren an Chondrozyten hinaufzuregulieren. J. E. Chin et al., Arthritis Rheum. 34, 314–324 (1991). In ähnlicher Weise kann aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF) die katabolischen Wirkungen von IL-1 und wahrscheinlich auch von TNF-α potenzieren. Manche Hinweise lassen jedoch darauf schließen, dass in menschlichem Knorpel bFGF und PDGF eine antikatabolische Wirkung haben können; ob dieses Phänomen speziesspezifisch oder eine Wirkung des steigenden Alters ist, bleibt noch aufzuklären.
Wenn auch die Entzündung nicht das auslösende Ereignis bei Osteoarthritis zu sein scheint, tritt Entzündung in osteoarthritischen Gelenken dennoch auf. Die Entzündungszellen (d.h. Monozyten, Makrophagen und Neutrophile), die nach der Verletzung und während der Entzündung in die Synovialauskleidung eindringen, produzieren Metalloproteinasen sowie katabolische Cytokine, die zu einer weiteren Freisetzung von abbauenden Enzymen beitragen können. Auch wenn Entzündungsphänomene und Gelenksabbau keine perfekte Korrelation in allen Tiermodellen von Arthritis aufzeigen, schränken Agenzien, die Entzündung hemmen, (wie z.B. IL-4, IL-13, IL-10) auch Knorpel- und Knochenkrankheitsbilder in arthritischen Tieren ein (siehe J. Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703). Die Anwendung von Agenzien, die Entzündungs-Cytokine inhibieren, können den Fortschritt von OA durch Entgegenwirken gegen die örtliche Synovitis, die in OA-Patienten auftritt, verlangsamen.
Zahlreiche Studien zeigen, dass Elemente der Tetracyclin-Familie von Antibiotika bei der Inhibierung von Collagenase- und Gelatinase-Aktivität wirksam sind. Es wurde erwiesen, dass orale Verabreichung von einem von diesen, Doxycyclin, zu einer Senkung von Collagenase- und Gelatinase-Aktivität in Knorpel aus einem Individuum mit Hüft-Osteoarthritis im Endstadium führte. Diese Daten lassen darauf schließen, dass eine wirksame orale Dosis an Doxycyclin den Fortschritt von Osteoarthritis verlangsamen kann. R. L. Smith, Front Biosci. 4, d704–712.
Das Krankheitsbild von OA bindet nicht nur den Abbau von Gelenksknorpel ein, was zur Eburneation von Knochen führt, sondern auch umfassendes Umformen von subchondralem Knochen, was zur sogenannten Sklerose von diesem Gewebe führt. Diese Knochenveränderungen gehen häufig mit der Bildung von subchondralen Zys ten infolge von fokaler Resorption einher. Agenzien, die Knochenresorption inhibieren, d.h. Osteoprotegerin oder Bisphosphonate, zeigten bereits vielversprechende Resultate in Tiermodellen von Arthritis und stellen daher gute Ansätze für die Behandlung von Knorpelerkrankungen dar. Kong et al., Nature 402, 304–308.
DNA153576 scheint insbesondere in Knorpel in großen Mengen exprimiert zu werden (4 & 5). Keine Expression von DNA153576 wurde in Bibliotheken nachgewiesen, die aus Milz, Herz, Thymus, Plazenta, Niere, Hoden, Uterus, Haut, Leber, Lunge, Speiseröhre, Schilddrüse hergestellt wurden (4), und auch nicht in RNA, die aus Dickdarm, Niere, Lunge, Dünndarm, Lymphknoten, Duodenum und Arterie genommen wurde (5).
Das Expressionsniveau von DNA 153576 in Knorpel ist jenem von Actin ähnlich, was darauf hinweist, dass das Gen hoch exprimiert wird. Darüber hinaus scheinen die Niveaus in erwachsenem Knorpelgewebe jenen in fötalem Knorpelgewebe ähnlich zu sein (5, 6), was darauf schließen lässt, dass dieses Molekül eine wichtige Rolle in der Biologie von Chondrozyten spielt. Interessanterweise wurden im Gegensatz zu Gelenksknorpel, der hyaliner Knorpel ist, etwa zehnfach niedrigere Expressionsniveaus im Meniskus gefunden, der aus Faserknorpel besteht (6). Darüber hinaus war Expression in normaler Membrana synovialis sogar noch geringer (10.000×) als in erkrankter Membrana synovialis, obwohl da bereits das Expressionsniveau sehr niedrig war (~100fach niedriger als in Knorpelgewebe) (6). Somit kann Hinaufregulierung von Expression von DNA153576 in der Membrana synovialis Teil des Erkrankungsprozesses in Gelenken sein.
Das Nativsequenz-PRO21074-Protein, für das DNA153576 kodiert, zeigt Sequenzhomologie zu Inter-alpha-Trypsininhibitor (ITI), einem Polypeptid, das sich an Hyaluronan (HA) zu binden scheint; ITI kann somit in die Assemblierung von der, und in die Adhäsion von Zellen an die, Knorpelmatrix eingebunden sein. Basierend auf seiner Homologie zu ITI spielt PRO21074 wahrscheinlich auch eine maßgebliche Rolle bei Chondrozytenanbindung und Knorpelmatrixassemblierung. Als solches ist Nativsequenz-PRO21074 wahrscheinlich als therapeutisches Mittel nützlich, um die Wie derherstellung von Knorpelgewebe zu stimulieren, insbesondere an der Grenzfläche zwischen "neuem" und "altem" Knorpel. Da die Matrix Signale zurück an die Chondrozyten aussenden kann, kann PRO21074 auch Chondrozytenproliferation und -differenzierung bewirken. Solche Aktivitäten wären auch für Knorpelwiederherstellung von Nutzen.
Angesichts des hohen Niveaus von Sequenzhomologie zwischen ITI und dem Protein, für das DNA153576 kodiert (Nativsequenz-PRO21074), erwarten die Erfinder, dass sich Nativsequenz-PRO21074 an Hyaluronan bindet und innerhalb der extrazellulären Matrix zurückgehalten wird. Da Arthritis durch Degeneration von Knorpelgewebe und Freisetzung von Knorpelmatrixmolekülen gekennzeichnet ist, können Veränderungen der Konzentrationen von Nativsequenz-PRO21074 oder Fragmenten davon (beispielsweise in der Synovialflüssigkeit, Plasma/Serum oder Urin) ein Hinweis auf einzelne Stadien der Gelenksdegeneration sein.
Wie in den vorhergehenden Absätzen erwähnt, ist die Gegenwart von Nativsequenz-PRO21074 (einschließlich Agonisten davon) wahrscheinlich in der Lage, die Wiederherstellung oder Regeneration von Knorpel zu unterstützen oder dafür therapeutisch zu sein. Es ist jedoch auch möglich, dass übermäßig hohe Mengen an Nativsequenz-PRO21074 oder Fragmenten davon (z.B. innerhalb des Gelenks oder in der Synovialflüssigkeit) ebenfalls abträglich wirken. In solch einer Situation würde der therapeutische Nutzen durch Verabreichung von Antagonisten von PRO21074 erzielt werden.
III. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
A. Volllängen-PRO21074-Polypeptid
Die vorliegende Erfindung stellt neu identifizierte und isolierte Nucleotidsequenzen bereit, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO21074 (oder auch als UNQ6369) bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für ein PRO21074-Polypeptid kodieren, identifiziert und isoliert, wie näher in den nachstehenden Beispiele offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurchgängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird. Zur einfachen und verständlichen Darstellung werden in der vorliegenden Beschreibung das Protein, für das DNA153576-2925 kodiert, sowie weitere native Homologe und Varianten, die in der obigen Definition von PRO21074 eingebunden sind, als "PRO21074" bezeichnet, und zwar unabhängig von ihrem Ursprung oder der Art der Herstellung.
Wie in den Beispielen nachstehend offenbart, wurden ein cDNA-Klon, der hierin als DNA153576-2925 bezeichnet wird, bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächliche Nucleotidsequenz dieses Klons kann von Fachleuten durch Sequenzieren des hinterlegten Klons mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für das hierin beschriebene PRO21074-Polypeptid und die kodierenden Nucleinsäuren konnten die Anmelder das identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er am besten mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation identifizierbar war.
Unter Verwendung des bereits oben erwähnten ALIGN-2-Sequenzabgleich-Computerprogramms wurde erkannt, dass das Nativsequenz-PRO21074 voller Länge (gezeigt in 2 und Seq.-ID Nr. 2) bestimmte Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus einem Teil von genomischer DNA (Dayhoff Nr. HS1409_1) aufweist. Dieser genomische Klon enthält jedoch nicht die vollständige Kodiersequenz von PRO21074. Folglich wird zur Zeit angenommen, dass das in der vorliegenden Anmeldung offenbarte PRO21074-Polypeptid ein neu identifiziertes Element der Inter-alpha-Trypsininhibitor-Proteinfamilie ist und eine oder mehrere biologische, enzymatische und/oder immunologische Aktivitäten oder Eigenschaften von Elementen dieser Proteinfamilie aufweist.
B. PRO21074-Varianten
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-PRO21074-Polypeptiden wird erwogen, dass PRO21074-Varianten hergestellt werden können. PRO21074-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die PRO21074-DNA und/oder durch Synthese des erwünschten PRO21074-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäurenänderungen posttranslationale Prozesse des PRO21074 verändern können, beispielsweise Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
Variationen im nativen Volllängen-Nativsequenz-PRO21074 oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO21074 können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das PRO21074 kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-PRO21074 zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO21074 führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit jeder anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO21074. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO21074 mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d.h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substituti onen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
PRO21074-Polypeptidfragmente werden hierin bereitgestellt. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können, beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine erwünschte biologische Aktivität des PRO21074-Polypeptids nicht essenziell sind.
PRO21074-Fragmente können durch jede beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Erwünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von PRO21074-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des erwünschten Fragments. Wiederum ein anderes, nützliches Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein erwünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die erwünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise teilen PRO21074-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem in 2 gezeigten nativen PRO21074-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2).
In besonderen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen in Tabelle 3 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden substanziellere Veränderungen, die in Tabelle 3 als "Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte gescreent.
Tabelle 3
Wesentliche Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des PRO21074-Polypeptids erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonforma tion, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen aufgeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Nicht-konservative Substitutionen erfordern den Austausch eine Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die PRO21074-DNA-Variante zu bilden.
Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren gemeinsam mit einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den beta-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante verändert [Cunningham & Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)]. Typischerweise wird Alanin ebenso bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters wird es häufig sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten, so kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
C. Modifikationen von PRO21074
Kovalente Modifikationen von PRO21074 sind in den Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen gerichteter Aminosäurereste eines PRO21074-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des PRO21074 zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, beispielsweise zum Vernetzen von PRO21074 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO21074-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des PRO21074-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylie rungsmusters des Polypeptids. "Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO21074 zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO21074 nicht zu finden sind. Darüber hinaus bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO21074-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von einem oder mehreren, oder die Substitution durch einen oder mehrere, Serin- oder Threoninreste(n) zum oder am Nativsequenz-PRO21074 (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO21074-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO21074-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO21074-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z.B. in der WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO21074-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al. in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation von PRO21074 umfasst das Binden des PRO21074-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinhältiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Das PRO21074 der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert werden, dass ein Hybridmolekül gebildet wird, das PRO21074, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion des PRO21074 mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO21074 platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen des PRO21074 kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass das PRO21074 leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion des PRO21074 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch als ein "Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion zur Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (deletierte oder inaktivierte Transmembrandomäne) eines PRO21074-Polypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für weitere Information zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130, ausgegeben am 27. Juni 1995.
D. Herstellung von PRO21074
Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von PRO21074 durch Kultivieren von Zellen, die mit einem PRO21074-Nucleinsäure-hältigen Vektor transformiert oder transfiziert sind, und die Reinigung des resultierenden Proteins. Natürlich wird erwogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von PRO21074 verwendet werden können. Beispielsweise kann die PRO21074-Sequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des PRO21074 können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO21074 zu bilden.
1. Isolation von für PRO21074 kodierender DNA
DNA, die für PRO21074 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die PRO21074-mRNA aufweist und diese auf einem nachweisbaren Niveau exprimiert. Folglich kann menschliche PRO21074-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen beschrieben ist. Das für PRO21074 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels bekannter synthetischer Verfahren (z.B. automatisierter Nucleinsäuresynthese) gewonnen werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das PRO21074 oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20–80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA- oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO21074 kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995))].
