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Bereich der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Behandlungen von menschlichen Papillomavirus-Infektionen.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Infektion mit menschlichem Papillomavirus (HPV) ist häufig. HPV
kann sexuell übertragen
werden, und es wird geschätzt,
dass 20–80%
der sexuell-aktiven Erwachsenen infiziert worden sind. Während die Mehrheit
von Infektionen asymptomatisch ist, kann eine Infektion zu der Entwicklung
von Genitalwarzen (die eine Prävalenz
von etwa 1–5%
unter Erwachsenen haben) und Krebs des Anogenitaltrakts führen. Eine
andere Art von Krebs, der Gebärmutterhalskrebs,
ist stark mit HPV assoziiert (Franzer, Genitourin. Med. 72: 398–403, 1996).
Die HPV-Typen 6,
11, 16, 18, 31 und 33 werden oft mit einem erhöhten Risiko für Krebs
assoziiert, wobei die Typen 16 und/oder 18 in mehr als 90% von Gebärmutterhalskrebs
nachgewiesen werden (van Driel et al., Arzn. Med. 28: 471–477, 1996).
Die Typen 6 und 11 werden auch mit Anogenitalwarzen assoziiert.
Für Literaturübersichten über Papillomaviren
und ihre assoziierten Pathologien siehe Shah et al., „Kapitel
66: Papillomaviruses",
In: Virology, 3. Auflage, Fields et al., Hrsg., Raven Press, Philadelphia,
S. 2077–2109,
1996 und zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst. 92: 690–698, 2000.
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WO
98/04706 beschreibt Polypeptide und Aggregate von Polypeptiden,
die Papilloma-abgeleitete Antigene umfassen, und Zusammensetzungen
davon und deren Verwendung zum Beispiel mit Adjuvanzien für immunogene
und Impfstoff-Zwecke
zum Hervorrufen von HPV-spezifischen Immunantworten. Roden et al.,
Virology 270: 254–257
(2000) beschreiben die Impfung mit virusähnlichen Partikeln, umfassend
sowohl L1 als auch L2 der HPV-Genitaltypen 6, 16 und 18, und beobachten
die Induktion von Typ-spezifischen neutralisierenden Antikörpern. Kawana
et al., J. Virol. 73; 6188–6190
(1999) beschreiben ein neutralisierendes Epitop im kleineren Kapsidprotein
L2 der HPV-Typen 16 und 6.
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Derzeit
gibt es keinen sicheren und wirksamen Weg, Warzen oder die oben
beschriebenen Erkrankungen durch Beeinflussung des Immunsystems
zu behandeln oder zu verhindern. Bemühungen, solche Behandlungen
zu entwickeln, sind aus mehreren Gründen behindert worden, einer
davon ist das Dogma, dass Antigene eines einzelnen HPV-Typs eine
limitierte, Typ-spezifische Immunantwort hervorrufen. Folglich ist
vorgeschlagen worden, dass ein Cocktail, der Antigene von einigen
unterschiedlichen HPV-Typen enthält,
für eine allgemein
wirksame HPV-Behandlung nötig
ist (Caine et al., Science 288: 1753, 2000).
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass
ein Fusionsprotein, das ein Hitzeschockprotein oder ein immunstimulatorisches
Fragment davon und ein HPV-Antigen, das aus einem HPV-E7-Protein
oder einem antigenen Fragment davon besteht, umfasst, verwendet
werden kann, um eine Erkrankung oder einen Zustand zu behandeln,
die/der durch eine Infektion mit einem anderen HPV-Typ verursacht
wurde. Zum Beispiel war ein HPV-Typ 16-Antigen, das an ein bakterielles
Hitzeschockprotein (hsp) fusioniert wurde, wirksam im Behandeln
von menschlichen Anogenitalwarzen, die durch andere HPV-Typen als Typ
16 (z.B. die HPV-Typen 6 und 11) verursacht wurden. Dieses Ergebnis
unterstützt
zwei Behauptungen: (1) dass die Warzen mit einem HPV-Protein behandelt
werden können
und (2) dass therapeutische Mittel, die HPV gerichtet sind, keine
Protein-Antigene
von anderen HPV-Typen enthalten müssen, um allgemein wirksam
zu sein.
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Dementsprechend
zeigt die Erfindung die Verwendung eines Fusionsproteins, umfassend
(1) ein hsp oder ein immunstimulatorisches Fragment davon und (2)
ein HPV-Protein, wobei das HPV-Protein aus dem E7-Protein von z.B.
HPV-Typ 16 oder einem antigenen Fragment davon besteht, für die Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung einer Warze in einem Patienten.
Diese Komponenten können
hierin als „Komponente
(1)" beziehungsweise „Komponente
(2)" bezeichnet
werden. Das hsp (oder das immunstimulatorische Fragment davon) und
das HPV-Protein (oder das antigene Fragment davon) können einfach
im gleichen Präparat durch
Fusion kombiniert werden (d.h. man kann ein Fusionsprotein, das
die hierin beschriebenen Komponenten aufweist, oder ein Nucleinsäuremolekül, das sie
codiert, verwenden). Wenn fusioniert, würden Komponente (1) und Komponente
(2) geeignet sein, gleichzeitig verabreicht zu werden. Die oben
beschriebene Verwendung kann einen Schritt einschließen, in
dem ein Patient identifiziert wird, der eine Warze aufweist oder
bei dem vermutet wird, eine aufzuweisen (in dem Zusammenhang der
Behandlung des Patienten würde
die Identifizierung durchgeführt,
bevor die Verabreichung des Arzneimittels beginnt). Ärzte oder
andere Fachleute können
solche Patienten gut identifizieren.
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Die
Verwendungen der Erfindung sind auch geeignet, eine Warze zu verhindern,
wobei ein Patient, der die Warzen-Verhinderung wünscht oder der davon profitieren
würde (eher
als ein Patient, der schon eine Warze hat), identifiziert wird.
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Die
Erfindung zeigt auch Verwendungen eines Fusionsproteins, umfassend
(1) ein hsp oder ein immunstimulatorisches Fragment davon und (2)
ein Protein eines HPV eines zweiten Typs, in dem das Protein eines
HPV aus dem E7-Protein, z.B. Typ 16, oder einem antigenen Fragment
davon besteht, für
die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln eines Patienten,
der eine Erkrankung oder einen Zustand hat, die/der durch eine Infektion
mit einem HPV eines ersten Typs (z.B. Typ 5, 6, 11, 18, 31, 33,
35, 45, 54, 60 oder 70) verursacht wird.
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Das
heißt,
das HPV des „ersten
Typs" und das HPV
des „zweiten
Typs" sind verschieden
von einander; sie sind von zwei unterschiedlichen HPV-Typen. Das
hsp (oder das immunstimulatorische Fragment davon) und das HPV-Protein
(oder das antigene Fragment davon) können einfach durch Fusion im
gleichen Präparat
kombiniert werden (d.h. man kann ein Fusionsprotein verabreichen,
das die hierin beschriebenen Komponenten aufweist, oder ein Nucleinsäuremolekül, das sie
codiert). Wenn sie fusioniert sind, würden die Komponente (1) und
die Komponente (2) geeignet sein, gleichzeitig verabreicht zu werden.
Hier kann die Verwendung wieder einen Schritt einschließen, in
dem ein Patient identifiziert wird, der eine HPV-Infektion (oder eine Erkrankung oder
einen Zustand, die/der damit assoziiert ist) hat, oder bei dem vermutet
wird, sie zu haben.
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Wenn
einem Patienten, der mit einem ersten HPV-Typ infiziert ist, eine
Zusammensetzung gegeben wird, die ein HPV eines zweiten Typs einschließt, kann
die Verwendung ausgeführt
werden, bevor eine HPV-Infektion typisiert wird, bevor sie manifestiert
ist oder bevor sie erfolgt ist (d.h. man muss nicht den bestimmten HPV-Typ
kennen, mit dem ein Patient infiziert worden ist oder infiziert
werden wird, bevor die Behandlung oder Prophylaxe beginnen kann).
Wenn die Verwendungen vorbeugend sind, können sie einen Schritt einschließen, in
dem ein Patient identifiziert wird, der die Verhinderung einer HPV-Infektion
wünscht
oder der davon profitieren würde.
