DE60038624T2

DE60038624T2 - Methoden zur behandlung von festen tumoren und metastasen mit gentherapie

Info

Publication number: DE60038624T2
Application number: DE60038624T
Authority: DE
Inventors: Carlos Estuardo Aguilar-Cordova
Original assignee: AQUILAR-CORDOVA CARLOS
Current assignee: AQUILAR-CORDOVA CARLOS
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 2000-10-07
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2020-10-08
Also published as: JP2003528813A; WO2001024684A3; EP1223952A4; JP5557974B2; AU7862600A; WO2001024684A2; ATE392210T1; CA2386374A1; JP2012001566A; EP1223952B1; EP1223952A2; DE60038624D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Krebstherapie und insbesondere auf Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von festen Tumoren und Metastasen unter Einsatz von Vektorkonstrukten, Podrug aktivierender Technologie, immunstimulierenden Konstrukten und deren Verwendung auf eine Weise, die mit klinischen Behandlungsstandards kompatibel ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
VERBREITUNG VON KREBS
Krebs betrifft Millionen von Menschen. Krebs ist die zweitgrößte Todesursache und verantwortlich für ein Fünftel der Gesamtsterblichkeit in den Vereinigten Staaten. Es gibt viele verschiedene Arten, wie primäre und Metastasen bildende Arten. Nachfolgend werden einige der für die USA prognostizierten Krankheits- und Mortalitätsziffern angegeben (S. H. Landis, T. Murray, S. Golden und P. A. Wingo, CA Cancer J. Clin. 49: 8-31, 1999).
Schätzungsweise gibt es 1999 1.221.800 neue Krebserkrankungen. Schätzungsweise gibt es 623.800 neue Krankheitsfälle bei Männern und 598000 neue Krankheitsfälle bei Frauen. Es wird 270.000 Tumore der Geschlechtsorgane (Gebärmutterhals, Gebärmutter, Eierstock, Vulva, Vagina, Prostata, Hoden und weitere), 226.000 Tumore des Verdauungstrakts (Speiseröhre, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Rektum, Anus, Bauchspeicheldrüse, Leber und weitere) und 180.000 neu diagnostizierte Brustkrebsfälle geben. Weitere Tumore, die auf den Rest der neu diagnostizierten Krebserkrankungen entfallen, betreffen das Harnsystem (86.500), Lymphknoten (64.000), Atemwegssystem (187.600), das Hirn und übrige Nervensystem (17.000), die Haut (54.000). Nichtfeste Tumore (Leukämie) sind lediglich für 30000 der neu diagnostizierten Tumore verantwortlich.
Es wird angenommen, dass es 1999 560.000 Todesfälle aufgrund von Krebserkrankungen in den USA gibt (290.000 Männer und 270.000 Frauen). Bei den Frauen betreffen davon schätzungsweise 61.000 den Verdauungstrakt, 69.000 die Atemwege (am häufigsten die Lunge), 43.000 Brustkrebs und der Rest der 270.000 Fälle betrifft andere feste Tumore. Nichtfeste Tumore werden für 9.700 Todesfälle aufgrund von Krebs verantwortlich sein. Bei den Männern werden schätzungsweise 70.000 Todesfälle auf Tumore des Verdauungstrakts, 95.000 auf Tumore der Atemwege (am häufigsten Lunge), 37.000 auf Prostatakrebs und der Rest der 290.000 auf andere Tumore entfallen. Lediglich 12.000 der geschätzten Krebstodesfälle werden von nichtfesten Tumoren verursacht.
Ein Großteil der Krebstodesfälle wird durch die systemische Metastasen bildende Wirkung dieser Krankheit verursacht. Metastasierung ist das Wachstum von Tumorzellen außerhalb des ursprünglichen Entstehungsortes. Es ist nicht ungewöhnlich, dass einige Krebspatienten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose unentdeckte Metastasen aufweisen. Dies wird manchmal als Mikrometastasenbildung bezeichnet.
AKTUELLE THERAPIEN
Charakteristisch für Krebs ist die unkontrollierte Teilung einer Zellpopulation. Diese unkontrollierte Teilung führt typischerweise zur Ausbildung eines Tumors, der dann in andere Bereiche streut.
Die aktuellen Krebstherapien können in vier Kategorien unterteilt werden: chirurgische Behandlung, Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie.
Die chirurgische Onkologie kann weiter in drei unterschiedliche Bereiche unterteilt werden: kurativ, Tumormassenverkleinerung und palliativ. Das Hauptziel der Chirurgie ist die vollständige Entfernung des Tumors und die Erzielung von „sauberen" chirurgischen Grenzen. Häufig ist es aufgrund der Lage oder aufgrund einer lokalen Invasion in das umgebende normale Gewebe nicht möglich, den Tumor vollständig herauszuschneiden. Beispiele hierfür sind Tumore, die lokal in Nervenwurzeln, Muskeln oder Knochen eingedrungen sind. Die Operation ist die einzige erforderliche Therapie für Tumore, die in einem frühen Stadium diagnostiziert worden sind, die noch nicht über den Blutstrom oder das Lymphsystem metastasiert haben oder in empfindliches oder nicht zugängliches Gewebe eingedrungen sind. Obwohl auch in diesen Situationen eine zusätzliche Therapie angezeigt sein kann. Beispielsweise erhalten Frauen, an denen eine Brust erhaltende Operation durchgeführt worden ist, oftmals nach der Operation eine Bestrahlung, um das Wiederauftreten zu verhindern. Es ist eine sorgfältige Stadienbewertung erforderlich, bevor ein Patient allein durch Operation als geheilt angesehen werden kann. Diese Stadieneinteilung wird durchgeführt, um zu zeigen, dass keine Streuung der Erkrankung stattgefunden hat. Selbst danach erkranken viele dieser Patienten wieder, nachdem eine vollständige Tumorentfernung angenommen worden war. Die Chirurgie wird zudem zur Tumormassenverkleinerung eingesetzt, wobei der Tumor mittels Chemotherapie, Strahlentherapie oder mit Chemotherapie und Bestrahlung weiter inhibiert worden ist oder werden wird. Der Grund, weshalb zuerst eine Bestrahlung und Chemotherapie durchgeführt wird, ist, dass der Tumor anfangs zu groß für eine Entfernung sein kann und daher eingeschränkt werden muss bevor eindeutige chirurgische Grenzen erzielt werden können. Die andere Rolle der Chirurgie betrifft die Palliativoperation (Linderung von Symptomen). Sie wird nicht mit dem Ziel der Heilung eingesetzt, sondern lediglich zur Linderung der Beschwerden angebotenen. Ein Beispiel für eine palliative onkologische Operation ist ein Patient, der eine Erkrankung hat, durch die das Rückenmark gequetscht wird und der Tumor entfernt wird, um den Schmerz und neurologische Defizite zu lindern. Kurzgesagt, die Chirurgie behandelt den Krebs, indem sie ihn entfernt.
Therapie durch Bestrahlung wird bei ungefähr 50% der Krebspatienten eingesetzt. Die Bestrahlung wird mit kurativem, adjuvanten oder palliativem Ziel eingesetzt. Es gibt einige Krebsarten, die durch die Bestrahlung allein geheilt werden können. Die Gruppe von Patienten, die von einer Monotherapie durch Bestrahlung profitieren kann, sind diejenigen, die vollständig klassifiziert worden sind und bei denen eine lokale oder lokal-regionale Erkrankung festgestellt worden ist.