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z.B. von ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäuren oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin beschrieben bestimmt werden.
Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind, gewonnen werden.
2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO21074-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o., gefunden werden.
Verfahren zur eukaryotischen Zelltransfektion und prokaryotischen Zelltransformation sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl₂-Verfahren, CaPO₄-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.- coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41 P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher Wirtstamm für Fermentationen von Rekombinations-DNA-Produkten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um in den Genen, die für die zum Wirt endogenen Proteine kodieren, eine genetische Mutation zu bewirken, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7ilvG kan^r aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6. mit einer nicht Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO21074-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, niedereukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2), 737–742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basis Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5339–5363 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefe, die in der Lage ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den Gattungen von Hanseaula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem PRO21074 werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in den Bereich der Erfindung fällt.
3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO21074 kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO21074 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für PRO21074 kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertaseleader, Alpha-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der sekretierten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen, zuführen.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für PRO21074 kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für PRO21074 kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die operabel an die für PRO21074 kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)] wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
PRO21074-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, ei nem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Transkription einer DNA, die für das PRO21074 kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO21074-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltige Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO21074 kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese von PRO21074 in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
4. Detektion von Genamplifikation/-expression
Genamplifikation und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO21074-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an PRO21074-DNA und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierend, hergestellt werden.
5. Reinigung von Polypeptid
Formen von PRO21074 können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von PRO21074 verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
Es kann erwünscht sein, PRO21074 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO21074. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten PRO21074 ab.
E. Verwendung von PRO21074
Nucleotidsequenzen (oder ihr Komplement), die für PRO21074 kodieren, haben verschiedene Anwendungsbereiche auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, beim Chromosom- und Genkartieren und bei der Bildung von Antisense-RNA und -DNA. PRO21074-Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von PRO21074-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
Das Volllängen-Nativsequenz-PRO21074-Gen (Seq.-ID Nr. 1) oder Teile davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek zur Isolierung der Volllängen-PRO21074-cDNA oder zur Isolierung wiederum anderer cDNAs (beispielsweise jener, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO21074 oder für PRO21074 aus anderen Spezies kodieren), die eine erwünschte Sequenzidentität zur in 1 offenbarten PRO21074-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) aufweisen, verwendet werden. Gegebenenfalls beträgt die Länge der Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von zumindest teilweise neuen Regionen der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 abgeleitet sein, worin jene Regionen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden können, oder von genomischen Sequenzen einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Intronen von Nativsequenz-PRO21074. Ein Screening-Verfahren umfasst beispielsweise das Isolieren der Kodierregion oder der untranslatierten Region des PRO21074-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine selektierte Sonde mit etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können durch zahlreiche verschiedene Markierungen markiert werden, einschließlich Radionucleotide wie z.B. ³²P oder ³⁵S oder enzymatische Markierungen wie z.B. alkalische Phosphatase, gebunden an die Sonde über Avidin/Biotin-Bindungssysteme. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des PRO21074-Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können zum Screenen von Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet werden, um zu bestimmen, an welche Mitglieder solcher Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren sind in den nachstehenden Beispielen näher beschrieben.
Jede beliebige EST-Sequenz, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart ist, kann in ähnlicher Weise unter Einsatz der hierin offenbarten Verfahren als Sonde verwendet werden.
Andere nützliche Fragmente der PRO21074-Nucleinsäuren sind Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, umfassend eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA), die in der Lage sind, an Target-PRO21074-mRNA-(Sense) oder -PRO21074-DNA-(Antisense)Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Fragment der Kodierregion oder der untranslatierten Region von PRO21074-DNA. Solch ein Fragment umfasst im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nucleotide, vorzugsweise von etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder ein Sense-Oligonucleotid auf Grundlage einer cDNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein & Cohen (Cancer Res. 48, 2659 (1988)) und in van der Krol et al. (BioTechniques 6, 958 (1988)) beschrieben.
Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden an Target-Nucleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Duplices, die Transkription oder Translation der Targetsequenz durch ein oder mehrere Mittel blockieren, einschließlich gesteigerten Abbaus der Duplices, frühzeitiger Termination von Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel. Somit können die Antisense-Oligonucleotide verwendet werden, um Expression von PRO21074-Proteinen zu blockieren. Antisense- und Sense-Oligonucleotide umfassen weiters Oligonucleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder mit anderen Zuckerbindungen, wie jene, die in der WO 91/06629 beschrieben sind), worin solche Zuckerbindungen gegenüber endogenen Nucleasen resistent sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (d.h. sind in der Lage, gegen enzymatischen Abbau resistent zu sein), behalten jedoch Sequenzspezifität bei, um in der Lage zu sein, Target-Nucleotidsequenzen zu binden.
Andere Beispiele für Sense- oder Antisense-Oligonucleotide umfassen jene Oligonucleotide, die kovalent an organische Gruppierungen, wie jene, die in der WO 90/10048 beschrieben sind, und andere Gruppierungen, die Affinität des Oligonucleotids gegenüber einer Target-Nucleinsäuresequenz steigern, wie z.B. Poly-(L-Lysin), gebunden sind. Darüber hinaus können interkalierende Agenzien, wie z.B. Ellipticin, und alkylierende Mittel oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden werden, um Bindungsspezifitäten des Antisense- oder Sense-Oligonucleotids für die Target-Nucleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonucleotide können mittels jedes beliebigen Gentransferverfahrens in eine Zelle eingeführt werden, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, einschließlich beispielsweise CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation, oder unter Verwendung von Gentransfervektoren wie z.B. Epstein-Barr-Virus. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert. Eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, wird entweder in vivo oder ex vivo mit dem rekombinanten retroviralen Vektor kontaktiert. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, jene, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, aus N2 (ein Retrovirus, das aus M-MuLV abgeleitet ist) oder aus den Doppelkopievektoren, die als DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe die WO 90/13641), abgeleitet sind.
Sense- oder Antisense-Oligonucleotide können auch in eine Zelle, die die Target-Nucleotidsequenz enthält, durch Bildung eines Konjugats mit einem Ligandenbindungsmolekül wie in der WO 91/04753 beschrieben eingeführt werden. Geeignete Ligandenbindungsmoleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die sich an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise stört die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls, sich an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt von Sense- oder Antisense-Oligonucleotid oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
Alternativ dazu kann ein Sense- oder ein Antisense-Oligonucleotid in eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes wie in der WO 90/10448 beschrieben eingeführt werden. Der Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die Sonden können auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen zur Identifikation von nah verwandten PRO21074-Kodiersequenzen zu bilden.
Nucleotidsequenzen, die für ein PRO21074 kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden: zur Bestimmung von Expressionsstellen von DNA 153576 in Geweben (In-situ-Hybridisierung), zum Kartieren des Gens, das für das PRO21074 kodiert, und zur genetischen Analyse von Personen mit bestimmten Erkrankungen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screenen mit Bibliotheken, zu einem Chromosom und spezifischen Regionen eines Chromosoms kartiert werden.
Kodieren die Kodiersequenzen für PRO21074 für ein Protein, das sich an ein anderes Protein bindet (beispielsweise, wenn das PRO21074 ein Rezeptor ist), so kann das PRO21074 in Tests zur Identifikation der anderen Proteine oder Moleküle verwendet werden, die in die Bindungswechselwirkung involviert sind. Mittels solcher Verfahren können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen eingebunden sind, können auch verwendet werden, um auf Peptid oder niedermolekulare Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Das Rezeptor-PRO21074 kann auch verwendet werden, um korrelative(n) Liganden zu isolieren. Screening-Tests können entworfen werden, um Leitverbindungen zu finden, die die biologische Aktivität eines nativen PRO21074 oder eines Rezeptors für PRO21074 nachahmen. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die zu High-Throughput-Screening von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, was sie besonders geeignet zur Identifikation von niedermolekularen Wirkstoffkandidaten macht. In Betracht gezogene kleine Moleküle schließen synthetische organische oder anorganische Verbindungen ein. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemische Screening-Tests, Immuntests und zellbasierte Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
Nucleinsäuren, die für PRO21074 oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder "Knock-out"-Tiere zu bilden, die wiederum nützlich für die Entwicklung und das Screenen von therapeutisch nützlichen Reagenzien sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei dieses Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in einem pränatalen, z.B. einem embryonalen, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für PRO21074 kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für PRO21074 kodiert, gemäß bekannten Verfahren und die zur Bildung von transgenen Tieren verwendeten genomischen Sequenzen zu klonieren, wobei diese Tiere Zellen enthalten, welche DNA, die für PRO21074 kodiert, exprimieren. Verfahren zur Bildung von transgenen Tieren, insbesondere von Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits Routine und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würden bestimmte Zellen zur PRO21074-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen Enhancern als Target dienen. Transgene Tiere, die eine Kopie eines für PRO21074 kodierenden Transgens enthalten, das in die Keimlinie des Tieres in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Wirkung von gesteigerter Expression von für PRO21074 kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor beispielsweise pathologischen Leiden, die mit seiner Überexpression assoziiert sind, verleihen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und eine reduzierte Häufigkeit des pathologischen Leidens im Vergleich zu nicht behandelten Tieren, die das Transgen in sich tragen, würde auf eine mögliche therapeutische Wirkung bezüglich des pathologischen Leidens hinweisen.
Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von PRO21074 verwendet werden, um ein PRO21074-"Knock-out"-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für PRO21074 kodierendes Gen als ein Resultat homologer Rekombination zwischen dem endogenen, für PRO21074 kodierenden Gen und geänderter genomischer, für PRO21074 kodierender DNA, eingeführt in eine embryonale Stammzelle des Tiers, aufweist. Beispielsweise kann für PRO21074 kodierende cDNA verwendet werden, um für PRO21074 kodierende genomische DNA gemäß den bekannten Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen, für PRO21074 kodierenden DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie bei spielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen. Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) in den Vektor eingebunden [siehe z.B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden [siehe z.B. Bradley in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.) (IRL, Oxford, 1987), 113–152]. Ein Hybridembryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier implantiert und ausgetragen werden, um ein "Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann mittels Standardverfahren identifiziert werden und kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit, Abwehr gegen bestimmte pathologische Leiden aufzubauen, sowie aufgrund ihrer Entwicklung pathologischer Leiden wegen des fehlenden PRO21074-Polypeptids charakterisiert werden.
Nucleinsäure, die für die PRO21074-Polypeptide kodiert, kann auch bei Gentherapie eingesetzt werden. Bei Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produkts, beispielsweise zum Ersatz eines defekten Gens, zu erreichen. "Gentherapie" schließt sowohl herkömmliche Gentherapie ein, in der eine langanhaltende Wirkung durch eine einzelne Behandlung erreicht wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen Mitteln, die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Agenzien zum Blockieren der Expression bestimmter Gene in vivo verwendet werden. Es konnte bereits gezeigt werden, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen eingeführt werden können, wo sie trotz geringer intrazellulä rer Konzentrationen, die durch ihre eingeschränkte Aufnahme durch die Zellmembran verursacht wird, als Inhibitoren wirken (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu steigern, z.B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
Es gibt zahlreiche verschiedene Verfahren, die zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen verfügbar sind. Die Verfahren variieren je nachdem, ob die Nucleinsäure in vitro in kultivierte Zellen oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert werden. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Fällungsverfahren usw. Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransferverfahren umfassen Transfektion über virale (typischerweise retrovirale) Vektoren und virale Hüllprotein-Liposomen-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Targetzellen gerichtet ist, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder für die Targetzelle spezifisch ist, mit einem Liganden für einen Rezeptor auf der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z.B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren Internalisierung erfahren, oder Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisierung gerichtet sind und intrazelluläre Halbwertszeit verlängern. Das Verfahren zu Rezeptor-vermittelter Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987); und von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Ein Überblick zu Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften wird in Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992), geliefert.
Die hierin beschriebenen PRO21074-Polypeptide können auch als Molekulargewichtsmarker im Rahmen von Protein-Elektrophorese eingesetzt werden.