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Die
hierin beschriebenen Zusammensetzungen sind geeignet, in Mengen
verabreicht zu werden, die ausreichend sind, um die Warze zu behandeln
(durch zum Beispiel Reduzieren der Größe oder Verändern der Form der Warze oder
durch Bessern eines Symptoms, das mit einer Warze assoziiert ist
(z.B. der Schmerz, der oft mit einer Fußsohlenwarze assoziiert ist);
wenn ein Patient mehr als eine Warze hat, kann die Behandlung die
Reduzierung der Zahl der Warzen umspannen). In ähnlicher Weise sind die hierin
beschriebenen Zusammensetzungen geeignet, in Mengen verabreicht
zu werden, die ausreichend sind, um die Erkrankung (z.B. Krebs (wie
Gebärmutterhalskrebs
oder Analkrebs) oder den anderen Zustand (z.B. Dysplasie (wie cervicale oder
Analdysplasie)) zu behandeln, die/der durch eine HPV-Infektion verursacht
wird oder damit assoziiert ist. Obwohl Warzen oben getrennt erwähnt wurden,
stellen Warzen auch einen Zustand dar, der durch HPV verursacht
wird oder damit assoziiert ist. Ärzte
oder andere Fachleute werden eine wirksame „Behandlung" einer Warze oder
einer/eines HPV-assoziierten Erkrankung oder Zustands erkennen,
wenn es eine Abnahme einer unerwünschten
physiologischen Auswirkung gibt, die mit der Warze oder der Erkrankung
oder dem Zustand assoziiert ist. Die klinischen und physiologischen
Erscheinungsformen einer Warze so wie von jenen einer Erkrankung
oder eines Zustands, die/der mit einer HPV-Infektion assoziiert
ist, werden zum Beispiel in Fauci et al., Harrison's Principles of Internal
Medicine, 14. Aufl., McGraw-Hill Press, New York, S. 302–303 und 1098–1100, 1998
diskutiert.
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„Patienten", die von den hierin
beschriebenen Verfahren profitieren können, sind jene, die durch
Papillomaviren infiziert werden können (z.B. Säuger wie
Menschen, Nutztiere (z.B. Rinder, Pferde, Schweine, Schafe und Ziegen)
und Haustiere (z.B. Katzen und Hunde)). Die Warze kann eine sein,
die auf den Genitalien, der Haut oder inneren Organen auftritt (wie
die Warzen, die auf den Stimmbändern
in rezidivierender Atemwegspapillomatose auftreten (RRP; auch bekannt
als juvenile Kehlkopfpapillomatose (JLP) oder im Erwachsenenalter
auftretende RRP)).
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Die
Erfindung schließt
darüber
hinaus die Verwendung von einer oder mehreren der hierin beschriebenen
Zusammensetzungen (einschließlich
jenen, die Fusionsproteine oder die Nucleinsäuremoleküle, die sie codieren, enthalten)
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten ein,
der Warzen oder eine Erkrankung oder Zustände hat, die mit einer HPV-Infektion
assoziiert sind (oder dadurch verursacht werden), gemäß den hierin
beschriebenen Verfahren.
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Ein „antigenes
Fragment" eines
Proteins (z.B. eines HPV-Proteins) ist irgendein Teil des Proteins,
der, wenn er in der Form eines Arzneimittels gemäß den hierin beschriebenen
Verwendungen verabreicht wird, in einem Patienten eine Immunantwort
hervorruft, die entweder Fragment-spezifisch oder spezifisch für das Protein
ist, von dem das Fragment erhalten wurde. Die Immunantwort kann
entweder eine humorale oder eine Zell-vermittelte Antwort sein.
Zum Beispiel kann ein antigenes Fragment ein HLA-Klasse I-Peptidantigen,
wie unten beschrieben, sein. Ein Fachmann wird erkennen, dass die
Immunantwort, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
erwünscht
wird, nicht nur durch intakte Proteine und Fragmente davon hergestellt werden
kann, sondern auch durch mutierte Proteine (z.B. jene, die eine
oder mehrere Additionen, Substitutionen (z.B. konservative Aminosäure-Substitutionen)
oder Deletionen in ihrer Aminosäuresequenz
enthalten). Mutierte HPV-Antigene können leicht gemacht und auf
ihre Fähigkeit,
im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung zu funktionieren, getestet
werden.
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Ein „immunstimulatorisches
Fragment" eines
Proteins (z.B. eines hsp) ist irgendein Teil des Proteins, der,
wenn er in der Form eines Arzneimittels gemäß den hierin beschriebenen
Verwendungen verabreicht wird, eine Immunantwort durch ein Antigen
ermöglicht.
Wenn zum Beispiel die Immunantwort auf ein HPV-Protein ermöglicht wird,
wenn jenes HPV-Protein in der Form eines Arzneimittels mit (z.B.
fusioniert an) einem Fragment eines hsp verabreicht wird, ist jenes
Fragment ein immunstimulatorisches Fragment eines hsp. Ein Fachmann
wird erkennen, dass die Immunantwort auch durch mutierte hsps (z.B.
hsps, die eine oder mehrere Additionen, Substitutionen (z.B. konservative
Aminosäure-Substitutionen)
oder Deletionen in der Aminosäuresequenz
enthalten) ermöglicht
werden kann. Mutierte hsps können
leicht gemacht und auf ihre Fähigkeit,
eine Immunantwort auf ein HPV-Antigen
zu ermöglichen,
getestet werden.
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Die
Verwendungen der Erfindung liefern ein wirksames Mittel der: (1)
Behandlung oder Verhinderung von Warzen und (2) Behandlung oder
Verhinderung einer Erkrankung oder eines Zustands, der durch eine
Infektion mit einem HPV-Typ mit (d.h. unter Verwendung) einer Zusammensetzung,
die ein HPV-E7-Protein eines anderen Typs enthält, verursacht wird (oder damit
assoziiert ist). Folglich kann eine Zusammensetzung, die ein HPV-Antigen
enthält,
das aus einem HPV-E7-Protein besteht, in vielen, wenn nicht in den
meisten Patienten verwendet werden, unabhängig vom HPV-Typ, mit dem sie
infiziert sind (oder mit dem sie infiziert werden können). Es
ist überraschend,
dass HPV-Zusammensetzungen unter diesen Umständen (d.h. Umständen, die
eine Kreuzreaktivität
erfordern) wirksam sind. Es ist angenommen worden, dass HPV-Antigene
von einem Typ keine wirksame Immunantwort gegen einen anderen Typ
hervorrufen können.
Andere Eigenschaften oder Vorteile der vorliegenden Erfindung werden
durch die folgende, detaillierte Beschreibung und auch durch die Ansprüche offensichtlich.
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Detaillierte Beschreibung
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Die
Erfindung betrifft allgemein wirksame, auf HPV basierende therapeutische
Mittel, die ein hsp und ein HPV-Protein (z.B. ein Protein-Antigen)
umfassen, wobei das HPV-Protein aus einem HPV-E7-Protein besteht.
Ohne die Erfindung auf Verwendungen zu beschränken, in denen HPV-basierende
Therapeutika ihre Wirkung durch einen bestimmten Mechanismus ausüben, wird
von den Mitteln angenommen, dass sie eine Immunantwort produzieren,
die Warzen und andere Zustände
(z.B. Dysplasie) und Erkrankungen (z.B. Krebs), die mit HPV-Infektionen
assoziiert sind, zurückdrängt bzw.
verbessert. Zusammensetzungen, die ein HPV-E7-Protein von einem HPV-Typ enthalten,
sind nützlich
in der Behandlung oder Verhinderung von Warzen oder anderen HPV-assoziierten
Erkrankungen oder Zuständen,
die durch eine HPV-Infektion eines anderen (d.h. eines unterschiedlichen)
Typs verursacht werden. Verschiedene Materialien und Vorgehensweisen, die
für die
Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung geeignet sind, werden
unten diskutiert.
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Herstellung von Fusionsproteinen
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Die
Nucleinsäuresequenzen,
die hsps und HPV-Proteine codieren, sind bekannt und für Fachleute
erhältlich.
Daher können
Nucleinsäure-Konstrukte,
die Fusionspolypeptide codieren, die in den Verwendungen der Erfindung
nützlich
sind, leicht unter Verwendung von Routineverfahren hergestellt werden.
Beispiele von Nucleinsäuresequenzen,
die ein hsp codieren, das wahlweise an ein Antigen (z.B. ein HPV-Antigen)
fusioniert ist, können
in den Internationalen Veröffentlichungen
Nr. WO 89/12455, WO 94/29459, WO 98/23735 und WO 99/07860 gefunden
werden. Verfahren, durch die Proteine, einschließlich Fusionsproteine, exprimiert
und aufgereinigt werden können,
werden weiter unten diskutiert.
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Unabhängig von
der endgültigen
Konfiguration der Zusammensetzung, die für die Herstellung eines Arzneimittels,
das für
die Verabreichung geeignet ist, verwendet wird, können die
Komponente (1) und die Komponente (2) das Folgende einschließen.
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HPV-Protein-Antigene
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Jegliches
HPV-E7-Antigen ist geeignet für
die Verwendung in den Zusammensetzungen (z.B. den hierin beschriebenen
Fusionsproteinen) der vorliegenden Erfindung.
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Hsps
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Eine
Vielzahl von hsps sind von einer Ansammlung unterschiedlicher Organismen
isoliert, cloniert und charakterisiert worden (Mizzen, Biotherapy
10: 173–189,
1998; wie hierin verwendet, ist der Ausdruck „Hitzeschockprotein(e)" oder seine Abkürzung (hsps(s))
synonym mit oder umspannt Proteine(n), die als „Stressproteine" bezeichnet werden).