Wie der Chirurg das Skalpell benutzt der Radiologe die Strahlung um Krebszellen durch physikalische Schädigung wie Bruch des DNA- Doppelstranges der Zelle zu zerstören. Die Strahlung kann in hohen Dosen, niederen Dosen, kurzzeitig oder langfristig erzeugt werden. Die Quellen können radioaktive Keime, radioaktive Proben oder externe Strahlung wie hochenergetische Röntgenstrahlen, die durch ein Gerät erzeugt werden, das Linearbeschleuniger genannt wird, sein. Krebsarten, die in manchen Fällen allein durch Bestrahlung geheilt werden können, umfassen Prostatakrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Zervikalkrebs, Gehirntumore und weitere Krebsarten. Wie bei allen anderen Krebstherapien, gibt es jedoch viele Patienten, die wieder erkranken.
Am häufigsten wird die Strahlentherapie als adjuvante Maßnahme eingesetzt. Die Bestrahlung kann entweder vor oder nach dem chirurgischen Eingriff oder der Chemotherapie erfolgen. Beispiele hierfür umfassen Patienten mit Brustkrebs, die eine Bestrahlung nach einer Brust erhaltenden Operation erhalten, oder Patienten mit Hals- und Nackenkrebs, der chirurgisch entfernt worden ist und bei dem ein hohes Risiko eines lokalen Wiederauftretens besteht, oder ein Patient mit nicht eindeutigen chirurgischen Grenzen. Dieselbe Wechselwirkung kann mit der Chemotherapie erzielt werden. Beispielsweise wenn ein Tumor mittels Chemotherapie geschrumpft worden ist und Bestrahlung eingesetzt wird, um verbleibende Krebszellen, die durch die Chemotherapie nicht zerstört worden sind, vollständig auszurotten, oder wenn sich Bestrahlung und Chemotherapie gegenseitig sensibilisieren, zum Beispiel mit 5-Fluoruracil.
Die andere Weise, in der die Bestrahlung eingesetzt wird, ist die palliative Behandlung, bei der sie Knochenschmerzen oder neurologische Symptome aufgrund einer Hirn- oder Rückenmarkkompression lindern kann.
Die Wirkung der Chemotherapie beruht auf den Eingriff in verschiedene Phasen der Zellzyklen oder eine Intercalation mit der DNA der Krebszellen. Wie die anderen Methoden wird sie kurativ, adjuvant in Kombination mit Bestrahlung oder palliativ eingesetzt. Die Art der Durchführung der Chemotherapie hängt vom Krankheitsort und pathologischen Subtyp ab. Die Chemotherapie wird systemisch eingesetzt und wirkt auf Krebszellen im ganzen Körper. Dieser systemische Effekt unterscheidet sie von der Bestrahlung und Chirurgie, die die Krebszellen nur am Ort der Behandlung zerstören. Chemotherapeutische Mittel werden häufig im Rahmen von Multiarzneimittelbehandlungen verabreicht, um die verschiedenen Wirkweisen der Medikamente auszunutzen und um die Vermehrung von gegen einzelne Arzneimittel resistente Mutantenzellen zu verhindern.
Die Chemotherapie zeigte gute heilende Resultate bei Patienten mit Hodenkrebs und mit Lymphoma. Häufiger wird die Chemotherapie adjuvant in Verbindung mit der Chirurgie, Bestrahlung oder beiden eingesetzt. Beispielsweise erfolgt eine Chemotherapie vor der Bestrahlung bei Patienten mit Lungenkrebs vom small-cell Typ, Blasenkarzinom, Kopf- und Halskrebs und Hodgkins Lymphom. Sie wird zusammen mit einer Bestrahlung bei Patienten mit Lungenkrebs vom small-cell Typ, Analkarzinom, den meisten gastro-intestinalen Malignomen (Magen, Rektum, Speiseröhre, Bauchspeicheldrüse) eingesetzt. Sie wird nach einem operativen Eingriff bei Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs und weiteren festen Tumoren eingesetzt. Sie wird palliativ bei Patienten eingesetzt, die Schmerzen oder neurologische Beschwerden haben.
GRENZEN DER HEUTIGEN THERAPIEN
Die vorstehend genannten Standardtherapien haben signifikante Einschränkungen. Keine ist 100%ig heilend und alle weisen toxische Nebenwirkungen auf. Chirurgie und Bestrahlung sind dadurch eingeschränkt, dass sie lediglich für die lokale Behandlung oder bei loko-regionalen Erkrankungen eingesetzt werden können. Auch ist die Bestrahlungsdosis beschränkt, die verabreicht werden kann, ohne dass gesunde benachbarte Strukturen zu sehr beeinträchtigt werden. Gleichermaßen gibt es eine Grenze wieviel ein Chirurg entfernen darf, um eine eindeutige chirurgische Grenze zu erhalten. Wird zu viel normales Gewebe entfernt, kann dies eine erhöhte Sterblichkeit bei dem Patienten bewirken. Die Chemotherapie beeinträchtigt das ganze Gewebe des Körpers, da sie systemisch eingesetzt wird. Unterschiedliche chemo-therapeutische Mittel beeinträchtigen verschiedene Organe unterschiedlich. Das am häufigsten beeinträchtigte Organ ist das Knochenmark, wobei ein Abfall der Blutzähler die Dosis der Chemotherapie beschränkt, die einem Patienten verabreicht werden kann. Es kann jedoch auch eine signifikante Toxizität für Nieren, Leber, Verdauungstrakt und anderes Gewebe bestehen.
Primäre feste Tumore werden im allgemeinen durch chirurgische Entfernung behandelt. Jedoch weist die Großzahl der Patienten, die feste Tumore haben, auch Mikrometastasen außerhalb der Stelle mit dem primären Tumor auf. Wird allein chirurgisch behandelt, tritt bei annähernd 70% dieser Patienten der Krebs wieder auf. Daher werden viele Krebsarten zusätzlich zur chirurgischen Behandlung mit einer Kombination von Therapien einschließlich mit cytotoxischen chemotherapeutischen Medikamenten (zum Beispiel Vincristin, Vinblastin, Cisplatin, Methotrexat, 5-FU, usw.) und/oder Strahlentherapie behandelt. Ein Problem bei diesem Ansatz ist jedoch, dass strahlentherapeutische und chemotherapeutische Mittel toxisch für normales Gewebe sind und häufig lebensbedrohliche Nebeneffekte auftreten. Zusätzlich weisen diese Ansätze häufig extrem hohe Fehlschlag-/Remissionsraten auf (bis zu 90% abhängig von der Art des Krebses).
NEUE THERAPIEN
Zusätzlich zu den chirurgischen, Chemo- und Strahlentherapien haben viele versucht, dass Immunsystem eines Patienten zu stärken oder zu fördern, um die Krebszellen zu eliminieren. Verschiedene Immuntherapien nutzen bakterielle oder virale Komponenten als Adjuvant, um das Immunsystem dazu zu stimulieren, die Tumorzellen zu zerstören.
