DE60105977T2

DE60105977T2 - Auf lipiden basierende systeme zur arzneistoffabgabe

Info

Publication number: DE60105977T2
Application number: DE60105977T
Authority: DE
Inventors: Kent JÖRGENSEN; Jesper Davidsen; Charlotte Vermehren; Sven FRÖKJÄR; G. Ole MOURITSEN
Original assignee: Liplasome Pharma ApS
Current assignee: Liplasome Pharma ApS
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2021-02-10
Also published as: DE60105977D1; EP1484332A3; WO2001058910A3; AU3153301A; EP1484332A2; EP1254143B1; ES2230268T3; WO2001058910A2; CA2399821A1; PT1254143E; AU778659B2; JP2003522193A; ATE277935T1; EP1254143A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Lipid-basierte pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Behandlung verschiedener Störungen verwendet werden, z.B. bei Krebs, infektiösen und entzündlichen Zuständen etc., d.h., Störungen und Erkrankungen, die mit einem erhöhten Aktivitätsgrad extrazellulärer PLA₂ im erkrankten Gewebe verbunden sind oder daraus resultieren.
Hintergrund der Erfindung
Monoetherlysophospholipide und Alkylphosphocholine sind als wirksame Antikrebsmittel bekannt (siehe z.B. US 3 752 886 und spätere Zitate). Ein spezielles Beispiel eines gut untersuchten Monoetheralkylphosphocholins ist 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholin (EP 18-OCH₃).
Es wurden mehrere Mechanismen der toxischen Wirkung von Etherlipiden gegen Krebszellen vorgeschlagen, bei denen ein Mangel an Alkylspaltungsenzymen in Krebszellen vorliegt. Dies kann zu einer Anreicherung von Etherlipiden in den Zellmembranen führen, die Membrandefekte und möglicherweise anschließende Lyse induzieren. Zu den anderen möglichen Wirkungsmechanismen zählen die Wirkungen auf die Phosphorylierung intrazellulärer Proteine und Störungen des Lipid-Metabolismus. Normale Zellen besitzen typischerweise Alkylspaltungsenzyme, die es ihnen ermöglichen, die toxische Wirkung von Etherlipiden zu vermeiden. Einige normale Zellen, z.B. rote Blutzellen, verfügen ebenso wie Krebszellen über keine Mittel, die zerstörerische Wirkung von Etherlipiden zu vermeiden. Demgemäß ist bei der therapeutischen Anwendung von Etherlipiden ein wirksames Arzneimittelabgabesystem erforderlich, das die normalen Zellen vor den to xischen Wirkungen schützt und imstande ist, das Etherlipid zum erkrankten Gewebe zu bringen.
Lohmeyer und Workman (Brit. J. Cancer (1995) 72, 277–286) beschreiben die zytotoxische Wirkung von Arachidonoyl-PAF₁₆ in vitro.
US 5 827 836 offenbart Retinoyl-substituierte Glycerophosphoethanolamine. Es wird angegeben, daß die Verbindungen und deren Salze Wirkung gegen Tumoren, Psoriasis und Entzündungen aufweisen. Eine mögliche Klasse von Verbindungen hat einen Fettether-Substituenten in 1-Stellung, einen Retinoidester(Retinoyl)-Substituenten in 2-Stellung und einen Phosphoethanolamin-Substituenten in 3-Stellung. Es wird erwähnt, daß einige der Verbindungen in einer Liposom-Formulierung dargereicht werden können.
US 4 372 949 offenbart ein karzinostatisches und immunstimulierendes Mittel, das ein Lysophospholipid und ein Phospholipid enthält. Beispiele für Verbindungen sind 3-Phosphorylcholin mit einem C_5-22-Acyloxy- oder C_5- ₂₂-Alkoxy-Substituenten in 1-Stellung und einem Wasserstoff, Hydroxy-, C_1-5-Acyloxy- oder C_1-5-Alkoxy-Substituenten in 2-Stellung. Es wird erwähnt, daß die Mittel in Form von Mizellen oder Lipid-Vesikeln dispergiert werden können.
US 5 484 911 offenbart Nucleosid-5'-diphosphat-Konjugate von Etherlipiden, die antivirale Wirkung aufweisen. Die Verbindungen können einen Fettether/Thioether-Substituenten in sn-1-Stellung und einen Fettsäureester-Substituenten in sn-2-Stellung aufweisen. Die Verbindungen sind so ausgestaltet, daß sie die Zellmembran durchdringen, wonach das Nucleosid-Arzneimittel durch Spaltung durch intrazelluläre Phosphatasen freigesetzt wird. Des weiteren wird vorgeschlagen, daß die ebenfalls freigesetzten Etherlipide anschließend durch intrazelluläre Phospholipase A₂ gespalten werden könnten. Es wird vorgeschlagen, daß die Konjugate in Form von Mizellen dargereicht werden können, die leichter von Makrophagen aufgenommen werden können.
US 4 622 392 offenbart zytotoxische Verbindungen vom Nucleotid/Lipid-Konjugat-Typ.
ES 2 034 884 offenbart 2-Azaphospholipide als PLA₂-Hemmer. Auch de Haas et al. (Biochem. Biophys. Acta, Lipid and Lipids Metabolism, 1167 (1993), Nr. 3, S. 281–288) offenbaren die Hemmung von Pankreas-PLA₂ durch (R)-2-Acylaminophospholipid-Analoga.
Hoffman et al., Blood, Bd. 63, Nr. 3 (März), 1984, S. 545-552, offenbaren die Zytotoxizität von PAF und verwandten Alkylphospholipid-Analoga bei menschlichen Leukämie-Zellen.
WO 94/09014 offenbart Phosphorsäureester als PLA₂-Hemmer. Eine Gruppe der Hemmer sind 1-O-Phospho-2-O-(C_2-21-acyl)-(C_12-24-alkane).
Xia und Hui offenbaren die chemische Synthese einer Reihe von Etherphospholipiden von D-Mannit und deren Eigenschaften als tumorzytotoxische Mittel.
US 5 985 854 , US 6 077 837 , US 6 136 796 und US 6 166 089 beschreiben Prodrugs mit verbessertem Eindringen in Zellen, die besonders brauchbar sind zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen am Menschen, die mit supranormaler intrazellulärer Enzymaktivität in Zusammenhang stehen. Die Prodrugs können sn-2-Ester von Lysophospholipiden sein. Diese Arzneimittel sind so ausgestaltet, daß sie von intrazellulärer Phospholipase A₂ gespalten werden.
Auch angesichts der obigen Darstellung gibt es einen wachsenden Bedarf an neuen Arzneimittelabgabesystemen zur ge zielten Abgabe von Arzneimittelsubstanzen, mit denen Zustände wie etwa Krebs und Entzündungen behandelt oder gelindert werden können. Aufgrund der Tatsache, daß Arzneimittel zur Behandlung von Krebs ganz allgemein für Gewebe besonders schädlich sein können, ist es von besonderer Bedeutung, die Freisetzung der Arzneimittelsubstanz oder -substanzen an anderen Stellen als dem erkrankten Gewebe zu unterdrücken.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittelabgabesysteme, die besonders brauchbar sind zur Behandlung oder Linderung von Erkrankungen, die durch eine lokale Aktivität extrazellulärer PLA₂ gekennzeichnet sind.
Bei dem neuen, in dieser Anmeldung beschriebenen Prinzip für das Targeting liposomaler Arzneimittel durch extrazelluläre PLA₂ sind Lipid-basierte Prodrugs beteiligt, wie in 10 und 11 erläutert. In diesem Falle kann eine spezifische lipidanaloge Verbindung in das mit Polymer- oder Polysaccharid-Ketten "gepfropfte" Trägerliposom eingebracht werden und als Prodrug wirken, das durch Hydrolyse über extrazelluläre Phospholipase in ein aktives Arzneimittel verwandelt wird. Mögliche Beispiele könnten bestimmte Monoetherlipide sein, von denen gefunden wurde, daß sie Wirkung gegen Krebs aufweisen. werden die Monoetherlipide mit einer langen Fettsäurekette modifiziert, die in sn-2-Stellung esterverknüpft ist und daher durch extrazelluläre PLA₂ an der Zielstelle hydrolysiert werden kann, so fungieren diese modifizierten Monoetherlipide, die das Trägerliposom bilden, als Prodrugs. Schließlich sei darauf hingewiesen, daß bestimmte Arzneimittel wie das Antikrebsmittel Adriamycin (wovon Doxorubicin ein Derivat ist) selbst dafür bekannt sind, daß sie die Aktivität extrazellulärer PLA₂ durch Senkung des Calcium-Bedarfs des Enzyms stimulieren.
Das Prinzip von Arzneimittel-Targeting, Freisetzung und Resorption durch extrazelluläre Phospholipase A2 (PLA₂), das in 10 und 11 erläutert ist, kann auf einen Fall angewandt werden, wo ebenfalls Lipid-basierte Prodrugs beteiligt sind. In diesem Falle sind Lipid-Derivate Bestandteil des Trägerliposoms und fungieren als Prodrugs, die durch Hydrolyse über extrazelluläre PLA₂, die im erkrankten Zielgewebe in erhöhten Konzentrationen vorhanden ist, in aktive Arzneimittel (z.B. Etherlipide) verwandelt werden.
Ein spezielles Beispiel ist ein Prodrug eines bestimmten Monoetherlipids, das Wirkung gegen Krebs aufweist. Dies kann eine therapeutisch wirksame Verbindung sein (z.B. ein regulatorisches Fettsäure-Derivat), das in sn-2-Stellung mit dem Phospholipid esterverknüpft ist und daher das Lipid-Derivat zu einem Substrat für extrazelluläre PLA₂ macht. Werden die Monoetherlipide z.B. mit einem esterverknüpften Derivat in sn-2-Stellung modifiziert, so daß sie an der Zielstelle durch extrazelluläre PLA₂ hydrolysiert werden können, so fungieren diese das Trägerliposom bildenden Lipid-Derivate als Prodrugs, die an der Zielstelle durch die extrazelluläre PLA₂ hydrolysiert und in Arzneimittel verwandelt werden. Auf diese Weise werden therapeutisch wirksame Substanzen, z.B. Monoetherlipide und esterverknüpfte Derivate, an der gewünschten Zielstelle freigesetzt. Des weiteren kann das Hydrolyseprodukt als lokaler Permeabilitätsverstärker fungieren, der den Transport des erzeugten Antikrebsmittels in die Zelle erleichtert. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Lipid-basierte System enthalten, können therapeutisch eingesetzt werden, zum Beispiel bei der Behandlung von Krebs, infektiösen und entzündlichen Zuständen.
Die Erfindung macht ein solches Abgabesystem in Form von Lipid-basierten Trägern verfügbar, z.B. Liposomen oder Mizellen, zusammengesetzt aus Lipid-Doppelschichten bildenden Etherlipiden wie etwa Glycerophospholipiden, die eine Alkyl-Verknüpfung in 1-Stellung und eine Acyl-Verknüpfung in sn-2-Stellung am Glycerin-Gerüst enthalten und aufgepfropfte Polymer- oder Polysaccharid-Ketten aufweisen. Daneben kann das Trägersystem Komponenten enthalten, die Lipid-Doppelschichten stabilisieren, z.B. Lipopolymere, Glycolipide und Sterine, die zu längeren vaskulären Kreislaufzeiten und infolgedessen zu einer Anreicherung im erkrankten Zielgewebe führen. Sobald die Träger die Zielstelle der therapeutischen Wirkung erreichen, z.B. Krebszellen, so werden durch PLA₂-katalysierte Hydrolyse der Acyl-Verknüpfung die therapeutisch wirksamen Komponenten freigesetzt, typischerweise Lysoetherlipide und esterverknüpfte Derivate. Im Gegensatz zu Alkylspaltungsenzymen, die in Krebszellen so gut wie nicht vorhanden sind, ist die Aktivität extrazellulärer PLA₂ in Krebsgewebe erhöht. Die Aktivität der extrazellulären PLA₂ ist auch in erkrankten Regionen wie etwa entzündetem Gewebe erhöht.
Die vorliegende Erfindung macht somit ein Lipid-basiertes Arzneimittelabgabesystem zur Verabreichung eines Arzneimittelwirkstoffs verfügbar, der ausgewählt ist aus Lysolipid-Derivaten, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Prodrugs im Lipid-basierten System vorliegt, wobei das Prodrug ein Lipid-Derivat ist, das (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen und einen organischen Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen sowie (b) eine hydrophile Einheit aufweist, wobei das Prodrug zudem insoweit ein Substrat für extrazelluläre Phospholipase A2 ist, als der organische Rest hydrolytisch abgespalten werden kann, wohingegen die aliphatische Gruppe im wesentlichen nicht angegriffen wird, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei das System Lipopolymere oder Glycolipide enthält, so daß hydrophile Ketten an der Oberfläche des Systems vorliegen.
Somit wird bei der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise der überraschende Befund genutzt, daß Liposomen (und Mizellen), die Lipid-Derivate enthalten, die spezifisch und nur teilweise von extrazellulären Phospholipasen gespalten werden können, und die gleichzeitig Lipopolymere oder Glycolipide enthalten, die Eigenschaft aufweisen, daß sie hinreichend lange im Blutstrom zirkulieren, um so ein Zielgewebe zu erreichen, wo die Aktivität der extrazellulären PLA₂ erhöht ist, ohne daß sie vom retikuloendothelialen System des Säugers erkannt werden und ohne Zellwände zu durchdringen, wobei die Lipid-Derivate der Liposomen durch extrazelluläre PLA₂ spezifisch gespalten werden, um die therapeutisch wirksamen Bestandteile am gewünschten Ort freizusetzen.
Die vorliegende Erfindung macht auch eine Klasse neuartiger Lipid-Derivate verfügbar, die besonders brauchbar sind als Bestandteile der hierin beschriebenen Arzneimittelabgabesysteme.
Beschreibung der Zeichnungen
1. Wärmekapazitätskurven, erhalten mit Hilfe der Differentialscanningkalorimetrie. (a) Mehrschichtige (obere Kurve) MLV-Liposomen und einschichtige (untere Kurve) LW-Liposomen, hergestellt aus 1 mM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC). (b) MLV-Liposomen (obere Kurve) und LW-Liposomen (untere Kurve), hergestellt aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC).
2. Charakteristisches Reaktionszeitprofil der Hydrolyse von einschichtigen 1-O-DPPC-Liposomen, zusammengesetzt aus 90% 1-O-DPPC und 10% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) mit Phospholipase A2, PLA₂, (A. piscivorus piscivorus) bei 41°C. Die PLA₂-Hydrolysereaktion wird durch die Eigenfluoreszenz (durchgezogene Linie) des Enzyms und die statische 90°-Lichtstreuung (unterbrochene Linie) der Lipid-Suspension verfolgt. Nach Zugabe von PLA₂ zur äquilibrierten Liposomen-Suspension nach 800 s folgte eine charakteristische Verzögerungszeit, ehe eine abrupte Zunahme der katalytischen Aktivität eintrat. Die Proben für die HPLC wurden vor Zugabe des Enzyms und 20 Minuten nach der beobachteten Verzögerungszeit entnommen.
3. HPLC-Chromatogramme, die die Wirkung der Hydrolyse von Liposomen, zusammengesetzt aus 90% 1-O-DPPC und 10% 1-O-DPPE-PEG350, mit Phospholipase A2 veranschaulichen. Die Chromatogramme zeigen die Menge 1-O-DPPC (100, durchgezogene Linie) vor Zugabe der Phospholipase A2 (A. piscivorus piscivorus) zur Liposomen-Suspension und die Menge 1-O-DPPC (75%, unterbrochene Linie) nach dem Verzögerungsschub.
4. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein aus Liposomen, zusammengesetzt aus 25 μM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC), suspendiert in 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5), als Funktion der Zeit. 25 nM Phospholipase A2 (A. piscivorus piscivorus) wurden zur Zeit 900 s zugegeben, und die Temperatur war 37°C. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird bestimmt als % Freisetzung = 100 (I_F(t) – I_B) / (I_T – I_B), worin I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zur Zeit t nach Zugabe des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist und I_T die gesamte Fluoreszenz ist, gemessen nach Zugabe von Triton X-100, was zu vollständiger Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der Liposomen führt.
5. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein durch die Zielmembran nichthy drolysierbarer Membranen (siehe 11b) als Funktion der Zeit für Liposomen, zusammengesetzt aus 25 μM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC), suspendiert in 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5). 25 nM Phospholipase A2 wurden zur Zeit 0 s zugegeben, und die Temperatur war 37°C. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird wie in 4 bestimmt.
6. Hämolyse-Profil von normalen roten Blutzellen in Gegenwart von Liposomen, zusammengesetzt aus 100% 1-O-DPPC (Quadrate); 90% 1-O-DPPC und 10% 1-O-DPPE-PEG350 (Dreiecke); 90% 1-O-DPPC und 10% 1-O-DPPE-PEG2000 (Kreise) und ET-18-OCH₃ (Karos). Die Konzentrationen, die 5% Hämolyse ergeben (H₅) lagen deutlich oberhalb 2 mM für die aus 100% 1-O-DPPC zusammengesetzten Liposomen und die aus 90% 1-O-DPPC mit 10% DPPE-PEG350 zusammengesetzten Liposomen. Der Hämolysetest wurde durchgeführt wie beschrieben von Perkins et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1327, 61–68. Kurz umrissen wurde jede Probe mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in Reihen verdünnt, und 0,5 ml einer jeden verdünnten Suspension wurden mit 0,5 ml gewaschener menschlicher roter Blutzellen (RBC) gemischt [4% in PBS (Vol./Vol.)]. Probe und Standard wurden in einen Brutkasten bei 37°C gegeben und 20 Stunden gerührt. Die Röhrchen wurden 10 Minuten mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert (2000 × g), und 200 μl des Überstands wurden mit Hilfe der Extinktion bei 550 nm quantifiziert. 100 Prozent Hämolyse wurde definiert als maximaler Anteil Hämolyse, erhalten mit dem Detergens Triton X-100. Das Hämolyse-Profil in 6 zeigt einen niedrigen Hämolysewert (unter 5% Prozent) für 2 mM 1-O-DPPC-Liposomen und für Liposomen aus 1-O-DPPC mit 10% 1-O-DPPE-PEG350.
7. Charakteristisches Reaktionszeitprofil der Hydrolyse von einschichtigen Liposomen mit eingebrachten 0,5 und 10% 1-O-DPPE-PEG350-Lipopolymeren mit PLA₂, (A. piscivorus piscivorus) bei 41°C. Die PLA₂-Hydrolysereaktion wird durch die Eigenfluoreszenz (durchgezogene Linie) des Enzyms und die statische 90°-Lichtstreuung (unterbrochene Linie) der Lipid-Suspension verfolgt. Nach Zugabe von PLA₂ zur äquilibrierten Liposomen-Suspension folgte eine charakteristische Verzögerungszeit, ehe eine abrupte Zunahme der katalytischen Aktivität eintrat.
8. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein durch die Zielmembran nichthydrolysierbarer Membranen als Funktion der Zeit für Mizellen, zusammengesetzt aus 25 μM 1-O-DPPE-PEG350 (punktierte Linie), DSPE-PEG750 (unterbrochene Linie), 1-O-DPPE-PEG2000 (durchgezogene Linie), suspendiert in 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5). Phospholipase A2 (25 nM) wurde zur Zeit 1200 s zugegeben, und die Temperatur war 41°C. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird wie in 4 bestimmt. Die PLA₂-katalysierte Hydrolyse von 1-O-DPPE-PEG350 induzierte die schnellste und höchste Freisetzung.
9. HPLC-Chromatogramme, die die Wirkung der Hydrolyse von Mizellen, bestehend aus DSPE-PEG750 (0,150 mM), mit Phospholipase A2 veranschaulichen. Die Chromatogramme zeigen die Menge Stearinsäure (durchgezogene Linie), die vor der Zugabe von Phospholipase A2 (A. piscivorus piscivorus) zur Mizellen-Suspension erzeugt wurde, und die Menge DSPE-PEG750 (unterbrochene Linie) nach dem Verzögerungsschub. Die gepunktete Linie zeigt reine Stearinsäure (0,4 mM). Der Prozentanteil Hydrolyse wurde errechnet auf Grundlage der integrierten Fläche des Stearinsäure-Standards (115850 Einheiten) und der integrierten Fläche der Probe (45630 Einheiten). Die Konzentration an Stearinsäure in der Probe wurde zu (45630/115850·0,4 mM) 0,157 mM berechnet, und das heißt, daß 100% des DSPE-PEG750 zu Lyso-DSPE-PEG750 und Stearinsäure hydrolysiert wurden.
10 beschreibt das Prinzip der liposomalen Wirkstoff-Adressierung, Freisetzung und Resorption durch extrazelluläre Enzyme.

(I) Pathologisches Gewebe mit undichten Kapillaren
(II) Liposomaler Arzneimittelträger
(III) Zielzelle und Zellmembran
(IV) Lokale Arzneimittel-Freisetzung und Resorption durch extrazelluläre Phospholipase A2.

11(a). Schematische Darstellung des Prinzips der liposomalen Wirkstoff-Adressierung mit Anreicherung der liposomalen Arzneimittelträger in porösem erkranktem Gewebe und anschließender Freisetzung des Arzneimittels und Transport durch die Zielmembran über die Aktivität extrazellulärer PLA₂.

(I) Pathologisches Gewebe mit undichten Kapillaren
(II) Polymerstabilisiertes Prodrug-Liposom
(III) Zielzelle und Zellmembran
(IV) Prodrug (Monoetherlipid), Proenhancer (Lipid), Proaktivator (Lipid)
(V) Arzneimittel (Etherlysolipid und Fettsäure-Derivate), Enhancer (Lysolipid + Fettsäure), PLA₂-Aktivatoren (Lysolipid + Fettsäure)

(b)

₂

(I) Polymerstabilisiertes Trägerliposom
(II) Nichtabbaubare liposomale Zielmembran
(V) Enhancer (Lysolipid + Fettsäure), Arzneimittel (Etherlysolipid und Fettsäure-Derivate), PLA₂- Aktivatoren (Lysolipid + Fettsäure)

12(a) PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein durch die Zielmembran als Funktion der Zeit für verschiedene Zusammensetzungen der Trägerliposomen. Die Temperatur ist 37°C. Im Vergleich zu den nackten DPPC-Trägern ist die Geschwindigkeit der Freisetzung des Modell-Arzneimittels bei den polymerbeschichteten Trägern DPPC + 2,5 Mol-% DPPE-PEG2000 stark erhöht. Eine weitere Erhöhung der Freisetzungsgeschwindigkeit erhält man, wenn der Träger auch ein kurzkettiges Phospholipid, DCPC, enthält, das als lokaler Aktivator für das Enzym fungiert. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird bestimmt als % Freisetzung = 100 (I_F(t) – I_B)/(I_T – I_B), worin I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zur Zeit t nach Zugabe des Enzyms ist, I_H die Hintergrundfluoreszenz und I_T die gesamte Fluoreszenz ist, gemessen nach Zugabe von Triton X-100, was zu vollständiger Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der Ziel-Liposomen führt. (b) (a) PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein durch die Zielmembran als Funktion der Zeit bei verschiedenen Temperaturen. Bei Erhöhung der Temperatur erhöht sich die Freisetzungsgeschwindigkeit aufgrund der erhöhten Aktivität des Enzyms, die durch strukturelle Veränderungen im Lipid-Doppelschicht-Substrat des Trägerliposoms hervorgerufen wird. Beim vorliegenden Test wird in allen Fällen eine maximale Freisetzung von etwa 70% erreicht. Der Einschub zeigt die Zeit der 50%igen Calcein-Freisetzung, t_50%, als Funktion der Temperatur. Die Konzentration von Target- und Trägerliposomen beträgt 25 μM, und PLA₂ wird in einer Konzentration von 25 nM in HEPES-Puffer mit pH = 7,5 zugesetzt.
13. Gesamte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein durch die Zielmembran nach 20 min als Funktion der Zugabe steigender Mengen an Lysopalmitoylphospholipid und Palmitinsäure, die getrennt und als 1:1-Mischung zugegeben werden. Die Konzentration der Zielmem branen beträgt 25 μM in HEPES-Puffer mit pH = 7,5 bei einer Temperatur von 39°C.
14. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneimittels Calcein aus Liposomen, zusammengesetzt aus 25 μM 90 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und 10 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), suspendiert in 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5), als Funktion der Zeit. 50 nM (gerade Linie), 1 nM (durchgezogene Linie) und 0,02 nM (punktierte Linie) Phospholipase A2 (A. piscivorus piscivorus) wurden zur Zeit 300 s zugesetzt, und die Temperatur war 35,5°C. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird bestimmt wie in 4 beschrieben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eines der wichtigen Merkmale der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, daß bestimmte Lipid-Derivate durch extrazelluläre PLA₂ an extrazellulären Stellen in Säugergewebe in definierter Weise gespalten werden. Es wurde gefunden, daß extrazelluläre PLA₂ imstande ist, Monoether/Monoester-Lipidderivate zu spalten, um Monoetherlysolipid-Derivate zu ergeben, die als solche oder in Kombination mit anderen wirksamen Verbindungen eine therapeutische Wirkung zeigen.
Lipid-Derivate
Die Arzneimittelabgabesysteme der vorliegenden Erfindung (Liposomen oder Mizellen) beruhen somit auf einem Lipid-Derivat, das (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen und einen organischen Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen sowie (b) eine hydrophile Einheit aufweist, wobei das Prodrug zudem insoweit ein Substrat für extrazelluläre Phospholipase A2 ist, als der organische Rest hydrolytisch abgespalten werden kann, wohingegen die aliphatische Gruppe im wesentlichen nicht angegriffen wird, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei das System Lipopolymere oder Glycolipide enthält, so daß hydrophile Ketten an der Oberfläche des Systems vorliegen.
Auch wenn die Begriffe "Lipid" und "Lysolipid" (im Zusammenhang mit Phospholipiden) für den Fachmann wohlbekannte Begriffe sind, sollte doch betont werden, daß der Begriff "Lipid" bei der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen für Triester von Glycerin mit der folgenden Formel stehen soll:
worin R^A und R^B Fettsäure-Einheiten (C_9-30-Alkyl-/Alkylen-/Alkyldien-/Alkyltrien-/Alkyltetraen-C(=O)-) sind, und R^C eine Phosphatidsäure (PO₂-OH) oder ein Derivat einer Phosphatidsäure ist. Somit sind die Gruppen R^A und R^B über Ester-Bindungen an das Glycerin-Gerüst gebunden.
Der Begriff "Lysolipid" soll für ein Lipid stehen, bei dem die R^B-Fettsäuregruppe fehlt (z.B. hydrolytisch abgespalten ist), d.h., ein Glycerin-Derivat der obigen Formel, worin R^B Wasserstoff ist, aber die anderen Substituenten im wesentlichen unverändert bleiben. Die Überführung eines Lipids in ein Lysolipid kann unter Einwirkung eines Enzyms, insbesondere unter Einwirkung zellulärer sowie extrazellulärer PLA₂ vor sich gehen.
Die Begriffe "Lipid-Derivat" und "Lysolipid-Derivat" sollen mögliche Derivate der obigen möglichen Verbindungen innerhalb der Gruppen "Lipid" bzw. "Lysolipid" abdecken. Beispiele für biologisch wirksame Lipid-Derivate und Lysolipid-Derivate sind gegeben bei Houlihan et al., Med. Res. Rev. 15, 3, 157–223. Wie somit offensichtlich sein wird, sollte die Erweiterung "Derivat" im breitesten Sinn verstanden werden.
Bei der vorliegenden Anmeldung sollten jedoch die Lipid-Derivate und Lysolipide bestimmte funktionelle Kriterien (siehe oben) und/oder strukturelle Anforderungen erfüllen. Von besonderer Relevanz ist die Feststellung, daß geeignete Lipid-Derivate solche sind, die (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7, vorzugsweise wenigstens 9 Kohlenstoff-Atomen und einen organischen Rest mit wenigsten 7 Kohlenstoff-Atomen und (b) eine hydrophile Einheit aufweisen. Es sei klar, daß die aliphatische Gruppe und der organische Rest den beiden Fettsäure-Einheiten in einem normalen Lipid entsprechen und die hydrophile Einheit dem Phosphat-Teil eines (Phospho)lipids oder einem Bioisoster desselben entspricht.
Die allgemeine Vorstellung hinter der vorliegenden Erfindung ist die Nutzung des erhöhten Aktivitätsgrads extrazellulärer PLA₂ in lokalen Bereichen eines Säugerkörpers, insbesondere erkranktem Gewebe, und daher sollten die Lipid-Derivate, die bei der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, Substrate für extrazelluläre PLA₂ sein, d.h., die Lipid-Derivate sollten eine hydrolytische enzymatische Abspaltung des organischen Rests eingehen können, der der Fettsäure in 2-Stellung in einem Lipid entspricht. Extrazelluläre PLA₂ gehört bekanntlich zur Enzymklasse (EC) 3.1.1.4.. Wenn also die Rede von (extrazellulärer) PLA₂ ist, sind darunter alle extrazellulären Enzyme dieser Klasse zu verstehen, z.B. Lipasen, die hydrolytische Abspaltung des organischen Rests herbeiführen können, der der Fettsäure in 2-Stellung in einem Lipid entspricht. Ein besonderer Vorteil des Lipid-basierten Arzneimittelabgabesystems (als Liposomen und Mizellen) ist, daß im Vergleich zu monomeren Substraten die Aktivität der extrazellulären PLA₂ gegenüber organisierten Substraten signifikant erhöht ist.
In Anbetracht der Anforderung der Hydrolysierbarkeit durch extrazelluläre PLA₂ ist klar, daß der organische Rest (z.B. eine aliphatische Gruppe) vorzugsweise über eine Esterfunktionalität gebunden ist, die durch extrazelluläre PLA₂ gespalten werden kann, vorzugsweise in einer Weise, daß die abgespaltene Gruppe eine Carbonsäure ist.
Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist zudem, daß die aliphatische Gruppe (die Gruppe, die der Fettsäure in 1-Stellung in einem Lipid entspricht) des Lipid-Derivats, d.h., das Lysolipid-Derivat nach Spaltung durch extrazelluläre PLA₂, durch die Wirkung der extrazellulären PLA₂ im wesentlichen nicht angegriffen wird. Mit "im wesentlichen nicht angegriffen" ist gemeint, daß die Unversehrtheit der aliphatischen Gruppe erhalten bleibt, und daß weniger als 1 Mol-%, vorzugsweise weniger als 0,1 Mol-% der aliphatischen Gruppe (der aliphatischen Gruppe in 1-Stellung) durch die Wirkung der extrazellulären PLA₂ abgespalten wird.
Auch das Lysolipid-Derivat, das aus der hydrolytischen Abspaltung des organischen Rests resultiert, sollte selbst kein Substrat für Lysophospholipase sein. Lysophospholipase gehört bekanntlich zur Enzymklasse (EC) 3.1.1.5.. Wenn also die Rede von Lysophospholipase ist, sind darunter alle Enzyme dieser Klasse zu verstehen, die die Reaktion Lyso(phospho)lipid + Wasser unter Bildung von Phosphoglycerin + Fettsäure katalysieren. Der Begriff "kein Substrat für Lysophospholipase" soll bedeuten, daß Lysophospholipase ei ne Aktivität von weniger als 1% für das Substrat im Vergleich zum entsprechenden Esterlipid, d.h., praktisch keine enzymatische Aktivität aufweist.
Geeignete Beispiele für diese Lysolipid-Derivate sind solche, die keine hydrolytische Spaltung unter der Wirkung von Lysophospholipasen eingehen. Die Lysolipid-Derivate sind also insbesondere keine Lysolipide und Lysolipid-Derivate, die eine Esterverknüpfung in 1-Stellung des Lysolipids oder in der Stellung eines Lysolipid-Derivats aufweisen, die der 1-Stellung eines Lysolipids entspricht.
Eine bevorzugte Klasse von Lipid-Derivaten zum Einbringen in die erfindungsgemäßen Arzneimittelabgabesysteme läßt sich durch die folgende Formel darstellen:
worin X und Z unabhängig voneinander ausgewählt sind aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂, vorzugsweise O, NH, NMe und CH₂, insbesondere O;
Y -OC(O)- ist, wobei Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist, vorzugsweise über das Carbonyl-Kohlenstoffatom;
R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist;
R² ein organischer Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen ist, etwa eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7, vorzugsweise wenigstens 9 Kohlenstoff Atomen, vorzugsweise eine Gruppe der Formel Y¹Y²; worin Y¹ –(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9 ist und die Summe n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist, und n9 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; n2, n4, n6 und n8 jeweils unabhängig voneinander null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei Y¹-Y² jeweils unabhängig voneinander mit Halogen oder C_l-C₄-Alkyl substituiert sein kann, und Y¹-Y² jedoch vorzugsweise unsubstituiert ist;
R³ ausgewählt ist aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten von Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben (unter anderem Phosphatidsäure-Derivate, woran ein hydrophiles Polymer oder Polysaccharid covalent gebunden ist).
Wie vorstehend erwähnt, ist bei bevorzugten Ausführungsformen Y -OC(O)-, wobei Y über das Carboxyl-Atom an R² gebunden ist. Bei den besonders bevorzugten Ausführungsformen sind X und Z O, und Y ist -OC(O)-, wobei Y über das Carboxyl-Atom an R² gebunden ist. Dies bedeutet, daß das Lipid-Derivat eine Verbindung vom Typ 1-Monoether-2-monoesterphospholipid ist.
Eine weitere bevorzugte Gruppe von Lipid-Derivaten ist diejenige, bei der die Gruppe X S ist.
In einer Ausführungsform sind R¹ und R² aliphatische Gruppen der Formel Y¹Y², worin Y² CH₃ oder CO₂H ist, vorzugsweise jedoch CH₃, und worin Y¹ – (CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9 ist; die Summe n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine ganze Zahl von 9 bis 23 ist; das heißt, die aliphatische Gruppe Y¹Y² ist 10 bis 24 Kohlenstoff-Atome lang. n1 ist gleich null oder ist ein ganze Zahl von 1 bis 23; n3 ist gleich null oder ist eine ganze Zahl von 1 bis 20; n5 ist gleich null oder ist eine ganze Zahl von 1 bis 17; n7 ist gleich null oder ist eine ganze Zahl von 1 bis 14; n9 ist gleich null oder ist eine ganze Zahl von 1 bis 11; n2, n4, n6 und n8 sind jeweils unabhängig voneinander gleich null oder 1.
Obwohl die aliphatischen Gruppen ungesättigt und sogar mit Halogenen (Fluor, Chlor, Brom, Iod) und C_1-4-Gruppen substituiert sein können (d.h., es ergeben sich verzweigte aliphatische Gruppen), sind die aliphatischen Gruppen R¹ und R² in einer Ausführungsform vorzugsweise gesättigt und nicht verzweigt, das heißt, sie besitzen vorzugsweise keine Doppelbindung zwischen benachbarten Kohlenstoff-Atomen, wobei n2, n4, n6 und n8 dann jeweils gleich null sind. Demgemäß ist Y¹ vorzugsweise (CH₂)_n1. Besonders bevorzugt (in dieser Ausführungsform) sind R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander (CH_a)_n1CH₃ und ganz besonders bevorzugt (CH₂)₁₇CH₃ oder (CH₂)₁₅CH₃. In alternativen Ausführungsformen können die Gruppen eine oder mehrere Doppelbindungen besitzen, das heißt, sie können ungesättigt sein, und eines oder mehrere der n2, n4, n6 und n8 kann gleich 1 sein. Besitzt zum Beispiel der ungesättigte Kohlenwasserstoff eine Doppelbindung, so ist n2 gleich 1, n4, n6 und n8 sind jeweils gleich null, und Y¹ ist (CH₂)_n1CH=CH(CH₂)_n3. n1 ist gleich null oder ist eine ganze Zahl von 1 bis 21, und n3 ist ebenfalls null oder ist ein ganze Zahl von 1 bis 20, wobei wenigstens eines der n1 oder n3 nicht gleich null ist.
In einer speziellen Ausführungsform sind die Lipid-Derivate Monoetherlipide, wobei X und Z O sind, R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl-Gruppen (CH₂)_nCH₃, worin n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29, vorzugsweise 14, 15 oder 16 und insbesondere 14 ist; Y -OC(O)- ist, wobei Y dann über das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist.
Was die hydrophile Einheit anbelangt (oft als "Kopfgruppe" geläufig), die R³ entspricht, so geht man davon aus, daß eine Fülle von Gruppen verwendet werden können, die Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten von Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben entsprechen. Die entscheidende Anforderung an R³ ist offensichtlich, daß die Gruppen enzymatische Abspaltung der R²-Gruppe (tatsächlich R²-C(=O) oder R²-OH) durch extrazelluläre PLA₂ ermöglichen sollten. "Bioisostere zu Phosphatidsäure und Derivaten derselben" impliziert tatsächlich, daß solche Gruppen – als Phosphatidsäure – die enzymatische Spaltung durch extrazelluläre PLA₂ ermöglichen sollten.