Die hierin beschriebenen, für die PRO21074-Polypeptide kodierenden Nucleinsäuremoleküle oder Fragmente davon sind zur Chromosomenidentifikation nützlich. In dieser Hinsicht besteht ein permanenter Bedarf daran, neue Chromosomenmarker zu identifizieren, da, basierend auf aktuellen Sequenzdaten, relativ wenig Chromosommarkierungs-Reagenzien bis heute erhältlich sind. Jedes PRO21074-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann als ein Chromosomenmarker verwendet werden.
Die PRO21074-Polypeptide und -Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können auch zur Gewebetypisierung verwendet werden, worin die PRO21074-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Gewebe differenziell im Vergleich zu einem anderen exprimiert werden können. PRO21074-Nucleinsäuremoleküle finden Verwendung bei der Herstellung von Sonden für PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse und Western-Analyse.
Die PRO21074-Polypeptide und -Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können auch in therapeutischen Anwendungen in Verbindung mit der Haut, z.B. Hauttransplantaten, Verbrennungen, Hautheilung, Narbenreduktion und dergleichen, nützlich sein. Die strukturelle Ähnlichkeit zwischen Knorpel und Haut sowie die Bedeutung der extrazellulären Matrix in der Zellbiologie von Haut lassen darauf schließen, dass die hierin offenbarten PRO21074-Polypeptide und -Nucleinsäuremoleküle möglicherweise auch Hautwiederherstellung hervorrufen oder dazu führen würden.
Die hierin beschriebenen PRO21074-Polypeptide können auch als therapeutische Mittel verwendet werden. Die PRO21074-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen formuliert werden, wobei das PRO21074-Produkt hiervon in einer Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Therapeutische Formulierungen werden zur Lagerung durch Vermischen des aktiven Bestandteils mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie beispielsweise Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder PEG.
Die zur In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung erreicht.
Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, gegeben.
Die Art der Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularern, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, topische Verabreichung oder mittels eines Retardsystems.
Dosierungen und erwünschte Wirkstoffkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können je nach bestimmter beabsichtigter Verwendung variieren. Die Festlegung der geeigneten Dosierung oder Art der Verab reichung fällt in den Wissensbereich eines gewöhnlichen Arztes. Tierexperimente liefern verlässliche Bezugswerte für die Bestimmung wirksamer Dosen zur Therapie von Menschen. Die Umrechnung von wirksamen Dosen zwischen verschiedenen Spezies kann gemäß den Prinzipien, die von J. Mordenti und W. Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York, 42–96 (1989), festgelegt wurden, erfolgen.
Wird In-vivo-Verabreichung eines PRO21074-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon verwendet, so können normale Dosierungsmengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise von etwa 1 μg/kg/Tag bis zu 10 mg/kg/Tag, je nach Art der Verabreichung variieren. Leitfäden zu den bestimmten Dosierungen und Verabreichungsverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344 oder 5.225.212. Es wird vorausgesetzt, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Erkrankungen wirksam sind, dass die Verabreichung, die beispielsweise für ein Organ oder Gewebe bestimmt ist, eine andere Art der Verabreichung erforderlich machen kann als die Verabreichung an ein anderes Organ oder Gewebe.
Ist Retard-Verabreichung eines PRO21074-Polypeptids in einer Formulierung mit Freisetzungseigenschaften erwünscht, die zur Behandlung jeder beliebigen Erkrankung oder jedes beliebigen Leidens geeignet sind, die oder das Verabreichung des PRO21074-Polypeptids erfordert, so wird Mikroeinkapselung des PRO21074-Polypeptids erwogen. Mikroeinkapselung von rekombinanten Proteinen für verzögerte Freisetzung wurde mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon-(rhIFN-), Interleukin-2 und MN rgp120 bereits erfolgreich durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell & Newman (Hrsg.), Plenum Press: New York, 439–462 (1995); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; und das US-Patent Nr. 5.654.010.
Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Poly-Milch-Co-Glykolsäure-(PLGA-)Polymer aufgrund seiner Biokompatibilität und seinen umfassenden biologisch abbaubaren Eigenschaften entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure, können im menschlichen Körper rasch entsorgt werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers je nach seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung von Monaten bis hin zu Jahren eingestellt werden. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: M. Chasin & R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, New York, 1–41 (1990).
Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das PRO21074-Polypeptid nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung des PRO21074-Polypeptids unterbinden (Antagonisten). Screeningtests für Antagonisten-Wirkstoffkandidaten werden entworfen, um Verbindungen zu identifizieren, die sich an die PRO21074-Polypeptide, für die die hierin identifizierten Gene kodieren, binden oder mit ihnen Komplexe bilden oder die sonst die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen stören. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für High-Throughput-Screenen von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, wodurch sie sich besonders gut zur Identifikation niedermolekularer Wirkstoffkandidaten eignen.
Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind.
Alle Tests für Antagonisten gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des Wirkstoffkandidaten mit einem PRO21074-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordert, um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
Bei Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte PRO21074-Polypeptid oder der Wirkstoffkandidat an einer festen Phase, z.B. einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des PRO21074-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende PRO21074-Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert werden kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente aufweist, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten z.B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise durch Verwendung eines markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
Zeigt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten PRO21074-Polypeptid, für das das hierin identifizierte Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet sich jedoch nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines auf Hefe basie renden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields & Mitarbeitern (Fields & Song, Nature (London) 340, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)), beschrieben wurde, wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991), offenbart. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die DNA-Bindungsdomäne und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert. Das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das "Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein zweites, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression von einem GAL1-lacZ-Reportergen unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, genau zu lokalisieren.
Verbindungen, die Wechselwirkungen eines Gens, das für ein hierin identifiziertes PRO21074-Polypeptid kodiert, und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten stören, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch, das das Produkt des Gens und der intra- oder extrazellulären Komponente enthält, unter solchen Bedingungen und über eine bestimmte Zeitspanne hinweg hergestellt, um Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte zu ermöglichen. Um die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente, die im Gemisch vorhanden sind, wird wie zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihres Reaktionspartners stört.
Um auf Antagonisten zu testen, kann das PRO21074-Polypeptid gemeinsam mit der auf eine bestimmte Aktivität zu screenenden Verbindung zu einer Zelle zugesetzt werden, und die Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität von Interesse in Gegenwart des PRO21074-Polypetpids zu hemmen, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist gegenüber dem PRO21074-Polypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren des PRO21074-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen PRO21074-Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen Konkurrenzhemmungstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das PRO21074-Polypeptid kann markiert werden, beispielsweise durch Radioaktivität, sodass die Anzahl an PRO21074-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bestimmen. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise durch Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1 (2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf ein PRO-Polypeptid reagiert, und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA hergestellt wird, in Pools aufgeteilt und verwendet wird, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die auf das PRO21074-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden markiertem PRO21074-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO21074-Polypetpid kann durch zahlreiche verschiedene Mittel markiert sein, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger autoradiographischer Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening- Verfahrens hergestellt und neu transfiziert, was schließlich einen einzelnen Klon ergibt, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
Als ein alternativer Ansatz für Rezeptoridentifikation kann markiertes PRO21074-Polypeptid mittels Photoaffinität mit Zellmembran oder mit Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, verbunden werden. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst, und ein Röntgenfilm wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzieren unterzogen werden. Die mittels Mikrosequenzierens gewonnene Aminosäuresequenz würde dann verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen und hierdurch das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
In einem anderen Test für Antagonisten werden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, das den Rezeptor exprimiert, mit markiertem PRO21074-Polypeptid in Gegenwart der Kandidatenverbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, kann dann gemessen werden.
Spezifischere Beispiele für potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an die Fusionen von Immunglobulin mit PRO21074-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper einschließlich, ohne dadurch eine Einschränkung darzustellen, poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmente, einkettiger Antikörper, anti-idiotypischer Antikörper und chimärer oder humanisierter Versionen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschliche(r) Antikörper und Antikörperfragmente. Alternativ dazu kann ein potentieller Antagonist ein nahe verwandtes Protein, beispielsweise eine mutierte Form des PRO21074-Polypeptids, das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht, sein und dabei die Wirkung des PRO21074-Polypeptids kompetitiv hemmen.
Ein anderer potenzieller PRO21074-Polypeptidantagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie, worin z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Proteintranslation direkt blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für die reifen PRO21074-Polypeptide hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch Transkription und die Produktion des PRO21074-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum PRO21074-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um Produktion des PRO21074-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle, z.B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
Potenzielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder eine andere relevante Bindungsstelle des PRO21074-Polypeptids binden, wodurch die normale biologische Aktivität des PRO21074-Polypeptids blockiert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nichtpeptidyl-Verbindungen.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z.B. Rossi, Current Biology 5, 469–471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Formation gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551, s.o.
Diese kleinen Moleküle können durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin erläutert werden, und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten bekannt ist, identifiziert werden. Basierend auf seiner Sequenzidentität mit anderen bekannten Polypeptiden umfassen potenzielle Verwendungen für das PRO21074-Polypeptid die Verwendung als ein Regulationsmittel bei Peptidabbau oder zur Regulation von Matrixproteinbindung.
F. Anti-PRO21074-Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-PRO21074-Antikörper bereit. Beispiele für solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper ein.
1. Polyklonale Antikörper
Die Anti-PRO21074-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern erwünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO21074-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Tier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
2. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO21074-Antikörper können alternativ zu polyklonalen Antikörpern monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirttier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, die sich spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO21074-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten des peripheren Bluts ("PBLs"), sofern Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbinden.
Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, die stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomliniert, die beispielsweise beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51–63 (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen PRO21074 gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden [Goding, s.o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörper kodieren) sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster- Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen [US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen Hybridantikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise umfasst ein Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
3. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO21074-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-)Antikörpern sind _Chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimal-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Akzeptorantikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Akzeptors durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donorantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Akzeptorantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen im besten Fall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeiter [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Folglich sind solche "humanisierten" Antikörper Hybridantikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)] hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86–95 (991)]. In ähnlicher Weise können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist, die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung, Anordnung und Antikörperrepertoire. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 und den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
4. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das PRO21074, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein(en) Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen bearbeitet werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehr kurze Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" von identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen der langen Aminosäureseitenketten durch kürzere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers im Vergleich zu unerwünschten Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren.
Bispezifische Antikörper können als Volllängenantikörper oder Antikörperfragmente (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischen Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur bereits beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin rekonvertiert und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikörper können als Mittel für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen F(ab')₂-Antikörper-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten, sowie an normale menschliche T-Zellen, und konnte die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets steigern.
Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolation bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden auch beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene "Diabody"-Technologie stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_H), die über einen Linker an eine variable Leichtkettendomäne (V_L) gebunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Folglich werden die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch eine andere Vorgehensweise zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente durch die Verwendung von einkettigen Fv-(sFv-)Dimeren wurde bereits beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Beispielhafte bispezifische Antikörper können sich an zwei verschiedene Epitope an einem gegebenen PRO21074-Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-PRO21074-Polypeptidarm mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten wie beispielsweise ein T-Zellrezeptormolekül (z.B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z.B. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), bindet, sodass zelluläre Abwehrmechanismen auf die Zelle fokussiert werden, die das bestimmte PRO21074-Polypeptid exprimiert. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel zu Zellen lokalisieren, die ein bestimmtes PRO21074-Polypeptid exprimieren. Diese Antikörper besitzen einen PRO21074-Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuclidchelatbildner bindet, wie z.B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das PRO21074-Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor (tissue factor, TF).
5. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [US-Patent Nr. 4.676.980] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
6. Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z.B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
7. Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d.h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAPS), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipirnidat-HCl), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026.
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen "Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
8. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19), 1484 (1989).
9. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern
Antikörper, die sich spezifisch an ein hierin identifiziertes PRO21074-Polypeptid binden, sowie andere Moleküle, die durch die zuvor offenbarten Screeningtests identifiziert wurden, können zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Ist das PRO21074-Polypeptid intrazellulär und werden ganze Antikörper als Inhibitoren verwendet, werden internalisierende Antikörper bevorzugt. Es können jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment in Zellen bereitzustellen. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als nur eine aktive Verbindung als für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion steigert, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel, Zytokin, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination vorhanden, und dies in Mengen, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, hergestellt beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation, z.B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Wirkstoffzufuhrsystemen (z.B. Liposome, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milch-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine längere Zeit im Körper, so können sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Stellt der Aggregationsmechanismus beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch dar, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsge halts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
G. Verwendungen für Anti-PRO21074-Antikörper
Die Anti-PRO21074-Antikörper der Erfindung haben verschiedene Einsatzbereiche. Beispielsweise können Anti-PRO21074-Antikörper in Diagnosetests für PRO21074, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben, Synovialflüssigkeit, Plasma/Serum oder Urin, verwendet werden. Beispielsweise kann das Niveau von PRO21074-Expression in Gelenksknorpel durch einen Anti-PRO21074-Antikörper als ein Marker für die Gegenwart und das Ausmaß einer Knorpelerkrankung verwendet werden. Verschiedene Diagnosetestverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, wie beispielsweise Konkurrenzbindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunfällungstests, die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147–158 (1987)]. Die in Diagnosetests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal abzugeben. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein. Jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Anti-PRO21074-Antikörper sind auch zur Affinitätsreinigung von PRO21074 aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen PRO21074 an einem geeigneten Träger, wie z.B. Sepha dexharz oder Filterpapier, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende PRO21074 enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe unter Ausnahme des PRO21074, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, der das PRO21074 vom Antikörper freisetzt.
H. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Dosierungen
Die PRO210-Polypeptide und -Antagonisten, die im Verfahren der Erfindung einsetzbar sind, können zur Behandlung von Knorpelerkrankungen in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Darüber hinaus können Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um das PRO21074-Polypeptid oder den PRO21074-Antagonisten zuzuführen.
Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibierungsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Basierend auf den Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers können beispielsweise Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, sich an die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren produziert werden (siehe Marasco et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993)).
Therapeutische Formulierungen werden für die Lagerung präpariert, indem das aktive Molekül mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen vermischt wird (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)). Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid; Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechol; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Cresol); niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zucker wie z.B. Saccharose, Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie beispielsweise Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Proteinkomplexe); und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Die zur In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Die Formulierung kann mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung steril gemacht werden. Die therapeutischen Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Stöpsel, der mit einer Injektionsnadel durchstochen werden kann, gegeben.
Die Formulierung hierin kann auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, wenn dies für die bestimmte behandelte Indikation notwendig ist, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die einander gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein zytotoxisches Mittel, Cytokin oder ein wachstumshemmendes Mittel enthalten. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den jeweiligen Zweck wirksam sind.
Die Art der Verabreichung entspricht bekannten und anerkannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, intraarte riellem, intraläsionalem oder intraartikulärem Weg, topische Verabreichung oder mittels eines Retard- oder Depotsystems. Gegebenenfalls wird die aktive Verbindung oder Formulierung direkt in die betroffene Knorpelregion oder das betroffene Gelenk injiziert.
Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung, z.B. Antikörper, werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß bekannten Verfahren, wie z.B. durch intravenöse Verabreichung in Form eines Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einem bestimmten Zeitraum hinweg, intramuskulär, intraperitoneal, intrazerebral, intrazerebrospinal, subkutan, intraartikulär, intrasynovial, intrathekal, intraokular, intraläsional, oral, topisch, über Inhalation oder mittels eines Retardsystems, verabreicht.
Dosierungen und erwünschte Wirkstoffkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können je nach bestimmter beabsichtigter Verwendung variieren. Die Festlegung der geeigneten Dosierung oder Art der Verabreichung fällt in den Wissensbereich eines gewöhnlichen Fachkundigen. Tierexperimente liefern verlässliche Bezugswerte für die Bestimmung wirksamer Dosen zur Behandlung von Menschen. Die Umrechnung von wirksamen Dosen zwischen verschiedenen Spezies kann gemäß den Prinzipien, die von J. Mordenti und W. Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York, 42–96 (1989), festgelegt wurden, erfolgen.
Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln eingeschlossen werden, die beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, wie beispielsweise Hydroyxmethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)mikrokapseln, in kolloidalen Arzneimittelverabreichungssystemen (z.B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das aktive Molekül enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retardmatrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milch-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Mikroeinkapselung rekombinanter Proteine für Retardfreisetzung wurde bereits erfolgreich mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon-(rhIFN-), Interleukin-2 und MN rpg 120 durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell & Newman (Hrsg.), Plenum Press: New York, 439–462 (1995); WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; und US-Patent Nr. 5.654.010.
Die Retardformulierungen dieser Proteine können unter Verwendung von Poly-Milch-Co-Glyclolsäure-(PLGA-)Polymer aufgrund seiner Biokompatibilität und des umfassenden Bereichs seiner Eigenschaften biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure, werden rasch aus dem menschlichen Körper ausgeschieden. Außerdem kann die Abbaubarkeit dieses Polymers je nach Molekulargewicht und Zusammensetzung auf Monate bis Jahre eingestellt werden. Lewis, „Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Polymer", in: Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems, S. 1–41, M. Chasin und R. Langeer (Hrsg.), Marcel Dekker: New York (1991).
Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über mehr als 100 Tage hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine innerhalb von kürzeren Zeiträumen frei. Wenn eingekapselte An tikörper längere Zeit im Körper verbleiben, können sie als Ergebnis der Einwirkung von Feuchtigkeit bei 37°C denaturiert werden oder aggregieren, was zum Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Änderungen der Immunogenität führt. Vernünftige Strategien zur Stabilisierung können in Abhängigkeit vom involvierten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn sich beispielsweise zeigt, dass der Aggregationsmechanismus die Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thiodisulfidaustausch darstellt, kann eine Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Gefriertrocknen aus sauren Lösungen, Regeln des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erreicht werden.
Wird In-vivo-Verabreichung des PRO21074 oder der PRO21074-Antagonisten verwendet, so können normale Dosierungsmengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise von etwa 1 mg/kg/Tag bis zu 10 mg/kg/Tag, je nach Art der Verabreichung variieren. Leitfäden zu den bestimmten Dosierungen und Verabreichungsverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344 oder 5.225.212. Es liegt im Schutzumfang der Erfindung, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungen und verschiedene Erkrankungen wirksam sind und dass die Verabreichung, die zur Behandlung eines spezifischen Organs oder Gewebes bestimmt ist, eine andere Art der Verabreichung erforderlich machen kann als die Verabreichung an ein anderes Organ oder Gewebe. Darüber hinaus können Dosierungen mit einer oder mehreren separaten Verabreichungen oder mittels kontinuierlicher Infusion zugeführt werden. Im Fall von wiederholten Verabreichungen über mehrere Tage hinweg oder auch länger wird, je nach behandeltem Leiden, die Behandlung fortgesetzt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Erkrankungssymptome eintritt. Es können jedoch auch andere Dosierungspläne geeignet sein. Der Verlauf dieser Therapie kann mittels herkömmlicher Verfahren und Tests leicht beobachtet werden.
I. Behandlungsverfahren
Zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen hängt die geeignete Dosierung eines Wirkstoffs von der Art der zu behandelnden Erkrankung, wie zuvor definiert, dem Ausmaß und dem Verlauf der Erkrankung, davon, ob das Mittel zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von vorhergehenden Therapien, von der Anamnese des Patienten und seiner Reaktion auf das Mittel und dem Ermessen des behandelnden Arztes ab. Das Mittel wird dem Patienten geeigneterweise einmalig oder im Laufe mehrerer Behandlungen verabreicht.
Es wird erwogen, dass die Polypeptide, Antikörper und anderen aktiven Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung verschiedener Knorpelerkrankungen eingesetzt werden können. Beispiele für Krankheiten oder Leiden, die mit den Polypeptiden der Erfindung behandelt werden sollen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, juvenile chronische Arthritis, Osteoarthritis, Spondylarthropathien, systemische Sklerose (Sklerodermie), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis, Polymyositis), Sjögren-Syndrom, systemische Vaskulitis, Sarkoidose, autoimmune hämolytische Anämie (Immunpanzytopenie, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie), Autoimmunthrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpura, immunvermittelte Thrombozytopenie), Thyreoiditis (Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoiditis, atrophische Thyreoiditis), Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankungen (Glomerulonephritis, tubulointerstitielle Nephritis), Entmarkungskrankheiten des zentralen und peripheren Nervensystems wie z.B. multiple Sklerose, idiopathische demyelinisierende Polyneuropathie oder Guillain-Barre-Syndrom und chronische inflammatorisch demyelinisierende Polyneuropathie, hepatobiliäre Erkrankungen wie z.B. infektiöse Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht hepatotrope Viren), chronische aktive Autoimmunhepatitis, primäre biliäre Zirrhose, granulomatöse Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa, Crohn-Krankheit), glutensensitive Enteropathie und Whipple-Krankheit, Autoimmun- oder immunvermittelte Hautkrankheiten einschließlich bullösen Hautkrankheiten, Erythema multiforme und Kontakt dermatitis, Psoriasis, Allergosen wie z.B. Asthma, Rhinitis allergica, atopische Dermatitis, Überempfindlichkeit gegen Nahrungsmittel und Urtikaria, immunologische Erkrankungen der Lunge wie z.B. eosinophile Pneumonien, idiopathische Lungenfibrose und hypersensitive Pneumonitis, mit Transplantationen zusammenhängende Erkrankungen einschließlich Transplantatabstoßung und Erkrankungen aufgrund von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen.
Bei systemischem Lupus erythematodes ist die wichtigste Krankheitsursache die Produktion von Autoantikörpern gegen Eigenproteine/-gewebe und die darauf folgende Entstehung einer immunvermittelten Entzündung. Diese Antikörper führen entweder direkt oder indirekt zu Gewebeverletzungen. Obwohl sich T-Lymphozyten nicht als direkt an Gewebeschädigung beteiligt herausstellten, sind T-Lymphozyten für die Entwicklung von Autoantikörpern erforderlich. Die Entstehung der Erkrankung ist somit von T-Lymphozyten abhängig. Mehrere Organe und Systeme sind dabei klinisch betroffen, einschließlich der Niere, der Lunge, des Bewegungsapparats, des mukokutanen Systems, der Augen, des Zentralnervensystems, des Kreislaufs, des Gastrointestinaltrakts, des Knochenmarks und des Bluts.
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische systemische entzündliche Autoimmunerkrankung, welche die Membrana synovialis mehrerer Gelenke betrifft und zu einer Schädigung des Gelenksknorpels führt. Die Pathogenese hängt von T-Lymphozyten ab und hängt mit der Produktion von rheumatoiden Faktoren, Autoantikörpern gegen endogene Proteine, zusammen und resultiert in der Entstehung von Immunkomplexen, die hohe Werte an Gelenksflüssigkeit und Blut aufweisen. Diese Komplexe können eine Infiltration durch Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile in das Synovialkompartiment induzieren. Betroffene Gewebe sind vor allem die Gelenke, häufig in einem symmetrischen Muster. Erkrankungen außerhalb der Gelenke treten jedoch in zwei Hauptformen auf. In einer Form sind typische Läsionen Lungenfibrose, Vaskulitis und Hautgeschwüre. Die zweite Form ist das so genannte Felty-Syndrom, das spät im Verlauf der RA-Erkrankung auftritt, manchmal nachdem sich die Gelenke beruhigt haben, und die Gegenwart von Neutropenie, Thrombozytopenie und Splenomegalie umfasst. Dies kann durch Vaskulitis in mehreren Organen und das Auftreten von Infarkten, Hautgeschwüren und Gangränen begleitet sein. Patienten entwickeln außerdem oft Rheumaknoten in Unterhautgewebe, das über betroffenen Gelenken liegt; in späteren Phasen können die Knoten Nekrosezentren aufweisen, die von einem gemischten entzündlichen zellulären Infiltrat umgeben sind. Andere Manifestationen, die bei RA auftreten können, umfassen: Perikarditis, Pleuritis, Koronararteriitis, interstitielle Pneumonie mit Lungenfibrose, Keratoconjunctivitis sicca und Rheumaknoten.
Juvenile chronische Arthritis ist eine chronische idiopathische Entzündungskranhkeit, die oft unter einem Alter von 16 Jahren auftritt und Ähnlichkeiten zur RA aufweist. Manche Patienten mit einem positiven Rheumafaktor werden als juvenile chronische Arthritis klassifiziert. Die Krankheit wird in drei Hauptgruppen unterteilt: pauciartikulär, polyartikulär und systemisch. Die Arthritis kann schwer sein und zu Gelenksankylose und einer Verzögerung des Wachstums führen. Andere Manifestationen können chronische anteriore Uveitis und systemische Amyloidose umfassen.