Beispiele für solche Komponenten umfassen BCG, Endotoxin, bakterielle Vaccinmischungen, Interferone (Alpha, Beta und Gamma), Interferon-Inducer (zum Beispiel Brucella abortus und verschiedene Viren) und Thymusfaktoren (zum Beispiel Thymosinfraktion 5 und Thymosin Alpha-l) (siehe allgemein „Principles of Cancer Biotherapy," Oldham (ed.), Raven Press, New York, 1987). Diese Mittel sind allgemein hilfreich als Adjuvant und als nicht spezifische Stimulanzien bei Tumortiermodellen, jedoch haben sich bisher noch nicht als allgemein wirksam bei Menschen gezeigt.
Lymphokine wurden gleichfalls für die Krebsbehandlung eingesetzt. Kurz gesagt, Lymphokine werden von einer Reihe von Zellen sekretiert und haben allgemein einen Effekt auf spezifische Zellen bei der Erzeugung einer Immunantwort. Beispiele für Lymphokine umfassen TNF-Alpha, Interferone, Interleukine (zum Beispiel IL-1, -2, -3,-4 und -12 sowie Kolonie stimulierende Faktoren wie G-CSF, GM-CSF und M-CSF). Vor Kurzem hat eine Gruppe IL-2 eingesetzt, um periphere Blutzellen zu stimulieren, zu wachsen und große Mengen an Zellen zu produzieren, die für Tumorzellen cytotoxisch sind (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 313: 1485-1492, 1985). Eine weitere Gruppe von Mitteln, die untersucht worden sind, wird Chemokine genannt. Dies sind Mittel, die Immunzellen an einen Ort locken und so eine Immunantwort stimulieren können. Ein Beispiel dafür ist Rantes.
Von anderen wurde der Einsatz von Antikörper vermittelten Antikrebstherapien vorgeschlagen.
Kurzgesagt, können Antikörper entwickelt werden, die bestimmte Antigene auf der Zelloberfläche erkennen, die entweder spezifisch oder im Vergleich zu normalen Zellen prävalent für Krebszellen sind.
Diese Antikörper oder „magic bullets" können entweder allein oder in Verbindung mit einem Toxin eingesetzt werden, um spezifisch auf Tumorzellen abzuzielen und diese abzutöten (Dillman, „Antibody Therapy," Principles of Cancer Biotherapy, Oldham (e. d.), Raven Press, Ltd,., New York, 1987). Beispielsweise behandelten Ball et al. (Blond 62: 1203-1210, 1983) verschiedene Patienten mit akuter myelogener Leukämie mit einem oder mehreren verschiedenen für Leukämie spezifischen monoklonalen Antikörpern, wobei während der Behandlung eine deutliche Abnahme an zirkulierenden Leukämiezellen erzielt wurde. Gleichermaßen haben andere Toxin-verbundene Antikörper therapeutisch zur Behandlung von zahlreichen Tumoren eingesetzt, umfassend zum Beispiel Melanome, colorektale Karzinome, Prostatakarzinome, Brustkarzinome und Lungenkarzinome (siehe Dillman, supra). Ein Problem ist jedoch, dass die meisten monoklonalen Antikörper murinen Ursprungs sind und daher eine Überempfindlichkeit gegen murine Antikörper die Wirksamkeit insbesondere nach wiederholten Therapien einschränken kann. Häufige Nebenwirkungen sind Fieber, Schwitzen und Frösteln, Hautausschlag, Arthritis und Nervenlähmungen.
Kürzlich wurden humanisierte Monoklone getestet und davon hat sich wenigstens einer als geeignet erwiesen, nämlich „Herceptin/Trastuzumab", ein monoklonaler Antikörper der den her2-neu Marker auf einigen Tumorzellen erkennt. Dieser zeigte sich geeignet bei der Behandlung von metastatischem Brustkrebs (Goldenberg, Clin. Therapy 21: 309-318, 1999) jedoch verbleibt der Einfluss auf die Behandlung von Brustkrebs noch nachzuweisen.
GENTHERAPIE (GEN DELIVERY VEHICLE)
Vektoren für die Gentherapie können in zwei Haupttypen unterteilt werden – viral und nicht viral. Beide Typen werden im Detail in Methods in Human Gene Therapy, T. Freidmann Ed. Cold Spring Harbor Press, 1999 beschrieben, das hier durch Bezugnahme mit einbezogen ist. Die am häufigsten eingesetzten viralen Systeme sind retrovirale Vektoren und adenovirale Vektoren, teilweise aus historischen Gründen und teilweise weil sie vergleichsweise einfach in klinisch nützlichen Mengen hergestellt werden können. Beide Vektoren wurden extensiv klinisch eingesetzt und es wurden einige klinische Versuche mit Adenoassoziierten viralen Vektoren, Rhabdoviren, viralen Herpesvektoren und Vektoren auf Basis von Vaccinvirus oder Poxviren durchgeführt. Diese Viren haben einige Stärken und Schwächen, übertragen jedoch alle relativ wirkungsvoll Gene auf Zielgewebe. Einschränkungen sind Schwierigkeiten bei der Herstellung von ausreichenden Mengen bei einigen Vektoren, das Unvermögen in vivo das Gen exakt auf das Ziel zu übertragen, toxische oder immunologische Nebenwirkungen der viralen Genprodukte. Es ist jedoch anzumerken, dass selbst mit vergleichsweise effizienten viralen Vektoren derzeit nicht vernünftigerweise erwartet werden kann, dass ein Gen in jede erkrankte Zelle transferiert werden kann, und damit bedarf die Therapie der Unterstützung durch Mittel, die mit diesem Gewebe kompatibel sind.
Nichtvirale Systeme umfassen nackte DNA, DNA, die in Liposome formuliert ist, und DNA, die mit polykationischen Kompaktierungsmitteln oder Hybridsystemen formuliert ist. Diese Systeme sind einer Erzeugung in rational regulierten Schritten zugänglich, um eine lange in vivo Halbwertszeit, Einschleusung in die Targetzelle/Gewebe, Eintritt in das Cytoplasma und den Kern und anschließende Expression zu erzielen. Obwohl es für jeden dieser Punkte Lösungsmöglichkeiten gibt, wurden diese bisher noch nicht wirksam kombiniert und die Wirksamkeit des Gentransfers in vivo ist zurzeit ein weiterer Punkt. Damit kann auch von diesen Systemen nicht vernünftigerweise erwartet werden, dass sie ein Gen in jede Zelle, zum Beispiel in einen Tumor, übertragen. Daher ist für Krebstherapien mit Gen Delivery Vehicles der Einsatz von Mechanismen erforderlich, die eine Art von Amplifizierung der Gentransferereignisse ermöglichen.
