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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein verändertes Konstrukt für einen
konstitutiv aktiven Aryl-Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR), ein CA-AhR
exprimierendes transgenes nicht-menschliches
Tier und ein Tiermodell zum Studium der molekularen Mechanismen
von Krebs, besonders Magenkrebs. Die Erfindung betrifft auch Verfahren
zum Durchmustern und/oder Untersuchen von karzinogenen und anti-karzinogenen
Verbindungen, das Durchmustern und/oder Untersuchen von Arzneimittel-Anwärtern als
auch von Verbindungen, die beim Verwenden dieses Verfahrens entdeckt
oder entwickelt wurden.
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Hintergrund
zur Erfindung
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Der
Dioxin/Aryl-Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) gehört zu einer
speziellen Klasse von Transkriptionsfaktoren, einfachen Helix-Schleife-Helix/Per-Arnt-Sim-Domänen (bHLH/PAS)-Proteinen, aus denen
eine wichtige Reihe von regulatorischen Faktoren, die sich anscheinend
entwickelten, um auf Umweltsignale zu reagieren, hervorgeht. Andere
Mitglieder dieser Familie schließen den durch Hypoxie induzierbaren
Faktor HIF-1α,
dass die Rhythmik regulierende Protein Clock, das neuroregulatorische Protein
Sim und Arnt, einen essentieller Partnerfaktor für alle oben genannten Faktoren,
einschließlich
des AhRs, ein (1). Arnt wird auf eine ligandenabhängige Art
und Weise vom AhR angebunden, um die Erkennung von xenobiotischen
Reaktionselementen des Zielpromotors zu erleichtern.
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Das
durch Liganden aktivierte AhR vermittelt die Aktivierung der Transkription
eines Netzwerkes von Genen, die für Enzyme, wie z.B. CYP1A1, CYP1A2,
die Glutathion-S-Transferase Ya, die UDP-Glucuronosyl-Transferase
1A6 und die NAD(P)H-Chinon-Oxidoreduktase-1,
die im oxidativen Metabolismus von Xenobioten wirken, kodieren (2).
Gut charakterisierte Liganden des AhRs sind polyzyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe, die sich im Laufe von Verbrennungsprozessen
bilden, und polychlorierte Dioxine und coplanare Biphenyle, die industrielle
Chemikalien und die Umwelt kontaminieren (2). Daher stellen AhR-vermittelte
Signalwege eine erste Verteidigungslinie gegen mögliche toxische Umweltschadstoffe
dar. Andererseits kann das Auslösen
von oxidativen metabolischen Prozessen durch AhR auch die Produktion
von hochgradig karzinogenen Metaboliten verursachen, was eine starke Verbindung
zwischen der AhR-Aktivierung und der chemischen Karzinogenese schafft
(3). Zusätzlich scheint
der Rezeptor durch bisher unklare Mechanismen einen großen Bereich
von toxischen Wirkungen, einschließlich Geburtsfehler, beeinträchtigte
Reproduktionsfähigkeit
und Immunsuppression durch chlorinierte Dioxine zu vermitteln (1).
Eine Anzahl von durch Genzerstörung
in Mäusen
durchgeführten
unabhängigen
Studien zum Funktionsverlust haben keine schlüssigen Informationen im Bezug
auf eine mögliche
Entwicklungsrolle des Rezeptors ergeben (4–7). Im Hinblick auf seine
kritische Rolle bei der Vermittlung von metabolischen Reaktionen
auf Umweltschadstoffe könnte
die einzige biologische Funktion des AhRs daher auf die Regulation
von adaptiven Reaktionen bei Xenobioten begrenzt sein. Diese Ansicht
scheint durch die Tatsache bestätigt
zu werden, dass es noch übrig
bleibt eine vermeintliche physiologische Funktion des AhRs zu bestimmen. Auf
Grundlage dieses Hintergrundes haben die Erfinder eine Studie zum
Hinzugewinnen von Funktionen (gain-of-function study) durchgeführt, um
mögliche biologische
Funktionen des AhR-Systems zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde
eine konstitutiv aktive AhR-Variante (CA-AhR) erzeugt und in transgenen
Mäusen
exprimiert, um mögliche
durch AhR-vermittelte
biologische Wirkungen zu studieren, die in Abwesenheit jeglicher
Einwirkung durch Umweltkontaminanten generiert werden.
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Stand der Technik
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U.S.
5,378,822 offenbart rekombinante DNA Moleküle, die für murine und menschliche AhR-Rezeptoren
kodieren, die zur Erzeugung großer
Mengen des AhR-Rezeptorproteins zur Verwendung in kompetitiven Bindungsassays,
die zum Detektieren von Umweltschadstoffen oder zum Regulieren der Genexpression
in Reaktion auf Rezeptoragonisten verwendet werden, erzeugt werden.
Eine andere Verwendung ist die Erzeugung von rekombinanten Organismen,
die zur biologischen Überwachung
von Umweltschadstoff oder zum Detektieren von menschlichen und wildlebenden
Populationen, die eine hohe Anfälligkeit
für Umweltschadstoffe
aufweisen, dienen. U.S. 5,650,283 offenbart Säugetierzellen, die AhR konstitutiv
exprimieren, zum Studium von Schadstoffen. Es wird darin vorgeschlagen,
AhR in der ligandenbindenden Region zu verändern. Das Dokument "Breast Cancer Research
and Treatment", Vol.
63, 2000, S.117–131
diskutiert die Beteiligung der konstitutiven Expression von AhR
am Tumorzellwachstum.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung macht ein wirksames Werkzeug zum Studium von
Krebs, das auf einem neuen Expressionskonstrukt für einen
konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor CA-AhR basiert, zugänglich.