Spondylarthropathien sind eine Gruppe von Leiden mit einigen gemeinsamen klinischen Merkmalen und dem gemeinsamen Zusammenhang mit der Expression eines HLA-B27-Genprodukts. Diese Leiden umfassen: Spondylitis ankylosans, Reiter-Syndrom (reaktive Arthritis), Arthritis im Zusammenhang mit entzündlichen Darmerkrankungen, Spondylitis im Zusammenhang mit Psoriasis, im Jugendalter ausbrechende Spondylarthropathie und undifferenzierte Spondylarthropathie. Unterscheidende Merkmale umfassen Sakroileitis mit oder ohne Spondylitis; entzündliche asymmetrische Arthritis; Assoziation mit HLA-B27 (einem serologisch definierten Allel des HLA-B-Locus eines Klasse-I-MHC); Augenentzündungen und die Abwesenheit von Autoantikörper im Zusammenhang mit einer anderen rheumatoiden Erkrankung. Die Zelle, die am wahrscheinlichsten den Schlüssel zur Induktion dieser Krankheit darstellt, ist der CD8+-T-Lymphozyt, eine Zelle, dessen Ziel ein durch Klasse-I-MHC-Moleküle präsentiertes Antigen ist. CD8+-T-Zellen können gegen das Klasse-I-MHC-Allel HLS-B27 reagieren, als ob es ein fremdes Peptid wäre, das durch MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert wird. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Epitop von HLA-B27 ein bakterielles oder mikrobielles antigenes Epitop nachahmen und so eine CD8+-T-Zellenreaktion auslösen kann.
Systemische Sklerose (Sklerodermie) besitzt eine unbekannte Ätiologie. Ein Kennzeichen dieser Krankheit ist eine Induration der Haut, die wahrscheinlich durch einen aktiven Entzündungsvorgang induziert wird. Sklerodermie kann lokal oder systemisch auftreten. Gefäßläsionen sind recht häufig, und eine Endothelzellenschädigung im Mikrogefäßsystem ist ein früher und bedeutender Vorgang in der Entwicklung von systemischer Sklerose. Eine immunologische Basis wird durch die Gegenwart von mononuklearen Zellinfiltraten in den Hautläsionen und die Gegenwart von antinukleären Antikörper in vielen Patienten impliziert. ICAM-1 wird oft auf der Zelloberfläche von Fibroblasten in Hautläsionen hochreguliert, was vermuten lässt, dass eine T-Zellen-Wechselwirkung mit diesen Zellen eine Rolle in der Pathogenese der Krankheit spielen könnte. Andere Organe können ebenfalls involviert sein. Im Gastrointestinaltrakt kann eine Atrophie und Fibrose der glatten Muskulatur zu anomaler Peristaltik/Motilität führen. In der Niere kann eine konzentrische subendotheliale Intimalproliferation, welche die kleinen Arteriae arcuatae und die Arteriae interlobares betrifft, zu einem reduzierten kortikalen Blutfluss und somit zu Proteinurie, Azotemie und Hypertension führen. In Skelett- und Herzmuskeln können Atrophie, interstitielle Fibrose/Verschwartung und Nekrose auftreten. Und schließlich kann die Lunge an interstitieller Pneumonie und interstitieller Fibrose leiden.
Idiopathische entzündliche Myopathien einschließlich Dermatomyositis, Polymyositis und anderen Formen sind chronische Muskelentzündungen mit unbekannter Ätiologie, die zur Muskelschwäche führen. Muskelschäden/-entzündungen sind oft symmetrischer und progressiver Natur. Autoantikörper hängen mit den meisten Formen zusammen. Diese Myositis-spezifischen Autoantikörper sind gegen die Funktion von an Proteinsynthese beteiligten Komponenten gerichtet und hemmen diese.
Das Sjögren-Syndrom ist das Ergebnis einer immunvermittelten Entzündung und darauf folgenden funktionellen Zerstörung der Tränendrüsen und Speicheldrüsen. Die Krankheit kann mit entzündlichen Bindegewebeerkrankungen verbunden sein oder von solchen begleitet werden. Außerdem ist die Erkrankung mit der Produktion von Autoantikörpern gegen Ro- und La-Antigene verbunden, die beide kleine RNA-Proteinkomplexe sind. Läsionen führen zu Keratoconjunctivitis sicca und Xerostomie, und weitere Manifestationen oder Assoziationen umfassen biliäre Zirrhose, periphere oder sensorische Neuropathie und erfastbare Purpura.
Systemische Vaskulitis umfasst Krankheiten, bei denen die primäre Läsion eine Entzündung ist, auf die eine Schädigung der Blutgefäße folgt, welche zu Ischämie/Nekrose/Degeneration von Geweben führt, die von den betroffenen Gefäßen versorgt werden, und in manchen Fällen schließlich zur Dysfunktion der Muskelendplatte. Vaskulitis kann auch als sekundäre Läsion oder Folgeerschiendung anderer entzündlicher immunvermittelter Krankheiten, wie z.B. rheumatoider Arthritis, systemischer Sklerose usw., auftreten, vor allem bei Krankheiten, die auch mit der Bildung von Immunkomplexen verbunden sind. Erkrankungen der Gruppe der primären systemischen Vaskulitis umfassen: systemische nekrotisierende Vaskulitis: Polyarteriitis nodosa, allergische Angiitis und Granulomatose, Polyangiitis; Wegener-Klinger-Granulomatose; lymphomatoide Granulomatose; und Riesenzellenarteriitis. Verschiedene andere Vaskulitisarten umfassen: das mukokutane Lymphknotensyndrom (MLNS oder Kawasaki-Syndrom), isolierte ZNS-Vaskulitis, die Behet-Krankeit, Thromboangiitis obliterans (Buerger-Syndrom) und kutane nekrotisierende Venulitis. Der pathogene Mechanismus der meisten angeführten Vasculitisarten scheint primär auf die Ablagerung von Immunglobulinkomplexen an den Gefäßwänden und die darauf folgende Induktion einer Entzündungsreaktion entweder durch ADCC, Komplement-Aktivierung oder beides zurückzuführen sein.
Sarkoidose ist ein Leiden mit unbekannter Ätiologie, das durch die Gegenwart von epitheloiden Granulomen in fast jedem Körpergewebe gekennzeichnet ist; eine Involvierung der Lunge ist sehr häufig. Die Pathogenese umfasst die Persistenz von aktivierten Makrophagen und Lymphoidzellen an erkrankten Stellen und darauf folgende chronische Folgeerscheinungen, die aus der Freisetzung von lokal und systemisch aktiven Produkten resultiert, die von diesen Zelltypen abgegeben werden.
Autoimmune hämolytische Anämie einschließlich autoimmunhämolytischer Anämie, Immunpanzytopenie und paroxymaler nächtlicher Hämoglobinurie ist ein Ergebnis der Produktion von Antikörpern, die mit auf der Oberfläche von roten Blutkörperchen (und in manchen Fällen anderen Blutkörperchen einschließlich Blutplättchen) exprimierten Antigenen reagieren und spiegelt die Entfernung dieser antikörperbeschichteten Zellen durch Komplement-vermittelte Lyse und/oder ADCC/Fc-Rezeptor-vermittelte Mechanismen wider.
Bei Autoimmunthrombozytopenie einschließlich thrombozytopenischer Purpura und immunvermittelter Thrombozytopenie vor anderen klinischen Hintergründen findet eine Blutplättchenzerstörung/-entfernung als Ergebnis einer Antikörper- oder Komplementbindung an Blutplättchen und die darauf folgende Entfernung durch Komplementlyse, ADCC- oder FC-Rezeptor-vermittelte Mechanismen statt.
Thyreoiditis einschließlich Basedow-Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, juveniler lymphozytischer Thyreoiditis, atrophischer Thyreoiditis ist das Ergebnis einer Autoimmunantwort auf Thyroidantigene mit der Produktion von Antikörpern, die mit Proteinen reagieren, die in der Schilddrüse vorhanden und oft für diese spezifisch sind. Es gibt Versuchsmodelle, einschließlich spontaner Modelle: Ratten (BUF- und BB-Ratten) und Hühner (Stamm fettleibiger Hühner); induzierbarer Modelle: Immunisierung von Tieren mit entweder Thyroglobulin, mikrosomalem Schilddrüsenantigen (Schilddrüsenperoxidase).
Diabetes mellitus ist eine genetische Störung des Stoffwechsels von Kohlenhydraten, Proteinen und Fett in Zusammenhang mit einer relativen oder absoluten Insuffizienz der Insulinsekretion und mit unterschiedlichen Graden an Insulinresistenz. In seiner voll ausgebildeten klinischen Form ist sie durch Fastenhyperglykämie gekennzeichnet und bei den meisten langjährigen Patienten auch durch atherosklerotische und mikroangiopathische Gefäßerkrankungen und Neuropathie. Unterschiede zwischen den verschiedenen Formen der Krankheit zeigen sich in der Ursache und Pathogenese, natürlichen Entwicklung und Reaktion auf Behandlungen. Somit ist Diabetes keine einzelne Krankheit, sondern ein Syndrom.
Diabetes mellitus Typ I oder insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) tritt in etwa 10 Prozent aller Diabetespatienten in der westlichen Welt auf. Diabetes mellitus Typ I oder insulinabhängiger Diabetes ist die Autoimmunzerstörung der β-Zellen der Langerhans-Inseln; diese Zerstörung wird durch Autoantikörper und autoreaktive T-Zellen vermittelt. Antikörper gegen Insulin oder den Insulinrezeptor können auch den Phänotyp ohne Reaktionsbereitschaft gegen Insulin produzieren.
Klassischerweise tritt diese Art der Krankheit am häufigsten in der Kindheit und im Jugendalter auf; sie kann jedoch in jedem Alter erkannt und symptomatisch werden. Bei der häufigsten Art von IDDM (Typ IA) wird davon ausgegangen, dass (erworbene) Umweltfaktoren, wie z.B. bestimmte Virusinfektionen, und möglicherweise chemische Stoffe, die genetischen Faktoren überlagert werden, zu zellvermittelter Autoimmunzerstörung von β-Zellen führen können. Somit wird davon ausgegangen, dass genetisch bestimmte anomale Immunantworten (in Verbindung mit HLA-Assoziationen), die durch zellvermittelte und humorale Autoimmunität gekennzeichnet sind, nach Auslösung durch einen Umweltfaktor eine pathogene Rolle spielen. Eine zweite Art von IDDM (Typ IB) ist wahrscheinlich auf eine primäre Autoimmunität zurückzuführen. Diese Patienten haben assoziierte endokrine Autoimmunkrankheiten wie z.B. Hashimoto-Thyreoiditis, Basedow-Krankheit, Addison-Krankheit, Gonadenversagen und assoziierte nichtendokrine Autoimmunkrankheiten wie z.B. perniziöse Anämie, Bindegewebeerkrankungen, Zöliakie und Myasthenia gravis. Insulinabhängigkeit bedeutet, dass die Verabreichung von Insulin wesentlich ist, um spontane Ketose, Koma und Tod zu verhindern. Aber auch mit einer Insulinbehandlung können Diabetespatienten an zahlreichen weiteren Problem in Zusammenhang mit Diabetes leiden, d.h. Bindegewebestörungen, Neuropathie usw.
Die zweite Art von Diabetes, Typ II oder insulinunabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM), die etwa 90% aller Diabetiker betrifft, hat ebenfalls genetische Ursachen. Patienten mit Diabetes Typ II können ein Körpergewicht aufweisen, das von normal bis übergewichtig reicht. Fettleibigkeit und pathologische Insulinresistenz sind auf keinen Fall wesentlich für die Entwicklung von NIDDM. Bei den meisten Patienten mit NIDDM wird die Krankheit im mittleren Alter diagnostiziert. Patienten mit NIDDM hängen für die Vorbeugung von Ketose nicht von Insulin ab, aber sie können Insulin zur Korrektur von symptomatischer oder nichtsymptomatischer andauernder Fastenhyperglykämie benötigen, wenn dies nicht durch die Diät oder orale Wirkstoffe erreicht werden kann. Somit unterscheidet die therapeutische Verabreichung von Insulin nicht zwischen IDDM und NIDDM. In manchen NIDDM-Familien sind die insulinsekretorischen Antworten auf Glucose so gering, dass sie denen von frühem Diabetes Typ I zu jedem Zeitpunkt ähneln können. Früh in seiner natürlichen Entwicklung kann der Insulinsekretionsdefekt und die Insulinresistenz durch eine Behandlung (d.h. Gewichtsreduktion) und damit einhergehender Normalisierung der Glucosetoleranz umkehrbar sein. Die typischen chronischen Komplikationen von Diabetes, nämlich Makroangiopathie, Mikroangiopathie, Neuropathie und Katarakt, die bei IDDM auftreten, finden sich auch bei NIDDM.
