DE60110127T2 - LIGATION PROCESSES AND REAGENTS FOR FORMING AMID BINDING - Google Patents

Abstract

Methods and reagents for the formation of amide bonds between an activated carboxylic acid derivative and an azide useful in the synthesis of peptides, proteins and derivatized or labeled amino acids, peptide or proteins. The method involves the formation of a phosphinothioester which reacts with an azide resulting in amide formation. The invention provides phosphinothiol reagents which convert activated carboxylic acid derivatives to phosphinothioesters which then react with azides to form an amide bond. The methods and reagents of the invention can be used for stepwise synthesis of peptides on solid supports or for the ligation to two or more amino acids, two or more peptide or two or more protein fragments.

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Peptidchemie, insbesondere betreffend Verfahren zur Ausbildung von Amidbindungen, die für die Synthese von Peptiden und Proteinen und auch die Synthese von derivatisierten Peptiden oder Proteinen verwendbar sind.These The invention relates to the field of peptide chemistry, in particular concerning Process for the formation of amide bonds necessary for the synthesis of peptides and proteins and also the derivatized synthesis Peptides or proteins are useful.

Neue Verfahren erleichtern die chemische Gesamtsynthese von Proteinen. Als historische Referenzen, siehe: Merrifield, R. B. Science 1984, 232, 341–347; Kent, S. B. Annu. Rev.Biochem. 1988, 57, 957–989; Kaiser, E. T. Acc. Chem. Res. 1989, 22, 47–54. Insbesondere Kent und andere haben elegante Mittel entwickelt, um zwei ungeschützte Peptide in wässriger Lösung zu verknüpfen, genannt "native chemische Ligation", Dawson, P. E.; Muir, T. W.; Clark. Lewis, I.; Kent, S. B. Science 1994, 266, 776–779. Als wichtige Vorgänger, siehe: Wieland, T.; Bokelmann, E.; Bauer, L.; Lang, H. U.; Lau, H. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129–149; Kemp, D. S.; Galakatos, N. G.J Org. Chem. 1986, 51, 1821–1829. Als Übersichten, siehe: Muir, T. W.; Dawson, P. E.; Kent, S. B. H. Methods Enzymol. 1997, 289, 266–298; Wilken, J.; Kent, S. B. H. Curr. Opin. Biotechnol. 1998, 9, 412-426;Kochendoerfer, G. G.; Kent, S. B. H. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 665–671; Tam, J. P.: Yu Q.; Miao, Z. Biopolymers 1999, 51, 311–332; Dawson, P. E.; Kent, S. B. H. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 923–960; Borgia, J. A.; Fields, G. B. Trends Biotechnol. 2000, 18, 243–251.New Procedures facilitate the overall chemical synthesis of proteins. As historical references, see: Merrifield, R. B. Science 1984, 232, 341-347; Kent, S.B. Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 957-989; Kaiser, E.T. Acc. Chem. Res. 1989, 22, 47-54. In particular, Kent and others have developed elegant means to two unprotected Peptides in aqueous solution to link, called "native chemical ligation, "Dawson, P.E .; Muir, T.W .; Clark. Lewis, I .; Kent, S.B. Science 1994, 266, 776-779. As important predecessors, see: Wieland, T .; Bokelmann, E .; Bauer, L .; Lang, H. U .; Lau, H. Liebigs Ann. Chem. 1953, 583, 129-149; Kemp, D. S .; Galakatos, N.G.J Org. Chem. 1986, 51, 1821-1829. As overviews, see: Muir, T.W .; Dawson, P.E .; Kent, S.B.H. Methods Enzymol. 1997, 289, 266-298; Wilken, J .; Kent, S.B.H. Curr. Opin. Biotechnol. 1998, 9, 412-426; Kochendoerfer, G.G .; Kent, S.B.H. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 665-671; Tam, J.P .: Yu Q .; Miao, Z. Biopolymers 1999, 51, 311-332; Dawson, P.E .; Kent, S. B. H. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 923-960; Borgia, J.A .; Fields, G. B. Trends Biotechnol. 2000, 18, 243-251.

Bei nativer chemischer Ligation des Thiolats eines N-terminalen Cysteinrests in einem Peptid greift der Kohlenstoff eines C-terminalen Thioesters in einem anderen Peptid an, um letztendlich eine Amidbindung zwischen den beiden Peptiden zu bilden (Schema 1). Dieses Ligationsverfahren wurde entdeckt, als die Reaktion von ValSPh und CysOH in wässrigem Puffer erwies sich als das Dipeptid ergebend: ValCysOH (Wieland et al., 1953).at native chemical ligation of the thiolate of an N-terminal cysteine residue in a peptide, the carbon of a C-terminal thioester attacks in a different peptide to finally an amide bond between to form the two peptides (Scheme 1). This ligation procedure was discovered when the reaction of ValSPh and CysOH in aqueous Buffer proved to yield the dipeptide: ValCysOH (Wieland et al., 1953).

Vor Kurzem haben Muir und andere die Nützlichkeit nativer chemischer Ligation ausgeweitet, indem sie zeigten, dass das Thioesterfragment direkt mit rekombinan ten DNA-, (rDNA)-Techniken erzeugt werden kann. Muir, T. W.; Sondhi, D.; Cole, P. A. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 1998, 9, 6705–6710; Evans, Jr., T. C.; Benner, J.; Xu, M.-Q. Protein Sci. 1998, 7, 2256–2264; Ayers, B.; Blaschke, U. K.; Camarero, J. A.; Cotton, G. J.; Holford, M.; Muir, T. W. Biopolymers 2000, 51, 343–354. Als Übersichten siehe: Holford, M.; Muir, T. W. Structure 1998, 15, 951–956; Cotton, G. J.; Muir, T. W. Chem. Biol. 1999, 6, R247-R256 ; Evans, Jr., T. C.; Xu, M.-Q.Biopolymers 2000, 51, 333–342. Diese Ausweitung von "nativer chemischer Ligation" ist als "exprimierte Proteinligation" bezeichnet worden.In front In short, Muir and others have the utility of native chemical Ligation expanded by showing that the thioester fragment directly with recombinant DNA, (rDNA) techniques can be generated. Muir, T.W .; Sondhi, D .; Cole, P.A. Proc. Natl Acad. Sci. U.S. A. 1998, 9, 6705-6710; Evans, Jr., T. C .; Benner, J .; Xu, M.-Q. Protein sci. 1998, 7, 2256-2264; Ayers, B .; Blaschke, U.K .; Camarero, J.A .; Cotton, G.J .; Holford, M .; Muir, T.W. Biopolymers 2000, 51, 343-354. For overviews see: Holford, M .; Muir, T.W. Structure 1998, 15, 951-956; Cotton, G.J .; Muir, T.W. Chem. Biol. 1999, 6, R247-R256; Evans, Jr., T. C .; Xu, M.-Q. Biopolymers 2000, 51, 333-342. This expansion of "native chemical ligation " has been termed "expressed protein ligation".

Schema 1

Scheme 1

Obwohl Leistungsfähig hat die native chemische Ligation eine ernste Einschränkung. Dieses Verfahren hat eine absolute Zuverlässigkeit bei der Bildung einer Peptidbindung an einen Cysteinrest. Die Erzeugung einer Verknüpfung an einer natürlichen Xaa-Cys-Bindung ist nicht immer möglich, da Cystein nur 1.7% der Reste in globularen Proteinen ausmacht (McCaldon, P.; Argos, P.Proteins 1988,4,99–122). Die moderne Peptidsynthese ist typischerweise auf Peptide von < 50 Resten beschränkt (Dawson et al., 1994; Wieland et al., 1953; Kemp et al., 1986; Muir et al, 1997; Wilken et al., 1986; Kochendoerfer et al., 1999; Tam et al., 1999; Dawson et al., 2000; Borgia et al., 2000). Daher können die meisten Proteine nicht durch ein Verfahren hergestellt werden, das erfordert, dass die Peptide nur an einen Cysteinrest gebunden werden.Although powerful, native chemical ligation has a serious limitation. This method has absolute reliability in forming a peptide bond to a cysteine residue. The generation of a linkage to a natural Xaa-Cys bond is not always possible because cysteine constitutes only 1.7% of the residues in globular proteins (McCaldon, P. Argos, P.Proteins 1988, 4, 1992-122). Modern peptide synthesis is typically limited to peptides of <50 residues (Dawson et al., 1994; Wieland et al., 1953; Kemp et al., 1986; Muir et al., 1997; Wilken et al., 1986; Kochendoerfer et al , 1999; Tam et al., 1999; Dawson et al., 2000; Borgia et al., 2000). Therefore, most proteins can not be produced by a process requires that the peptides be bound to only one cysteine residue.

Weiterhin ist das Installieren eines extra Cysteinrests oft nicht wünschenswert. Cysteine ist bei weitem der reaktivste Rest gegenüber Disulfidbindungen,O2 (g), und anderen elektrophilen (Schneider, C. H.; deWeck, A. L.Biochim. Biophys. Acta 1965, 168,27–35; Raines, R. T. NatureStruct. Biol. 1997,4,424–427). Zusätzlich kann die Sulfhydrylgruppe von Cystein einer β-Eliminierung unterliegen, um Dehydroalanin zu bilden, welches weiterer Reaktion unterliegen kann (Friedman,M. Adv.Exp. Med. Biol. 1999,459, 145–159). Die Entfernung der Cysteineinschränkung durch Anwenden einer allgemeineren Ligationstechnik würde die Anwendbarkeit einer Gesamtproteinsynthese erweitern.Farther installing an extra cysteine residue is often undesirable. Cysteine is by far the most reactive residue towards disulfide bonds, O2 (g), and other electrophiles (Schneider, C. H .; deWeck, A. L.Biochim. Biophys. Acta 1965, 168, 27-35; Raines, R.T. NatureStruct. Biol. 1997, 4, 244-427). In addition, the sulfhydryl group of cysteine of a β-elimination to form dehydroalanine, which is another reaction (Friedman, M. Adv. Exp. Med. Biol. 1999, 459, 145-159). The Removal of cysteine restriction by applying a more general ligation technique, the Extend applicability of total protein synthesis.

Offer und Dawson haben kürzlich ein Peptidligationsverfahren beschrieben, das keine Gegenwart von Cystein erfordert. (Offer, J.; Dawson, P. E. Org. Lett. 2000,2,23–26). In ihrem Verfahren wird eine Peptidbindung aus einem Thioester und einem o-Mercaptobenzylamin gebildet. Obwohl effizient hinterlässt dieses Verfahren zwangsläufig o-Mercaptobenzylamin in dem Ligationsprodukt.Offer and Dawson have recently described a peptide ligation method that does not involve the presence of cysteine requires. (Offer, J .; Dawson, P.E. Org. Lett. 2000,2, 23-26). In Their method is a peptide bond from a thioester and an o-mercaptobenzylamine formed. Although efficient leaves this Procedure inevitably o-mercaptobenzylamine in the ligation product.

In der wohlbekannten Staudingerreaktion wird ein Phosphin verwendet, um ein Azid zu einem Amin zu reduzieren: PR₃ + N₃R' + H₂O → O = PR₃ + H₂NR' + N₂(g). (Staudinger, H.; Meyer, J. Helv. Chim. Acta 1919,2,635–646. Als Übersichten siehe: Gololobov, Yu. G.; Zhmurova,I. N.; Kasukhin, L. F. Tetrahedron 1981, 37, 437–472; Gololobov, Yu. G.; Kasukhin, L. F. Tetrahedron 1992,48, 1353–1406). Die Zwischenstufe in der Reaktion ist ein Iminophosphoran (R''₃P⁺-^–NR), welches einen nucleophilen Stickstoff hat.In the well-known Staudinger reaction, a phosphine is used to reduce an azide to an amine: PR ₃ + N ₃ R '+ H ₂ O → O = PR ₃ + H ₂ NR' + N ₂ (g). (Staudinger, H. Meyer, J. Helv. Chim. Acta 1919, 2.635-646 For reviews see: Gololobov, Yu G, Zhmurova, IN, Kasukhin, LF Tetrahedron 1981, 37, 437-472; Gololobov, Yu. G .; Kasukhin, LF Tetrahedron 1992, 48, 1353-1406). The intermediate in the reaction is an iminophosphorane (R " ₃ P ^{+ -} NR), which has a nucleophilic nitrogen.

Vilarassa und andere haben gezeigt, dass der Stickstoff von Iminophosphoran acyliert werden kann, sowohl in intermolekularen als auch intramolekularen Reaktionen, welche als "Staudinger-Ligationen" bezeichnet worden sind wie beispielhaft darge stellt in den Reaktionen 1 und 2 in Schema 2. Als Beispiele, siehe: Garcia, J.; Urpi, F.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 4841–4844; Garcia, J.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 639–640;Urpi, F.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 4623–4624; Bosch, I.; Romea, P.;Urpi, F.; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 4671–4674; Inazu, T.; Kobayashi, K. Synlett. 1993, 869–870; Molina, P.; Vilaplana, M. J. Synthesis-Stuttgart 1994, 1197–1218; Bosch,I.;Urpi, F.; Vilarrasa, J.J Clzem. Soc., Claern. Commun. 1995, 91–92; Shalev, D. E.; Chiacchiera, S. M.; Radkowsky, A. E.; Kosower, E. M. J ; Org. Chem. 1996, 61, 1689–1701; Bosch, I.; Gonzalez, A.; Urpi, F.; Vilarrasa, J. J. Org. Chem. 1996, 61, 5638–5643; Maunier, V.; Boullanger, P.; Lafont, D. J.Carbohydr. Res. 1997, 16, 231–235; Afonso, C. A. M. Synthetic Commun. 1998, 28, 261–276; Tang, Z.; Pelletier, J. C. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 4773–4776; Ariza X.;Urpi, F.; Viladomat, C.; Vilarrasa J. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 9101–9102; Mizuno, M.; Muramoto, I.; Kobayashi, K.; Yaginuma, H.; Inazu, T. Synthesis-Stuttgart 1999, 162–165; Mizuno, M.; Haneda, K.; Iguchi, R.; Muramoto, I.;Kawakami, T.; Aimoto, S.; Yamamoto, K.; Inazu, T.J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 284–290; Boullanger P.; Maunier, V.; Lafont, D.Carbohydr. Res. 2000, 324, 97–106; Velasco, M. D.; Molina, P.; Fresneda, P. M.; Sanz, M. A. Tetrahedron 2000, 56; 4079–4084 ;Malkinson, J. P.; Falconer, R. A.; Toth, I. J. Org. Chem. 2000, 65, 5249–5252.Vilarassa and others have shown that the nitrogen of iminophosphorane can be acylated, both intermolecular and intramolecular Reactions which have been termed "Staudinger's Ligations." are as exemplified in the reactions 1 and 2 in Scheme 2. As examples, see: Garcia, J .; Urpi, F .; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 4841-4844; Garcia, J .; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 639-640; Urpi, F .; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 4623-4624; Bosch, I .; Romea, P.; Urpi, F .; Vilarrasa, J. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 4671-4674; Inazu, T .; Kobayashi, K. Synlett. 1993, 869-870; Molina, P .; Vilaplana, M.J. Synthesis-Stuttgart 1994, 1197-1218; Bosch, I.; Urpi, F .; Vilarrasa, J.J Clzem. Soc., Claern. Commun. 1995, 91-92; Shalev, D.E .; Chiacchiera, S. M .; Radkowsky, A. E .; Kosower, E.M.J .; Org. Chem. 1996, 61, 1689-1701; Bosch, I .; Gonzalez, A .; Urpi, F .; Vilarrasa, J.J. Org. Chem. 1996, 61, 5638-5643; Maunier, V .; Boullanger, P .; Lafont, D.J. Carbohydr. Res. 1997, 16, 231-235; Afonso, C.A.M. Synthetic Commun. 1998, 28, 261-276; Tang, Z .; Pelletier, J.C. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 4773-4776; Ariza X.; Urpi, F .; Viladomat, C .; Vilarrasa J. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 9101-9102; Mizuno, M .; Muramoto, I .; Kobayashi, K .; Yaginuma, H .; Inazu, T. Synthesis-Stuttgart 1999, 162-165; Mizuno, M .; Haneda, K .; Iguchi, R .; Muramoto, I.; Kawakami, T .; Aimoto, S .; Yamamoto, K .; Inazu, T.J. At the. Chem. Soc. 1999, 121, 284-290; Boullanger P .; Maunier, V .; Lafont, D. Carbohydr. Res. 2000, 324, 97-106; Velasco, M. D .; Molina, P .; Fresneda, P.M .; Sanz, M.A. Tetrahedron 2000, 56; 4079-4084 Malkinson, J.P .; Falconer, R. A .; Toth, I.J. Org. Chem. 2000, 65, 5249-5252.

Saxon und Bertozzi haben berichtet, dass das Phosphin auch als Acyldonor dienen kann wie in Schema 2, Reaktion 3 veranschaulicht, Saxon, E.; Bertozzi, C. R. Science 2000, 287, 2007–2010.saxon and Bertozzi have reported that the phosphine is also called acyl donor can serve as shown in Scheme 2, Reaction 3, Saxon, e .; Bertozzi, C.R. Science 2000, 287, 2007-2010.

Schema 2 Vilarrasa und andere (viele Beispiele in den 1980gern und 1990gern)

Scheme 2 Vilarrasa and others (many examples in the 1980's and 1990's)

Saxon und Bertozzi (Science 2000,287,2007)

Saxon and Bertozzi (Science 2000,287,2007)

Kürzlich haben Saxon et al. eine Modifikation der Staudinger-Ligation berichtet, um aus einem Amid ein Azid unter Verwendung eines Phosphinreagenzes zu bilden (Saxon, E.; Armstrong, J. I.; Bertozzi, C. R. Org. Lett. 2000,2,2141–2143.) Es wurde berichtet, dass die Phosphinreagenzien:

wenn reagiert mit einem Azidonucleosid, zur Bildung eines Amids durch Acylgruppenüberführung führen. Die Ligation wird "spurenfrei" genannt, da kein anderer Anteil des Phosphinereagenzes als die Acylgruppe im Produkt verbleibt. Die Autoren berichten auch, dass die Reaktion des Phosphinothioesters:

mit demselben Azidonucleosid anfangs eher zu einer Aza-Ylid-Hydrolyse als Acylübertragung führt. Die Beobachtung von Amidprodukten nach einigen Tagen ist als wahrscheinliches Ergebnis der Reaktion von Aminhydrolyseprodukten mit dem Thioester kennzeichnend. Die Autoren zeigen, dass der eingesetzte Phosphin-Thioester (bzw. Phosphinothioester, im folgenden Phosphinothioester genannt) nicht der Reaktion „zugänglich" ist.Recently, Saxon et al. a modification of the Staudinger ligation reported to form an amide from an azide using a phosphine reagent (Saxon, E., Armstrong, JI, Bertozzi, CR Org. Lett., 2000, 2241-2143.) It has been reported that that the phosphine reagents:

when reacted with an azido nucleoside, lead to the formation of an amide by acyl group transfer. The ligation is called "trace-free" because no other portion of the phosphine reagent than the acyl group remains in the product. The authors also report that the reaction of the phosphinothioester:

initially leads to aza-ylide hydrolysis rather than acyl transfer with the same azidonucleoside. Observation of amide products after a few days is a likely result of the reaction of amine hydrolysis products with the thioester. The authors show that the phosphine thioester used (or phosphinothioester, hereinafter referred to as phosphinothioester) is not "accessible" to the reaction.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION

Die Erfindung ergibt allgemein ein Verfahren und Reagenzien zur Bildung von Amidbindungen zwischen einem Phosphinothioester und einem Azide, wie in Schema 3 veranschaulicht. Die Reaktion ermöglicht die Bildung einer Amidbindung unter einer Großen Vielzahl chemischer Spezies (veranschaulicht in Schema 3 als R^P und R^B). Von besonderem Interesse sind jene Reaktionen, in welchen die ligierten Einheiten Aminosäuren, Peptide oder Proteinfragmente sind. In einer spezifischen Ausführung ergibt diese Erfidnung ein Verfahren und Reagenzien zur Peptidligation, die den Bedarf an einem Cysteinrest erübrigen und hinterlässt keine restlichen Atome in dem ligierten Peptidprodukt (d.h. ist spurenfrei).The invention generally provides a method and reagents for forming amide bonds between a phosphinothioester and an azide, as illustrated in Scheme 3. The reaction allows the formation of an amide bond under a wide variety of chemical species (illustrated in Scheme 3 as R ^P and R ^B ). Of particular interest are those reactions in which the ligated units are amino acids, peptides or protein fragments. In a specific embodiment, this invention provides a method and reagents for peptide ligation that obviate the need for a cysteine residue and leaves no residual atoms in the ligated peptide product (ie, no trace).

Perez-Lourido und andere haben Startmaterialien angegeben, einschließlich o-(Diphenylphosphin)-Benzothiol, die verwendet werden, um Organozinnkomplexe herzustellen. (Perez-Lourido., P; Romero, J.; Garcia-Vazquez, J.A.; Sousa, A.; Zubieta, J; Russo, U. Journal of Organometallic Chemistry 2000, 595, 59–65.) Hingegen wurden die offenbarten Verbindungen nicht verwendet, um Amidbindungen zu bilden oder um Phosphinothioester zu erzeugen.Perez Lourido and others have indicated starting materials, including o- (diphenylphosphine) -benzothiol, which are used to make organotin complexes. (Perez Lourido., P; Romero, J .; Garcia-Vazquez, J.A .; Sousa, A .; Zubieta, J; Russo, U. Journal of Organometallic Chemistry 2000, 595, 59-65.) On the other hand For example, the disclosed compounds were not used to amide bonds to form or to produce phosphinothioester.

Schema 3

Scheme 3

Ein bei dieser Ligation verwendbarer Phosphinothioester kann auf eine Vielzahl von Arten erzeugt werden. Wie in Schema 3 veranschaulicht kann ein aktiviertes Carboxylsäurederivat, zum Beispiel ein Thioester oder ein N-Acylsulfonamid in einen Phosphinothioester umgewandelt werden. Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Ausbildung eines Phosphinothioesters kann im Allgemeinen verwendet werden. Diese Erfindung ergibt ein effizientes Verfahren zum Erzeugen von Phosphinothioestern, insbesondere jenen von Aminosäuren, Peptiden und Proteinfragmenten unter Verwendung eines Phosphinothiolreagenzes. Dieses Reagenz kann verwendet werden, um den gewünschten Phosphinothioester aus aktivierten Carboxylsäurederivaten (z.B. Thioester oder aktivierte Sulfamylgruppen) oder aus einer Carboxylsäure durch konventionelle Kopplungsreaktionen, vermittelt durch Dicyclohexylcarbodiimid oder ein ähnliches Koppeln zu erzeugen.One can be used in this ligation phosphinothioester on a Variety of types are generated. As illustrated in Scheme 3 may be an activated carboxylic acid derivative, for example, a thioester or an N-acylsulfonamide in a phosphinothioester being transformed. Any method known in the art to form a phosphinothioester can generally be used become. This invention provides an efficient method of generating of phosphinothioesters, especially those of amino acids, peptides and protein fragments using a phosphinothiol reagent. This reagent can be used to prepare the desired phosphinothioester from activated carboxylic acid derivatives (e.g., thioesters or activated sulfamyl groups) or from a carboxylic acid by conventional coupling reactions mediated by dicyclohexylcarbodiimide or something similar To create coupling.

Ein bei dieser Ligationsreaktion dieser Erfindung verwendbarer Phosphinothioester kann auch aus einem Peptid- oder Proteinfragment erzeugt werden, das an ein Harz an seinem C-Terminus angeheftet werden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid- oder Proteinfragment von einem Harz durch Reaktion mit einem Phosphinothiolreagenz dieser Erfindung freigesetzt werden, um einen Phosphinothioester zu erzeugen. Ein Peptid- oder Proteinfragment kann an einem geeigneten Harz unter Verwendung bekannter Verfahren von Festzustandspeptidsynthese synthetisiert werden, z.B. Fmoc-basierte Verfahren. Das Peptid- oder Proteinfragment, das an dem Harz synthetisiert ist, kann dann durch Reaktion mit einem Phosphinothiol freigesetzt werden, um einen Phosphinothioester zu erzeugen, welcher dann mit einem Azid ligiert werden kann, um einen Amidbindung zu bilden. Unter diesem Aspekt der Erfindung kann jedes im Stand der Technik als zur Peptidsynthese geeignet bekannte Harz und welches für Reaktion mit einem Phosphinothiol kompatibel ist, um einen Phosphinothiolester zu bilden, in dieser Erfindung eingesetzt werden. Im Stand der Technik bekannte Harze wie "Safety-Catch"-Harze sind von besonderem Interesse. Siehe: Backes, B.J.; Ellman, J.A. J. Org. Chem. 2000, 64, 2322–2330.One Phosphinothioester useful in this ligation reaction of this invention can also be generated from a peptide or protein fragment, which can be attached to a resin at its C-terminus. To the Example may be a peptide or protein fragment from a resin Reaction with a Phosphinothiolreagenz this invention released to produce a phosphinothioester. A peptide or Protein fragment can be cloned on a suitable resin using known Methods of solid state peptide synthesis are synthesized, e.g. Fmoc-based method. The peptide or protein fragment that binds to is synthesized by the resin can then by reaction with a phosphinothiol be released to produce a Phosphinothioester, which then ligated with an azide to form an amide bond form. In this aspect of the invention, each in the state of Technique known as suitable for peptide synthesis resin and which for reaction compatible with a phosphinothiol to a phosphinothiol ester to be used in this invention. In the prior art known resins such as "Safety Catch" resins are of particular Interest. See: Backes, B.J .; Ellman, J.A. J. Org. Chem. 2000, 64, 2322-2330.

Die R^P- und R^B-Einheiten, welche ligiert werden, können jede von einer großen Vielzahl chemischer Einheiten sein, die verträglich sind mit den Reaktionsbedingungen und in welchem sie keiner ungewünschten Reaktion miteinander oder mit anderen funktionellen Gruppen unterliegen, zum Beispiel bei R_1-2 oder X in dem Phosphinothioester. Die X-Einheit und R₁- und R₂-Gruppen in Schema 3 leiten sich vom Phosphinothiolreagenz ab und werden gewählt, um die Bildung des Amids wie unten beschrieben zu erleichtern.The R ^P and R ^B units which are ligated may each be of a wide variety of chemical moieties compatible with the reaction conditions and in which they do not undergo undesired reaction with each other or with other functional groups, for example R _{1 -2} or X in the phosphinothioester. The X moiety and R ₁ and R ₂ groups in Scheme 3 are derived from the phosphinothiol reagent and are chosen to facilitate formation of the amide as described below.