Immunstimulatorische hsps oder immunstimulatorische Fragmente davon
sind für die
Verwendung in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen geeignet
(z.B. als ein Teil eines Fusionspolypeptids). Hsp70, hsp60, hsp20–30 und
hsp10 sind unter den Hauptdeterminanten, die durch Wirts-Immunantworten
auf eine Infektion durch Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium
leprae erkannt werden. Zusätzlich
wurde gefunden, dass das hsp65 von Bacille Calmette Guerin (BCG),
einem Stamm von Mycobacterium bovis, ein wirksames immunstimulatorisches
Mittel ist, wie im Beispiel unten beschrieben.
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Die
Familien der hsp-Gene und hsps, wobei jedes davon, wie hierin beschrieben,
als die Komponente (1) verwendet werden kann, sind auf dem Fachgebiet
wohlbekannt. Diese schließen
zum Beispiel Hsp100–200,
Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBPs, Cyclophiline,
Hsp20–30,
ClpP, GrpE, Hsp10, Ubiquitin, Calnexin und Protein-Disulfid-Isomerasen
ein. Siehe z.B. Macario, Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:
59–70,
1995; Parsell et al., Rev. Genet. 27: 437–496, 1993; und US-Patent Nr.
5,232,833. Das hsp kann ein Säuger-,
bakterielles oder mycobakterielles hsp sein, ist aber nicht darauf
beschränkt.
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Grp170
(für Glucose-reguliertes
Protein) ist ein Beispiel eines hsp in der hsp100–200-Familie.
Grp170 befindet sich im Lumen des endoplasmatischen Retikulums im
prä-Golgi-Kompartiment
und kann eine Rolle in der Immunglobulin-Faltung und dem Immunglobulin-Zusammenbau
spielen.
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Beispiele
von hsps in der hsp100-Familie schließen das Säuger-Hsp110, das Hefe-Hsp104
und die E. coli-hsps ClpA, ClpB, ClpC, ClpX und ClpY ein.
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Beispiele
von hsps in der hsp90-Familie schließen HtpG in E. coli, Hsp83
und Hsc83 in Hefe und Hsp90alpha, Hsp90beta und Grp94 in Menschen
ein. Hsp90 bindet Gruppen von Proteinen, die typischerweise zelluläre, regulatorische
Moleküle
wie Steroidhormon-Rezeptoren (z.B. Glucocorticoid-, Östrogen-,
Progesteron- und Testosteron-Rezeptoren), Transkriptionsfaktoren
und Proteinkinasen sind, die eine Rolle in Signaltransduktions-Mechanismen
spielen. Hsp90-Proteine nehmen auch an der Bildung von großen, reichlich
vorhandenen Proteinkomplexen teil, die andere Stressproteine einschließen.
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Lon
ist eine tetramere ATP-abhängige
Protease, die nicht-natürliche
Proteine in E. coli degradiert.
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Beispiele
von hsps in der hsp70-Familie schließen Hsp72 und Hsc73 von Säugerzellen,
DnaK von Bakterien oder Mycobakterien wie Mycobacterium leprae,
Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis (wie Bacille-Calmette
Guerin; hierin als hsp71 bezeichnet), DnaK von E. coli, Hefe und
anderen Prokaryonten und BiP und Grp78 ein. Hsp70 ist zu spezifischer
Bindung von ATP so wie ungefalteten Polypeptiden und Peptiden in
der Lage; hsp70 nimmt an der Proteinfaltung und -Entfaltung so wie
am Zusammenbau und Abbau von Proteinkomplexen teil.
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Ein
Beispiel eines hsp aus der Hsp60-Familie ist Hsp65 von Mycobakterien.
Bakterielles Hsp60 ist allgemein auch als GroEL bekannt. Hsp60 bildet
große,
homo- oligomere Komplexe
und scheint eine Schlüsselrolle
in der Proteinfaltung zu spielen. Hsp60-Homologe sind in eukaryontischen
Mitochondrien und Chloroplasten vorhanden.
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Beispiele
von hsps in der TF55-Familie schließen TcpI, TRiC und Thermosom
ein. Diese Proteine treten typischerweise im Cytoplasma von Eukaryonten
und manchen Archaebakterien auf, und sie bilden vielgliedrige Ringe,
was die Proteinfaltung fördert.
Sie sind auch schwach homolog zu Hsp60.
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Beispiele
von hsps in der Hsp40-Familie schließen DnaJ von Prokaryonten wie
E. coli und Mycobakterien und HSJ1, HDJ1 und Hsp40 ein. Hsp40 spielt
unter anderen zellulären
Aktivitäten
als ein molekulares Chaperon in der Proteinfaltung, Wärmetoleranz
und DNA-Replikation eine Rolle.
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Beispiele
von FKBPs schließen
FKBP12, FKBP13, FKBP25 und FKBP59, FprI und NepI ein. Diese Proteine
weisen typischerweise eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität auf und
interagieren mit Immunsuppressoren wie FK506 und Rapamycin. Die
Proteine werden typischerweise im Cytoplasma und im endoplasmatischen
Retikulum gefunden.
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Beispiele
von Cyclophilinen schließen
die Cyclophiline A, B und C ein. Diese Proteine weisen eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität auf und
interagieren mit dem Immunsuppressor Cyclosporin A.
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Hsp20–30 wird
auch als kleines Hsp bezeichnet. Hsp20–30 wird typischerweise in
großen
homo-oligomeren Komplexen oder möglicherweise
hetero-oligomeren
Komplexen gefunden. Ein Organismus oder ein Zelltyp kann einige
unterschiedliche Typen von kleinen Hsps exprimieren. Hsp20–30 interagiert
mit Strukturen des Cytoskeletts und kann eine regulatorische Rolle
in der Polymerisierung/Entpolymerisierung von Aktin spielen. Hsp20–30 wird
bei Stress oder Aussetzen von ruhenden Zellen gegenüber Wachstumsfaktoren
schnell phosphoryliert. Hsp20–30-Homologe
schließen
alpha-Crystallin ein.
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ClpP
ist eine E. coli-Protease, die in den Abbau von abnormalen Proteinen
involviert ist. Homologe von ClpP werden in Chloroplasten gefunden.
ClpP bildet einen hetero-oligomeren Komplex mit ClpA.
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GrpE
ist ein E. coli-Protein von etwa 20 kDa, das in die Rettung von
Stress-geschädigten Proteinen
so wie den Abbau von beschädigten
Proteinen involviert ist. GrpE spielt eine Rolle in der Regulierung
der Stressgen-Expression in E. coli.
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Hsp10-Beispiele
schließen
GroES und Cpn10 ein. Hsp10 wird in E. coli und in den Mitochondrien
und Chloroplasten von eukaryontischen Zellen gefunden. Hsp10 bildet
einen siebengliedrigen Ring, der mit Hsp60-Oligomeren assoziiert.
Hsp10 ist auch in die Proteinfaltung involviert.
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Es
ist gefunden worden, dass Ubiquitin in Koordination mit der proteolytischen
Entfernung der Proteine durch ATP-abhängige cytosolische Proteasen
Proteine bindet.
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Die
Stress-Proteine, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
können
von Enterobakterien (z.B. E. coli), Mycobakterien (insbesondere
M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis und M. bovis),
Hefe, Drosophila, Wirbeltieren (z.B. Vögel oder Säuger wie Nager oder Primaten,
einschließlich
Menschen) erhalten werden.
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Protein-Expression
und -Aufreinigung
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Proteine
können
rekombinant produziert werden. Genauer können hsps (oder Fragmente davon)
und die HPV-E7-Antigene (oder Fragmente davon), die geeignet sind,
in Kombination als Fusionsproteine verabreicht zu werden, die die
Komponente (1) und die Komponente (2), die aus einem HPV-E7-Protein
oder einem antigenen Fragment davon besteht, enthalten, rekombinant
in Bakterien, Hefe, Pflanzen oder Pflanzenzellen oder Tieren oder
tierischen Zellen produziert werden. Zum Beispiel können hsps,
HPV-Antigene und Fusionsproteine, die sie enthalten, durch Transformation
(d.h. Transfektion, Transduktion oder Infektion) einer Wirtszelle
mit einer Nucleinsäuresequenz
in einem geeigneten Expressionsvehikel produziert werden. Geeignete Expressionsvehikel
schließen
Plasmide, virale Partikel und einen Phagen ein. Für Insektenzellen
sind Baculovirus-Expressionsvektoren geeignet. Das gesamte Expressionsvehikel
oder ein Teil davon kann in das Wirtszell-Genom integriert werden.
In machen Fällen
ist es wünschenswert,
einen induzierbaren Expressionsvektor, zum Beispiel das LACSWITCH® Inducible
Expression System (Stratagene; La Jolla, CA), anzuwenden.
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Fachleute
auf dem Gebiet der Molekularbiologie werden verstehen, dass jedes
einer breiten Vielfalt von Expressionssystemen verwendet werden
kann, um rekombinante Proteine (z.B. Fusionsproteine), die in den
hierin beschriebenen Verfahren nützlich
sind, zu liefern. Die genaue Wirtszelle und der genaue Vektor, die/der
verwendet wird, ist für
die Erfindung nicht entscheidend.