Diese können die Stimulierung des Immunsystems, verschiedene Formen des Zuschauereffekts, Ausweitung der Apoptose, anti-angiogene Effekte, die Blutgerinnung begünstigende Effekte, replikationskompetente virale Vektoren oder andere Mechanismen sein
GENTHERAPIEVERFAHREN IN DER KREBSBEHANDLUNG
Im Hinblick auf die allgemein düsteren Aussichten für viele Krebspatienten und die Stagnation bei Verbesserungen der herkömmlichen Therapien wie die vorstehend beschriebenen, besteht beträchtliches Interesse neuartige Behandlungsmethoden wie die Gentherapie für die Behandlung von Krebs einzusetzen (vergleiche F. Farzaneh, U. Trefzer, W. Sterry und P. Walden: „Gene therapy of Cancer" Immunology Today 19: 294-296, 1998). Diese umfassen verschiedene Paradigmen wie: Einführung von Genen für verschiedene Cytokine und Chemokine um generell die Immunität gegen Tumor und dessen angenommene Tumor-assozierte Antigene zu stimulieren (TAAs zum Beispiel Addison et al. Gene Ther. 5: 1400-1409 1998); Verabreichung von Genen für spezifische TAAs um die Immunität gegen diese Antigene zu stimulieren (zum Beispiel Schlom & Hodge Immunol Rev. 170: 73-84 1999); Behandlung mit Tumorunterdrücker oder Apoptose induzierenden Genen wie p53 (Eastham JA J. Urol. 164: 814-9 2000); Behandlung mit Genen, deren Produkte zur Unterdrückung der Angiogenese führen können oder die auf andere Weise den Blutstrom zu den Tumorbereichen verringern (zum Beispiel Grischelli et al Proc Natl Acad Sci USA 95: 6367-6372 1998, WO 96/21416 ); Behandlung mit Genen, deren Produkte inaktive Verbindungen in aktive Antitumorverbindungen umwandeln (Connors, Gene Ther. 2: 702-709 1995, Deonarian et al. Gene Ther. 2 235-244 1995); und Kombinationen davon (zum Beispiel Soler MN, Cancer Immunol Immunother. 48: 91-99 1999); verschiedene andere Behandlungsmethoden wie solche, die die Anti-Tumorantwort von T-Zellen potenzieren können. Die eingesetzten Vektoren umfassen retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, nackte und formulierte DNA, Herpesvirenvektoren, adeno-assoziierte Vektoren und viele andere Arten von Vektoren (siehe T. Friemann 1999 a. o. O.).
Anhand von Tierversuchen konnten mögliche Erfolge mit einigen von diesen Behandlungsmethoden und Vektoren gezeigt werden und viele davon sind immer noch erfolgversprechend. Jedoch gibt es, wie vorstehend angeführt, logistische Schwierigkeiten bei der Umsetzung der Versuche und der Einführung vieler dieser Therapien. Dies wurde noch dadurch erschwert, dass Gentherapieansätze häufig als Monotherapien angesehen werden oder nur für Patienten im Endstadium eingesetzt wurden. Die Einführung und der Einsatz von Gentherapieansätzen würde einfacher sein, wenn deren Wechselwirkung mit den Standardtherapien verstanden werden würde und wenn sie als adjuvante Therapie in allen Stadien der Krankheit eingesetzt werden würde.
Es wurde eine Reihe von Studien an Tiertumoren mit dem adenoviralen Vektor, der für Herpesvirus Thymidinkinase kodiert (HSVTK, AdTk, AdV-tk usw.) durchgeführt (J. A. Eastham et al. Hum. Gene Ther. 7 515-523 1996; M. Y. Hurwitz et al. Human Gene Ther. 9: 1323-1333 1998,). Zudem wurde über Tierversuche mit replizierenden adenoviralen Vektoren, die für TK kodieren (O. Wildner et al. Gene Therapy 6: 57-62 1999) und der Einsatz von adenoviralen Vektoren, die für Prodrug aktivierende Gene kodieren (PDAG), mit Strahlentherapie (Freytag et al Hum. Gene Ther. 9: 1323-1333 1998 und die darin genannten Literaturstellen) berichtet. Jedoch stößt die klinische Implementierung dieser Therapien auf beträchtliche Probleme wie sie hier beschrieben sind. Zudem gibt es Berichte über Ergebnisse von klinischen Versuchen mit einem adenoviralen Vektor kodierend für TK zusammen mit Gancyclovir an Patienten, die an Prostatakrebs leiden, deren Krankheit nach einer Strahlentherapie im T2-Stadium wieder auftrat (J. R. Herman, Hum. Gene Ther. 10: 1239-1249 1999). Anhand dieser Daten scheint es unwahrscheinlich, dass die Monotherapie mit Adeno-TK für die Behandlung von. festen Tumoren sehr brauchbar ist.
PROBLEME BEI DER EINFÜHRUNG VON NEUEN THERAPIEN
Klinische Studien, die auf ethische und gesetzliche Art und Weise durchgeführt werden, folgen etablierten Regeln für die Durchführung und Praxis (siehe zum Beispiel den US Code of Federal Regulation – Kapitel 21). Diese Richtlinien werden von Patientenvertretergruppen, dem National Institute of Health, gemäß den ethischen Standards und Ratschlägen von Ärzten, den Institutional Review Boards, die dazu eingesetzt wurden, speziell derartige Gesichtspunkte jeder klinischen Studie, die an einem bestimmten medizinischen Institut durchgeführt wird, zu überprüfen, und den nationalen Zulassungsstellen für Arzneimittel (in den USA die Food and Drug Administration, FDA) durchgesetzt und überwacht. Die Versuche werden daher auf eine Art durchgeführt, die einem Patienten nicht die geeignetste Behandlung vorenthält, die normalerweise an dem Patienten durchgeführt worden wäre (der klinische Standard). Daher ist es schwierig, die Wirksamkeit von neuen Therapien, besonders für Krebs, als eigenständige Behandlung für diese Erkrankung zu ermitteln. Der einzige Umstand, unter dem solche Therapien klinisch zugelassen werden können, ist, wenn alle anderen Therapien versucht worden sind und keine Therapie verbleibt, die einen klinischen Nutzen verspricht. Solche Patienten haben üblicherweise fortgeschrittene Erkrankungen mit kurzer Lebenserwartung. Hierdurch wird das Testen solcher neuen Therapien sehr schwer und macht positive Ergebnisse unter Berücksichtigung des fortgeschrittenen Stadiums der Erkrankung unwahrscheinlich. Eine Alternative zu diesem Ansatz ist das Testen von Therapiekandidaten, die in Verbindung mit den bestehenden Standards eingesetzt werden können und die einfach zusätzlich zu bestehenden Therapien eingesetzt werden. Dies setzt zumindest voraus, dass die neue Therapie mit der bestehenden Therapie nicht negativ wechselwirkt und vice versa. Idealerweise wird von der neuen Therapie erwartet, dass sie eine unterstützende Wirkung auf die bestehende klinische Behandlung ausübt. Zudem ist es schwierig und teuer während der Versuche und auch für die neuen Therapien, wenn eine medizinische Extraversorgung wie Infusionen, die einen Krankenhausaufenthalt erfordert, oder extensive häusliche Pflege notwendig ist. Daher wird eine neue Therapie, die auch nur ein Minimum Extrapflege im Krankenhaus oder extensive oder häusliche Pflege erfordert, eher von Patienten, Ärzten oder diesen Institutionen akzeptiert, die für die Gesundheitsfürsorge zahlen. Das wiederum führt dazu, dass diese Therapien eher die Zustimmungsverfahren der Gesundheitsbehörden durchlaufen und von behandelnden Ärzten eingesetzt werden.