Andere Arten von Diabetes umfassen Symptome, die sekundär sind oder mit bestimmten andere Leiden oder Syndromen zusammenhängen. Diabetes kann eine sekundäre Entwicklung von Pankreasleiden oder der Entfernung von Pankreasgewebe; endokrinen Krankheiten wie z.B. Akromegalie, des Cushing-Syndroms, Phäochromozytomen, Glucagonomen, Somatostatinomen oder primärem Aldosteronismus; der Verabreichung von Hyperglykämie verursachenden Hormonen; und der Verabreichung von bestimmten Arzneimitteln (d.h. antihypertensiven Arzneimitteln, Thiaziddiuretika, Östrogen enthaltenden Präparaten, psychoaktiven Arzneimitteln, sympathomimetischen Arzneimitteln) sein. Diabetes kann mit vielen verschiedenen genetischen Syndromen zusammenhängen. Und schließlich kann Diabetes mit genetischen Defekten des Insulinrezeptors zusammenhängen oder auf Antikörper gegen den Insulinrezeptor mit oder ohne assoziierte(n) Immunstörungen zurückzuführen sein.
Immunvermittelte Nierenerkrankungen einschließlich Glomerulonephritis und tubulointerstitieller Nephritis sind das Ergebnis von Antikörper- oder T-Lymphozyten-vermittelten Schädigungen des Nierengewebes, entweder direkt als Ergebnis der Produktion von autoreaktiven Antikörpern oder T-Zellen gegen Nierenantigene oder indirekt als Ergebnis der Ablagerung von Antikörpern und/oder Immunkomplexen in der Niere, die in Bezug auf andere, nicht renale Antigene reaktiv sind. Somit können andere immunvermittelte Krankheiten, die zur Bildung von Immunkomplexen führen, auch eine immunvermittelte Nierenerkrankung als indirekte Folgeerscheinung auslösen. Sowohl direkte als auch indirekte Immunmechanismen führen zu Entzündungsreaktionen, welche die Entwicklung von Läsionen in Nierengewebe auslösen/induzieren, was zur Störung der Organfunktion und in manchen Fällen zur Progression zu Nierenversagen führt. Sowohl humorale als auch zelluläre Immunmechanismen können an der Pathogenese von Läsionen beteiligt sein.
Es wird angenommen, dass Entmarkungskrankheiten des zentralen und peripheren Nervensystems einschließlich multipler Sklerose; idiopathischer demyelinisierender Polyneuropathie oder des Guillain-Barre-Syndroms; und chronischer inflammatorisch demyelinisierender Polyneuropathie auf Autoimmunität basieren und als Ergebnis einer Schädigung aufgrund von Oligodendrozyten oder durch Myelin direkt zu Nervendemyelinisierung führen. Bei MS gibt es Beweise dafür, dass die Krankheit in Abhängigkeit von T-Lymphozyten induziert wird und fortschreitet. Multiple Sklerose ist eine Entmarkungskrankheit, die T-Lymphozyten-abhängig ist und verläuft entweder rezidivierend-remittierend oder chronisch progressiv. Die Ätiologie ist unbekannt; aber Virusinfektionen, genetische Prädisposition, Umwelteinflüsse und Autoimmunität tragen alle dazu bei. Läsionen enthalten Infiltrate von vorwiegend T-Lmyphozyten-vermittelten Mikrogliazellen und infiltrierenden Makrophagen; CD4+-T-Lymphozyten sind der vorherrschende Zelltyp bei Läsionen. Der Mechanismus von Oligodendrozytenzelltod und darauf folgende Entmarkung ist nicht bekannt, wird aber wahrscheinlich von T-Lymphozyten gesteuert.
Entzündliche und fibrotische Lungenkrankheiten einschließlich eosinophiler Pneumonien, idiopathischer Lungenfibrose und hypersensitiver Pneumonitis können eine disregulierte entzündliche Immunantwort involvieren. Eine Hemmung dieser Antwort wäre von therapeutischem Vorteil und im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten.
Autoimmun- oder immunvermittelte Hautkrankheiten einschließlich bullösen Hautkrankheiten, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis werden durch Autoantikörper vermittelt, und ihr Entstehen hängt mit T-Lymphozyten zusammen.
Psoriasis ist eine T-Lymphozyten-vermittelte Entzündungserkrankung. Läsionen enthalten Infiltrate von T-Lymphozyten, Makrophagen und Antigen-Processing-Zellen sowie einige Neutrophile.
Mit Transplantationen zusammenhängende Erkrankungen einschließlich Transplantatabstoßung und Erkrankungen aufgrund von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen (GVHD) sind T-Lymphozyten-abhängig; die Hemmung der T-Lymphozytenfunktion wirkt lindernd.
Weitere Erkrankungen, bei denen ein Eingriff in die Immun- und/oder Entzündungsreaktion von Vorteil ist, sind infektiöse Erkrankungen einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Virusinfektionen (einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, AIDS, Hepatitis A, B, C, D, E und Herpes), Bakterieninfektionen, Pilzerkrankungen und Protozoen- und Parasiteninfektionen (Moleküle (oder Derivate/Antagonisten), welche die MLR stimulieren, können zur Therapie eingesetzt werden, um die Immunantwort auf infektiöse Stoffe zu steigern), Immundefizienzerkrankungen (Molekül/DerivatelAgonisten, welche die MLR stimulieren, können zur Therapie eingesetzt werden, um die Immunantwort bei Leiden wie vererbter, erworbener, infektiös induzierter (wie bei HIV-Infektionen) oder iatrogener (d.h. beispielsweise durch Chemotherapie) Immundefizienz zu steigern) und Neoplasie.
Weiters kann die Hemmung von Molekülen mit proinflammatorischen Eigenschaften therapeutische Wirkung bei Reperfusionsschädigungen; Schlaganfall, Herzinfarkt; Atherosklerose; akuter Lungenschädigung; Blutungsschock; Verbrennungen; Sepsis/septischem Schock; akuter tubulärer Nekrose; Endometriose; degenerativen Gelenkserkrankungen und Pankreatis aufweisen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, beispielsweise Polypeptide oder Antikörper, werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß bekannten Verfahren, wie z.B. durch intravenöse Verabreichung als Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion über längere Zeit, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intrazerebrospinalem, subkutanem, intraartikufärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem oder inhalatorischem (intranalasem, intrapulmonalem) Weg, verabreicht.
Es kann wünschenswert sein, auch Antikörper gegen andere mit Immunkrankheiten assoziierten oder tumorassoziierten Antigene zu verabreichen, wie beispielsweise Antikörper, die an CD20, CD11a, CD40, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder den Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) binden. Alternativ oder zusätzlich dazu können zwei oder mehr Antikörper, welche die gleichen oder zwei oder mehr unterschiedliche hierin offenbarte Antigene binden, gleichzeitig dem Patienten verabreicht werden. Manchmal kann es vorteilhaft sein, auch ein oder mehrere Zytokine an den Patienten zu verabreichen. In einer Ausführungsform werden die Polypeptide der Erfindung gleichzeitig mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht. Das wachstumshemmende Mittel kann beispielsweise zuerst verabreicht werden, gefolgt von einem Polypeptid der Erfindung. Aber auch seine gleichzeitige Verabreichung oder Verabreichung zuerst sind eingeschlossen. Geeignete Dosierungen für das wachstumshemmende Mittel sind die derzeit verwendeten und können aufgrund der Kombinationswirkung (Synergie) des wachstumshemmenden Mittels und des Polypeptids der Erfindung verringert werden.
Zu Behandlung oder Verringerung der Schwere einer Krankheit im Zusammenhang mit dem Immunsystem hängt die geeignete Dosis einer Verbindung der Erfindung von der wie oben definierten Art der Krankheit, die behandelt werden soll, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob das Mittel zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von vorhergehenden Therapien, der Krankengeschichte des Patienten und seiner Reaktion auf die Verbindung sowie vom Ermessen des behandelnden Arztes ab. Die Verbindung wird dem Patienten am besten auf einmal oder im Laufe mehrerer Behandlungen verabreicht.
J. Herstellungsartikel
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Herstellungsartikel bereitgestellt, welcher Materialien umfasst, die für die Diagnose oder Behandlung der oben beschriebenen Leiden zweckdienlich sind. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter und Anleitungen. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Reagenzgläser. Die Behälter können aus unterschiedlichen Materialien wie z.B. Glas oder Kunststoff bestehen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung der Erkrankung zweckdienlich ist, und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel oder eine Phiole mit einer intravenösen Lösung sein, die einen Stöpsel aufweisen, der mit einer Injektionsnadel durchstochen werden kann). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist typischerweise ein PRO21074-Polypeptid oder ein Antagonist davon. Die Zusammensetzung kann jede beliebige oder mehrere der hierin offenbarten Bestandteile enthalten. Die Anleitungen, die sich auf dem Behälter befinden oder mit dem Behälter geliefert werden, geben an, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung einer Krankheit nach Wahl dient. Beispielsweise könnte in den Anleitungen stehen, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis oder jeder beliebigen anderen Knorpelerkrankung wirksam ist. Der Herstellungsartikel kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer enthält, wie z.B. eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, eine Ringer-Lösung oder eine Dextroselösung. Weiters kann sie noch andere Materialien enthalten, die vom kommerziellen oder Benutzerstandpunkt wünschenswert sein könnten, einschließlich anderer Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung, keinesfalls aber der Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders angemerkt, gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA.
BEISPIEL 1
Isolieren von cDNA-Klonen, die für ein menschliches PRO21074 kodieren
Die extrazellulären Domänen-(ECD-)Sequenzen (einschließlich der Sekretionssignalsequenz, sofern vorhanden) aus etwa 950 bekannten sekretierten Proteinen aus der öffentlich zugänglichen Swiss-Prot-Datenbank wurden verwendet, um Sequenz-Datenbanken zu durchsuchen. Die Datenbanken umfassten öffentliche Datenbanken (z.B. GenBank). In diesem Fall wurde genomische DNA-Sequenz aus GenBank unter Verwendung des Genvorhersage-Programms GENSCAN, lizenziert für Stanford University, analysiert. GENSCAN-Analyse sagt Genkodierregionen vorher und bringt Sequenzen hervor, die der ECD-Suche unterzogen werden können. Die Suche erfolgte unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der Sequenzen. Diese Vergleiche mit einem BLAST-Score von 70 (oder in manchen Fällen von 90) oder mehr, die nicht für bekannte Proteine kodierten, wurden gruppiert und mit dem Programm "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) zu Consensus-DNA-Sequenzen assembliert.
Eine Consensus-DNA-Sequenz wurde assembliert. Diese Consensus-Sequenz wird hierin als DNA144306 bezeichnet. Basierend auf der DNA144306-Consensus-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert: 1) um durch PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthält, und 2) zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der Kodiersequenz voller Länge für PRO21074 zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 30 Nucleotiden und werden häufig entworfen, um ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100-1.000 bp zu ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40–55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensus-Sequenz länger als etwa 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Klon voller Länge zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, s.o., beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann unter Verwendung des Sondenoligonucleotids und eines der Primerpaare verwendet, um Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
PCR-Primer (vorwärts und rückwärts) wurden synthetisiert:
Darüber hinaus wurde eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus der DNA144306-Consensus-Sequenz konstruiert, die die folgende Nucleotidsequenz aufwies:
Ein Pool aus 50 verschiedenen menschlichen cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Geweben wurde beim Klonieren verwendet. Die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden mittels, Standardverfahren unter Verwendung von handelsüblichen Reagenzien wie jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem stumpfen Ende an SalI-hemikinasierte Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, in geeigneter Weise mittels Gelelektrophorese der Größe nach klassiert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von pRK5D, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) in die einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
DNA-Sequenzieren der wie oben beschrieben isolierten Klone ergab die DNA-Sequenz voller Länge für ein PRO21074-Polypeptid voller Länge (hierin als DNA153576-2925 [1, Seq.-ID Nr. 1] bezeichnet) und die abgeleitete Proteinsequenz für dieses PRO21074-Polypeptid.