Die Erfindung umfasst weiterhin transgene nicht-menschliche Tiere,
bevorzugt Säugetiere,
die CA-AhR in einem oder mehreren Geweben exprimieren. Ein Tiermodell,
das auf diesen transgenen nicht-menschlichen Tieren aufbaut, bildet die
Grundlage für
neue Verfahren, z.B. für
das Studium von Krebs; für
das Durchmustern von Verbindungen, wie z.B. Arzneimittel-Anwärtern; für die Untersuchung
von molekularen Mechanismen von Krebs, besonders Magenkrebs; für die Untersuchung
der Mechanismen von hochgradig differenzierten Adenokarzinomen etc.
Es wird gleichfalls ein in vitro-Modell offenbart, das auf transformierten
Zellen oder Zelllinien, die das erfinderische Konstrukt funktionell
enthalten, basiert.
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Die
Erfindung wird in der Beschreibung, den Beispielen und den angehängten Ansprüchen, die hiermit
in ihrer Gänze
aufgenommen werden, weiter definiert.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Erfindung wird in der unten stehenden Beschreibung und den Beispielen
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen detailliert beschrieben, wobei
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1 die
konstitutive Aktivität
von CA-AhR zeigt. (A) Schematische Darstellung der Wildtypmaus AhR
(mAhR) und von CA-AhR. (B)Funktionelle Aktivität von CA-AhR in CHO-Zellen.
Die Zellen werden mit einem AhR-abhängigen Luziferase-Reportergen und Expressionsvektoren,
die für
Arnt, Wildtyp AhR oder CA-AhR kodieren, transient transfiziert.
Die Kontrollbahnen (Ctrl) stellen die Aktivität des Reportergens alleine
und des leeren Expressionsplasmids dar. Die Daten stammen von einem
Experiment, das zweimal durchgeführt
wurde, und sind für
wenigstens drei unabhängige
Experimente charakteristisch. (C) Die Detektion der AhR- und CA-AhR-Proteine, die nach
der transienten Transfektion der CHO-Zellen exprimiert wurden. Zellvollextrakte
wurden durch Immun- Blotting
mittels Anti-AhR-Antikörpern
analysiert. Der Stern zeigt eine nicht spezifische Immunoreaktivität an. (D)
Expression und funktionale Aktivität von CA-AhR in acht Monate
alten weiblichen Mäusen. RNA-Blotanalyse
(2μg poly-A
RNA), die die Expression von endogenem AhR, CA-AhR und den Zielgenen
CYP1A1 und CYP1A2 zeigen. Die Expression der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)
wird als RNA-Ladekontrolle für
entsprechende Gewebe dargestellt.
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2 die
funktionale Aktivität
von CA-AhR im Mäusethymus
und den Zeitverlauf der Sterblichkeit zeigt. (A) Der RNA-Blot (30 μg Gesamt-RNA) zeigt
die Expression von CYP1A1 mRNA im Thymus von sechs Monate alten
Wildtypen gegen gleichaltrige heterozygote und homozygote CA-AhR
Mäuse, die
mit einem Trägerstoff
(Maisöl)
oder TCDD, wie angegeben, behandelt wurden. (B) Das relative Gewicht
des Thymus (g/g Körpergewicht)
wurde in bis zu sechs Monate alten homozygoten CA-AhR Tieren verringert.
Geschlossene Balken stellen den Wildtyp dar und offene Balken stellen
die CA-AhR Tiere dar. Wenigstens vier weibliche Tiere jedes Genotyps
und Alters wurden untersucht. Der Stern gibt an p < 0,05, was mit dem
zweiseitigen Studenten t-Test überprüft wurde.
(C) Das Alter der tot aufgefundenen, homozygoten CA-AhR Mäuse, aufgeteilt
nach Geschlecht (geschlossene Symbole für Männchen, offene für Weibchen)
und Stamm (Dreiecke für
den Stamm "A3" und Kreise für den Stamm "Y8").
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3 zeigt,
wie auffallend neoplastische Läsionen
im Magen beobachtete werden. (A) Der normale Magen eines zwölf Monate
alten Wildtypmännchens,
das den Vormagen (fs) und den glandulären Magen (gs) zeigt. (B) Im
Alter von 3–4
Monaten sah man einzelne kleine Zysten nahe der Grenzfalte in CA-AhR-Mäusen (Pfeil). (C) In älteren CA-AhR-Tieren
(6–12
Monate) waren die zystischen Tumore zahlreicher und bedeckten einen größeren Bereich des
Magens. (D) In den schwersten Fällen
(9–12
Monate alt) haftete der Magen benachbarten Organen, wie z.B. der
Milz (sp), dem Pankreas (pank) und der Leber (liv) an. (E) Der normale
Magen einer sechs Monate alten männlichen
Wildtypmaus zeigt die Muskularis propria-Schicht (mp) und die Grenzfalte (lr),
die die Grenze zwischen dem Plattenepithel und dem Vormagen (fs)
und dem glandulären
Epithel (ge; Hämatoxylin
und Eosin-Färbung
[HE], bar = 0,5 mm) bildet. (F) Nahe der Grenzfalte sieht man einen
Bruch der Submucosa durch neoplastische Krypten in einem 3,5 Monate
alten CA-AhR Männchen.
Man beachte die Drüsen
innerhalb des Stromas der Grenzfalte (HE, bar = 0,5 mm). (G) Eine
höhere
Vergrößerung des
umrahmten Bereichs in 3F (HE, bar
= 0,15 mm). (H) Magen eines 12-Monate alten CA-AhR Männchens
mit schwer zerstörter
Gewebearchitektur (HE, bar = 1,25 mm). (I) Der Serosa (ser) unterliegende
Drüsen
in einem 12-Monate altem CA-AhR Weibchen mit Charakteristika eines
Hamartoms (har), d.h. eine definierte Struktur, die lymphatisches
Gewebe, Gefäße und Fett
(HE, bar = 0,5 mm) enthält.
Man beachte auch die Inversion (Pfeil) von Drüsen aus dem glandulären Epithel
(ge) in den Muskularis propria (mp).