Blackburn et al. (1999) Int. J. Cancer 82, 293-7 beschreibt die adenovirale Transduktion eines Cytosindeaminase/Thymidinkinase Fusionsgens in Prostatakrebszellen. Obwohl festgestellt wurde, dass die Prodrug- und Strahlungsempfindlichkeit verstärkt wurde, wird von diesen Autoren darauf hingewiesen, dass in vivo die starken Immunreaktionen, die die adenovirale Infektion hervorrief, problematisch sein könnte.
Kim et al. (1994) Cancer Research 54, 6053-6 beschreiben eine in vitro Studie über das strahlungsinduzierte Abtöten von menschlichen Gliomazellen, in die ein retroviraler Vektor kodierend für Thymidinkinase eingeschleust worden ist. Die Autoren weisen darauf hin, dass bei den Arzneimittelkonzentrationen, die bei Menschen eingesetzt werden können, Antiherpesmittel keine effektiven Sensibilisatoren für die Bestrahlung sind, und dass andere Gene als Thymidinkinase untersucht werden sollten.
Hanna et al. (1997) Cancer Research 57 4205-9 beschreiben eine Gentherapie mit Cytosindeaminase und 5-Fluorcytosin, zur Verstärkung der Bestrahlungsreaktion in menschlichen Krebsheterotransplantat. Die Autoren sind der Ansicht, dass dieser Ansatz nicht für menschliche Krebsarten geeignet ist, da die. therapeutischen Gene in vivo nicht wirkungsvoll genug übertragen werden konnten. Außerdem wird darauf hingewiesen, dass die Immunogenität der Adenoviren einer Antitumorwirkung entgegenwirkt.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines replikationsdefizienten adenoviralen Gen Delivery Vektors wie er in Anspruch 1 definiert ist, bereitgestellt.
Dieser und weitere Aspekte der Erfindung werden anhand der anliegenden ausführlichen Beschreibung und der Zeichnungen ersichtlich.
1 zeigt eine Dosissteigerungsanalyse für eine Einzeltherapie. Subkutane RM-1 Tumore von 50–60 mm³ wurden zur Bestimmung von wirksamen, aber nicht heilenden Dosen in einer Einzeltherapie eingesetzt, die für Kombinationstherapiestudien verwendet werden sollen. A). Die Vektordosen wurden mittels einzelner AdV. RSV-tk intra-tumoralen Injektionen in Dosen von 1 × 10⁹ bis 1 × 10¹¹ v. p. pro Tumor in halb log Abschnitten analysiert, mit anschließender 6-tägiger GCV mit 20 mg/kg bid. B). Die Strahlungsdosis wurde mittels Einzelverabreichung von 5, 10 und 15 Gy wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert.
2 zeigt die Wirkung einer Kombinationstherapie auf das Tumorwachstum in einem Maus-Prostata-Tumor-Model. Tumore denen adenovirale Vektoren verabreicht wurden, wurde 3 × 10¹⁰ AdV-tk oder AdV-β-gal v. p. injiziert. Bestrahlte Tumore erhielten eine Einzeldosis von 5 Gy.
A). Relatives Tumorwachstum nach Übertragungsbehandlung der Kontroll-, Einzeltherapie- und Kombinationstherapiegruppen.
B). C57BL/6 Mäuse zehn Tage nach der Behandlung mit: a) AdV-b-gal+5Gy; b) nur AdV-tk; c) nur 5 Gy; und d) AdV-tk+5Gy. In beiden Flanken der Tiere wurde Tumormasse beobachtet. C) Relative Überlebensdauer der behandelten Tiere und der Kontrolltiere.
3 zeigt die Wirkung einer Kombinationstherapie auf das Tumorwachstum in einem Maus-Brustkrebs-Modell. Den Tumoren wurden wie vorstehend beschrieben, adenovirale Vektoren verabreicht. Balb/c Mäuse zehn Tage nach der Behandlung mit AdV-b-gal+5Gy; nur AdV-tk; nur 5 Gy; und AdV-tk+5Gy wie angegeben. Tumormasse wurde in der rechten Flanke der Tiere beobachtet.
4 zeigt den Immuneffekt der Behandlung. Ergebnisse der Immunzelleninfiltration der Tumore nach Einzelbehandlung oder Behandlung mit kombinierter Therapie.
Gefrorene Schnitte von jedem Tumor wurden mit für die Immuncharakterisierung spezifischen Antikörpern gefärbt, und die relative Anzahl an positiven Zellen pro mm2 wurde für wenigstens 10 Bereiche mikroskopisch bestimmt.
5 zeigt den antimetastatischen Effekt der Kombinationstherapie. A) Balkendiagramm der Anzahl an Lungenmetastasen. B) Repräsentative Lungen aus jeder Gruppe. Tumore wurde durch subkutane Inokulation von 1 × 10⁴ und Inokulation von 5 × 10³ RM-1 Zellen in die Schwanzvene erzeugt. Wir verglichen die Kombinationstherapie mit den zwei Einzeltherapien und der Kontrollgruppe ohne Behandlung. AdV/RSV-tk in einer Dosis von 3 × 10¹⁰ AdV-tk in 20 μl wurde in den subkutanen Tumor injiziert. Gancyclovirbehandlung startete 24 Stunden nach der HSV-tk-Injektion und eine Einzelstrahlungsdosis von 5 Gy wurde 72 Stunden später verabreicht. Die Brusthöhle wurde 10 Tage nach Vektorinjektion auf Tumore hin untersucht. Es wurden Lungenschnitte angefertigt und mit Pikrinsäure fixiert und die Tumorknoten wurden gezählt. Die HSV-tk-Therapie zeigte eine signifikant reduzierte Kolonisierung der Lunge (p < 0,05), jedoch zeigte die Kombinationstherapie eine weitere signifikante Verringerung der Anzahl an Metastasen in der Lunge (p < 0,05).
6 zeigt, dass Adenovirus kodierend für HSV-tk Mausfibroblasten transduziert und die MHC Klasse II abhängige Proliferation von T-Zellen unterstützt. A) Western blot Analyse der Zelllysate von mit Ad5tk transduzierten DR-1 transfizierten L Zelllysaten. 30 × 10⁶ Zellen wurden lysiert und auf SDS-PAGE separiert und anschließend auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit polyklonalen Kaninchenantiserum gegen HSV-tk versehen und mit Eselsantikaninchen HRP und ECL sichtbar gemacht. Gereinigte HSV-tk wurde als Positivkontrolle eingesetzt. Es wurden keine Banden für eine adenovirale Transduktion mit _-galactosidase beobachtet. B) DR-1⁺ und parentale L-Zellen wurden mit 1 × 10⁹ vp/ml transduziert und 24–36 Stunden inkubiert. APCs wurden mit Mitomycin C behandelt und gewaschen.