Der oben identifizierte Klon voller Länge enthielt einen einzelnen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 31–33 und ein Stoppsignal an den Nucleotidpositionen 3970–3972 (1, Seq.-ID Nr. 1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 1313 Aminosäuren lang, weist ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 143.187 Da und einen geschätzten pI von etwa 9,27 auf. Eine Analyse der in 2 gezeigten Volllängen-PRO21074-Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) belegt die Gegenwart einer Vielzahl wichtiger Polypeptiddomänen, wie in 2 gezeigt, worin die für diese wichtigen Polypeptiddomänen angegebenen Positionen etwa der obigen Beschreibung entsprechen. Klon DNA153576-2925 wurde bei der ATCC am 23. Mai 2000 hinerlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA zugeteilt.
Eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter Verwendung der ALIGN-2-Sequenzabgleichanalyse der in 2 gezeigten Volllängensequenz (Seq.-ID Nr. 2) bewies die Sequenzidentität zwischen der PRO21074-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen: HS1409_1; P_Y17829; P_Y32169; ITH3_HUMAN; ITH4_HUMAN; ITH2_HUMAN; ITH1_HUMAN; AF119856_1; P_Y48475; HSU70136_1.
BEISPIEL 2
Verwendung von PRO21074 als eine Hybridisierungssonde
Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für PRO21074 kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
DNA, die das gesamte Gen, das für PRO21074 kodiert, oder einen Teil davon umfasst, wird als eine Sonde zum Screenen auf homologe DNAs (wie jene, die für natürlich vorkommende Varianten von PRO21074 kodieren) in cDNA-Bibliotheken aus menschlichem Gewebe oder genomischen Bibliotheken aus menschlichem Gewebe verwendet.
Hybridisieren und Waschen von Filtern, die beide Bibliotheks-DNAs enthalten, erfolgt unter den folgenden hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung von radioaktiv markierter, von PRO21074 abgeleiteter Sonde an die Filter erfolgt in einer Lösung von 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardts Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C 20 Stunden lang. Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung von 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C.
DNAs mit einer erwünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für Volllängen-Nativsequenz-PRO21074 kodiert, kann dann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
DNA, die einen beliebigen Teil von Gen umfasst, das für PRO21074 kodiert, kann auch als eine Sonde verwendet werden, um Expressionsstellen in Gewebeschnitten zu detektieren.
BEISPIEL 3
Expression von PRO21074 in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von PRO21074 durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für PRO21074 kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich unter Verwendung von selektierten PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet wer den. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein antibiotisches Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, Polyhis-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die PRO21074-Kodierregion, λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen. Darüber hinaus kann der Vektor zumindest nicht insignifikante Teile der untranslatierten 5'- und 3'-Abschnitte der für Nativsequenz-PRO21074 kodierenden Nucleinsäure umfassen.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Antibiotika-resistente Kolonien werden dann ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Ausgewählte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie beispielsweise LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu inokulieren. Die Zellen werden dann bis zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor aktiviert wird.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden hinweg können die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte PRO21074-Protein kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildnersäule unter Bedingungen, die feste Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
PRO21074 kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für PRO21074 kodierende DNA wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für wirksame und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird, um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)), zu transformieren. Transformanten werden zuerst in LB, das 50 mg/ml Carbenicillin enthält, bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.₆₀₀ von 3–5 erreicht ist. Kulturen werden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat·2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und etwa 20–30 Stunden lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Proben werden dann entnommen, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-l-Fermentationen (6–10 g Pellets) wird in 10 Volumina (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8 (Puffer), resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathiosulfat werden zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erreichen, und die Lösung wird über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3–5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter zur Klärung filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die in Metallchelatsäulenpuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zusätzlichem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthält. Das Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Die das erwünschte Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch sein Absorptionsvermögen bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten basierend auf seiner Aminosäuresequenz geschätzt.
Die Proteine werden durch Verdünnen der Probe langsam in frisch hergestellten Neufaltungspufter, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, neu gefaltet. Neufaltungsvolumina werden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird sanft bei 4°C 12–36 Stunden lang gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA zu einer Endkonzentration von 0,4% (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wird zur Erreichung einer 2–10%igen Endkonzentration zugesetzt. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1% TFA mittels Elution mit einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80% chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein enthalten, werden gesammelt. Im Allgemeinen werden die korrekt gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Konzentrationen von Acetonitril eluiert, da diese Spezies mit ihrem hydrophoben Inneren am kompaktesten und vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz geschützt sind. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitrilkonzentrationen eluiert. Zusätzlich zum Auflösen fehlgefalteter Formen von Proteinen aus der erwünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Fraktionen, die das erwünschte gefaltete PRO21074-Polypeptid enthalten, werden gesammelt, und das Acetonitril wird unter Verwendung eines sanften Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet ist, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4% Mannit durch Dialyse oder durch Gelfiltra tion unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
BEISPIEL 4
Expression von PRO21074 in Säugetierzellen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten Form von PRO21074 durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe die EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als der Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die PRO21074-DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um Insertion der PRO21074-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird als pRK5-PRO21074 bezeichnet.
In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PRO21074-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)], vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugetropft, und ein Niederschlag wird 10 min lang bei 25°C bilden gelassen. Der Niederschlag wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugesetzt und etwa vier Stunden lang bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20% Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-stündigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das bearbeitete Gel kann getrocknet werden, und ein Film kann damit eine ausgewählte Zeitspanne lang belichtet werden, um die Gegenwart von PRO21074-Polypeptid aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
In einem alternativen Verfahren kann PRO21074 in 293-Zellen unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, vorübergehend eingeführt werden. 293-Zellen werden in einem Zentrifugenkolben bis zu maximaler Dichte gezüchtet, und 700 μg pRKS-PRO21074-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Zentrifugenkolben durch Zentrifugieren eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich in den Zentrifugenkolben, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Probe, die exprimiertes PRO21074 enthält, kann dann eingeengt und mittels jedes beliebigen Verfahrens wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann PRO21074 in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PRO21074 kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie beispielsweise CaPO₄ oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. ³⁵S-Methionin enthält, ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart von PRO21074-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PRO21074 enthaltende Medium kann dann konzentriert und durch jedes ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
Epitop-markiertes PRO21074 kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PRO21074 kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie beispielsweise einer poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte PRO21074-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Es kann eine Markierung wie zuvor beschrieben angebracht werden, um Expression zu überprüfen. Das Kulturmedium, das das exprimierte poly-His-markierte PRO21074 enthält, kann dann eingeengt und durch jedes ausgewählte Verfahren wie z.B. durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie gereinigt werden.
PRO21074 kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zur vorübergehenden Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Verfahren zur stabilen Expression exprimiert werden.
Stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die Kodiersequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Konstantregionensequenz, die die Gelenks-, CH2 und CH2-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist, fusioniert werden.
Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley & Sons (1997), beschrieben subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um leichtes Verschieben von cDNAs zu ermöglichen. Der Vektor, der für Expression in CHO-Zellen verwendet wird, ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24 (9), 1774–1779 (1996), beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion für stabile Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
12 μg der erwünschten Plasmid-DNA werden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Qiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa 3 × 10^–7 Zellen werden in einer Ampulle für weitere Züchtung und Herstellung wie nachstehend beschrieben eingefroren.
Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Verwirbeln vermischt. Die Inhalte werden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthält, und werden bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5% 0,2-μm-diafiltriertem fötalem Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in einer 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthält, aliquotiert. Nach 1–2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, gefüllt mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, übertragen und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugen mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird durch frisches Medium durch Zentrifugieren und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden kann, kann hier ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469, ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wird, verwendet werden. Eine 3-l-Produktionszentrifuge wird bei einer Konzentration von 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wird die Zellanzahl und der pH bestimmt. An Tag 1 werden der Zentrifuge Proben entnommen, und Hin durchperlenlassen von filtrierter Luft wird begonnen. An Tag 2 werden der Zentrifuge Proben entnommen, die Temperatur wird auf 33°C geändert, und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10%igem Antischaummittel (z.B. 35%ige Polydimethylsiloxanemulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe der Produktion wird der pH sofern erforderlich eingestellt, um ihn auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder sobald die Lebensfähigkeit auf unter 70% abgefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugieren und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4°C gelagert oder sofort auf Säulen zur Reinigung geladen.
Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten Medium zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min bei 4°C gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Ladepuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei –80°C gelagert.
(Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausführlich mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Ladepuffer wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität wird durch SDS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau bewertet.
BEISPIEL 5
Expression von PRO21074 in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO21074 in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PRO21074 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PRO21074 und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im selektierten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von PRO21074 zu steuern. Zur Sekretion kann für PRO21074 kodierende DNA zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, ein natives PRO21074-Signalpeptid oder ein anderes Säugetier-Signalpeptid kodiert, oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder -Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) zur Expression von PRO21074 in das selektierte Plasmid kloniert werden.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewähltem Fermentationsmedium kultiviert werden. Die Überstände transformierter Hefe können durch Fällen mit 10% Trichloressigsäure und durch Trennen durch SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blaufärbung, analysiert werden.
Rekombinantes PRO21074 kann daraufhin isoliert und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Einengen des Mediums unter Verwendung ausgewählter Patronenfilter gereinigt werden. Das PRO21074-hältige Konzentrat kann weiters unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt werden.
BEISPIEL 6
Expression von PRO21074 in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PRO21074 in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
Die für PRO21074 kodierende Sequenz wird stromab einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitop-Markierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmiden, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Kurz zusammengefasst wird die für PRO21074 kodierende Sequenz oder der erwünschte Abschnitt der Kodiersequenz von PRO21074, wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife Protein kodiert, sofern das Protein extrazellulär ist, durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfektion des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-("Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) hergestellt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes poly-His-markiertes PRO21074 kann dann, beispielsweise durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewa schen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin, 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird auf die Säule bei 0,5 ml pro Minute geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer zu A₂₈₀-Basislinie gewaschen, ein Punkt, an dem Fraktionssammlung gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte PRO21074 enthalten, werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PRO21074 unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
BEISPIEL 7
Herstellung von Antikörpern, die PRO21074 binden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die sich spezifisch an PRO21074 binden können.
Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes PRO21074, Fusionsproteine, die PRO21074 enthalten, und Zellen, die rekombinantes PRO21074 an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren treffen.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem PRO21074-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 μg injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen der Hinterläufe der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion von Anti-PRO21074-Antikörpern in periodischen Abständen entnommen werden.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit "positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion von PRO21074 verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol) fusioniert. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen PRO21074 gescreent. Bestimmung von "positiven" Hybridomzellen, die die erwünschten monoklonalen Antikörper gegen PRO21074 sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-PRO21074-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekultur kolben oder Rollflaschen gezüchtet werden. Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
BEISPIEL 8
Reinigung von PRO21074-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
Native oder rekombinante PRO21074-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gereinigt, werden. Beispielsweise wird pro-PRO21074-Polypeptid, reifes PRO21074-Polypeptid oder prä-PRO21074-Polypeptid mittels Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das PRO21074-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des Anti-PRO21074-Polypeptidantikörpers an ein aktiviertes Chromatographieharz konstruiert.
Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N. J.) hergestellt. In ähnlicher Weise werden monoklonale Antikörper aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder durch Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSE^TM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Derivatharz wird gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen.
Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von PRO21074-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion von Zellen, die PRO21074-Polypeptid in einer löslichen Form enthält, verwendet. Dieses Präparat wird durch Solubilisierung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion, die durch differenzielles Zentrifugieren durch den Zusatz von Detergens oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten wurde, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches PRO21074-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
Ein lösliches PRO21074-Polypeptid-hältiges Präparat wird über eine Immunaffinitätssäule geführt, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von PRO21074-Polypeptid ermöglichen (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/PRO21074-Polypeptid-Bindung aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2–3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanation), und PRO21074-Polypeptid wird gesammelt.