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Wie
oben erwähnt,
können
die Komponente (1), die Komponente (2) und Fusionsproteine, die
sie enthalten, durch Pflanzenzellen produziert werden. Für Pflanzenzellen
sind virale Expressionsvektoren (z.B. das Blumenkohl-Mosaikvirus
und das Tabak-Mosaikvirus) und Plasmid-Expressionsvektoren (z.B.
Ti-Plasmid) geeignet. Solche Zellen sind von einer breiten Auswahl
von Quellen (z.B. der American Type Culture Collection, Manassas,
VA; siehe auch z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons,
New York, 1994) erhältlich.
Die Verfahren der Transformierung und die Wahl des Expressionsvehikels
werden vom ausgewählten
Wirtssystem abhängen.
Transformierungsverfahren sind z.B. in Ausubel (vorstehend) beschrieben.
Die Expressionsvehikel können
aus jenen ausgewählt
werden, die in z.B. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory
Manual, 1985, Ergänz.
1987 geliefert werden.
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Die
Wirtszellen, die das Expressionsvehikel beherbergen, können in
konventionellen Nährmedien
gezüchtet
werden, die, wie benötigt,
für die
Aktivierung oder Unterdrückung
eines ausgewählten
Gens, die Selektion von Transformanten oder die Amplifikation eines
ausgewählten
Gens angepasst werden.
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Wo
es passend oder vorteilhaft ist, kann die Nucleinsäure, die
ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, eine Signalsequenz
für die
Absonderung des Fusionsproteins einschließen, um z.B. die Isolierung
des Proteins aus einer Zellkultur zu ermöglichen. Spezifische Startsignale
können
auch für
eine wirksame Translation der inserierten Nucleinsäuresequenzen
nötig sein.
Diese Signale schließen
das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen ein. In manchen Fällen müssen exogene
Translations-Kontrollsignale, einschließlich vielleicht des ATG-Startcodons,
geliefert werden. Darüber
hinaus muss das Startcodon phasengleich mit dem Leseraster der erwünschten
codierenden Sequenz sein, um die Translation der gesamten Insertion
sicherzustellen. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und
Startcodons können
von einer Vielzahl von Ursprüngen,
sowohl natürlicher
als auch synthetischer, stammen. Die Wirksamkeit der Expression kann
durch das Einschließen
von geeigneten Transkriptions- oder Translations-Enhancer-Elementen
(z.B. die in Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 516, 1987
offenbarten) verstärkt
werden.
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Komponente
(1), Komponente (2), wie hierin beschrieben, und Fusionsproteine,
die sie enthalten, können
unter normalen physiologischen Bedingungen löslich sein. Zusätzlich können solche
Fusionsproteine ein oder mehrere nicht-verwandte(s) (d.h. ein nicht-hsp,
nicht-HPV) Protein(e) (ganz oder zum Teil) einschließen, um
ein zu mindestens dreiteiliges Fusionsprotein zu bilden. Das „dritte" Protein kann eines
sein, dass die Aufreinigung, den Nachweis oder die Solubilisierung
des Fusionsproteins ermöglicht
oder das irgendeine andere Funktion liefert. Zum Beispiel kann der
Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791, 1983)
verwendet werden, um lacZ-Fusionsproteine zu bilden, und pGEX-Vektoren können verwendet
werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine zu exprimieren,
die die Glutathion-S-Transferase (GST) enthalten. Im Allgemeinen
sind solche Fusionsproteine löslich
und können
leicht von den lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarosekugeln,
gefolgt von Elution in der Anwesenheit von freiem Glutathion aufgereinigt
werden. Die pGEX-Vektoren sind gestaltet, um Thrombin- oder Faktor
Xa-Protease-Spaltungsstellen einzuschließen, so dass das clonierte
Zielgenprodukt von der GST-Einheit freigesetzt werden kann. Das „dritte" Protein kann auch
eine Immunglobulin Fc-Domäne
sein. Solch ein Fusionsprotein kann leicht unter Verwendung einer
Affinitätssäule aufgereinigt
werden. Natürlich
können
die Fusionsproteine, die in den Verwendungen der Erfindung nützlich sind,
mehr als eine Komponente (1) und/oder mehr als eine Komponente (2)
einschließen,
und die Komponenten (1) und (2) können direkt oder indirekt verknüpft sein
(z.B. ein oder mehrere Aminosäure-Rest können zwischen
ihnen vorhanden sein).
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Ein
Protein (z.B. ein hsp, ein HPV-Antigen oder ein hsp-enthaltendes
Fusionsprotein) kann durch Anwenden eines Antikörpers, an den das Protein spezifisch
bindet, aufgereinigt werden. Ein Fachmann kann affinitätsbasierende
Aufreinigungsverfahren verwendet, um Proteine aufzureinigen. Zum
Beispiel, siehe Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:
8972, 1981, für
die Aufreinigung von nicht-denaturierten Fusionsproteinen, die in
menschlichen Zelllinien exprimiert werden. In diesem System wird
das Gen von Interesse in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subcloniert, so
dass das offene Leseraster des Gens translationell an eine Amino-terminale
Markierung, die aus sechs Histidin-Resten besteht, fusioniert ist.
Extrakte von Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert
werden, werden auf Ni2+-Nitrilessigsäure-Agarosesäulen geladen,
und die Histidin-markierten Proteine werden selektiv mit Imidazol-enthaltenden
Puffern eluiert. Die selbe Vorgehensweise kann für eine bakterielle Kultur verwendet
werden.
-
Proteine,
einschließlich
Fusionsproteine (insbesondere jene, die kurze antigene Fragmente
enthalten), können
auch durch chemische Synthese produziert werden (z.B. durch die
Verfahren, die in Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., 1984
The Pierce Chemical Co., Rockford, IL beschrieben sind).
-
Sobald
sie isoliert sind, können
die Proteine, wenn erwünscht,
weiter aufgereinigt und/oder konzentriert werden, so lange die weitere
Verarbeitung nicht ihre Fähigkeit
beeinträchtigt,
eine Immunantwort hervorzurufen, die ausreichend ist, um in den
Verfahren der Erfindung wirksam zu sein. Eine Vielzahl von Verfahren zum
Aufreinigen und Konzentrieren von Proteinen sind auf dem Fachgebiet
wohlbekannt (siehe z.B. Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry
And Molecular Biology, Work und Burdon, Hrsg., Elsevier, 1980),
einschließlich
Ultrazentrifugation und/oder Präzipitation
(z.B. mit Ammoniumsulfat), Mikrofiltration (z.B. durch 0,45 μm-Celluloseacetat-Filter),
Ultrafiltration (z.B. mit der Verwendung einer Größeneinteilungs-Membran
und Rezirkulierungs-Filtration), Gelfiltration (z.B. Säulen, gefüllt mit
Sepharose CL-6B, CL-4B, CL-2B, 6B, 4B oder 2B, Sephacryl S-400 oder S-300, Superose
6 oder Ultrogel A2, A4 oder A6; alle erhältlich von Pharmacia Corp.), schnelle
Protein-Flüssigchromatographie
(FPLC) und Hochleistungs-Flüssigchromatographie
(HPLC).
-
Kreuzreaktive HPV-Sequenzen
-
Ein
Fachmann kann bestimmen, ob eine Zusammensetzung, die ein HPV-Antigen enthält, in dem
das Antigen ein HPV-E7-Protein oder ein antigenes Fragment davon
eines ersten Typs ist, für
die Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann, um einen
Patienten zu behandeln, der mit einem zweiten Typ von HPV infiziert
worden ist. Die Tests, auf denen solch eine Feststellung basieren
kann, schließen
vorhersagende Tests (z.B. jene, die Computermodelle ausnutzen) und
biologische Tests (in denen man tatsächlich auf Kreuzreaktivität testet)
ein. Ein oder beide Typen von Tests können verwendet werden (nicht überraschenderweise
würde man
erwarten, dass die Ergebnisse, die in einem vorhersagenden Test
erhalten wurden, weiter in einem biologischen Test getestet werden).
Beispiele von beiden folgen.
-
Man
kann unter Verwendung von gut etablierten immunologischen Verfahren
auf eine Kreuzreaktivität testen
(d.h. die Fähigkeit
einer Zusammensetzung, die ein HPV-Antigen eines Typs enthält, wobei
das Antigen ein HPV-E7-Protein ist, einen Patienten, der mit einem
HPV eines anderen Typs infiziert ist oder der eine Erkrankung oder
einen Zustand hat, die/der mit einem HPV eines anderen Typs assoziiert
ist, wirksam zu behandeln). Zum Beispiel können bi-transgene Mäuse, die
gentechnisch manipuliert wurden, um die Antigen-Bindungsregion des
menschlichen MHC-Klasse I-Moleküls
und des menschlichen CD8-Gens zu exprimieren (Lustgarten et al.,
Human Immunol. 52: 109, 1997; Vitiello et al., J. Exp. Med. 173:
1007, 1991), verwendet werden, um Immun-Kreuzreaktivität zu zeigen.