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4 zeigt
eine intestinale Metaplasie, die an benachbarten Organen anhaftet
und die Expression von CA-AhR im Gastrointestinaltrakt. (A, B) Glanduläre Strukturen,
die im Muskularis propria mit Zellen, die foveoläres Epithel (fe) und Pylorusdrüsen (pg) ähneln, angeordnet
sind, zeigen eine intestinale Metaplasie in einem 9-Monate alten
CA-AhR Männchen.
Färbungen:
Hämatoxylin
und Eosin (HE; Feld A) und Alcian Blue pH 2,5 (Feld B). Bars = 0,1
mm. (C, D) Von Bindegewebe (ct) umgebene eindringende Krypten dringen
mittels Penetration durch den Muskularis mucosa (mm), die Submucosa (sm)-Schichten
und in den Muskularis propria (mp) in einem 9-Monate alten CA-AhR Weibchen in die
Submucosa (sm) ein.
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Färbungen:
HE (Feld C) und van Gieson (Feld D). Bars = 0,1 mm. (E, F) Squamöse Zysten
auf dem Blinddarm zeigen Darmdrüsen
(cg) und Plattenepithel (sq.e) eines 9-Monate alten CA-AhR Männchens
(HE, bar = 0,5 mm). (G) Die Expression und Aktivität von CA-AhR
im Verdauungskanal ist im glandulären Magen am höchsten.
Der RNA-Blot (2 μg poly-A
RNA) zeigt die Expression von CA-AhR, endogenem AhR (AhR), CYP1A1
und GAPDH mRNA in unterschiedlichen Abschnitten des Verdauungstraktes
von 3-Monate alten
homozygoten CA-AhR-Mäusen.
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Beschreibung
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Vor
dem vorliegenden Konstrukt werden transgene Tiere, die das Konstrukt
enthalten, Tiermodelle und Verfahren, die auf der Verwendung dieser Tiere
basieren, offenbart und beschrieben, verständlicherweise soll diese Erfindung
nicht auf bestimmte Konfigurationen, Verfahrensschritte und Materialien, die
hierin offenbart werden, beschränkt
sein, da solche Konfigurationen, Verfahrensschritte und Materialien
etwas variieren können.
Verständlicherweise wird
die hierin gebrauchte Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung
bestimmter Ausführungsformen
verwendet und dient nicht der Begrenzung, da der Schutzumfang der
vorliegenden Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente
beschränkt
wird.
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In
der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen werden die folgenden Abkürzungen
verwendet: AhR = Aryl-Kohlenwasserstoff
(Dioxin)-Rezeptor; Arnt = AhR nukleärer Translokator; CA-AhR = konstitutiv
aktives AhR; CYP1A1 = Cytochrom P450 1A1; HE = Hämatoxylin-Eosin; TCDD = 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin.
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Die
Erfinder haben überraschenderweise festgestellt,
dass die Expression von CA-AhR in transgenen Mäusen eine ausgeprägte Sterblichkeit, beginnend
mit dem sechsten Lebensmonat, auslöst, die mit der Entwicklung
von schweren Tumoren im Magen korreliert. Daher verdeutlicht diese
Studie eindeutig das onkogene Potential von AhR. Es war schwierig
die Histopathologie der Magentumore in den CA-AhR-Mäusen unzweifelhaft
zu interpretieren. Die gut organisierten glandulären Strukturen und die niedrigen
Niveaus der zellulären
Atypie sprechen für einen
nicht malignen Phänotyp.
Andererseits weisen die reduzierte Lebensspanne, die aggressive
expandierende Invasion in alle Magenschichten und das Anheften an
die umgebenden Organe auf einen eher malignen Phänotyp hin. Die intestinale
Metaplasie war in den CA-AhR-Tumoren
weit verbreitet und ist mit als präkarzinomatöse Läsion betrachtet (17). Darüber hinaus
ist kürzlich
eine Untergruppe des menschlichen, gastrischen Karzinoms des intestinalen
Typs beschrieben worden, in der die Krebszellen ebenfalls hochgradig
differenziert sind (18). Angesichts des auffälligen, gastrischen, onkogenen
Phänotyps
der CA-AhR-Mäuse
ist es interessant festzustellen, dass die meisten physiologischen
Anwärter von
Rezeptorliganden Indolderivate sind, ganz besonders Indol[3,2-b]carbazol,
die in der sauren Umgebung des Magens aus Nahrungsmittelvorstufen, z.B.
Indol-3-carbinol
erzeugt werden (19). Darüber hinaus
bilden bestimmte im Nahrungsmittel enthaltende heterozyklische Amine,
die während
des Kochverfahrens der Lebensmittel erzeugt werden, ebenfalls AhR-Liganden
(20). Daher stellt die Korrelation zwischen der Anwesenheit von
vermeintlichen Nahrungsmittel-Rezeptorliganden
und einer möglichen Rolle
des AhRs in der homöostatischen
Kontrolle von Zellen aus der Magenschleimhaut ein faszinierendes biologisches
Szenario dar, dass es noch im näheren molekularen
Detail zu überprüfen gilt.
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Magenkrebs
ist der am zweithäufigsten
verbreitete bösartige
Tumor in der Welt (21). Die Rolle (falls irgendeine) des AhRs bei
der Entwicklung dieser Krebsart ist nicht bekannt. Interessanterweise wird
der Magenkrebs üblicherweise
mehr beim Mann als bei der Frau gefunden (21, 22), ein Geschlechterunterschied,
der von den CA-AhR-Mäusen
wiedergegeben wird. Einige epidemiologische Studien zeigen ein erhöhtes Auftreten
von Magenkrebs in menschlichen Populationen, die Herbiziden (23)
oder fetthaltigen Fischen (24), die mit TCDD oder anderen Dioxinen
kontaminiert sind, ausgesetzt worden. Noch geläufiger diskutierte Risikofaktoren
für Magenkrebs sind
die Nahrung, die mutagene nitrosierende Verbindungen enthält, als
auch die Infektion mit Helicobactor pylori (22). Jedoch erhielten
die CA-AhR-Tiere in dieser Studie herkömmliches Nagetierfutter und
es wurde keine Infektion mit Helicobactor bei selektiver Kultur
von Gewebehomogenaten (Daten nicht dargestellt) detektiert. Angesichts
der Abwesenheit irgendeines bekannten Karzinogens ist es unwahrscheinlich,
dass die Induktion von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen und
die darauf folgende Bioaktivierung von Mutagenen die onkogene Wirkung des
AhRs erklären
kann. Eine faszinierendere Hypothese ist, dass ein Netzwerk von
entscheidenden Wachstumskontrollgenen durch das CA-AhR fehlreguliert
wird.