R^P und R^B umfassen Einheiten, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Aliphaten, Heteroaliphaten, Allzyklen, Heteroalizyklen, Aromaten und Heteroaromaten, von denen alle mit einem oder mehreren Haliden (insbesondere F oder Cl), OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR-, CONH-, CONR- oder N(R')₂-Gruppen substituiert sein können, worin R, unabhängig von anderen R, eine aliphatische, heteroaliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' gewählt ist aus den Gruppen Wasserstoff, aliphatischen, heteroaliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen. R und R' können im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein. Insbesondere können bei R^P und/oder R^B, welche aliphatische und/oder alizyklische Teile enthalten, eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂ Gruppen mit O, S, CO, COO, N(R')₂ und CONR' ersetzt werden, worin R' wie oben definiert ist. Jede reaktive funktionelle Gruppe von der R^P o der R^B Gruppe kann vor ungewünschter Reaktion unter Verwendung von Schutzgruppen (Pr) geschützt sein.R ^P and R ^B include moieties selected from the group consisting of aliphatic, heteroaliphatic, allcene, heteroalicyclic, aromatic, and heteroaromatic, all of which contain one or more halides (especially F or Cl), OH-, OR- , COH, COR, COOH, COOR, CONH, CONR or N (R ') ₂ groups, wherein R independently of other R, an aliphatic, heteroaliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group and each R 'independently of other R' is selected from the groups hydrogen, aliphatic, heteroaliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups. R and R 'can be optional in return be substituted as listed above. In particular, at R ^P and / or R ^B containing aliphatic and / or alicyclic moieties, one or more non-adjacent CH ₂ groups can be replaced with O, S, CO, COO, N (R ') ₂ and CONR', wherein R 'is as defined above. Any reactive functional group on the R ^P o of the R ^B group may be protected from undesired reaction using protecting groups (Pr).

In spezifischen Ausführungen sind R^P und R^B Aminosäuren, Peptide oder Proteine. Die Phosphinothioestergruppe kann zum Beispiel am Carboxyterminus (C-Terminus) eines Peptids oder Proteins oder an einer Säureseitengruppe von einer oder mehreren Aminosäuren in einem Peptid oder Protein gebildet werden. Die Azidgruppe kann zum Beispiel an dem Aminoende (N-Terminus) von einem Peptid oder Protein oder an der basischen Seitengruppe von einer oder mehreren Aminosäuren in einem Peptid oder Protein gebildet werden. Das Ligationsverfahren kann verwendet werden, um zwei oder mehr Aminosäuren, zwei oder mehr Peptide oder zwei oder mehr Proteine zu ligieren. Mehrere Ligationszyklen können zum Beispiel eingesetzt werden zur Festzustandsynthese eines Proteins aus Aminosäurekomponenten. Mehrere Ligationszyklen können eingesetzt werden, um zwei oder mehrere kleinere Peptide zu verbinden, um ein größeres Peptid zu bilden. Die verbundenen Peptide können durch Festzustandsyntheseverfahren erhalten werden aus natürlichen Quellen oder durch rekombinante Verfahren.In specific embodiments, R ^P and R ^{B are} amino acids, peptides or proteins. For example, the phosphinothioester group may be formed at the carboxy terminus (C-terminus) of a peptide or protein or at an acid side group of one or more amino acids in a peptide or protein. The azide group may be formed, for example, at the amino terminus (N-terminus) of a peptide or protein or at the basic side group of one or more amino acids in a peptide or protein. The ligation method can be used to ligate two or more amino acids, two or more peptides, or two or more proteins. For example, several ligation cycles can be used to solid state synthesize a protein from amino acid components. Multiple ligation cycles can be used to join two or more smaller peptides to form a larger peptide. The linked peptides can be obtained by solid state synthesis methods from natural sources or by recombinant methods.

Das Verfahren dieser Erfindung ist besonders nützlich zum Beispiel für die Synthese von Peptiden und Proteinen wie in Schema 4 veranschaulicht, wo die zusammen ligierten Aminosäureeinheiten R^A1 und R^A2 unabhängig voneinander aliphatisch, heteroaliphatisch, allzyklisch, heteroalizyklisch, aromatisch oder heteroaromatisch sind, von denen jede wie oben angemerkt substituiert sein kann. Das Verfahren dieser Erfindung kann verwendet werden um nicht natürliche Aminosäuren sowie durch spezielle Isotope angereicherte natürliche Aminosäuren zu ligieren, wie jene mit ¹³C- und ¹⁵N-Isotopen angereicherten.The method of this invention is particularly useful, for example, for the synthesis of peptides and proteins as illustrated in Scheme 4, where the all-linked amino acid units R ^A1 and R ^{A2 are} independently aliphatic, heteroaliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic, each of which as noted above. The method of this invention can be used to ligate non-natural amino acids as well as natural iso-enriched natural amino acids such as those enriched with ¹³ C and ¹⁵ N isotopes.

Das Verfahren dieser Erfindung kann auch eingesetzt werden, um eine oder mehrere Aminosäuren zu ligieren, die eine elektrophile Seitengruppe tragen, wie ein Alkylhalid oder ein Epoxid, aneinander oder um eine oder mehrere Aminosäuren mit elektrophilen Seitengruppen in Peptide und/oder Proteine einzuverleiben. Das Verfahren dieser Erfindung kann auch eingesetzt werden, um zwei oder mehr β-Aminosäuren aneinander zu ligieren, um eine oder mehrere β-Aminosäuren an α-Aminosäuren zu ligieren oder eine oder mehrere β-Aminosäuren in Peptide und/oder Proteine einzuverleiben.The Method of this invention can also be used to provide a or more amino acids to ligate, which carry an electrophilic side group, such as a Alkyl halide or an epoxide, to each other or one or more amino acids incorporated with electrophilic side groups in peptides and / or proteins. The process of this invention can also be used to produce two or more β-amino acids together to ligate one or more β-amino acids to α-amino acids, or a or more β-amino acids in To incorporate peptides and / or proteins.

Insbesondere umfassen R^A1- und R^A2-Gruppen jede Seitengruppe einer sauren, basischen, unpolaren oder polaren Aminosäure. R^A1 und R^A2 umfassen Seitenketten oder Seitengruppen von 20 gewöhnlichen α-Aminosäuren sowie Seitengruppen von ungewöhnlichen Aminosäuren (z.B. Homoserin), die in Proteinen gefunden werden, und Seitengruppen von anderen biologisch aktiven Aminosäuren (z.B. Ornithin oder Citrullin). Dieses die Amidbindung enthaltende Produkt in der in Schema 4 veranschaulichten Reaktion ist ein Dipeptid.In particular, R ^A1 and R ^A2 groups include each side group of an acidic, basic, nonpolar or polar amino acid. R ^A1 and R ^A2 include side chains or side groups of 20 common α-amino acids as well as side groups of unusual amino acids (eg, homoserine) found in proteins and side groups of other biologically active amino acids (eg, ornithine or citrulline). This amide bond-containing product in the reaction illustrated in Scheme 4 is a dipeptide.

Schema 4

Scheme 4

Zusatzaminosäuren können dem in Schema 4 veranschaulichten Peptidprodukt zugefügt werden durch (1) Addition einer Azidogruppe an den N-Terminus des Peptids und Reagieren des Azidopeptids mit einem anderen Phosphinothioester einer Aminosäure (oder eines Peptids) oder (2) durch Bildung eines Phosphinothioesters am C-Terminus des Peptids und nachfolgende Reaktion des Phosphinothioesters, gebildet mit einer Azidosäure (oder einem N-terminalen Azidopeptid). Ein Phosphinothiol reagenz dieser Erfindung kann verwendet werden, um den Phosphinothioester zu erzeugen.Additional amino acids can the in Scheme 4, peptide product can be added by (1) addition of an azido group to the N-terminus of the peptide and Reacting the azidopeptide with another phosphinothioester an amino acid (or a peptide) or (2) by forming a phosphinothioester at the C-terminus of the peptide and subsequent reaction of the phosphinothioester, formed with an azido acid (or an N-terminal azido-peptide). A phosphinothiol reagent This invention can be used to synthesize the phosphinothioester to create.

Diese Schritte sind in Schema 5 veranschaulicht. Wiederholte Zyklen der Schritte 1 und/oder 2 können verwendet werden, um längere Peptide zu erzeugen.These Steps are illustrated in Scheme 5. Repeated cycles of Steps 1 and / or 2 can be used be longer To produce peptides.

Schema 5

Scheme 5

Das Verfahren dieser Erfindung kann auch zu Synthese größerer Peptide oder Proteine durch Ligieren von zwei oder mehr kleineren Peptiden eingesetzt werden (typischerweise weniger als 50 Aminosäuren lang) oder zur Synthese eines Proteins durch Ligation von zwei oder mehr Peptiden oder Proteinen. In diesem Verfahren können die zwei oder mehreren Peptide oder Proteine (welche die gleichen oder verschieden sein können), die zu ligieren sind, durch konventionelle Festphasenverfahren synthetisiert werden, zum Beispiel Fmoc-basierte Verfahren, erhalten aus natürli chen Quellen oder erhalten durch rekombinante Verfahren. Eines der beiden Peptide oder Proteine, die zu ligieren sind, wird mit einer Phosphinothioestergruppe an seinem C-Terminus derivatisiert und der N-Terminus wird geschützt mit einer geeigneten Schutzgruppe. Das andere der beiden Peptide oder Proteine, das zu ligieren ist, wird derivatisiert mit einer Azidogruppe an seinem N-Terminus und wird mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt. Der Peptidphosphinothioester kann zum Beispiel aus einem Harz-gebundenen Peptid- der Proteinfragment unter Verwendung eines Phosphinothiolreagenzes dieser Erfindung oder durch Reaktion (Transesterifizierungs- oder Kopplungsreaktion) eines Peptidthioesters mit dem Phosphinothiolreagenz erzeugt werden. Der Peptidphosphinothioester wird dann mit dem Azidopeptid reagiert, begleitet von einer Hydrolyse oder einem Verlust von Stickstoff, um eine Amidbindung zu erzeugen, die die beiden Peptide ligiert. Die Ligationsreaktion kann in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, das genügend Wasser enthält, um Hydrolyse und Amidbildung zu erleichtern, zum Beispiel ein Gemisch von THF und Wasser. Alternativ kann die Reaktion des Phosphinothioesters und des Azids in einem organischem Lösungsmittel (in welchem beide Reaktionspartner löslich sind) gestartet werden und Wasser kann anschließend zur Hydrolyse und Amidbindungsbildung zugegeben werden.The Process of this invention may also be used to synthesize larger peptides or proteins by ligating two or more smaller peptides be used (typically less than 50 amino acids long) or for the synthesis of a protein by ligation of two or more peptides or proteins. In this process, the two or more Peptides or proteins (which may be the same or different can), which are to be ligated, synthesized by conventional solid phase methods For example, Fmoc-based methods are obtained from natural Sources or obtained by recombinant methods. One of the two Peptides or proteins to ligate with a phosphinothioester group derivatized at its C-terminus and the N-terminus is protected with a suitable protecting group. The other of the two peptides or Proteins to be ligated are derivatized with an azido group at its N-terminus and is provided with a suitable protecting group protected. The peptide phosphinothioester may be, for example, a resin-bound Peptide protein fragment using a phosphinothiol reagent this invention or by reaction (transesterification or Coupling reaction) of a peptide thioester with the phosphinothiol reagent be generated. The peptide phosphinothioester is then reacted with the azido-peptide reacts, accompanied by hydrolysis or loss of nitrogen, to generate an amide bond that ligates the two peptides. The ligation reaction can be carried out in an organic solvent carried out that will be enough Contains water, to facilitate hydrolysis and amide formation, for example a mixture of THF and water. Alternatively, the reaction of the phosphinothioester and the azide in an organic solvent (in which both Reactant soluble are) and water can subsequently be used for hydrolysis and amide bond formation be added.

In bestimmten Ausführungen wird die Ligation umgesetzt unter Verwendung von Festphasentechniken. Speziell wird ein erstes Peptid an ein Harz mit einem Phosphinothiolreagenz dieser Erfindung reagiert, um das erste Peptid freizusetzen und einen Phosphinothioester am C-Terminus des ersten Peptids zu bilden. Ein zweites Peptid wird an ein Harz angeheftet an seinem C-Terminus derivatisiert mit einer Azidgruppe an seiner N-terminalen Aminosäure. Das erste Peptid nach Freisetzen von dem Harz wird reagiert mit dem am Harz gebundenen zweiten Peptid, begleitet von Hydrolyse und Stickstoffverlust, um eine Amidbindung zu bilden, die die beiden Peptide ligiert. Das ligierte Peptid verbleibt an das Harz angeheftet. Das erste Peptid kann durch konventionelle Festzustandsverfahren gebildet werden. Das zweite Peptid kann auch durch konventionelle Festphasensyntheseverfahren gebildet werden, in welchen eine Azidosäure das letzte an die Peptidkette zugefügte Monomer ist oder die Azidogruppe in situ aus der Aminogruppe der letzten Aminosäure gebildet wird. Das ligierte Peptid (oder Protein) kann entschützt werden und, wenn gewünscht, von dem Harz durch konventionelle Verfahren gespalten werden. Alter nativ können zusätzliche Zyklen von N-terminalem Entschützen, N-terminaler Azidsäurebildung und Reaktion mit einem Phosphinothioesterpeptid durchgeführt werden, um längere Peptide und Proteine zu erzeugen.In certain embodiments, ligation is implemented using solid-phase techniques. Specifically, a first peptide is reacted to a resin with a phosphinothiol reagent of this invention to liberate the first peptide and form a phosphinothioester at the C-terminus of the first peptide. A second peptide is attached to a resin attached at its C-terminus derivatized with an azide group at its N-terminal amino acid. The first peptide after release from the resin is reacted with the second peptide bound to the resin, accompanied by hydrolysis and nitrogen loss, to form an amide bond which ligates the two peptides. The ligated peptide remains attached to the resin. The first peptide can be formed by conventional solid state methods. The second peptide can also be formed by conventional solid phase synthesis methods in which an azido acid is the last monomer added to the peptide chain or the azido group is formed in situ from the amino group of the last amino acid. The ligated peptide (or protein) can be deprotected and, if desired, permeated by the resin conventional methods are split. Alternatively, additional cycles of N-terminal deprotection, N-terminal azidic acid formation and reaction with a phosphinothioester peptide may be performed to produce longer peptides and proteins.

Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann mit bekannten Varianten von Festphasenpeptidsynthesen kombiniert werden. Zum Beispiel können die Ligationsverfahren dieser Erfindung in den Synthesen von mehrfachen antigenen Peptiden (MAPs) eingesetzt werden, welche einen Lysin-basierten Verzweigungskern einsetzen. Siehe: Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998 85, 5409–5413.The Ligation method of this invention can be carried out with known variants be combined by solid phase peptide syntheses. For example, the Ligation method of this invention in the syntheses of multiple antigenic peptides (MAPs), which are a lysine-based Insert branch core. See: Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998 85, 5409-5413.

In einer anderen spezifischen Ausführung ist eines von R^P oder R^B (von Schema 3) eine Peptid- oder Proteingruppe und das andere eine Kohlenhydratgruppe. Zum Beispiel kann R^B ein Mono-, Di-, Tri- oder Polysaccharid sein. In einer anderen spezifischen Ausführung ist eines von R^P oder R^B eine Peptid- oder Proteingruppe und die andere ist ein Nukleosid oder Nukleinsäure. In einer anderen Ausführungsform ist R^P oder R^B eine Peptid- oder Proteingruppe und die andere ein Lipid. In einer weiteren spezifischen Ausführung ist eines von R^P oder R^B eine Peptid- oder Proteingruppe und das andere eine Reportergruppe, ein Schwanz oder eine Markierung (z.B. eine Gruppe, deren Gegenwart durch optische Spektroskopie oder Massenspektroskopie oder andere instrumentelle Verfahren detektiert werden kann), einschließlich einer fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Gruppe, einer Isotopenmarkierung oder einer Radioaktivmarkierung.In another specific embodiment, one of R ^P or R ^B (of Scheme 3) is a peptide or protein group and the other is a carbohydrate group. For example, R ^B may be a mono-, di-, tri- or polysaccharide. In another specific embodiment, one of R ^P or R ^{B is} a peptide or protein group and the other is a nucleoside or nucleic acid. In another embodiment, R ^P R or ^B is a peptide or protein group and the other a lipid. In a further specific embodiment, one of R ^P or R ^{B is} a peptide or protein group and the other is a reporter group, a tail or a label (eg a group whose presence can be detected by optical spectroscopy or mass spectroscopy or other instrumental methods), including a fluorescent or phosphorescent group, an isotope label or a radioactive label.

Das Verfahren dieser Erfindung ist allgemein anwendbar zum Abfangen: d.h. Reagieren mit jedem Thioesterzwischenprodukt in einem Biosynthesestoffwechselweg. In dieser Hinsicht kann das Verfahren einfach verwendet werden, um Schwanz und/oder Markierung als Zwischenstufe zur Identifizierung zu identifizieren oder verwendet werden, um einzig Produkte durch Amidbindungsbildung zu synthetisieren. Das Verfahren kann zum Beispiel verwendet werden, um Thioesterzwischenstufen in Polyketidbiosynthesen abzufangen. Das resultierende Kopplungsprodukt kann auf biologische Aktivität getestet werden oder in der weiteren Synthese von biologisch aktiven Produkten verwendet werden, zum Beispiel Polyketide, die strukturverändert sind und möglicherweise in Abhängigkeit von natürlich auftretenden Polyketiden verändert sind.The Method of this invention is generally applicable for interception: i.e. React with each thioester intermediate in a biosynthetic pathway. In this regard, the process can be easily used around tail and / or marker as an intermediate for identification to identify or be used to only products through Synthesize amide bond formation. The method can, for example used to synthesize thioester intermediates in polyketide biosyntheses intercept. The resulting coupling product may be biological activity be tested or in the further synthesis of biologically active Products are used, for example, polyketides that are structurally altered and possibly dependent on of course changed occurring polyketides are.

Das Verfahren dieser Erfindung in jeder seiner Ausführungen kann unter Verwendung von Festphasenverfahren implementiert werden. Entweder der Phosphinothioesterreaktionspartner oder der Azidreaktionspartner können an ein festes Trägermaterial mit dem reaktiven Ende freibleibend geheftet werden. Ein an einen festen Träger gebundener Reaktionspartner mit einer reaktiven Phosphinothioestergruppe kann an ein freies Azid ligiert werden (d.h., wo der Azidreaktionspartner nicht an einen festen Träger ligiert ist). Ein an einem festen Träger mit einer reaktiven Azidgruppe gebundener Reaktionspartner kann an einen freien Phosphinothioester ligiert werden. Das Verfahren kann allgemein verwendet werden, um eine Amidbindung zwischen zwei biologischen Molekülen zu bilden, d.h. zwischen zwei Peptiden, zwischen einem Peptid und einem Kohlenhydrat (Saccharid, Zucker, usw.), zwischen einem Peptid und einem Nukleosid, zwischen einem Peptid und einem Lipid, usw. Spezifischer kann das Verfahren auf eine Ligation angewandt werden, wo eines der biologischen Moleküle an einen festen Träger geheftet ist (oder Harz). Ein Phosphinothioesterpeptidreaktionspartner, angeheftet an einen festen Träger über seinen N-Terminus kann zum Beispiel erzeugt werden durch Koppeln des C-Terminus des angehefteten Peptids an ein Phosphinothiol unter Verwendung eines Kopplungsreagenz wie DCC, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-Pyrrolidino-Phosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP). Ein harzgebundenes Peptid mit einer Azidgruppe an seinem N-Terminus kann durch Reaktion von Trifyl-Azid oder ähnlichem Reagenz erzeugt werden.The Method of this invention in each of its embodiments can be used be implemented by solid phase method. Either the phosphinothioester reaction partner or the azide reaction partner to a solid substrate stapled with the reactive end without obligation. One to one solid carrier bound reactant with a reactive phosphinothioester group can be ligated to a free azide (i.e., where the azide reactant not to a solid carrier ligated). One on a solid support with a reactive azide group bound reactant can bind to a free phosphinothioester be ligated. The method can generally be used to to form an amide bond between two biological molecules i.e. between two peptides, between a peptide and a carbohydrate (Saccharide, sugar, etc.), between a peptide and a nucleoside, between a peptide and a lipid, etc. More specifically, the Procedures applied to a ligation where one of the biological molecules to a solid support stapled (or resin). A phosphinothioester peptide reactant, attached to a solid support over his N-terminus can for example, by coupling the C-terminus of the attached one Peptide to a phosphinothiol using a coupling reagent such as DCC, benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP). A resin-bound peptide with an azide group on it N-terminus may be by reaction of trifyl azide or the like Reagent be generated.

Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann in der Reaktion von kombinatorischen Bibliotheken von Peptiden, Proteinen oder verschiedenen chemischen Spezies, die eine Amidbindung enthalten, eingesetzt werden. Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann auch in Kombination mit Verfahren nativer chemischer Ligation zur Bildung von Peptid- und Proteinprodukten von Interesse verwendet werden.The Ligation method of this invention can be used in the reaction of combinatorial Libraries of peptides, proteins or various chemical Species containing an amide bond can be used. The Ligation method of this invention may also be used in combination with Methods of native chemical ligation for the formation of peptide and Protein products of interest can be used.

Am allgemeinsten führt die Erfindung zur Reaktion eines Phosphinothioesters und eines Azids. In spezifischen Ausführungen kann der Phosphinothioester unter Einsatz eines Phosphinothiolreagenzes hergestellt werden. Neue Phosphinothiole, die als Reagenzien in den Reaktionen dieser Erfindung verwendbar sind, werden bereitgestellt.At the most general leads the invention for the reaction of a phosphinothioester and an azide. In specific versions For example, the phosphinothioester can be synthesized using a phosphinothiol reagent getting produced. New phosphinothiols used as reagents in are useful in the reactions of this invention.

Die Erfindung ergibt auch Reagenzkits zum Ausbilden einer Amidbindung zwischen einem Phosphinothioester und einem Azid, welche eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung und insbesondere jene der verschiedenen hier beschriebenen Formeln umfassen. Zusätzlich können die Kits Reagenzien zum Ausbilden eines Azids enthalten. Die Kits umfassen optional Harz oder andere Festphasenmaterialien, die geeignet sind zum Durchführen der Ligation dieser Erfindung unter Verwendung von Festphasenverfahren. Der Kit kann auch ein Reagenz zum Erzeugen eines Thioesters umfassen, welches später zu einem Phosphinothioester umgewandelt werden würde. Der Kit kann auch optional Lösungsmittel oder andere Reagenzien zum Durchführen der Ligation sowie Anweisungen zum Durchführen der Reaktion und/oder Anweisungen zum Auswählen eines Phosphinothiolreagenzes für eine geeignete Ligation umfassen.The invention also provides reagent kits for forming an amide bond between a phosphinothioester and an azide comprising one or more phosphinothiol reagents of this invention, and particularly those of the various formulas described herein. In addition, the kits may contain reagents for forming an azide. The kits optionally include resin or other solid phase materials suitable for carrying out the ligation of this invention using solid phase ver drive. The kit may also include a reagent for generating a thioester, which would later be converted to a phosphinothioester. The kit may also optionally include solvents or other reagents for performing the ligation, and instructions for carrying out the reaction and / or instructions for selecting a phosphinothiol reagent for a suitable ligation.

In einer spezifischen Ausführung ergibt die Erfindung einen Kit zur Synthese von Peptiden oder Proteinen, welcher eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung umfasst. Der Kit kann optional weiterhin eine oder mehrere Aminosäureseitenkettenschutzgruppen, eines oder mehrere Reagenzien zum Ausbilden eines Thioesters einer Aminosäure oder eines Peptids oder eines oder mehrere Reagenzien zum Erzeugen einer Azidogruppe von einer Aminosäure oder einem Peptid enthalten. Der Kit kann auch eine oder mehrere Aminosäuren, Aminosäurethioester oder Azidosäuren enthalten. Die Kits umfassen optional Harz oder andere Festphasenmaterialien, die zu Durchführung der Ligation dieser Erfindung unter Verwendung von Festphasenverfahren geeignet sind. Der Kit kann auch optional Lösungsmittel oder andere Reagenzien zum Durchführen der Ligation sowie Anweisungen zum Durchführen der Synthese und/oder Anweisungen zur Auswahl eines Phosphinothiolreagenzes für eine gewünschte Ligation umfassen. Reagenzkits dieser Erfindung umfassen solche, welche eine oder mehrere 2-Phosphinobenzothiole oder eines oder mehrere Phosphinomethanthiole umfassen.In a specific execution the invention provides a kit for the synthesis of peptides or proteins, which is one or more phosphinothiol reagents of this invention includes. The kit may optionally further contain one or more amino acid side chain protecting groups, one or more reagents for forming a thioester of a amino acid or a peptide or one or more reagents for generating an azido group of an amino acid or a peptide. The kit may also contain one or more amino acids, amino acid thioesters or azido acids contain. The kits optionally include resin or other solid phase materials, to carry out the ligation of this invention using solid phase methods are suitable. The kit can also optionally use solvents or other reagents to perform ligation and instructions for carrying out the synthesis and / or Instructions for selecting a phosphinothiol reagent for a desired ligation include. Reagent kits of this invention include those which have a or more 2-phosphinobenzothiols or one or more phosphinomethanethiols include.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENSHORT DESCRIPTION THE DRAWINGS

1 ist eine Veranschaulichung der Anwendung des Ligationsverfahrens dieser Erfindung auf die Proteinsynthese. 1 Figure 4 is an illustration of the application of the ligation method of this invention to protein synthesis.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

In dem Verfahren dieser Erfindung wird eine Amidbindung zwischen einem Phosphinothioester und einem Azid ausgebildet. Die Reaktion ist spurenfrei darin, dass keine Atome des Reagenzes in dem ligierten Produkt belassen werden. Die Reaktion ist nützlich in einer Vielzahl von Anwendungen zur Derivatisierung von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, zur Ligation verschiedener biologischer Moleküle (z.B. Peptide an Saccharide, Peptide an Lipide, Peptide an Peptide, Peptide an Nukleoside oder Nukleinsäuren, usw.) und insbesondere für die Synthese von Peptid und Proteinen.In The process of this invention is an amide bond between a Phosphinothioester and formed an azide. The reaction is Trace free in that no atoms of the reagent in the ligated Product are left. The reaction is useful in a variety of ways Applications for the derivatization of amino acids, peptides or proteins, for ligation of various biological molecules (e.g., peptides to saccharides, Peptides to lipids, peptides to peptides, peptides to nucleosides or nucleic acids, etc.) and in particular for the synthesis of peptide and proteins.