R³ ist typischerweise ausgewählt aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Phosphatidylcholin (PO₂-O-CH₂CH₂N(CH₃)₃), Phosphatidylethanolamin (PO₂-O-CH₂CH₂NH₂), N-Methylphosphatidylethanolamin (PO₂-O-CH₂CH₂NHCH₃), Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit und Phosphatidylglycerin (PO₂-O-CH₂CHOHCH₂OH). Weitere mögliche Derivate von Phosphatidsäure sind solche, bei denen Dicarbonsäuren wie etwa Glutar-, Sebacin-, Bernstein- und Weinsäure an den endständigen Stickstoff von Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit etc. gebunden sind.
In der speziellen Ausführungsform, bei der ein Anteil des Lipid-Derivats auch ein Lipopolymer oder Glycolipid ist, ist typischerweise ein hydrophiles Polymer oder Polysaccharid covalent an den Phosphatidyl-Teil des Lipid-Derivats gebunden.
Hydrophile Polymere, die in geeigneter Weise in die erfindungsgemäßen Lipid-Derivate eingebracht werden können, um Lipopolymere zu bilden, sind solche, die leicht wasserlöslich sind, covalent an ein vesikelbildendes Lipid gebunden werden können und in vivo ohne toxische Wirkungen verträglich, d.h., biokompatibel sind. Zu den geeigneten Polymeren gehören Polyethylenglycol (PEG), Polymilchsäure (auch als Polylactid bezeichnet), Polyglycolsäure (auch als Polyglycolid bezeichnet), Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymer, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierte Cellulosen wie etwa Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulose.
Bevorzugte Polymere sind solche mit einem Molekulargewicht von etwa 100 Dalton bis zu etwa 10 000 Dalton, besonders bevorzugt etwa 300 Dalton bis etwa 5000 Dalton. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 5000 Dalton und besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 5000 Dalton. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglycol mit 750 Dalton (PEG(750)). Polymere lassen sich anhand der Anzahl von Monomeren in ihnen definieren; bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Polymere aus wenigstens etwa drei Monomeren eingesetzt, etwa PEG-Polymere, die aus drei Monomeren bestehen (etwa 150 Dalton).
Wird das Glycolipid oder Lipopolymer durch einen Anteil des Lipid-Derivats dargestellt, so bildet ein solches Lipid-Derivat (Lipid-Derivat mit einem Polymer oder einer Polysaccharid-Kette) typischerweise 1–80 Mol-%, etwa 2–50 Mol-% oder 3–25 Mol-% des gesamten dehydratisierten Lipidbasierten Systems. Bei Mizellen-Zusammensetzungen kann dieser Anteil sogar noch höher sein, etwa 1–100 Mol-%, z.B. 10–100 Mol-% des gesamten dehydratisierten Lipid-basierten Systems.
Bevorzugte Polymere, die covalent an den Phosphatidyl-Teil gebunden werden sollen (z.B. über den endständigen Stick stoff von Phosphatidylethanolamin), sind Polyethylenglycol (PEG), Polylactide, Polyglycolsäure, Polylactid-Polyglycolsäure-Copolymer und Polyvinylalkohol.
Ein überaus interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit der Modifikation der pharmazeutischen Wirkung des Lipid-Derivat durch Modifizieren der Gruppe R². Es sei klar, daß R² ein organischer Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen sein sollte (etwa eine aliphatische Gruppe mit einer bestimmten Länge (wenigstens 7, vorzugsweise 9 Kohlenstoff Atome)), wobei ein hoher Grad an Variabilität möglich ist, z.B. muß R² nicht notwendigerweise ein langer Kettenrest sein, sondern kann komplexere Strukturen darstellen.
Im allgemeinen geht man davon aus, daß R² entweder ziemlich inert für die Umgebung ist, in der es durch extrazelluläre PLA₂ freigesetzt werden kann, oder daß R² eine aktive pharmazeutische Rolle spielen kann, typischerweise als Hilfsarzneistoff oder als Wirksamkeitsmodifikator für das Lysolipid-Derivat und/oder etwaige andere (zweite) Arzneimittelsubstanzen, die in der Umgebung vorhanden sind.
Bei einigen Ausführungsformen ist die Gruppe R² ein langkettiger Rest, z.B. ein Fettsäurerest (zur Fettsäure gehört ein Carbonyl von der Gruppe Y). Dies wurde im obigen ausführlich beschrieben. Interessante Beispiele für Hilfsarzneistoffe als R² innerhalb dieser Untergruppen sind mehrfach ungesättigte Säuren, z.B. Oleat, Linolsäure, Linolensäure sowie Derivate von Arachidonoyl (mit dem Carbonyl von Y), z.B. Prostaglandine wie etwa Prostaglandin E₁, da Arachidonsäure-Derivate bekannte Regulatoren der Hormonwirkung sind, darunter die Wirkung von Prostaglandinen, Thromboxanen und Leukotrienen. Beispiele für Wirksamkeitsmodifikatoren als R² sind solche, die die Permeabilität der Zielzellmembran erhöhen, sowie die Aktivität der extrazellulären PLA₂ oder des Arzneimittelwirkstoffs oder etwaiger zweiter Arzneimittelsubstanzen erhöhen. Beispiele dafür sind kurzkettige (C_8-12) Fettsäuren.
Es wird jedoch auch in Betracht gezogen, daß andere Gruppen als organischer Rest R² brauchbar sein können, z.B. Vitamin D-Derivate, Steroid-Derivate, Retinoesäure (darunter alltrans-Retinoesäure, all-cis-Retinoesäure, 9-cis-Retinoesäure, 13-cis-Retinoesäure), Cholecalciferol- und Tocopherol-Analoga, pharmakologisch wirksame Carbonsäuren wie etwa verzweigtkettige aliphatische Carbonsäuren (z.B. Valproinsäure und die in WO 99/02485 beschriebenen), Salicylsäuren (z.B. Acetylsalicylsäure), Steroidcarbonsäuren (z.B. Lysergsäure und Isolysergsäure), monoheterocyclische Carbonsäuren (z.B. Nicotinsäure) und polyheterocyclische Carbonsäuren (z.B. Penicilline und Cephalosporine), Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen, 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure.
Es sei klar, daß die verschiedenen Beispiele für mögliche R²-Gruppen mit dem Namen einer diskreten Spezies und nicht mit dem Namen des Rests bezeichnet werden. Es sei außerdem klar, daß die möglichen Beispiele die Carbonyl-Gruppe oder die Oxy-Gruppe der Bindung enthalten können, über die der organische Rest an das Lipid-Gerüst gebunden ist (entsprechend "Y" in der obigen Formel). Dies wird dem Fachmann natürlich klar sein.
Obwohl es in der allgemeinen Formel der geeigneten Beispiele für die bei der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Lipid-Derivate nicht ausdrücklich angegeben ist, sei doch klar, daß die Glycol-Einheit der Lipid-Derivate substituiert sein kann, z.B. um die Spaltungsgeschwindigkeit durch die extrazelluläre PLA₂ zu verändern, oder einfach um die Eigenschaften der die Lipid-Derivate umfassenden Liposomen zu verändern.
Einige der vorstehend definierten Lipid-Derivate mögen bereits bekannt sein, doch wird angenommen, daß einige Untergruppen derselben völlig neue Verbindungen sind.
Eine spezielle Gruppe neuer Verbindungen sind die Lipid-Derivate der folgenden Formel:
worin
X und Z unabhängig voneinander ausgewählt sind aus O, CH₂, NH, NMe, S, S (O) und S(O)₂, vorzugsweise aus O, NH, NMe und CH₂, insbesondere O;
Y -OC(O)- ist, wobei Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist, vorzugsweise über das Carbonyl-Kohlenstoffatom;
R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist;
R² ein organischer Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen ist;
worin Y¹ – (CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9 ist und die Summe n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist, und n9 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; n2, n4, n6 und n8 jeweils unabhängig voneinander null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei Y¹-Y² jeweils unabhän gig voneinander mit Halogen oder C₁-C₄-Alkyl substituiert sein kann, und Y¹-Y² jedoch vorzugsweise unsubstituiert ist; R³ ausgewählt ist aus Derivaten von Phosphatidsäure, woran ein hydrophiles Polymer oder Polysaccharid gebunden ist. Das hydrophile Polymer oder Polysaccharid ist typischerweise und bevorzugt ausgewählt aus Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierten Cellulosen, insbesondere aus Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren und Polyvinylalkohol.
Besondere Untergruppen sind solche, worin X und Z O sind, R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl-Gruppen (CH₂)_nCH₃, worin n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29 ist, vorzugsweise 14 oder 16,; Y -OC(O)- ist, wobei Y dann über das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist.
Eine spezielle Gruppe von Verbindungen sind Polyethylen-oxid-1-O-palmityl-sn-2-palmitoylphosphatidylethanolamin, DPPE-PEG, und Polyethylenoxid-1-O-stearyl-sn-2-stearoylphosphatidylethanolamin, DSPE-PEG, mit einem PEG-Molekulargewicht von 100 bis 10 000 Dalton, insbesondere 300 bis 5000 Dalton.
Des weiteren macht die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung verfügbar, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein wie vorstehend definiertes Lipid-Derivat. Vorzugsweise ist das Lipid-Derivat in Form eines Liposoms dispergiert (siehe unten).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch derartige Lipid-Derivate zur Verwendung als Medikament, das vorzugsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegt, und die Verwendung eines wie vorstehend definierten Lipid-Derivats zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit einer lokalen Zunahme der Aktivität extrazellulärer Phospholipase A2 in Säugergewebe verbunden sind. Diese Erkrankungen oder Zustände sind typischerweise ausgewählt aus Krebs, z.B. Hirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs oder Eierstockkrebs, oder Leukämie, Lymphom, Sarkom, Karzinom und entzündlichen Zuständen. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verwendungen sind insbesondere in den Fällen anwendbar, wo die Zunahme der Aktivität extrazellulärer PLA₂ wenigstens 25% im Vergleich zum normalen Aktivitätsniveau im fraglichen Gewebe ist, wobei das Gewebe das eines Säugers und insbesondere das eines Menschen ist.
Lipid-Derivate als Prodrugs
Wie vorstehend beschrieben, macht die vorliegende Erfindung ein Lipid-basiertes Arzneimittelabgabesystem zur Verabreichung eines Arzneimittelwirkstoffs verfügbar, der ausgewählt ist aus Lysolipid-Derivaten, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Prodrugs im Lipid-basierten System vorliegt, wobei das Prodrug ein Lipid-Derivat ist, das (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen und einen organischen Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen sowie (b) eine hydrophile Einheit aufweist, wobei das Prodrug zudem insoweit ein Substrat für extrazelluläre Phospholipase A2 ist, als der organische Rest hydrolytisch abgespalten werden kann, wohingegen die aliphatische Gruppe im wesentlichen nicht angegriffen wird, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei das System Lipopolymere oder Glycolipide enthält, so daß hydrophile Ketten an der Oberfläche des Systems vorliegen.
Mit dem Begriff "Arzneimittelwirkstoff" ist jedes chemische Gebilde gemeint, das eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung im Körper eines Säugers und insbesondere eines Menschen ergibt. Somit betrifft die vorliegende Erfindung hauptsächlich das therapeutische Gebiet.
Der Begriff "Prodrug" sollte im normalen Sinne verstanden werden, nämlich als Arzneimittel, das zu dem Zweck maskiert oder geschützt wird, um in die beabsichtigte Arzneimittelsubstanz überführt zu werden (typischerweise durch Spaltung, aber auch durch chemische Umwandlung in vivo). Dem Fachmann ist der Umfang des Begriffs "Prodrug" bekannt.
Der Arzneimittelwirkstoff ist ausgewählt aus Lysolipid-Derivaten, und – wie aus der vorliegenden Beschreibung mit Patentansprüchen klar sein wird – die bei der vorliegenden Erfindung relevanten Lysolipid-Derivate haben eine therapeutische Wirkung, zumindest im Zusammenhang mit Erkrankungen und Zuständen, bei denen ein lokaler Bereich des Säugerkörpers ein Aktivitätsniveau der extrazellulären PLA₂ aufweist, das eine Freisetzung des Lysolipid-Derivats erlaubt.
Wie aus der vorliegenden Beschreibung mit Patentansprüchen klar sein wird, bildet das Lipid-Derivat das vorstehend bezeichnete Prodrug, und das Lysolipid-Derivat bildet somit den Arzneimittelwirkstoff – häufig ein Monoetherlysolipid-Derivat. Es sei jedoch klar, daß damit die Möglichkeit der Beigabe weiterer Arzneimittelsubstanzen, die als zweite Arzneimittelsubstanzen bezeichnet werden, zum erfindungsgemäßen Arzneimittelabgabesystem nicht ausgeschlossen ist, und es ist auch nicht ausgeschlossen, daß der organische Rest, der durch die Wirkung der extrazellulären PLA₂ hydro lytisch abgespalten werden kann, eine bestimmte pharmazeutische Wirkung aufweist (z.B. als Hilfsarzneistoff oder Wirksamkeitsmodifikator, wie anderswo hierin beschrieben). Zudem muß die pharmazeutische Wirkung des "Arzneimittelwirkstoffs", d.h., des Lysolipid-Derivats, nicht die am stärksten vorherrschende sein, wenn eine zweite Arzneimittelsubstanz beigegeben wird, und tatsächlich kann die Wirkung der zweiten Arzneimittelsubstanz sehr wohl die am stärksten vorherrschende sein.
Man nimmt an, daß die Freisetzung des Arzneimittelwirkstoffs (Lipolipid-Derivat) aus dem Prodrug (Lipid-Derivat) vor sich geht wie in folgendem Beispiel erläutert:
Des weiteren kann der Substituent R² einen Hilfsarzneistoff oder Wirksamkeitsmodifikator für den Arzneimittelwirkstoff bilden und wird unter der Wirkung der extrazellulären PLA₂ gleichzeitig freigesetzt:
Bei der Definition von R² wurde vorstehend beschrieben, wie die Gruppe R² verschiedene unabhängige oder synergistische Wirkungen in Verbindung mit dem Arzneimittelwirkstoff haben kann, z.B. als Hilfsarzneistoff oder Wirksamkeitsmodifikator, z.B. als Permeabilitäts- oder Zellysemodifikator. Man sollte sich im Gedächtnis halten, daß die R² entsprechenden Gruppen (z.B. R²-OH oder R²-COOH) eine pharmazeutische Wirkung aufweisen können, die gegenüber der Wirkung des Lysolipid-Derivats (Arzneimittelwirkstoff) die vorherrschende ist.
Als Liposomen und Mizellen formulierte Lipid-Derivate
Der Begriff "Lipid-basiertes Arzneimittelabgabesystem" soll makromolekulare Strukturen umfassen, die als Hauptbestandteil Lipide oder Lipid-Derivate enthalten. Geeignete Beispiele dafür sind Liposomen und Mizellen. Man nimmt gegenwärtig an, daß Liposomen den breitesten Umfang an Anwendungen bieten, und diese sollen im folgenden in aller Ausführlichkeit beschrieben werden. Zwar werden Liposomen gegenwärtig als das bevorzugte Lipid-basierte System angesehen, doch wird angenommen, daß auch Mizellensysteme interessante Ausführungsformen bei der vorliegenden Erfindung ergeben.
Bei einer wichtigen Variante, die mit Vorteil mit den hierin beschriebenen Ausführungsformen kombiniert werden kann, wird das Lipid-Derivat (z.B. das Prodrug) entweder als einziger Bestandteil oder – was üblicher ist – in Kombination mit anderen Bestandteilen (anderen Lipiden, Sterinen etc.) den Liposomen beigegeben. So sind die hierin beschriebenen Lipid-basierten Systeme vorzugsweise in Form von Liposomen, wobei die Liposomen aus Schichten aufgebaut sind, die das Lipid-Derivat (z.B. ein Prodrug) umfassen.
"Liposomen" sind bekannt als sich selbst organisierende Strukturen, umfassend eine oder mehrere Lipid-Doppelschichten, die jeweils ein wäßriges Kompartiment umgeben und zwei gegenüberliegende Monoschichten aus amphipathischen Lipid-Molekülen umfassen. Amphipathische Lipide (hierin u.a. Li pid-Derivate) umfassen eine polare (hydrophile) Kopfgruppenregion (entsprechend dem Substituenten R³ in den Lipid-Derivaten), die covalent an eine oder zwei unpolare (hydrophobe) aliphatische Gruppen (entsprechend R¹ und R² in den Lipid-Derivaten) gebunden ist. Von den energetisch ungünstigen Kontakten zwischen den hydrophoben Gruppen und dem wäßrigen Medium wird allgemein angenommen, daß sie die Lipid-Moleküle dazu veranlassen, sich so umzuordnen, daß die polaren Kopfgruppen zum wäßrigen Medium hin ausgerichtet sind, während die hydrophoben Gruppen sich zum Innern der Doppelschicht hin umorientieren. Es wird eine energetisch stabile Struktur gebildet, bei der die hydrophoben Gruppen wirksam gegen Kontakt mit dem wäßrigen Medium abgeschirmt werden.
Liposomen können eine einzige Lipid-Doppelschicht (einschichtige Liposomen "ULVs" oder mehrere Lipid-Doppelschichten aufweisen (mehrschichtige Liposomen, "MLVs"), und können mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden hergestellt werden (eine Übersicht findet sich zum Beispiel bei Deamer und Uster, Liposomes, Marcel Dekker, N.Y., 1983, 27–52). Zu diesen Methoden gehören die Verfahren von Bangham zur Herstellung mehrschichtiger Liposomen (MLVs), die Verfahren von Lenk, Fountain und Cullis zur Herstellung von MLVs mit im wesentlichen gleicher Verteilung des Gelösten zwischen den Schichten (siehe z.B. US 4 522 803 , US 4 588 578 , US 5 030 453 , US 5 169 637 und US 4 975 282 ) und das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren von Papahadjopoulos et al. ( US 4 235 871 ) zur Herstellung oligolamellarer Liposomen. ULVs können aus MLVs hergestellt werden mit Hilfe von Methoden wie z.B. Beschallung (siehe Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) oder Extrusion ( US 5 008 050 und US 5 059 421 ).
Die erfindungsgemäßen Liposomen können mit Hilfe der Verfahren irgendeiner dieser Offenbarungen hergestellt werden.
Verschiedene Arten der Methodik wie etwa Beschallung, Homogenisierung, French-Press-Anwendung und Mahlen können angewandt werden, um Liposomen geringerer Größe aus größeren Liposomen herzustellen. Die Extrusion (siehe US 5 008 050 ) kann angewandt werden, um Liposomen zu zerkleinern, das heißt, Liposomen mit einer vorbestimmten mittleren Größe herzustellen, indem die Liposomen unter Druck durch Filterporen einer definierten, ausgewählten Größe gedrückt werden. Auch die Tangentialstromfiltration (siehe WO 89/08846) kann angewandt werden, um die Größe der Liposomen zu regeln, das heißt, Liposomen mit einer Liposomen-Population zu erzeugen, die eine geringere Größenheterogenität und eine homogenere, definierte Größenverteilung aufweisen. Die Größe der Liposomen kann auch mit Hilfe einer Reihe von Techniken wie etwa der quasielektrischen Lichtstreuung und mit Geräten, z.B. Nicomp^®-Teilchenklassierern bestimmt werden, die dem Durchschnittsfachmann ohne weiteres zur Verfügung stehen.
