DE60112973T2

DE60112973T2 - Pestizide und antiparasitische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60112973T2
Application number: DE60112973T
Authority: DE
Inventors: Jesus Mena Campos; Eulogio La Vigia PIMENTEL VAZQUEZ; Tomas Armando HERNANDEZ GARCIA; Liuven La Zambrana VELOZ GONZALES; Marieta La Vigia MARIN BRUZOS; Oscar Compte Alberto; Marilin Domingo Puente; Licette Leon Barreras; Merardo Pujol Ferrero; Diego Juan MENCHO PONCE; Carlos Playa BORROTO NORDELO
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: IL156700A0; EP1356733A2; MXPA03006040A; CA2431669C; WO2002052934A3; CA2431669A1; JP2007326861A; RU2249957C1; BR0116711B1; ES2247009T3; UY27112A1; EP1356733B1; ZA200305121B; ATE302552T1; BR0116711A; DK1356733T3; RU2003124061A; JP2004522727A; CN1484494A; US20040071663A1

Description

Diese Erfindung umfasst mehrere synergistische Zusammensetzungen mit pestizider und antiparasitischer Wirkung, die für die Bekämpfung von parasitischen Phytonematoden und Zoonematoden, einigen Krankheiten (durch Pilze und Bakterien) und die Bekämpfung von parasitischen Trematoden (Fasciola hepatica) geeignet sind.
Stand der Technik
Nematoden wird die Schuld an den größten Schäden in der Landwirtschaft in tropischen, subtropischen und gemäßigten Regionen weltweit gegeben (Nickle W.R. (Hrsg.), 1991, Manual of Agricultural Nematology, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. Pub., S. 1035ff). Allein bei Kochbananen gibt es etwa 20% der Weltproduktion an Verlusten durch Nematoden, was jedes Jahr 178 Millionen Dollar ausmacht (Sasser J.N. und Freckman D.W., 1987, A world perspective on nematology: the role of the society; Vistas on nematology: a commemoration of the twenty-fifth anniversary of the Society of Nematologists, Hrsg. Joseph A. Veech und Donald W. Dickson, S. 7–14). Kochbananen- und Bananenplantagen werden durch Radopholus similis erheblich beeinträchtigt.
Meloidogyne spp. ist der wichtigste phytoparasitische Nematode, da seine Aktivität Verluste zwischen 11% und 25% der Ernte in fast allen tropischen Regionen verursacht (Sasser J.N., 1979, Root-knot nematodes, Hrsg. F. Lamberti & C.E. Taylor, Academic Press, London, S. 359). Folglich gibt es ein großes Bedürfnis, diese Parasiten, die in der Vergangenheit mit chemischen Nematiziden bekämpft wurden, zu bekämpfen. Solche Verbindungen können hocheffektiv sein; viele von ihnen stellen jedoch eine große Gefahr für die Umwelt dar. In einigen Fällen haben die Regulierungsbehörden die Menge oder Häufigkeit oder beides bei der Verwendung solcher Verbindungen eingeschränkt, was ihre nematizide Wirksamkeit beeinträchtigt.
Die Nematodenbekämpfung entspricht noch immer nicht den Erwartungen. Die Verwendung von chemischen Nematiziden wird jeden Tag immer mehr eingeschränkt, da sie hochtoxische Verbindungen mit breiter Wirkung enthalten. Infolgedessen wurden Anstrengungen unternommen, ein wirksames Mittel zu finden, um den durch Nematoden verursachten Schaden zu beseitigen und gleichzeitig die Verwendung von chemischen Pestiziden zu reduzieren. Einer der Ansätze ist die Verwendung von biologischen Pestiziden mit spezifischem Wirkungsmodus und unbedenklicheren toxikologischen Profilen anstelle von chemischen Nematiziden. Einige der alternativen Nematizide sind ABG-9008, ein Metabolit des Pilzes Myrothecium verrucaria und eine Kombination von Avermectinen (oder verwandter Verbindungen, wie Milbecine) mit Fettsäuren (Abercrombie K.D. 1994, Synergistic pesticidal compositions, Patent US 5,346,698 , Mycogen Corporation, 13. Sept.). Ähnlich wird ein Verfahren, das die gleichzeitige Verabreichung von a) einem Metaboliten des Pilzes Myrothecium verrucaria und b) eines chemischen Pestizids sowie der in diesem Fall geeigneten synergistischen Nematizidzusammensetzungen an Pflanzen, den Standort, den Boden oder die Samen, die einer Behandlung bedürfen, zur Beseitigung von durch Nematoden verursachten Schäden beinhaltet, unter einem Patent beansprucht (Warrior P., Heiman D.F. und Rehberger Linda A., 1996, Synergistic nematocidal compositions, Abbott Laboratories, WO 96/34529, 7.11.1996).
Ein anderer Ansatz besteht darin, Sporen von Pasteuria penetrans, eines bakteriellen Nematodenparasiten, mit organophosphorierten Nematiziden zu kombinieren (Nordmeyer D. 1987, Synergistic nematocidal compositions of Pasteuria penetrans spores and an organophosphorus nematocide, 1987, Ciba-Geigy AG, Patent AU 06057386A1 , 29.01.1987).
Bei der Herstellung von P.-penetrans-Sporen im industriellen Maßstab besteht jedoch das Problem, dass der Organismus ein obligatorischer Parasit ist; daher muss er in situ in Nematoden gezüchtet werden, die aus nematodenverseuchten Wurzelauszügen isoliert werden.
Chitinolytische Pilze und Bakterien, die in demselben Lebensraum wie der Nematode vorkommen, können zu einer gewissen biologischen Ausgewogenheit führen und die Vermehrung von Nematoden bis zu einem gewissen Grad einschränken. Zwei Stämme von chitinolytischen Bakterien (Toda T. und Matsuda H. 1993, Antibacterial, anti-nematode and/or plant-cell activating composition, and chitinolytic microorganisms for producing the same, Toda Biosystem Laboratory, Japan, Patent US 5,208,159 , 4.5.1993) wurden als antibakterielle, nematizide und/oder Pflanzenzellen aktivierende Zusammensetzung beansprucht.
Es gibt einige Beispiele für die chitinolytische Wirkung auf Nematoden. Einige der bedeutendsten sind die beschriebenen Stämme von neuen Bakterien (Suslow T. und Jones D.G., 1994, Novel chitinase-producing bacteria and plants, DNA Plant Technology Corporation, US 04,940,840 , 10.07.1990), die durch die Einführung von DNA geschaffen werden, die für Chitinase-Produktion codiert, ein Enzym, das Chitin in Pilzen und Nematoden zersetzen kann. Die Stämme sind für die Herstellung von Chitinase zur Hemmung von Pflanzenpathogenen geeignet. Neue Pflanzen, die gegenüber Pathogenen resistent sind, werden als Ergebnis der Einführung von DNA, die für Chitinase-Produktion codiert, ebenfalls beschrieben.
Herrera-Estrella und Chet ("Chitinases in biological control" in Chitin and Chitinases, Vol. 87, S. 171–184, 1999) analysierten die physiologische Rolle von Chitinasen und ihre potentielle Verwendung bei der Verbesserung von biologischen Schädlingsbekämpfungsmitteln und Kulturpflanzen durch Gentechnik.
Weitere Beispiele für Mikroorganismen, die Nematodenpopulationen, welche unter natürlichen Bedingungen Pflanzen angreifen, reduzieren, werden beschrieben.
Rodriguez-Kabana et al. (Rodriguez-Kabana R., Jordan J.W., Hollis J.P., 1965, Nematodes: Biological control in rice fields – role of hydrogen sulfide, Science 148: 524–26) sowie Hollis und Rodriguez-Kabana (Hollis, J.P. und R. Rodriguez-Kabana, 1966, Rapid kill of nematodes in flooded soil, Phytopathology 56, S. 1015–19) beobachteten eine Korrelation zwischen dem Bakterium Desulfovibrio desulfuricans, der Wasserstoffsulfidproduktion und pflanzenparasitischen Nematoden, deren Population in den Reisplantagen von Louisiana abnahm. Sulfide sind Inhibitoren im Elektronentransport-Atmungsprozess der aeroben Organismen, wie auch andere Metabolite, die von bestimmten Bodenbakterien erzeugt werden (Rodriguez-Kabana R. 1991, Control biológico de nematodos parásitos de plantas, Nematropica, 21(1), S. 111–22).