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In
der Magenschleimhaut werden hohe Niveaus an endogener AhR-mRNA am Schwangerschaftstag
15,5 der sich entwickelnden Maus nachgewiesen (25). Die Erfinder
haben die Expression des CA-AhRs
im Magen von neugeborenen Mäusen nachgewiesen
(Daten nicht dargestellt). Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass
das vorliegende Mausmodell eine Situation einer frühen in utero
Einwirkung des AhR-Liganden widerspiegelt, die sich nach der Geburt
fortsetzt. Auffallenderweise gibt es einen Mangel an Daten im Bezug
auf die Langzeitwirkungen, die der in utero Einwirkung von Dioxinen
und anderen Umweltschadstoffen, die AhR-Liganden bilden, folgt.
Zusätzlich
zu Dioxinen schließen
xenobiotische AhR-Liganden halogenierte Biphenyle und eine große Anzahl
von nicht halogenierten, polyzyklischen, aromatischen Kohlenwasserstoffen,
z.B. Benzo[a]pyren, 9,10-Dimethylbenz[a]anthrazen
und 3-Methylcholanthren ein. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert,
dass vor kurzem vorgeschlagen wurde, dass AhR verschiedene Zielgene
abhängig
von der chemischen Natur des Rezeptorliganden unterschiedlich reguliert
(26). Es wurde berichtet, dass AhR die Bax-Gentranskription aktiviert, wenn es 9,10-Dimethylbenz[a]anthrazen
ausgesetzt wird, jedoch nicht wenn es mit TCDD als Liganden (26)
besetzt ist. Offensichtlich muss dieses Modell weiter substantiiert
werden. Auffallenderweise könnte
das vorliegende Modellsystem ein experimentelles Werkzeug zum Lösen dieses
Problems bereitstellen. Besonders die möglichen biologischen Wirkungen,
die durch den aktivierten Rezeptor per se (d.h. erzeugt durch das
CA-AhR) vermittelt werden, können
mit den Wirkungen verglichen werden, die durch die verschiedenen
ligandenstimulierten Rezeptorformen erzeugt werden. Jedoch muss
dieses Szenario unter der Berücksichtigung,
dass alle Klassen von Rezeptorliganden jetzt noch nicht identifiziert
sein könnten, weiter
experimentell aufgeklärt
werden.
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Interessanterweise
hat man von verschiedenen Spezies von Labortieren, die mit AhR-Liganden behandelt
worden sind, berichtet, die Läsionen
in der glandulären
Magenschleimhaut entwickeln, was den Befunden in den CA-AhR Mäusen der
vorliegenden Erfindung gleicht. Zum Beispiel wird ein Adenokarzinom
nach der Injektion von 3-Methylcholantren in die Magenwand von verschiedenen
Mäusestämmen beobachtet
(27, 28). Ob dies durch reaktive 3-Methylcholantren-Metaboliten
oder einen anderen Mechanismus verursacht wird, eine mögliche Rolle für das AhR
im durch 3-Methylcholantren induzierten Magenkrebs wird durch die
Beobachtung gestützt,
dass der DBA Mäusestamm,
der eine wenig affine AhR Variante exprimiert, bezüglich der
Entwicklung von durch 3-Methylcholantren induzierten Magentumore resistent
ist (27). Zusätzlich
wurden eine Hyperplasie der Magenschleimhaut und der Zysten in der
Submucosa von Rhesusaffen (29) und ein Adenokarzinom des glandulären Magens
der Ratte (30) nach der Einwirkung von Nährstoffmischungen von polychlorinierten
Biphenylen, die das Potential haben AhR zu aktivieren, beobachtet.
Zusammengenommen weisen diese Beobachtungen auf eine wichtige Rolle
des AhRs in der Magentumorgenese hin und daher auch auf die Kontrolle
des Wachstums und der Proliferation von Magenepithelzellen.
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Es
existieren anscheinend gegenteilige Berichte über die Rolle des AhRs in der
Zellzykluskontrolle. Vom TCDD wurde berichtet, dass es das Wachstum
von menschlichen Keratinozyten (31) und veränderten Zellen, die kein oder
wesentlich niedrigere Niveaus an AhR exprimieren, stimuliert, was
erhöhte
Wachstumsraten im Vergleich zu Wildtypzellen (32, 33) anzeigt. Andererseits
ist vom TCDD berichtet worden, dass es die Expression des Cyklin/cdk-Inhibitors
p27 (Kip 1) in bestimmten Zellen induziert (34). Interessanterweise
entwickeln Mäuse
Adenokarzinome im glandulären
Magen nach der Expression von viralen Onkoproteinen, die an das
Retinoblastomprotein Rb binden (35–38). Besonders vom AhR wurde vor
kurzem berichtet, dass es mit Rb (39,40) über einen bisher unklaren Mechanismus
physikalisch interagiert, und es bleibt zu ermitteln, ob diese Wirkung
irgendeine Relevanz für
den Phänotyp
der CA-AhR exprimierenden Mäuse
hat.
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Interessanterweise
zeigen Mäuse,
die TGFα oder
EGF-ähnliche
virale Wachstumsfaktoren überexprimieren
zystische Hyperplasie, intestinale Metaplasie und Dysplasie im Magen
(41, 42). Darüber
hinaus sind TGFα-mRNA-Expressionsniveaus
dafür bekannt,
dass sie durch TODD-Behandlung von, z.B., Keratinozyten induziert
werden (43). Jedoch gelang es den Erfindern nicht, irgendeine Zunahme
in den TGFα-mRNA-Niveaus
im glandulären
Magen der CA-AhR Mäuse
festzustellen (Daten nicht dargestellt). Demnach wird es jetzt von
Bedeutung sein, das Netzwerk von Genen zu identifizieren, das nach der
Expression des CA-AhRs fehlreguliert wird und dadurch eine mögliche physiologische
Rolle des AhRs in der gastrischen Homöostase zu verstehen.