Ohne an irgendeinen speziellen Mechanismus gebunden sein zu wollen, ist ein wahrscheinlicher Mechanismus für die Reaktion in Schema 6 veranschaulicht. Die Ligation beginnt durch Kopplung eines Phosphinothioesters mit einem Azid, was zur Bildung eines reaktiven Iminophosphorans und Stickstoffgas führt. Der Angriff von Iminophosphoranstickstoff an den Thioester führt zu einem Amidophosphoniumsalz. Die Hydrolyse des Amidophosphoniumsalzes erzeugt ein Amid und ein Phosphinoxid. Signifikant verbleiben keine Atome von dem Phosphinothiol in dem Amidprodukt; d.h. die Ligation ist spurenfrei. Schema 6 veranschaulicht die Bildung des Phosphinothioesters durch Transesterifizierung aus einem Thioester, hingegen sind andere Verfahren verfügbar, um verwendbare Phosphinothioester zu machen. Am allgemeinsten kann der Phosphinothioester durch Reaktion eines Phosphinothiolreagenzes mit einem aktivierten Carboxylsäurederivat gebildet werden. Ein "aktiviertes" Carboxylsäurederivat wird zum nukleophilen Angriff aktiviert, wie es im Stand der Technik verstanden wird und ist beispielhaft veranschaulicht durch Thioester, Acylhalide, Acylimidazole, aktivierte Ester und N-Acylsulfonamide (verwendet in bestimmten Safety-Catch-Verknüpfern).Without to be bound to any particular mechanism is a probable mechanism for the reaction in Scheme 6 illustrated. Ligation begins by coupling a phosphinothioester with an azide, leading to the formation of a reactive iminophosphorane and nitrogen gas leads. The attack of iminophosphorus nitrogen on the thioester leads to a Amidophosphonium salt. Hydrolysis of the amidophosphonium salt is produced an amide and a phosphine oxide. Significantly, no atoms remain from the phosphinothiol in the amide product; i.e. the ligation is traceless. Scheme 6 illustrates the formation of the phosphinothioester by transesterification from a thioester, however, are others Method available, to make useful phosphinothioesters. Most commonly can the phosphinothioester by reaction of a phosphinothiol reagent with an activated carboxylic acid derivative be formed. An "activated" carboxylic acid derivative is activated for nucleophilic attack, as in the prior art is understood and exemplified by thioester, Acyl halides, acylimidazoles, activated esters and N-acylsulfonamides (used in certain safety catch links).

Die Ligationsreaktionen dieser Erfindung sind beispielhaft veranschaulicht durch spezifische Reaktionen von Schema 7 und 8, welche ein o-Phosphinobenzothiol (R₁R₂PC₆H₄-o-SH), spezifisch o-(Diphenylphosphino)-Benzothiol (2) und ein Phosphinomethanthiol (R₁R₂P-CH₂-SH), spezifisch (Diphenylposphino)-Methanthiol 20, jeweils als Phosphinothiolreagenzien einsetzen.The ligation reactions of this invention are exemplified by specific reactions of Schemes 7 and 8 which include an o-phosphinobenzothiol (R ₁ R ₂ PC ₆ H ₄ -o-SH), specifically o- (diphenylphosphino) -benzothiol (2) and a phosphinomethanethiol (R ₁ R ₂ P-CH ₂ -SH), specific (diphenyl-posphino) -methanethiol 20, each used as Phosphinothiolreagenzien.

Das o-Phosphinobenzothiol wurde zuerst als Reagenz ausgewählt, da es es ermöglicht, einen sechsgliedrigen Ring bei dem Übergangszustand zum Acyltransfer (siehe: Schema 6) auszubilden. Darüber hinaus erlaubt R₁R₂PC₆H₄-o-SH nicht die Bildung eines Episulfids und eines stabilen Amidophosphins (R₁R₂PNR'C(O)R'') durch C-P-Bindungsspaltung in dem Amidophosphoniumsalz, wie es ein Thiol wie R₁R₂PCH₂CH₂SH tun würde. Weiterhin ist von Thiophenol selbst bekannt, dass es Transesterifizierung von Thioestern bei nativer chemischer Ligation bewirkt (Dawson, P.E.; Churchill, M.; Ghadiri, M.R.; Kent, S.G.H. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 4325–4329). Die R-Gruppen an dem Phosphor (R₁ und R₂) werden als Elektronenabziehende Phenylgruppen gewählt, welche den Phosphor weniger nukleophil machen und dabei die Neigung des Phosphins zu schädlicher Oxidation durch O₂(g) zu minimieren.The o-phosphinobenzothiol was first selected as a reagent because it allows a six-membered ring to be formed in the transition state to acyl transfer (see: Scheme 6). In addition, R ₁ R ₂ PC ₆ H ₄ -o-SH does not permit the formation of an episulfide and a stable amidophosphine (R ₁ R ₂ PNR'C (O) R '') by CP bond cleavage in the amidophosphonium salt, such as Thiol as R ₁ R ₂ PCH ₂ CH ₂ SH would do. Further, thiophenol itself is known to effect transesterification of thioesters by native chemical ligation (Dawson, PE, Churchill, M., Ghadiri, MR, Kent, SGHJ Am, Chem Soc, 1997, 119, 4325-4329). The R groups on the phosphorus (R ₁ and R ₂ ) are chosen as electron-withdrawing phenyl groups which render the phosphor less nucleophilic and thereby minimize the tendency of the phosphine to be detrimentally oxidized by O ₂ (g).

Schema 6

Scheme 6

Bei der in Schema 7 veranschaulichten Umwandlung wurde das Peptid AcPheGlyNHBn (5, worin R Benzyl (Bn) ist) aus einem Phenylalanylthioester (1, worin R Bn ist) und einem Glycylazid (4) durch die Wirkung von o-(Diphenylphosphino)-Benzothiol (2) synthetisiert. o-(Diphenylphosphino)-Benzothiol (2) wurde durch Reak tion von Chlordiphenylphosphin und ortho-Lithiertem Thiophenol hergestellt, wie beschrieben durch Block, E.;Ofori-Okai, G.; Zubieta, J. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,2327–2329.) Thioester 3 (worin R ist Bn) wurde hergestellt in quantitativer Ausbeute durch die Transthioesterifizierung von Thioester (1, worin R Bn ist) mit einem Überschuss von Phosphinobenzothiol 2 in DMF, das Düsopropylethylamin (DIEA) enthielt. Phosphine sind bemerkenswerte Katalysatoren von Acylübertragungsreaktionen, Vedejs, E.; Diver, S. T. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115,3358–3359. Thioester 3 (worin R Bn ist) resultiert daher wahrscheinlich aus der Bildung eines Acylphosphoniumsalzes (Ph₂P⁺(C₆H₄-o-SH)C(O)R), gefolgt von intramolekularer P-zu-S-Acyl-Migration.In the transformation illustrated in Scheme 7, the peptide AcPheGlyNHBn (5 where R is benzyl (Bn)) was prepared from a phenylalanyl thioester (1 where R is Bn) and a glycyl azide (4) by the action of o- (diphenylphosphino) benzothiol (2) synthesized. o- (diphenylphosphino) -benzothiol (2) was prepared by the reaction of chlorodiphenylphosphine and ortho-lithiated thiophenol as described by Block, E.; Ofori-Okai, G .; Zubieta, JJ Am. Chem. Soc. 1989, 111, 3227-2329.) Thioester 3 (where R is Bn) was prepared in quantitative yield by the transthioesterification of thioester (1, where R is Bn) with an excess of phosphinobenzothiol 2 in DMF containing diisopropylethylamine (DIEA) , Phosphines are notable catalysts of acyl transfer reactions, Vedejs, E .; Diver, STJ Am. Chem. Soc. 1993, 115, 3358-3359. Thus, thioester 3 (where R is Bn) is likely to result from the formation of an acylphosphonium salt (Ph ₂ P ⁺ (C ₆ H ₄ -o-SH) C (O) R), followed by intramolecular P to S acyl migration ,

Schema 7

Scheme 7

Überschüssiges Thiol wurde durch kovalente Immobilisieunrg an ein Merrifield-Harz (Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol) entfernt. Azid 4 (1 Äquivalent) wurde zu einer Lösung von Thioester 3 zugegeben (worin R Bn ist) in ungepuffertem THF : H₂O (3: 1) und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 2 N HCl angesäuert und die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Chromatographie aus Silica-Gel ergibt gereinigtes Amid 5 (worin R Bn ist) bei 35% Ausbeute. Das andere Hauptprodukt war GlyNHBn, welches aus einer Staudingerreaktion hervorgehen kann (Staudinger et al., 1919). Ergebnisse der Reaktionen von Schema 7, worin R H ist, sind in Tabelle 1 angegeben.Excess thiol was removed by covalent immobilization on a Merrifield resin (chloromethylpolystyrene-divinylbenzene). Azide 4 (1 equivalent) was added to a solution of thioester 3 (where R is Bn) in unbuffered THF: H ₂ O (3: 1) and the resulting solution was stirred at room temperature for 12 h. The reaction was then acidified by adding 2N HCl and the solvents were removed under reduced pressure. Chromatography from silica gel yields purified amide 5 (where R is Bn) in 35% yield. The other major product was GlyNHBn, which may result from a Staudinger reaction (Staudinger et al., 1919). Results of the reactions of Scheme 7, wherein RH is shown in Table 1.

Alternative Lösungsmittelbedingungen sind auch untersucht worden, um deren Wirkung auf die Kopplungseffizienz von Thioester 3 und Azid 4 zu bestimmen. Die Reaktion wurde in THF: H₂O (3: 1), gepuffert bei pH 2, 4, 8, und 13.5 durchgeführt. Die Reaktion wurde auch in Methylenchlorid oder Dimethylformamid durchgeführt„ gefolgt von saurer wässriger Aufarbeitung. Produktausbeuten unter diesen Bedingungen waren ähnlich zu jenen in ungepuffertem THF:H20 (3: 1). Die Ligation war auch wirksam zum Koppeln von Azid 4 mit dem o-Phosphinobenzolthioester von N-Acetylglycin (R=H in Schema 7).Alternative solvent conditions have also been investigated to determine their effect on the coupling efficiency of thioester 3 and azide 4. The reaction was carried out in THF: H ₂ O (3: 1) buffered at pH 2, 4, 8, and 13.5. The reaction was also carried out in methylene chloride or dimethylformamide followed by acidic aqueous work-up. Product yields under these conditions were similar to those in unbuffered THF: H 2 O (3: 1). The ligation was also effective in coupling azide 4 with the o-phosphinobenzene thioester of N-acetylglycine (R = H in Scheme 7).

Amid 5 könnte durch einen anderen Mechanismus gebildet worden sein, der in Schema 6 veranschaulicht ist. Spezifisch könnte das Amidprodukt der Ligation in der Theorie aus der Reduktion des Azids, gefolgt durch Acyltransfer auf das resultierende Amin, hervorgerufen worden sein. Dieser Mechanismus wurde (zumindest als ein Hauptstoffwechselweg) durch ein Kontrollexperiment ausgeschlossen, in welchem Thioester 3 und authentisches GlyNHBn unter Bedingungen (Reaktionspartner, Konzentration, Lösungsmittel, Temperatur und Zeit) gemischt wurde, die identisch zu jenen waren, die zum bewirken der Ligation von Thioester 3 und Glycl-Azid 4 verwendet wurden. Kein Nachweis der Bildung von Amid 5 wurde beobachtet.Amide 5 may have been formed by another mechanism, which is illustrated in Scheme 6 light is. Specifically, the amide product of the ligation could theoretically have been due to the reduction of the azide, followed by acyl transfer to the resulting amine. This mechanism was excluded (at least as a major pathway of metabolism) by a control experiment in which thioester 3 and authentic GlyNHBn were mixed under conditions (reactant, concentration, solvent, temperature, and time) identical to those used to effect ligation of thioester 3 and Glycl-Azide 4 were used. No evidence of formation of amide 5 was observed.

Phosphinothiol 2 hat ausreichende Eigenschaften, um die Ligation dieser Erfindung zu bewirken. Die Reaktionsausbeuten unter Verwendung dieses Phosphinothiolreagenzes waren gering, was das Ergebnis der niedrigen Wasserlöslichkeit von Phosphinothiol 2 sein kann. Die Ausbeuten können durch Optimierung von Lösungsmittel für die Reaktion oder durch Verwendung von Reagenzien verbessert werden, die höhere Löslichkeit in einer wässrigen Lösung haben. Die Ligation mit Phosphinothiol 2 tritt bei einem Übergangszustand mit einem sechsgliedrigen Ring (Schema 6) auf. Die Verminderung der Größe dieses Rings in dem Übergangszustand würde den nucleophilen Imidstickstoff näher an den elektrophilien Thioesterkohlenstoff bringen und zu verbesserten Ausbeuten für die Ligationsprodukte führen.Phosphinothiol 2 has sufficient properties to the ligation of this invention to effect. The reaction yields using this Phosphinothiolreagenzes were low, which is the result of low water solubility of phosphinothiol 2 may be. The yields can be optimized by optimizing solvent for the Reaction or by using reagents, the higher one solubility in an aqueous solution to have. Ligation with phosphinothiol 2 occurs in a transition state with a six-membered ring (Scheme 6). The reduction the size of this Rings in the transition state would the nucleophilic imide nitrogen closer at the electrophilic thioester carbon and improved Yields for lead the ligation products.

Die Wirkung eines kleineren Ringübergangszustandes wurde bei den Ligationsreaktionen von Schema 8 unter Verwendung des Phosphinothiols 20 eingeschätzt, welches einen fünfgliedrigen Ringübergangszustand bilden sollte. Thioester von 20, abgeleitet von AcOH, AcGlyOH, und AcPheOH wurden entweder durch Transthioesterifizierung oder Koppeln mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hergestellt. Nachdem diese Reaktionen durch TLC-Analyse vervollständigt waren, wurde Merrifield-Harz verwendet, um reagiertes Phosphinothiol zu immobilisieren. Nach Aufarbeitung und Chromatographie wurden die gereinigten Thioester in > 90% Ausbeuten isoliert.The Effect of a smaller ring transition state was used in the ligation reactions of Scheme 8 of phosphinothiol 20, which is a five-membered one Ring transition state should form. Thioesters of 20 derived from AcOH, AcGlyOH, and AcPheOH were either by transthioesterification or coupling prepared with dicyclohexylcarbodiimide (DCC). After these reactions completed by TLC analysis Merrifield resin was used to react phosphinothiol to immobilize. After work-up and chromatography were the purified thioesters in> 90% Isolated yields.

Um die Ligation zu bewirken wurde jeder Thioester mit N₃CN₂C(O)NHBn (1 Äquivalent) in THF/H2O (3: 1) bei Raumtemperatur für 12 h gerührt. Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und die Amidprodukte wurden durch Chromatographie gereinigt. Die Amidproduktausbeuten, die unter Verwendung von Phosphinothiol 20 erhalten wurden, sind viel größer als jene , die unter Verwendung von Phosphinothiol 2 erhaltenen (Siehe: Tabelle 1). AcGlyNHBn wurde bei 91 % isolierter Ausbeute unter Verwendung von 20 erhalten, verglichen mit einer Spurenausbeute mit 2. AcGlyGlyNHBn wurde in 80% Ausbeute unter Verwendung von 20 erhalten, verglichen mit 15% unter Verwendung von 2. AcPheGlyNHBn wurde in 92% Ausbeute mit 20 erhalten, verglichen mit 35% mit 2. Tabelle 1 fasst die Ausbeuten zur Ligation unter Verwendung der Phosphinothiole 2 und 20 zusammen.In order to effect the ligation of each thioester with N ₃ CN ₂ C (O) NHBn (1 equivalent) in THF / H2O: stirred at room temperature for 12 h (3 1). Solvents were removed under reduced pressure and the amide products were purified by chromatography. The amide product yields obtained using phosphinothiol 20 are much greater than those obtained using phosphinothiol 2 (See: Table 1). AcGlyNHBn was obtained in 91% isolated yield using 20, compared to a trace yield of 2. AcGlyGlyNHBn was obtained in 80% yield using 20 compared to 15% using 2. AcPheGlyNHBn was obtained in 92% yield with 20 compared to 35% with 2. Table 1 summarizes the yields for ligation using phosphinothiols 2 and 20.

Ein anderer Vorteil der Verwendung von Phosphinothiol 20 ist, dass das Reagenz aus seinem Phosphinoxide regeneriert werden kann durch Reduktion mit einem Überschuss von Trichlorsilan in Chloroform.One Another advantage of using phosphinothiol 20 is that Reagent can be regenerated from its phosphine oxides by reduction with a surplus of trichlorosilane in chloroform.

Tabelle 1: Ausbeuten für Ligationen mit Phosphinothiolen 2 und 20

Table 1: Yields for ligations with phosphinothiols 2 and 20

Die dramatischen Verbesserungen bei Ausbeute, die beobachtet wurden, zeigen an, dass Phosphinothiol 20 ein überlegenes Reagenz zum Bewirken der Ligation eines Thioesters und eines Azids ist, um ein Amid zu bilden. Hingegen schätzten Bertozzi und Mitarbeiter (Saxon, E.; Armstrong, J.L.; Bertozzi, C.R. Org. Lett. 2000, 2, 2141–2143), dass das Vermögen der Oxo-Analoga von Phosphinothioen 2 und 20 eine Staudinger-Ligation bewirken würde. Überraschend fanden sie, dass Ph₂PC₆H₄-o- OH eine höhere Ausbeute ergibt als Ph₂PCH₂OH. Die Basis dieser scheinbaren gegenpoligen Reaktivität von Thioestern und Estern ist unklar.The dramatic improvements in yield observed indicate that phosphinothiol 20 is a superior reagent for effecting the ligation of a thioester and an azide to form an amide. On the other hand, Bertozzi and coworkers (Saxon, E, Armstrong, JL, Bertozzi, CR Org. Lett., 2000, 2, 2141-2143) estimated that the ability of the oxo analogs of phosphinothioenes 2 and 20 would cause Staudinger ligation. Surprisingly, they found that Ph ₂ PC ₆ H ₄ -oOH gave a higher yield than Ph ₂ PCH ₂ OH. The basis of this apparent antipolar reactivity of thioesters and esters is unclear.

Die hohen mit Phosphinothiol 20 erhaltenen Ausbeuten können aus der Nähe des Nucleophils und Elektrophils in diesem Reagenz herrühren. Der unmittelbare Schlüssel bei dieser Ligation wird vermutet, das Iminophosphoran (Schema 6) zu sein. Der Übergangszustand, der vom Iminophosphoran von 20 zu dem Amidophosphoniumsalz führt, enthält einen fünfgliedrigen Ring. Sowohl C-S- als auch P-N-Bindungen in diesem Ring haben signifikant Doppelbindungscharakter. Daher kann das Aminophosphoran relativ wenige Konformationen einnehmen. Im Gegensatz dazu verläuft die Reaktion von N₃(CH₂)₁₀C(O)SPy und PBu₃, um ein Lactam zu bilden, über einen Übergangszustand mit einem 12-gliedrigen Ring (Bosch, I; Romea, P; Urpi, F; Vilarassa, J. Tetrahedron Lett. 1993 34:4671–4674). Die Ausbeute dieser Reaktion ist nur 28 %.The high yields obtained with phosphinothiol 20 may result from the proximity of the nucleophile and electrophile in this reagent. The immediate key to this ligation is thought to be the iminophosphorane (Scheme 6). The transition state leading from the iminophosphorane of 20 to the amidophosphonium salt contains a five-membered ring. Both CS and PN bonds in this ring have significant double bond character. Therefore, the Aminophosphoran can assume relatively few conformations. In contrast, the reaction of N ₃ (CH ₂ ) ₁₀ C (O) SPy and PBu ₃ to form a lactam proceeds via a transition state with a 12-membered ring (Bosch, I; Romea, P; Urpi, F Vilarassa, J. Tetrahedron Lett. 1993 34: 4671-4674). The yield of this reaction is only 28%.

Ein anderer Faktor, der zu den hohen mit Phosphinothiol 20 erhaltenen Ausbeuten beitragen würde, ist eine stabile Konformation, die Amidbildung erleichtert. Molekularmechanismenberechnungen zeigen, dass die Iminophosphoran-Zwischenstufe eine β-Turn-artige Konformation annehmen kann. Eine β-Turn ist stabilisiert durch eine O···HN-Wasserstoffbindung, welche einen 10-gliedrigen Ring definiert. Die Thioester-, Imid- und Amidgruppen des Iminophosphorans sind an Positionen gelegen, die drei Amidgruppen in einer β-Turn entsprechen. In dieser Konformation ist der nucleophile Imid Stickstoff innerhalb von 3,0 Å von dem elektrophilen Thioesterkohlenstoff. Darüber hinaus würde die O···HN-Wasserstoffbindung den Thioester polarisieren, wobei er seinen Kohlenstoff noch elektrophiler macht. Schließlich könnte die Ansammlung der beiden Phenylgruppen Acylüberführung durch Verstärken der Iminophosphoranfraktion in der β-Turn-artigen Konformation beschleunigen (Als Beispiele des "reaktiven Rotamereffekts", siehe: (a) Bruice, T.C.; Pandit, U.K. J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 5858–5865. (b) Jung, M.E.; Gervay, J. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 224–232). Diese günstige Konformation würde unzugänglich bei einer Ligation mit 2 sowie bei der Ligation eines Thioesters mit einem Nicht-Peptidylazid.Another factor that would contribute to the high yields obtained with phosphinothiol 20, is a stable conformation that facilitates amide formation. Molecular mechanics calculations show that the iminophosphorane intermediate can adopt a β-turn-like conformation. A β-turn is stabilized by an O ··· HN hydrogen bond, which defines a 10-membered ring. The thioester, imide and amide groups of the iminophosphorane are located at positions corresponding to three amide groups in a β-turn. In this conformation, the nucleophilic imide is nitrogen within 3.0 Å of the thiophene electrophilic carbon. In addition, O ··· HN hydrogen bonding would polarize the thioester, making its carbon even more electrophilic. Finally, the accumulation of the two phenyl groups could accelerate acyl transfer by enhancing the iminophosphorane fraction in the β-turn-like conformation (As examples of the "reactive rotamer effect", see: (a) Bruice, TC; Pandit, UKJ Am. Chem. Soc. 82, 5858-5865 (b) Jung, ME; Gervay, JJ Am. Chem. Soc. 1991, 113, 224-232). This favorable conformation would be inaccessible in ligation with 2 as well as in the ligation of a thioester with a non-peptidyl azide.

Phosphinothiol 20 hat einen zusätzlichen intrinsischen Vorteil gegenüber Phosphinothiol 2. Im Allgemeinen haben aliphatische Thiole (wie 20) höhere pKa-Werte als aromatische Thiole (wie 2). Da Thioesterhydrolysegeschwindigkeiten umgekehrt mit deren Thiol-pKa-Werten korrelieren (Janssen, M. J. The Chemistry of Carboxylic Acids and Esters; Patai, S., Ed.; Interscience Publishers; New York, 1969, S. 730–736), haben aliphatische Thioester eine längere Halbwertszeit in wässriger Lösung. Diese längere Halbwertszeit ist wichtig, da die Hydrolyse der Thioester entweder vor oder nach Iminophosphoranbildung wahrscheinlich eine kompitierende Nebenreaktion für die Ligation sein wird.Phosphinothiol 20 has an extra intrinsic advantage over Phosphinothiol 2. Generally, aliphatic thiols (such as 20) higher pKa values as aromatic thiols (as 2). Since thioester hydrolysis rates conversely correlate with their thiol pKa values (Janssen, M.J. The Chemistry of Carboxylic Acids and Esters; Patai, S., Ed .; Interscience Publishers; New York, 1969, pp. 730-736), have aliphatic thioesters a longer one Half-life in aqueous Solution. This longer Half life is important because the hydrolysis of the thioesters either before or after iminophosphorus formation probably a compitatory one Side reaction for the ligation will be.

Daher ist die Wahl des Phosphinothiolreagenzes ein wichtiger Aspekt beim Durchführen der Ligation eines Thioesters und eines Azids dieser Erfindung. Ein bei dieser Erfindung verwendbares Phosphinothiol hat die allgemeine Struktur:

worin:
n und m 0 oder ganze Zahlen gleich 1–3, einschließlich, und n + m = 0 – 4, sind; die gestrichelte Linie anzeigt, dass die Doppelbindung vorliegen kann oder dass die Bindung Teil einer aromatischen Gruppe sein kann (R₄, R₆ und R₈ sind nicht vorliegend, wenn es eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen gibt oder die Bindung Teil eines aromatischen Rings ist, wie angezeigt);
R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogeniden (insbesondere F oder Cl), OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, allzyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizykli sche, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR' und R₁ und R₂ zusammen einen Ring bilden können , der das P-Atom einschließt, und
R₃–R₈ unabhängig gewählt sind unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂ und worin zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe.Therefore, the choice of the phosphinothiol reagent is an important aspect in performing the ligation of a thioester and an azide of this invention. A phosphinothiol useful in this invention has the general structure:

wherein:
n and m are 0 or integers equal to 1-3, inclusive, and n + m = 0 - 4; the dashed line indicates that the double bond may be present or that the bond may be part of an aromatic group (R ₄ , R ₆ and R ₈ are not present if there is a double bond between the carbons or the bond is part of an aromatic ring, as indicated);
R ₁ and R _{2 are} independently selected groups of aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups optionally substituted with halides (especially F or Cl), OH, OR, COH, COR, COOH, COOR - or n (R ') ₂ groups, in which R, independently of other R, is an aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group and each R' independently of another R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, in turn, R and R 'may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ ; in R ₁ and R _2, one or more non-adjacent CH ₂ groups may be replaced by O, S, CO, COO or CONR 'and R ₁ and R _{2 may} together form a ring which includes the P atom, and
R ₃ -R _{8 are} independently selected from hydrogen, aliphatic alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups, which may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ , for R ₃ -R ₈ one or more non-adjacent CH ₂ - Groups may be replaced with O, S, CO, COO or CONR 'groups, wherein each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group which is optionally substituted as listed above R ₁ and R ₂ and wherein two or more R ₃ -R _{8 may be} covalently bonded to form a cyclic group, including a bicyclic group.