Topp et al. ("Effects of marigold (Tagetes sp.) roots on soil microorganisms" in Biology and Fertility of Soils, Vol. 27, Nr. 2, S. 149–154, 1988) kamen zu dem Ergebnis, dass die Unterdrückung von Nematoden durch Studentenblumen (Gattung Tagetes) vermutlich auf Thiophene zurückzuführen ist, d.h. heterocyclische schwefelhaltige Moleküle, die in dieser Pflanze in großer Menge vorkommen.
Paecil^TM, das auch als Bioact oder Nemachek bekannt ist, ist ein biologisches Nematizid, das einen patentierten Stamm von Paecilomyces lilacinus in einer trockenen und stabilen Sporenkonzentration für Boden- und Samenbehandlung enthält. Diese Pilzart ist in allen Böden weltweit häufig zu finden. Der patentierte Stamm, der als Wirkstoff von Paecil^TM verwendet wird, hat eine besondere Wirksamkeit gegen phytoparasitische Nematoden. Er wurde ursprünglich an der Philippines University isoliert und in Australien, Macquarie University, entwickelt. Weiterhin wurde er grob auf die Bekämpfung mehrerer Arten von Nematoden getestet, die wichtige Kulturpflanzen in Australien, den Philippinen, Südafrika und anderen angreifen. Die Zubereitung Paecil^TM ist kommerziell als Pestizid erhältlich, das auf den Philippinen unter dem Namen Bioact^®, in Südafrika unter dem Namen PL PLUS und in Indonesien unter dem Namen Paecil^TM eingetragen ist. Zur Zeit bewertet die australische nationale Eintragungsbehörde das Produkt als Pestizid (Holland, R. PAECIL^TM, 1998, http://www.ticorp.com.au/article1.htm). Die oben genannten Beispiele lösen nicht alle Probleme mit parasitischen Helminthen.
Daher besteht immer noch ein Bedürfnis nach verbesserten Mitteln für die Parasitenbekämpfung, um chemische Pestizide und Antiparasitenprodukte zu ersetzen.
Trematoden verursachen beträchtliche ökonomische Schäden für die Tierproduktion und beeinträchtigen die menschliche Gesundheit. Die Vielfalt der Arten, ihre relativ gutartige Pathogenität und ihr Endemismus in isolierten Regionen scheinen wesentliche Faktoren zu sein, die fehlende Kenntnisse über Trematoden bewirken. Allgemein gesagt sind Darmtrematoden zoonotisch und haben bei jeder Spezies eine große Zahl von Reservewirten.
Ökonomisch gesehen ist Fasciola hepatica (Großer Leberegel), der erste bekannte parasitische Trematode, einer der wichtigsten Trematoden; er befällt den Menschen, indem er die Gallengänge bewohnt. Sein Ei ist eines der größten der Helminthen, eiförmig und mit einem Deckel versehen und verursacht Verdauungstrakt-Fehlfunktionen, die in einer Magendyspepsie, einer Fehlfunktion der Colonmotilität, Schmerzen in Leber und Gallenblase, Fieber und Leberkoliken bestehen. Weitere Anzeichen können cystische Formen in Lungen, Augen, Gehirn, Lebervene und anderen Geweben sein (Saleha A. 1991, Liver fluke disease (fasciolosis) epidemiology, economic impact and public health significance, Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 22 suppl. 1 dic., S. 361–4).
Zoohelminthen sind zu bedeutenden Schädlingen bei Schafen und Rindern geworden. Die Resistenz gegen Antihelminthika ist verbreitet, insbesondere in Populationen von parasitischen Nematoden kleiner Wiederkäuer.
Neue ergänzende Techniken wurden entwickelt, andere werden noch erforscht. Der Pilz Duddingtonia ist ein Räuber, der Netze bildet und dickwandige bewegungslose Sporen erzeugt: Chlamydosporen, die in der Lage sind, die Passage durch den Darmtrakt von Rindern, Pferden, Schafen und Schweinen zu überleben (Larsen M. 1999, Biological control of helminths, Int. J. Parasitol., Jan.; 29(1): 139–46, und Larsen, M., 2000, Prospects for controlling animal parasitic nematodes by predacious micro fungi, Parasitology, 120, S120–S121).
Arbeiten über D. flagrans in Dänemark, Frankreich, Australien, den USA und Mexiko haben das große Potential dieses Pilzes für die biologische Schädlingsbekämpfung bestätigt.
Wie viele andere wichtige schaferzeugende Länder erfährt auch Südafrika eine große Krise aufgrund der Resistenz gegen Antihelminthika, insbesondere bei Magen-Darm-Nematoden in Schafen und Ziegen. An diesem Phänomen sind bedeutende parasitische Helminthen beteiligt; dies verursacht jedoch ein besonderes Problem bei dem hämatophagen Labmagenparasiten Haemonchus contortus. Die Studien weisen darauf hin, dass über 90% der Stämme dieses Parasiten aus den wichtigsten schaferzeugenden Regionen in Südafrika in drei der vier Antihelminthikum-Gruppen, die auf dem Südafrikanischen Markt erhältlich sind, mehrere Grade der Wirkstoffresistenz zeigen. Selbst in gemeinsamen Weidearealen in der nördlichen Provinz wurde er in fünf Herden nachgewiesen, die 1993 untersucht wurden (van Wyk J.A., Bath G.F. und Malan F.S., 2000, The need for alternative methods to control nematode parasites of ruminant livestock in South Africa, World Animal Review, http://www.fao.org/ag/AGA/AGAP/FRG/FEEDback/War/contents.htm).
Die Ausbreitung der Resistenz ist ernst geworden, da sie auch in anderen Arealen angetroffen wurde. Eine Reihe von Antihelminthikum-Studien wurde vor kurzem in vier lateinamerikanischen Ländern durchgeführt: Argentinien (Eddi, C., Caracostantogolo, )., Peya, M., Schapiro, J., Marangunich, L, Waller, P.J. & Hansen, J.W. 1996. The prevalence of anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin America: Argentina. Vet. Parasitol., 62: 189–197); Brasilien (Echevarria F., Borba M.F.S., Pinheiro A.C., Waller P.J. & Hansen J.W. 1996. The prevalence of anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin America: Brazil. Vet. Parasitol., 62: 199–206); Paraguay (Maciel S., Giminez A.M., Gaona, C., Waller P.J. & Hansen J.W. 1996. The prevalence of anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin America: Paraguay. Vet. Parasitol., 62: 207–212); und Uruguay (Nari A., Salles )., Gil A., Waller P.J. & Hansen J.W. 1996. The prevalence of anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin America: Uruguay. Vet. Parasitol., 62: 213–222).
Einer der Nematoden, die die größten Schäden bei Rindern verursachen, ist Dictyocaulus viviparus, ein Parasit, der geschlechtsreif wird und, wenn er ausgewachsen ist, die Lunge von Rindern, insbesondere Jungtieren, bewohnt. Die dadurch verursachte Krankheit ist als parasitäre Bronchitis oder Rinder-Lungenwurmseuche bekannt, und ein Befall entsteht nach der Einverleibung von Larven im 3. Entwicklungsstadium, auch infizierende Larven genannt, die im Weidefutter vorhanden sind. Die Behandlung erfordert Antihelminthika (Borgsteede F.H.M., de Leeuw W.A. & Burg W.P.J., 1988, A comparison of the efficacy of four different long-acting boluses to prevent infections with Dictyocaulus viviparus in calves. The Veterinary Quarterly, Band 10, Nr. 3), aber mit dem Erfolg nimmt man neue Stämme in Kauf, die gegenüber den Wirkstoffen resistent sind, was die Behandlung von weiteren befallenen Tieren erschwert. Die hohen Kosten dieser Produkte sind für die Länder mit einer großen Zahl von Ressourcen ein einschränkender Faktor, und durch die Verwendung dieser Zubereitungen entstehen schädliche ökologische Wirkungen.