Recht interessant ist die Feststellung, daß die Lipid-Derivate der vorliegenden Erfindung den Hauptteil eines Lipid-basierten Systems ausmachen können, auch wenn dieses System ein Liposomensystem ist. Dies liegt an der strukturellen (aber nicht funktionellen) Ähnlichkeit zwischen den Lipid-Derivaten der vorliegenden Erfindung und Lipiden. So wird angenommen, daß die Lipid-Derivate für die vorliegende Erfindung der einzige Bestandteil von Liposomen sein können, d.h., bis zu 100 Mol-% der gesamten dehydratisierten Liposomen können durch die Lipid-Derivate gebildet werden. Dies steht im Gegensatz zu den bekannten Monoetherlysolipiden, die nur einen kleineren Teil der Liposomen bilden können.
Vorteilhaft enthalten Liposomen, wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, typischerweise weitere Bestandteile, die eine pharmazeutische Wirkung haben können oder nicht, die aber die Liposomenstruktur stabiler (oder alternativ instabiler) machen oder die Liposomen vor Entleerung schützen und dadurch die Zirkulationszeit erhöhen, so daß die Gesamtwirksamkeit eines pharmazeutischen Mittels, in dem das Liposom enthalten ist, verbessert wird.
Aufgrund dieser Feststellungen wird angenommen, daß die einzelnen Lipid-Derivate, bezogen auf das gesamte dehydratisierte Liposom, typischerweise 15 bis 100 Mol-%, etwa z.B. 50 bis 100 Mol-%, vorzugsweise 75 bis 100 Mol-%, insbesondere 90 bis 100 Mol-% ausmachen.
Die Liposomen können einschichtig oder mehrschichtig sein. Einige bevorzugte Liposomen sind unilamellar, und haben Durchmesser von weniger als etwa 200 nm, vorzugsweise mehr als etwa 50 nm bis weniger als etwa 200 nm.
Wie in der Fachwelt bekannt, werden Liposomen typischerweise mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt, umfassend die Schritte: (a) Lösen des Lipid-Derivats in einem organischen Lösungsmittel; (b) Abtrennen des organischen Lösungsmittels von der Lipidderivat-Lösung von Schritt (a); und (c) Hydratisieren des Produkts von Schritt (b) mit einem wäßrigen Lösungsmittel, um so die Liposomen zu bilden.
Das Verfahren kann des weiteren einen Schritt der Zugabe einer zweiten Arzneimittelsubstanz (siehe unten) zum organischen Lösungsmittel von Schritt (a) oder zur wäßrigen Phase von Schritt (c) umfassen.
Das Verfahren kann anschließend einen Schritt des Extrudierens der in Schritt (c) erzeugten Liposomen durch ein Filter umfassen, um Liposomen einer bestimmten Größe, z.B. 100 nm, zu erzeugen.
Lipid-basierte teilchenförmige Systeme, d.h., Liposomen sowie Mizellen mit Größen, die einen breiten Bereich abdecken, können nach den vorstehend erwähnten Techniken, hergestellt werden. Je nach Verabreichungsweg liegen geeignete Größen für pharmazeutische Anwendungen normalerweise im Bereich von 20 bis 10 000 nm, insbesondere im Bereich von 30 bis 1000 nm. Größen im Bereich von 50 bis 200 nm sind normalerweise bevorzugt, da angenommen wird, daß Liposomen in diesem Größenbereich länger im Gefäßsystem von Säugern zirkulieren als größere Liposomen, die schneller vom retikuloendothelialen System des Säugers ("RES") erkannt und daher schneller aus dem Kreislauf entfernt werden. Eine längere vaskuläre Zirkulation kann die therapeutische Wirksamkeit dadurch verbessern, daß mehr Liposomen den beabsichtigten Ort der Wirkung, z.B. Tumoren oder Entzündungen, erreichen können.
Man geht davon aus, daß die Liposomen bei einem wie in den Ausführungsformen hierin definierten Arzneimittelabgabesystem, das zur Verabreichung über intravenöse und intramuskuläre Injektion angepaßt ist, vorzugsweise eine mittlere Teilchengröße von etwa 100 nm aufweisen sollten. So sollte die Teilchengröße im allgemeinen im Bereich von 50 bis 200 nm liegen.
Weiterhin sollten die Liposomen bei einem Arzneimittelabgabesystem, das zur Verabreichung mittels subkutaner Injektion angepaßt ist, vorzugsweise eine mittlere Teilchengröße von 100 bis 5000 nm aufweisen, und die Liposomen können dann ein- oder mehrschichtig sein.
Einer der Vorteile des Einschlusses der Lipid-Derivate in Liposomen ist, daß die Liposomenstruktur, insbesondere bei Stabilisierung wie nachstehend beschrieben, eine viel längere vaskuläre Zirkulationszeit hat als die Lipid-Derivate in Form diskreter Verbindungen. Zudem werden die Lipid- Derivate mehr oder weniger inert oder sogar "unsichtbar", wenn sie in Liposomen "gepackt" werden, in denen Lipopolymere oder Glycolipide eingeschlossen sind. Dies bedeutet, daß etwaige nachteilige Wirkungen, z.B. eine hämolytische Wirkung, unterdrückt werden können.
Die Liposomen sollten vorzugsweise als inerte Bestandteile fungieren, bis sie im fraglichen Bereich reagieren, z.B. in krebsbefallenen, infizierten oder entzündlich erkrankten Bereichen oder Geweben. Wie im folgenden beschrieben, können die Liposomen eine Reihe weiterer Bestandteile enthalten. Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittelabgabesystem des weiteren eine Komponente enthalten, die die Freisetzung einer etwaigen zweiten Arzneimittelsubstanz steuert, Mittel, die die Aktivität der extrazellulären PLA₂ steuern, oder Mittel, die die Permeabilität erhöhen, z.B. kurzkettige Lipide und Lipopolymere/Glycolipide.
Zwei sehr wichtige Gruppen von Verbindungen, die den Liposomen als Modifikatoren beizugeben sind, sind die stabilisierenden Verbindungen Lipopolymere und Glycolipide, etwa Lipopolymere (z.B. Polyethylenoxid-dipalmitoylphosphatidylethanolamin, DPPE-PEG, Polyethylenoxid-distearoylphosphatidylethanolamin, DSPE-PEG) mit einem PEG-Molekulargewicht von 100 bis 10 000 Dalton. Es wurde gezeigt, daß Lipopolymere als Stabilisatoren für das Liposom fungieren, d.h., das Lipopolymer erhöht die Zirkulationszeit, und – was im vorliegenden Zusammenhang höchst interessant ist – als Aktivatoren für extrazelluläre PLA₂. Die stabilisierenden Wirkung soll im folgenden beschrieben werden.
Man nimmt an, daß die äußere Oberfläche der Liposomen mit Serumproteinen, etwa mit Opsoninen, im Kreislaufsystem von. Säugern beschichtet wird. Ohne sich in irgendeiner Weise durch irgendeine spezielle Theorie einschränken zu lassen, wird angenommen, daß die Entleerung der Liposomen durch Mo difizieren der äußeren Oberfläche der Liposomen in einer Weise gehemmt werden kann, daß die Bindung von Serumproteinen ganz allgemein gehemmt wird. Man nimmt an, daß wirksame Oberflächenmodifikation, das heißt, Veränderungen der äußeren Oberfläche der Liposomen, die zur Hemmung der Opsonisierung und RES-Aufnahme führen, dadurch herbeigeführt werden kann, daß in die liposomalen Doppelschichten Lipide, eingebracht werden, deren polare Kopfgruppen durch Anbindung einer chemischen Einheit derivatisiert worden sind, welche die Bindung von Serumproteinen an Liposomen hemmen kann, so daß das pharmakokinetische Verhalten der Liposomen im Kreislaufsystem von Säugern verändert und die Aktivität der extrazellulären PLA₂, wie vorstehend für die Lipopolymere beschrieben, verbessert wird.
Es wurden Liposomen-Präparate entworfen, mit denen rasche RES-Aufnahme vermieden wird, und die somit eine erhöhte Halbwertszeit im Blutstrom haben. STEALTH^®-Liposomen (Liposome Technology Inc., Menlo Park, Calif.) enthalten Polyethylenglycol(PEG)-gepfropfte Lipide mit etwa 5 Mol-% des gesamten dehydratisierten Liposoms. Die Gegenwart von Polymeren auf der äußeren Liposomenoberfläche verringert die Aufnahme der Liposomen durch die Organe des RES. Die Liposomenmembranen können so aufgebaut sein, daß sie der zerstörerischen Wirkung des darin enthaltenen Tensids widerstehen. Eine Liposomenmembran zum Beispiel, die als Bestandteile Lipide enthält, die mit einem hydrophilen (d.h., wasserlöslichen) Polymer derivatisiert sind, hat normalerweise erhöhte Stabilität. Die Polymer-Komponente der Lipid-Doppelschicht schützt das Liposom vor Aufnahme durch das RES, womit sich die Zirkulationszeit der Liposomen im Blutstrom verlängert.
Hydrophile Polymere, die zur Verwendung in Lipopolymeren geeignet sind, sind solche, die leicht wasserlöslich sind, covalent an ein vesikelbildendes Lipid gebunden werden kön nen und in vivo ohne toxische Wirkungen verträglich, d.h., biokompatibel sind. Zu den geeigneten Polymeren gehören Polyethylenglycol (PEG), Polymilchsäure (auch als Polylactid bezeichnet), Polyglycolsäure (auch als Polyglycolid bezeichnet), Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymer und Polyvinylalkohol. Bevorzugte Polymere sind solche mit einem Molekulargewicht von etwa 100 oder 120 Dalton bis zu etwa 5000 oder 10 000 Dalton, vorzugsweise etwa 300 Dalton bis etwa 5000 Dalton. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 5000 Dalton und besonders bevorzugt mit einem Molekulargewicht von etwa 300 bis etwa 5000 Dalton. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Polyethylenglycol mit 750 Dalton (PEG(750)). Polymere lassen sich auch anhand der Anzahl von Monomeren in ihnen definieren; bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Polymere aus wenigstens etwa drei Monomeren eingesetzt, etwa PEG-Polymere, die aus drei Monomeren bestehen (etwa 150 Dalton). Zu den weiteren hydrophilen Polymeren, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, zählen Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierte Cellulosen wie etwa Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulose.
Glycolipide sind Lipide, an die eine hydrophile Polysaccharid-Kette covalent gebunden ist. Es sei klar, daß Glycolipide wie Lipopolymere genutzt werden können, wenn auch die Lipopolymere gegenwärtig die vielversprechendesten Ergebnisse zeitigen.
Es wird allgemein angenommen, daß der Gehalt an Lipopolymer, bezogen auf das gesamte dehydratisierte Liposom, vorteilhaft im Bereich von 1 bis 50 Mol-%, wie z.B. 2–25%, insbesondere 2 bis 15 Mol-% liegt.
Die Doppel- oder Mehrfachschichten der Liposomen können auch weitere Bestandteile, etwa weitere Lipide, Sterin-Verbindungen, Polymer-ceramide als Stabilisatoren und Targeting-Verbindungen etc. enthalten.
Die die Lipid-Derivate umfassenden Liposomen können (im Prinzip) ausschließlich aus den Lipid-Derivaten bestehen. Zur Modifizierung der Liposomen können jedoch ebensogut "weitere Lipide" beigegeben werden. Diese weiteren Lipide werden nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, passende Packungskonformationen mit den Lipidderivat-Komponenten der Doppelschicht anzunehmen, so daß alle Lipid-Bestandteile dicht gepackt sind und die Freisetzung der Lipid-Derivate aus der Doppelschicht gehemmt wird. Lipid-basierte Faktoren, die zu passenden Packungskonformationen beitragen, sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, und dazu zählen ohne Einschränkung die Länge der Acyl-Kette, der Ungesättigtheitsgrad sowie Größe und Ladung der Kopfgruppe. Demgemäß können geeignete weitere Lipide, darunter verschiedene Phosphatidylethanolamine ("PE") wie z.B. Ei-Phosphatidylethanolamin ("EPE") oder Dioleoylphosphatidylethanolamin ("DOPE"), von einem Durchschnittsfachmann ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Lipide können auf verschiedene Weise modifiziert werden, z.B. Kopfgruppen-Derivatisierung mit Dicarbonsäuren wie etwa Glutar-, Sebacin-, Bernstein- und Weinsäure, wobei die Dicarbonsäure vorzugsweise Glutarsäure ("GA") ist. Zu den geeigneten kopfgruppenderivatisierten Lipiden zählen demnach Phosphatidylethanolamindicarbonsäuren wie z.B. Dipalmitoylphosphatidylethanolaminglutarsäure ("DPPE-GA"), Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamin-glutarsäure ("POPE-GA") und Dioleoylphosphatidylethanolamin-glutarsäure ("DOPE-GA"). Besonders bevorzugt ist das derivatisierte Lipid DOPE-GA.
Der Gesamtgehalt an den "weiteren Lipiden" liegt typischerweise im Bereich von 0 bis 30 Mol-%, insbesondere 1 bis 10 Mol-%, bezogen auf das gesamte dehydratisierte Liposom.
Sterin-Verbindungen, die im Liposom enthalten sind, können im allgemeinen die Fluidität der Lipid-Doppelschichten beeinflussen. Sterin-Wechselwirkungen mit umliegenden Kohlenwasserstoff-Gruppen hemmen demnach im allgemeinen die Wanderung dieser Gruppen aus der Doppelschicht. Ein Beispiel für eine im Liposom einzuschließende Sterin-Verbindung ist Cholesterin, doch ist auch eine Vielzahl anderer Sterin-Verbindungen möglich. Es wird allgemein angenommen, daß der Gehalt an Sterin-Verbindung, sofern vorhanden, im Bereich von 0 bis 25 Mol-%, insbesondere 0 bis 10 Mol-%, z.B. 0 bis 5 Mol-% liegt, bezogen auf das gesamte dehydratisierte Liposom.
Polymer-ceramide sind Stabilisatoren, die die vaskuläre Zirkulationszeit verbessern. Beispiele sind Polyethylenglycol-Derivate von Ceramiden (PEG-Ceramide), insbesondere solche, bei denen das Molekulargewicht des Polyethylenglycols 100 bis 5000 beträgt. Es wird allgemein angenommen, daß der Gehalt an Polymer-ceramiden, bezogen auf das gesamte dehydratisierte Liposom, im Bereich von 0 bis 30 Mol-%, insbesondere 0 bis 10 Mol-% liegen sollte.
Zusätzliche weitere Bestandteile können 0 bis 2 Mol-%, insbesondere 0 bis 1 Mol-%, bezogen auf das gesamte dehydratisierte Liposom, ausmachen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Lipid-Doppelschicht eines Liposoms Lipide, die mit Polyethylenglycol (PEG) in einer Weise derivatisiert sind, daß sich die PEG-Ketten von der Innenfläche der Lipid-Doppelschicht in den vom Liposom eingekapselten Innenraum und von der Außenseite der Lipid-Doppelschicht in die um liegende Umgebung erstrecken (siehe z.B. US 5 882 679 und 10 und 11).
In der Fachwelt ist eine Vielzahl von Kopplungsverfahren zur Herstellung eines vesikelbildenden, mit einem biokompatiblen hydrophilen Polymer wie Polyethylenglycol derivatisierten Lipid bekannt (siehe z.B. US 5 213 804 , US 5 013 556 ).
Die derivatisierten Lipid-Komponenten der Liposomen gemäß vorliegender Erfindung können zusätzlich eine labile Lipid/Polymer-Verknüpfung enthalten, etwa eine Peptid-, Ester- oder Disulfid-Verknüpfung, die unter selektiven physiologischen Bedingungen gespalten werden kann, z.B. in Gegenwart von Peptidase- oder Esterase-Enzymen oder Reduktionsmitteln. Durch solche Verknüpfungen zur Kopplung von Polymeren an Phospholipide wird es möglich, hohe Blutspiegel dieser Liposomen einige Stunden lang nach der Verabreichung zu erhalten, wonach die reversiblen Verknüpfungen gespalten werden und das Polymer von der Außenseite der Liposomen-Doppelschicht entfernt wird. Die polymerlosen Liposomen werden dann schnell vom RES-System aufgenommen (siehe z.B. US 5 356 633 ).
Daneben können die Liposomen gemäß vorliegender Erfindung Nichtpolymermoleküle enthalten, die an die Außenseite des Liposoms gebunden sind, etwa Haptene, Enzyme, Antikörper oder Antikörper-Fragmente, Cytokine und Hormone (siehe z.B. US 5 527 528 ) sowie andere kleine Proteine, Polypeptide, Polysaccharid-Einheiten aus einem Zucker oder Nichtproteinmoleküle, die dem Liposom ein spezielles Merkmal der Enzym- oder Oberflächenerkennung verleihen. Siehe veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/21235. Oberflächenmoleküle, die das Liposom bevorzugt zu spezifischen Organen oder Zellarten leiten, werden hierin als "Targeting-Moleküle" bezeichnet, und dazu gehören beispielsweise Antikörper und Zucker-Einhei ten, z.B. Ganglioside oder solche, die auf Mannose und Galactose basieren, die das Liposom zu spezifischen Zellen führen, die spezifische Antigene tragen (Rezeptoren für Zucker-Einheiten). Techniken zur Ankopplung von Oberflächenmolekülen an Liposomen sind in der Fachwelt wohlbekannt (siehe z.B. US 4 762 915 ).
Das Liposom kann dehydratisiert, gelagert und dann in einer Weise wiedergeherstellt werden, daß ein erheblicher Teil seines Inhalts im Innern erhalten bleibt. Die liposomale Dehydratisierung erfordert im allgemeinen die Verwendung eines hydrophilen Trocknungsschutzmittels, etwa ein Disaccharid-Zucker, sowohl an der Innen- als auch der Außenfläche der Liposomen-Doppelschicht (siehe US 4 880 635 ). Es wird allgemein angenommen, daß diese hydrophile Verbindung die Neuordnung der Lipide im Liposom verhindert, so daß Größe und Inhalt während des Trocknungsvorgangs und bei der anschließenden Rehydratisierung beibehalten werden. Geeignete Qualitäten eines solchen Trocknungsschutzmittels wären, daß sie starke Akzeptoren für Wasserstoff-Bindungen sind und stereochemische Merkmale aufweisen, die den intramolekularen Abstand der Komponenten der Liposomen-Doppelschicht bewahren. Alternativ kann das Trocknungsschutzmittel weggelassen werden, falls das Liposomen-Präparat vor der Dehydratisierung nicht gefroren wird und nach der Dehydratisierung genügend Wasser im Präparat verbleibt.