R₁- und R₂-Gruppen umfassen unter anderem Alkylgruppen, Alkenylgruppen, zyklische Alkylgruppen, zyklische Alkenylgruppen, bizyklische Gruppen, aromatische Gruppen, heteroaromatische Gruppen, Ethergruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Thioethergruppen und Ketongruppen.R ₁ and R ₂ groups include, but are not limited to, alkyl groups, alkenyl groups, cyclic alkyl groups, cyclic alkenyl groups, bicyclic groups, aromatic groups, heteroaromatic groups, ether groups, ester groups, amide groups, thioether groups and ketone groups.

Es ist bevorzugt, dass R₅–R₈ nicht alle Wasserstoffe sind. Es ist auch bevorzugt, dass n + m = 0, 1 oder 2 ist. In spezifischen Ausführungen sind R₃ und R₄ beide Wasserstoffe und n und m beide Null.It is preferred that R ₅ -R _{8 are} not all hydrogens. It is also preferred that n + m = 0, 1 or 2. In specific embodiments, R ₃ and R ₄ are both hydrogens and n and m are both zero.

In spezifischen Ausführungen hat das Phosphinothiol die Formel:

worin R₁ und R₂ aromatische oder heteroaromatische Gruppen sind, welche optional substituiert sind wie oben beschrieben und R₃ und R₄ sind wie oben beschrieben. R₃ und R₄ sind vorzugsweise Wasserstoffe. R₁ und R₂ sind vorzugsweise Elektronenabziehende Gruppen, einschließlich Phenylgruppen und substituierte Phenylgruppen. Eines von R₃, und/oder R₄ und R₂ können kovalent gebunden sein, um einen heteroaromatischen Ring zu bilden, der mit Gruppen wie oben aufgelistet substituiert sein kann.In specific embodiments, the phosphinothiol has the formula:

wherein R ₁ and R _{2 are} aromatic or heteroaromatic groups which are optionally substituted as described above and R ₃ and R ₄ are as described above. R ₃ and R ₄ are preferably hydrogens. R ₁ and R ₂ are preferably electron withdrawing groups, including phenyl groups and substituted phenyl groups. One of R ₃ , and / or R ₄ and R ₂ may be covalently bonded to form a heteroaromatic ring which may be substituted with groups as listed above.

In anderen Ausführungen kann das Phosphinothiol die Formel haben:

worin R₁–R₆ wie oben definiert sind, R₁ und R₂ und/oder R₄ und R₅ sind optional kovalent verknüpft, um einen alicyclischen oder aromatischen Ring zu bilden, worin die gestrichelte Linie zwischen Kohlenstoffen eine optionale Doppelbindung oder Teil eines aromatischen Rings anzeigt, R₃ und R₆ sind nicht vorhanden, wenn es eine Doppelbindung zwischen Kohlenstoffen gibt wie angezeigt.In other embodiments, the phosphinothiol may have the formula:

wherein R ₁ -R _{6 are} as defined above, R ₁ and R ₂ and / or R ₄ and R ₅ are optionally covalently linked to form an alicyclic or aromatic ring, wherein the dashed line between carbons is an optional double bond or part of a aromatic ring, R ₃ and R ₆ are absent if there is a double bond between carbons as indicated.

In einer anderen Ausführung hat das Phosphinothiol die Struktur:

worin R₁–R₈ wie oben definiert sind und R₁–R₂, oder R₄–R₅, oder R₅–R₇, R₄–R₇ oder R₄–R₅–R₇ optional kovalent verknüpft sind, um einen alicyklischen oder aromatischen Ring zu bilden.In another embodiment, the phosphinothiol has the structure:

wherein R ₁ -R _{8 are} as defined above and R ₁ -R ₂ , or R ₄ -R ₅ , or R ₅ -R ₇ , R ₄ -R ₇ or R ₄ -R ₅ -R _{7 are} optionally covalently linked, to form an alicyclic or aromatic ring.

In weiteren Ausführungen hat das Phosphinothiol die Struktur:

worin n und m 0 oder 1 sind, R₁ und R₂ wie oben definiert sind, und X₁–X₄ Substituenten an der aromatischen Gruppe sind, von denen zwei kovalent verknüpft sein können, um einen alizyklischen oder aromatischen Ring zu bilden, X₁–X₄ aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halogenid, OH, OR, COR, COOH, COOR sein können (worin R aliphatisch, alizyklisch oder aromatisch ist) oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von dem anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist und R und R' wie oben für R₁ und R₂ aufgelistet optional substituiert sind.In further embodiments, the phosphinothiol has the structure:

wherein n and m are 0 or 1, R ₁ and R _{2 are} as defined above, and X ₁ -X _{4 are} substituents on the aromatic group, two of which may be covalently linked to form an alicyclic or aromatic ring, X ₁ -X _{4 may be} aliphatic, alicyclic or aromatic groups or may be halide, OH, OR, COR, COOH, COOR (where R is aliphatic, alicyclic or aromatic) or N (R ') ₂ group, wherein each R 'independently of the other R' is a hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group and R and R 'are optionally substituted as listed above for R ₁ and R ₂ .

In einer anderen Ausführung hat das Phosphinothiol die Struktur:

worin R₁ und R₂ wie oben definiert sind und M einen alizyklischen, einschließlich einen bizyklischen oder aromatischen, einschließlich eines heteroaromatischen Rings darstellt; M einen Phenylring, Naphthalin (oder anderen verschmolzenen Ring), ein Pyridin (oder anderen heteroaromatischen Ring) oder ein Cyclohexen (oder anderen alizyklischen Ring) und R₁ und R₂ optional kovalent verknüpft sind, um einen phosphorhaltigen Ring zu bilden.In another embodiment, the phosphinothiol has the structure:

wherein R ₁ and R _{2 are} as defined above and M is an alicyclic, including a bicyclic or aromatic, including a heteroaromatic ring; M is optionally covalently linked to a phenyl ring, naphthalene (or other fused ring), a pyridine (or other heteroaromatic ring), or a cyclohexene (or other alicyclic ring) and R ₁ and R ₂ to form a phosphorus-containing ring.

Spezifische Beispiele dieser Struktur umfassen:

worin X₁–X₄, wenn vorliegend, Substituenten an dem heteroaromatischen Ring sind und unabhängig gewählt werden können unter einem Wasserstoff, einem Halid, einer Alkylgruppe, einer aromatischen Gruppe, einer OR-, COR- oder COOR-Gruppe, worin R ein Wasserstoff, eine aliphatische Gruppe, eine alizyklische Gruppe, eine aromatische Gruppe, eine CONR'- oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von anderen R' Wasserstoff oder eine aliphatische oder aromatische Gruppe sein kann.Specific examples of this structure include:

wherein X ₁ -X ₄ , when present, are substituents on the heteroaromatic ring and can be independently selected from hydrogen, halide, alkyl group, aromatic group, OR, COR or COOR group, wherein R is hydrogen is an aliphatic group, an alicyclic group, an aromatic group, a CONR 'or N (R') ₂ group, wherein each R 'independently of other R' may be hydrogen or an aliphatic or aromatic group.

In zusätzlichen spezifischen Ausführungen umfassen die Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung:

worin R₁, R2, X₁–X₄ wie oben definiert sind; und

worin R₁ und R₂ wie oben definiert sind, die gestrichelte Linie eine optionale Doppelbindung anzeigt und X₁–X₁₀, wenn vorliegend, Wasserstoff, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halid, OH, OR, COR, COOH, COOR (worin R aliphatisch, alizyklisch oder aromatisch ist), CONR' oder N(R')₂-Gruppen sein können, worin R' unabhängig von anderen R' Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sind, R und R' optional substituiert sind wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, Substituenten, in Anführungszeichen, nicht vorliegen wenn die Doppelbindung vorliegt.In additional specific embodiments, the phosphinothiol reagents of this invention include:

wherein R ₁ , R ₂ , X ₁ -X _{4 are} as defined above; and

wherein R ₁ and R _{2 are} as defined above, the dotted line indicates an optional double bond and X ₁ -X ₁₀ , when present, may be hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic groups, or halide, OH, OR, COR, COOH, COOR (wherein R is aliphatic, alicyclic or aromatic), CONR 'or N (R') ₂ groups, wherein R 'independently of other R' are hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic groups, R and R 'are optionally substituted are as listed above for R ₁ and R ₂ , substituents, in An is not present if the double bond is present.

R₁- und R₂-Gruppen in dem Phosphinothiolreagenz werden im Allgemeinen gewählt, um das Ansteigen freier Energie des Übergangsreaktionszustandes zu vermeiden unter Vermeidung ungünstiger sterischer oder elektronischer Interaktionen und um Löslichkeit in sowohl organischen Lösungsmitteln (für deren Synthese) und wässrigen Puffern (für Anwendungen) zu ergeben. Polyethylenglykolgruppen können zum Beispiel verwendet werden, um Löslichkeit sowohl in organischen Lösungsmitteln als auch wässrigen Lösungen zu verleihen. Beispielhaft umfassen R₁- und R₂-Gruppen die Polyethergruppen:

worin p 0 oder eine ganze Zahl ist, reichend von 1 bis etwa 10, einschließlich, vorzugsweise ist p 1 bis einschließlich 4. und R ist Wasserstoff oder eine Alkylgruppe. Kohlenstoffe in den Polyethergruppen werden optional mit Haliden oder kleinen Alkylgruppen substituiert. In spezifischen Ausführungsformen sind Phosphinothiolreagenzien dieser Erfindung, in welchen R₁ und R₂ Phenylgruppen sind, können diese Phenylgruppen mit einer oder mehreren Polyethergruppen substituiert werden, um die Löslichkeit des Reagenzes in Wasser zu verstärken.R ₁ and R ₂ groups in the phosphinothiol reagent are generally chosen to avoid the increase in free energy of the transition reaction state, avoiding unfavorable steric or electronic interactions, and solubility in both organic solvents (for their synthesis) and aqueous buffers (for applications ). For example, polyethylene glycol groups can be used to impart solubility in both organic solvents and aqueous solutions. By way of example, R ₁ and R ₂ groups include the polyether groups:

wherein p is 0 or an integer ranging from 1 to about 10 inclusive, preferably p is 1 to 4 inclusive and R is hydrogen or an alkyl group. Carbons in the polyether groups are optionally substituted with halides or small alkyl groups. In specific embodiments, phosphinothiol reagents of this invention in which R ₁ and R _{2 are} phenyl groups, these phenyl groups can be substituted with one or more polyether groups to enhance the solubility of the reagent in water.

In anderen spezifischen Ausführungen haben Reagenzien dieser Erfindung die Formeln:

worin p1 und p2 Null oder ganze Zahlen, reichend von 1 bis etwa einschließlich 10 sind, R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist. Die ganzen Zahlen p1 und p2 bevorzugt die gleichen sind, vorzugsweise von 1 bis einschließlich 4 reichend.In other specific embodiments, reagents of this invention have the formulas:

wherein p1 and p2 are zero or integers ranging from 1 to about 10 inclusive, R is hydrogen or an alkyl group. The integers p1 and p2 are preferably the same, preferably ranging from 1 to 4 inclusive.

Diese Phosphinatreagenzien sind von besonderem Interesse als wasserlösliches Thiolreagenz zur Verwendung in Ligationen dieser Erfindung. Dieser Reagenztyp kann über das Phosphoramidit PCl₂(N(C₂H₅) ₂ ) synthetisiert werden, welches vorher verwendet worden ist, um Alkohole zu phosphorylieren (Perch, J.W.; und Johns, RB 1988 Synthesis-Stuttgart 2, 142–144). Nachdem das Phosphoramidit mit monogeschütztem Tetraethylenglykol reagiert hat, welches kommerziell verfügbar ist, wird N(C₂H₅)₂-Substituent durch Cl ersetzt. Ortho-Lithierung mit Thiophenol und Entschützen ergibt das gewünschte Phosphinat: These phosphinate reagents are of particular interest as a water-soluble thiol reagent for use in ligations of this invention. This type of reagent can be synthesized via the phosphoramidite PCl ₂ (N (C ₂ H ₅ ) ₂ ) previously used to phosphorylate alcohols (Perch, JW, and Johns, RB 1988 Synthesis-Stuttgart 2, 142-144). After the phosphoramidite reacts with monoprotected tetraethylene glycol, which is commercially available, N (C ₂ H ₅ ) ₂ substituent is replaced by Cl. Ortho-lithiation with thiophenol and deprotection gives the desired phosphinate:

Im Allgemeinen können die R₁- und R₂-Gruppen, die Polyethergruppen enthalten, durch Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik von bereits erhältlichen Startmaterialien bekannt sind.In general, the R ₁ and R ₂ groups containing polyether groups can be prepared by methods be synthesized, which are known in the art of already available starting materials.

Die Reaktivität des Phosphinothiolreagenzes kann eingestellt werden durch Wahl der Substituenten R₁ und R₂, wie im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen werden diese Gruppen gewählt, um die gewünschte Reaktivität mit einer ausgewählten Azid basierend, wenigstens teilweise auf der elektronischen und sterischen Eigenschaften des Azids, zu erhalten und um die Sensitivität des Reagenzes gegenüber Sauerstoff zu minimieren. Reagenzien, die gegenüber Sauerstoff sensitiver sind, sind im Allgemeinen schwierig zu handhaben und erfordern mehr Sorgfalt bei der Anwendung, um ungewünschte Sauerstoffgehalte zu vermeiden, die die Effizienz des Reagenzes zerstören oder vermindern können. Hingegen können Ligationen mit weniger reaktivem Azid wie Aziden von Glycosiden signifikant durch Verwendung von reaktiveren Phosphinothiolreagenzien verbessert werden. Zum Beispiel kann die Verwendung von n-Alkylgruppen wie n-Butylgruppen als R₁- und R₂-Gruppen signifikant die Reaktivität des Reagenzes erhöhen.The reactivity of the phosphinothiol reagent can be adjusted by choice of the substituents R ₁ and R ₂ as known in the art. Generally, these groups are chosen to obtain the desired reactivity with a selected azide based, at least in part, on the electronic and steric properties of the azide and to minimize the sensitivity of the reagent to oxygen. Reagents that are more sensitive to oxygen are generally difficult to handle and require more care in use to avoid undesirable levels of oxygen that can destroy or reduce the efficiency of the reagent. On the other hand, less reactive azide ligations, such as glycoside azides, can be significantly improved by using more reactive phosphinothiol reagents. For example, the use of n-alkyl groups such as n-butyl groups as R ₁ and R ₂ groups can significantly increase the reactivity of the reagent.

In einem zusätzlichen Beispiel können die Substitution von Elektronendonorgruppen (wie Alkoxygruppen in geeigneten Ringpositionen wie im Stand der Technik bekannt) oder Elektronen-abziehenden Gruppen (wie NO₂-Gruppen in geeigneten Ringpositionen wie im Stand der Technik bekannt, insbesondere p-NO₂) an Phenylgruppensubstituenten der Phosphinothiolreagenzien verwendet werden, um die Reaktivität der Reagenzien abzustimmen. Zusätzlich werden die Elektronen-abziehenden Gruppen dazu neigen, die Reaktivität und Addition von Elektronendonorgruppen an Phenylsubstituenten zu vermindern, welche dazu neigen die Reagenzreaktivität zu verstärken.In an additional example, substitution of electron donating groups (such as alkoxy groups in suitable ring positions as known in the art) or electron withdrawing groups (such as NO ₂ groups in appropriate ring positions as known in the art, especially p-NO ₂ ) may be employed Phenylgruppen substituents of the phosphinothiol reagents can be used to tune the reactivity of the reagents. In addition, the electron-withdrawing groups will tend to reduce the reactivity and addition of electron donating groups to phenyl substituents, which tend to enhance reagent reactivity.

Phosphinothiolreagenzien, die in dieser Erfindung verwendbar sind, können durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren aus bereits erhältlichen Ausgangsmaterialien angesichts der Lehren hierin hergestellt werden.Phosphinothiolreagenzien, which are useful in this invention can be characterized by those in the art well known methods from already available starting materials in view of the teachings herein.

Reagenzien dieser Erfindung können in Kit-Form bereitgestellt werden, optional umfassend Lösungsmittel für eine gewünschte Reaktion, optional umfassend Anwei sungen zum Ausführen der Reaktion sowie optional umfassend eines oder mehrere Azid- oder Thioesterreagenzien. Ein Kit kann Reagenzien zum Erzeugen von Thioestern und/oder Aziden umfassen. Ein Reagenzkit kann auch eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien enthalten, die eine Markierungsgruppe, einen Schwanz oder ein Reportermolekül zum Koppeln an eine Aminosäure, Peptid oder Protein tragen. Reagenzkits können zum Beispiel Gefäße oder andere Behälter umfassen, die abgemessene relative Mengen an Bestandteilen zum Ausführen einer ausgewählten Reaktion umfassen. Die Reagenzien können verpackt und abgemessen werden zur Verwendung in einer einzigen Ligationsreaktion oder verpackt und abgemessen für eine schrittweise Synthese, die zwei oder mehr Aminosäuren, Peptide oder Proteinfragmente ligiert.reagents of this invention in kit form, optionally comprising solvent for one desired Reaction, optionally including instructions for executing the Reaction and optionally comprising one or more azide or Thioesterreagenzien. A kit may contain reagents for generating thioesters and / or azides. A reagent kit can also be one or more Phosphinothiol reagents containing a labeling group, a tail or reporter molecule for coupling to an amino acid, peptide or carry protein. Reagent kits may include, for example, vessels or include other containers, the measured relative amounts of ingredients to perform a chosen Reaction include. The reagents can be packed and measured are packaged for use in a single ligation reaction or and measured for a stepwise synthesis involving two or more amino acids, peptides or protein fragments ligated.

Die Synthese des zuvor unbekannten Phosphinothiols 20 ist unten in Beispiel 2 beschrieben und in Schema 9 veranschaulicht. Phenylmagnesiumbromid wurde zur Chlormethylphosphondichlorid 23 gegeben und die resultierende Grignard-Reaktion ließ man für 12 Stunden unter Rückfluss laufen, um Phosphinoxid 24 zu ergeben. Das Gemisch 24 mit Thioessigsäure und Triethylamin in trockenem THF wurde bei Rückfluss für 12 Stunden geheizt (Lamoureux, G.V.; Whitesides, G.M. J. Org. Chem., 1993, 58, 633–641; Woycechowsky, K.J.; Wittrup, K. D.; Raines, R. T. Chem. Biol. 1999, 6, 871–879). Nach Reinigung durch Flashchromatographie bzw. Blitzchromatographie und Behandlung mit Aktivkohle, wurde Thiophosphinoxid 25 in einer kombinierten Ausbeute von 54 % für die beiden Schritte isoliert. Ein Überschuss an Trichlorsilan in Chloroform für 72 Stunden wurde verwendet, um 25 zu Phosphinothioester 26 zu reduzieren, welcher durch Flashchromatographie bzw. Blitzchromatographie in nahezu quantitativer Ausbeute isoliert wurde. Die Hydrolyse des Phosphinoesters 26 (Charrier, C.; Mathey, F. Tetrahedron Lett. 1978, 27, 2407–2410) mit Natriumhydroxid in Methanol für 2 Stunden ergab Phosphinothiol 20. (Hydrolyse unter sauren Bedingungen war nicht erfolgreich.) Bei dieser Reaktion wurde Ar(g) durch das Reaktionsgemisch gesprudelt, um die Oxidation des resultierenden Thiols zu vermeiden. Phosphinothiol 20 wurde durch Chromatographie über Aluminiumoxid gereinigt und in 74 % Ausbeute isoliert. Die Gesamtausbeute für das Verfahren in Schema 9 war 39 %.The Synthesis of the previously unknown phosphinothiol 20 is shown below in Example 2 and illustrated in Scheme 9. phenylmagnesium was added to the chloromethylphosphonic dichloride 23 and the resulting Grignard reaction left for 12 Hours under reflux run to give phosphine oxide 24. The mixture 24 with thioacetic acid and Triethylamine in dry THF was heated at reflux for 12 hours (Lamoureux, g.v .; Whitesides, G.M. J. Org. Chem., 1993, 58, 633-641; Woycechowsky, K.J .; Wittrup, K. D .; Raines, R.T. Chem. Biol. 1999, 6, 871-879). To Purification by flash chromatography or flash chromatography and Treatment with activated carbon, thiophosphine oxide was 25 in a combined yield from 54% for the two steps isolated. An excess of trichlorosilane in chloroform for 72 hours was used to reduce 25 to phosphinothioester 26, which by flash chromatography or flash chromatography in isolated almost quantitative yield. The hydrolysis of the Phosphinoester 26 (Charrier, C .; Mathey, F. Tetrahedron Lett. 1978, 27, 2407-2410) with sodium hydroxide in methanol for 2 hours gave phosphinothiol 20. (Hydrogenation under acidic conditions was unsuccessful.) In this reaction, Ar (g) was bubbled through the reaction mixture, to avoid the oxidation of the resulting thiol. Phosphinothiol 20 was purified by chromatography Purified alumina and isolated in 74% yield. The total yield for the Procedure in Scheme 9 was 39%.

Schema 9

Scheme 9

Die folgenden Ausdrücke haben die angezeigte Bedeutung in der Beschreibung und den Ansprüchen:
Der Ausdruck aliphatisch betrifft Kohlenwasserstoffe, welche gesättigt oder ungesättigt sind (Alkane, Alkene, Alkyne) und welche geradkettig oder verzweigt sein können. Aliphatische Gruppen können optional mit verschiedenen Substituenten oder funktionellen Gruppen substituiert sein, unter anderem einschließend Halide, Hydroxygruppen, Thiolgruppen, Estergruppen, Ketongruppen, Carboxylsäuregruppen, Amine und Amide. Eine heteroaliphatische Gruppe ist eine aliphatische Gruppe, die eines oder mehrere Nicht-Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffkette enthält (zum Beispiel eine oder mehrere benachbarte CH₂-Gruppen werden ersetzt durch O, S oder NH).The following terms have the meaning indicated in the description and claims:
The term aliphatic refers to hydrocarbons which are saturated or unsaturated (alkanes, alkenes, alkynes) and which may be straight-chain or branched. Aliphatic groups may optionally be substituted with various substituents or functional groups including, but not limited to halides, hydroxy groups, thiol groups, ester groups, ketone groups, carboxylic acid groups, amines and amides. A heteroaliphatic group is an aliphatic group containing one or more non-carbon atoms in the hydrocarbon chain (for example, one or more adjacent CH ₂ groups are replaced by O, S or NH).

Der Ausdruck alizyklisch betrifft Kohlenwasserstoffe, die einen oder mehrere ungesättigte Ringe haben (z.B. drei- bis zehngliedrige Ringe) und welche bizyklisch sein können. Alizyklische Gruppen können Anteile einschließen, die verzweigt- und/oder geradkettig aliphatisch sind in Kombination mit einem zyklischen Kohlenwasserstoff. Alizyklische Gruppen können substituiert sein wie oben bemerkt für aliphatische Gruppen. Eine heteroalizyklische Gruppe ist eine alizyklische Gruppe, die eines oder mehrere Heteroatome (Nicht-Kohlenstoffatome) in der Kohlenwasserstoffkette, in einem Ring oder in einem geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Anteil einer alizyklischen Gruppe enthält (z.B. können eine oder mehrere benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein durch O, S oder NH).The term alicyclic refers to hydrocarbons having one or more unsaturated rings (eg, three- to ten-membered rings) and which may be bicyclic. Alicyclic groups may include moieties that are branched and / or straight chain aliphatic in combination with a cyclic hydrocarbon. Alicyclic groups may be substituted as noted above for aliphatic groups. A heteroalicyclic group is an alicyclic group containing one or more heteroatoms (non-carbon atoms) in the hydrocarbon chain, in a ring, or in a straight or branched aliphatic portion of an alicyclic group (eg, one or more adjacent CH ₂ groups may be substituted by O, S or NH).

Der Begriff aromatisch betrifft Kohlenwasserstoffe, die einen oder mehrere aromatische Ringe umfassen, welche fusionierte Ringe sein können (z.B. in einer Naphthalingruppe). Aromatische Gruppen können Anteile einschließen, die verzweigt und/oder geradkettig, aliphatisch und/oder alizyklisch sind in Kombination mit Aromaten.Of the Term aromatic refers to hydrocarbons containing one or more include aromatic rings which may be fused rings (e.g. in a naphthalene group). Aromatic groups can share lock in, branched and / or straight chain, aliphatic and / or alicyclic are in combination with aromatics.

Aromatische Gruppen können substituiert sein wie oben für aliphatische Gruppen bemerkt. Eine heteroaromatische Gruppe ist eine aromatische Gruppe, welche eines oder mehrere Heteroatome (Nicht-Kohlenstoffatome) in einem aromatischen Ring enthält (z.B. ein Pyridinring). Ein CH in einem aromatischen Ring kann ersetzt sein mit O, S oder N. In jedem alizyklischen oder aliphatischen Anteil der aromatischen Gruppe können eine oder mehrere benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt werden durch ein Heteroatom (z.B. O, S, NH).Aromatic groups may be substituted as noted above for aliphatic groups. A heteroaromatic group is an aromatic group containing one or more heteroatoms (non-carbon atoms) in an aromatic ring (eg, a pyridine ring). A CH in an aromatic ring may be replaced with O, S, or N. In each alicyclic or aliphatic portion of the aromatic group, one or more adjacent CH ₂ groups may be replaced by a heteroatom (eg, O, S, NH).

Aliphatische, alizyklische, aromatische Gruppen und die entsprechenden Heteroatom-haltigen Gruppen können auch mit funktionellen Gruppen wie oben bemerkt substituiert sein. Aromatische Ringe können zum Beispiel substituiert sein mit Elektronengebenden oder Elektronen-abziehenden Gruppen wie gewünscht. Elektronengebende und Elektronen-abziehende Gruppen sind dabei im Stand der Technik gut bekannt.aliphatic, alicyclic, aromatic groups and the corresponding heteroatom-containing Groups can also be substituted with functional groups as noted above. Aromatic rings can be used for Example be substituted with electron-donating or electron-withdrawing Groups as desired. electron Imaging and electron-withdrawing groups are known in the art well known.