-
Genauer,
die HLA-A2/CD8-bi-transgene Maus (Lustgarten et al., vorstehend)
kann verwendet werden, um die Kreuzreaktivität von cytotoxischen T-Lymphocyten
(CTL), die gegen HPV16-E7 hervorgerufen wurden, mit Peptiden, die
vom E7-Protein von HPV6 und 11 abstammen, unter Verwendung von immunologischen Standardtechniken
(siehe z.B. Coligan et al., Hrsg., Current Protocols in Immunology,
John Wiley & Sons, 1999)
zu zeigen. Kurz, die Mäuse
werden ein- bis dreimal in Abständen
von sieben bis 21 Tagen mit dem HspE7-Fusionsprotein (basierend
auf den BCG-Hsp65- und HPV16-E7-Molekülen) immunisiert. HspE7 wird in
Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS) aufgelöst
und subcutan in einer Dosis im Bereich von 1 μg bis 1000 μg pro Maus verabreicht. Sieben
Tage nach der letzten Verabreichung von HspE7 werden die Mäuse getötet, ihre
Milzen entfernt und das Gewebe in eine Einzelzell-Suspension zerteilt.
CTLs, die spezifisch für
HPV-E7 sind, werden durch die Zugabe von HLA-A2-Bindungspeptiden,
die von HPV16-E7, HPV6-E7
und HPV11-E7 abgeleitet wurden, in einer Konzentration von 1 μM zum Kulturmedium
re-stimuliert. Die Zellen können
zum Beispiel in Platten mit 6 Vertiefungen, die ein unterschiedliches
Peptid in jeder Vertiefung haben, re-stimuliert werden. Die Peptide
(z.B. die zehn Peptide) mit der höchsten vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch
Computer-Algorithmus definiert, können für jedes von HPV16, HPV6 und
HPV11 verwendet werden (oder jeden anderen HPV-Typ; siehe Parker
et al., J. Immunol. 152: 163, 1994; der Algorithmus ist auch im Internet
durch die BIMAS (Bioinformatics & Molecular
Analysis Section)-Webseite der National Institutes of Health (Zugriff
am 26. Juni, 2001 unter http://bimas.dcrt.nih.gov/) verfügbar). Zusätzlich,
wo sie anders sind, würden
die entsprechenden Peptide von den anderen zwei HPV-Genotypen auch
verwendet werden (d.h. HPV16-E7-Peptid 11–20 und HPV6- und 11-Peptide
11–20).
-
Nach
einem Zeitraum (z.B. einer Woche) der Re-Stimulierung in vitro würde die
CTL-Aktivität
durch die Lyse von T2-Zielzellen, die mit HLA-A2-Bindungspeptiden, die von HPV16-E7,
HPV6-E7 und HPV11-E7 abgeleitet sind, gepulst wurden, gemessen werden.
Zusätzlich
können
Antigen-spezifische T-Lymphocyten, die
HLA-A2-Bindungspeptide erkennen, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7
abgeleitet wurden, durch ELISPOT-Analyse von IFN-γ-sezernierenden Zellen
unter Verwendung von kürzlich
beschriebenen Verfahren (Asal et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol.
7: 145, 2000) gemessen werden. Diese Analysen könnten in Mäusen, die für andere HLA-Allele transgen
sind, durchgeführt
werden.
-
Alternativ
kann man die Fähigkeit
von CTL messen, die durch Immunisierung mit HspE7 induziert werden,
mit Peptiden, die von HPV6- oder 11-E7-Proteinen abgeleitet wurden,
in menschlichen, HLA-A2-positiven Patienten, die sich einer Therapie
gegen Genitalwarzen unter Verwendung von HspE7 unterziehen, kreuzzureagieren.
Mononucleäre
periphere Blutzellen (PBMC) können
von Patienten (z.B. menschlichen Patienten) vor der Behandlung und
einige Tage (z.B. 7 Tage) nach jeder Behandlung mit HspE7 isoliert
werden. Die Zellen können
durch fluorogene MHC-Peptid-Komplexe (Tetramere, Altman et al.,
Science 274: 94, 1996) oder durch ELISPOT-Analyse (Asal et al.,
Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) analysiert werden. Die
Zellen können direkt
aus dem peripheren Blut und nach in vitro-Re-Stimulierung, wie von
Youde et al. (Cancer Res. 60: 365, 2000) beschrieben, getestet werden.
Für die
in vitro-Re-Stimulierung werden 2 × 106/ml
PBMC in RPMI1640 mit 10% menschlichem AB-Serum (RAB) und dem Peptid
in einer Konzentration von 10 μg/ml
kultiviert. Re-stimulierende Peptide würden von HPV16-E7 abgeleitet sein
und würden
die Peptide (z.B. die zehn Peptide) mit der höchsten vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch
Computer-Algorithmus definiert (Parker et al., vorstehend), umfassen.
Am Tag 4 wird 1 ml RAB, enthaltend 25 Einheiten/ml IL-2, zu jeder
Vertiefung zugefügt.
Am Tag 6 wird 1 ml Medium durch 1 ml Medium, enthaltend 10 Einheiten/ml
IL-2, ersetzt. Am Tag 7 werden bestrahlte autologe PBMC (frisch
oder tiefgefroren – dann
aufgetaut) zu 3 × 106 Zellen/ml in RAB, enthaltend 10 μg/ml Peptid
und 3 μg/ml β2-Mikroglobulin,
resuspendiert. Man läßt Antigen-präsentierende
Zellen für
zwei Stunden anhaften und sie werden dann gewaschen, um nicht-anhaftende
Zellen vor der Zugabe von 1–2 × 106 Effektorzellen/ml zu entfernen. Am Tag
9 wird ein ml RAB, enthaltend 25 Einheiten/ml IL-2, zu jeder Vertiefung
zugefügt.
Am Tag 13 werden die Inhalte der Vertiefungen auf mehrere Platten
verteilt, und das Medium (enthaltend 10 Einheiten/ml IL-2) wird
auf das ursprüngliche
Volumen zurück
gebracht. Die Zellen werden am Tag 14 verwendet. Für die FACS-Analyse
werden Tetramere, wie früher
beschrieben (Altman et al., Science 274: 94, 1996), hergestellt.
Die Peptide, die für
das Beladen der Tetramere verwendet werden, sind HLA-A2-Bindungspeptide,
die von dem E7-Molekül
von HPV16, HPV6 und HPV11 stammen. Die Peptide (z.B. die zehn Peptide)
mit der höchsten
vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch Computer-Algorithmus
definiert (Parker et al., vorstehend), werden für jedes von HPV16, HPV6 und
HPV11 verwendet. Zusätzlich,
wo verschieden, werden auch die entsprechenden Peptide von den anderen
zwei HPV-Genotypen verwendet (d.h. HPV16-E7-Peptid 11–20 und
HPV6- und 11-Peptide 11–20).
Frische oder re-stimulierte
PBMCs werden mit PE-markierten HPV-E7-Peptid-Tetrameren und FITC-markiertem anti-CD8-Antikörper gefärbt und durch
Durchflusscytometrie analysiert, wie es beschrieben worden ist.
ELISPOT-Analyse von Antigen-spezifischen T-Lymphocyten, die HLA-A2-Bindungspeptide
erkennen, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7 stammen, und in
frischen und re-stimulierten PBMC vorhanden sind, wird unter Verwendung
von früher
beschriebenen Verfahren (Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol.
7: 145, 2000) durchgeführt.
In ähnlicher
Weise können
diese Techniken auf Patienten mit anderen HLA-Haplotypen angewendet
werden.
-
Zusätzlich ist
es möglich,
die Fähigkeit
von menschlichen PBMC zu testen, die von HLA-A2-positiven, gesunden
Freiwilligen stammen, die nicht vorher mit HspE7 behandelt worden
sind, und die in vitro mit HspE7-Protein oder -Peptiden, die vom
HPV-Typ 16-E7 stammen, stimuliert worden sind, mit Zellen kreuzzureagieren,
die mit den entsprechenden Peptiden von den anderen zwei HPV-Genotypen
(6 und 11) gepulst wurden. Zellen werden unter Verwendung von Vorgehensweisen,
die auf dem Fachgebiet üblich
sind, stimuliert und getestet. Kurz, PBMC werden aus dem peripheren
Blut isoliert, adhärente
Zellen werden von nicht-adhärenten
Zellen getrennt, und die adhärenten
Zellen werden kultiviert, um dentritische Zellen (DC) herzustellen,
wie in Current Protocols in Immunology (Coligan et al., Hrsg., John
Wiley & Sons,
S. 7.32.7–8,
1999) beschrieben. Die nicht-adhärenten
Zellen werden in 90% FCS/10% DMSO für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt
im Test tiefgefroren.
-
Für die Stimulation
werden DC mit 50 μg/ml
HspE7 oder mit 40 μg/ml
des geeigneten Peptids und 3 μg/ml β2-Microglobulin
für 24
Stunden bei 37°C,
5% CO2 gepulst (Kawashima et al., Human
Immunol. 59: 1, 1998). Die verwendeten Peptide sind HLA-A2-Bindungspeptide,
die von dem E7-Molekül
von HPV16, HPV6 und HPV11 abstammen. Die Peptide (z.B. die zehn
Peptide) mit der höchsten
vorhergesagten HLA-A2-Bindungsaffinität, wie durch Computer-Algorithmus
definiert (Parker et al., vorstehend), werden für jedes von HPV16, HPV6 und
HPV11 verwendet. Zusätzlich,
wo verschieden, würden
auch die entsprechenden Peptide von den anderen zwei HPV-Genotypen
verwendet werden (d.h. HPV16-E7-Peptid 11–20 und HPV6- und 11-Peptide
11–20).