Lipidderivat-Liposomen als Arzneimittelträgersysteme
Wie oben erwähnt, können die Liposomen, die die Lipid-Derivate der vorliegenden Erfindung enthalten, auch eine zweite Arzneimittelsubstanz enthalten. In einer speziellen Ausführungsform liegt das vorstehend beschriebene Lipid-basierte Arzneimittelabgabesystem in Form von Liposomen vor, in die eine zweite Arzneimittelsubstanz eingebracht ist. Es sei klar, daß die zweite Arzneimittelsubstanz pharmazeutisch wirksame Bestandteile umfassen kann, die eine pharmazeutische Einzelwirkung oder synergistische Wirkung in Kombination mit dem Lipid-Derivat und den Lysolipid-Derivaten aufweisen können. Der Begriff "zweite" bedeutet nicht notwendigerweise, daß die pharmazeutische Wirkung der zweiten Arzneimittelsubstanz geringer ist als z.B, die der vom Prodrug abgeleiteten Arzneimittelsubstanz, sondern wird lediglich zur Unterscheidung zwischen den beiden Substanzgruppen verwendet.
Die vorliegende Erfindung macht demnach ein Arzneimittelabgabesystem verfügbar, das in Form von Liposomen vorliegt, wobei eine zweite Arzneimittelsubstanz eingebracht ist.
Eine mögliche "zweite Arzneimittelsubstanz" ist jede Verbindung oder Stoffzusammensetzung, die Säugern und vorzugsweise Menschen verabreicht werden kann. Solche Mittel können biologische Wirkung bei Säugern aufweisen. Zu den zweiten Arzneimittelsubstanzen, die mit Liposomen assoziiert werden können, gehören – ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: antivirale Mittel wie etwa Acyclovir, Zidovudin und die Interferone; antibakterielle Mittel wie etwa Aminoglycoside, Cephalosporine und Tetracycline; antifungale Mittel wie etwa Polyen-Antibiotika, Imidazole und Triazole; antimetabolische Mittel wie etwa Folsäure, Purin- und Pyrimidin-Analoga; antineoplastische Mittel wie etwa die Anthracyclin-Antibiotika und Pflanzenalkaloide; Sterine wie etwa Cholesterin; Kohlenhydrate, z.B. Zucker und Stärken; Aminosäuren, Peptide, Proteine wie z.B. Zellrezeptorproteine, Immunglobuline, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und Glycoproteine; Farbstoffe; radioaktive Markierungen wie etwa Radioisotope und Radioisotop-markierte Verbindungen; strahlenundurchlässige Verbindungen; fluoreszierende Verbindungen; mydriatische Verbindungen; Bronchodilatoren; Lokalanästhetika; und dergleichen.
Liposomale Formulierungen mit zweiter Arzneimittelsubstanz verbessern den therapeutischen Index der zweiten Arzneimittelsubstanz, indem sie die Toxizität des Arzneimittels verringern. Liposomen können auch die Geschwindigkeit verringern, mit der eine zweite Arzneimittelsubstanz aus dem vaskulären Kreislauf von Säugern entfernt wird. Demnach kann die liposomale Formulierung einer zweiten Arzneimittelsubstanz bedeuten, daß weniger von dem Arzneimittel verabreicht werden muß, um die gewünschte Wirkung zu erzielen.
Liposomen können mit einer oder mehreren zweiten Arzneimittelsubstanzen beladen werden durch Solubilisieren des Arzneimittels in der Lipidphase oder wäßrigen Phase, die zur Herstellung der Liposomen verwendet wird. Alternativ können die Liposomen mit ionisierbaren zweiten Arzneimittelsubstanzen beladen werden, indem zunächst die Liposomen gebildet werden, ein elektrochemisches Potential, z.B. durch einen pH-Gradienten, über der äußersten liposomalen Doppelschicht erzeugt und dann die ionisierbare zweite Arzneimittelsubstanz dem wäßrigen Medium außerhalb des Liposoms zugesetzt wird (siehe z.B. US 5 077 056 und WO 86/01102).
Verfahren zur Herstellung lipophiler, zur Liposomen- oder Mizellen-Formulierung geeigneter Arzneimittel-Derivate sind in der Fachwelt wohlbekannt (siehe z.B. US 5 534 499 und US 6 118 011 , die die covalente Bindung therapeutischer Mittel an eine Fettsäurekette eines Phospholipids beschreiben). Eine Mizellen-Formulierung von Taxol ist beschrieben bei Alkan-Onkyuksel et al., Pharmaceutical Research, 11, 206 (1994).
Die zweite Arzneimittelsubstanz kann demnach irgendeine aus der Fülle der bekannten und möglichen pharmazeutisch wirksamen Bestandteile sein, ist aber vorzugsweise eine therapeutisch und/oder prophylaktisch wirksame Substanz. Aufgrund des beim Abbau der Liposomen der vorliegenden Erfin dung beteiligten Mechanismus ist die zweite Arzneimittelsubstanz vorzugsweise eine solche, die Erkrankungen und/oder Zustände betrifft, die mit einer lokalen Zunahme der Aktivität extrazellulärer PLA₂ verbunden sind.
Besonders interessante zweite Arzneimittelsubstanzen sind ausgewählt aus (i) Antitumormitteln wie etwa Anthracylin-Derivaten, Cisplatin, Paclitaxel, 5-Fluoruracil, Exisulind, cis-Retinoesäure, Suldinacsulfid und Vincristin, (ii) Antibiotika und antifungalen Mitteln, und (iii) entzündungshemmenden Mitteln wie z.B. Steroiden und Nichtsteroiden. Die Steroide können insbesondere auch eine stabilisierende Wirkung auf die Liposomen aufweisen.
Die zytotoxischen Wirkungen einer ganzen Reihe von Antikrebsmitteln werden bei Einkapselung in die erfindungsgemäßen Träger wahrscheinlich verbessert. Des weiteren ist zu erwarten, daß die Hydrolyse-Produkte, d.h., die Monoetherlysolipide und esterverknüpften Derivate wiederum als Resorptionsverstärker bei der Arzneimittelpermeation durch die Zielmembranen fungieren, wenn die Träger lokal im erkrankten Gewebe auseinanderbrechen.
Es ist vorgesehen, daß sich die zweite Arzneimittelsubstanz gemäß ihrer Hydrophilie in den Liposomen verteilt, d.h., hydrophile zweite Arzneimittelsubstanzen sind eher im Hohlraum der Liposomen vorhanden, und hydrophobe zweite Arzneimittelsubstanzen werden eher in der hydrophoben Doppelschicht vorhanden sein. Wie vorstehend erläutert, sind die Verfahren zum Einbringen der zweiten Arzneimittelsubstanzen in der Fachwelt wohlbekannt.
Der hydrolytisch abspaltbare organische Rest kann ein Hilfsarzneistoff oder Wirksamkeitsmodifikator für die zweite Arzneimittelsubstanz sein. Es sei klar, daß das Lipid-Derivat ein wie vorstehend definiertes Lipid-Derivat ist.
Typischerweise macht das Lipid-Derivat 15 bis 100 Mol-%, z.B. 50 bis 100 Mol-% des gesamten dehydratisierten (liposomalen) Systems aus.
Wie aus dem Vorstehenden klar sein sollte, macht die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung verfügbar, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eines der vorstehend beschriebenen Lipidbasierten Arzneimittelabgabesysteme. Die Zusammensetzung soll nachstehend ausführlich beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines der hierin beschriebenen Lipid-basierten Arzneimittelabgabesysteme als Medikament sowie die Verwendung eines der hierin beschriebenen Lipid-basierten Arzneimittelabgabesysteme zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit einer lokalen Zunahme der Aktivität extrazellulärer Phospholipase A2 in Säugergewebe verbunden sind. Diese Erkrankungen oder Zustände sind typischerweise ausgewählt aus Krebs, z.B. Hirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs oder Eierstockkrebs, oder Leukämie, Lymphom, Sarkom, Karzinom und entzündlichen Zuständen. Dazu gehört auch die prophylaktische Anwendung. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verwendungen sind insbesondere in den Fällen anwendbar, wo die Zunahme der Aktivität extrazellulärer PLA₂ wenigstens 25% im Vergleich zum normalen Aktivitätsniveau im fraglichen Gewebe ist, wobei das Gewebe das eines Säugers und insbesondere das eines Menschen ist.
Pharmazeutische Präparate und therapeutische Anwendungen
Ebenfalls hiermit verfügbar gemacht wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und das erfindungsgemäße Lipid-Derivat, z.B. als Liposom.
"Pharmazeutisch annehmbare Träger" wie hierin verwendet sind solche Medien, die allgemein für die Verwendung im Zusammenhang mit der Verabreichung von Lipiden und Liposomen, darunter liposomale Arzneimittel-Formulierungen, an Säuger einschließlich Menschen annehmbar sind. Pharmazeutisch annehmbare Träger werden im allgemeinen gemäß einer Reihe von Faktoren formuliert, deren Bestimmung und Berücksichtigung durchaus im Rahmen der Möglichkeiten eines Durchschnittsfachmanns liegen, darunter ohne Einschränkung: der verwendete spezielle Arzneimittelwirkstoff und/oder die verwendete zweite Arzneimittelsubstanz, das Liposomen-Präparat, dessen Konzentration, Stabilität und beabsichtigte Bioverfügbarkeit; die Krankheit, Störung oder der Zustand, die mit der liposomalen Zusammensetzung zu behandeln sind; der Patient, dessen Alter, Größe und Allgemeinzustand; der beabsichtigte Verabreichungsweg der Zusammensetzung, z.B. nasal, oral, ophthalmisch, subkutan, intramammär, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär. Zu den typischen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die bei der parenteralen Arzneimittelverabreichung verwendet werden, zählt beispielsweise D5W, eine wäßrige Lösung, die 5% Gew./Vol. Dextrose und physiologische Salzlösung enthält. Pharmazeutisch annehmbare Träger können zusätzliche Bestandteile enthalten, zum Beispiel solche, die die Stabilität der enthaltenen wirksamen Bestandteile verbessern, etwa Konservierungsmittel und Antioxidantien.
Das Liposom oder Lipid-Derivat wird typischerweise in einem Dispersionsmedium, z.B. einem pharmazeutisch annehmbaren wäßrigen Medium formuliert.
Es wird eine Menge der Zusammensetzung, umfassend eine gegen Krebs wirksame Menge des Lipid-Derivats, typischerweise etwa 0,1 bis etwa 1000 mg Lipid-Derivat pro kg des Säugerkörpers, verabreicht – vorzugsweise intravenös. Für die Zwecke dieser Erfindung sind "gegen Krebs wirksame Mengen" an liposomalen Lipid-Derivaten solche Mengen, die wirksam sind, um Ausbildung, Wachstum, Metastasierung oder Invasion eines oder mehrerer Karzinome bei Säugern, denen die Lipid-Derivate verabreicht wurden, zu hemmen, zu bessern oder zu verhindern. Die gegen Krebs wirksamen Mengen werden im allgemeinen gemäß einer Reihe von Faktoren ausgewählt, z.B. Alter, Größe und Allgemeinzustand des Patienten, zu behandelndes Karzinom und beabsichtigter Verabreichungsweg, und mit Hilfe einer Reihe von Hilfsmitteln bestimmt, zum Beispiel Dosisbereichstests, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind und von diesem anhand der Lehren dieser Erfindung ohne weiteres durchgeführt werden können. Antineoplastisch wirksame Mengen der liposomalen Arzneimittel/Prodrugs dieser Erfindung sind etwa die gleichen wie die Mengen an freien, nichtliposomalen Arzneimitteln/Prodrugs, z.B. etwa 0,1 mg Lipid-Derivat pro kg Körpergewicht des zu behandelnden Säugers bis etwa 1000 mg pro kg.
Vorzugsweise ist das verabreichte Liposom ein unilamellares Liposom mit einem mittleren Durchmesser von etwa 50 nm bis etwa 200 nm. Das Antikrebsbehandlungsverfahren kann die Verabreichung einer oder mehrerer zweiter Arzneimittelsubstanzen neben dem liposomalen Arzneimittel umfassen, wobei diese zusätzlichen Mittel im gleichen Liposom wie das Lipid-Derivat enthalten sind. Die zweiten Arzneimittelsubstanzen, die in den inneren Kompartimenten der Liposomen eingeschlossen oder in ihren Lipid-Doppelschichten maskiert werden können, sind bevorzugt – aber nicht notwendigerweise – Antikrebsmittel.
Die pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise parenteral durch Injektion, Infusion oder Implantation (intravenös, intramuskulär, intraartikulär, subkutan oder dergleichen) in Dosierungsformen, Formulierungen oder z.B. geeigneten Abgabevorrichtungen oder Implantaten verabreicht, die herkömmliche, nichttoxische pharmazeutisch annehmbare Träger und Hilfsmittel enthalten.
Formulierung und Herstellung solcher Zusammensetzungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung bekannt. Spezielle Formulierungen finden sich in dem Lehrbuch mit dem Titel "Remington's Pharmaceutical Sciences".
So können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen die Arzneimittelwirkstoffe in Form einer sterilen Injektion umfassen. Zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung werden die geeigneten Arzneimittelwirkstoffe in einem parenteral annehmbaren, flüssigen Arzneimittelträger dispergiert, der zweckmäßigerweise Suspendiermittel, Lösungsvermittler, Stabilisatoren, pH-Einstellmittel und/oder Dispergiermittel umfassen kann. Zu den annehmbaren Arzneimittelträgeren, die verwendet werden können, zählen Wasser, Wasser, das durch Zugabe einer geeigneten Menge Salzsäure, Natriumhydroxid oder eines geeigneten Puffers auf einen geeigneten pH eingestellt wurde, 1,3-Butandiol, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchlorid-Lösung. Die wäßrige Formulierung kann auch ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten, zum Beispiel, Methyl-, Ethyl- oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat.
Wird die Behandlung eines Tumors oder Neoplasmas gewünscht, so ist es zur wirksamen Abgabe eines im Liposom eingekapselten Arzneimittels über den Blutstrom erforderlich, daß das Liposom die zusammenhängende (aber "undichte") Endothel-Schicht und die darunterliegende Basalmembran durchdringen kann, die die Gefäße umgeben, von denen ein Tumor mit Blut versorgt wird. Kleinere Liposomen erwiesen sich als wirksamer bei der Extravasation in Tumoren durch die Endothelzellenbarriere und die darunterliegende Basalmembran, die eine Kapillare von Tumorzellen trennt.
So wie hierin verwendet, sind "feste Tumoren" solche, die an einer anatomischen Stelle und nicht im Blutstrom wachsen (im Gegensatz zu hämatogenen Tumoren wie Leukämien). Feste Tumoren erfordern die Bildung kleiner Blutgefäßen und Kapillaren zur Ernährung des wachsenden Tumorgewebes.
Gemäß vorliegender Erfindung wird das Antitumor- oder antineoplastische Mittel der Wahl in ein erfindungsgemäßes Liposom eingeschlossen; die Liposomen werden mit einer Größe formuliert, von der bekannt ist, daß das Durchdringen der Endothel- und Basalmembranbarrieren möglich ist. Die resultierende liposomale Formulierung kann einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, parenteral verabreicht werden, vorzugsweise durch intravenöse Verabreichung. Tumoren, die charakterisiert sind durch akute Zunahme der Permeabilität der Gefäßanordnung in der Region des Tumorwachstums sind besonders geeignet für eine Behandlung mit Hilfe der vorliegenden Verfahren. Die Liposomen werden schließlich aufgrund der Lipase-Wirkung am Tumorort abgebaut oder können zum Beispiel thermisch oder mittels Ultraschall-Bestrahlung durchlässig gemacht werden. Das Arzneimittel wird dann in einer bioverfügbaren, transportierbaren löslichgemachten Form freigesetzt. Zudem kann eine leichte Temperaturerhöhung, wie sie häufig bei erkranktem Gewebe zu sehen ist, die Stimulierung der extrazellulären PLA₂ weiter steigern.
Wird eine ortspezifische Behandlung einer Entzündung gewünscht, so ist für eine wirksame Liposomenabgabe eines Arzneimittels erforderlich, daß das Liposom eine lange Halbwertszeit im Blut aufweist und in der Lage ist, die zusammenhängende Endothelzellenschicht und die darunterliegende Basalmembran zu durchdringen, die die Blutgefäße in der Nähe des Orts der Entzündung umgeben. Kleinere Liposomen erwiesen sich als wirksamer bei der Extravasation durch die Endothelzellenbarriere und in die damit verbundenen entzündeten Regionen. Durch das begrenzte Arzneimitteltragevermögen herkömmlicher Präparate mit kleinen Liposomen ist jedoch deren Effektivität für derartige Zwecke eingeschränkt.
Gemäß vorliegender Erfindung wird das entzündungshemmende Mittel der Wahl in ein erfindungsgemäßes Liposom eingeschlossen; die Liposomen werden mit einer Größe formuliert, von der bekannt ist, daß das Durchdringen der Endothel- und Basalmembranbarrieren möglich ist. Die resultierende liposomale Formulierung kann einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, parenteral verabreicht werden, vorzugsweise durch intravenöse Verabreichung. Entzündete Regionen, die charakterisiert sind durch akute Zunahme der Permeabilität der Gefäßanordnung in der Region der Entzündung sind besonders geeignet für eine Behandlung mit Hilfe der vorliegenden Verfahren.
Es ist bekannt, daß die Aktivität der extrazellulären PLA₂ in den Bereichen des Säugerkörpers abnorm hoch ist, die an Krebs, Entzündung etc. erkrankt sind. Mit der vorliegenden Erfindung ergibt sich eine Möglichkeit, diese Tatsache auszunutzen, und es wird angenommen, daß die Aktivität der extrazellulären PLA₂ im Vergleich zu einem vergleichsweise normalen Bereich in den erkrankten Bereichen des Körpers wenigstens 25% höher sein sollte (bestimmt in der extrazellulären Umgebung). Es ist jedoch vorstellbar, daß das Aktivitätsniveau der extrazellulären PLA₂ oft viel höher ist, z.B. wenigstens 100%, z.B. wenigstens 200%, wie z.B. wenigstens 400%. Dies bedeutet, daß die Behandlung eines Säugers, der einer solchen Behandlung mit dem Zweck der Heilung oder Linderung bedarf, mit nur minimalem Einfluß auf ein Gewebe mit "normalem" Aktivitätsniveau extrazellulärer PLA₂ durchgeführt werden kann. Dies ist insbesondere bei der Behandlung von Krebs von sehr großer Bedeutung, wo häufig recht starke Arzneimittel (zweite Arzneimittelsubstanzen) erforderlich sind.
