DE60115475T2

DE60115475T2 - VARIANTEN DES DERMATOPHAGOIDES-ALLERGENS DER p 2

Info

Publication number: DE60115475T2
Application number: DE60115475T
Authority: DE
Inventors: Monica Sturaro; Angelo Viotti; Paolo Falagiani; Giovanni Mistrello; Daniela Roncarolo; Stefania Zanotta
Original assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 2000-09-12
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: US6800290B2; CN100469789C; ITMI20001986A1; ITMI20001986A0; DE60115475D1; EP1317483A2; ATE311407T1; US20020054881A1; EP1317483B1; WO2002022677A2; ES2252315T3; WO2002022677A3; IT1318691B1; AU2002220545A1; CN1454213A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Varianten eines Allergens von Milben der Spezies Dermatophagoides pteronyssinus.
Im Besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Aminosäuresequenzen von hypoallergenen Varianten des Allergens Der p 2, die durch ortsspezifische Mutagenese der Nukleotidsequenz, die für das genannte Allergen codiert, erhalten wurden. Die hypoallergenen Varianten können in der spezifischen Immuntherapie von allergischen Pathologien verwendet werden, die durch Staubmilben verursacht werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Allergien sind unmittelbare Hypersensibilitätsreaktionen, die durch die Produktion von Antikörper der IgE-Klasse, welche auf den Kontakt mit Allergen folgt, verursacht wird. IgEs binden an spezifische Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Effektorzellen (Basophile und Mastzellen) lokalisiert sind, und wenn sie erneut dem Allergen ausgesetzt sind, induzieren sie die Degranulation dieser Zellen, die Mediatoren, wie Histamine und Leukotriene, freisetzen, welche für die bekannten Symptome von Allergien verantwortlich sind: Rhinitis, Konjunktivitis, atopische Dermatitis und Asthma.
Dermatophagoides pteronyssinus und Dermatophagoides farinae sind zwei ähnliche Spezies von Milben, die in Hausstaub gegenwärtig sind. Die Allergene, die von diesen Arthropoden herrühren, haben bemerkenswerte Bedeutung im klinischen Bereich.
Neun verschiedene Typen von Milbenallergenen wurden bislang identifiziert. Die beiden Haupttypen sind Der p 1 (Der f 1) und Der p 2 (Der f 2), wobei jedes von ihnen mit den IgEs bei etwa 80% der allergischen Personen eine Immunreaktion zeigt.
Das Allergen Der p 2 (dessen Nukleotidsequenz bei GenBank unter dem Zugangscode AF276239 identifiziert ist) ist ein Protein, das aus 129 Aminosäureresten besteht, mit einem Molekulargewicht von etwa 14 kD, das 3 Disulfidbindungen enthält, die wesentlich für seine Immunogenität sind [1, 2]. Es hat keine Sequenzhomologien mit irgendeinem anderen bekannten Protein, außer Der f 2 (GenBank Zugangscode D10449).
Die einzige äthiologische Behandlung von Allergien wird repräsentiert durch die spezifische Desensibilisierungs-Immuntherapie (SIT). Diese besteht daraus, zunehmende Dosen der Substanz, die die Allergie verursacht, zu verabreichen und dadurch eine allmähliche Desensibilisierung gegenüber dieser Substanz bei dem Patienten zu induzieren (3).
Jedoch ist die Immuntherapie, obwohl sie eine etablierte Behandlung für Allergien darstellt, nicht völlig frei von Risiken (4).