Jeweils 5 × 10⁴ APC wurde in 96-Well-Rundbodenfläschchen mit 2,5 × 10⁵ gereinigten T-Zellen gegeben und wie unter Materialien und Methoden beschrieben, inkubiert. β-Galactosidase wurde zur Bestimmung der T-Zellantworten auf virale Antigene eingesetzt. Dies diente als Negativkontrolle. Adenovirus enthaltend VSAg-7 (ein gut charakterisiertes virales Superantigen) wurde als Positivkontrolle verwendet. CPM von VSAg-7 in Gegenwart von MHC Klasse II Molekülen überstieg 80.000. In Abwesenheit von spezifischen präsentierenden Molekülen waren die cpm-Gehalte niedriger als 3000. Diese Daten stammen aus einem repräsentativen Versuch, der vierfach durchgeführt wurde. Vergleichbare Resultate wurden mit verschiedenen Donoren erzielt. C) DR-1, DQ und DP Isotypen wurden zur Unterstützung der Transduktion mit Adenovirus und der anschließenden Proliferation von T-Zellen eingesetzt. APCs wurden mit 1 × 10⁹ vp/ml transduziert und wie vorstehend beschrieben, behandelt. APCs wurden seriell vor der Zugabe von T-Zellen verdünnt. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit drei Individuen erzielt.
7 zeigt, dass die Stimulierung von T-Zellen spezifisch für HSV-tk und nicht für Adenovirus oder Inserte ist. A) Ad5tk wurde titiriert, um die optimale Konzentration an Adenovirus zu ermitteln, die die T-Zellen Proliferation fördert. Bei sehr hohen Konzentrationen zeigte sich ein offensichtlicher cytopathischer Effekt und Zelltod wurde beobachtet. Die optimale Konzentration, die von uns gefunden wurde, betrug 1 × 10⁹ vp/ml. Geringere Konzentrationen förderten die T-Zellenproliferation geringfügig. B) Wildtyp Ad5 wurde auf gleiche Weise titriert. Trotz einer breiten Dosiskurve konnten wir keine messbare T-Zellen Proliferation beobachten. C) und D) T-Zellen Proliferation ist spezifisch für HSV-tk. Wir untersuchten einige Adenoviren mit herkömmlich verwendeten Inserten auf die Fähigkeit, T-Zellen Proliferation zu fördern. Gezeigt sind hier zwei repräsentative Inserte mit zwei repräsentativen Donoren. Diese Versuche wurden verschiedene Male mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie vorstehend ausgeführt, betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Medikamenten zur Inhibierung von Tumorwachstum und zur Verbesserung der Therapie von festen Tumoren und Metastasen.
Kurz gesagt, die Fähigkeit eine große Anzahl an Tumorzellen abzutragen und eine systemische Antitumorwirkung durch Einführung des Herpes Thymidin Kinasegens in Tumorzellen mit einem Gen Delivery Vehicle (GDV), gefolgt von einer Behandlung mit Prodrug Gancyclovir oder analogen Verbindungen, und die Durchführung von diesen Maßnahmen in Verbindung mit einer Strahlentherapie stellt eine attraktive und leicht einsetzbare Ergänzung von Standardtherapien dar. Wirkt die Therapie zudem der Radiotherapie nicht entgegen oder unterstützt diese sogar, werden klinische Studien sehr viel einfacher, Ärzte und Patienten werden geneigter, diese neue Therapie anzuwenden und es wird ein zusätzlicher klinischer Nutzen für den Patienten erzielt. Ein weiterer Punkt sind jedoch die Kompliziertheit und die Kosten der neuen Therapien. Ein Hauptkostenpunkt einer klinischen Therapie ist die Länge des Krankenhausaufenthalts und/oder die Anzahl der Patientenvisiten des Arztes oder der Krankenschwester. Daher erfordern Therapien wie eine Gancyclovirinfusion (üblicherweise mehrere Stunden jeden Tag über 14 Tage) üblicherweise einen Krankhausaufenthalt oder eine teurere häusliche Pflege über diesen Zeitraum. Sofern dies für eine herkömmliche Behandlung nicht erforderlich ist, führt die zusätzliche Belastung durch den Krankenhausaufenthalt und die Kosten und die Unbequemlichkeiten zu einem weniger häufigen Einsatz der neuen Therapie. Daher betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Prodrugs, die einfach selbst verabreicht werden können, wie die oral verabreichbaren Prodrugs Valacyclovir und Famcyclovir.
GENKONSTRUKTE
Die Erfindung umfasst Genkonstrukte verschiedenster Art. Das Thymidinkinasegen hat üblicherweise einen Promoter, eine kodierende Sequenz und eine Polyadenylierungsstelle, wenn es in einem DNA-Format vorliegt. Die Promotoren sind viral oder nicht viral und sind gemäß einer Ausführungsform so ausgestaltet, dass sie eine gewebespezifische Expression bewirken, wie die des PSA Promoters für Prostata-Gewebe; gemäß einer anderen Ausführungsform sind sie so ausgestaltet, dass sie eine tumorspezifische Expression eines Promoters ergeben, der auf den Wechsel des Zellzyklus reagiert oder der auf Änderungen der Tumorzellen reagiert, die zur Expression von ansonsten stummen Genen führt wie p21 Promoter in p53 Mutantentumorzellen; gemäß einer anderen Ausführungsform sind sie so ausgestaltet, dass sie eine wahllose Expression in den meisten Geweben ergeben wie Rous Sarcoma Virus LTR Promoter oder CMV immediate early Promotor. Gemäß weiteren Ausführungsformen wird die Gewebe- und/oder Tumorspezifität bewirkt durch Verstärkerelemente, lokale Kontrollbereiche, spezifische RNA-Kernexport- oder Splicing-Anordnungen, Translationskontrollelemente, zelltypische spezifische Proteinverarbeitungs-Aktivitäten und andere zellspezifische biochemische Prozesse.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Prodrug aktivierende Gen durch den RSV LTR Promoter gesteuert.
PRODRUG AKTIVIERENDE GENE (PDAG) UND ARZNEIMITTEL
Prodrug aktivierende Gene sind Gene, deren Proteinprodukte für eine Aktivität kodieren, die inaktive Arzneimittel in eine pharmazeutisch aktive Form überführen, die die Zellproliferation inhibiert, und die die Zelle und in einigen Fällen Nachbarzellen abtötet (der „Zuschauereffekt" Touraine et al. Hum Gene Ther. 9: 2385-2391 1998) oder auf andere Weise einige der Funktionen inhibiert (zum Beispiel die Fähigkeit zu metastasieren, die Fähigkeit angiogene Promotoren zu sekretieren, die Fähigkeit das Immunsystem und andere anormale Eigenschaften von Tumorzellen und von Zellen im Tumor oder Tumorbereich zu inhibieren). Das HSV TK Gen wird gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit Gancyclovir, Acyclovir, Valacyclovir oder Famcyclovir wie andere Herpesvirus TK-Gene für dieselben Prodrugs eingesetzt.