Mit den Erkenntnissen der vorliegenden Erfindung macht die Erfindung somit ein Verfahren zur selektiven Wirkstoff-Adressierung an erkrankte Bereiche, wobei diese Bereiche neoplastische Zellen umfassen, z.B. Bereiche im Körper eines Säugers, vorzugsweise eines Menschen, die eine Aktivität der extrazellulären Phospholipase A2 (extrazelluläre PLA₂) aufweisen, die im Vergleich zur normalen Aktivität in diesen Bereichen wenigstens 25% höher ist, durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines hierin definierten Arzneimittelabgabesystems an einen Säuger verfügbar, der einer solchen Behandlung bedarf.
Bereitgestellt wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines mit Krebs befallenen Säugers, z.B. Hirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs oder Eierstockkrebs oder Leukämie, Lymphom, Sarkom, Karzinom, umfassend die Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger. Es wird angenommen, daß die Lipid-Derivate und/oder die zweite Arzneimittelsubstanz in Liposomenform für Tumorzellen selektiv zytotoxisch ist.
Toxizität
Die Toxizität der die Lipid-Derivate umfassenden Liposomen läßt sich bewerten durch Bestimmen des therapeutischen Fensters "TW", ein numerischer Wert, der abgeleitet ist aus der Beziehung zwischen der Hämolyseinduktion der Verbindung und ihrer Fähigkeit, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen. Die TW-Werte sind definiert als HI₅/GI₅₀ (wobei "HI₅" gleich der Konzentration der Verbindung ist, die Hämolyse von 5% der roten Blutzellen in einer Kultur induziert, und "GI₅₀" gleich der Dosis der Verbindung ist, die eine fünfzigprozentige Wachstumshemmung in einer Population von Zel len induziert, die dem Mittel ausgesetzt sind). Je höher der HI₅-Wert eines Mittels ist, desto weniger hämolytisch ist das Mittel. Höhere HI₅ bedeuten, daß höhere Konzentrationen der Verbindung vorhanden sein müssen, damit die Verbindung 5% Hämolyse induziert. Je höher also HI₅, desto höher der therapeutische Nutzen einer Verbindung, da mehr davon gegeben werden kann, ehe sie das gleiche Ausmaß an Hämolyse wie ein Mittel mit niedrigerer HI₅ induziert. Im Gegensatz dazu sind niedrigere GI₅₀ ein Hinweis für bessere therapeutische Mittel. Ein niedrigerer GI₅₀-Wert zeigt an, daß eine geringere Konzentration eines Mittels für 50% Wachstumshemmung erforderlich ist. Je höher also der HI₅-Wert und je niedriger der GI₅₀-Wert, desto besser die therapeutischen Eigenschaften eines Mittels mit der betreffenden Verbindung.
Ist ganz allgemein das TW eines Arzneimittels kleiner als 1, so kann dieses nicht effektiv als therapeutisches Mittel verwendet werden. Das heißt, der HI₅-Wert des Mittels ist so niedrig und sein GI₅₀-Wert so hoch, daß es im wesentlichen nicht möglich ist, genügend von dem Mittel zu verabreichen, um einen ausreichenden Grad an Tumor-Wachstumshemmung zu erreichen, ohne damit auch ein unannehmbares Ausmaß an Hämolyse zu erhalten. Da mit den Lipidderivat-Liposomen der Vorteil geringerer Aktivität extrazellulärer PLA₂ im Blutstrom im Vergleich zur Aktivität im erkrankten Gewebe genutzt wird, geht man davon aus, daß das TW viel höher als das für normale Monoetherlysolipide sein wird. Da der Aktivitätsunterschied sich in einigen Größenordnungen bewegt, und da die Liposomen in Gewebe mit hoher Aktivität der extrazellulären PLA₂ eingeschlossen werden, wird allgemein angenommen, daß das TW der erfindungsgemäßen Liposomen größer als etwa 3, vorzugsweise größer als etwa 5 und besonders bevorzugt größer als etwa 8 ist.
Die Erfindung soll anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert werden.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung der Liposomen
Unilamellare vollhydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC). DPPC wurde von Avanti Polar Lipids bezogen, und 1-O-DPPC wurde in unserem Laboratorium synthetisiert. Kurz umrissen wurden abgewogene Mengen DPPC oder 1-O-DPPC in Chloroform gelost. Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe eines leichten N₂-Stroms entfernt, und die Lipid-Filme wurden über Nacht unter niedrigem Druck getrocknet, um Spurenmengen des Lösungsmittels zu entfernen. Multilamellare Vesikel wurden hergestellt durch Dispergieren der getrockneten Lipide in einer Pufferlösung, enthaltend 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. Die multilamellaren Vesikel wurden zehnmal durch zwei übereinandergestapelte Polycarbonat-Filter mit 100 nm Porengröße extrudiert wie beschrieben von Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858, 161–168.
Die Wärmekapazitätskurven wurden erhalten mit Hilfe eines N-DSC II-Differentialscanningkalorimeters (Calorimetry Sciences Corp., Provo) vom Energieausgleichstyp mit einem Zellenvolumen von 0,34 ml. Vor dem Scannen, wurde die Liposomensuspension 50 min im Kalorimeter bei der Anfangstemperatur äquilibriert. Die Scan-Geschwindigkeit belief sich auf +10°C/h. Die Lipid-Konzentration war 1 mM. Der Gel/Fluid- Übergang der multilamellaren Liposomen (MLV) ist charakterisiert als scharfer Übergang erster Ordnung, was sich in dem schmalen Peak in den Wärmekapazitätskurven widerspiegelt, die in 1a und 1b (obere Kurven) für 1-O-DPPC und DPPC gezeigt sind. Der scharfe Peak ist Ausdruck des Übergangsverhaltens mehrschichtiger Liposomen und steht im Gegensatz zu dem breiteren Gel/Fluid-Übergang, der bei einschichtigen Liposomen (LUV) zu beobachten ist (Pedersen et al., 1996, Biophys. J. 71, 554–560), wie in 1a und 1b (untere Kurven) für die unilamellaren extrudierten 1-O-DPPC- und DPPC-Liposomen gezeigt.
Beispiel 2
Phospholipase A2-Reaktionsprofil und Messungen der Verzögerungszeit
Gereinigte Schlangengift-Phospholipase A2 (PLA₂ aus Agkistrodon piscivorus piscivorus) wurde isoliert nach dem Verfahren von Maraganore et al., J. Biol. Chem. 259, 13839-13843. Dieses PLA₂-Enzym gehört zur Klasse der niedermolekularen 14 kD-Sekretionsenzyme, die strukturelle Ähnlichkeit mit menschlicher extrazellulärer Phospholipase A2 aufweisen, was auf übereinstimmende molekulare Mechanismen der Phospholipase-katalysierten Hydrolyse an der Lipid/Membran-Grenzfläche hindeutet (Wery et al., Nature 352, 79–82; Hønger et al., Biochemistry 35, 9003–9006; Vermehren et al., Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27–36). Unilamellare vollhydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und aus 1-O-DPPC mit 5 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) oder 5 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (1-O-DPPE-PEG2000). Die Assay-Bedingungen für das in 2 gezeigte PLA₂-Reaktionszeitprofil und die in Tabelle 1 angegebene Verzögerungszeit und prozentuale Hydrolyse waren: 0,15 mM unilamellare Liposomen, 150 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Tabelle 1. Verzögerungszeit und Prozent hydrolysiertes 1-O-DPPC bei 41°C, bestimmt mittels HPLC. Die Lipid-Konzentration war 0,150 mM in 10 mM HEPES Puffer (pH = 7,5).
Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Zugabe von 8,9 μl einer 42 μM PLA₂-Stammlösung (150 nM) zu 2,5 ml der thermostatisierten Liposomensuspension (0,150 mM), die vor der Zugabe von PLA₂ 800 s äquilibriert worden war. Das charakteristische Verzögerungsschubverhalten von PLA₂ gegenüber den Liposomen zeigt sich durch eine abrupte Zunahme der Eigenfluoreszenz von PLA₂ bei 340 nm nach Anregung mit 285 nm, gefolgt von begleitender Abnahme der 90°-Lichtstreuung aus der Lipidsuspension (Hønger et al., Biochemistry 35, 9003–9006). Die Proben für die HPLC-Analyse der Menge an verbleibendem nichthydrolysiertem 1-O-DPPC und folglich der Menge an erzeugtem 1-O-Hexadecyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin (Lyso-1-O-DPPC) wurden vor der Zugabe von PLA₂ und 1200 s nach der beobachteten Verzögerungszeit entnommen. 100 μl-Aliquote wurden der Lipidsuspension entnommen, schnell mit 1 ml Chloroform/Methanol/Essigsäure- Lösung (2:4:1) vermischt, um die enzymatische Reaktion zu löschen. Die Lösung wurde mit 1 ml Wasser gewaschen, und 20 μl der schweren organischen Phase wurden für die HPLC verwendet. Die HPLC-Chromatogramme in 3 zeigen die Mengen 1-O-DPPC vor und nach (t = 2050 s) Zugabe von PLA₂ (t = 800 s) zur Liposomensuspension. Die HPLC-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung einer 5 μm Diol-Säule mit einer mobilen Phase aus Chloroform/Methanol/Wasser (730:230:30, Vol./Vol.) und einem Verdampfüngslichtstreuungsdetektor. Der Umsatz der PLA₂-katalysierten Lipid-Hydrolyse von 1-O-DPPC zu Lyso-1-O-DPPC wurde mittels HPLC gemessen (siehe Tabelle 1). Die Enzym-Eigenfluoreszenz und die 90°-Lichtstreuung wurden gemessen als Funktion der Zeit wie in 2 gezeigt.
Beispiel 3
Phospholipase A2-induzierte Freisetzung eines eingekapselten wasserlöslichen Modell-Arzneimittels
Multilamellare 1-O-DPPC-Liposomen wurden hergestellt in Gegenwart von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch einstündiges Hydratisieren eines Films aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin in HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 und 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur. Unilamellare Liposomen wurden gebildet durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei übereinandergestapelte 100 nm-Polycarbonat-Filter. Die einschichtigen Liposomen wurden rasch auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein-haltigen 1-O-DPPC-Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatographiesäule von freiem Calcein getrennt.
Die Assay-Bedingungen für die PLA₂-induzierte Calcein-Freisetzung waren: 25 μM unilamellare 1-O-DPPC-Liposomen, 25 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5 oder 8,0), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. PLA₂ wurde zur Zeit 900 s zu 2,5 ml thermostatisierter 1-O-DPPC-Liposomensuspension gegeben, die vor der Zugabe von PLA₂ wenigstens 20 min bei 37°C äquilibriert worden war. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird bestimmt als: % Freisetzung = 100(I_F(t)- I_B)/(I_T – I_B) , worin I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zur Zeit t nach Zugabe des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist und I_T die gesamte Fluoreszenz ist, gemessen nach Zugabe von Triton X-100, was zu vollständiger Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der 1-O-DPPC-Liposomen führt. Wie in 4 gezeigt, induzierte PLA₂ bei 1-O-DPPC-Liposomen eine Gesamtfreisetzung des eingeschlossenen Calceins von 90 Prozent.
Beispiel 4
Phospholipase A2-gesteuerte Permeabilitätserhöhung einer Modellzielmembran
Multilamellare Ziel-Liposomen mit Modellmembran wurden hergestellt in Gegenwart von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch einstündiges Hydratisieren eines Films aus 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen (D-O-SPC) in HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 und 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur (T_m = 55°C). Unilamellare Liposomen wurden hergestellt durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei übereinandergestapelte 100 nm-Polycarbonat-Filter. Die einschichtigen Liposomen wurden rasch auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein-haltigen Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatographiesäule von freiem Calcein getrennt. Die unilamellaren Träger-Liposomen, be stehend aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, wurden hergestellt wie vorstehend beschrieben. Die Calcein-Freisetzung aus den Ziel-Liposomen wird bestimmt durch Messen der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm.
Die Konzentrationen der D-O-SPC- und 1-O-DPPC-Liposomen beliefen sich auf 25 μM. Es wurde Schlangengift-PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) zugesetzt (25 nM), um die hydrolytische Reaktion einzuleiten, die zur Bildung der Hydrolyseprodukte 1-O-Hexadecyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin (Lyso-1-O-DPPC) und Fettsäure führt. Da aufgrund des Einbaus der Hydrolyseprodukte Lyso-1-O-DPPC, das keine Doppelschicht bildet, und Fettsäure in die Ziel-Lipidmembran Calcein aus den D-O-SPC-Liposomen freigesetzt wird, ist eine lineare Zunahme der Fluoreszenz bei 520 nm nach Anregung mit 492 nm zu beobachten, wenn das Calcein sich im umgebenden Puffermedium verdünnt, wie in 5 gezeigt ist. Der Prozentsatz des freigesetzten Calceins wird wie vorstehend beschrieben bestimmt (siehe Beispiel 3).
Beispiel 5
Hämolyse-Assay
Unilamellare vollhydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und aus 1-O-DPPC mit 5 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) oder mit 5 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (1-O-DPPE-PEG2000). Die Lipide wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) hydratisiert. 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholin (ET-18-OCH₃) in PBS wurde dem Assay als Vergleich beigegeben.
Der Hämolysetest wurde durchgeführt wie beschrieben von Perkins et al., Biochim. et Biophys. Acta 1327, 61–68. Kurz umrissen wurde jede Probe mit PBS in Reihen verdünnt, und 0,5 ml einer jeden verdünnten Suspension der 1-O-DPPC-Liposomen wurden mit 0,5 ml gewaschener menschlicher roter Blutzellen (RBC) gemischt [4% in PBS (Vol./Vol.)]. Zur Kontrolle wurden 0,5 ml der Suspension der roten Blutzellen entweder mit 0,5 ml Pufferlösung (negative Hämolyse-Kontrolle) oder mit 0,5 ml Wasser (positive Hämolyse-Kontrolle) gemischt. Proben und Standard wurden in einen Brutkasten mit 37°C gegeben und 20 Stunden gerührt. Die Röhrchen wurden 10 Minuten mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert (2000 × g), um RBC-Pellets zu bilden. 200 μl des Überstands wurden mit Hilfe der Extinktion bei 550 nm quantifiziert, wobei ein Perkin-Elmer 320-Raster-Spektrophotometer verwendet wurde. 100 Prozent Hämolyse wurde definiert als maximaler Anteil Hämolyse, erhalten mit dem Detergens Triton X-100. Das Hämolyse-Profil in 6 zeigt einen niedrigen Hämolysewert (unter 5% Prozent) für 2 mM 1-O-DPPC-Liposomen. 6 zeigt auch, daß niedrige Konzentrationen an ET-18-OCH₃ ein signifikantes Ausmaß an Hämolyse induzieren.
Beispiel 6
Verstärkung der Phospholipase A2-Aktivität durch polymergepfropfte 1-O-DPPC-Lipide
Unilamellare vollhydratisierte Liposomen mit einer engen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und 1-O-DPPC mit 5 oder 10 Mol-% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE PEG350) wie beschrieben in Beispiel 2. Die Assay-Bedingungen für die PLA₂-Verzögerungszeitmessungen waren: 0,15 mM unilamellare Liposomen, 150 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Zugabe von 8,9 μl einer 42 μM PLA2-Stammlösung zu 2,5 ml der thermostatisierten Liposomensuspension, die vor der Zugabe von PLA₂ 800 s bei 41°C äquilibriert worden war. Die verstrichene Zeit vor dem Einsetzen rascher enzymatischer Aktivität wird bestimmt durch eine abrupte Zunahme der Eigenfluoreszenz von PLA₂ bei 340 nm nach Anregung mit 285 nm. Die in 7 gezeigten Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der Verzögerungszeit bei Einbringen von 5 und 10 Mol-% 1-O-DPPE-PEG₃₅₀ in die 1-O-DPPC-Liposomen.
Beispiel 7
Herstellung von Mizellen, zusammengesetzt aus 1-O-DPPE-PEG350, DSPE-PEG750/DPPE-PEG750 und 1-O-DPPE-PEG2000
Mizellen wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE PEG350), Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-750] (DSPE-PEG750) oder 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (1-O-DPPE PEG2000). Kurz umrissen wurden abgewogene Mengen des polymerisierten Lipids in Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe eines leichten N₂-Stroms entfernt. Die Lipid-Filme wurden über Nacht unter niedrigem Druck getrocknet, um Spurenmengen des Lösungsmittels zu entfernen. Die Mizellen wurden hergestellt durch Dispergieren der getrockneten polymerisierten Lipide in einer Pufferlösung, enthaltend 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Beispiel 8
Permeabilitätserhöhung einer Modellzielmembran, gesteuert durch Phospholipase A2-Hydrolyse von Mizellen Multilamellare Ziel-Liposomen mit Modellmembran wurden hergestellt in Gegenwart von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch einstündiges Hydratisieren eines Films aus 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholinen (D-O-SPC) in HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 und 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur (T_m = 55°C). Unilamellare Liposomen wurden hergestellt durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei übereinandergestapelte 100 nm-Polycarbonat-Filter. Die einschichtigen Liposomen wurden rasch auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein-haltigen Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatographiesäule von freiem Calcein getrennt. Die Mizellen, zusammengesetzt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE PEG350), Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-750] (DSPE-PEG750) oder 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (1-O-DPPE PEG2000), wurden hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Calcein-Freisetzung aus dem Target wird bestimmt durch Messen der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm.
Die Konzentrationen von D-O-SPC und der polymerisierten Lipid-Mizellen beliefen sich auf 25 μM. Es wurde Schlangengift-PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) zugesetzt (25 nM), um die hydrolytische Reaktion einzuleiten, die zur sofortigen Bildung der Hydrolyseprodukte Polymer-Lyso-1-O-DPPE und entsprechende freie Fettsäure führte. Da aufgrund des Einbaus von Polymer-Lyso-1-O-DPPC, das keine Doppel schicht bildet, und Fettsäure in die Ziel-Lipidmembran Calcein aus den D-O-SPC-Liposomen freigesetzt wird, ist eine lineare Zunahme der Fluoreszenz bei 520 nm nach Anregung mit 492 nm zu beobachten, wenn das Calcein sich im umgebenden Puffermedium verdünnt, wie in 8 gezeigt ist. Der Prozentsatz des freigesetzten Calceins wird bestimmt wie in Beispiel 3 beschrieben. Die PLA₂-katalysierte Hydrolyse von 1-O-DPPE-PEG350 ergab die schnellste Freisetzungsgeschwindigkeit, während DPPE mit der längsten an der Kopfgruppe gebundenen Polymer-Kette (PEG2000) die langsamste Freisetzungsgeschwindigkeit ergab.