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Zusammenfassend
haben die Erfinder dargestellt, das CA-AhR die Entwicklung von hochgradig invasiven
Magentumoren in Abwesenheit der Einwirkung irgendeines bekannten
Karzinogens auslöst. Diese
Studie stellt zum ersten Mal Beweise für das direkte onkogene Potential
des AhRs zur Verfügung und
schlägt
eine mögliche
physiologische Rolle des AhRs in der homöostatischen Kontrolle von Zellen der
Magenschleimhaut vor.
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Infolgedessen
stellt die vorliegende Erfindung einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor
(CA-AhR) und insbesondere ein verändertes Konstrukt bereit.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung fehlt dem Konstrukt ein Abschnitt der ligandenbindenden
Domäne.
Gemäß einer
bestimmten Ausführungsform,
die derzeit von den Erfindern bevorzugt wird, umfasst das Konstrukt
eine Mäuse-AhR-Sequenz,
in der die Aminosäuren
288–421 fehlen.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein transgenes nicht-menschliches Tier bereit, das CA-AhR
in einem oder mehreren Geweben exprimiert oder ein transgenes nicht-menschliches Tier,
das ein Expressionskonstrukt, wie weiter oben definiert, funktionell
enthält.
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Das
transgene nicht-menschliche Tier gemäß der Erfindung wird bevorzugt
aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Mäusen,
Ratten, Affen, Schafen und Hasen besteht.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch eine isolierte Zelle des erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen
Tieres, wie weiter oben definiert. Die Erfindung umfasst auch eine
isolierte Zelllinie, die von dem transgenen Tier, wie weiter oben
definiert, abstammt. Gemäß einer
Ausführungsform
wird die Zelle oder werden die Zellen aus einer Keimzelle oder einer
Körperzelle
ausgewählt.
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Die
vorliegenden Erfindung stellt ein Tiermodell zum Studium von Krebs
bereit, das ein transgenes nicht-menschliches Tier, das ein Expressionskonstrukt
für einen
konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) in wenigstens
einer seiner Zellen aufweist, umfasst. Das transgene Tier gemäß der Erfindung
wird bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mäusen, Ratten,
Affen, Schafen und Hasen besteht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein in vitro-Modell zum Studium
von Krebs bereit, das eine Zelle umfasst, die ein Expressionskonstrukt
für einen konstitutiv
aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR), der funktionell enthalten
ist, aufweist. Die Erfindung stellt weiterhin ein in vitro-Modell zum Studium
von Krebs bereit, das eine Zelllinie umfasst, wobei dessen Zellen
ein Expressionskonstrukt für
einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR), der
funktionell enthalten ist, umfassen.
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Eine
wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern von
Arzneimittel-Anwärtern,
wobei die anti-karzinogene Wirkung der Arzneimittel-Anwärter in
einem nicht-menschlichen transgenen Tier oder einer Zelle oder Zelllinie
davon, die einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR)
exprimiert, geprüft
wird.
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Eine
andere Ausführungsform
ist ein Verfahren zum Durchmustern von Arzneimittel-Anwärtern, wobei
die anti-karzinogene Wirkung der Arzneimittel-Anwärter in
einem Tiermodell oder in einem in vitro-Modell, wie weiter oben
definiert, geprüft
wird.
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Eine
andere Ausführungsform
ist ein Verfahren zum Untersuchen der molekularen Mechanismen des
Krebses, wobei ein Tiermodell oder in vitro-Modell, wie weiter oben
definiert, verwendet wird.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Untersuchen der Mechanismen
von hochgradig differenzierten Adenokarzinomen im Magen bereit,
wobei ein Tiermodell oder in vitro-Modell, wie weiter oben definiert,
verwendet wird.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Auslösen von
Magenkrebs in einem nicht-menschlichen Tier für Forschungszwecke bereit,
wobei das Tier mit einem Konstrukt transformiert wird, das einen
konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR) exprimiert.
Mit dem Konstrukt transformiert bedeutet in diesem Kontext, dass
das Konstrukt funktionell inseriert wird, d.h. im korrekten Leserahmen
und Orientierung, so wie es vom Fachmann allgemein verstanden wird.
Verschiedenartige Expressionsvektoren oder Systeme sind gut bekannt.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Konstrukt in eine befruchtete
Eizelle des nicht-menschlichen
Tieres injiziert, und man lässt
sich das Ei zu einem Tier entwickeln, das das Konstrukt in seinem
Genom trägt.
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Des
Weiteren stellt die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren von Arzneimittel
metabolisierenden Enzymen, die normalerweise durch den Ah-Rezeptor
in Gegenwart eines Liganden reguliert werden, zum Studium des Arzneimittel-Metabolismus durch
irgendein Mitglied (irgendwelche Mitglieder) der Enzyme, bereit,
wobei ein nicht-menschliches Tier mit einem Konstrukt transfiziert
wird, das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR)
exprimiert.
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Gemäß einer
Ausführungsform
des obigen Verfahrens wird ein in vitro-Verfahren zum Induzieren von
Arzneimittel metabolisierenden Enzymen, die normalerweise durch
den Ah-Rezeptor
in Gegenwart eines Liganden reguliert werden, zum Studium des Arzneimittel-Metabolismus
durch irgendein Mitglied (irgendwelche Mitglieder) dieser Enzyme,
durch das Transfizieren von kultivierten Zellen mit einem Konstrukt,
das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor (CA-AhR)
exprimiert, aufgebaut.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft, durch das Bereitstellen der obigen
praktischen und leistungsfähigen
Forschungs- und Durchmusterungswerkzeuge, auch Arzneimittel-Anwärter, Arzneimittelvorstufen
und Behandlungskuren, die durch einen Prozess einschließlich eines
Verfahrens identifiziert werden, ein Tierverfahren oder ein in vitro-Verfahren,
das Tiere oder Zellen einschließt,
die ein Konstrukt enthalten, das einen konstitutiv aktiven Kohlenwasserstoffrezeptor
(CA-AhR) exprimiert.