Gewöhnliche Aminosäuren sind jene 20 Aminosäuren, die gewöhnlich in natürlich vorkommenden Peptiden und Proteinen gefunden werden und umfassen: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Tyrosin, Cystein, Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. R^A-Gruppen umfassen unter anderem Seitenketten oder Seitengruppen von gewöhnlichen Aminosäuren.Common amino acids are those 20 amino acids commonly found in naturally occurring peptides and proteins and include: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, asparagine, glutamine, tyrosine, cysteine, Lysine, arginine, histidine, aspartic acid and glutamic acid. R ^A groups include, among others, side chains or side groups of common amino acids.

Ungewöhnliche Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden, umfassen solche mit hydroxylierten, alkylierten, phosphorylierten, formylierten und acylierten Seitengruppe und umfassen unter anderem insbesondere 4-Hydroxyprolin, 3- Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, o-Phosphoserin, Carboxyglutamat, Acetyllysin und N-Methylarginin. Aminosäurederivate mit biologischer Aktivität umfassen unter anderem α-Aminobuttersäure, Thyroxin, Citrullin, Ornithin, Homocystein, S-Adenosylmethionin, β-Cyanoalanin und Azaserin. R^A-Gruppen können Seitengruppen oder Seitenketten gewöhnlicher und ungewöhnlicher Aminosäuren und Seitengruppen von biologisch aktiven Derivaten von Aminosäuren umfassen, welche mit einem oder mehreren Haliden, Hydroxylen, Akylgruppen, Thiolen, geschützten Thiolen, Aminogruppen, geschützten Aminogruppen, Acetyl-, Ester- oder Carboxylsäuregruppen substituiert sind.Unusual amino acids found in proteins include those with hydroxylated, alkylated, phosphorylated, formylated and acylated side groups and include, inter alia, in particular 4-hydroxyproline, 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, o-phosphoserine, carboxyglutamate, acetyllysine and N-methylarginine. Biologically active amino acid derivatives include, but are not limited to, α-aminobutyric acid, thyroxine, citrulline, ornithine, homocysteine, S-adenosylmethionine, β-cyanoalanine and azaserine. R ^A groups may include side groups or side chains of ordinary and unusual amino acids and side groups of biologically active derivatives of amino acids containing one or more halides, hydroxyls, alkyl groups, thiols, protected thiols, amino groups, protected amino groups, acetyl, ester or carboxylic acid groups are substituted.

Das Verfahren dieser Erfindung kann auch eingesetzt werden, um zwei oder mehrere Aminosäuren zu ligieren, die elektrophile Seitengruppen tragen wie Alkylhalidseitengruppen oder Epoxidseitengruppen zusammen oder eine oder mehrere dieser Aminosäuren in ein Peptid oder Protein einverleiben. Einverleiben solcher Aminosäuren ist schwierig mit konventionellen Peptidsynthesen aufgrund des Bedarfs, die Fmoc-Schutzgruppe mit einer Base (typischerweise Piperidin) zu entfernen. Die Base kann auch als Nukleophil wirken, dass die elektrophile Seitenkette angreift. Zum Beispiel könnte eine Aminosäure mit einer elektrophilen Seitenkette durch Zusetzen einer Azidsäure gemacht werden, die eine elektrophile Seitenkette als Endmonomer eines synthetischen Peptids enthält. Entschützen dieses Peptids und Spalten von dem Harz würde ein Azidpeptid ergeben, das eine elektrophile Seitenkette trägt, welche dann unter Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung an ein anderes Peptid oder Protein ligiert werden könnte, das eine Phosphinothioestergruppe trägt.The Method of this invention can also be used to two or more amino acids ligate the electrophilic side groups such as alkyl halide side groups or epoxy side groups together or one or more of these amino acids into a peptide or protein. Incorporation of such amino acids is difficult with conventional peptide syntheses due to the need the Fmoc protecting group with a base (typically piperidine) to remove. The base can also act as a nucleophile that the electrophilic Side chain attacks. For example, an amino acid could be with an electrophilic side chain made by adding an azido acid be an electrophilic side chain as the end monomer of a synthetic Contains peptides. deprotection this peptide and cleavage of the resin would give an azide peptide, which carries an electrophilic side chain which is then used the method of this invention to another peptide or protein could be ligated which carries a phosphinothioester group.

Aminosäuren, die durch das Verfahren dieser Erfindung ligiert werden können, schließen solche ein, welche durch ein spezielles Isotop angereichert sind, zum Beispiel ¹³C- oder ¹⁵N-angereicherte Aminosäuren. Isotopen angereicherte Aminosäuren, die eingesetzt werden können, umfassen gewöhnliche oder ungewöhnliche Aminosäuren, β-Aminosäuren und Aminosäuren mit elektrophilen Seitengruppen.Amino acids that can be ligated by the method of this invention include those that are enriched by a particular isotope, for example, ¹³ C- or ¹⁵ N-enriched amino acids. Isotopically enriched amino acids that can be used include common or unusual amino acids, β-amino acids, and amino acids with electrophilic pendant groups.

Gewöhnlich in Proteinen und Peptiden gefundene Aminosäuren sind L-Aminosäuren. Die Erfindung wird hingegen mit D-Aminosäuren sowie Peptiden und Proteinen, die D-Aminosäuren enthalten. Reagenzien, die R^A-Gruppen umfassen, können chiral nichtracemisch, racemisch oder achiral sein. Zur Synthese der gewünschten Peptide und/oder Proteine kann ein Reagenz mit geeigneter Chiralität einfach ausgewählt werden und solche sind bereits verfügbar. Reaktive funktionale Gruppen an R^A-Gruppen können mit geeigneten Schutzgruppen wie im Stand der Technik bekannt geschützt werden. Schutzgruppen umfassen unter anderem Acetylgruppen, Benzylgruppen und andere Schutzgruppen, einschließlich jener, die typischerweise im Stand-der-Technik-Verfahren oder Peptidsyntheseverfahren eingesetzt werden. Fachleute können eine Stand-der-Technik-Schutzgruppe zur Verwendung mit einer vorgegebenen funktionalen Gruppe und einem vorgegebenen Satz von Reaktionsbedingungen auswählen.Amino acids commonly found in proteins and peptides are L-amino acids. The invention, however, with D-amino acids and peptides and proteins containing D-amino acids. Reagents comprising R ^A groups may be chirally nonracemic, racemic or achiral. To synthesize the desired peptides and / or proteins, a reagent of suitable chirality can be readily selected and such are already available. Reactive functional groups on R ^A groups can be protected with suitable protecting groups as known in the art. Protecting groups include, but are not limited to, acetyl groups, benzyl groups, and other protecting groups, including those typically employed in the art-of-the-art or peptide synthesis methods. Those skilled in the art can select a prior art protecting group for use with a given functional group and set of reaction conditions.

Die Ligation, wie hierin beispielhaft veranschaulicht, kann verwendet werden, um ein Peptid oder ein Protein zu erzeugen. Peptide können, wie in Schema 5 veranschaulicht, synthetisiert werden durch wiederholte Zyklen von Ligation, um Amidbindungen zwischen Aminosäuren zu bilden. In einer spezifischen Ausführung kann Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren implementiert werden, in welchen die Aminosäure kovalent an einen festen Träger oder Harz geheftet ist. Eine Vielzahl von Harzen ist im Stand der Technik zur Verwendung in Kombination mit dem Ligationsverfahren dieser Erfindung verfügbar. Zum Beispiel Tentagel, PEGA oder andere Harze, die verträglich mit der Verwendung in sowohl organischen als auch wässrigen Lösungsmitteln sind, sind in Kombination mit den Ligationsverfahren dieser Erfindung verwendbar.The Ligation, as exemplified herein, may be used to produce a peptide or a protein. Peptides can, like in Scheme 5, are synthesized by repeated Cycles of ligation to bind amides between amino acids form. In a specific embodiment, peptide synthesis may occur under Use of solid phase methods can be implemented in which the amino acid covalently attached to a solid support or resin is stapled. A variety of resins is in the state of the art Technique for use in combination with the ligation method of this invention available. For example, Tentagel, PEGA or other resins that are compatible with of use in both organic and aqueous solvents are in Useful combination with the ligation methods of this invention.

Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann mit konventionellen Verfahren zum sequenziellen Zugeben von Aminosäuren kombiniert werden zu einer wachsenden Peptidkette an einem festen Träger oder Harz. Zum Beispiel kann konventionelle Fmoc-Chemie kombiniert werden mit einem oder mehreren Ligationsschritten, welche die Phosphinothioester- und Azidreagenzien dieser Erfindung einsetzen. In einem speziellen Beispiel können eine oder mehrere β-Aminosäuren oder eine oder mehrere Aminosäuren mit elektrophilen Seitengruppen in eine Peptidkette eingeführt werden, die durch konventionelle Verfahren (z.B. Fmoc-basierte Chemie) unter Verwendung des Ligationsverfahrens dieser Erfindung synthetisiert wird.The Ligation method of this invention can be carried out by conventional methods for sequentially adding amino acids to be combined growing peptide chain on a solid support or resin. For example Conventional Fmoc chemistry can be combined with one or several ligation steps, which the Phosphinothioester- and Use azide reagents of this invention. In a specific example can one or more β-amino acids or one or more amino acids with electrophilic side groups are introduced into a peptide chain, by conventional methods (e.g., Fmoc-based chemistry) Use of the ligation method of this invention synthesized becomes.

1 veranschaulicht einen exemplarischen Ansatz zum Proteinaufbau unter Einsatz des Ligationsverfahrens dieser Erfindung in Kombination mit Festzustandsver fahren. In diesem Ansatz wird zuerst Peptid 100 über seinen C-Terminus an ein Harz 101 über Thioesterverknüpfung angeheftet. Das erste Peptid wird an seinem N-Terminus mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt. Dieses erste Peptid kann zum Beispiel durch konventionelle Festzustandspeptidsyntheseverfahren synthetisiert werden, zum Beispiel Fmoc-Verfahren. Das gebundene erste Peptid (100) wird reagiert mit einem Phosphinothiolreagenz 102 wie 2 oder 20, welches N-terminales geschütztes Peptid von dem Harz als Phosphinothioester 104 freisetzt. 1 Figure 3 illustrates an exemplary approach to protein construction using the ligation method of this invention in combination with solid state methods. In this approach, first becomes peptide 100 via its C-terminus to a resin 101 attached via thioester linkage. The first peptide is protected at its N-terminus with a suitable protecting group. This first peptide can be synthesized, for example, by conventional solid state peptide synthesis methods, for example Fmoc methods. The bound first peptide ( 100 ) is reacted with a phosphinothiol reagent 102 as 2 or 20, which N-terminal protected peptide from the resin as a phosphinothioester 104 releases.

Ein zweites Peptid 105 wird an ein Harz 101' an seinem C-Terminus angeheftet und welches ein ungeschütztes NH₂ an seinem N-Terminus (nach Entschützen) hat, wird mit Azidsäure 106 reagiert, um ein harzgebundenes Peptid 107 mit einer Azidgruppe an seinem N-Terminus zu bilden. Das Azido-N-terminierte Peptid 107 wird dann mit ungebundenem N-terminal geschützten Phosphinothioester 104 reagiert, begleitet durch Hydrolyse und Verlust von Stickstoff, um eine Amidbindung zu bilden, welche die ersten und zweiten Peptide 108 ligiert. Das ligierte Peptid bleibt an das Harz geknüpft.A second peptide 105 gets to a resin 101 ' attached to its C-terminus and having an unprotected NH ₂ at its N-terminus (after deprotection) is treated with azidic acid 106 reacts to a resin-bound peptide 107 with an azide group at its N-terminus. The azido-N-terminated peptide 107 is then bound with unbound N-terminal phosphinothioester 104 accompanied by hydrolysis and loss of nitrogen to form an amide bond containing the first and second peptides 108 ligated. The ligated peptide remains attached to the resin.

Zusätzliche Zyklen von:
Entschützen des N-Terminus des ligierten Peptids 108;
Reagieren des entschützten Peptids mit einer Azidsäure, um ein harzgebundenes Peptid zu erzeugen mit einer Azidsäure an seinem N-Terminus 107; und
Reagieren des harzgebundenen Azidsäurepeptids mit Phosphinothioester 104 mit Hydrolyse und Stickstoffverlust, um harzgebundenes ligiertes Peptid 108 zu erzeugen,
Zugabe von Peptiden zu einer wachsenden Peptidkette. Die Zyklen werden fortgesetzt, bis das gewünschte größere Peptid oder Protein synthetisiert ist.Additional cycles of:
Deprotecting the N-terminus of the ligated peptide 108 ;
Reacting the deprotected peptide with an azidic acid to produce a resin-bound peptide with an azidic acid at its N-terminus 107 ; and
Reacting the resin-bound azide acid peptide with phosphinothioester 104 with hydrolysis and nitrogen loss to resin bound ligated peptide 108 to create,
Adding peptides to a growing peptide chain. The cycles are continued until the desired larger peptide or protein is synthesized.

In dem Ansatz von 1 werden reaktive (oder potenziell reaktive) Seitenketten oder Seitengruppen von Aminosäuren oder Peptiden, die zu ligieren sind, vor Reaktion unter Verwendung geeigneter Schutzgruppen geschützt. Nachdem das gewünschte größere Peptid oder Protein synthetisiert ist, werden die Seitenketten schützenden Gruppen entfernt (Entschützen) unter Verwendung konventioneller Verfahren und Reagenzien. Das größere Peptid oder Protein wird optional Bedingungen unterzogen, welche eine gewünschte Faltung erleichtern und das Peptid- oder Prote inprodukt wird optional von dem Harz abgespalten. Wohlgemerkt kann die Proteinfaltung auch nach Abspalten des Proteins von dem Harz vollbracht werden.In the approach of 1 For example, reactive (or potentially reactive) side chains or side groups of amino acids or peptides to be ligated are protected from reaction using suitable protecting groups. After the desired larger peptide or protein is synthesized, the side chains are deprotected (deprotected) using conventional methods and reagents. The larger peptide or protein is optionally subjected to conditions that facilitate a desired folding, and the peptide or protein product is optionally cleaved from the resin. Mind you, protein folding can be accomplished even after cleavage of the protein from the resin.

Peptide, die durch konventionelle Festzustandsverfahren gebildet werden, reichen in der Länge typischerweise von etwa 30 bis 50 Aminosäuren, so dass ein Protein von etwa 300 Aminosäuren Länge etwa 8 bis 10 Additionszyklen erfordern würde.peptides formed by conventional solid state processes, range in length typically from about 30 to 50 amino acids, making a protein of about 300 amino acids Length about Would require 8 to 10 addition cycles.

Peptidthioester können aus konventioneller Festphasenpeptidsynthese kommen (z.B., Fmoc-basierte Festphasensynthese) (Ingenito, R.; Bianchi, E.; Fattori, D.; Pessi, A. J Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369–11374; Shin, Y.; Winans, K. A.; Backes, B. J.; Kent, S. B. H.;Ellman, J. A. Bertozzi, C. R. J.Am. Chem. Soc.1999, 121, 11684–11689 ; Swinnen, D.; Hilvert, D. Org. Lett. 2000, 2, 2439–2442) oder rDNA-Technologie (Muir et al., 1998; Evans, Jr., et al., 1998; Ayers, et al., 2000; Holford et al., 1998; Cotton et al., 1999; Evans, Jr., 2000). Alternativ können Peptide aus natürlichen, z.B., als Proteinfragmente, oder durch Expression in rekombinanten Systemen erzeugt werden. Diese Peptide können derivatisiert werden zu Thioester unter Verwendung konventioneller Reagenzien und Verfahren. Peptide aus welcher Quelle auch immer können derivatisiert werden (an deren N-Terminus mit Azid, z.B. durch Reaktion der α-Aminogruppe eines geschützten Peptids mit CF₃SO₂N₃. (Zaloom, J.; Roberts, D. C. J.Org Chem. 1981, 46, 5173–5176). Azidgruppen können auch zu den Peptidaminogruppen durch konventionelle Reagenzien und Verfahren zugegeben werden.Peptide thioesters may come from conventional solid phase peptide synthesis (eg, Fmoc-based solid phase synthesis) (Ingenito, R .; Bianchi, E., Fattori, D., Pessi, A. J Am. Chem Soc, 1999, 121, 11369-11374, Shin Winans, KA; Backes, BJ; Kent, SBH; Ellman, JA Bertozzi, CRJ. Chem. Soc. 1999, 121, 11684-11689; Swinnen, D .; Hilvert, D. Org. Lett. 2, 2439-2442) or rDNA technology (Muir et al., 1998; Evans, Jr., et al., 1998; Ayers, et al., 2000; Holford et al., 1998; Cotton et al., 1999 Evans, Jr., 2000). Alternatively, peptides can be generated from natural, eg, as protein fragments, or by expression in recombinant systems. These peptides can be derivatized to thioesters using conventional reagents and methods. Peptides from whatever source can be derivatized (to their N-terminus with azide, eg, by reaction of the α-amino group of a protected peptide with CF ₃ SO ₂ N _3. (Zaloom, J., Roberts, DC Org Chem., 1981, 46 , 5173-5176.) Azide groups may also be added to the peptide amino groups by conventional reagents and procedures.

Feste Trägermaterialien, z.B. Harz, die zur Verwendung in organischen und wässrigen Lösungsmitteln geeignet sind, wie sie in den Ligationen dieser Erfindung eingesetzt werden, sind im Stand der Technik bekannt und ein Durchschnittsfachmann kann leicht Trägermaterialien auswählen, die kompatibel mit den Syntheseschritten sind, die auszuführen sind. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Safety-Catch-Verknüpfern an Harze zur Synthese von Peptiden, welche hiernach unter Verwendung von den Verfahren dieser Erfindung ligiert werden können. Native chemische Ligation ist unter Verwendung eines Safety-Catch-Verknüpfers umgesetzt worden. Siehe: Brik, A.; Keinan E.; Dawson, P. E.;J Org. Chem. 2000 (Jun) 16: 65 (12): 3829–3835. Schema 10 veranschaulicht die Peptidsynthese durch konventionel le Verfahren auf einem Safety-Catch-Harz und die Freisetzung des Peptids unter Verwendung eines Phosphinothiolreagenzes dieser Erfindung.firm Support materials e.g. Resin intended for use in organic and aqueous Solvents suitable are as used in the ligations of this invention, are known in the art and one of ordinary skill in the art can easily support materials choose, which are compatible with the synthetic steps to be performed. Of particular interest is the use of safety catch connectors Resins for the synthesis of peptides, which are hereinafter used of the methods of this invention can be ligated. native chemical ligation is implemented using a safety catch linker Service. See: Brik, A .; Keinan E .; Dawson, P.E., J Org. Chem. 2000 (Jun) 16: 65 (12): 3829-3835. Scheme 10 illustrates peptide synthesis by conventional le Procedure on a safety catch resin and the release of the peptide using a phosphinothiol reagent of this invention.

Der Durchschnittsfachmann kann leicht harzgebundene Peptide synthetisieren durch konventionelle Verfahren, die mit den Ligationsschritten dieser Erfindung verträglich sind. In einer spezifischen Ausführung kann das Peptid an das Harz zur Festphasensynthese über eine photolabile Verknüpfungsgruppe verknüpft werden. Eine solche Gruppe wird durch Bestrahlung bei einer geeigneten Wellenlänge abgespalten.Of the One of ordinary skill in the art can readily synthesize resin bound peptides by conventional methods, with the ligation steps of these Invention compatible are. In a specific execution can the peptide to the resin for solid phase synthesis via a photolabile linking group be linked. Such a group is cleaved by irradiation at a suitable wavelength.

Eine Vielzahl von Seitengruppen schützenden Gruppen, in dem Verfahren dieser Erfindung verwendbar sind, ist im Stand der Technik bekannt und können leicht für vorgegebene Reaktionsbedingungen ausgewählt werden. Verfahren zum Seitenkettenentschützen und Spaltung von Peptiden und Proteinen von Harzen ohne substantielle Schädigung der Produktpeptide oder -proteine sind im Stand der Technik bekannt. Azidsubstituierte Aminosäuren sind leicht aus kommerziellen Quellen oder aus Anwendung von Routineverfahren erhältlich, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.A variety of pendant protecting groups employable in the process of this invention are known in the art and can be readily selected for given reaction conditions. Methods for side-chain deprotection and cleavage of peptides and proteins of resins without substantial damage to the product peptides or proteins are known in the art. Azidsub Substituted amino acids are readily available from commercial sources or from routine procedures well known in the art.

Schema 10

Scheme 10

Reaktionspartner und Reagenzien, die in den Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden, sind leicht entweder aus kommerziellen Quellen verfügbar oder können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, mit Blick auf die Beschreibung hierin. Z.B. können Azidoglycoside (z.B. Azidomannose) und Azidonucleoside (z.B. AZT) durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Thioester verschiedener biologisch interessanter Moleküle sind auch leicht durch wohlbekannte Verfahren zugänglich. Phosphinothioester werden durch hier veranschaulichte Verfahren oder im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt und können insbesondere synthetisiert werden durch Transthioesterifizierungs- oder Kopplungsreaktionen. Exemplarische Verfahren sind in den Beispielen angegeben. Azidosäuren sind leicht zugänglich (Zaloom, J.; et al.,1981) und können bei Festphasensynthese (Meldal, M.; Juliano, M. A.; Jansson, A. M. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2531–2534) verwendet werden. Thioester zahlreicher biologisch interessanter Moleküle wie Sialinsäure oder bestimmte Lipide sind auch leicht durch bekannte Verfahren zugänglich.reactants and reagents used in the methods of this invention are easily available either from commercial sources or can be prepared using methods that are in the art are well known in the art, with a view to the description herein. For example, can azidoglycosides (e.g., azidomannose) and azidonucleosides (e.g., AZT) known to the art. Thioesters of various biologically interesting molecules are also readily accessible by well-known methods. Phosphinothioesters are exemplified by methods illustrated herein in the prior art known methods and in particular be synthesized by transthioesterification or coupling reactions. Exemplary methods are given in the examples. Azido acids are easily accessible (Zaloom, J., et al., 1981) and may in solid phase synthesis (Meldal, M., Juliano, M.A., Jansson, A. M. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 2531-2534). thioester numerous biologically interesting molecules such as sialic acid or certain lipids are also readily accessible by known methods.

Ligationsverfahren dieser Erfindung von diese Erfindung einsetzendem Phosphinothiol 20 sind insbesondere verwendbar, um die Proteinsynthese zu erleichtern.Ligation procedure this invention of phosphinothiol employing this invention In particular, they are useful to facilitate protein synthesis.

Ferner ist das Ligationsverfahren dieser Erfindung orthogonal zur nativen chemischen Ligation (sowie anderen effektiven Kopplungsstrategien, Tam, J. P.; Lu, Y. A.; Chuan-Fa, L.; Shao, J. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995, 92, 12485–12489; Tam, J. P.; Yu, Q.; Miao, Z. Biopolymers 2000, 51, 311–332), und erweitert daher die Proteinsynthesereichweite. Darüber hinaus können auch Kopplungsreaktionen an ungeschützten Peptiden in Gegenwart von H₂O durchgeführt werden.Further, the ligation method of this invention is orthogonal to native chemical ligation (as well as other effective coupling strategies, Tam, JP; Lu, YA; Chuan-Fa, L .; Shao, J. Proc. Natl. Acad Sci., USA 1995, 92, 12485) Tam, JP, Yu, Q., Miao, Z. Biopolymers 2000, 51, 311-332), and thus extends the protein synthesis range. In addition, coupling reactions to unprotected peptides may also occur be carried out in the presence of H ₂ O.

Schema 11 bildet die einfachsten Proteine ab, die durch native chemische Ligation allein, die Staudinger-Ligation allein, und eine sequentielle Kombination der beiden Verfahren zugänglich sind. Die Verwendung von Thiol- oder Azid-schützenden Gruppen kann die Vielseitigkeit dieser Verfahren noch weiter ausdehnen.scheme 11 replicates the simplest proteins by native chemical Ligation alone, the Staudinger ligation alone, and a sequential one Combination of the two methods are accessible. The usage of Thiol or azide protective Groups can extend the versatility of these methods even further.

Schema 11

Scheme 11

Das Ligationsverfahren dieser Erfindung kann auch allgemein verwendet werden, um natürliche Thioesterzwischenprodukte in biosynthetischen Stoffwechselwegen abzufangen. Eine Vielzahl von biosynthetischen Stoffwechselwegen verläuft über die Ausarbeitung von Thioesterzwischenprodukten. (Als neuere Übersichten, siehe: Katz, L, Chem. Rev. 1997, 97, 2557–2575; Khosla, C. Chem. Rev. 1997, 97, 2577–2590; Marahiel, M. A.; Stachelhaus, T.; Mootz, H. D. Chem. Rev. 1997, 97, 2651–2673; von Dohren, H; Keller, U.; Vater, J.; Zocher, R Chem. Rev. 1997, 97, 2675–2705; Cane, D. E.; Walsch, C. T.; Khosla, C. Science 1998,282,63–68; Konz, D.; Marahiel, M. A., Chem. Biol. 1999,6, R39–R48; Keating, T. A; Walsch, C. T., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999,. 3,598–606.)The Ligation method of this invention can also be used generally be natural Thioester intermediates in biosynthetic pathways intercept. A variety of biosynthetic pathways passes over the Preparation of thioester intermediates. (As newer overviews, see: Katz, L, Chem. Rev. 1997, 97, 2557-2575; Khosla, C. Chem. Rev. 1997, 97, 2577-2590; Marahiel, M.A .; Sting House, T .; Mootz, H.D. Chem. Rev. 1997, 97, 2651-2673; from Dohren, H; Keller, U .; Father, J .; Zocher, R. Chem. Rev. 1997, 97, 2675-2705; Cane, D.E .; Walsch, C.T .; Khosla, C. Science 1998, 28, 62, 63-68; Konz, D .; Marahiel, M.A., Chem. Biol. 1999, 6, R39-R48; Keating, T.A .; Walsch C.T., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999 ,. 3.598-606.)