Das internationale Problem der Resistenz gegen Antihelminthika wird dadurch verschlimmert, dass die Chemotherapie zwar immer noch der Eckpfeiler der Parasitenbekämpfung ist, jedoch wenig Hoffnung zu sein scheint, dass irgendwelche neuen, chemisch nicht verwandten Antihelminthika auftauchen, wenigstens während der nächsten Dekade (Soil, M.D., 1997, The future of anthelmintic therapy from an industry perspective, in J.A. van Wyk & P.C. van Schalkwyk Hrsg.), Managing anthelmintic resistance in endoparasites, S. 1–5, Proceedings of the 16th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, Sun City, Südafrika, 10.–15. August 1997).
Im Falle von Bakterien und pathogenen Pilzen gibt es umfassende Berichte über biologische Mittel, deren Wirkung hauptsächlich auf Antagonismus beruht, und eine große Menge davon ist kommerziell erhältlich. Einige davon sind Conquer (Pseudomonas fluorescens, das Pseudomonas tolassii antagonisiert), Galltrol-A (Agrobacterium radiobacter, das Agrobacterium tumefaciens bekämpft), Bio-Fungus (Trichoderma spp., das die folgenden Pilze bekämpft: Phytophthora, Rhizoctonia solani, Pythium spp., Fusarium, Verticillium), Aspire (Candida oleophila 1–182, das Botrytis spp. und Penicillium spp. bekämpft) usw.
Eines der am breitesten wirksamen Biofungizide ist Trichoderma spp. (Chet I., Inbar J. 1994, Biological control of fungal pathogens, Appl. Biochem. Biotechnol. 48(1): 37–43), ein Pilz, dessen Wirkungsmechanismus ausführlich diskutiert wird, wobei Chitinasen, die die Zellwand des Wirtspilzes abbauen, eine Rolle spielen. Außerdem gibt es experimentelle Beweise für die chitinolytische Wirkung von Pilzen und Bakterien, die als Bioregulatoren für Pilzkrankheiten verwendet werden (Herrera-Estrella A., Chet I. 1999, Chitinases in biological control, EXS 87: 171-84). Dies ist jedoch nicht der einzige Wirkungsmodus von Bakterien auf phytopathogene Pilze; es gibt auch andere Bekämpfungsmethoden auf der Grundlage der Produktion von sekundären Metaboliten, wie Cyanwasserstoff, das im besonderen Fall des P.-fluorescens-CHAO-Stamms wurzelpathogene Pilze hemmt (Blumer C. und Haas D., 2000, Mechanism, regulation, and ecological role of bacterial cyanide biosynthesis, Arch. Microbiol. Mar; 173(3): 170–7).
Analysen der Bakterium-Bakterium-Wechselwirkung haben gezeigt, dass es drei Haupttypen gibt: Antibiose, Substratkonkurrenz und Parasitismus. Im Falle der Antibiose ist bekannt, dass einige Bakterienstämme Antibiotika freisetzen, um die Aktivität von Bakterien in der Umgebung zu unterdrücken, was für die biologische Bekämpfung von pathogenen Spezies ausgenutzt werden kann. Ähnlich ist Substratkonkurrenz ein Mechanismus, der ebenfalls ausgenutzt werden kann, um eine richtige biologische Bekämpfung zu erreichen, da der bioregulierende Organismus in der Lage ist, Siderophore als Mikroelement-Chelatoren zu synthetisieren, was einen Mangel an Mikroelementen, hauptsächlich Eisen, im Medium verursacht und dadurch das Wachstum des jeweiligen Pathogens hemmt (Ongena M. 1998, Conference on biological controls, Training program in the area of biotechnology applied to agriculture and bioindustry, Gembloux, Belgien).
Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die wenigstens ein chitinolytisches Mittel oder ein chitinolytische Aktivität induzierendes Mittel und ein Sulfid oder ein sulfidbildendes Mittel aus Mikroorganismen oder chemischen Verbindungen enthält, wobei das chitinolytische Mittel oder das chitinolytische Aktivität induzierende Mittel und das Sulfid oder sulfidbildende Mittel aus Mikroorganismen oder chemischen Verbindungen gleichzeitig in einer wesentlich kleineren Menge angewendet werden, als wenn jede Komponente unabhängig verwendet wird, um eine effektive Bekämpfung von Helminthen und Pathogenen von Bakterien- und Pilzkrankheiten zu erreichen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher Zusammensetzungen und/oder die gleichzeitige Verabreichung der Verbindungen aus verschiedenen Quellen, wie biologische Mittel und Chemikalien, zur effektiven Bekämpfung eines breiten Spektrums von phytoparasitischen Nematoden (Meloidogyne spp., Angina spp., Ditylenchus spp., Pratylenchus spp., Heterodera spp., Aphelenchus spp., Radopholus spp., Xiphinema spp., Rotylenchulus spp.), zooparasitischen Nematoden und Trematoden (Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Dictyocaulus spp. und Fasciola hepatica), bakteriellen Pathogenen (Erwinia chrysanthemi, Burkholderia glumae) und Pilz-Pathogenen (Pestalotia Palmarum, Alternaria tabacina, Sarocladium orizae).
Die Wirkungen eines chitinolytischen Mittels oder eines chitinolytische Aktivität induzierenden Mittels und Sulfid oder eines sulfidbildenden Mittels auf Helminthen, Bakterien und Pilze wurden schon früher nachgewiesen oder berichtet. In dieser Studie wird jedoch zum ersten Mal eine synergistische Wirkung nachgewiesen, wenn beide Komponenten gleichzeitig angewendet werden.
Wenn das chitinolytische Mittel oder das chitinolytische Aktivität induzierende Mittel und Sulfid oder ein sulfidbildendes Mittel getrennt angewendet werden, sind die Wirkungen stets geringer, als wenn die beiden Mittel gleichzeitig angewendet werden.
Wenn sie als Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung angewendet werden, können das chitinolytische Mittel oder das chitinolytische Aktivität induzierende Mittel und Sulfid oder das sulfidbildende Mittel in geeigneter Weise in Form einer Lösung, Suspension, Emulsion, eines Pulvers oder Granulierungsgemischs gemischt werden, und die Zusammensetzung wird als Düngemittel, vorgepackte Erde, Saatabdeckungsvorrichtung, Pulver, Granulat, Vernebler, Suspension, Flüssigkeit oder eine der angegebenen Formen in Kapseln für die Bekämpfung von parasitischen Helminthen und Bakterien- und Pilzkrankheiten auf die Pflanze oder den Boden aufgetragen.
Die optimalen Anwendungsbereiche des chitinolytischen Mittels oder des chitinolytische Aktivität induzierenden Mittels und des Sulfids oder sulfidbildenden Mittels für den besonderen Fall von Nematoden, Trematoden, Bakterien oder Pilzen; und für den Fall von speziellen Bedingungen werden die Bereiche durch experimentelle Studien, in vitro, im Treibhaus oder unter Feldbedingungen bestimmt.
Gemäß den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Ergebnissen wird eine erhebliche Bekämpfung von Helminthen, Bakterien und Pilzen erreicht mit einem Gemisch von 1) einem Chitinase bildenden Mikroorganismus zwischen 10⁷ koloniebildenden Einheiten (CFU) und 10¹² CFU eines besonderen Mikroorganismus pro Gramm der Zusammensetzung oder Chitin zwischen 1% und 50% der Zusammensetzung; und 2) einem sulfidbildenden Mikroorganismus zwischen 10⁷ CFU und 10¹² CFU eines besonderen Mikroorganismus pro Gramm der Zusammensetzung oder irgendeinem sulfidbildenden chemischen Mittel, wobei die Menge des Sulfids zwischen 1,0 mg/Minute pro Gramm der Zusammensetzung variiert.
Jede Zusammensetzung mit einem Mikroorganismus zwischen 10⁷ CFU und 10¹² CFU pro Gramm der Zusammensetzung, die gleichzeitig chitinolytische Mittel und Sulfid erzeugt, ist für die Bekämpfung von Helminthen, Bakterien und Pilzen geeignet. Die obigen Zusammensetzungen beinhalten Kombinationen aus den folgenden Mitteln in den oben genannten Anteilen:

1. Chitinase und Na₂S.
2. Chitinase und FeS.
3. Chitinase und der Mikroorganismus Desulfovibrio desulfuricans.
4. Chitinase und Na₂S.
5. Chitinase und FeS.
6. Chitin und der Mikroorganismus Desulfovibrio desulfuricans.
7. Ein Mikroorganismus, der gleichzeitig chitinolytische Aktivität und H₂S produziert.

Die obigen Zusammensetzungen sind wirksam gegen eine Vielzahl von phytoparasitischen Nematoden einschließlich, unter anderem, Meloidogyne-Spezies, wie M. incognita; Angina-Spezies, wie A. tritici; Ditylencus-Spezies, wie D. dipsaci; Pratylenchus-Spezies, wie P. coffee; Heterodera-Spezies, wie H. glycines; Aphelenchus-Spezies, wie A. avenae; Radopho/us-Spezies, wie R. similis; Xiphinema-Spezies, wie X. index; Rotylenchulus-Spezies, wie R. reniformis; Zoonematoden, wie: Haemonchus spp., Trichostrongylus spp., Ostertagia spp., Nematodirus spp., Cooperia spp., Ascaris spp., Bunostomum spp., Oesophagostomum spp., Chabertia spp., Trichuris spp., Strongylus spp., Trichonema spp., Dictyocaulus spp., Capillaria spp., Heterakis spp., Toxocara spp., Ascaridia spp., Oxyuris spp., Ancylostoma spp., Uncinaria spp., Toxascaris spp. und Parascaris spp.; Trematoden, wie Fasciola hepatica; phytopathogene Bakterien, wie Erwinia chrysanthemi, Burkholderia glumae; und phytopathogene Pilze, wie Pestalotia palmarum, Alternaria tabacina und Sarocladium orizae.
Beispiele
Beispiel 1: In-vitro-Bewertung der nematiziden Wirkung von Schwefelwasserstoff aus chemischen Quellen und eines chitinolytischen Enzyms.
Eier von den Zoonematoden Haemonchus spp. und Trichostrongylus colubriformis und Dictyocaulus viviparus sowie Larven parasitischer Phytonematoden (Jugendform 2) von Melodoigyne incognita wurden verwendet.
Die Nematoden Haemonchus spp und Trichostrongylus colubriformis wurden aus dem Labmagen von Schafen bzw. Rindern gesammelt. Die adulten weiblichen Nematoden wurden in einer physiologischen Lösung gewaschen und 1 Minute lang mit 0,5% "Hibitan" (Chlorhexidinacetate) behandelt, und der Prozess wurde bei 37 °C entwickelt. Ungefähr 100 zuvor desinfizierte Individuen wurden in einen Erlenmeyer-Kolben, der 50 ml LB-Mediumlösung enthielt, eingeführt, mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnt und über Nacht ihre Eier legen gelassen (8–10 Stunden).
Der Nematode D. viviparus wurde aus der befallenen Lunge eines zuvor getöteten Rinds gesammelt. Dasselbe Verfahren wurde für Haemochus spp. und T. colubriformis verwendet, doch man ließ die Weibchen 2–3 Stunden lang ihre Eier legen.
Von diesem Zeitpunkt an erfolgte die Manipulation unter aseptischen Bedingungen in einer vertikalen laminaren Strömung unter Verwendung von 24-Napf-Gewebekulturplatten. Das Gesamtvolumen des Mediums, das die Weibchen und die Eier enthielt, wurde mit einem Siebnetz von 60 μm filtriert. Die Nematodeneier wurden auf dem 30-μm-Netz eines zweiten Siebs aufgefangen. Sie wurden 3 Minuten lang in eine Lösung von 0,5% Hibitan eingeführt und dann dreimal mit LB-Medium gewaschen, das mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnt war.
Sobald sie desinfiziert waren, wurden die Eier aus dem Sieb entnommen und vorsichtig in einer mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnten LB-Mediumlösung resuspendiert. Das Endergebnis der Verteilung wurde überprüft, indem man die Eier in jedem Napf mit einem umgekehrten Olympus-Mikroskop zählte und registrierte, und Beobachtungen der Gleichmäßigkeit des Entwicklungsstadiums in dieser Phase wurden ebenfalls vorgenommen.
Die Eier von Haemochus spp. und T. colubriformis schlüpfen nach 24 bis 48 Stunden Inkubation bei 28 °C, während die Eier von D. viviparus innerhalb von 24 Stunden schlüpfen. Ein gutes Probenpräparat ist erreicht, wenn in allen unbehandelten Kontrollen in den zuvor für jede Spezies vorgesehenen Zeiträumen mehr als 60% der Eier schlüpfen.
Die Sammlung der Eiermasse von Meloidogyne incognita erfolgte aus Kürbiswurzeln (Cucurbita pepo), die zuvor infiziert und in Treibhäusern kultiviert wurden. Für diese Operation wurden ein Stereomikroskop und Nadeln mit in geeigneter Weise veränderten Spitzen verwendet. Die Massen wurden in steriles destilliertes Wasser in Petri-Schalen bei 28 °C gegeben, und zwar in einer Zahl von 50 Massen pro Schale. Tägliche Beobachtungen wurden durchgeführt, um zu überprüfen, wann die Eier schlüpfen. In ungefähr 72 Stunden gab es genug Larven, um mit dem Sammeln und Desinfizieren zu beginnen.
Das Gesamtvolumen an Wasser, das die Eiermassen und die Larven enthielt, wurde durch ein Siebnetz von 60 μm filtriert. Von diesem Zeitpunkt an erfolgte die Manipulation unter aseptischen Bedingungen in einer vertikalen laminaren Strömung unter Verwendung von 24-Napf-Gewebekulturplatten. Die aus der Masse abgelösten Eier konnten nicht schlüpfen und blieben auf dem Siebnetz von 30 μm zurück; die Larven wurden mit einem weiteren Netz von 5 μm gesammelt. Sie wurden 3 Minuten lang in eine Lösung von 0,5% Hibitan eingeführt und dann dreimal mit LB-Medium gewaschen, das mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnt war. Sobald sie desinfiziert waren, wurden die Meloidogyne-incognita-Larven aus dem Siebnetz entnommen und vorsichtig in einer mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnten LB-Mediumlösung resuspendiert. Die Endergebnisse des Sammelns und Desinfizierens wurden überprüft, indem man die lebenden Larven mit einem umgekehrten Olympus-Mikroskop zählte und registrierte.
Die Eier und Larven der Nematoden wurden in einer Anzahl von 100 Individuen in ungefähr 2 ml zehnfach verdünntes LB-Medium gegeben. Dieses Volumen wurde in Sicherheitsventile eingeführt, die die Luft durch die Flüssigkeit passieren lassen, und daher kommen die Gase in Kontakt mit den Eiern und Larven. Jedes Ventil war ein Replikat für jede Behandlung.
Der Schwefelwasserstoff wurde durch eine Reaktion von zwei Sulfidsalzen (Na₂S und FeS) mit Salzsäure und aus einer anaeroben Fermentation durch das Bakterium Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans ATCC 27774 (isoliert aus einem Schafpansen) erhalten. Das verwendete chitinolytische Enzym war Chitinase Sigma C 1650 aus dem Bakterium Serratia marcescens.
Die untersuchten Eier und Larven der Nematoden wurden 24 Stunden lang den folgenden Behandlungen unterzogen:

1. Kontrollbehandlung: Chitinase nicht angewendet, und Luft durch das Ventil zirkulieren gelassen.
2. Chitinase-Behandlung: Chitinase in einer Menge von 0,2 Einheiten pro Replikat.
3. Sulfidbehandlung: Schwefelwasserstoff aus Na₂S mit einem 0,2-Fluss von 0,3 mg/Minute.
4. Sulfidbehandlung: Schwefelwasserstoff aus FeS mit einem 0,2-Fluss von 0,3 mg/Minute.
5. Sulfidbehandlung: Schwefelwasserstoff aus Desulfovibrio desulfuricans mit einem 0,2-Fluss von 0,3 mg/Minute.
6. Kombinierte Behandlung: gleichzeitige Anwendung der Behandlungen 2 und 3.
7. Kombinierte Behandlung: gleichzeitige Anwendung der Behandlungen 2 und 4.
8. Kombinierte Behandlung: gleichzeitige Anwendung der Behandlungen 2 und 5.

Alle obigen Behandlungen hatten 4 Replikate.
Vierundzwanzig Stunden nach dem Beginn des Experiments wurden die auftretenden Larven (Haemonchus sp., T. colubriformis und D. viviparus) bzw. die lebenden Larven (Melodogyne incognita) bei allen Behandlungen gezählt. Die Effektivitätsergebnisse (E) sind in Tabelle 1 gezeigt. Dieser Wert ist der Mittelwert der 4 Replikate bei jeder Behandlung. Eine Varianzanalyse (ANOVA) wurde auf die Ergebnisse, die bei jeder Nematodenspezies in der Studie erhalten wurden, getrennt angewendet; der Duncan-Test (Lerch G. 1977, La Experimentación en las ciencias biológicas y agrίcolas, 1. Ausgabe, S. 203–308, Editorial Cientίfico-Técnica, Havanna) wurde angewendet, was ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt ist. Gleiche Buchstaben zeigen an, dass es keine signifikanten Unterschiede (p < 0,05) zwischen den Behandlungen gab.
Tabelle 1: Behandlungseffektivität (E)*

* Die Effektivität (E) ist das Ergebnis der Subtraktion des Werts der relativen Häufigkeit (Fr) des Schlüpfens bzw. der lebenden Larven von 1. Fr ist das Verhältnis zwischen der Zahl der auftretenden oder lebenden Larven bei jeder Behandlung (Ntto) und der Zahl der auftretenden oder lebenden Larven bei Behandlung 1 (Nc): E = 1 – Fr, wobei Fr = Ntto/Nc; somit E = 1 – Ntto/Nc

Um die synergistische Wirkung bei den Behandlungen 6, 7 und 8 zu bestimmen, wurde angenommen, dass die dort auftretenden Ereignisse nicht ausschließend sind.
Bei dieser Art von Analyse muss die erwartete Effektivität (EE) gleich der Summe der einzelnen Effektivitäten (EI), die durch die Effektivität aufgrund der Chitinasewirkung (Eq) und die Effektivität aufgrund der Schwefelwasserstoffwirkung (Esn, Esf und Esd) gegeben sind, minus der Schnittwirkung (ei) sein (Sigarroa, A. 1985, Biometrίa y diseño experimental, 1. Teil, Ministerio de Educación Superior, Editorial Pueblo y Educación, Havanna, Kap. 3, S. 69–107). EE = Eq + Es – ei, wobei ei = Eq × Es
Wenn die experimentelle Effektivität (E) bei den Behandlungen, bei denen zwei nematizide Mittel miteinander kombiniert werden (Behandlungen 6, 7, 8), größer ist als die erwartete Effektivität (EE) für diese Behandlungen, kann bestätigt werden, dass es einen Synergismus gibt in Bezug auf die nematizide Aktivität des chitinolytischen Mittels (Chitinase) und des Schwefelwasserstoffs, wenn beide gleichzeitig bei derselben Behandlung angewendet werden. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2. Experimentelle (E) und erwartete (EE) Effektivität
Bei den drei Behandlungen, bei denen Chitinase und Schwefelwasserstoff gleichzeitig miteinander kombiniert werden, war die experimentelle Effektivität (E) für die vier untersuchten Nematoden größer als die erwartete Effektivität (EE), was statistisch die Existenz eines Synergismus zwischen den beiden Verbindungen (wenn sie gleichzeitig wirken) bezüglich ihrer nematiziden Aktivität beweist.
Bezüglich der Herkunft der Sulfide und ihrer nematiziden Wirkung wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet (Tabelle 1).
Beispiel 2: Treibhausbewertung der nematiziden Wirkung eines chitinolytische Aktivität induzierenden Mittels (Chitin) und eines schwefelwasserstoffbildenden Mittels (Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans ATCC 29577, aus dem Boden isoliert).
Braunerde mit neutralem pH wurde ausgewählt: Sie wurde getrocknet und mit einem 0,5-cm-Netz gesiebt, um die unerwünschten Teilchen zu entfernen. Sie wurde 1 Stunde lang in einem vertikalen Autoklaven bei 120 °C und unter 1 Atmosphäre sterilisiert (Sambrook J., Fritsch E.F. und Maniatis T. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA). Sie wurde 3–4 Tage lang bei Raumtemperatur getrocknet, um später die vorgesehenen Gemische bei den Behandlungen mit Flusssand, Regenwurmhumus und Chitin herzustellen (ICN Katalognummer 101334).
Zwanzig Töpfe (15 cm Durchmesser × 13 cm Tiefe und 1 Liter Kapazität) wurden bei den folgenden Behandlungen mit den eingestellten Anteilen gefüllt:

1. Kontrollbehandlung: Erde 70%, Flusssand 25% und Humus 5%.
2. Chitinbehandlung: Erde 70%, Flusssand 25%, Humus 4% und Chitin 1%.
3. Mikroorganismusbehandlung: Erde 70%, Flusssand 25%, Humus 5% und D. desulfuricans, angewendet bis zu einer Konzentration von 10¹⁰ CFU/Topf.
4. Kombinierte Behandlung: Erde 70%, Flusssand 25%, Humus 4%, Chitin 1% und D. desulfuricans, angewendet bis zu einer Konzentration von 10¹⁰ CFU/Topf.