Beispiel 9
Hydrolyse von Mizellen, bestehend aus DSPE-PTG750
Die Hydrolyse von Mizellen aus DSPE-PEG750 wurde durch Analyse der erzeugten Menge an Stearinsäure verfolgt. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch Zugabe von 8,9 μl einer 42 μM PLA₂-Stammlösung (150 nM) zu 2,5 ml der thermostatisierten Mizellen-Lösung von DSPE-PEG750 (0,150 mM), die vor der Zugabe von PLA₂ 600 s bei 45°C äquilibriert worden war. Das charakteristische Verzögerungsschubverhalten von PLA₂ gegenüber den Mizellen zeigt sich durch eine abrupte Zunahme der Eigenfluoreszenz von PLA₂ bei 340 nm nach Anregung mit 285 nm, gefolgt von begleitender Abnahme der 90°-Lichtstreuung aus der Lipidsuspension (Hønger et al., Biochemistry 35, 9003–9006). Die Proben für die HPLC-Analyse der Menge an erzeugter Stearinsäure wurden vor der Zugabe von PLA₂ und 100 s nach der beobachteten Verzögerungszeit entnommen. Die HPLC-Chromatogramme in 9 zeigen die Menge der erzeugten Stearinsäure 100 s nach der beobachteten Verzögerungszeit (10 s) bei 45°C. Die Menge (0,156 mM) der durch Hydrolyse erzeugten Stearinsäure war gleich 100 Hydrolyse der DSPE-PEG750 Polymer-Lipide. Die HPLC-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung einer 5 μm Diol-Säule mit einer mobilen Phase aus Chloroform/Methanol/Wasser (730:230:30, Vol./Vol.) und eines Verdampfungslichtstreuungsdetektors (siehe Beispiel 2).
Beispiel 10
Modellbeispiele
Polymerbeschichtete Liposomen können aufgrund der langen vaskulären Zirkulationszeit und des passiven Targeting durch undichte Blutgefäße in erkranktem Gewebe als vielseitige Arzneimittelabgabesysteme fungieren. In den Beispielen hierin wird ein experimentelles Modellsystem beschrieben, das ein neues Prinzip zur verbesserten und programmierbaren Arzneimittelabgabe veranschaulicht, bei dem man sich die erhöhte Aktivität von extrazellulärer Phospholipase A2 am erkrankten Zielgewebe zunutze macht. Die Phospholipase A2 hydrolysiert einen Lipid-basierten Proenhancer im Träger-Liposom, unter Bildung von Lysophospholipid und freier Fettsäure, von denen gezeigt wird, daß sie mit Erhöhung der Permeabilität der Zielmembran synergistisch zu verstärkter Liposomendestabilisierung und gleichzeitiger Arzneimittel-Freisetzung führen. Das vorgeschlagene System kann temperaturempfindlich gemacht werden und bietet eine rationale Möglichkeit für die Entwicklung intelligenter Liposomenbasierter Arzneimittelabgabesysteme durch Einbringen von spezifischen Lipid-basierten Proenhancern, Prodestabilisatoren oder Prodrugs in den Träger, die nur an den erkrankten Zielorten, etwa entzündetem oder krebsbefallenem Gewebe, durch Phospholipase A2 automatisch aktiviert werden.
Arzneimittelabgabesysteme auf Basis von liposomalen Trägern im Bereich von 100 nm zählen zu den modernen therapeutischen Mikroträgersystemen, die so vielversprechend sind, daß sie der Verwirklichung der frühen Vision einer "Zauberkugel" von Paul Ehrlich zur Behandlung von Krankheiten recht nahekommen. Liposomen aus biokompatiblen nichttoxischen Phospholipiden liefern ein System zur wirkungsvollen Formulierung und Einkapselung von toxischen Arzneimitteln, mit dem sich das Immunsystem wirksam umgehen läßt.
Das Arzneimittel nimmt die veränderte Pharmakokinetik des liposomalen Trägers an und kann im Prinzip an das erkrankte Gewebe adressiert werden, indem eine Kombination aus physikochemischen und pathophysiologischen Faktoren an den Stellen des Liposomträgers bzw. der Zielmembran genutzt wird. Liposomen mit eingebrachten Glycolipiden oder Lipopolymeren wie etwa Polyethylenglycol(PEG)-Lipiden, bekannt als Liposomen, zeigen verbesserte Stabilität im vaskulären System, was möglicherweise auf den sterischen Schutz durch die Polymerbeschichtung zurückgeht. Die längere Zirkulationszeit dieser Liposomen, in Kombination, mit der erhöhten Gefäßporosität des erkrankten Gewebes, bildet die Basis für positive klinische Ergebnisse bei bestimmten Systemen, darunter Arzneimittel gegen Krebs wie z.B. Doxorubicin sowie antibakterielle und entzündungshemmende Arzneimittel.
Liposomen sind sich selbst organisierende Lipid-Systeme, und ihre Stabilität wird daher zu einem großen Teil durch unspezifische physikalische Wechselwirkungen gesteuert. Einblicke in die molekulare Steuerung der physikalischen Eigenschaften von Liposomen sind daher wichtig, um die liposomalen Eigenschaften in Verbindung mit speziellen Zwecken der Arzneimittelabgabe zu beeinflussen und maßzuschneidern. Beispielsweise wurde der thermisch induzierte Gel/Fluid-Lipidphasenübergang genutzt und optimiert, um Systeme zur erhöhten Freisetzung von Arzneimitteln aufgrund von Hyperthermie zu entwickeln. In neuerer Zeit wurden programmierbare fusogene PE-Liposomen aufgebaut, enthaltend das Antikrebsmittel Mitoxantron, wobei eine zeitverzögerte Freisetzung von doppelschichtstabilisierenden Lipiden der Liposomen angewandt wird, die sich durch Extravasation an den Tumororten anreichern. Es wäre wünschenswert, wenn man ein intelligentes und vielseitiges Arzneimittelabgabesystem entwickeln könnte, das einen doppelten virtuellen Auslösemechanismus der gleichzeitigen (i) erhöhten Arzneimittel-Freisetzung selektiv am Zielgewebe und (ii) erhöhten Transportierung des Arzneimittels in die erkrankten Zellen eingebaut hat. Dieses Prinzip ist schematisch in 11a dargestellt.
Mit den Beispielen hierin ist die Entwicklung eines einfachen und funktionstüchtigen experimentellen biophysikalischen Modellsystems beschrieben, das einen solchen Doppelmechanismus aufrechterhält, der an den pathologischen Zielstellen ausgelöst werden soll. Bei dem Modell wird erhöhte Aktivität extrazellulärer Phospholipase A2 an den erkrankten Stellen angenommen, wie es der Fall ist bei entzündetem oder krebsbefallenem Gewebe, wo die Menge der extrazellulären PLA₂ um ein Vielfaches vergrößert sein kann. Es wurde gezeigt, daß die Phospholipide der PEG-Liposomen bei Einwirkung extrazellulärer PLA₂ im Vergleich zu herkömmlichen nackten Liposomen verstärkt Hydrolyse eingehen. Dies führt zu Destabilisierung des Liposoms und erhöhter Freisetzung des eingekapselten Arzneimittels. Die Hydrolyseprodukte, d.h., Lysophospholipide und freie Fettsäuren, fungieren wiederum als Resorptionsverstärker für die Arzneimittelpermeation durch die Zielmembran. Somit verhalten sich die Phospholipide des Träger-Liposoms als Prodestabilisatoren am Ort des Trägers und als Proenhancer am Ort der Zielmembran. Die molekularen Details dieses Prinzips sind schematisch in 11b dargestellt.
Das experimentelle Modellsystem besteht aus einem polymerbeschichteten Liposom-Träger und einer Modellzielmembran. Der Träger ist ein einschichtiges Liposom mit 100 nm aus Dipalmitoylphosphatidylcholin-Lipiden (DPPC) mit 2,5 Mol-% Lipopolymer vom Typ Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) -PEG₂₀₀₀. Die Zielmembran ist ein weiteres Liposom aus 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycerophosphatidylcholin (D-O-SPC), ein Phospholipid, bei dem die Acyl-Verknüpfungen der Stearoyl-Ketten Ether-Bindungen sind. Im Gegensatz zu DPPC ist D-O-SPC gegenüber der PLA₂-katalysierten Hydrolyse inert und imitiert so die Stabilität einer intakten Zielzellenmembran gegen Abbau durch deren eigene Enzyme. Bei diesem experimentellen Test, der eine gleichzeitige wie auch getrennte Untersuchung der Wirkung von Destabilisatoren an den Träger-Liposomen und der Wirkung von Enhancern an der Zielmembran ermöglicht, wird ein wasserlösliches fluoreszierendes Calcein-Modellarzneimittel in einer selbstlöschenden Konzentration im Innern des nichthydrolysierbaren Ziel-Liposoms und nicht im Träger-Liposom eingeschlossen. Der erhöhte Spiegel extrazellulärer PLA₂ an der Zielmembran kann dann simuliert werden durch Zugabe extrazellulärer PLA₂, um die hydrolytische Reaktion in einer Suspension von Träger- und Ziel-Liposomen einzuleiten. Die Permeation von Calcein durch die D-O-SPC-Zielmembran wird anschließend anhand der Zunahme der Fluoreszenz verfolgt. Zur Untersuchung der Wirkung der Gegenwart von PEG-Lipiden im Träger-Liposom wurde ein ähnliches Experiment mit herkömmlichen nackten DPPC-Liposomen durchgeführt. Um die permeabilitätserhöhende Wirkung von Lysophospholipiden zu vergleichen und sie von der freier Fettsäuren zu unterscheiden, wurden Experimente ohne Enzyme durchgeführt, wobei die Lysophospholipide und die freien Fettsäuren den Ziel-Liposomen gleichzeitig oder getrennt zugesetzt wurden.
In 12a sind die Ergebnisse der Calcein-Freisetzung als Funktion der Zeit nach Zugabe von PLA₂ zum System gezeigt. Der Reaktionszeitverlauf der im einzelnen verwendeten PLA₂ hat ein charakteristisches Verzögerungsschubverhalten mit einer sogenannten Verzögerungszeit, die zweckmäßigerweise als Maß für die enzymatische Aktivität herangezogen werden kann. Eine starke Abnahme der Verzögerungszeit und beglei tende Erhöhung der Freisetzungsgeschwindigkeit wird beobachtet, wenn die Träger-Liposomen die Lipopolymere DPPE-PEG2000 enthalten, was in Übereinstimmung ist mit den vorherigen Befunden eines erhöhten Abbaus polymerbeschichteter Liposomen durch extrazelluläre PLA₂.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Produkte der PLA₂-katalysierten Hydrolyse der DPPC-Lipide des Trägers, Lysophospholipid und freie Fettsäure, die als 1:1-Mischung erzeugt werden, in die Zielmembran eingebaut werden und zu einer starken Zunahme der Membranpermeabilität führen. Diese Produkte, die sehr geringe Wasserlöslichkeit haben, sind dafür bekannt, daß sie aufgrund ihrer nichtzylindrischen Molekülformen ein Krümmungsstreßfeld in der Membran oder kleinere seitliche Phasentrennung induzieren, wodurch Membrandefekte und erhöhte Permeabilität hervorgerufen werden. Dies wird durch die Daten in 13 erhärtet, die zeigen, daß die getrennte Zugabe von Lysophospholipid oder Fettsäure zum vorliegenden Zielsystem in Abwesenheit von PLA₂ zu einer erhöhten Calcein-Freisetzungsgeschwindigkeit durch die Zielmembran führt. Der entscheidende Befund ist jedoch, daß bei gleichzeitiger Zugabe von Lysophospholipid und freier Fettsäure in einer 1:1-Mischung eine starke Erhöhung der Freisetzungsgeschwindigkeit zu beobachten ist, wie in 13 gezeigt. Dies läßt stark vermuten, daß die beiden Enhancer synergistisch wirken und so die einmalige Möglichkeit eröffnen, die PLA₂-katalysierte Hydrolyse für eine kombinierte Destabilisierung des Träger-Liposoms und Verstärkung des Arzneimittel-Transports durch die Zielmembran zu nutzen. Die synergistische Wirkung wird weiter durch die Tatsache erhöht, daß extrazelluläre PLA₂ durch ihre eigenen Hydrolyse-Produkte aktiviert wird, womit sich zeigt, daß die abbaubaren Phospholipide des Träger-Liposoms eine Art Proaktivator sind.
Es sei darauf hingewiesen, daß die Wirkung beim vorliegenden Arzneimittelabgabe-Modellsystem unter Verwendung von Lipiden als Proenhancer und Prodestabilisatoren über die Aktivität extrazellulärer PLA₂ dynamisch ist und sich auf eine eigene Zeitskala bezieht. Diese Zeitskala ist die effektive Retentionszeit der Träger-Liposomen in der Nähe der Zielmembran. Je schneller das Enzym aktiv wird, desto schneller ist die Arzneimittel-Freisetzung und desto größer die Arzneimittel-Resorption während der Zeit, in der der Träger in der Nähe des Targets verbleibt. Je schneller das Enzym arbeitet, desto schneller wird es zudem für die Hydrolyse anderer arzneimitteltragender Liposomen verfügbar, die sich der erkrankten Zielstelle nähern. Sobald feststeht, daß die Aktivität der extrazellulären PLA₂ zur Steuerung der Arzneimittel-Freisetzung verwendet werden kann, eröffnen sich mehrere rationale Möglichkeiten für intelligente Verbesserungen des vorgeschlagenen Arzneimittelabgabesystems durch Anwendung bekannter Mechanismen zur Änderung der Aktivität extrazellulärer PLA₂ durch Beeinflussung der physikalischen Eigenschaften der Lipid-Doppelschicht, für die das Enzym bekanntermaßen empfindlich ist. Die Strategie besteht demnach darin, bestimmte physikalische Eigenschaften der Träger-Liposomen zu modifizieren, ohne ihr vaskuläre Zirkulationszeit signifikant zu verändern. Wir erläutern dieses allgemeine Prinzip durch Aufzeigen der Auswirkungen eines physikochemischen Faktors, der Lipid-Zusammensetzung des Trägers, sowie eines (thermodynamischen) Umgebungsfaktors, der lokalen Temperatur am Zielort.
Kurzkettige Phospholipide wie etwa Didecanoylphosphatidylcholin (DCPC) aktivieren extrazelluläre PLA₂. Die Wirkung auf die Calcein-Permeation durch die Zielmembranen, induziert durch Einbringen einer kleinen Menge DCPC in die Träger-PEG-Liposomen, ist ebenfalls in 12a gezeigt. Aufgrund der nahezu sofortigen Aktivierung des Enzyms erfolgt die Freisetzung sehr schnell. Wir haben des weiteren gefun den, daß extrazelluläre PLA₂ deaktiviert wird (Daten nicht gezeigt), wenn eine große Menge Cholesterin (≈20 Mol-%) in die Liposomen eingebracht wird. Im Gegensatz dazu fanden wir, daß eine kleine Menge Cholesterin (≈3 Mol-%) extrazelluläre PLA₂ aktiviert. Diese signifikanten Befunde sind von besonderem Interesse, da berichtet wird, daß die Blutzirkulationszeit von PEG-Liposomen ohne Cholesterin nahezu die gleiche ist wie die mit großen Mengen Cholesterin.
Die Temperatur hat bekanntlich dramatische und in hohem Maße nichtlineare Wirkung auf die Aktivierung extrazellulärer PLA₂ in der Region des Gel/Fluid-Phasenübergangs von gesättigten Phospholipid-Doppelschichten. Diese Wirkung wird nicht durch Veränderungen im Enzym, sondern durch dramatische laterale strukturelle Veränderungen in der Lipid-Doppelschicht hervorgerufen. Dieser Effekt läßt sich mit Vorteil für das vorliegende Arzneimittelabgabesystem nutzen, wie die Daten in 12b nahelegen. Nähert sich die Temperatur der Übergangstemperatur bei 41°C, so erhöht sich die Calcein-Freisetzungsgeschwindigkeit zunehmend – quantifiziert durch die Zeit bei 50%-Calcein-Freisetzung, t_50%, gezeigt im Einschub zu 12b. Es wurde bereits vorgeschlagen, daß eine Hyperthermie zur Verbesserung der Arzneimittel-Freisetzung genutzt werden könnte, und daß eine lokale Erwärmung an vordefinierten Tumor-Bereichen dazu genutzt werden könnte, die arzneimitteltragenden Liposomen durch Nutzung der erhöhten Durchlässigkeit der Liposomen an ihrem Phasenübergang lokal zu destabilisieren. Bei dem neuen, hier vorgeschlagenen Modell-Arzneimittelabgabesystem sind diese Möglichkeiten der Thermosensitivität integriert und werden über die Thermosensitivität der extrazellulären PLA₂ gegenüber den physikalischen Eigenschaften des Träger-Liposoms voll genutzt. Im Gegensatz zu. dem Fall, wo die thermische Wirkung nur durch lokale Temperaturerhöhung unter Verwendung externer Heizquellen an einem vorbestimmten Tumorort minimaler Größe erreicht wird, wird die PLA₂- gesteuerte Freisetzung überall dort erhöht, wo die Temperatur und die Konzentration der extrazellulären PLA₂ erhöht werden, z.B. in entzündetem Gewebe, ungeachtet der Größe der erkrankten Region, und ohne daß eine vorhergehende Lokalisierung des erkrankten Gewebes erforderlich wäre.
DPPC, DCPC, D-O-SPC und DPPE-PEG₂₀₀₀ wurden von Avanti Polar Lipids bezogen. Das DPPE-PEG₂₀₀₀-Lipopolymer enthält 45 Monomere in der PEG-Polymerkette. Die gereinigte PLA₂ aus Schlangengift (Agkistrodon piscivorus piscivorus) war ein großzügiges Geschenk von Dr. R.L. Biltonen. Dieses PLA₂-Enzym gehört zur Klasse der niedermolekularen 14 kD-Sekretionsenzyme, die strukturelle Ähnlichkeit mit menschlicher extrazellulärer Phospholipase A2 aufweisen. Multilamellare Target-Liposomen in Gegenwart von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM wurden hergestellt durch einstündiges Hydratisieren eines Films aus D-O-SPC in HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 und 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur T_m = 55°C. Unilamellare Liposomen wurden hergestellt durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei übereinandergestapelte 100 nm-Polycarbonat-Filter. Die einschichtigen Liposomen wurden rasch auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calceinhaltigen Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatographiesäule von freiem Calcein getrennt. Die unilamellaren Träger-Liposomen aus DPPC, DCPC und DPPE-PEG₂₀₀₀ wurden in ähnlicher Weise hergestellt (T_m = 41°C). Die Calcein-Freisetzung aus den Target-Liposomen wird bestimmt durch Messen der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Anregung bei 492 nm. Alle Messungen wurden bei Temperaturen durchgeführt, wo die Lipide der Träger- wie auch der Target-Liposomen im Gel-Zustand vorliegen.