Da sogar ernste Nebenwirkungen während einer solchen Therapie auftreten können, fokussierten sich die Forschungen auf die Verwendung von Wegen ohne Injektion (oral/sublingual) zur Verabreichung der Vakzine und auf die Herstellung von hypoallergenen Varianten der Proteine, die als Vakzine verwendet werden, welche durch Modifikation der Allergene durch chemische Behandlungen oder durch ortsspezifische Mutagenese erhalten wurden [5]. Chemische Modifikation von Der p-Allergenen durch Reaktion von Kaliumcyanat mit Lysingruppen wurde bereits früher verwendet, um ihr allergenes Potential zu verringern.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG
Eine neue cDNA, die für das Hauptallergen Der p 2 von Dermatophagoides pteronyssinus codiert, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 1 aufgeführt ist, wurde nun durch RT-PCR isoliert. Es unterscheidet sich von der Sequenz, die in GenBank vorliegt, in 8 Positionen. Das Protein, das durch den isolierten Klon codiert wird, angeführt in SEQ ID NO: 3, unterscheidet sich von dem Allergen Der p 2 in zwei Resten, Ala16 und Ser63.
Es wurde jetzt festgestellt, dass die allergene Wirkung des reifen Proteins Der p 2, das durch Entfernung der Aminosäurereste 1–16 von SEQ ID NO: 3 produziert wurde, durch Veränderung seiner Aminosäuresequenz an die Positionen Nr. 33, 48, 82, 96, 100, 126, an denen ein Lysinrest vorliegt, verringert werden kann.
„Verändern" bedeutet hierbei, Reste an den spezifizierten Positionen zu ersetzen, bevorzugt mit neutralen oder polaren Aminosäuren, oder Lysinreste, die in der natürlichen Form vorliegen, zu deletieren oder Reste gleichzeitig zu ersetzen und zu deletieren.
Die Mutationen durch Substitution führen einen Rest der Aminosäure Alanin an jeder der 6 zuvor angezeigten Positionen ein. Die Variante, die sechs Lys→Ala-Substitutionen trägt, ist in SEQ ID NO: 4 angeführt.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Varianten des Proteins Der p 2, die zu mehr als 85% homolog dazu sind, die an den entsprechenden Positionen ihrer Aminosäuresequenz das gleiche Substitutions-/Deletionsmuster, wie oben beschrieben, haben, im Besonderen das Protein Der f 2.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein immunologisch aktives Peptid, das sich von der Aminosäuresequenz von Der p 2 oder von einer dazu homologen Sequenz ableitet und die oben beschriebenen Substitutionen/Deletionen enthält.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Erfindung auf ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Mutationsvariante von Der p 2, für eine homologe Variante davon oder für ein davon abgeleitetes Peptid codiert, wie oben präzisiert.
Die erfindungsgemäßen Sequenzvarianten können leicht hergestellt werden, ausgehend von der cDNA des reifen Der p 2 oder einer homologen Variante davon, in der die Region, die für das Signalpeptid codiert, fehlt und die gewünschten Mutationen eingeführt wurden.
Die cDNA-Sequenz (mutagene Basen fettgedruckt), die die bevorzugte Variante (SEQ ID NO: 4) codiert, ist in SEQ ID NO: 2 angeführt.
Das hergestellte rekombinante Protein hat verringerte IgE-Reaktivität im Serum von Personen, die allergisch gegen Dermatophagoides pteronyssinus-Milben sind. Im Besonderen bewiesen Western-Blotting-Analysen, die mit einem Serumpool von Personen, die gegen Milben mit einer RAST 4+-Reaktivität allergisch waren, durchgeführt wurden, dass die IgE-Reaktivität der Variante, die in SEQ ID NO: 4 angeführt ist, im Mittel um etwa 90% abnimmt, verglichen mit derjenigen des normalen Proteins, welches in Escherichia coli produziert wurde [1]. Dieses Ergebnis wurde mit ELISA-Assays bestätigt, die es erlaubten, Epitope einschließlich Konformations-Epitope in Proteinen in der nativen Konformation zu identifizieren [2].
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für irgendeine der oben definierten hypoallergenen Varianten codiert.