Jede Behandlung wurde mit 5 Replikaten (Töpfen) durchgeführt.
Bei den Behandlungen 2 und 4 wurde eine Vormischung von Humus und Chitin in einem Verhältnis von 4:1 hergestellt, und dann erfolgte die endgültige Mischung mit der Erde und dem Sand. Bei den Behandlungen 3 und 4 wurde D. desulfuricans mit 100 ml deionisiertem Wasser pro Topf angewendet. Diese Volumina wurden während des ersten Gießens gleichmäßig aufgetragen.
Bei allen Behandlungen wurden 500 Nematodenexemplare von Radopholus similis, die zuvor aus natürlich befallenen Bananenwurzeln gesammelt worden waren, in die Töpfe eingeimpft. Die Zentrifugations-Flotations-Technik (Jenkins, W.R. 1964, A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil, Plant Disease Reporter, 48:692) wurde verwendet; die Proben wurden mit 5 ml destilliertem Wasser verdünnt und in einer Tiefe von 5 cm unter der Bodenoberfläche gleichmäßig aufgetragen.
Die Töpfe wurden in Treibhäuser gestellt und blieben drei Tage lang stehen, nachdem die Behandlungen angewendet und die Nematoden eingeimpft worden waren. Während dieses Stadiums wurde täglich gegossen, um gute Feuchtigkeitsbedingungen aufrechtzuerhalten. Vor dem vierten Tag der Behandlungen wurde eine Bananenpflanze der Varietät Cavendish, die durch in-vitro-Gewebekultur erhalten wurde, in die Töpfe umgepflanzt. Von diesem Zeitpunkt an wurde ein strenger Gießplan befolgt, der in seiner Feldkapazität eine permanente Bodenfeuchtigkeit ermöglichte.
Die endgültige Bewertung erfolgte drei Monate nach Beginn des Experiments, und die Wurzeln der Pflanze wurden vorsichtig aus dem Boden entnommen. Dann wurde die Zahl der Exemplare (Larven und Adulte) und der lebenden Nematoden, die aus den Pflanzen gesammelt wurden, registriert, wobei man die Zentrifugati ons-Flotations-Technik (Jenkins, W.R. 1964, A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil, Plant Disease Reporter, 48:692) und ein umgekehrtes Mikroskop für die Zählungen verwendete. Die Effektivitätsergebnisse für die verschiedenen Behandlungen sind in Tabelle 3 gezeigt. Dies ist der Mittelwert der 5 Replikate für jede Behandlung. Eine Varianzanalyse (ANOVA) wurde auf die erzielten Ergebnisse angewendet, und dann erfolgte ein Duncan-Test (Lerch G. 1977, La Experimentación en las ciencias biológicas y agrίcolas, 1. Ausgabe, S. 203–308, Editorial Cientίfico-Técnica, Havanna), was in Tabelle 3 gezeigt ist. Gleiche Buchstaben zeigen an, dass es keine signifikanten Unterschiede (p < 0,05) zwischen den Behandlungen gab.
Tabelle 3. Behandlungseffektivität (E)*

* Die Effektivität (E) ist das Ergebnis der Subtraktion des Werts der relativen Häufigkeit (Fr) der lebenden Exemplare von 1. Fr ist das Verhältnis zwischen der Zahl der lebenden Exemplare bei jeder Behandlung (Ntto) und der Zahl der lebenden Exemplare bei Behandlung 1 (Nc): E = 1 – Fr, wobei Fr = Ntto/Nc; somit E = 1 – Ntto/Nc

Um die mögliche synergistische Wirkung bei Behandlung 4 zu bestimmen, wurde angenommen, dass die dort auftretenden Ereignisse (nematizide Wirkung) nicht ausschließend sind.
Wie in Beispiel 1 muss die erwartete Effektivität (EE) gleich der Summe der einzelnen Effektivitäten (EI), die durch die Effektivität aufgrund der Chitinwirkung (Eq) als Induktor der chitinolytischen Aktivität der in dem Gemisch von Erde und Humus vorhandenen Mikroorganismen und die Effektivität aufgrund der Wirkung von Schwefelwasserstoff (Esd) aus den Bakterien D. desulfuricans gegeben sind, minus der Schnittwirkung (ei) zwischen den beiden Behandlungen sein (Sigarroa, A. 1985, Biometrίa y diseño experimental, 1. Teil, Ministerio de Educación Superior, Editorial Pueblo y Educación, Havanna, Kap. 3, S. 69–107). EE = Eq + Es – ei, wobei ei = Eq × Es
Wenn die experimentelle Effektivität (E) bei Behandlung 4, bei der die zwei nematiziden Mittel miteinander kombiniert werden, größer ist als die erwartete Effektivität (EE), kann bestätigt werden, dass es einen Synergismus gibt zwischen dem chitinolytische Aktivität induzierenden Mittel (Chitin) und Schwefelwasserstoff (von D. desulfuricans), wenn sie gleichzeitig bei derselben Behandlung angewendet werden. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4: Experimentelle (E) und erwartete (EE) Effektivität
Bei Behandlung 4 werden ein Induktor der chitinolytischen Wirkung (Chitin) und eine biologische Quelle für Schwefelwasserstoff (D. desulfuricans) miteinander kombiniert. In diesem Fall war die experimentelle Effektivität (E) größer als die erwartete Effektivität (EE), was die Existenz eines Synergismus (bezüglich der nematiziden Aktivität) bei den beiden Verbindungen, wenn sie gleichzeitig in den Boden eingebracht werden, beweist.
Beispiel 3: Nachweis der chitinolytischen Aktivität und Sulfiderzeugung durch die Bakterien Corynebacterium paurometabolum C-924 und Tsukamurella paurometabola DSM 20162
Bestimmung der Sulfidproduktion:
In 100-ml-Röhrchen zum Auffangen von Gas wurden Proben aus dem Gasstrom aus der Fermentation der Stämme C-924 und DSM 20162 in 5-l-Bioreaktoren entnommen. Die Gesamtkulturzeit betrug 24 h. Die Bildung von Schwefelwasserstoff wurde zuerst in der 16. Stunde nachgewiesen.
Die Proben wurden analog zu dem erzeugten H₂S-Muster verarbeitet. Die Analyse wurde im Varian-Gaschromatograph durchgeführt, wobei diese Bedingungen befolgt wurden:

• Flammenphotometriedetektor mit einem Filter, der gegenüber schwefelhaltigen Verbindungen empfindlich ist.
• Schwefelwasserstoffmuster: 43,2 ng/ml, durch Duplikat.
• Proben: Duplikat für jedes Mal, wenn eine Probenahme erfolgte.
• Injektion: 1 ml oder μl Kopfraum.
• Säule: DB-5 (15 m × 0,53 mm).
• Temperatur: 35 °C.
• Trägergas: Stickstoff 1,5 ml/min.
• Detektor: FPD-S
• Spülgas: Stickstoff 30 ml/min.

Tabelle 5 zeigt eine Zusammenfassung der Analyse der Sulfidgase, die zu verschiedenen Zeitpunkten durch die beiden Stämme freigesetzt wurden.
Tabelle 5: Analyse der Sulfidgase
Beide Stämme erzeugen Sulfide, aber C-924 erzeugt einen höheren Fluss als der Stamm DSM 20162.
Bestimmung der chitinolytischen Aktivität:
Die Stämme Corynebacterium paurometabolum C-924, Tsukamurella paurometabola DSM 20162, Serratia marcescens ATCC 13880 und E. coli ATCC 25922 wurden verwendet.
Die Bakterienkulturen der untersuchten Stämme wurden 24 Stunden lang in LB-Medium bei 28 °C und mit 100 U/min gezüchtet, und anschließend wurde mit 3500 U/min zentrifugiert; die Überstände wurden durch die 0,2-μm-Netze filtriert. Das filtrierte Produkt wurde in Platten, die mit einer kolloidalen Chitinsuspension (0,5%) präpariert worden waren, einem Assay unterzogen, Agarose wurde bis zu 0,8% hinzugefügt, um ein Gelieren des Mediums zu erreichen und Porosität zu gewährleisten und dadurch die Diffusion des Proteins zu erleichtern. Nach dem Gelieren wurden Näpfe mit 5 mm Durchmesser geöffnet, und 100 μl des filtrierten Überstands von jedem Bakterienstamm wurden hinzugefügt. Für jede Platte wurden drei Replikate verwendet, und sie wurden bei 28 °C im Dunklen inkubiert.
Ab der 48. Stunde wurde eine Abnahme der Trübheit des Mediums beobachtet, die einem Hof ähnelt, was die Hydrolyse von Chitin bewies. In der folgenden Tabelle (Tabelle 6) sind die qualitativen Ergebnisse vom Auftreten eines Hydrolysehofs bei verschiedenen Inkubationszeiten mit dem Überstand von der Kultur der verschiedenen untersuchten Stämme gezeigt.
Tabelle 6: Auftreten eines Hydrolysehofs

+++ bezieht sich auf den größten beobachteten Hydrolysehof;
++ bezieht sich auf einen mittelgroßen Hydrolysehof; und
+ bezieht sich auf den kleinsten beobachteten Hydrolysehof.