ANDERE GENE ODER FUNKTIONEN, DIE SICH EBENFALLS AUF DEM VEKTOR BEFINDEN
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung befinden sich auf dem Gen Delivery Vehicle zusätzliche exogene Gene als separate kodierende Bereiche oder als Fusionen mit dem Thymidinkinasegen, zusätzlich zu dem Thymidinkinasegen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung haben die Produkte des Thymidinkinasegens zusätzlich zu der Prodrug-Aktivierung weitere Eigenschaften, zum Beispiel Hyperantigenaktivitäten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die zusätzlichen exogenen Gene andere PDAG oder Fusionen damit wie die TK-Cytosindeaminasefusion; gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kodieren die weiteren exogenen Gene Cytokine wie Interferone, α, β oder γ, Kolonie stimulierende Faktoren wie GMCSF, GCSF, MCSF; gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die zusätzlichen exogenen Gene Cytokine wie IL1, IL2, IL3, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12, IL13, IL15, TNF; gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft das zusätzliche Gen ein Chemiokin wie Rantes, Myp 1α, CXCR4 Ligand, oder ein immunologisches co-stimulierendes Molekül wie B7.1, B7.2, Beta2mikroglobulin, NK-stimulierende Moleküle, ICAM 1, 2, 3, HLA-Moleküle; gemäß einer weiteren Ausführungsform kodieren die zusätzlichen Gene Transportmoleküle für das Prodrug wie Zellrezeptoren oder Kanäle; gemäß einer weiteren Ausführungsform kodiert das zusätzliche Gel Moleküle, die den Zuschauereffekt unterstützen wie Connexine; Fusionen mit VP22 oder HIV-tat, die die Aufnahme von Nachbarzellen von exogenen Proteinen unterstützt, gemäß einer weiteren Ausführungsform kodiert das zusätzliche Gen für antiangiogene Mittel wie Endostatin, Angiostatin, Betainterferon, Procoagulantien-Gene wie Gewebefaktor oder Varianten davon. Das Protein des Thymidinkinasegens kann auch andere Antitumoraktivitäten aufweisen, wie die Stimulierung einer Immunreaktion wie ein herkömmliches fremdes Antigen oder wie ein Superantigen (siehe Beispiel X), das dann einen Antitumoreffekt durch Immun-„Ausbreitung” hat, wobei eine Immunreaktion auf ein Antigen in einer Zelle zu Immunreaktionen auf andere Antigene, sogar Autoantigene, in dieser Zelle führt, die andernfalls nicht als immunogen erkannt worden wären.
DAS GEN DELIVERY VEHICLE
Ws wurden verschiedene Typen von replizierenden Vektoren (siehe zum Beispiel D. J. Jolly in Friedmann 1999, op. cit) vorgeschlagen, einerseits um den vorstehend ausgeführten Aspekten zu genügen, und andererseits um zu versuchen, aus den natürlichen Eigenschaften des betreffenden Virus Vorteile zu ziehen. Diese basieren zum Beispiel auf Poxviren, Adenoviren ( US 5,998,205 , US 5,871,726 ) Herpesviren ( US 5,728,379 ), Parvoviren, Alphaviren, Retroviren, Rhabdoviren und weiteren.
Die Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung werden mit adenoviralen Vektoren eingesetzt einschließlich der ersten (ohne EI), der zweiten (ohne EI, E4 oder E2) oder dritten („gutless") Generation adenoviraler Vektoren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das GDV ein modifizierter adenoviraler Vektor, der auf spezifische Zelltypen abzielt, indem er an spezifische Zellmarker bindet, der Ligand hierfür wurde in die virale Vektorhülle eingebracht (Printz et al Hum. Gene Ther. 11; 191-204 2000). Gen Delivery Vehicle gemäß der vorliegenden Erfindung können auch verschiedene Typen von adenoviralen Vektoren sein, einschließlich Vektoren mit konditionaler Expression oder Mini-Adenotypen (Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988 Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991, Kochanek, Hum. Gene Ther. 10: 2451 1999, Steiner et al. Cancer Gene Therapy 6: 456-464 1999; Chem. Et al. Proc Natl. Acad. Sci USA 94 1645-1650 1997; Zhang Cancer Gene Ther. 6: 113-138 1999). Zudem können virale Träger homolog oder nicht-pathogen (defective) sein.
VERWENDUNG UND SYNERGIE MIT STANDARDBEHANDLUNGEN
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Behandlung mit GDV in Verbindung mit einer Strahlentherapie. Wie eingangs zum Hintergrund der Erfindung ausgeführt, gibt es vier Hauptklassen von Krebstherapien: chirurgische Therapie, Strahlentherapie, Chemotherapie und Immuntherapien. Nachstehend ist ein Beispiel für Evaluierungsmöglichkeiten und resultierende Therapievarianten beschrieben, die auf gut charakterisierten Ergebnissen basieren, die bei Studien wie Patienten mit Prostatakrebs zu behandeln sind, erhalten wurden. Es wurden annähernd alle Krebsarten von messbaren Auftreten auf gleiche Weise erfasst und so, obwohl die Behandlungsentscheidungen auf den ersten Blick komplex erscheinen, basieren sie tatsächlich auf extensiven klinischen Experimenten und können ohne Weiteres als ein Satz von Regeln für die Behandlung angesehen werden. Dies macht eine „Standard"-Therapie aus und ist eine Behandlung, die die meisten Ärzte verschreiben, die deren Kollegen als normal akzeptieren, für die die Versicherungen zahlen, und die nicht ohne Weiteres durch eine Therapie ohne äquivalentes klinisches Nachweisverfahren ersetzt werden kann. Beispielsweise werden Prostatapatienten im Stadium T2 mit einem Gleason Score von weniger als 6 und PSA-Spiegel von weniger als 10 ng/ml entweder mittels Strahlentherapie, entweder mit externer Bestrahlung oder Implantierung von radioaktiven Pellets (Brachytherapie), oder mittels chirurgischem Eingriff auf Grundlage der vorstehend beschriebenen Erwägungen behandelt. Brustkrebspatienten werden mit externer Bestrahlung nach Entfernung des primären Tumors behandelt, und Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs, die nahezu alle zum Zeitpunkt der Diagnose im fortgeschrittenen Erkrankungsstadium waren, werden mit Strahlentherapie behandelt. Diese Standardtherapien sind Onkologen und Fachleuten gut bekannt, und viele finden sich in Fachbüchern oder Richtlinien, die routinemäßig von Gesellschaften oder andere Interessengruppen in Zeitschriften veröffentlicht werden. Beispiele für Dokumente über Standardbehandlungen sind diejenigen, die vom National Comprehensive Cancer Network, Rockledge, PA 19046 (http://www.nccn.org) für spezifische Krebsarten bezogen werden können, die im Journal Oncology veröffentlicht sind, die Versionen für Patienten, die von der American Cancer Society, US National Institutes of Health Consensus Statements (http://odp.od.nih.gov/consensus/cons/cons.htm) über medizinische Themen und Übersichten über bestimmte Erkrankungen und Krebsarten bezogen werden können, die von Zeit zu Zeit im New England Journal of Medicine (zum Beispiel Jay R. Harris et al., „Medical Progress: Breast Cancer", New Eng. J. Med Vol. 327: 319, July 30 1992) veröffentlicht werden.
Gemäß einer bevorzugen Ausführungsform der Erfindung wirken die Prodrug aktivierende Aktivität oder die anderen Aktivitäten, für die ein GDV kodiert, nicht antagonistisch auf die Strahlentherapie, und gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform hat die Gentherapie eine kooperative Wirkung für die Strahlentherapie.