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Im
Kontext von Arzneimittelentwicklungen und dem Verständnis der
molekularen Mechanismen von Krebs sind andere nicht-menschliche Tiere
außer
Mäusen
ebenfalls von Interesse, besonders andere Säugetiere. Nagetiere werden
zum Beispiel weiterhin verwendet, besonders Ratten und Mäuse. Da das
erfindungsgemäße Konstrukt
auch in anderen Tieren transformiert und der CA-AhR-Rezeptor auch in
anderen Tieren exprimiert werden kann, umfasst die vorliegende Erfindung
auch die Verwendung des Konstruktes in diesen anderen Tieren, Tiermodellen und
Verfahren, die darauf basieren.
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Beispiele
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Materialien und Methoden
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Zellkultur, Reportergen
und Immunoblot-Assays:
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CHO-Zellen
wurden mit einem XRE-enthaltenden Luziferase Reportergenkonstrukt,
PTXDIR, und CMV Expressionsplasmiden, die für Arnt und entweder das Wildtypmäuse AhR
(8) oder ein Mäuse AhR,
dem ein Abschnitt der ligandenbindenden Domäne (Aminosäuren 288–421) fehlt, CA-AhR (J. McGuire,
K. Okamoto, M.L. Whitelaw, H. Tanaka, L. Poellinger, Studien durchgeführt, Manuskript
in Vorbereitung) kodieren, transient transfiziert. Nach 48 h Inkubation
entweder in Gegenwart von 10 nM TCDD (2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin)
oder einem Trägerstoff
(1 % DMSO) alleine, wurde die Luziferase-Aktivität geprüft. Gesamtzellextrakte wurden
wie zuvor bereits beschrieben hergestellt (8), um die Expression
von AhR zu überwachen.
Die Extrakte (30 μg
Protein) wurden durch eine 7,5 % SDS-PAGE getrennt, auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und
die relativen Expressionsniveaus durch Immunodetektion mit anti-AhR-Antiserum (BioMol,
PA) bestimmt.
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Mäuse:
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Das
CA-AhR wurde zwischen dem Mäuse IgH
Intron-Verstärker/SV40-Promotor
und der SV40-Polyadenylierungsstelle von pEμSR (9) subkloniert. Transgene
Mäuse wurden
durch pronukleäre
Injektion eines 5,5 kb KpnI-Fragmentes, das das EμSR-CA-AhR-Konstrukt
umfasst, in befruchtete C57BL/6 × CBA Eier erzeugt, was zu
fünf Gründertieren
geführt
hat, die das CA-AhR im Genom tragen. Drei Linien wurden für weitere
Studien ausgewählt und
nachfolgend in den C57BL/6-Stamm für zwei zusätzliche Generationen eingekreuzt.
Transgene CA-AhR und Wildtypkontrolltiere weisen den gleichen gemischten
genetischen Hintergrund auf. Die Homozygotie wurde durch Southern-Blot-Analysen genomischer
DNA aus Schwanzbiopsien verifiziert. Die Tiere wurden in ventilierten
Käfigen
mit Oberfilter gehalten und erhielten herkömmliches Nagetierfutter (RM3,
spezieller Ernährungsservice)
und Wasser nach belieben und wurden einem 12-stündigem Licht/Dunkelzyklus ausgesetzt.
In Studien zur TCDD Einwirkung wurden gleichaltrige Wildtyp- und weibliche CA-AhR-Mäuse mit
Maisöl
oder verschiedenen Dosen von TCDD, das in Maisöl gelöst war, behandelt und wurden
drei Tage später
getötet.
Die Tiere wurden durch CO2-Erstickung gefolgt
von einer Halswirbeldislokation getötet. Alle tierischen Verfahren waren
vom örtlichen
Ethikkomitee genehmigt.
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Das
Geschlechterverhältnis
aller CA-AhR Tiere lag bei 216 Männchen
und 209 Weibchen und bei den homozygoten CA-AhR Mäusen bei
125 Männchen
und 107 Weibchen, im Vergleich zu 245 Männchen und 246 Weibchen bei
den Wildtypmäusen.
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Wildtyp-
und homozygote CA-AhR-Tiere wurden einmal in der Woche während der
ersten drei Lebensmonate gewogen. Auch wenn individuelle Würfe sich
in der Gewichtszunahme unterschieden, wurde kein Unterschied bei
irgendeinem Geschlecht beobachtet, wenn das Durchschnittsgewicht
von fünf Würfen jedes
Genotyps verglichen wurde (45 Wildtypen und 44 CA-AhR Tiere insgesamt).
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RNA-Isolation und Northern-Blot-Assay:
-
Die
Gesamt-RNA wurde durch Gewebehomogenisation in einem Guanidiniumthiocyanatpuffer gefolgt
von einer CsCl2-Gradientenzentrifugation aufbereitet
(10). Poly-A RNA wurde aus der Gesamt-RNA mittels oligo-(dT)-gekoppelten
magnetischen Kügelchen
(Dynal AS, Oslo, Norwegen) isoliert. Die Northern-Blot-Analysen wurden
mittels Standardverfahren durchgeführt (10). Die Prähybridisierung
und Hybridisierung wurde bei 42°C
in einem Formamid enthaltenden Puffer durchgeführt (10). Die Filter wurden über Nacht
mit 32P-markierten cDNA-Sonden, die für die angegebenen
Gene spezifisch sind, hybridisiert (11). Die Filter wurden mit 2 × SSPE bei
Raumtemperatur, 30 Minuten 2 × SSPE/2 %
SDS bei 65 °C
und 30 Minuten 0,1 × SSPE/0,1
% SDS bei 65 °C
gewaschen und nachfolgend einem autoradiographischen Film bei –70 °C und einer PhosphorImager
Analyse (FujiFilm Inc.) ausgesetzt. Die PhosphorImager-Ergebnisse
wurden mittels der vom Hersteller zur Verfügung gestellten Software quantifiziert.