Beide Stämme (C. paurometabolum und T. paurometabola) zeigten den Chitinhydrolysehof, genau wie die verwendete positive Kontrolle (S. marcescens), während der E.-coli-Stamm (negative Kontrolle) keinen Hydrolysehof erzeugte.
Beispiel 4: In-vitro-Bewertung von Wirkungen von Sulfiden und Chitinasen, die durch die Bakterien Corynebacterium paurometabolum C-924 und Tsukamurella paurometabola DSM 20162 erzeugt wurden, auf den Parasiten Fasciola hepatica (Trematode).
Eier von dem Parasiten Fasciola hepatica wurden verwendet. Die Eier wurden direkt aus der Galle der befallenen Leber eines zuvor getöteten Rindes gesammelt. Der Gallegehalt wurde in einem dreimal größeren Volumen von destilliertem Wasser resuspendiert und 2–3 Stunden lang auf 28 °C gehalten, um eine Ausfällung der Eier zu erreichen. Dann wurde das größtmögliche Volumen der überstehenden Flüssigkeit entfernt. Der Niederschlag wurde durch ein Siebnetz von 71 μm filtriert, wo die Eier abgefangen wurden.
Von diesem Zeitpunkt an erfolgten alle Manipulationen unter aseptischen Bedingungen in einer vertikalen laminaren Strömung unter Verwendung von 24-Napf-Gewebekulturplatten. Das Sieb mit den F.-hepatica-Eiern wurde 3 Minuten lang in eine Lösung von 0,5% Hibitan eingeführt und dann dreimal mit LB-Medium gewaschen, das mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnt war.
Sobald sie desinfiziert waren, wurden die Eier aus dem Sieb entnommen und vorsichtig in einer mit sterilem destilliertem Wasser auf das Zehnfache verdünnten LB-Mediumlösung resuspendiert. Die Endergebnisse des Sammelns und Desinfizierens wurden überprüft, indem man die lebenden Larven mit einem umgekehrten Olympus-Mikroskop zählte und registrierte.
Beobachtungen zur Gleichmäßigkeit des Entwicklungsstadiums in dieser Phase wurden ebenfalls durchgeführt.
Die Eier dieses parasitischen Trematoden schlüpfen unter den zuvor eingestellten in-vitro-Bedingungen in etwa 15 Tagen Inkubation bei 28 °C; als gutes Präparat der Probe gilt es, wenn am Ende der Inkubationszeit mehr als 60% der Eier geschlüpft sind.
Um das Experiment zu entwickeln, wurden die desinfizierten Eier in einer Anzahl von ungefähr 100 Individuen in 1 ml zehnfach verdünntes LB-Medium gegeben. Das Volumen wurde gleichmäßig in 20 Sicherheitsventile eingeführt, die den Durchtritt von Luft durch die Flüssigkeit ermöglichen; somit kamen die Gase mit den Eiern in Kontakt. Jedes Ventil war ein Replikat (4 pro Behandlung) in allen fünf Behandlungen.
Die F.-hepatica-Eier wurden während der letzten 4 Tage der Inkubation den folgenden Behandlungen unterzogen:

1. Kontrollbehandlung: Zugabe von 1 ml zehnfach verdünntem LB-Medium zu jedem Ventil, ohne Chitinase, und Luft wird hindurch zirkulieren gelassen.
2. Zugabe von 1 ml eines chitinolytischen Überstands ohne Bakterienzellen von einer Kultur von 10¹⁰ koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (CFU/ml) Corynebacterium paurometabolum C-924 zu jedem Ventil.
3. Zugabe von 1 ml eines chitinolytischen Überstands ohne Bakterienzellen von 10¹⁰ CFU/ml Tsukamurella paurometabola DSM 20162 zu jedem Ventil.
4. Der Fluss von Gasen aus einer kontinuierlichen Kultur von Corynebacterium paurometabolum C-924 mit 10¹⁰ CFU/ml wurde durch die Ventile passieren gelassen.
5. Der Fluss von Gasen aus einer kontinuierlichen Kultur von Tsukamurella paurometabola DSM 20162 mit 10¹⁰ CFU/ml wurde durch die Ventile passieren gelassen.
6. Kombinierte Behandlung: gleichzeitige Anwendung der Behandlungen 2 und 4.
7. Gleichzeitige Behandlung: gleichzeitige Anwendung der Behandlungen 3 und 5.

Am vierten Tag nach Beginn des Experiments wurden die geschlüpften Eier gezählt. Im Falle von F. hepatica war es aufgrund der großen Beweglichkeit der Larven (Miraciden), die herauskommen, nicht möglich, sie zu zählen; daher konzentrieren sich Beobachtungen durch das Mikroskop auf die Eier. Die Effektivitätsergebnisse aus den verschiedenen Behandlungen sind in Tabelle 7 gezeigt. Dies ist der Mittelwert für die 4 Replikate bei jeder Behandlung. Gleiche Buchstaben zeigen an, dass es keine signifikanten Unterschiede (p < 0,05) zwischen den Behandlungen gab.
Tabelle 7: Behandlungseffektivität (E)*

* Die Effektivität (E) ist das Ergebnis der Subtraktion des Werts der relativen Häufigkeit (Fr) des Schlüpfens von 1. Fr ist das Verhältnis zwischen der Zahl der geschlüpften Eier bei jeder Behandlung (Ntto) und der Zahl der geschlüpften Eier bei Behandlung 1 (Nc): E = 1 – Fr, wobei Fr = Ntto/Nc; somit E = 1 – Ntto/Nc