Beispiel 11
Test zur Phospholipase A2-konzentrationsabhängigen Freisetzung
Multilamellare 1-O-DPPC-Liposomen mit 10 Mol-% 1-O-DPPE-PEG350 wurden hergestellt in Gegenwart von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM durch einstündiges Hydratisieren eines Films aus 90% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und 10% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] in HEPES-Pufferlösung bei pH = 7,5 und 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur. Unilamellare Liposomen wurden hergestellt durch zehnmaliges Extrudieren der multilamellaren Liposomen durch zwei übereinandergestapelte 100 nm-Polycarbonat-Filter. Die einschichtigen Liposomen wurden rasch auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die Calcein-haltigen Liposomen wurden unter Verwendung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatographiesäule von freiem Calcein getrennt.
Die Assay-Bedingungen für die PLA₂-induzierte Calcein-Freisetzung waren: 25 μM unilamellare 1-O-DPPC-Liposomen, 50,1 und 0,02 nM PLA₂, 150 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. PLA₂ wurde zu 2,5 ml thermostatisierter Mizellen-Lösung gegeben, die vor der Zugabe von PLA₂ wenigstens 300 s bei 35,5°C äquilibriert worden war. Der Prozentsatz an freigesetztem Calcein wird bestimmt als: % Freisetzung = 100 (I_F(t) – I_B)/(I_T – I_B), worin I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zur Zeit t nach Zugabe des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist und I_T die gesamte Fluoreszenz ist, gemessen nach Zugabe von Triton X-100, was zu vollständiger Freisetzung von Calcein durch Aufbrechen der 1-O-DPPC-Liposomen führt. 14 zeigt, daß die induzierte Freisetzung von Calcein am langsamsten war, wenn nur 0,02 nM PLA₂ der Liposomensuspension zugesetzt wurde.
Beispiel 12
Fluoreszenz-Messungen der Aktivität extrazellulärer PLA₂ an MCF-7- und Lewis-Lungenkrebs-Zellinien
Zellkultivierung: Die Zellinien werden kultiviert in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% Kalbfötenserum in 5% Kohlendioxid. Die Zellinien werden in 20 ml Medium in einem Kulturkolben (Typ navn og) gezogen. Kulturproben werden entnommen, wenn die Zelldichte eine Konfluenzdichte von 1·10⁷ Zellen erreicht, und bis zur Analyse bei –80°C aufbewahrt. Die Kulturproben werden 10 min bei 2000 × g zentrifugiert, und die Aktivität der extrazellulären PLA₂ in den Überständen wird mit Hilfe von Fluoreszenztechniken gemessen wie in Beispiel 3 und 11 beschrieben.
Beispiel 13
Assay zur Wachstumshemmung
Der Wachstumshemmungstest wird durchgeführt zur Bestimmung des GI₅₀-Parameters (die Konzentration eines Arzneimittels, die das Zellwachstum zu 50% hemmt), wobei ein Sulforhodamin B(SRB)-Assay angewandt wird wie beschrieben von Peters et al. in Lipids 32, (1997). Zellinien, die extrazelluläre Phospholipase A2 exprimieren, werden wie in Beispiel 12 beschrieben vermehrt in PRMI 1640-Medium mit L-Glutamin, ergänzt mit 10% Rinderfötenserum. 100 μl der Zellen werden in 96-Mulden-Mikrotiterplatten überführt und 24 Stunden bei 37°C, 100%° Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ inkubiert. Medium (100 μl) wird mit "Zeit null" gekennzeichneten Platten zugesetzt, die mit 50 μl 50% Trichloressigsäure (Gew./Vol.) oder 80% Trichloressigsäure fixiert werden (Suspensionszel len). Der Überstand wird dann verworfen, und die Platten werden mit Wasser gespült und an der Luft getrocknet. 1-O-DPPC-Liposomen, 1-O-DPPC-Liposomen mit 10% eingebrachtem 1-O-DPPE-PEG350 und ET-18-OCH₃ werden den nichtfixierten Platten mit der doppelten vorbestimmten Höchstkonzentration zugesetzt und über die Platten reihenverdünnt. Die Mulden mit Wachstumskontrolle werden mit 100 μl Medium versetzt. Die Zellen werden 72 Stunden unter den obigen Bedingungen inkubiert. Die behandelten Platten werden säurefixiert und wie oben gespült und getrocknet. 100 μl 0,4% SRB in 1% Essigsäure werden den Platten zugesetzt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nichtgebundene Färbung wird durch Spülen der Platten mit 1% Essigsäure entfernt. Die Platten werden luftgetrocknet, die gebundene Färbung wird mit 100 μl 10 mM Tris-Puffer löslich gemacht, und die optische Dichte wird spektrophotometrisch bei 490 nm abgelesen. Das prozentuale Wachstum wird berechnet als: (T-T₀)/(C-T₀)·100, worin T = mittlere optische Dichte behandelter Mulden mit gegebener Arzneimittel-Konzentration, T₀ = mittlere optische Dichte der Zeit null-Mulden, und C = mittlere optische Dichte der Kontroll-Mulden. Ist T < T₀, was bedeutet, daß Zelltod eingetreten ist, so wird der prozentuale Zelltod berechnet als (T-T₀)/(T₀)·100. Durch verändern der Arzneimittel-Konzentration lassen sich Dosis-Wirkungs-Kurven erstellen, und die GI₅₀-Werte können berechnet werden.
Beispiel 14
Tierstudien
Studien zur maximal verträglichen Dosis (MTD) werden durchgeführt wie beschrieben bei Ahmad et al., Cancer Res. 57 (1997). Gruppen weiblicher C57/BL6-Mäuse (5/Gruppe; Gewicht: 18–22 g) erhalten verschiedene Dosen 1-O-DPPC-Liposomen (25–600 mg/kg), 1-O-DPPC-Liposomen mit 10% einge brachtem 1-O-DPPE-PEG350 (25–600 mg/kg) und ET-18-OCH₃ (12,5–100 mg/kg) in PBS injiziert.
Für Mehrfachdosenstudien werden 25–300 mg/kg 1-O-DPPC-Liposomen, 25–300 mg/kg 1-O-DPPC-Liposomen mit 10% eingebrachtem 1-O-DPPE-PEG350 und 12,5–75 mg/kg ET-18-OCH₃ fünf aufeinanderfolgende Tage lang i.v. verabreicht. Die Mäuse werden dreimal wöchentlich gewogen, und die Mortalität wird täglich aufgezeichnet. Die Versuche werden 1 Monat nach der ersten Behandlung beendet, und die MTD wird bestimmt.
In vivo-Antikrebsstudien werden durchgeführt an immundefekten Nacktmäusen (z.B. weibliche NMRI nu/nu-Mäuse), die mit Tumor-Zellinien geimpft werden, ausgewählt auf Grundlage der Ergebnisse früherer in vivo-Experimente. Auf der Grundlage von Literaturstudien (Ahmad I. et al., Cancer Research 1997, 57, 1915–1921) könnten zu den relevanten Zellinien möglicherweise Lewis-Lungenkrebs- (LLC), B16/F10-Melanom- und P388-Leukämie-Zellen gehören.
Jedes Experiment umfaßt zwischen 30 und 60 Mäuse, die in Scantainern (oder ähnlichem) unter halbsterilen Bedingungen gehalten werden. Nach der Impfung läßt man die Tumoren 4–12 Tage wachsen (je nach Tumortyp) oder bis zur Meßbarkeit. Die Tiere werden dann mit Hilfe eines Verfahrens in Gruppen zu 10 geteilt, mit dem sichergestellt ist, daß die Tumorbeladung zwischen den Gruppen vergleichbar ist. Die Tiere erhalten eine Behandlung entweder mit dem Lysoetherlipid, Etherlipid oder einer negativen Kontrolle über einen Zeitraum von 3–8 Wochen, je nach untersuchtem Tumortyp. Zur Untersuchung verschiedener Dosen an Lysoetherlipid bzw. Etherlipid können weitere Tiergruppen mit dazugenommen werden. Alle Medikamente werden nach einem Dosierregime, das auf der Grundlage früherer pharmakokinetischer Experimente entschieden wird, i.v. oder i.p. verabreicht.
Die Bewertung der Antikrebswirkung kann das Zählen von Primärtumoren (wie bei den Modellen B16/F10 und LLC), die Messung der Tumorgröße in 2 senkrechten Winkeln (bei subkutanen festen Tumoren, falls solche Modelle eingesetzt werden) und die Überlebensbewertung (beim P388-Modell) umfassen.
Die Versuche zur Antikrebswirkung umfassen auch die Verwendung von Lewis-Lungenkrebszellen (LLC), die i.m. injiziert werden. Dieser schnell wachsende Tumor metastasiert von den i.m.-Tumoren zur Lunge, und es werden Versuche durchgeführt, um die Wirkung von Lipidderivat-Liposomen, Etherlipid und ET-18-OCH₃ auf die spontane Lungenmetastasen-Entwicklung zu bestimmen.
Das Körpergewicht (als Maß für die Toxizität) wird vor, während und am Ende des Experiments aufgezeichnet. Daneben werden die Mäuse Tag für Tag auf etwaige ungünstige klinische Reaktionen beobachtet.
Zur Untersuchung des Hämolysegrads wird am Ende der Behandlung Blut durch Herzpunktion entnommen.
Je nach Art der aufgezeichneten Daten werden zum Vergleich der Gruppen geeignete statistische Methoden herangezogen.
Pharmakokinetische Studien unter Verwendung von z.B. radiomarkierten Lipidderivat-Liposomen werden durchgeführt an gesunden Tiere sowie an Tieren, die verschiedene Tumorarten injiziert erhalten, die extrazelluläre Phospholipase A2 in hohen Mengen exprimieren, z.B. Brustkrebs, Genitaltumoren, Magentumoren (Yamashita et at. Br. J. Cancer (1994) 6, 1166; Kallajoki et al. Prostate (1998) 35, 263; Yamashita et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (994) 198, 878; Abe et al. Inj. J. Cancer (1997) 74, 245). Die Blutzirkülationszeit und Gewebeverteilung von PEGylierten Lipidderivat-Liposomen wird bestimmt. Auch die Fähigkeit der lange zir kulierenden Lipidderivat-Liposomen, durch undichte Kapillaren auszutreten und sich in den Tumoren anzureichern, wo sich die Lipid-Derivate aufgrund der durch extrazelluläre Phospholipase A2 katalysierten Hydrolyse in Etherlipide umwandeln, wird z.B. mit Hilfe von (doppelt) radioaktiv markierten Lipid-Derivaten untersucht.
Beispiel 15
Klinische Studien
Frühklinische Studien werden an Patienten mit fortgeschrittenem Krebs durchgeführt (die Krebsart ist zu bestimmen auf Grundlage der bei den in vivo-Tierstudien erhaltenen Ergebnisse). Die "Notes for Guidance in Evaluation of Anticancer Medicinal Products in Man, The European Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA), 1996, oder nachfolgende Aktualisierungen werden beachtet. Die erste Studie bewertet Sicherheit, Wirksamkeit und pharmakokinetische Parameter bei Verabreichung von Einzeldosen sowie wiederholten Dosen. Angewandt wird ein modifiziertes Fibronacci-Regime (Simon R. et al., Journal of the National Cancer Institute 1997, 89, 1138–1147). Falls möglich, wird auch die Auswahl geeigneter Patienten auf der Grundlage eines früheren immunhistochemischen Nachweises hoher mPLA-2-Spiegel in Tumor-Proben berücksichtigt.
Beispiel 16
In vivo-Hämolyse
Assay
Mäusegruppen (n = 5/Gruppe, Gewicht 18–22 g) wurden i.v. behandelt mit Puffer (PBS), ET-18-OCH₃ (50 mg/kg) und Liposomen, bestehend aus 1-O-DPPC mit 5 Mol-% 1-O-DPPE-PEG2000 (68,7 und 137,5 mg/kg). 30 min nach der Injektion wurden 100 μl Blut direkt aus dekapitierten CO₂-anästhetisierten Mäusen in heparinisierten Röhrchen aufgefangen. Das Blut wurde 10 min mit 500 × g zentrifugiert, und das Plasma wurde abgetrennt und bis zur Analyse bei –20°C aufbewahrt.
Der Hämolysegrad wurde gemessen anhand der Extinktion bei 550 nm unter Verwendung eines Perkin-Elmer 320-Raster-Spektrophotometers. 25 μl Plasma wurden mit 2,5 ml PBS oder 2,5 ml 10% Triton X-100 gemischt. 100% Hämolyse wurde definiert als maximales Ausmaß der Hämolyse, erhalten aus dem Plasma PBS-behandelter Mäuse, das mit 10% Triton X-100 gemischt wurde, und 0% als Plasma von PBS-behandelten Mäusen, das mit PBS gemischt wurde.
Das Hämolyse-Profil in Tabelle 2 zeigt einen niedrigen Hämolyse-Wert für die Mäuse, die mit 2 mM Liposomen aus 1-O-DPPC mit 5 Mol-% 1-O-DPPE-PEG2000 behandelt worden waren. Die mit ET-18-OCH₃ behandelten Mäuse verstarben innerhalb eines Zeitraums von 30 Minuten.
Tabelle 2. Prozentuale Hämolyse ±-Standardfehler nach 30 min sowie Anzahl der überlebenden Mäuse in jeder Gruppe.

Claims

Lipid-basiertes Arzneimittelabgabesystem zur Verabreichung eines Arzneimittelwirkstoffs, der ausgewählt ist aus Lysolipid-Derivaten, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Prodrugs im Lipid-basierten System vorliegt, wobei das Prodrug ein Lipid-Derivat ist, das (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen und einen organischen Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen sowie (b) eine hydrophile Einheit aufweist, wobei das Prodrug zudem insoweit ein Substrat für extrazelluläre Phospholipase A2 ist, als der organische Rest hydrolytisch abgespalten werden kann, wohingegen die aliphatische Gruppe im wesentlichen nicht angegriffen wird, wobei der Arzneimittelwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, wobei das System Lipopolymere oder Glycolipide enthält, so daß hydrophile Ketten an der Oberfläche des Systems vorliegen.
Arzneimittelabgabesystem nach Anspruch 1, wobei die Lipopolymere oder Glycolipide von einem Teil des Lipid-Derivats verkörpert werden.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Polymer des Lipopolymers ausgewählt ist aus Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacryla mid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierten Cellulosen.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der organische Rest, der hydrolytisch abgespalten werden kann, ein Hilfsarzneistoff oder ein Wirksamkeitsmodifikator für den Arzneimittelwirkstoff ist.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Prodrug ein Lipid-Derivat der folgenden Formel ist:
worin X und Z unabhängig voneinander ausgewählt sind aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂; Y -OC(O)- ist, wobei Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist; R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist; R² ein organischer Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen ist; worin Y¹ – (CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9 ist und die Summe n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist, und n9 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; n2, n4, n6 und n8 jeweils unabhängig voneinander null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei Y¹, Y² jeweils unabhängig von einander mit Halogen oder C₁-C₄-Alkyl substituiert sein können; R³ ausgewählt ist aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten von Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben.
Arzneimittelabgabesystem nach Anspruch 5, wobei R² eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen ist.
Arzneimittelabgabesystem nach Anspruch 6, wobei R² eine Gruppe der Formel Y¹Y² ist.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei wenigstens ein Teil des Prodrugs die in den Ansprüchen 5 bis 7 definierte Formel hat, worin R³ ein Phosphatidsäure-Derivat ist, an das ein Polymer, das ausgewählt ist aus Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierten Cellulosen, covalent gebunden ist.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Prodrug 15 bis 100 Mol% des gesamten dehydratisierten Lipid-basierten Systems ausmacht.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Lipopolymer 1 bis 50 Mol% des gesamten dehydratisierten Systems ausmacht.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Lipid-basierte System in Form von Liposomen vorliegt.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, das in Form von Liposomen vorliegt, in die ein zweiter Arzneistoff eingebracht ist.
Arzneimittelabgabesystem nach Anspruch 1 zur Verabreichung eines zweiten Arzneistoffs, wobei der zweite Arzneistoff in das System eingebracht ist.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 13, wobei der organische Rest, der hydrolytisch abgespalten werden kann, ein Hilfsarzneistoff oder ein Wirksamkeitsmodifikator für den zweiten Arzneistoff ist.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der zweite Arzneistoff eine therapeutisch und/oder prophylaktisch wirksame Substanz ist, ausgewählt aus (i) Antitumormitteln, (ii) Antibiotika und Antimykotika und (iii) entzündungshemmenden Mitteln.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Arzneimittelabgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Arzneimittelabgabesystems nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit einer lokalen Zunahme der Aktivität extrazellulärer Phospholipase A2 in Säugergewebe verbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Erkrankungen oder Zustände ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus entzündlichen Zuständen und Krebs.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Krebsart ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Eierstockkrebs, Leukämie, Lymphom, Sarkom und Karzinom.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 20, wobei die Zunahme der Aktivität extrazellulärer Phospholipase A2 wenigstens 25% im Vergleich zum normalen Aktivitätsniveau im fraglichen Gewebe beträgt.
Lipid-Derivat der folgenden Formel:
worin X und Z unabhängig voneinander ausgewählt sind aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂; Y -OC(O)- ist, wobei Y dann entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist; R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist; R² ein organischer Rest mit wenigstens 7 Kohlenstoff-Atomen ist; worin Y¹ -(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9 ist und die Summe n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine ganze Zahl von 9 bis 29 ist; n1 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 29 ist, n3 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, n5 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17 ist, n7 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14 ist, und n9 null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 ist; n2, n4, n6 und n8 jeweils unabhängig voneinander null oder 1 sind; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei Y¹, Y² jeweils unabhängig voneinander mit Halogen oder C_l-C₄-Alkyl substituiert sein können; R³ ausgewählt ist aus Derivaten der Phosphatidsäure, an die ein hydrophiles Polymer gebunden ist.
Lipid-Derivat nach Anspruch 22, wobei das hydrophile Polymer ausgewählt ist aus Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polymilchsäure-Polyglycolsäure-Copolymeren, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethoxazolin, Polyethyloxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacrylamid und derivatisierten Cellulosen.
Lipid-Derivat nach einem der Ansprüche 22 bis 23, wobei X und Z O sind.
Lipid-Derivat nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei X und Z O sind, R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Alkyl-Gruppen (CH₂)_nCH₃, worin n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29 ist; Y -OC(O)- ist, wobei Y dann über das Carbonyl-Kohlenstoffatom an R² gebunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Lipid-Derivat nach einem der Ansprüche 22 bis 25 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Lipid-Derivat in Form eines Liposoms oder einer Mizelle dispergiert ist.
Lipid-Derivat wie definiert in einem der Ansprüche 22 bis 25 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 22 bis 25 definierten Lipid-Derivats zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit einer lokalen Zunahme der Aktivität extrazellulärer Phospholipase A2 in Säugergewebe verbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Erkrankungen oder Zustände ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus entzündlichen Zuständen und Krebs.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Krebsart ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Eierstockkrebs, Leukämie, Lymphom, Sarkom und Karzinom.