Dieser Vektor kann ein Plasmid, ein Cosmid, ein Virus, ein Bakteriophage oder irgendein anderer Vektor sein, der allgemein in der Gentechnologie verwendet wird, und kann, zusätzlich zu dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung, eukaryotische oder prokaryotische Elemente als Expressionskontrolle enthalten, wie Regulationssequenzen für die Initiierung und die Terminierung der Transkription, Enhancer, Promotoren, Signalsequenzen und dergleichen.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, in die der Vektor der Erfindung transformiert wird oder die mit dem Vektor der Erfindung transfiziert wird. Im Prinzip werden prokaryotische Zellen, wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis, oder eukaryotische Zellen, wie Saccharomyces cerevisiae, für die Klonierung des Vektors und das Exprimieren der cDNA verwendet.
Die Proteinvarianten der Erfindung können entweder als solche oder als Fusionsproteine hergestellt werden.
Dank der reduzierten IgE-Reaktivität dieser Varianten können sie für therapeutische Zwecke in der Herstellung von Vaccinen verwendet werden, die in der Immuntherapie von Allergien aufgrund von Staubmilben verwendet werden sollen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich daher auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge der hypoallergenen Variante der Erfindung, optional in Kombination mit anderen Allergenen, natürlich oder modifiziert, von Milben des Genus Dermatophagoides oder ähnlicher Genera, zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsart ist diese pharmazeutische Zusammensetzung ein Vakzin für die Verwendung in der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von allergischen Erkrankungen, wie Bronchialasthma, allergische Rhinitis, allergische Dermatitis, allergische Konjunktivitis. Die Prinzipien und die Praxis der Vaccination sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt und z.B. in (7) und (8) beschrieben.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung ausführlicher.
BEISPIELE
Die Verfahren, die in den folgenden Beispielen verwendet wurden, sind, falls nicht anderweitig spezifiziert, diejenigen, die durch Sambrook, Fritsch ET Maniatis „Molecular cloning. A laboratory manual" II. Ausgabe, Bd. 1-2-3 CSH Lab Press 1989 beschrieben wurden.
BEISPIEL 1 – Isolierung der cDNA von Der p 2 mit RT-PCR
mRNA von Dermatophagoides pteronyssinus wurde verwendet, um die korrespondierende cDNA durch RT-PCR herzustellen, wobei ein poly-dT-Oligonukleotid als Primer für die Reaktion verwendet wurde, die durch das Enzym Reverse Transkriptase katalysiert wurde. Danach wurde die zu dem Allergen Der p 2 korrespondierende cDNA selektiv durch PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) vervielfältigt, wobei zwei spezifische Primer, jeder 15 Nukleotide, verwendet wurden, entsprechend dem Ende des Genbereichs, der für das Protein codiert. Die cDNA von Der p 2 wurde in einen Vektor (pBluescript-Stratagene) zur Vervielfältigung in Escherichia coli-Zellen kloniert und nach der Methode von Sanger mit einem automatischen Sequenzer sequenziert.
BEISPIEL 2 – Ortsspezifische Mutagenese der cDNA, die für das Allergen Der p 2 codiert
Die ortsspezifische Mutagenese der cDNA, die für das Allergen Der p 2 codiert, wird durch PCR-Vervielfältigung (Polymerase-Ketten-Reaktion) der gleichen DNA durchgeführt, die in einem prokaryotischen Vektor (pBluescript) kloniert ist. Die Oligonukleotide, die als Primer für die PCR-Reaktion verwendet wurden, haben die erforderlichen Substitutionen der Basen. Zu jeder Mutagenese wurde ein komplementäres Paar dieser Oligonukleotide verwendet, die an die korrespondierenden Bereiche der beiden DNA-Stränge binden. Nach der Vervielfältigung wird die originale, unveränderte Matrix selektiv durch enzymatischen Verdau abgebaut, der durch das Restriktionsenzym Dpn 1 katalysiert wird. Escherichia coli-Zellen werden dann mit den mutagenisierten Molekülen transformiert. Klone, die aus einzelnen Bakterienkolonien erhalten wurden, werden dann nach der Methode von Sanger sequenziert, um die korrekten Modifikationen der Basen und die Abwesenheit von unspezifischen Mutationen der cDNA zu verifizieren.