Um die mögliche synergistische Wirkung bei den Behandlungen 6 und 7 zu bestimmen, wurde angenommen, dass die dort auftretenden Ereignisse (antiparasitische Wirkung) nicht ausschließend sind.
Bei dieser Art von Analyse ist die erwartete Effektivität (EE) gegeben durch die Effektivität aufgrund der Chitinasewirkung (Eq) und die Effektivität aufgrund der Schwefelwasserstoffwirkung (Esn, Esf und Esd) minus der Schnittwirkung (ei) (Sigarroa, A. 1985, Biometrίa y diseño experimental, 1. Teil, Ministerin de Educación Superior, Editorial Pueblo y Educación, Havanna, Kap. 3, S. 69–107). EE = Eq + Es – ei, wobei ei = Eq × Es
Wenn die experimentelle Effektivität (E) bei den Behandlungen, bei denen zwei antiparasitische Mittel miteinander kombiniert werden (Behandlungen 6 und 7), größer ist als die erwartete Effektivität für diese Behandlungen, kann bestätigt werden, dass es einen Synergismus gibt in Bezug auf die antiparasitische Aktivität des chitinolytischen Mittels (Chitinase) und des Schwefelwasserstoffs, wenn beide gleichzeitig bei derselben Behandlung angewendet werden. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8. Experimentelle (E) und erwartete (EE) Effektivität
Bei den Behandlungen, bei denen Chitinase und Schwefelwasserstoff miteinander kombiniert werden, war die experimentelle Effektivität (E) größer als die erwartete Effektivität (EE), was den Synergismus zwischen den beiden Verbindungen, wenn sie gleichzeitig wirken, bezüglich ihrer nematiziden Aktivität beweist.
Beispiel 5: In-vitro-Bewertung der Wirkung eines Bakterienstamms (Corynebacterium paurometabolum C-924), der Schwefelwasserstoff erzeugt und chitinolytische Wirkung hat, auf mehrere Bakterien und Pilze.
Die folgenden Pilzspezies wurden verwendet: Pestalotia palmarum, Alternaria tabacina, Sarocladium orizae, Pythium debaryanum; und ebenfalls verwendet wurden die folgenden Bakterienspezies: Erwinia chrysanthemi, Burkholderia glumae, Serratia marcescens ATCC 13880, Bacillus subtilis F 1695 und Escherichia coli ATCC 25922.
A) Pilzassay.
Die Wechselwirkung von Corynebacterium paurometabolum C-924 mit Pilzen wurde an diesen Pilzen bestimmt: Pestalotia palmarum, Alternaria tabacina, Sarocladium orizae und Pythium deharyanum. Der Stamm Serratia marcescens ATCC 13880 wurde als positive Kontrolle für die fungizide Wirkung verwendet, und der E.-coli-Stamm ATCC 25922 wurde als negative Kontrolle für die fungizi de Wirkung verwendet. Die Bakterienkulturen wurden für alle Spezies unter den üblichen Schüttel- und Temperaturbedingungen in 24 Stunden gezüchtet. Die notwendigen Verdünnungen wurden mit der Extinktion bei λ = 530 nm hergestellt, so dass eine Zellkonzentration von 10⁹ cfu/ml gewährleistet wurde. Sie wurden in Petri-Schalen gegeben, die PDA-Medium (Agar-Kartoffel-Dextrose) enthielten, die Impfungen erfolgten mit einer zentralen Linie und mit Hilfe der mikrobiologischen Öse. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert, dann wurden die Scheiben der verschiedenen zuvor gezüchteten Pilzstämme mit 8 mm Durchmesser eingeimpft (Platten, die PDA-Medium enthielten) und an beiden Polen bezüglich der zentralen Linie der eingeimpften Bakterien auf die Oberfläche der Platte gelegt. Drei Replikate wurden für jeden zu untersuchenden Pilz verwendet und 10 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Die Ergebnisse wurden vom fünften Tag seit Beginn des Experiments an abgelesen.
b) Bakterieller Assay
Das Eintreffen der Wechselwirkung zwischen Corynebacterium paurometabolum C-924, E. coli ATCC 25922 und Bacillus subtilis F 1695 wurde bei diesen Bakterien untersucht: Erwinia chrysanthemi und Burkholderia glumae. Der Bacillus-subtilis-Stamm F 1695 wurde als positive Kontrolle für den Antagonismus mit anderen Bakterien verwendet, und als negative Kontrolle wurde der E.-coli-Stamm ATCC 25922 verwendet. Die Bakterienstämme wurden in LB-Medium unter den üblichen Schüttel- und Temperaturbedingungen während 24 Stunden gezüchtet. Von diesen Kulturen wurden die notwendigen Verdünnungen mit einer zuvor erfolgenden Extinktionsablesung bei λ = 530 nm hergestellt, so dass eine Zellkonzentration von 10⁹ cfu/ml gewährleistet wurde. Im Falle von C-924 wurden Tropfen von 5 μl auf drei verschiedene Stellen auf Platten mit LB-Medium, auf zwei verschiedene Stellen für die positive Kontrolle und zwei andere verschiedene Stellen für die negative Kontrolle aufgetragen. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert. Nach dieser Zeit wurden sie 3 Minuten lang mit Chloroformdampf behandelt (um zu inaktivieren und die Dispersion in weiteren Schritten zu vermeiden), dann wurde die Platten in der laminaren Strömung gelassen, halboffen, um das überschüssige Gas zu beseitigen. Die Einimpfung der provozierenden Stämme Erwinia chrysanthemi und Burkholderia glumae wurde durchgeführt, was mit Reinkulturen von jedem Mikroorganismus begann, von denen die notwendigen Mengen zum Erreichen einer Zellkonzentration von 10⁹ cfu/ml entnommen wurden, nachdem bis auf drei Milliliter halbfestes LB-Medium aufgefüllt wurde (0,1% technischer Agar Nr. 3). Das Gemisch wurde auf den Platten dispergiert, die die provozierten Stämme enthielten, dann wurden sie 48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert, um die Ergebnisse zu bewerten.
Tabelle 9 zeigt die Beschreibung der Ergebnisse, die während der oben erwähnten Wechselwirkungsassays erzielt wurden.
Tabelle 9: Während der Wechselwirkungsassays erzielte Ergebnisse

+++: Ein starker Antagonismus wird beobachtet, wenn das Wachstum aufhört und die Bildung eines Hofes durch die Wirkung von C-924 verursacht wird. Im Falle von Pilzen wird das typische radiale Wachstum gehemmt.
++: Mittlere antagonistische Wirkung von C-924 auf den Mikroorganismus.
+: Geringfügige antagonistische Wirkung von C-924 auf den Mikroorganismus.
–. Keine antagonistische Wirkung von C-924 auf den Mikroorganismus wird beobachtet.

Wie in Tabelle 9 gezeigt ist, gibt es eine ausgeprägte antagonistische Wirkung des Stammes Corynebacterium paurometabolum C-924 auf die Pilze Pestalotia Palmarum, Alternaria tabacina und Sarocladium orizae, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen hohen Chitingehalt in ihren Strukturen haben. Nur ein geringfügiger Antagonismus, der durch die Wirkung von Schwefelwasserstoff verursacht wird, wurde beobachtet. Im Falle der Wechselwirkung mit den untersuchten Bakterien wurde der Antagonismus bei den beiden pathogenen Stämmen (Erwinia chrysanthemi und Burkholderia glumae) beobachtet, während im Falle von Bacillus subtilis kein Antagonismus beobachtet wurde, da dieses aus einem Antagonistenboden mit anderen Mikroorganismen isoliert wird und daher resistenter gegenüber nachteiligen Umweltfaktoren ist.

Claims

Zusammensetzung zur Verwendung in der Agrikultur und Veterinärmedizin, umfassend wenigstens ein chitinolytisches Mittel oder ein chitinolytische Aktivität induzierendes Mittel und ein Sulfid oder ein sulfidbildendes Mittel.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das chitinolytische Mittel eine Chitinase ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das chitinolytische Mittel ein Chitinase bildendes Mittel ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei das Chitinase bildende Mittel ein Mikroorganismus ist, der zwischen 10⁷ koloniebildenden Einheiten (CFU) und 10¹² CFU des Mikroorganismus pro Gramm der Zusammensetzung enthält.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem chitinolytische Aktivität induzierenden Mittel um Chitin handelt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das Chitin im Bereich zwischen 1 und 50% liegt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das sulfidbildende Mittel ein Mikroorganismus ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, die zwischen 10⁷ CFU und 10¹² CFU des Mikroorganismus pro Gramm der Zusammensetzung enthält.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die sulfidbildenden Mittel chemische Mittel sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Sulfidproduktion im Bereich von 0,1 mg/Minute bis 1,0 mg/Minute pro Gramm der Zusammensetzung liegt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem chitinolytischen Mittel und dem sulfidbildenden Mittel um einen Mikroorganismus handelt.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Bekämpfung von parasitischen Zoonematoden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei den parasitischen Zoonematoden um Haemonchus spp., Trichostrongylus spp. und Dictiocaulus spp. handelt.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Bekämpfung von parasitischen Phytonematoden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei den parasitischen Phytonematoden um Meloidogyne spp. und Radopholus similis handelt.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Bekämpfung von pathogenen Bakterien bei Pflanzen und Tieren.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei den pathogenen Bakterien um Erwinia spp. und Burkholderia spp. handelt.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Bekämpfung von pathogenen Pilzen bei Pflanzen und Tieren.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, wobei es sich bei den pathogenen Pilzen um Pestalotia palmarum, Alternaria tabacina und Sarocladium orizae handelt.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Bekämpfung von parasitischen Trematoden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, wobei es sich bei der parasitischen Trematode um Fasciola hepatica handelt.
Zusammensetzung zur Verwendung in der Agrikultur und/oder Veterinärmedizin gemäß den vorstehenden Ansprüchen, wobei ein geeigneter Träger, wie ein Düngemittel, vorgepackte Erde, eine Saatabdeckungsvorrichtung, ein Pulver, Granulat, Vernebler, eine Suspension, Flüssigkeit oder eine der angegebenen Formen in einer eingekapselten Zubereitung, verwendet wird, zur Bekämpfung von parasitischen Helminthen, Bakterien und pathogenen Pilzen.