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Histopathologische Analysen:
-
Die
Gewebe wurden entfernt und in 4 % gepuffertem Formaldehyd fixiert,
in Paraffin eingebettet und in 4 μm
dicke Schnitte geschnitten, die mit Hämatoxylin-Eosin, Alcian Blue pH 2,5 oder van Gieson Färbemittel
gemäß den Standardverfahren
gefärbt wurden.
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Ergebnisse
-
In
Analogie zu nukleären
Hormonrezeptoren (12) vermittelt die ligandenbindende Domäne des AhRs
sowohl die Aktivierung der Rezeptorfunktion in Gegenwart eines Liganden
als auch die Hemmung der Rezeptorfunktion in Abwesenheit eines Liganden (8,
13). Die teilweise Deletion der minimalen ligandenbindenden Domäne des AhRs
ergibt ein Protein, CA-AhR (1A), das
keinen Liganden binden kann (Daten nicht dargestellt). Dieser veränderte Rezeptor war
im Bezug auf die Reportergenaktivierung (1B)
in transienten Transfektionsexperimenten bei CA-AhR Expressionsniveaus,
die dem ligandenabhängigen
Wildtyp AhR (1C) entsprechen, konstitutiv
aktiv.
-
CA-AhR
wurde in transgenen Mäusen
unter der Kontrolle eines SV40-Promotors und dem immunoglobulinen
schwere Kette (IgH) Intron-Verstärker exprimiert
(9). Das Paaren von heterzygoten CA-AhR Tieren ergab Wildtyp, hetero-
und homozygote Mäuse
mit einer normalen Mendelschen 1:2:1 Frequenz, was auf keine pränatale Letalität von homozygoten Mutanten
hinweist. Sowohl heterozygote als auch homozygote CA-AhR Mäuse waren
fruchtbar und zeigten ein normales Geschlechterverhältnis. In Übereinstimmung
mit anderen Studien, die IgH Intron-Verstärker getriebene Expressionskonstrukte verwenden
(9, 14), wurden CA-AhR
mRNA Expressionsniveaus im Thymus und in der Milz (1D),
und in angereicherten B- und T-Zellen (Daten nicht dargestellt)
als auch in einer Anzahl von nicht-lymphoiden Geweben (1D) detektiert. Das durch Liganden aktivierte
AhR reguliert die Expression einer Reihe von Genen, die für xenobiotisch
metabolisierende Enzyme, z.B. CYP1A1 und CYP1A2 kodieren (1). Mit Ausnahme
der Lunge wurde die Expression von CYP1A1 mRNA in unbehandelten
Wildtypmäusen (1D) nicht detektiert. Im Gegensatz dazu
zeigten alle Gewebe, die eine CA-AhR transgene Expression zeigten,
auch eine induzierte Expression bei verschiedenen Niveaus an CYP1A1
mRNA (1D). Jedoch korrelierte die
Streuung bei der induzierten Expression dieser Zielgene nicht mit
den Expressionsniveaus von CA-AhR, was darauf hinweist, dass weitere
gewebespezifische Faktoren für
die Regulation der CYP1A1 Expression wichtig sind. Zusätzlich wurde
in der Leber die Expression der CYP1A2 mRNA auch durch das Transgen
induziert. Zusammengenommen zeigt dies, dass CA-AhR transkriptionell
aktiv ist und die Wirkung des durch Liganden aktivierten AhRs mimt.
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Um
das Niveau der funktionellen Aktivität von CA-AhR zu prüfen, wurde
die Induktion der CYP1A1 mRNA Expression durch CA-AhR im Thymus
mit der Induktionsreaktion, die in Wildtypmäusen infolge einer oralen Einwirkung
von TCDD erzeugt wurde, verglichen. In homozygoten CA-AhR Mäusen waren
die Niveaus an CYP1A1 mRNA vergleichbar mit denen, die in Wildtypmäusen, die
mit einer einzelnen Dosis an TCDD mit 3 μg TCDD/kg Körpergewicht (2A)
behandelt wurden, beobachtet wurden. Nach der Einwirkung dieser
Dosis an TCDD wurden keine akuten toxischen Wirkungen (z.B. Letalität oder das
Wasting-Syndrom)
in Mäusenmodellen
erkennbar (15). Es wurde keine Auswirkung auf die Körpergewichtszunahme
sowohl bei männlichen als
auch bei weiblichen CA-AhR Mäusen
(Daten nicht dargestellt) beobachtet. Diese Ergebnisse stimmen mit
der Tatsache überein,
dass ein Gewichtsverlust oder eine beeinträchtigte Gewichtszunahme nur nachgewiesen
werden, wenn Mäusen
Dosen an TCDD ausgesetzt werden, die beträchtlich höher als 3 μg/kg Körpergewicht (2, 15) sind. Demnach
scheint die Aktivität
des CA-AhRs mit einer chronischen, relativ geringen Einwirkdosis
an TCDD oder anderen AhR-Liganden zu korrespondieren.
-
Eine
gut charakterisierte nachteilige Wirkung von Dioxins ist die Rückbildung
des Thymus (1). Das relative Thymusgewicht von CA-AhR-Tieren war
bis zum sechsten Lebensmonat verringert (2B). Veränderte Populationsgrößen von
einzelnen positiven CD8+ und CD4+ T-Zellen wurden zuvor bei Ratten beobachtet,
die dem TCDD während
der Trächtigkeit
ausgesetzt waren (16). Die Wirkung wurde auch im Thymus von neugeborenen
CA-AhR-Mäusen
(Daten nicht dargestellt) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass
in Abwesenheit von Dioxin CA-AhR die biologischen Wirkungen, die
normalerweise durch die dioxinaktivierte Form des AhRs ausgelöst werden,
mimt.