BEISPIEL 3 – Herstellung des Proteins Der p 2 und der Varianten davon
Normale cDNA und Der p 2 und mutagenisierte cDNA, entsprechend SEQ ID NO: 2, werden nach dem Klonieren in einen Expressionsvektor (pCALn – Stratagene) in Escherichia coli nach Standardprotokollen exprimiert, wobei die Kultur im exponentiellen Wachstum (O. D: 600 nm = 0,6) mit IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) versetzt wird, um die Expression der cDNA zu induzieren. Die rekombinanten Proteine werden 2 Stunden nach der Induktion ihrer Synthese isoliert, durch Lyse der Bakterienzellen durch Ultraschallbehandlung und Entfernen der Zellpartikel durch Zentrifugation. Proteine werden aus dem Überstand durch Affinitätschromatographie aufgereinigt, unter Verwendung von Säulen, bei denen die Matrix an das Protein Calmodulin gebunden ist, welches mit dem CBP-Bereich (Calmodulin-bindendes Protein) wechselwirkt, der mit dem Allergen fusioniert ist.
BEISPIEL 4 – Western-Blotting-Assay der Allergenität der Der p 2-Variante
Gleiche Mengen des normalen rekombinanten Allergens und der mutagenisierten Variante, angeführt in SEQ ID NO: 4, werden durch Elektrophorese in Polyacrylamid-Gel und nachfol gender Übertragung auf eine Nitrocellulose-Membran durch Elektroblotting nach der Technik, die von Towbin (6) beschrieben wurde, analysiert.
Die Membran wird für eine Stunde in TBS, 5% Milchpulver (Sättigungspuffer) enthaltend, inkubiert und dann über Nacht mit Einzelseren von Patienten, inkubiert, die mit einer RAST 4+-Reaktivität allergisch gegen Milben sind. Nach drei Waschschritten mit TBS, 0,05% Tween-20 enthaltend, werden an die Membran gebundene IgE-Antikörper detektiert, durch Inkubation für eine Stunde mit einem Anti-Human-IgE Peroxidase-konjugiertem Antiserum und nach weiteren Waschschritten, mit dem Detektionssystem, das auf der Verwendung einer DAB-Lösung (Diaminobenzidin), die H₂O₂ als Substrat für die Peroxidase enthält, basiert.
BEISPIEL 5 – ELISA-Assay für die Reaktivität der Der p 2-Variante gegen IgE
Gleiche Mengen (0,1 μg) des normalen Allergens und seiner mutagenisierten Varianten in Carbonat/Hydrogencarbonat-Puffer, 50 mM, pH 9,6, werden an die Vertiefungen von Polystyrolplatten für ELISA-Tests durch Inkubation bei 4°C für 16 Stunden gebunden. Die Antigene werden dann mit einer Waschlösung (60 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, 0,05% Tween-20 enthaltend) gewaschen und die freien Bindungsstellen werden mit Diluent-Lösung (25% Pferderserum, EDTA 1 mM, 0,05% Tween-20, 0,01% Thiomersal in Phosphatpuffer, 150 mM, pH 7,4) gesättigt. Serielle Verdünnungen von Human-Pool-Serum mit RAST 4+-Reaktivität werden in einem 1:2-Verhältnis in Diluent-Puffer hergestellt. Gleiche Mengen (100 μl) der verschiedenen Serumverdünnungen werden zu jeder Probe zugefügt und bei 25°C für 2 Stunden inkubiert. Nach drei Waschschritten wird das Anti-Human-IgE Peroxidase-konjugierte Antiserum, 1:1500, in Diluent-Puffer verdünnt, zugegeben und bei 25°C 1,5 Stunden inkubiert. Nach drei Waschschritten wird die kolorimetrische Reaktion entwickelt, durch Zugabe von 100 μl Ultra Blu-Reagens (Intergen, Milford, MA) und Inkubation für 15 Minuten bei 25°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl 1 N HCl gestoppt und bei 450 nm mit einem Spektrophotometer ausgewertet.