Zum Beispiel verlaufen sowohl die Biosynthese von Polyketiden als auch die nicht ribosomale Biosynthese von Proteinen über Thioesterzwischenstufen. Die Einfügung dieser Zwischenstufen mit einem Phosphinothiol ermöglicht die Ligation eines Azids, die eine Amidbindung bildet. Die Ligation einer biosynthetischen Bibliothek von Thioestern mit einer chemischen Bibliothek von Aziden ist ein leichtes Mittel, um die molekulare Vielfalt zu vergrößern. Chemische Bibliotheken, die unter Verwendung des Ligationsverfahrens dieser Erfindung gebildet sind, können auf biologische Funktion durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren gescreent bzw. abgesucht werden.To the For example, both the biosynthesis of polyketides and. Run the non-ribosomal biosynthesis of proteins via thioester intermediates. The insertion This intermediate with a phosphinothiol allows the Ligation of an azide that forms an amide bond. The ligation a biosynthetic library of thioesters with a chemical Library of azides is an easy way to molecular diversity to enlarge. Dry Libraries using the ligation method of this Invention can be formed on biological function through a variety of in the art be screened or searched for known methods.

Wie in 1 beispielhaft dargestellt, können die Ligationsverfahren dieser Erfindung bei Festphasensynthese umgesetzt werden. Entweder die Thioester- oder Azidreaktionspartner in der Ligation kann eine feste Oberfläche oder Trägermaterial gebunden werden. Die Verwendung von Festphasenverfahren ist insbesondere für die Synthese von Peptiden durch wiederholte Zyklen der Ligation dieser Erfindung zuträglich. Die Verwendung von Festphasenverfahren ist auch zuträglich für die Ligation von zwei oder mehr Peptiden oder Proteinen, um längere Peptide oder Proteine zu bilden. Die Reaktion eines gebundenen Thioesters mit dem Phosphinothiolreagenz und ungebundenen Azid oder einem gebundenen Azid mit einem ungebundenen Thioester und dem Phosphinothiolreagenz wird zu einem gebundenen Ligationsprodukt führen. Konventionelle Verfahren zum Anheften verschiedener Spezies an eine feste Oberfläche oder Trägermaterial können verwendet werden, um entweder Thioesterreaktionspartner oder Azidreagenz an solche Materialien zu heften.As in 1 by way of example, the ligation methods of this invention can be reacted in solid phase synthesis. Either the thioester or azide reactants in the ligation can be bound to a solid surface or support material. The use of solid phase methods is particularly conducive to the synthesis of peptides by repeated cycles of the ligation of this invention. The use of solid phase methods also aids in the ligation of two or more peptides or proteins to form longer peptides or proteins. The reaction of a bound thioester with the phosphinothiol reagent and unbound azide or a bound azide with an unbound thioester and the phosphinothiol reagent will result in a bound ligation product. Conventional methods of attaching various species to a solid surface or support material can be used to attach either thioester reactant or azide reagent to such materials.

Die Ligation des Phosphinothiols und Azids dieser Erfindung wird vorzugsweise in einem gemischten organischen/wässrigen Lösungsmittel durchgeführt wie Gemische von THF und Wasser. Wasser nimmt an der Hydrolyse des Amidophosphoniumsalzes teil, um das gewünschte Amid zu bilden. THF oder ein anderes organisches Lösungsmittel (z.B. Methylenchlorid, DMF) wird eingefügt, um das Phosphinothiolreagenz oder die Reaktionspartner zu lösen. Die in dem Lösungsmittel vorliegende Wassermenge muss daher ausreichend sein, um die gewünschte Hydrolyse zu bewirken. Mit Phosphinothiolreagenzien, die ausreichend wasserlöslich sind, kann die Ligation im wässrigen Lösungsmittel durchgeführt werden.The Ligation of the phosphinothiol and azide of this invention is preferred in a mixed organic / aqueous solvent such as Mixtures of THF and water. Water increases in the hydrolysis of the amidophosphonium salt Part, to the desired To form amide. THF or another organic solvent (e.g., methylene chloride, DMF) is added to the phosphinothiol reagent or to dissolve the reactants. The in the solvent the amount of water present must therefore be sufficient to achieve the desired hydrolysis to effect. With phosphinothiol reagents that are sufficiently soluble in water, can the ligation in aqueous solvent carried out become.

Fachleute werden mit Blick auf die Beschreibung hierin wissen, dass die spezifischen Reaktionsbedingungen (z.B. Lösungsmittel, Reaktionstemperatur und Reaktionszeit), die zur Ligation eingesetzt werden, abhängig von spezifischen Reagenzien (z.B. Phosphinothiol), Reaktionspartnern und Produkten (z.B. Aminosäuren, Peptide oder Proteine) einer vorgegebenen Reaktion variieren können. Die Reaktionsbedingungen können leicht durch im Stand der Technik verstandene Verfahren optimiert werden.professionals With regard to the description herein, be aware that the specific Reaction conditions (e.g., solvent, Reaction temperature and reaction time) used for ligation become dependent specific reagents (e.g., phosphinothiol), reactants and products (e.g., amino acids, Peptides or proteins) of a given reaction. The Reaction conditions can easily optimized by methods understood in the art become.

Reaktionen, die Phosphinothiol 2 einsetzen, wurden gleichzeitig durch Ansäuern (mit HCl) vor Produktreinigung ausgeführt. Es wird vermutet, dass es nicht notwendig ist, Säure zum Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um das gewünschte Amidprodukt zu erhalten, wenigstens wenn Phosphinothiol 20 eingesetzt wird. Ansäuern des Rektionsgemisches kann hingegen Produktausbeuten beeinträchtigen. Hydrolyse kann auch in geeigneten Fällen durch Zugabe einer Base zum Reaktionsgemisch erleichtert werden.reactions the phosphinothiol 2 were used simultaneously by acidification (with HCl) before product purification. It is believed that it is not necessary to add acid to the reaction mixture the wished To obtain amide product, at least when phosphinothiol 20 used becomes. acidify the reaction mixture, however, may affect product yields. Hydrolysis may also be carried out in suitable cases by addition of a base be facilitated to the reaction mixture.

Produkte der Ligationsverfahren dieser Erfindung werden durch konventionelle Verfahren gereinigt, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Jedes einer großen Vielzahl von Verfahren zur Peptid- und Proteinreinigung kann in Kombination mit den Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden.Products The ligation methods of this invention are characterized by conventional Processes are well known in the art. Each one big Variety of methods for peptide and protein purification can be found in Combination with the methods of this invention.

Ein auf der Ligation von Thioestern und Aziden basierendes Verfahren ist eine wertvolle Quelle von Proteinen sowohl zur Grundlagenforschung als auch zur Medikamentauffindung. Verfahren dieser Erfindung können als ein verlässlicher Weg zu homogenen, korrekt gefalteten Proteinen mit hoher biologischer Aktivität verwendet werden. Der Anwender dieser Erfindung kann Werkzeuge von synthetischer und medizinischer Chemie verwenden, um Proteinreagenzien und Proteintherapeutika herzustellen und zu verbessern.One Ligation of thioesters and azides based method is a valuable source of both basic and basic proteins as well as for drug discovery. Methods of this invention can be used as a reliable one Way to homogeneous, correctly folded proteins with high biological Activity used become. The user of this invention may use synthetic tools and medical chemistry to use protein reagents and protein therapeutics produce and improve.

Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Erfindung weiter zu veranschaulichen und sind in keiner Weise vorgesehen, um die Erfindung zu begrenzen.The The following examples are provided to further extend the invention illustrate and are in no way intended to the invention to limit.

BEISPIELEEXAMPLES

Allgemein ExperimentellesGenerally Experimental

Chemikalien und Lösungsmittel wurden von Aldrich^® bezogen, mit Ausnahme von N-Methylmercaptoacetamid (Fluka^®), Bromacetylbromid (Acros^®), und Merrifield-Harze (Novabiochem^®). Verwendete Merrifield-Harze (Chlormethylpolystyrol-Divinylbenzol) waren 200–400 mesh (Substitution 0.63 mmol/g) und 70–90 mesh (1.26 mmol/g). Die Reaktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Whatman^® TLC Platten (AL SILG/UV) verfolgt und visualisiert durch UV oder I₂. NMR-Spektren wurden erhalten unter Verwendung von Bruker AC-300- oder Varian-UNITY500-Spectrometern. Phosphor-31-NMR-Spectren wurden protonen-entkoppelt und bezogen auf einen externen Standard von deuterierter Phosphorsäure. Massenspektren wurden erhalten unter Verwendung von Elektrosprayionisierungstechniken (ESI) am Biotechnology Center der University of Wisconsin.Chemicals and solvents were purchased from Aldrich ^®, with the exception of N-methylmercaptoacetamide (Fluka ^®), bromoacetyl bromide (Acros ^®) and Merrifield resin (Novabiochem ^®). Merrifield resins (chloromethylpolystyrene-divinylbenzene) used were 200-400 mesh (substitution 0.63 mmol / g) and 70-90 mesh (1.26 mmol / g). The reactions were followed by thin layer chromatography using Whatman ^® TLC plates (AL SilG / UV) and visualized by UV or I. ₂ NMR spectra were obtained using Bruker AC-300 or Varian UNITY500 spectrometers. Phosphor-31 NMR spectra were proton decoupled and based on an external standard of deuterated phosphoric acid. Mass spectra were obtained using electrospray ionization techniques (ESI) at the University of Wisconsin Biotechnology Center.

BEISPIEL 1:EXAMPLE 1:

Thioester 1 (worin R H oder Bn ist) (bezogen auf Schema 7)Thioester 1 (where R is H or Bn is) (referring to Scheme 7)

N-Acetylaminosäure (N-Acetylglycin oder N-Acetylphenylalanin) und ein Äquivalent N-Methylmercaptoacetamid (NMA) wurden in ein flammengetrocknetes Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre gegeben und gelöst in trockenem DMF (N,N-Dimethylformamid) zu einer Endkonzentration von 0.5–0.7 M. DCC (Dicyclohexylcarbodiimid, 1.1 Äquivalente) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10–12 h gerührt. Das Nebenprodukt DCU (Dicyclohexylharnstoff) wurde abfiltriert und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Die Produkte wurden umkristallisiert aus CH₂Cl₂ und Hexanen. Thioester 1 (R = H) wurde erhalten in einer 90%-Ausbeute und Thioester 1 (R = Bn wurde erhalten in einer 92%-Ausbeute. Thioester 1 (R= H). ¹H NMR (DMSO-d6, 1: 1,300 MHz) δ 8.62 (t, J=6 Hz, 1H), 8.05 (bs, 1H), 4.00 (d,J = 6 Hz, 2H), 3.56 (s, 2 H), 2.59 (d, J=4.5 Hz, 3H), 1.93 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (DMSO-d₆, 75 MHz) δ 197.95, 170.07, 167.13, 48.54, 31.81, 25.84, 22.26 ppm; MS(ESI) m/z 204.25 (M⁺ = 204.9, Fragmente bei 105.9, 100.0, 72.0). Thioester 1 (R=Bn). ¹H NMR (CDCl₃:CD₃OD, 1: 1,500 MHz) δ 7.30–7.27 (m, 2H), 7.24–7.19(m, 3H), 4.79 (dd, J=10,5 Hz, 1H), 3.57 (sichtbar 1, J=15 Hz, 2H), 3.24 (ABX, J-14,5 Hz, 1H), 2.91 (ABX, J=14, 10 Hz, 1 H), 2.76 (s, 3 H), 1.95 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1:1, 125 MHz) δ 200.26, 172.83, 169.92, 136.93, 129.47, 128.98, 127.40, 61.24, 37.73, 32.72, 26.72, 22.40 ppm; MS(ESI) m/z 294.37(MH⁺-295.0 Fragmente bei 190.0, 162.2, 120.2).N-acetylamino acid (N-acetylglycine or N-acetylphenylalanine) and one equivalent of N-methylmercaptoacetamide (NMA) were placed in a flame-dried reaction vessel under an argon atmosphere and dissolved in dry DMF (N, N-dimethylformamide) to a final concentration of 0.5-0.7M DCC (dicyclohexylcarbodiimide, 1.1 equivalents) was added and the mixture was stirred at room temperature for 10-12 h. The by-product DCU (dicyclohexylurea) was filtered off and solvent was removed under reduced pressure. The products were recrystallized from CH ₂ Cl ₂ and hexanes. Thioester 1 (R = H) was obtained in a 90% yield and thioester 1 (R = Bn was obtained in a 92% yield, thioester 1 (R = H), ¹ H NMR (DMSO-d6, 1: 1.300 MHz) δ 8.62 (t, J = 6Hz, 1H), 8.05 (bs, 1H), 4.00 (d, J = 6Hz, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.59 (d, J = 4.5Hz , 3H), 1.93 (s, 3H) ppm, ¹³ C NMR (DMSO-d ₆ , 75 MHz) δ 197.95, 170.07, 167.13, 48.54, 31.81, 25.84, 22.26 ppm, MS (ESI) m / z 204.25 (m ⁺ = 204.9, fragments at 105.9, 100.0, 72.0) thioester 1 (R = Bn) ¹ H NMR (CDCl _3:.. CD ₃ OD, 1: 1,500 MHz) δ 7:30 to 7:27 (m, 2H), 7:24 to 7:19 (m, 3H), 4.79 (dd, J = 10.5 Hz, 1H), 3.57 (Visible 1, J = 15 Hz, 2H), 3.24 (ABX, J-14.5 Hz, 1H), 2.91 (ABX , J = 14, 10 Hz, 1 H), 2.76 (s, s, 3H) ppm 3 H), 1.95 ⁽¹³ C NMR (CDCl _3: CD ₃ OD, 1: 1, 125 MHz) δ 200.26, 172.83 , 169.92, 136.93, 129.47, 128.98, 127.40, 61.24, 37.73, 32.72, 26.72, 22.40 ppm, MS (ESI) m / z 294.37 (MH ⁺ -295.0 fragments at 190.0, 162.2, 120.2).

2-Phosphinobenzothiol (2)2-Phosphinobenzothiol (2)

Verbindung 2 (wurde hergestellt durch das Verfahren von Block, E.; Ofori-Okai, G.; Zubieta, J., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,2327–2329 und NMR-Daten (¹H und ³¹P) korrelierten mit deren publizierten Daten. Zusatzspektraldaten: ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 137.71 (d, J=30Hz), 135.93 (d, J=8.75 Hz), 135.35 (d, J=9.75 Hz), 133.98, 133.83, 130.45, 129.25, 129.00, 128.67 (d, J-6.75 Hz), 125.92 ppm; MS (ESI) m/z 294.35(MH⁺-295.0).Compound 2 (was prepared by the method of Block, E. Ofori-Okai, G .; Zubieta, J., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 3227-2329, and NMR data ( ¹ H and ³¹ P) correlated with their published data Supplemental spectral data: ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 137.71 (d, J = 30 Hz), 135.93 (d, J = 8.75 Hz), 135.35 (d, J = 9.75 Hz), 133.98, 133.83, 130.45, 129.25, 129.00, 128.67 (d, J-6.75 Hz), 125.92 ppm, MS (ESI) m / z 294.35 (MH ⁺ -295.0).

Thioester 3 (R=H oder Bn)Thioester 3 (R = H or Bn)

Verfahren A (Transthioesterifizierung)Method A (Transthioesterification)

Verbindung 1 (1 Äquivalent) und Verbindung 2 (10 Äquivalente) wurden in ein flammengetrocknetes Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre beschickt und gelöst in trockenem DMF (0.25 M). Trockenes Argon wurde durch das Gemisch gesprudelt und Düsopropylethylamin (DIEA, 5 Äquivalente) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt für 12 h, nach welchen weitere 5 Äquivalente DIEA zugegeben wurden. Merrifield-Harz (Sowohl mit hoher als auch mit niedriger Beladungskapazität wurden zu verschiedenen Anlässen verwendet) mit einer hohen Beladungskapazität wurde wenigstens ein Äquivalent zur molaren Menge der Verbindung 2 zu dem Gemisch zugegeben, um überschüssiges Phosphinobenzothiol und N-Methylmercaptoacetamid zu entfernen. Dieses Gemisch wurde gerührt für weitere 12h unter Argon und das Harz wurde abfiltriert. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen und die unlöslichen DIEA-Salze wurden abfiltriert. Lösungsmittel wurde erneut entfernt und der Rückstand wurde in der nachfolgenden Kopplungsreaktion ohne weitere Reinigung verwendet. Die Reaktion verlief in quantitativer Ausbeute, wie durch TLC bewertet.Compound 1 (1 equivalent) and Compound 2 (10 equivalents) were charged to a flame-dried reaction vessel under an argon atmosphere and dissolved in dry DMF (0.25 M). Dry argon was bubbled through the mixture and diisopropylethylamine (DIEA, 5 equivalents) was added. The mixture was stirred for 12 h, after which an additional 5 equivalents of DIEA were added. Merrifield resin (both high and low loading capacities were used on different occasions) with a high loading capacity, at least one equivalent to the molar amount of compound 2 was added to the mixture to remove excess phosphinobenzothiol and N-methylmercaptoacetamide. This mixture was stirred for a further 12h under argon and the resin was filtered off. Solvent was removed under reduced pressure, the residue was taken up in CH ₂ Cl ₂ and the insoluble DIEA salts were filtered off. Solvent was again removed and the residue was used in the subsequent coupling reaction without further purification. The reaction proceeded in quantitative yield as assessed by TLC.

Verfahren B (DCC-Kopplung).Method B (DCC coupling).

Verbindung 1 (R= H oder R = Bn) (1 Äquivalent) und Verbindung 2 (1 Äquivalent) wurden zu einem flammengetrockneten Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre zugegeben. DCC (1.1 Äquivalente) wurde zugegeben und die Reaktion wurde für 12 h gerührt. Das DCU Nebenprodukt wurde abfiltriert und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Verbindungen 3 (R = H oder R =Bn) wurden durch Chromatographie gereinigt (Silicagel, Ethylacetat: Hexan 1:1, gefolgt von 100% Ethylacetat). Verbindung 3 (R = H) wurde erhalten in 61 % Ausbeute und Verbindung 3 (R = Bn) wurde erhalten in 52% Ausbeute. Thioester 3 (R=H). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.48 (ddd, J-5.5, 4, 1.5 Hz, 1H), 7.41 (td, J=7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.37–7.32 (m, 7H), 7.28–7.24 (m, 4H), 6.92 (ddd, J=7.5,3, 1.5 Hz, 1H), 5.86 (bs, 1H), 4.07 (d, J=6 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 194.83, 170.63, 144.04, 138.00, 136.68 (d, J=10.75 Hz), 134.84, 134.69, 130.95, 130.30, 129.68, 129.34 (d, J=6.88 Hz), 49.78, 23.69 ppm ; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 Hz) –9.91 ppm; MS(ESI) m/z 393.44 (MH⁺-394.2, Fragmente bei 295.2,225.2). Thioester 3 (R=Bn). ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.44 (ddd, J=7.5, 4, 1.5 Hz, 1H), 7.40 (td, J=7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.36–.31 (m, 7H), 7.28–7.21 (m, 7H), 7.12–7.10 (m, 2H), 6.89 (ddd, J=8,3, 1 Hz, 1H), 5.63 (d,J=13. 5 Hz, 1H), 4.92(m, 1H), 2.95 (ABX, J=14.5, 5.5 Hz, 1H), 2.64 (ABX, J-14,8 Hz, 1H), 1.91 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 197.47, 170.43, 137.94, 136.40, 134.83, 134.75, 134.67, 134.58, 130.79, 130.30, 129.94, 129.64 (d, J=5.9 Hz), 129.33, 127.77, 60.29, 38.24,23.79 ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 Hz) –10.33 ppm; MS(ESI) m/z 483.56(MH⁺-484.2, Fragment bei 295.2).Compound 1 (R = H or R = Bn) (1 equivalent) and Compound 2 (1 equivalent) were added to a flame-dried reaction vessel under an argon atmosphere. DCC (1.1 equivalents) was added and the reaction was stirred for 12 h. The DCU by-product was filtered off and solvent was removed under reduced pressure. Compounds 3 (R = H or R = Bn) were purified by chromatography (silica gel, ethyl acetate: hexane 1: 1, followed by 100% ethyl acetate). Compound 3 (R = H) was obtained in 61% yield and compound 3 (R = Bn) was obtained in 52% yield. Thioester 3 (R = H). ¹ H NMR (CDCl _3, 500 MHz) δ 7:48 (ddd, J-5.5, 4, 1.5 Hz, 1H), 7:41 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7:37 to 7:32 (m, 7H), 7.28-7.24 (m, 4H), 6.92 (ddd, J = 7.5.3, 1.5Hz, 1H), 5.86 (bs, 1H), 4.07 (d, J = 6Hz, 2H), 2.02 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 194.83, 170.63, 144.04, 138.00, 136.68 (d, J = 10.75 Hz), 134.84, 134.69, 130.95, 130.30, 129.68, 129.34 (d, J = 6.88 Hz), 49.78 , 23.69 ppm; ³¹ P NMR (CDCl ₃ , 202 Hz) -9.91 ppm; MS (ESI) m / z 393.44 (MH ⁺ -394.2, fragments at 295.2, 22525.2). Thioester 3 (R = Bn). ¹ H NMR (CDCl _3, 500 MHz) δ 7:44 (ddd, J = 7.5, 4, 1.5 Hz, 1H), 7:40 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7:36-.31 (m, 7H) , 7.28-7.21 (m, 7H), 7.12-7.10 (m, 2H), 6.89 (ddd, J = 8.3, 1 Hz, 1H), 5.63 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 4.92 (m, 1H), 2.95 (ABX, J = 14.5, 5.5Hz, 1H), 2.64 (ABX, J-14.8Hz, 1H), 1.91 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 197.47, 170.43, 137.94, 136.40, 134.83, 134.75, 134.67, 134.58, 130.79, 130.30, 129.94, 129.64 (d, J = 5.9 Hz), 129.33, 127.77, 60.29, 38.24 , 23.79 ppm; ³¹ P NMR (CDCl ₃ , 202 Hz) -10.33 ppm; MS (ESI) m / z 483.56 (MH ⁺ -484.2, fragment at 295.2).

Azid 4Azide 4

Benzylamin (20.4 mL, 186 mmol) und Methylenchlorid (186 ml) wurden zu einem flammengetrockneten Reaktionsgefäß unter einer Argonatmosphäre zugegeben und die Lösung wurde auf 0°C in einem Eisbad gekühlt. Bromacetylbromid (8.1 ml, 93 mmol) wurde tropfenweise zu der Lösung zugegeben. Das HBr-Salz von Benzylamin fiel aus der Lösung fast unmittelbar aus. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 1 h gerührt. Das Benzylaminsalz wurde abfiltriert und die organische Phase wurde zweimal mit 2 N HCl (75 ml) gewaschen. Die organische Lage wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der resultierende weiße Festkörper wurde gelöst in THF (200 ml) und Wasser (50 ml). Natriumazid (30.3 g, 466 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde kräftig bei Rückfluss für 17 h gerührt. Die organische Lage wurde dann von der wässrigen Lage getrennt, wurde zweimal mit gesättigter Salzlösung (75 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert, und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Azid 6 wurde isoliert in 98% Ausbeute und wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Spektraldaten: 'H-NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.39–7.27 (m, 5H), 6.71 (bs, 1H), 4.47 (d, J=5.7 Hz), 4.00 (s, 2H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 166.66, 137.39, 128.43, 127.45, 127.35, 52.06, 43.08ppm ; MS(ESI) m/z 190.20 (MH⁺= 191.0, Fragment bei 91.2).Benzylamine (20.4 mL, 186 mmol) and methylene chloride (186 mL) were added to a flame-dried reaction vessel under an argon atmosphere and the solution was cooled to 0 ° C in an ice bath. Bromoacetyl bromide (8.1 mL, 93 mmol) was added dropwise to the solution. The HBr salt of benzylamine precipitated out of the solution almost immediately. The reaction was warmed to room temperature and stirred for 1 h. The benzylamine salt was filtered off and the organic phase was washed twice with 2N HCl (75 ml). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and solvent was removed under reduced pressure. The resulting white solid was dissolved in THF (200 ml) and water (50 ml). Sodium azide (30.3 g, 466 mmol) was added and the mixture was stirred vigorously at reflux for 17 h. The organic layer was then separated from the aqueous layer, washed twice with saturated brine (75 ml), dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and solvent removed under reduced pressure. Azide 6 was isolated in 98% yield and was used without further purification. Spectral data: 'H-NMR _(CDCl3, 300 MHz) δ 7:39 to 7:27 (m, 5H), 6.71 (bs, 1H), 4:47 (d, J = 5.7 Hz), 4.00 (s, 2H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 166.66, 137.39, 128.43, 127.45, 127.35, 52.06, 43.08ppm; MS (ESI) m / z 190.20 (MH ⁺ = 191.0, fragment at 91.2).