CD8+-Zellen werden von tiefgefrorenen, autologen,
nicht-adhärenten
Zellen durch positive Selektion unter Verwendung von immun-magnetischen
Kugeln (Miltenyi Biotec) isoliert. Peptid/Protein-beladene DC werden
bei 4200 rad bestrahlt und mit autologen CD8+-Zellen
in einem Verhältnis
von 1:20, z.B. in Platten mit 48 Vertiefungen, enthaltend 0,25 × 105 DC und 5 × 105 CD8+-Zellen und 10 ng/ml IL-7 in 0,5 ml RAB, gemischt.
An den Tagen 7 und 14 werden die Zellen mit autologen, Peptid-gepulsten,
adhärenten
APC re-stimuliert (Kawashima et al., Human Immunol. 59: 1, 1998).
Den Kulturen werden alle 2–3
Tage 10 E/ml hIL-2 zugesetzt. HPV-E7-Peptid-spezifische T-Lymphocyten
werden durch fluorogene MHC-Peptid-Komplexe (Tetramere, Altman et
al., Science 274: 94, 1996) oder durch ELISPOT-Analyse (Asal et
al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) nach 7 und 14 Tagen
der in vitro-Stimulierung analysiert. Für die FACS-Analyse werden Tetramere
hergestellt, wie früher
beschrieben (Altman et al., Science 274: 94, 1996). Die Peptide,
die für
das Beladen der Tetramere verwendet werden, würden HLA-A2-Bindungspeptide
sein, die vom E7-Molekül
von HPV16, HPV6 und HPV11 abstammen, wie oben beschrieben. Peptid-spezifische
T-Lymphocyten werden mit PE-markierten HPV-E7-Peptid-Tetrameren
und FITC-markiertem anti-CD8-Antikörper gefärbt und
durch Durchflusscytometrie analysiert (Youde et al., Cancer Res.
60: 365, 2000). ELISPOT-Analyse von Antigen-spezifischen T-Lymphocyten, die
HLA-A2-Bindungspeptide erkennen, die von HPV16-E7, HPV6-E7 und HPV11-E7
stammen, wird unter Verwendung von früher beschriebenen Verfahren
(Asal et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 145, 2000) durchgeführt. In ähnlicher
Weise könnten
diese Techniken auf Patienten mit anderen HLA-Haplotypen angewendet werden.
-
Verabreichung der Zusammensetzungen
-
Die
Erfindung schließt
ein Fusionsprotein ein, umfassend ein HPV-Protein-Antigen, wobei
das HPV-Protein-Antigen aus einem HPV-E7-Protein oder einem antigenen
Fragment davon und einem hsp (oder einem immunstimulatorischen Fragment
davon) besteht, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der hierin erwähnten Zustände. Gegebenenfalls
können
diese Proteine in einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie einem Verdünner (z.B.
PBS) oder einer Bicarbonat-Lösung
(z.B. 0,24 M NaHCO3) suspensiert sein. Nützliche
Träger
werden auf der Basis der Art und Weise und des Wegs der Verabreichung
und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt. Geeignete pharmazeutische
Träger
und Verdünner
sowie pharmazeutische Notwendigkeiten für ihre Verwendung sind in Remington's Pharmaceutical
Sciences beschrieben. Es können
auch ein Adjuvans, zum Beispiel ein Cholera-Toxin, Escherichia coli-hitzelabiles
Enterotoxin (LT), ein Liposom oder ein immunstimulierender Komplex
(ISCOM) eingeschlossen sein.
-
Das
(die) Protein(e) (z.B. das Fusionsprotein) muss (müssen) nicht
geeignet sein, direkt an den Patienten verabreicht zu werden. Stattdessen
ist eine Nucleinsäuresequenz,
die das Protein codiert, geeignet, verabreicht zu werden; das Protein
wird in dem Patienten in vivo exprimiert. Die Nucleinsäure kann
ein Teil eines Vektors (wie eines viralen Vektors, zum Beispiel
ein Teil eines viralen Vektor-Genoms)
oder zum Beispiel in Liposomen verkapselt sein. Alternativ ist die
Nucleinsäure
geeignet, als eine nackte Nucleinsäure abgegeben zu werden.
-
Die
Zusammensetzungen können
als eine Lösung,
eine Suspension, ein Suppositorium, eine Tablette, Granula, ein
Pulver, eine Kapsel, eine Salbe oder eine Creme formuliert sein.
Wie oben bemerkt, können
beim Herstellen dieser Zusammensetzungen ein oder mehrere pharmazeutische
Träger
eingeschlossen sein. Zusätzliche
Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Trägern oder anderen Zusätzen schließen Lösungsmittel (z.B.
Wasser oder physiologische Kochsalzlösung), solubilisierende Mittel
(z.B. Ethanol, Polysorbate oder Cremophor EL®),
Mittel zum Erbringen der Isotonie, Konservierungsmittel, Antioxidantien,
Excipienten (z.B. Lactose, Stärke,
kristalline Cellulose, Mannit, Maltose, Calciumhydrogenphosphat,
leichtes Kieselsäure-Anhydrid oder
Calciumcarbonat), Bindemittel (z.B. Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropyl-Cellulose,
Ethyl-Cellulose,
Carboxymethyl-Cellulose oder Gummi arabicum), Gleitmittel (z.B.
Magnesiumstearat, Talk oder gehärtete Öle) oder
Stabilisatoren (z.B. Lactose, Mannit, Maltose, Polysorbate, Makrogele
oder Polyoxyethylen-gehärtete
Castoröle)
ein. Wenn nötig
(oder erwünscht)
können
Glycerin, Dimethylacetamid, Natriumlactat, ein grenzflächenaktives
Mittel, Natriumhydroxid, Ethylendiamin, Ethanolamin, Natriumbicarbonat,
Arginin, Meglumin oder Trisaminomethan zugefügt werden. Biodegradierbare
Polymere wie poly-D,L-Lactid-co-glycolid oder Polyglycolid können als
eine Hauptmatrix verwendet werden, wenn eine langsame Freigabe der
Zusammensetzung erwünscht
wird (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,417,986, 4,675,381 und
4,450,150). Pharmazeutische Präparate
wie Lösungen,
Tabletten, Granula oder Kapseln können mit diesen Komponenten
gebildet werden. Wenn die Zusammensetzung oral verabreicht werden
soll, können
Geschmackstoffe und Farben zugefügt werden.
-
Die
therapeutischen Zusammensetzungen sind geeignet, auf irgendeinem
geeigneten Weg, zum Beispiel intravenös, intraarteriell, örtlich,
intraperitoneal, intrapleural, oral, subcutan, intramusculär, intradermal, sublingual,
intraepidermal, nasal, intrapulmonal (z.B. durch Inhalation), vaginal
oder rektal verabreicht zu werden.
-
Die
Menge der verabreichten Zusammensetzung wird zum Beispiel von der
bestimmten Zusammensetzung, ob ein Adjuvans zusammen mit der Zusammensetzung
verabreicht wird, dem Typ des zusammen verabreichten Adjuvans, der
Art und Weise und der Frequenz der Verabreichung und der erwünschten
Wirkung (z.B. Schutz oder Behandlung) abhängen. Dosierungen werden routinemäßig durch
Fachleute im Verlauf der Entwicklung von Arzneistoffen oder prophylaktischen
Mitteln bestimmt. Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung geeignet, in Mengen im Bereich zwischen 1 μg und 100
mg pro Dosis für
einen erwachsenen Menschen verabreicht zu werden. Wenn Adjuvantien
mit den Zusammensetzungen verabreicht werden, können im Allgemeinen Mengen
im Bereich zwischen 1 ng und 1 mg pro Dosis für einen erwachsenen Menschen
verwendet werden. Die Verabreichung wird, wenn nötig, wiederholt, was durch
einen Fachmann bestimmt werden kann. Zum Beispiel können auf
eine Grunddosierung drei Auffrischungs-Dosierungen in wöchentlichen
oder monatlichen Abständen
folgen. Eine Auffrischungs-Impfung kann drei bis zwölf Wochen
nach der ersten Verabreichung gegeben werden, und eine zweite Auffrischung
kann drei bis zwölf
Wochen später
unter Verwendung des selben Präparats
gegeben werden. Serum oder T-Zellen können von dem Patienten für das Testen
der Immunantwort genommen werden, die durch die Zusammensetzung
gegen das HPV-Antigen, das zum Beispiel in dem Fusionsprotein oder
Protein-Konjugat
eingeschlossen ist, hervorgerufen wird. Verfahren zum Testen von
Antikörpern
oder cytotoxischen T-Zellen gegen ein spezifisches Antigen sind
auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zusätzliche Auffrischungen können, wenn
nötig,
gegeben werden. Durch Variieren der Menge zum Beispiel des Fusionsproteins
in der Zusammensetzung kann das Immunisierungsprotokoll für das Hervorrufen
einer maximalen Immunantwort optimiert werden.