LITERATURVERZEICHNIS

1) Chua K. Y., Doyle C. R., Simpson R. J., Turner K. J., Stewart G. A., Thomas W. R., (1990) "Isolation of cDNA coding for the major mite allergen Der p II by IgE plaque immunoassay". Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91 (2): 118–123
2) Smith A. M., Chapman M. D., (1996) "Reduction of IgE binding to allergen variants generated by site-directed mutagenesis: contribution of disulfide bonds to the antigenic structure of the major house dust mite allergen Der p 2". Mol. Immunol. 33 (4–5): 399–405
3) Theodoropoulos D. S., Lockey R. F., (2400) "Allergen immunotherapy: guidelines, update, and recommendations of the World Health Organization". Allergy Asthma Proc. 21 (3): 159–166
4) Ohashi Y., Nakai Y., Tanaka A., Kakinoki Y., Washio Y., Ohno Y., Yamada K., Nasako Y., (1998). "Risk factors for adverse systemic reactions occurring during immunotherapy with standardized Dermatophagoides farinae extracts". Acta Otolaryngol. Suppl. 538: 113–117
5) Ferreira F., Ebner C., Kramer B., Casari G., Briza P., Kungl A. J., Grimm R., Jahn-Schmid B., Breiteneder H., Kraft D., Breitenbach M., Rheinberger H. J., Scheiner O., (1998). "Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: potential use of hypoallergenic variants for immunotherapy". FASEB J. 12: 231–242
6) Towbin J., Staehelin T., Gordon J., (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedures and some applications". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350–4354
7) Paul, (1989), "Fundamental Immunology", Raven press, New York.
8) Cryz, S. J. (1991), "Immunotherapy and Vaccines", VCH Verlagsgesellschaft.
9) Mistrello G., Brenna O., Roncarolo D., Zanoni D., Gentili M., Falagiani P. (1996): "Monomeric chemically modified allergens: immunologic and physicochemical characterization". Allergy 51: 8–15

SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Dermatophagoides-Allergen, das mit Wildtyp Der p 2 eine Aminosäuresequenzidentität von höher als 85% aufweist, und wobei die Lys-Reste, die der Wildtyp Der p 2-Sequenz and den Positionen 33, 48, 82, 96, 100 und 126 entsprechen, ersetzt und/oder deletiert sind.
Allergen nach Anspruch 1, welches ausgewählt ist aus Der p 2 und Der f 2.
Allergen nach den Ansprüchen 1–2, wobei die Lys-Reste mit neutralen oder polaren Aminosäuren ersetzt sind.
Allergen nach Anspruch 3, wobei Lys-Reste mit der Aminosäure Alanin ersetzt sind.
Allergen nach Anspruch 4, das die Sequenz SEQ ID NO: 4 aufweist.
Peptid-Fragment des Allergens der Ansprüche 1–5, geeignet zur Verwendung in einem Impfstoff gegen Staubmilben, wobei das Peptidfragment all die Lys-Substitutionen und/oder -Deletionen, die in Anspruch 1 angezeigt sind, trägt.
Nucleinsäuremolekül, codierend für ein Dermatophagoides-Allergen nach den Ansprüchen 1–5 oder für ein Peptid nach Anspruch 6.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 7 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2.
Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül der Ansprüche 7–8.
Wirtszelle, transduziert mit dem Vektor nach Anspruch 9.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Allergen nach den Ansprüchen 1–5, oder ein Peptid nach Anspruch 6, zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienzien, zur Verwendung in der Immuntherapie von durch Staubmilben verursachten Allergien.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 in der Form eines Impfstoffs.