Amid 5 (R=H oder Bn)Amide 5 (R = H or Bn)

Thioester 3 (R= H oder Bn) (1 Äquivalent) und Azid 6 (1 Äquivalent) wurden gelöst in THF:H₂O (3:1) auf eine Konzentration von 0.2 M. Eine gelbe Farbe, vermutlich von freigesetztem Thiolat, bildete sich schnell. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12–16 h gerührt und wurde dann mit 2N HCl angesäuert bis die gelbe Farbe klar wurde. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und die Amidprodukte wurden von den Phosphinoxidnebenprodukten getrennt (auch spektral charakterisiert, Daten nicht gezeigt) durch Chromatographie (Silicagel, 2.5 – 10% Methanol in Methylenchlorid). Die Reinigung erforderte häufig mehrere Kolonnen. Die Ausbeuten für Amide 7 und 8 reichten von 15 bis 40%. Amid (5 R =H). ¹H NMR (CDCl₂ CD₃OD, 1: 1,500 MHz) δ 7.33–7.22 (M,5H), 4.41 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.86 (s, 2H), 2.01 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1:1, 125 MHz) δ 173.56, 171.52, 170.67, 138.83, 129.04, 218.02, 127.78, 43.70, 43.62, 43.16,22.45 ppm; MS(ESI) m/z 263.29 (MH⁺-264.0). Amid 5 (R =Bn). ¹H NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1:1,500 MHz) δ 7.327.19 (m, 10H), 4.48 (sichtbar t, J-7.5 Hz, 1H), 4.44 (d, J=15 Hz, 1H), 4.34 (d, J=14.5 Hz, 1H), 3.95 (d, J=16.5 Hz, 1H), 3.71 (d, J=16.5 Hz, 1H), 3.11 (dd, J=13.5,7 Hz, 1H), 2.94 (dd, J=14,8 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H) ppm ; ¹³C NMR (CDCl₃ CD₃OD, 1: 1, 125 MHz) δ 173.42, 172.81, 170.34, 138.61, 137.18, 129.55, 129.01, 128.93, 127.86, 127.68, 127.40, 56.12, 43.53, 43.18, 37.76, 22.36 ppm; MS (ESI) m/z 353.42 (MNa⁺=376.2,MH⁺=354.2 Fragmente bei 165.2, 120.2, 91.2).Thioester 3 (R = H or Bn) (1 equivalent) and azide 6 (1 equivalent) were dissolved in THF: H ₂ O (3: 1) to a concentration of 0.2 M. A yellow color, probably of released thiolate, formed fast. The mixture was stirred at room temperature for 12-16 h and was then acidified with 2N HCl until the yellow color became clear. Solvent was removed under reduced pressure and the amide products were separated (also spectrally characterized, data not shown) from the phosphine oxide byproducts by chromatography (silica gel, 2.5-10% methanol in methylene chloride). The cleaning often required several columns. The yields for amides 7 and 8 ranged from 15 to 40%. Amide (5 R = H). ¹ H NMR (CDCl ₂ CD ₃ OD, 1: 1.500 MHz) δ 7.33-7.22 (M, 5H), 4.41 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.86 (s, 2H), 2.01 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ : CD ₃ OD, 1: 1, 125 MHz) δ 173.56, 171.52, 170.67, 138.83, 129.04, 218.02, 127.78, 43.70, 43.62, 43.16,22.45 ppm; MS (ESI) m / z 263.29 (MH ⁺ -264.0). Amide 5 (R = Bn). ¹ H NMR (CDCl ₃ : CD ₃ OD, 1: 1.500 MHz) δ 7.327.19 (m, 10H), 4.48 (visible t, J-7.5 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 15 Hz, 1H) , 4.34 (d, J = 14.5 Hz, 1H), 3.95 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.71 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 13.5.7 Hz, 1H) , 2.94 (dd, J = 14.8 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ CD ₃ OD, 1: 1, 125 MHz) δ 173.42, 172.81, 170.34, 138.61, 137.18, 129.55, 129.01, 128.93, 127.86, 127.68, 127.40, 56.12, 43.53, 43.18, 37.76, 22.36 ppm ; MS (ESI) m / z 353.42 (MNa ⁺ = 376.2, MH ⁺ = 354.2 fragments at 165.2, 120.2, 91.2).

BEISPIEL 2:EXAMPLE 2

Phosphinoxid 24 (Bezogen auf Schema 9)Phosphine Oxide 24 (Referred on scheme 9)

Chlormethylphosphondichlorid 23 (20g, 120 mmol) wurde gelöst in frisch destilliertem THF (240 ml). Eine Lösung von Phenylmagnesiumbromid (1.0 M) in THF (240 mL, 240 mmol) wurde tropfenweise zugegeben über 1 h. Das resultierende Gemisch wurde bei Rückfluss für 24 h gerührt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von Wasser (20 ml) abgeschreckt und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen und wurde einmal mit Wasser (50 ml) und einmal mit Salzlösung (50 ml) gewaschen. Die organische Lage wurde über wasserfreiem MgSO₄(s) getrocknet und filtriert, und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde gereinigt durch Blitzchromatographie (flash chromatography) (Silicagel, 3% Methanol in Methylenchlorid). Phosphinoxid 24 wurde als eine weißer Festkörper in 63% Ausbeute isoliert. Spektraldaten 'H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.84–7.79 (m, 4H), 7.62-7.58 (m, 2H), 7.54– 7.50 (m, 4H), 4.05 (d, J=7 Hz, 2H) ppm ; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 132.60, 131.51 (d, J=9.6 Hz), 129.64 (d, J=103.9 Hz), 128.72 (d, J=11.6 Hz), 37.64 (d, J=71.9 Hz) ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 Hz) 28.46 ppm; MS(ESI) m/z 250.03 (MH⁺=251.0, M₂H⁺-501.2 Fragmente bei 173.0, 143.0, 91.0).Chloromethylphosphonic dichloride 23 (20 g, 120 mmol) was dissolved in freshly distilled THF (240 mL). A solution of phenylmagnesium bromide (1.0 M) in THF (240 mL, 240 mmol) was added dropwise over 1 h. The resulting mixture was stirred at reflux for 24 h. The reaction was then quenched by the addition of water (20 ml) and solvent was removed under reduced pressure. The residue was taken up in CH ₂ Cl ₂ and washed once with water (50 ml) and once with brine (50 ml). The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ (s) and filtered, and solvent was removed under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography (silica gel, 3% methanol in methylene chloride). Phosphine oxide 24 was isolated as a white solid in 63% yield. Spectral data 'H NMR _(CDCl3, 500 MHz) δ 7.84-7.79 (m, 4H), 7.62-7.58 (m, 2H), 7.54- 7:50 (m, 4H), 4:05 (d, J = 7 Hz, 2H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 132.60, 131.51 (d, J = 9.6 Hz), 129.64 (d, J = 103.9 Hz), 128.72 (d, J = 11.6 Hz), 37.64 (d, J = 71.9 Hz) ppm; ³¹ P NMR (CDCl _3, 202 Hz) 28.46 ppm; MS (ESI) m / z 250.03 (MH ⁺ = 251.0, M ₂ H ⁺ -501.2 fragments at 173.0, 143.0, 91.0).

Verbindung 25Connection 25

Phosphinoxid 24 (18.94 g, 75.6 mmol) wurde gelöst in THF (0.45 L). Thioessigsäure (34.3 mL, 480 mmol) wurde zugegeben, und die resultierende Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt. Ar(g) wurde durch das Reaktionsgemisch für 1 h gesprudelt. Düsopropylethylamin (83.6 mL, 480 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und das resultierende Gemisch wurde bei Rückfluss für 24 h gerührt. Eine weitere Portion Thioessigsäure wurde als ein oranges Öl isoliert, das beim Stehen bei Raumtemperatur fest wurde. (35.2 mL, 492 mmol) wurden dann zugegeben, gefolgt von Triethylamin (60.0 mL, 492 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss für weitere 24 h erhitzt, nach welchen Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt wurde in einer gut gelüfteten Haube (Gestank!). Das resultierende schwarze Öl wurde gelöst in Methylenchlorid (0.35 L), und diese Lösung wurde mit 2N HCl (0.15 L), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (0.15 L) und Salzlösung (0.15 L) gewaschen. Die organische Lage wurde über wasserfreiem MgSO₄(s) getrocknet und filtriert. Aktivkohle wurde zu dieser Lösung zugegeben, welche dann bei Rückfluss für 30 min gerührt wurde. Die Aktivkohle wurde entfernt durch Filtration, Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatography) gereinigt (Silicagel, 70 % Ethylacetat in Hexanen). Die gesammelten Fraktionen wurden gelöst in Methylenchlorid (0.30 L), und die Aktivkohlebehandlung wurde wiederholt. Bei Lösungsmittelentfernung wurde Thioacetat 25 als oranges Öl isoliert, das beim Stehen bei Raumtemperatur fest wurde. Die Ausbeute für diese Reaktion war 85%. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.80–7.75 (m, 4H), 7.56–7.52 (m, 2H), 7.49–7.46 (m, 4H), 3.77 (d, J=8 Hz, 2H), 2.25 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 192.82, 132.11, 131.05 (d, J= 102 Hz), 130.86 (d, J=9.75 Hz), 128.46 (d, J=12.63 Hz), 29.83, 27.12 (d, J=69.88 Hz) ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 MHz) δ 29.14 ppm; MS(ESI) m/z 290.05(MH⁺= 291.0, M²H⁺ = 581.2, Fragmente bei 249.2, 171.0, 125.0).Phosphine oxide 24 (18.94 g, 75.6 mmol) was dissolved in THF (0.45 L). Thioacetic acid (34.3 mL, 480 mmol) was added and the resulting solution was cooled in an ice bath. Ar (g) was bubbled through the reaction mixture for 1 h. Diisopropylethylamine (83.6 mL, 480 mmol) was added dropwise and the resulting mixture was stirred at reflux for 24 h. Another portion of thioacetic acid was isolated as an orange oil which solidified on standing at room temperature. (35.2 mL, 492 mmol) was then added, followed by triethylamine (60.0 mL, 492 mmol). The reaction mixture was heated at reflux for a further 24 h, after which solvent was removed under reduced pressure in a well ventilated hood (stench!). The resulting black oil was dissolved in methylene chloride (0.35 L) and this solution was washed with 2N HCl (0.15 L), saturated sodium bicarbonate solution (0.15 L) and brine (0.15 L). The organic layer was dried over anhydrous MgSO ₄ (s) and filtered. Activated carbon was added to this solution, which was then stirred at reflux for 30 minutes. The charcoal was removed by filtration, solvent was removed under reduced pressure, and the residue was purified by flash chromatography (silica gel, 70% ethyl acetate in hexanes). The collected fractions were dissolved in methylene chloride (0.30 L) and the charcoal treatment was repeated. Upon solvent removal, thioacetate 25 was isolated as an orange oil which solidified on standing at room temperature. The yield for this reaction was 85%. Spectral data: 'H NMR _(CDCl3, 500 MHz) δ 7.80-7.75 (m, 4H), 7:56 to 7:52 (m, 2H), 7:49 to 7:46 (m, 4H), 3.77 (d, J = 8 Hz, 2H ), 2.25 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 192.82, 132.11, 131.05 (d, J = 102 Hz), 130.86 (d, J = 9.75 Hz), 128.46 (d, J = 12.63 Hz), 29.83, 27.12 (i.e. , J = 69.88 Hz) ppm; ³¹ P NMR (CDCl _3, 202 MHz) δ 29.14 ppm; MS (ESI) m / z 290.05 (MH ⁺ = 291.0, M ² H ⁺ = 581.2, fragments at 249.2, 171.0, 125.0).

Phosphin 26Phosphine 26

Thioacetat 25 (18.65 g, 64.2 mmol) wurde gelöst in wasserfreiem Chloroform (160 ml). Zu dieser Lösung wurde Trichlorsilan (97mL, 963 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde unter Ar(g) für 72 h gerührt. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt (merke: überschüssiges Trichlorsilan in dem entfernten Lösungsmittel wurde durch langsame Zugabe von Natriumbicarbonatlösung in einer gut gelüfteten Haube abgeschreckt) und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 3% Methanol in Methylenchlorid). Phosphin 26 wurde als weißer Feststoff in 98% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: ¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.43–7.40 (m, 4H), 7.33–7.30 (m, 6H), 3.50 (d, J=4 Hz, 2H), 2.23 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 194.01, 136.42 (d,J=13.6 Hz), 132.28 (d, J=19.4 Hz), 128. 69, 128.11 (d, J=6.8 Hz), 29.83, 25.41 (d, J=23.4 Hz) ppm; ³¹P NMR (CDCl₃, 202 MHz) -15.11 ppm; MS(ESI) m/z 274.06(MH⁺= 275.0, Fragmente bei 233.0, 199.2, 121.2).Thioacetate 25 (18.65 g, 64.2 mmol) was dissolved in anhydrous chloroform (160 mL). To this solution was added trichlorosilane (97 mL, 963 mmol) and the mixture was stirred under Ar (g) for 72 h. Solvent was removed under reduced pressure (note: excess trichlorosilane in the removed solvent was quenched by slow addition of sodium bicarbonate solution in a well ventilated hood) and the residue was purified by flash chromatography (silica gel, 3% methanol in methylene chloride). Phosphine 26 was isolated as a white solid in 98% yield. Spectral data: ¹ H NMR (CDCl _3, 500 MHz) δ 7:43 to 7:40 (m, 4H), 7:33 to 7:30 (m, 6H), 3:50 (d, J = 4 Hz, 2H), 2.23 (s, 3H) ppm ; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 194.01, 136.42 (d, J = 13.6 Hz), 132.28 (d, J = 19.4 Hz), 128. 69, 128.11 (d, J = 6.8 Hz), 29.83, 25.41 (d, J = 23.4 Hz) ppm; ³¹ P NMR (CDCl ₃ , 202 MHz) -15.11 ppm; MS (ESI) m / z 274.06 (MH ⁺ = 275.0, fragments at 233.0, 199.2, 121.2).

(Diphenylphosphino)-Methanthiol (20)(Diphenylphosphino) -Methanthiol (20)

Phosphin 26 (17.27 g, 63.0 mmol) wurde gelöst in wasserfreiem Methanol (0.40 L), und Ar(g) wurde durch die Lösung für 1 h gesprudelt. Natriumhydroxid (5.04 g, 127 mmol) wurde dann zugegeben und das Gemisch wurde unter Argon für 2 h gerührt. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde gelöst in Methylenchlorid (0.30 L). Die resultierende Lösung wurde mit 2H HCl (2 × 0.10 L) und Salzlösung (0.10 L) gewaschen. Die organische Lage wurde über MgSO₄(s) getrocknet und filtriert und Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Aluminiumoxid, 25% Ethylacetat in Hexanen). (Diphenylphosphi no)Methanthiol 2 wurde als ein klares Öl in 74% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.41–7.38 (m, 4H), 7.33–7.26 (m, 6H), 3.02 (d, J=7.8 Hz, 2H), 1.38 (t, J=7.5 Hz, 1H) ppm13C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 132.54 (d, J=17.1 Hz), 128.86, 128.36, 128.14,20.60 (d, J=21.7 Hz) ppm ; 31P NMR (CDCl₃, 121 MHz) δ -7.94 ppm ; MS(ESI) m/z 232.05 (MH⁺-233.0, Fragmente bei 183.0, 155.0, 139.0, 91.2).Phosphine 26 (17.27 g, 63.0 mmol) was dissolved in anhydrous methanol (0.40 L) and Ar (g) was bubbled through the solution for 1 h. Sodium hydroxide (5.04 g, 127 mmol) was then added and the mixture was stirred under argon for 2 h. Solvent was removed under reduced pressure and the residue was dissolved in methylene chloride (0.30 L). The resulting solution was washed with 2H HCl (2 × 0.10 L) and brine (0.10 L). The organic layer was dried over MgSO ₄ (s) and filtered, and solvent was removed under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography (alumina, 25% ethyl acetate in hexanes). (Diphenylphosphino) Methanethiol 2 was isolated as a clear oil in 74% yield. Spectral data: 'H NMR (CDCl ₃ , 300 MHz) δ 7.41-7.38 (m, 4H), 7.33-7.26 (m, 6H), 3.02 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 1.38 (t, J = 7.5 Hz, 1H) ppm13C NMR (CDCl _3, 75 MHz) δ 132.54 (d, J = 17.1 Hz), 128.86, 128.36, 128.14,20.60 (d, J = 21.7 Hz) ppm; 31P NMR _(CDCl3, 121 MHz) δ -7.94 ppm; MS (ESI) m / z 232.05 (MH ⁺ -233.0, fragments at 183.0, 155.0, 139.0, 91.2).

AcPheCH2PPh2 (Tabelle 1)AcPheCH2PPh2 (Table 1)

Verfahren A (Transthioesterifizierung). Phosphinothiol 20 (500 mg, 2.2 mmol) wurde gelöst in trockenem THF (5ml). Die Lösung wurde deoxygeniert durch Sprudeln von Ar(g) für 0.5 h. Zu dieser Lösung wurde NaH (51.6 mg, 2.2 mmol) zugegeben. Das Gemisch bildete eine Suspension, welcher DMF (2 ml) zugegeben wurde, um jeglichen Niederschlag zu lösen. Der N-Methylmercaptoacetamidthioester (NMA) von N-Acetylphenylalanin (63 mg, 0.22 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde für 8 h gerührt. Unreagiertes Phosphinothiol 20 wurde entfernt durch Zusetzen von Merrifield-Harz (1.5 g, 1.26 mmol/g), Rühren für 6 h, und Entfernen des Harzes durch Filtration. Der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 50% Ethylacetat in Hexanen). AcPheSCH2PPh2 wurde als weißer Feststoff in 92% Ausbeute isoliert.method A (transthioesterification). Phosphinothiol 20 (500 mg, 2.2 mmol) was solved in dry THF (5ml). The solution was deoxygenated by bubbling Ar (g) for 0.5 h. NaH became this solution (51.6 mg, 2.2 mmol) was added. The mixture formed a suspension, which DMF (2 mL) was added to any precipitate to solve. The N-methylmercaptoacetamide thioester (NMA) of N-acetylphenylalanine (63 mg, 0.22 mmol) was added and the reaction mixture became for 8 h touched. Unreacted phosphinothiol 20 was removed by adding Merrifield resin (1.5 g, 1.26 mmol / g), stirring for 6 h, and removing the resin by filtration. The residue was purified by flash chromatography (Silica gel, 50% ethyl acetate in hexanes). AcPheSCH2PPh2 was called white Isolated solid in 92% yield.

Verfahren B (DCC Kopplung). Verbindung 20 (500 mg, 2.15 mmol) und N-Acetylphenylalanin (446 mg, 2.15 mmol) wurden in DMF (15 ml) unter Ar(g) gelöst. 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; 489 mg, 2.37 mmol) wurde dann zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Das 1,3-Dicyclohexylharnstoffnebenprodukt (CU) wurde entfernt durch Filtration, Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Chromatographie wie in Verfahren A gereinigt. AcPheSCH2PPh2 wurde als weißer Feststoff in 84% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.44–7.39 (m, 4H), 7.35–7.33 (m, 6H), 7.26–7.21 (m, 3H), 7.11–7.09 (m, 2H), 6.29 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.98–4.91(m, 1H), 3.57–3.44 (m, 2H), 3.09 (dd, J=14.1,5.4 Hz, 1H), 2.93 (dd, J=14.1,7.5 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ 198.901, 169.86, 135.50, 132.62 (d,J=19. 4 Hz), 129.11 (d, J-9.8 Hz) 128.79 (d, J=35.9 Hz), 128.50, 128.45, 126.99, 59.56, 37.99, 25.61 (d, J=24.4 Hz), 22.88 ppm ; ³¹P NMR (CDCl₃, 121 MHz) -44.55 ppm.Method B (DCC coupling). Compound 20 (500 mg, 2.15 mmol) and N-acetylphenylalanine (446 mg, 2.15 mmol) were dissolved in DMF (15 mL) under Ar (g). 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 489 mg, 2.37 mmol) was then added and the reaction mixture was stirred for 12 h at room temperature. The 1,3-dicyclohexylurea by-product (CU) was removed by filtration, solvent was removed under reduced pressure, and the residue was purified by chromatography as in Method A. AcPheSCH2PPh2 was isolated as a white solid in 84% yield. Spectral data: 'H NMR (CDCl ₃ , 300 MHz) δ 7.44-7.39 (m, 4H), 7.35-7.33 (m, 6H), 7.26-7.21 (m, 3H), 7.11-7.09 (m, 2H), 6.29 (d, J = 8.4Hz, 1H), 4.98-4.91 (m, 1H), 3.57-3.44 (m, 2H), 3.09 (dd, J = 14.1.5.4Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 14.1 , 7.5 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ 198.901, 169.86, 135.50, 132.62 (d, J = 19.4 Hz), 129.11 (d, J-9.8 Hz) 128.79 (d, J = 35.9 Hz), 128.50, 128.45, 126.99, 59.56, 37.99, 25.61 (d, J = 24.4 Hz), 22.88 ppm; ³¹ P NMR (CDCl ₃ , 121 MHz) -44.55 ppm.

AcGlyCH2PPh2 (Tabelle 1)AcGlyCH2PPh2 (Table 1)

Verfahren A. Phosphinothiol 20 (500 mg, 2.2 mmol) wurde gelöst in 5 mL trockenem THF. Die Lösung wurde deoxygeniert durch Sprudeln von Ar(g) für 0.5 h. Zu dieser Lösung wurde NaH (51.6 mg, 2.2 mmol) zugegeben. Das Gemisch bildete eine Suspension, zu welcher DMF (2 ml) zugegeben wurde, um jeglichen Niederschlag zu lösen. Der NMA-Thioester von N-Acetylglycin (44 mg, 0.22 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde für 8 h gerührt. Unreagiertes Phosphinothiol 20 wurde entfernt durch zugeben von Merrifield-Harz (1.5 g, 1.26 mmol/g), Rühren für 6 h, und Entfernen des Harzes durch Filtration. Der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 50% Ethylacetat in Hexanen). AcGlyCH₂PPh₂ wurde als weißer Feststoff in 91 % Ausbeute isoliert.Method A. Phosphinothiol 20 (500 mg, 2.2 mmol) was dissolved in 5 mL of dry THF. The solution was deoxygenated by bubbling Ar (g) for 0.5 h. To this solution was added NaH (51.6 mg, 2.2 mmol). The mixture formed a suspension to which DMF (2 ml) was added to dissolve any precipitate. The NMA thioester of N-acetylglycine (44 mg, 0.22 mmol) was added and the reaction mixture was stirred for 8 h. Unreacted phosphinothiol 20 was removed by adding Merrifield resin (1.5 g, 1.26 mmol / g), stirring for 6 h, and removing the resin by filtration. The residue was purified by flash chromatography (silica gel, 50% ethyl acetate in hexanes). AcGlyCH ₂ PPh ₂ was isolated as a white solid in 91% yield.

Verfahren B. Phosphinothiol 20 (100 mg, 0.43 mmol) und N-Acetylglycin (55 mg, 0.47 mmol) wurden gelöst in DMF (3ml) unter Ar(g). DCC (98 mg, 0.47 mmol) wurde zugegeben, und Das Gemisch wurde gerührt für 12 h bei Raumtemperatur. Das DCU-Nebenprodukt wurde entfernt durch Filtration, Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Chromatographie gereinigt wie in Verfahren A. AcGlyCH2PPh2 wurde als weißer Feststoff in 67% Ausbeute isoliert. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.46–7.39 (m, 4H), 7.38–7.36 (m, 6H), 6.44 (bs, 1H), 4.15 (d, J=5/7 Hz, 2H), 3.53 (d, J=3.6 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H) ppm; ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 196.13, 170.29, 136.45 (d, J=13. 6 Hz), 132.62 (d,J=19. 1 Hz), 129.17, 128.54 (d, J=6. 7 Hz), 48.98,25.29 (d, J-24.2 Hz), 22.84 ppm ; ³¹P NMR (CDCl₃, 121 MHz) δ -15.20 ppm; MS(ESI) m/z 331.08 (MH⁺-332.2, MK⁺-370.0).Method B. Phosphinothiol 20 (100 mg, 0.43 mmol) and N-acetylglycine (55 mg, 0.47 mmol) were dissolved in DMF (3 mL) under Ar (g). DCC (98 mg, 0.47 mmol) was added and the mixture was stirred for 12 h at room temperature. The DCU by-product was removed by filtration, solvent was removed under reduced pressure, and the residue was purified by chromatography as in Method A. AcGlyCH2PPh2 was isolated as a white solid in 67% yield. Spectral data: 'H NMR _(CDCl3, 300 MHz) δ 7:46 to 7:39 (m, 4H), 7:38 to 7:36 (m, 6H), 6:44 (bs, 1H), 4.15 (d, J = 5/7 Hz, 2H ), 3.53 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H) ppm; ¹³ C NMR (CDCl ₃ , 75 MHz) δ 196.13, 170.29, 136.45 (d, J = 13.6 Hz), 132.62 (d, J = 19.1 Hz), 129.17, 128.54 (d, J = 6.7 Hz), 48.98, 25.29 (d, J-24.2 Hz), 22.84 ppm; ³¹ P NMR (CDCl ₃ , 121 MHz) δ -15.20 ppm; MS (ESI) m / z 331.08 (MH ⁺ -332.2, MK ⁺ -370.0).

AcGlyNHBn (Table 1)AcGlyNHBn (Table 1)

Thioester AcSCH2PPh2 (271 mg, 0.99 mmol) und Azid N₂GlyNHBn (187 mg, 0.99 mmol) wurden gelöst in THF/H2O (3: 1,9.4ml), und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 h gerührt. Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie (flash chromatograpy) gereinigt (Silicagel, 5% Methanol in Methylenchlorid). AcGlyNHBn wurde als weißer Feststoff in 91 % Ausbeute erhalten. Spektraldaten: 'H NMR (CDCl₃ : CD₃OD, 1: 1,125 MHz) δ 171.76, 169.37, 137.49, 127.83, 126.77, 126.59,42.50, 42.09,21.32 ppm; MS (ESI) m/z 206.11(MH⁺-207.0).AcSCH2PPh2 thioester (271 mg, 0.99 mmol) and N azide GlyNHBn ₂ (187 mg, 0.99 mmol) were dissolved in THF / H2O (3: 1,9.4ml), and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. Solvent was removed under reduced pressure and the residue was purified by flash chromatography (silica gel, 5% methanol in methylene chloride). AcGlyNHBn was obtained as a white solid in 91% yield. Spectral data: 'H NMR (CDCl ₃ : CD ₃ OD, 1: 1.125 MHz) δ 171.76, 169.37, 137.49, 127.83, 126.77, 126.59, 42.50, 42.09, 21.32 ppm; MS (ESI) m / z 206.11 (MH ⁺ -207.0).

Experimental- und Spektralinformation für die anderen Amidprodukte und für die NMA-Thioester können in der unterstützenden Information von Nilsson, B. L.; Kiessling, L. L.; Raines, R. T., Org. Lett. 2000,2, 1939–1941 gefunden werden, welche vollständig als Bezugnahme hierin eingefügt ist.experimental and spectral information for the other amide products and for the NMA thioesters can in the supportive Information from Nilsson, B.L .; Kiessling, L. L .; Raines, R.T., Org. Lett. 2000,2, 1939-1941 which are found completely incorporated herein by reference is.

BEISPIEL 3: Synthese eines Peptidphosphinothioesters unter Verwendung eines Safety-Catch-HarzesEXAMPLE 3: Synthesis of a Peptidphosphinothioesters using a safety catch resin

Peptidsynthese und Aktivierung. 4-Sulfamylbutyryl-AM-Harz (Novabiochem 01-64-0152) wurde mit FmocGlyOH gemäß dem Verfahren von Backes und Ellman geladen (Backes, B. J.; Ellman, J. A.J. Org. Chem. 1999, 64, 2322–2330). Peptidkettenverlängerung mit Glu (tBu) und Cys (Trt) wurde unter Verwendung von Standard Py-BOP/HOBt-Kopplungsverfahren durchgeführt.peptide synthesis and activation. 4-sulfamylbutyryl AM resin (Novabiochem 01-64-0152) was mixed with FmocGlyOH according to the method by Backes and Ellman (Backes, B.J .; Ellman, J.A.J. Org. Chem. 1999, 64, 2322-2330). Peptide chain extension with Glu (tBu) and Cys (Trt) was prepared using standard Py-BOP / HOBt coupling procedure carried out.