-
Natürlich sind
die hierin beschriebenen Proteine auch geeignet, durch Verabreichen
einer Nucleinsäure
wie eines viralen Vektors (z.B. eines retroviralen oder adenoviralen
Vektors) abgegeben zu werden.
-
Ohne
weitere ausführliche
Darstellung wird angenommen, dass ein Fachmann basierend auf der
obigen Offenbarung und den Beispielen unten die vorliegende Erfindung
in ihrem vollsten Ausmaß ausnutzen kann.
-
BEISPIEL
-
Ein
Fusionspolypeptid, enthaltend das M. bovis-BCG Hsp65, gekoppelt
an das E7-Protein des HPV-Typ 16, wurde rekombinant produziert und,
wie in WO 99/07860 beschrieben, formuliert. Hsp65 ist ein Mitglied
der Hsp60-Familie von Stress-Proteinen.
Im Verlauf eines menschlichen klinischen Versuchs zum Testen der
Wirksamkeit dieses Fusionspolypeptids bei der Behandlung von analen
hochgradigen schuppenartigen intraepithelialen Läsionen (HSIL) wurde die folgende
Beobachtung gemacht.
-
22
Patienten nahmen an einem randomisierten, Placebo-kontrollierten,
multizentrischen Doppelblindversuch von HspE7 bei der Behandlung
von analer HSIL teil. Geeignete Patienten hatten eine durch Biopsie bestätigte anale
HSIL und waren negativ für
das menschliche Immunschwächevirus
(HIV). Die Patienten wurden unter Verwendung von Zellen, die von
einem Anal-Abstrich erhalten wurden, auf HPV typisiert, mussten aber
nicht HPV-16 haben. Individuelle Läsionen wurden nicht auf HPV
typisiert. Die Patienten erhielten drei subcutane Injektionen von
entweder 100 μg
HpsE7 oder Placebo in monatlichen Abständen. Sie wurden durch anale
Abstriche, hoch-auflösende
Anoskopie (HRA) mit Biopsie und allgemeiner ärztlicher Bewertung auf die Behandlungs-Antwort
beurteilt. Patienten, die nach 12 oder 24 Wochen im kontrollierten
Versuch nicht antworteten (d.h. jene mit persistierender analer
HSIL), wurde erlaubt, in einen Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung überzuwechseln,
wo sie drei Injektionen von 500 μg
HspE7 in monatlichen Abständen
erhielten. Die Behandlungszuteilung unterlag im Placebo-kontrollierten Versuch
einer Doppelblindheit, und der Blindversuch ist nicht aufgedeckt
worden.
-
Um
den (die) HPV-Typ(en), der (die) Patienten infiziert (infizieren),
zu bestimmen, wurde ein Dacron-Abstrich verwendet, um Proben vom
Anus der Patienten beim Screening-Besuch des randomisierten, Placebo-kontrollierten
Versuchs gerade vor der Biopsie zu sammeln. Nach dem Transport in
Sample Transport Medium (Digene) wurde DNA isoliert und verwendet,
um den HPV-Typ zu bestimmen. Kurz, der Konsens-Primersatz MY09/MY11
wurde verwendet, um die HPV-DNA durch Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) zu amplifizieren. Nach dem Amplifizierungsschritt wurden die
Proben auf eine Nylonmembran geblottet und mit Biotin-markierten
Oligonucleotiden, die für
29 verschiedene HPV-Typen spezifisch waren (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32,
33, 35, 39, 40, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 66, 68,
69, 70, 73, AE2, Pap155 und Pap291), und einer gepoolten Sonde,
die Primer für
10 HPV-Typen (2, 13, 34, 42, 57, 62, 64, 67, 72 und W13B) enthielt, sondiert.
Proben, die einen „Dot-Blot" produzierten, wurden
durch Vergleich mit standardisierten Kontrollen unter Verwendung
einer 5-Punkt-Skala als positiv oder negativ für den HPV-Typ bewertet; eine
Bewertung von 1 oder mehr war positiv.
-
Um
zu bestätigen,
dass die PCR erfolgreich war, wurde eine beta-Globin-Kontrollamplifikation
und ein Sondennachweis für
jede Probe durchgeführt.
Wenn die Probe nicht positiv für
die Anwesenheit von beta-Globin war, wurde der PCR-Schritt als ein
technisches Versagen angesehen. Wenn die Konsensus-Sonde nicht in
einer Bewertung von 2 oder mehr resultierte, wurde die Probe als „HPV-negativ" angesehen.
-
Zum
Zeitpunkt ihres Eintretens in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung
hatten 14 der 22 Patienten (64%) Anogenitalwarzen, die durch den
vorherigen Doppelblindversuch persistierten, in dem sie drei monatliche
Injektionen von entweder 100 μg
HspE7 oder Placebo erhielten. Von diesen 14 Patienten trat bei acht
Patienten (57%) eine Verschlechterung ein, 4 Patienten (29%) zeigten
keine Änderung
und bei zwei Patienten (14%) trat eine Verbesserung ein (bei einem
dramatisch und bei dem anderen minimal) zum Zeitpunkt, als sie zum
Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung überwechselten. Ein zusätzlicher
Patient wies ein Kondylom am Beginn des Doppelblindversuches auf,
das sich vor dem Beginn des Versuches mit offen gelegter Kennzeichnung
auflöste,
und wurde von dieser Analyse ausgelassen, so wie die sieben anderen
Patienten, die während
der beiden Versuchen keine nachweisbaren Warzen aufwiesen. Kondylomen
waren im Anorektalkanal in allen 14 Patienten (100%) und auch auf
der perianalen Haut in sechs von 14 Patienten (43%) vorhanden. Von
den 14 Patienten mit Warzen am Beginn des Versuchs mit offen gelegter
Kennzeichnung bestimmte der Untersucher vor Ort, dass für elf (79%)
Patienten eine chirurgische Entfernung nötig war, lokale Entfernung
(z.B. flüssiger
Stickstoff, Elektro-Versengen) war für zwei Patienten (14%) nötig, und örtliche
Behandlung (z.B. Imiquimod) war für einen Patienten (7%) nötig. Diese
Patienten wählten,
die vom Untersucher vor Ort empfohlene Behandlung zu verschieben,
und stimmten zu, an deren Stelle drei Injektionen von HspE7, 500 μg in monatlichen
Abständen,
im Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung zu erhalten.
-
Einen
Monat nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7 hatten zwei Patienten
(14%) keine nachweisbaren Warzen, elf Patienten (79%) hatten eine
Reduzierung der Größe oder
Zahl der Warzen im Vergleich zu ihrem Zustand beim Eintreten in
den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung, und ein Patient (7%)
erfuhr eine Steigerung der Warzengröße (Tabelle 1). Zum Zeitpunkt
des ersten Bewertungspunkts des Versuchs mit offen gelegter Kennzeichnung
(vier Monate nach der letzten Dosis) erfuhr ein zusätzlicher
Patient eine Verbesserung von teilweiser zu vollständiger Antwort
(d.h. keine sichtbaren Warzen), was insgesamt drei (21%) Patienten,
die eine vollständige
Antwort zeigten, ergibt (Tabelle 1). Keiner dieser Patienten, die
eine Antwort zeigten, zeigte während
der sechs Monate der Bewertung im Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung
Rezidive. Zehn Patienten (71%) fuhren fort, eine Verbesserung der
teilweisen Antwort (d.h. Warzen, die sich signifikant weiter verkleinerten,
mit fortgesetzter Abnahme des Ausmaßes der benötigten Behandlung, um die verbleibenden
Warzen zu entfernen) zu zeigen. Der eine Patient, der keine Antwort
zeigte (7%), zeigte bis zum Ende des Versuchs mit offen gelegter
Kennzeichnung keine Verbesserung. TABELLE
1 Zusammenfassung
der Antwort für
Anogenitalwarzen nach einer Behandlung mit HspE7
- * Einen Monat nach der letzten Behandlung
mit 500 μg
HspE7.
- † Vier
Monate nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.
-
Am
Ende des Versuchs empfahl der Untersucher vor Ort keine weitere
Behandlung für
die drei Patienten, die eine vollständige Antwort zeigten. Wie
in Tabelle 2 aufgelistet, war die vom Untersucher vor Ort empfohlene
Behandlung vor die Patienten, die eine teilweise Antwort zeigten,
eine entfernende Therapie (6 von 14, 43%) oder eine Behandlung mit
einem örtlichen
Mittel (4 von 14, 29%); zusätzliche
Chirurgie wurde für
den Patienten, die keine Antwort zeigten, empfohlen (1 von 14, 7%).
Alle 22 Patienten traten in ein registriertes Protokoll für ein Langzeit-Verfolgen ihrer Antwort
ein, und sie stimmten zu, die vom Untersucher empfohlene Behandlung
zu verschieben. TABELLE
2 Beurteilungen
der Anogenitalwarzen-Antwort und die vom Kliniker empfohlene Behandlung
- * Grundlinie bezieht sich auf den Beginn
des Versuchs mit offen gelegter Kennzeichnung.