-
Die
CA-AhR Mäuse
zeigten eine wesentlich verringerte Lebensspanne in der nur sehr
wenig homozygote Tiere über
ein Alter von 12 Monaten hinaus überlebten.
Etliche Mäuse
wurden bereits ab einem Alter von 6 Monaten tot aufgefunden, häufig ohne
irgendwelche vorhergehenden klinischen Symptome. Besonders war der
auffallende Geschlechterunterschied, bei dem männliche Mäuse früher starben als weibliche.
Zusätzlich
wurde auch ein Unterschied im zeitlichen Verlauf zwischen zwei unabhängigen homozygoten
Mäuselinien
beobachtet (2C).
-
Bei
der Autopsie wurden drastische Magenläsionen in den CA-AhR-Mäusen beobachtet.
Im Gegensatz zu Mägen
von Wildtypmäusen
(3A) zeigten CA-AhR Mäuse grobe,
sichtbare Zysten im Alter von 3–4
Monaten in der kleinen Magenkurvatur (3B).
Die Zysten wurden mit zunehmendem Alter zahlreicher (3C) und in den ernsteren Fällen (im
Alter von 12 Monaten) hefteten die Wachsenden an umliegenden Organe,
wie z.B. der Leber, der Bauchspeisedrüse und dem Bauchfett (3D) an. In vielen Fällen war die Magenwand überall im
Mageneingang und im Korpusbereich des glandulären Magens verdickt. Die Grenzfalte,
die die Grenze zwischen dem Vormagen und dem glandulären Teil
des Nagetiermagens bildet (3E) war
auch makroskopisch deutlich vergrößert (Daten nicht dargestellt).
-
Histopathologische
Analysen offenbarten glanduläre
Strukturen, die sich von der Mucosa in das Stroma der Grenzfalte
ausbreiteten, was die Fettung erklärt, die bei der groben Inspektion
beobachtet wurde (3F). Das expansive
Wachstum der zystischen glandulären
Strukturen in der Schleimhaut zeigte die Invasion von dysplastischen
Krypta in die Submucosa, die Muskularis propria und letztendlich in
die subserosale Region (3F, G). Trotz
des aggressiven Verhaltens der eindringenden Tumorzellen behielten
sie ein bemerkenswertes gut differenziertes Aussehen nach dem Hindurchtreten
durch den Muskularis mucosa (3G).
Die Tumorentwicklung schritt über
die Zeit voran und führte
zu einer bizarren deformierten Gewebearchitektur, die vor der Letalität beobachtet
wurde (im Alter von 12 Monaten, 3H).
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Die
Erfinder wiesen auch Drüsen
in der Subserosa nach, die durch Bindegewebe in Verbindung mit lymphatischen
Geweben, Gefäßen, Fett
und manchmal Nerven (3I) definiert
waren, was auf eine ernste Störung
des Differenzierungsstatuses dieser Gewebe hinweist. Diese Veränderungen
sind charakteristisch für
das Hamartom des menschlichen Magens. Die intestinale Metaplasie
war in den meisten Zysten der Tumoren verbreitet, was durch das Färben des
Schleims des intestinalen Typs, der normalerweise im Korpus des
Magens nicht zu finden ist (4A–B), dargestellt
wird. Darüber
hinaus wurde auch eine Plattenepithelmetaplasie, die zur Bildung von
Plattenepithelzysten führte,
beobachtet (Daten nicht dargestellt). Eine nähere Analyse der expansiv wachsenden
Epithelzellen, die die Muskularis mucosa-Schicht penetrieren, zeigte,
dass diese Zellen nicht von Zellen der Muskularis mucosa-Schicht (4C–D)
umgeben waren. Diese Beobachtung schließt die Herniation als Grund
für die
Penetration aus, was mit einem invasiven Wachstumsverhalten konsistent
ist. Die Erfinder wiesen auch Plattenepithelzysten nach, die auf
dem Blinddarmvokal angeordnet waren und gelegentlich auf dem Krummdarm in
verschiedenen CA-AhR Mäusen
im Alter von 6 Monaten oder mehr (4E–F). Obwohl
das CA-AhR mit dem höchsten
Niveau im glandulären
Teil des Magens mit sich einer daraus ergebenden starken CYP1A1
Induktionsantwort exprimiert wurde, wurde das Transgen überall im
ganzen Gastrointestinaltrakt (4G)
exprimiert und funktionell aktiv. Trotz dieser Tatsache wurden keine
weiteren größeren Läsionen als
die beschriebenen im Gastrointestinaltrakt gefunden.
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Die
Magentumoren wurden in keinen Wildtypmäusen (n > 200) gefunden, jedoch in mehr als 200
transgenen Tieren. Darüber
hinaus traten die Tumoren in drei unabhängigen Linien von CA-AhR-Mäusen auf,
was darauf hinweist, dass die Neoplasie keine Wirkung aufgrund einer
zufälligen Integration
des Expressionskonstruktes in das Genom war. Heterozygote Mäuse zeigten
weniger ernsthafte Magentumore als homozygote Mäuse, was auf eine Gen-Dosis-Wirkung
hinweist (Daten nicht dargestellt). Darüber hinaus nahm die Schwere der
Magentumore mit dem Alter zu und Männchen waren ernsthafter betroffen
(Daten nicht dargestellt), was den Geschlechterunterschied bei der
Empfindlichkeit gegenüber
CA-AhR, die zuvor im Bezug auf die Sterblichkeit (2C)
beobachtet wurde, illustriert.
-
Auch
wenn die Erfindung im Bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen,
die die beste den Erfindern derzeit bekannte Methode darstellt,
beschrieben worden ist, sollte deutlich geworden sein, dass verschiedene
Veränderungen
und Modifikationen, die für
einen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sind, durchgeführt werden
können,
ohne sich aus dem Schutzumfang der Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen dargestellt
wird, zu entfernen.
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