Aktivierung des Harzes. Etwa 1 g Harz (0.477 mmol Peptid) wurde in CH₂Cl₂ für 1 h vorgeschwollen und dann abgetropft. Iodacetonitril (1.8 mL, 25 mmol), Düsopropyl-Ethylamin (DIPEA, 1.7 mL, 10 mmol), und 1-Methyl-2-Pyrrolidinon (NMP, 40 ml) wurden gemischt und filtriert durch ein Abschlussstück aus basischem Aluminiumoxid und anschließend auf das Harz zugegeben. Das Harz wurde durch Sprudeln von Ar(g) bei Raumtemperatur für 18 h geschüttelt. Das Harz wurde dann mit NMP(5 × 10 ml), DMF(5 × 10 ml), und CH₂Cl₂ (5 × 10 ml) gewaschen. Das Harz wurde dann unmittelbar in dem nachfolgenden Schritt verwendet.Activation of the resin. About 1 g of resin (0.477 mmol peptide) was vorwollen in CH ₂ Cl ₂ for 1 h and then drained. Iodoacetonitrile (1.8 mL, 25 mmol), diisopropyl-ethylamine (DIPEA, 1.7 mL, 10 mmol), and 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP, 40 mL) were mixed and filtered through a plug of basic alumina and then to Resin added. The resin was shaken by bubbling Ar (g) at room temperature for 18 h. The resin was then washed with NMP (5 x 10 mL), DMF (5 x 10 mL), and CH ₂ Cl ₂ (5 x 10 mL). The resin was then used immediately in the subsequent step.

Peptid-Phosphinothioesterfreisetzung aus dem Harz. (Diphenylphospino)-Methanthiol (0.88 g, 3.8 mmol) in 20 mL DMF wurden zugegeben zu dem aktivierten Safety-Catch-Harz. Das Gemisch wurde für 18 h durch Sprudeln von Ar(g) geschüttelt. Das Harz wurde dann filtriert und wurde mit DMF (5 × 10ml) und CH₂Cl₂ (5 × 10 ml) gewaschen. Das Eluat wurde gesammelt und Lösungsmittel wurde unter ver mindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie gereinigt (Silicagel, 30% EtOAc in Hexanen), um 285 mg (0.27 mmol) FmocCys (Trt)Glu (tBu) GlySCH₂PPh₂ als weißen Feststoff zu ergeben. Basierend auch einem Fmocbeladungsansatz für das aktivierte Peptid, stellt dies 57% Ausbeute des gewünschten Phosphinothioesterpeptids dar.Peptide phosphinothioester release from the resin. (Diphenylphosphino) -methanethiol (0.88 g, 3.8 mmol) in 20 mL of DMF was added to the activated Safety-Catch resin. The mixture was shaken for 18 h by bubbling Ar (g). The resin was then filtered and washed with DMF (5 x 10 mL) and CH ₂ Cl ₂ (5 x 10 mL). The eluate was collected and solvent was removed under reduced pressure. The residue was purified by chromatography (silica gel, 30% EtOAc in hexanes) to give 285 mg (0.27 mmol) FmocCys (Trt) Glu (tBu) GlySCH ₂ PPh ₂ as a white solid. Based also on an Fmoc loading approach for the activated peptide, this represents 57% yield of the desired phosphinothioester peptide.

Fachleute werden merken, dass Verfahren, Reagenzien, Reaktionspartner, Reaktionsbedingungen (z.B. Lösungsmittel, Temperatur, Reaktionszeit) und Reinigungsverfahren, die von den hier spezifisch offenbarten verschieden sind, in der Praxis dieser Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren eingesetzt werden können. Alle bekannte funktionellen Äquivalente von Verfahren, Reagenzien, Reaktionspartnern, Reaktionsbedingungen und Reinigungsverfahren, die hier in ihrer Gesamtheit spezifisch offenbart oder beschrieben sind, sind hier als Bezugnahme vollständig eingefügt wie wenn alle einzeln individuell als Bezugnahme eingefügt wären.professionals will note that methods, reagents, reactants, reaction conditions (e.g. Solvent, Temperature, reaction time) and purification procedures used by the specifically disclosed herein, in practice this Invention can be used without unreasonable experimentation. All known functional equivalents of procedures, reagents, reactants, reaction conditions and purification methods, which are specific here in their entirety are disclosed or described, are fully incorporated by reference herein as if individually individually inserted as references.

Claims (60)

Verfahren zum Ausbilden einer Amidbindung, welches einen Schritt des Reagierens eines Phosphinothioesters mit einem Azid, gefolgt von Hydrolyse kombinierter Reagenzien umfasst, um eine Amidbindung zu bilden.A method of forming an amide bond comprising a step of reacting a phosphinothioester with an azide, followed by hydrolysis of combined reagents to form an amide bond form. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphinothioester gebildet wird durch Reaktion eines aktivierten Carboxylsäurederivats mit einem Phosphinothiol.The method of claim 1, wherein the phosphinothioester is formed by reaction of an activated carboxylic acid derivative with a phosphinothiol. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktion ausgeführt wird in Gegenwart von genügend Wasser, um die Hydrolyse zu erleichtern.The method of claim 1, wherein the reaction is carried out in the presence of enough Water to facilitate hydrolysis. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reaktion in einem wässrigen organischen Medium ausgeführt wird.The method of claim 1 wherein the reaction is in an aqueous one organic medium is carried out. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Reaktion in einem Gemisch von THF und Wasser ausgeführt wird.The method of claim 4, wherein the reaction is in a mixture of THF and water is carried out. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Phosphinothiol o-(Diphenylphosphino)-Thiophenol ist.The method of claim 2, wherein the phosphinothiol o- (diphenylphosphino) thiophenol. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Phosphinothiol (Diphenylphosphino)-Methanthiol ist.The method of claim 2, wherein the phosphinothiol (Diphenylphosphino) -methanethiol. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Peptid gebildet wird.The method of claim 1, wherein a peptide is formed becomes. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Protein gebildet wird.The method of claim 1, wherein a protein is formed becomes. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphinothioester ein Phosphinothioester einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins ist.The method of claim 1, wherein the phosphinothioester a phosphinothioester of an amino acid, a peptide or a Protein is. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Azid ein Azid einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins ist.The method of claim 1, wherein the azide is an azide an amino acid, a peptide or a protein. Verfahren nach Anspruch 1, worin wenigstens einer, der Phosphothioester oder das Azid, ein Phosphinothioester oder ein Azid einer β-Aminosäure ist.Method according to claim 1, wherein at least one, the phosphothioester or the azide, a phosphinothioester or is an azide of a β-amino acid. Verfahren nach Anspruch 1, worin wenigstens einer, der Phosphinothioester oder das Azid, ein Phosphinothioester oder ein Azid von einer Aminosäure mit einer elektrophilen Seitengruppe ist.Method according to claim 1, wherein at least one, the phosphinothioester or the azide, a phosphinothioester or an azide of one amino acid with an electrophilic side group. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Phosphinothiol die Formel hat:

worin n und m 0 oder ganze Zahlen gleich 1–3, einschließlich, und n + m = 0 – 4, einschließlich, sind; die gestrichelte Linie anzeigt, dass die Doppelbindung vorliegen kann oder dass die Bindung Teil einer aromatischen Gruppe sein kann (R₄, R₆ und R₈ sind nicht vorliegend, wenn es eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen gibt oder die Bindung Teil eines aromatischen Rings ist, wie angezeigt); R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₈ unabhängig Gruppen sind, gewählt unter Wasserstoff-, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂ und worin R₁ und R₂ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe oder zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe.The method of claim 1, wherein the phosphinothiol has the formula:

wherein n and m are 0 or integers equal to 1-3, inclusive, and n + m = 0-4, inclusive; the dashed line indicates that the double bond may be present or that the bond may be part of an aromatic group (R ₄ , R ₆ and R ₈ are not present if there is a double bond between the carbons or the bond is part of an aromatic ring, as indicated); R ₁ and R ₂ independently selected groups are selected from aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups which are optionally substituted with halide, OH, OR, COH, COR, COOH, COOR or n (R ') ₂ groups, wherein R, independently of other R, is an aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group and each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group, R and R 'in turn may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ ; one or more non-adjacent CH ₂ groups in R ₁ and R ₂ may be replaced by O, S, CO, COO or CONR '; and R ₃ -R _{8 are} independently groups selected from hydrogen, aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups, which may be optionally substituted as listed above for R ₁ and R ₂ ; for R ₃ -R _8, one or more are not adjacent CH 2 groups may be replaced with O, S, CO, COO or CONR 'groups, wherein each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group which optionally is as above is substituted for R ₁ and R ₂ and wherein R ₁ and R _{2 may be} covalently bonded to form a cyclic group, including a bicyclic group or two or more R ₃ -R _{8 may be} covalently bonded to a cyclic group to including a bicyclic group. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Phosphinothiol die Formel hat:

worin R₁ und R₂, unabhängig Gruppen sind, gewählt aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂- Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₄ unabhängig Gruppen sind, gewählt unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂ und worin R₁ und R₂ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe oder zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent gebunden sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe.The method of claim 14, wherein the phosphinothiol has the formula:

wherein R ₁ and R _{2 are} independently groups selected from aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups which are optionally substituted with halide, OH, OR, COH, COR, COOH, COOR or n (R ') ₂ - groups, wherein R, independently of other R is an aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group and each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic In turn, R 'and R' may optionally be substituted for R ₁ and R ₂ as listed above; one or more non-adjacent CH ₂ groups in R ₁ and R ₂ may be replaced by O, S, CO, COO or CONR '; and R ₃ -R _{4 are} independently groups selected from hydrogen, aliphatic alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups which may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ , for R ₃ -R ₈ one or more non-adjacent ones CH ₂ groups may be replaced with O, S, CO, COO or CONR 'groups, wherein each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group which optionally is as above is substituted for R ₁ and R ₂ and wherein R ₁ and R _{2 may be} covalently bonded to form a cyclic group, including a bicyclic group or two or more R ₃ -R _{8 may be} covalently bonded to a cyclic group including a bicyclic group. Verfahren nach Anspruch 15, worin in dem Phosphinothiol R₃ und R₄ beide Wasserstoff und R₁ und R₂ gewählt sind aus der Gruppe einer Phenylgruppe oder einer substituierten Phenylgruppe.A process according to claim 15, wherein in the phosphinothiol R ₃ and R ₄ both hydrogen and R ₁ and R ₂ are selected from the group of a phenyl group or a substituted phenyl group. Verfahren nach Anspruch 15, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols n-Butylgruppen sind.The method of claim 15, wherein the R ₁ and R ₂ groups of the phosphinothiol are n-butyl groups. Verfahren nach Anspruch 14, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols Polyether sind.The method of claim 14, wherein the R ₁ and R ₂ groups of the phosphinothiol are polyethers. Verfahren nach Anspruch 18, worin wenigstens eine der R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols die Formel haben:

worin p 0 oder eine ganze Zahl reichend von 1 bis etwa 10, einschließlich, ist und R ein Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist.The method of claim 18, wherein at least one of the R ₁ and R ₂ groups of the phosphinothiol has the formula:

wherein p is 0 or an integer ranging from 1 to about 10, inclusive, and R is a hydrogen or an alkyl group. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Phosphinothiol die Formel hat:

worin n und m 0 oder 1 sind und X₁–X₄ Substituenten an der aromatischen Gruppe sind, von denen zwei kovalent verknüpft sein können, um einen alizyklischen oder aromatischen Ring zu bilden, X₁–X₄ aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halogenid, OH, OR, COR, COOH, COOR sein können, worin R eine aliphatische, alizyklische oder aromatische oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von dem anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, von denen alle optional substituiert sein können.The method of claim 14, wherein the phosphinothiol has the formula:

wherein n and m are 0 or 1 and X ₁ -X _{4 are} substituents on the aromatic group, two of which may be covalently linked to form an alicyclic or aromatic ring, X ₁ -X _{4 may be} aliphatic, alicyclic or aromatic groups may be or halide, OH, OR, COR, COOH, COOR, wherein R is an aliphatic, alicyclic or aromatic or N (R ') ₂ group, wherein each R' independently of the other R 'is a hydrogen, aliphatic alicyclic or aromatic group, all of which may optionally be substituted. Verfahren nach Anspruch 20, worin R₁ und R₂ Phenyl oder substituierte Phenylgruppen sind.The method of claim 20, wherein R ₁ and R _{2 are} phenyl or substituted phenyl groups. Verfahren nach Anspruch 21, worin R₁ und R₂ Phenylgruppen, substituiert mit Elektronendonorgruppen oder Elektronen-abziehenden Gruppen sind.The process of claim 21, wherein R ₁ and R _{2 are} phenyl groups substituted with electron donating groups or electron withdrawing groups. Verfahren zur Synthese eines Peptids oder Proteins, worin wenigstens eine der Amidbindungen des Peptids oder Proteins nach dem Verfahren von Anspruch 1 gebildet wird.Process for the synthesis of a peptide or protein, wherein at least one of the amide bonds of the peptide or protein is formed according to the method of claim 1. Verfahren nach Anspruch 23, worin zwei Peptide durch konventionelle Festphasensynthese durch Bildung de Amidbindung ligiert werden.The method of claim 23, wherein two peptides by Conventional solid-phase synthesis ligated by forming the amide bond become. Verfahren nach Anspruch 23, worin zwei Peptide oder Proteine durch rekombinante DNA-Expressionsverfahren durch Bildung der Amidbindung ligiert werden.The method of claim 23, wherein two peptides or Proteins by recombinant DNA expression methods by education the amide bond are ligated. Verfahren nach Anspruch 23, worin ein Peptid oder Protein durch konventionelle Festphasenverfahren an ein Peptid oder Protein ligiert werden, das durch rekombinante DNA-Expressionsverfahren gebildet ist, durch Bildung der Amidbindungen.The method of claim 23, wherein a peptide or Protein by conventional solid phase method to a peptide or Protein are ligated by recombinant DNA expression methods formed by formation of the amide bonds. Verfahren nach Anspruch 23, worin ein Peptid gebildet wird durch sequenzielle Reihen von Ligationen unter Ausbildung von Amidbindungen zwischen Aminosäuren.The method of claim 23, wherein a peptide is formed is prepared by sequential series of ligations to form Amide bonds between amino acids. Verfahren zum Markieren eines Peptids oder Proteins mit einem Reportermolekül, welches den Ligationsschritt von Anspruch 1 umfasst.Method for labeling a peptide or protein with a reporter molecule, which comprises the ligation step of claim 1. Phosphinothiolreagens mit der Formel:

worin n und m 0 oder ganze Zahlen gleich 1–3, einschließlich, und n + m = 0 – 4, einschließlich, sind; die gestrichelte Linie anzeigt, dass eine Doppelbindung vorliegen kann oder dass die Bindung Teil einer aromatischen Gruppe sein kann (R₄, R₆ und R₈ sind nicht vorliegend, wenn es eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffen gibt oder die Bindung Teil eines aromatischen Rings ist, wie angezeigt); R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, OH-, OR-, COH-, COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₈ unabhängig gewählt sind unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂, und zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent verknüpft sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe, außer, dass, wenn n und m beide 0 sind und R₃ und R₄ beide Wasserstoff sind, R₁ und R₂ keine Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sein können, und worin das Reagenz nicht O-(Diphenylphosphino)-Thiophenol ist.Phosphinothiol reagent having the formula:

wherein n and m are 0 or integers equal to 1-3, inclusive, and n + m = 0-4, inclusive; the dashed line indicates that a double bond may be present or that the bond may be part of an aromatic group (R ₄ , R ₆ and R ₈ are not present if there is a double bond between the carbons or the bond is part of an aromatic ring, as indicated); R ₁ and R ₂ independently selected groups are selected from aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups which are optionally substituted with halide, OH, OR, COH, COR, COOH, COOR or n (R ') ₂ groups, wherein R, independently of other R, is an aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group and each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group, R and R 'in turn may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ ; one or more non-adjacent CH ₂ groups in R ₁ and R ₂ may be replaced by O, S, CO, COO or CONR '; and R ₃ -R _{8 are} independently selected from hydrogen, aliphatic alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups, which may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ , where R ₃ -R _{8 is} one or more non-adjacent CH 2 groups. Groups may be replaced with O, S, CO, COO or CONR 'groups, wherein each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group which is optionally substituted as listed above for R ₁ and R ₂ , and two or more R ₃ -R _{8 may be} covalently linked to form a cyclic group, including a bicyclic group, except that when n and m are both 0 and R ₃ and R ₄ both are hydrogen, R ₁ and R _{2 can} not be phenyl groups or substituted phenyl groups, and wherein the reagent is not O- (diphenylphosphino) thiophenol. Reagens nach Anspruch 29, worin das Phosphinothiol die Formel hat:

worin: R₁ und R₂ unabhängig gewählte Gruppen sind aus aliphatischen, alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sind mit Halogenid-, ON-, OR-, COH- COR-, COOH-, COOR- oder n(R')₂-Gruppen, worin R, unabhängig von anderen R eine aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist und jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische, heteroalizyklische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist, R und R' im Gegenzug optional wie oben aufgelistet substituiert sein können für R₁ und R₂; in R₁ und R₂ eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen ersetzt sein können durch O, S, CO, COO oder CONR'; und R₃–R₄ unabhängig gewählt sind unter Wasserstoff, aliphatischen alizyklischen, heteroalizyklischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen, welche optional substituiert sein können wie oben aufgelistet für R₁ und R₂, bei R₃–R₈ eine oder mehrere nicht benachbarte CH2-Gruppen ersetzt sein können mit O-, S-, CO-, COO- oder CONR'-Gruppen, wobei jedes R' unabhängig von anderen R' eine Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, welche optional wie oben aufgelistet substituiert ist für R₁ und R₂, und R₁ und R₂ oder zwei oder mehr R₃–R₈ kovalent verknüpft sein können, um eine zyklische Gruppe zu bilden, einschließlich einer bizyklischen Gruppe, außer, dass, wenn R₃ und R₄ beide Wasserstoff sind, R₁ und R₂ keine Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sein können.A reagent according to claim 29, wherein the phosphinothiol has the formula:

in which: R ₁ and R _{2 are} independently selected groups from aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups which are optionally substituted by halide, ON, OR, COHCOR, COOH, COOR or n ( R ') ₂ groups, wherein R, independently of other R, is an aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group and each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic group In turn, R and R 'may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ ; one or more non-adjacent CH ₂ groups in R ₁ and R ₂ may be replaced by O, S, CO, COO or CONR '; and R ₃ -R _{4 are} independently selected from hydrogen, aliphatic alicyclic, heteroalicyclic, aromatic or heteroaromatic groups, which may optionally be substituted as listed above for R ₁ and R ₂ , where R ₃ -R ₈ one or more non-adjacent CH 2 Groups may be replaced with O, S, CO, COO or CONR 'groups, wherein each R' independently of other R 'is a hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group which is optionally substituted as listed above for R ₁ and R ₂ , and R ₁ and R ₂ or two or more R ₃ -R _{8 may be} covalently linked to form a cyclic group, including a bicyclic group, except that when R ₃ and R _{4 are} both Are hydrogen, R ₁ and R _{2 can} not be phenyl groups or substituted phenyl groups. Reagens nach Anspruch 30, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols n-Butylgruppen sind.A reagent according to claim 30, wherein the R ₁ and R ₂ groups of the phosphinothiol are n-butyl groups. Reagens nach Anspruch 29, worin die R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols Polyether sind.A reagent according to claim 29, wherein the R ₁ and R ₂ groups of the phosphinothiol are polyethers. Reagens nach Anspruch 29, worin wenigstens eine der R₁- und R₂-Gruppen des Phosphinothiols eine Einheit mit der folgenden Formel umfassen:

worin p 0 oder eine ganze Zahl ist, die von 1 bis etwa 10 reicht, einschließlich, und R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist.A reagent according to claim 29, wherein at least one of the R ₁ and R ₂ groups of the phosphinothiol comprises a unit having the formula:

wherein p is 0 or an integer ranging from 1 to about 10 inclusive, and R is hydrogen or an alkyl group. Reagens nach Anspruch 29, worin das Phosphinothiol die Formel hat:

worin n und m 0 oder 1 sind und X₁–X₄ Substituenten an der aromatischen Gruppe sind, von denen zwei kovalent verknüpft sein können, um einen alizyklischen oder aromatischen Ring zu bilden, X₁–X₄ aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppen sein können oder Halogenid, OH, OR, COR, COOH, COOR sein können, worin R eine aliphatische, alizyklische oder aromatische oder N(R')₂-Gruppe ist, worin jedes R' unabhängig von anderen R' ein Wasserstoff-, aliphatische, alizyklische oder aromatische Gruppe ist, von denen alle optional substituiert sein können, außer, dass, wenn n und m beide 0 sind, R₁ und R₂ nicht Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sein können.A reagent according to claim 29, wherein the phosphinothiol has the formula:

wherein n and m are 0 or 1 and X ₁ -X _{4 are} substituents on the aromatic group, two of which may be covalently linked to form an alicyclic or aromatic ring, X ₁ -X _{4 may be} aliphatic, alicyclic or aromatic groups may be or halide, OH, OR, COR, COOH, COOR, wherein R is an aliphatic, alicyclic or aromatic or N (R ') ₂ group, wherein each R' independently of other R 'is hydrogen, aliphatic, alicyclic or aromatic group, all of which may optionally be substituted, except that when n and m are both 0, R ₁ and R ₂ can not be phenyl groups or substituted phenyl groups. Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ Phenyl oder substituierte Phenylgruppen sind.A reagent according to claim 34, wherein R ₁ and R _{2 are} phenyl or substituted phenyl groups. Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ Phenylgruppen, substituiert mit Elektronendonorgruppen oder Elektronen-abziehenden Gruppen sind.A reagent according to claim 34, wherein R ₁ and R _{2 are} phenyl groups substituted with electron donating groups or electron withdrawing groups. Reagens nach Anspruch 34, worin n und um beide 0 sind.A reagent according to claim 34 wherein n and both are 0 are. Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ beide Wasserstoff sind.A reagent according to claim 34, wherein R ₁ and R _{2 are} both hydrogen. Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ beide Phenylgruppen sind.A reagent according to claim 34, wherein R ₁ and R _{2 are} both phenyl groups. Reagens nach Anspruch 34, worin R₁ und R₂ beide n-Butylgruppen sind.A reagent according to claim 34, wherein R ₁ and R _{2 are} both n-butyl groups. Reagens nach Anspruch 29, welches (Diphenylphosphino)-Methanthiol ist.A reagent according to claim 29 which is (diphenylphosphino) methanethiol is. Kit zum Ausbilden einer Amidbindung zwischen einem aktivierten Carboxylsäurederivat und einem Azid, welcher eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien von Anspruch 29 umfasst.Kit for forming an amide bond between one activated carboxylic acid derivative and an azide containing one or more phosphinothiol reagents of claim 29. Kit zur Synthese von Peptiden oder Proteinen, welcher eines oder mehrere Phosphinothiolreagenzien nach Anspruch 29 umfasst.Kit for the synthesis of peptides or proteins, which one or more phosphinothiol reagents according to claim 29. Kit nach Anspruch 43, welcher weiterhin eines oder mehrere Schutzreagenzien für Aminosäureseitenketten umfasst.The kit of claim 43, which further comprises one or more several protective reagents for Amino acid side chains includes. Kit nach Anspruch 43, welcher weiterhin ein Harz für Festphasensynthese umfasst.The kit of claim 43, which further comprises a resin for solid phase synthesis includes. Kit nach Anspruch 44, worin das Harz ein Safety-Catch-Harz ist.The kit of claim 44, wherein the resin is a safety-catching resin is. Kit nach Anspruch 44, der ein Reagens zum Erzeugen von Azidopeptiden umfasst.The kit of claim 44, which is a reagent for generating of azido peptides. Kit nach Anspruch 46, weiterhin umfassend ein Reagenz zum Erzeugen von Thioestern.The kit of claim 46, further comprising a reagent for producing thioesters. Kit nach Anspruch 43, weiterhin umfassend eines oder mehrere Lösungsmittel zum Durchführen der Ligation und optional Anweisungen zum Ausführen der Ligation enthaltend.The kit of claim 43, further comprising or more solvents to perform ligation and optional instructions for performing the ligation. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Phosphinothioester ein Phosphinothioester eines Lipids ist.The method of claim 1, wherein the phosphinothioester is a phosphinothioester of a lipid. Verfahren nach Anspruch 50, worin das Azid ein Azidopeptid oder ein Azidoprotein ist.The method of claim 50, wherein the azide is an azido-peptide or an azidoprotein. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Azid ein Nukleosidazid ist.The method of claim 1, wherein the azide is a nucleoside azide is. Verfahren nach Anspruch 52, worin der Phosphinothioester ein Phosphinothioester eines Peptids oder eines Azidoproteins ist.The method of claim 52, wherein the phosphinothioester a phosphinothioester of a peptide or an azidoprotein. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung ein Saccharid an ein Peptid ligiert.The method of claim 1, wherein the amide bond a saccharide is ligated to a peptide. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung ein Lipid an ein Peptid ligiert.The method of claim 1, wherein the amide bond a lipid is ligated to a peptide. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung ein Nukleosid an ein Peptid ligiert.The method of claim 1, wherein the amide bond a nucleoside is ligated to a peptide. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidbindung eine Nukleinsäure an ein Peptid ligiert.The method of claim 1, wherein the amide bond a nucleic acid ligated to a peptide. Reagens nach Anspruch 29 mit der Formel:

worin R₁ und R₂ aromatische oder heteroaromatische Gruppen sind, welche optional substituiert wie definiert in Anspruch 29 sind und R₃ und R₄ wie in Anspruch 29 definiert sind.A reagent according to claim 29 having the formula:

wherein R ₁ and R _{2 are} aromatic or heteroaromatic groups which are optionally substituted as defined in claim 29 and R ₃ and R ₄ are as defined in claim 29. Reagens nach Anspruch 58, worin R₃ und R₄ beide Wasserstoff sind.A reagent according to claim 58, wherein R ₃ and R _{4 are} both hydrogen. Reagens nach Anspruch 59, worin R₁ und R₂ Phenylgruppen oder substituierte Phenylgruppen sind.A reagent according to claim 59, wherein R ₁ and R _{2 are} phenyl groups or substituted phenyl groups.