- † Einen
Monat nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.
- ‡ Vier
Monate nach der letzen Behandlung mit 500 μg HspE7.
- Abkürzungen:
CR = Patienten mit vollständiger
Antwort; PR = Patienten mit teilweiser Antwort
-
Bei
allen 14 Patienten, die mit Anogenitalwarzen diagnostiziert wurden,
wurde HPV-DNA von mehreren HPV-Typen in den Anal-Abstrichproben
während
der Durchmusterung für
den ersten randomisierten, kontrollierten Versuch nachgewiesen (Tabelle
3). HPV-6 und/oder 11 waren in 12 Patienten (86%) vorhanden. Ein Patient
hatte nur HPV-16 und verwandte Typen, und ein anderer Patient konnte
nicht typisiert werden. Drei der 14 Patienten (21%) waren positiv
für HPV-16.
Die meisten Patienten, deren Warzen sich verbesserten (11 von 13,
85%), hatten nicht HPV-16. Der Patient, der keine Antwort zeigte,
hatte auch nicht HPV-16 (siehe Tabelle 3). TABELLE
3 HPV-Typen
in Patienten mit Anogenitalwarzen
- * Durchmusterungs-Besuch bei dem randomisierten,
Placebo-kontrollierten klinischen Versuch.
- † Vier
Monate nach der letzten Behandlung mit 500 μg HspE7.
- Abkürzungen:
HPV = menschliches Papillomavirus; CR = vollständige Antwort; PR = teilweise
Antwort
-
In
diesem Übertreter-Versuch
mit offen gelegter Kennzeichnung von HspE7 (500 μg in drei monatlichen Abständen), der
Patienten mit persistierender analer HSIL und begleitenden Anogenitalwarzen
involviert, hatten drei der 14 Patienten (17%), die Warzen an der
Grundlinie aufwiesen, vier Monate nach der letzten Dosis keine Warzen
mehr. Weitere zehn Patienten (71%) erfuhren eine Verbesserung ihrer
Symptome (d.h. Warzen, die signifikant verkleinert waren, und eine
fortgesetzte Abnahme des Ausmaßes
der benötigten
Behandlung, um die verbleibenden Warzen zu entfernen). Ein Patient
(7%) verbesserte sich im Verlauf des Versuchs nicht, und eine zusätzliche
Operation wurde durch den Untersucher vor Ort empfohlen.
-
Vor
dem Einschreiben in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung
würden
sich die meisten Patienten bei diesem Versuch einem chirurgischen
Eingriff für
die Entfernung ihrer Warzen unterzogen haben (elf von 14, 79%).
Am Ende des Versuchs wurde die chirurgische Behandlung nur für einen
Patienten empfohlen. Lokale entfernende Therapie (z.B. flüssiger Stickstoff,
Elektro-Versengen) wurde für
sechs Patienten (43%) empfohlen, und Behandlung mit einem örtlichen
Mittel (z.B. Imiquimod) wurde für
vier Patienten (29%) empfohlen. Drei Patienten benötigten keine
weitere Behandlung.
-
Die
Antworten schienen über
6 Monate fortschreitend zu sein, und kein Patient mit einer Antwort
zeigte in diesem Zeitraum Rezidive. Graduelle und fortschreitende
Auflösung
eines Kondyloms ist in Übereinstimmung
damit, was man von einer immunologischen Wirt-Antwort nach der Induktion
von Zell-vermittelter Immunität
durch HspE7 erwarten würde.
-
Zwei
Patienten im Doppelblindversuch hatten eine gewisse Verbesserung
in ihrem Kondylom, bevor sie in den Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung
eintraten. Bis jetzt haben wir den Blindversuch nicht aufgedeckt
und wissen nicht, ob diese Patienten 100 μg HspE7 oder ein Placebo erhielten.
Basierend auf der Antwort, die im Versuch mit offen gelegter Kennzeichnung
von drei monatlichen Injektionen von 500 μg HspE7 beobachtet wurde, scheint
es jedoch, dass die höhere
Dosis aktiver ist als 100 μg.
-
HPV-16-DNA
wurde in Analabstrich-Proben von nur drei der 13 Patienten (23%),
deren Warzen sich nach der Behandlung mit HspE7 besserten, nachgewiesen.
DNA von HPV-6, HPV-11 oder beiden wurde in den meisten der Patienten
nachgewiesen, deren Warzen auf die Behandlung mit HspE7 ansprachen.
Diese Daten legen nahe, dass es eine immunologische Kreuzreaktivität zwischen
diesen HPV-Typen in ihrer Antwort auf HspE7 gibt.
-
Zusammengefasst
legen die hier dargelegten Ergebnisse nahe, dass HspE7 in Anogenitalwarzen
allgemein aktiv ist. Diese Aktivität scheint nicht auf HPV-16-positive Patienten
beschränkt
zu sein, sondern es gibt eine Kreuzaktivität bei mehreren HPV-Typen. Es
wird vorhergesagt, dass HspE7 in der Behandlung von HPV-induzierten
Erkrankungen der anogenitalen Region aktiv sein wird und dass diese
Aktivität
nicht auf HPV-16-positive Patienten limitiert sein wird.
-
Die
hier berichteten Beobachtungen legen nahe, dass eine therapeutische
Behandlung mit HspE7 eine neue, einfache und nicht-chirurgische
Behandlung für
Anogenitalwarzen darstellen kann, die mindestens die Warzen-Belastung
verringern würde,
wodurch das Ausmaß der
Behandlung und die resultierende Morbidität reduziert werden. Eine innere
anorektale Erkrankung erfordert oft eine zusätzliche Behandlung, die ziemliche
schmerzhaft und schwächend
sein kann. Jegliche Behandlung, die sogar eine teilweise Antwort
liefert, die die Menge oder das Ausmaß der „chirurgischen" oder entfernenden
Therapie reduziert oder eliminiert, überträgt sich auf eine Reduktion
der Morbidität,
einen geringeren Verlust der Zeit weg von der Arbeit und eine verbesserte
Lebensqualität.
-
Diese
Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Hitzeschockprotein/HPV-Typ
16-Antigen-Zusammensetzung wirksam im Eliminieren oder Reduzieren
von Warzen ist, von denen angenommen wird, dass sie vorwiegend durch
die HPV-Typen 6 und 11 verursacht werden. Von signifikanter Wichtigkeit
sind die Beobachtungen, dass (1) Warzen überhaupt mit einer auf HPV
basierenden Zusammensetzung behandelt werden können, und (2) eine HPV-Typ
16-Zusammensetzung wirksam in der Behandlung eines Zustands, der
mutmaßlich durch
ein anderes HPV als Typ 16 verursacht wurde, war. Das letztere kreuzreaktive
Ergebnis war völlig
unerwartet, angesichts der allgemein festgehaltenen Annahme, dass
eine Typ-spezifische Zusammensetzung nur eine Typ-spezifische Immunantwort
hervorrufen könnte.
-
Um
einen möglichen
Mechanismus für
die beobachtete Kreuzreaktivität
des Fusions-Polypeptids herauszufinden, wurde die theoretische Bindung
für verschiedene
HLA-Klasse 1-Moleküle
und E7-Peptide der HPV-Typen 16, 6 und 11 berechnet. Die T1/2 der Dissoziation wurde unter Verwendung
des in Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994 beschriebenen Algorithmus
berechnet (siehe auch die oben beschriebene Webseite). Die Daten
sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
-
-
-
-
-
Die
fett-gedruckten Peptidsequenzen weisen auf die zwei Spitzenbindesequenzen
für jedes
HLA-Molekül
und für
jedes E7-Protein von jedem HPV-Typ hin.
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 4 legen nahe, dass abhängig vom untersuchten spezifischen
HLA-Molekül das
HPV-Typ 16-E7-Antigen eine Zell-vermittelte Immunantwort gegen das
E7-Antigen von anderen HPV-Typen auslösen kann. Zum Beispiel wurde
für HLA-B-2705
eine hoher Grad der Bindung für
die Peptide, startend bei Aminosäureposition
76 von E7, für
alle drei HPV-Typen vorhergesagt. Daher ist es für Patienten, die dieses HLA-Molekül exprimieren,
möglich,
dass eine HPV-Typ 16-E7-Zusammensetzung kreuzreaktiv und nützlich für die Behandlung
oder Verhinderung einer Infektion durch die HPV-Typen 6 und 11 sein
würde.
Jedes der fett-gedruckten Peptid-Fragmente in Tabelle 4 repräsentiert
ein mögliches
antigenes Fragment, das in die Zusammensetzungen (z.B. die hierin
beschriebenen Fusionspolypeptide) als ein Ersatz für das vollständige virale E7-Antigen
eingeschlossen werden kann. Natürlich
können
auch zwei oder mehrere solcher mutmaßlichen HLA-Epitope oder ein
langes Fragment, das viele mutmaßliche HLA-Epitope enthält, verwendet werden.