BEISPIEL 9
Wirkstoff-Screenen
Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von PRO21074-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon im Rahmen eines von zahlreichen verschiedenen Screeningverfahren. Das PRO21074-Polypeptid oder -Fragment, das in solch einem Test verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert an einen festen Träger sein, an einer Zelloberfläche getragen werden oder intrazellulär angeordnet sein. Ein Verfahren zum Wirkstoff-Screenen verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nucleinsäuren, die das PRO21074-Polypeptid oder -Fragment exprimieren, stabil transformiert sind. Wirkstoffe werden gegen solche transformierten Zellen in Konkurrenzbindungstests gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form, können für herkömmliche Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen PRO21074-Polypeptid oder einem -Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann die Abnahme von Komplexbildung zwischen dem PRO21074-Polypeptid und seiner Targetzelle oder seinen Targetrezeptoren untersucht werden, die durch das zu testende Mittel verursacht wird.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe oder auf beliebige andere Mittel bereit, die mit PRO21074-Polypeptid assoziierte Erkrankungen oder Leiden beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem PRO21074-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (i) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem PRO21074-Polypeptid oder -Fragment oder (ii) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem PRO21074-Polypeptid oder -Fragment und der Zelle mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren. In solchen Konkurrenzbindungstests wird das PRO21074-Polypeptid oder -Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies PRO21074-Polypeptid oder -Fragment von dem, das in gebundener Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels dar, sich an PRO21074-Polypeptid zu binden oder den PRO21074-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
Ein anderes Verfahren zum Wirkstoff-Screenen sorgt für Screenen mit hohem Durchsatz von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an ein Polypeptid und wird in der WO 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, detailliert beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine große Anzahl an verschiedenen Testverbindungen kleiner Peptide an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Nachdem sie auf ein PRO21074-Polypeptid aufgetragen wurden, werden Peptidtestverbindungen mit PRO21074-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes PRO21074-Polypeptid wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes PRO21074-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten beschichtet werden. Darüber hinaus können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung erwägt auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screeningtests, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, PRO21074-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um Bindung an PRO21074-Polypeptid oder Fragmenten davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen, das mit PRO21074-Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten gemeinsam hat.
BEISPIEL 10
Rationales Wirkstoffdesign
Das Ziel von rationalem Wirkstoffdesign ist die Herstellung struktureller Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (z.B. von einem PRO21074-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Wirkstoffe zu entwerfen, die aktivere oder stabilere Formen des PRO21074-Polypeptids sind oder die die Funktion des PRO21074-Polypeptids in vivo verstärken oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19–21 (1991)).
In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des PRO21074-Polypeptids oder eines PRO21074-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computermodellierung oder, was am häufigsten vorkommt, durch eine Kombination der zwei Ansätze bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des PRO21074-Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur erkennen zu können und um (eine) aktive Stelle(n) des Moleküls zu identifizieren. Weniger häufig können nützliche Informationen hinsichtlich der Struktur des PRO21074-Polypeptids durch Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge PRO21074-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche Beispiele für rationales Wirkstoffdesign können Moleküle umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796–7801 (1992), gezeigt wird, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742–746 (1993), gezeigt wird.
Auch ist es möglich, einen Target-spezifischen Antikörper zu isolieren, der wie zuvor beschrieben durch funktionelle Tests selektiert wird, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz ergibt im Prinzip ein Pharmakor, auf Grundlage dessen Wirkstoffdesign vollzogen werden kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem anti-idiotypische Antikörper (anti-ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gebildet werden. Es wird erwartet, dass, als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes, die Bindungsstelle der anti-ids analog zu dem Originalrezeptor ist. Der anti-id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als der Pharmakor wirken.
Durch die vorliegende Erfindung können ausreichende Mengen des PRO21074-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytischen Studien wie z.B. Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus liefert die Kenntnis der hierin bereitgestellten PRO21074-Polypeptid-Aminosäuresequenz einen Leitfaden für jene, die Computermodellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie verwenden.
BEISPIEL 11
Gewebeexpressionsverteilung
Oligonucleotidsonden wurden unter Verwendung von DNA 153576, gezeigt in den beiliegenden Zeichnungen, zur Verwendung in quantitativen PCR-Amplifikationsreaktionen konstruiert. Die Oligonucleotidsonden wurden so ausgewählt, dass ein etwa 50–300 Basenpaare umfassendes, amplifiziertes Fragment vom 3'-Ende seiner assoziierten Matrix in einer Standard-PCR-Reaktion erhalten wurde. Die Oligonucleotidsonden wurden in herkömmlichen quantitativen PCR-Amplifikationsreaktionen mit cDNA-Bibliotheken, isoliert aus verschiedenen menschlichen erwachsenen und/oder fötalen Gewebequellen, verwendet und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert, um eine quantitative Bestimmung des Expressionsniveaus der für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nucleinsäure in den verschiedenen getesteten Geweben zu erhalten. Wissen bezüglich des Expressionsmusters oder der differenziellen Expression der für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nuc ziellen Expression der für PRO21074-Polypeptid kodierenden Nucleinsäure in den einzelnen unterschiedlichen menschlichen Gewebetypen liefert einen Diagnosemarker, der im Bereich der Gewebetypisierung, mit oder ohne andere(n) gewebespezifische(n) Marker, zur Bestimmung der primären Gewebequelle eines metastatischen Tumors und dergleichen nützlich ist. Die Resultate dieses Tests zeigten, dass das DNA153576-2925-Molekül in Knorpel stark exprimiert wird und in Knochenmark und Prostata in sehr geringen Konzentrationen (100–1.000fach geringer als jene in Knorpel) exprimiert wird. Es wird nicht in cDNA-Bibliotheken exprimiert, die aus HUVEC (humane venöse Nabelschnurendothelien), Milz, Herz, Uterus, Kolontumor, Substantia nigra, Hippocampus, Makrophagen, Dendrozyten oder Lymphoblasten hergestellt wurden.
BEISPIEL 12
TaqMan-Analyse
Das für Knorpelgewebe spezifische Expressionsmuster von DNA153576 wurde unter Verwendung der TaqMan-PCR-Methode an zahlreichen verschiedenen RNAs, hergestellt aus mehreren menschlichen Geweben, sowie an menschlichen cDNA-Bibliotheken analysiert. Die verwendeten Primer und die verwendete Sonde für die TaqMan-Analyse waren die Folgenden:
Standard-TaqMan-Arbeitsvorschriften, wie sie von PE Applied Biosystems Inc. in: "User Bulletin #2 ABI Prism 7700 Sequence Detection System" (11. Dezember 1997) bereitgestellt sind, wurden für alle Versuche verwendet. Kurz zusammengefasst wunden 50 ng cDNA-Bibliothek oder 6–50 ng RNA in einer 25-μl-Reaktion für jede Probe verwendet. Alle Proben wurden bezogen auf beta-Actin-Expression normalisiert, um Vergleiche zwischen den Proben zu ermöglichen. Die Bedingungen für die TaqMan-Reaktionen lauteten wie folgt:
Revers-Transkriptase-Reaktion (nur für RNA-Proben)

48°C 30 min
95°C 10 min

PCR-Reaktion für 40 Zyklen (sowohl für cDNA-Bibliotheken als auch für RNA-Proben)

95°C 30 s
60°C 1,5 min

Die TaqMan-Daten wurden mittels des "Comparative CT method" (Vergleichs-CT-Verfahrens) unter Verwendung das Programms "Sequence Detection Systems Ver. 1.6" von Perkin Elmer Corporation, Foster City, CA, wie im "User Bulletin #2 ABI Prism 7700 Sequence Detection System", 11–16 (11. Dezember 1997), beschrieben, analysiert.
HINTERLEGUNG VON MATERIAL
Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, (ATCC) hinterlegt:
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte Ausführungsform einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu verstehen ist, und jegliches andere Konstrukt, das funktionell äquivalent ist, liegt ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung. Die Hinterlegung des hierin offenbarten Materials stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung irgendeines Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche zu den spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. Schließlich werden Fachleuten auf Grundlage der obigen Beschreibung verschiedene Modifikationen der hierin beschriebenen Ausführungsformen, zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, ersichtlich sein, und diese liegen ebenfalls im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das DNA umfasst, die zumindest 80% Sequenzidentität (a) mit einem DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid kodiert, das die Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2 umfasst, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls unter (a) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend die Sequenz der Nucleotidpositionen 31 oder 100 bis 3969 aus 1.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend die Nucleotidsequenz aus 1.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für die Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das DNA umfasst, die zumindest 80% Sequenzidentität (a) mit einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche cDNA kodiert, die bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt wurde, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls unter (a) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, umfassend DNA, die für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche cDNA kodiert, die bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt wurde.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend DNA, die zumindest 80% Sequenzidentität (a) mit der Polypeptid-Kodiersequenz voller Länge der menschlichen Protein-cDNA, die bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt wurde, oder (b) mit dem Komplement der Kodiersequenz unter (a) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 7, umfassend die Polypeptid-Kodiersequenz voller Länge der menschlichen Protein-cDNA, die bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt wurde.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein PRO21074-Polypeptid kodiert und DNA mit zumindest 2036 Nucleotiden umfasst, die unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen an das Komplement der Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für die Aminosäuren 1 oder 24 bis 1313 aus 2 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das zumindest 2036 Nucleotide umfasst und durch Hybridisieren eines Test-DNA-Moleküls unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (a) mit einem DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid kodiert, das eine Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2 umfasst, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls unter (a) sowie Isolieren des Test-DNA-Moleküls erzeugt wird.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10, das zumindest 80% Sequenzidentität (a) mit einem DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid kodiert, das eine Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2 umfasst, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls unter (a) aufweist.
Vektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Vektor nach Anspruch 12, worin das Nucleinsäuremolekül operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Nucleinsäuremolekül, das bei der ATCC unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt ist.
Isolierte Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 12 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 15, worin die Zelle eine CHO-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, worin die Zelle eine E.coli-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, worin die Zelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines PRO21074-Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 15 unter Bedingungen, die für die Expression von PRO21074-Polypeptid geeignet sind, sowie das Gewinnen des PRO21074-Polypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes PRO21074-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zumindest 80% Sequenzidentität mit der Sequenz der Aminosäurereste von etwa 1 oder 24 bis 1313 aus 2 aufweist.
Isoliertes PRO21074-Polypeptid nach Anspruch 20, umfassend die Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2.
Isoliertes PRO21074-Polypeptid mit zumindest 80% Sequenzidentität mit dem Polypeptid, für das das cDNA-Insert des Vektors kodiert, der bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt wurde.
Isoliertes PRO21074-Polypeptid nach Anspruch 22, für das das cDNA-Insert des Vektors kodiert, der bei der ATCC am 23. Mai 2000 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 1907-PTA hinterlegt wurde.
Isoliertes PRO21074-Polypeptid, umfassend die Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2.
Isoliertes Polypeptid, das durch Kultivieren einer Wirtszelle, die ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10 umfasst, unter Bedingungen, die für. die Expression dieses Polypeptids geeignet sind, sowie Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur erzeugt wird.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 25, worin das isolierte Nucleinsäuremolekül zumindest 80% Sequenzidentität (a) mit einem DNA-Molekül, das für ein PRO21074-Polypeptid kodiert, das eine Sequenz der Aminosäurereste 1 oder 24 bis 1313 aus 2 umfasst, oder (b) mit dem Komplement des DNA-Moleküls unter (a) aufweist.
Chimäres Molekül, umfassend ein PRO21074-Polypeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 24, das an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Chimäres Molekül nach Anspruch 27, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitopmarkierungs-Sequenz ist.
Chimäres Molekül nach Anspruch 27, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region eines Immunglobulins ist.
Antikörper, der sich spezifisch an ein PRO21074-Polypeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 24 bindet.
Antikörper nach Anspruch 30, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 30, worin der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 30, worin der Antikörper ein Antikörperfragment ist.
Substanzzusammensetzung, umfassend (a) ein PRO21074-Polypeptid nach einem der Ansprüche 20 bis 24 oder (b) einen Antikörper nach einem der Ansprüche 30 bis 33 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.