Die Ausdrücke unterstützend (kollaborativ), zusammenwirkend (kooperativ) oder synergistischer Effekt betreffen alle die Situation, in der die kumulative Wirkung von zwei oder mehreren Mitteln größer ist als die erwartete additive Wirkung der einzelnen Mittel. Dies kann auf verschiedene Arten festgestellt werden, die den Fachleuten bekannt sind. Beispielsweise beschreibt Webb, J. L. (1963) in Enzyme and Metabolic Inhibitors, Volume 1, Academic Press die Originaldefinition dieser Ausdrücke für biochemische Reaktionen und A. M. Lopez et al. (1999) Proc. Natl Acad Sci US 96: 13023-13028 hat diese für komplizierte Fälle wie für Maustumormodelle überarbeitet.
Antagonismus ist das Gegenteil von Synergismus, wobei die kombinierte Wirkung von zwei oder mehreren Mitteln geringer ist als die addierte. Mittel können nichtsdestotrotz sinnvoll zusammen eingesetzt werden, obwohl sie nach dieser Definition formal Antagonisten sind. Das gilt auch für Mittel, die einfach additiv sind.
Deshalb kann das Fehlen eines Antagonismus oder eine Kooperation mit diesen Therapien in Mausmodellen zusammen mit der Gentherapie nachgewiesen werden. Obwohl es bekannt ist, dass die Extrapolation von Ergebnissen einer Tumorbehandlung mit Einzelmitteltherapien bei Menschen nicht vollständig möglich ist, sollte eine Synergie oder sonstiges zwischen zwei Mitteln zuverlässig und einfach mit diesen Modellen festgestellt werden können. Ein Beispiel für einen solchen Test an einen Prostatatumor, der mit HSVTK transduziert ist, mit anschließender Behandlung mit Gancyclovir und Strahlentherapie findet sich in Beispiel 2.
VERFAHREN ZUR VERABREICHUNG, DOSIERUNG UND FORMULIERUNG
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die GDV-Konstrukte mit Thymidinkinase einem festen Tumor eines Patienten in variierenden Dosen zwischen 10⁴ bis 10¹⁵ effektiven Partikeln verabreicht. Titer der adenoviralen Vektoren, die üblicherweise klinisch eingesetzt werden, liegen zwischen 10⁸ und 10¹³ vp/ml. Den Patienten können 0,3 bis 500 ml Vektor in einer einzelnen oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Die Tumorläsion kann von 1 bis 20 cm Größe variieren zum Beispiel bei einem Sarkom des weichen Gewebes, multiplen Myeloma, squamösen Karzinomen des Kopfes und Nackens. Patienten können über 5 Tage ansteigende Dosen von 0,3, 0,5 oder 1,0 ml/Injektion erhalten. Da die Dosis von der Tumorgröße oder Tumorlage abhängen kann, können bis zu 500 ml Vektor pro Tag verabreicht werden. Die Dosis kann mit einer einzigen Injektion oder mit mehreren Injektionen in dieselbe Stelle des Tumors über einen Zeitraum verabreicht werden. Alternativ kann eine Dosis von bis zu 500 ml pro Tag über einen Zeitraum von 5 Tagen verabreicht werden, um einen Zyklus zu erstellen. Die Patienten können soviele Zyklen erhalten, wie für eine Reaktion erforderlich sind ohne sich jedoch toxisch zu erweisen. Zyklen können zum Beispiel wöchentlich oder jede zweite Woche, über Monate oder Jahre verabreicht werden.
Wie vorstehend ausgeführt, werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die GDV mit Thymidinkinasevektorkonstrukt zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten (siehe Nyberg-Hoffmann und Aquilar-Cordova, Nature Medicine, April 1999 – deren Inhalt hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist. Die Zusammensetzung kann entweder als flüssige Lösung oder in fester Form (zum Beispiel lyophilisiert), die in einer Lösung vor der Verabreichung suspendiert wird, hergestellt werden. Weiter kann die Zusammensetzung mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmittels zur oberflächlichen Verabreichung, Injektion, oralen oder rektalen Verabreichung hergestellt werden.
Pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel sind für den Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen ungiftig. Repräsentative Beispiele für Träger oder Verdünnungsmittel für injizierbare Lösungen umfassen Wasser, isotonische Salzlösungen, die vorzugsweise auf einen physiologischen pH oder einen pH bei dem der Vektor stabil ist, gepuffert sind (wie Phosphat-gepufferte Salzlösung oder Tris-gepufferte Salzlösung), Mannitol, Dextrose, Saccharose, Glycerin und Ethanol sowie Polypeptide oder Proteine, wie menschliches Serum Albumin.
Für die vorliegende Erfindung können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um das Vektorkonstrukt direkt dem Tumor zu verabreichen, umfassend direkte intraläsionale Injektion, iv Verabreichung oder topischer Transfer. Beispielsweise kann gemäß einer Ausführungsform eine Läsion lokalisiert werden und der Vektor einmal oder mehrere Male unterschiedlichen Bereichen des Tumorkörpers injiziert werden. Alternativ können Arterien oder Blutgefäße identifiziert werden, die den Tumor versorgen, und der Vektor wird dem Blutgefäß injiziert, um den Vektor direkt in den Tumor einzuschleusen. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann bei einem Tumor, der eine nekrotische Mitte aufweist, diese abgesaugt werden, und der Vektor unmittelbar in die nun leere Mitte des Tumors injiziert werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Vektorkonstrukt direkt auf die Oberfläche des Tumors aufgebracht werden, zum Beispiel mit einer topischen pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Vektorkonstrukt, oder vorzugsweise einen rekombinanten viralen Vektor mit dem Vektorkonstrukt enthält. Vektorpartikel können der Stelle mit einer Tumorläsion entweder direkt (zum Beispiel intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan, oral, rektal, intraokular, intranasal, intravesikal, während eines chirurgischen Eingriffs) verabreicht werden, oder das Vektorkonstrukt kann nach Formulierung mit verschiedenen physikalischen Methoden eingeschleust werden, wie Lipofektion (Felgner et al., PNAS 84: 7413-7414, 1989), direkte DNA-Injektion (Fung et al., PNAS 80: 353-357, 1983; Seeger et al., PNAS 81: 5849-5852; Acsadi et al., Nature 352: 815-818, 1991); Mikroprojektilbeschuss (Williams et al., PNAS 88: 2726-2730, 1991); verschiedene Arten von Liposomen (siehe Wang et al., PNAS 84: 7851-7855, 1987); CaPO₄ (Dubensky et al., PNAS 81: 7529-7533, 1984); DNA-Ligand (Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989); Verabreichung als Nukleinsäuren ( WO 90/11092 ); oder Verabreichung von mit einem abgetöteten Adenovirus verknüpfter DNA (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992); via Polykationverbindungen wie wie Polylysin, mittels Rezeptor spezifischen Liganden, mit inaktivierten psoralen Viren wie Sendai oder Adenovirus, mittels Elektroporation oder druckvermittelter Übertragung. Weiter können die Vektorpartikel oder das formulierte Konstrukt entweder durch direkte Injektion in die gewünschte Stelle oder mit anderen klinisch akzeptablen Mitteln wie verschiedene Arten von Kathetern, die mit nur minimaler Unbequemlichkeit für den Patienten gesetzt werden können und ausschließender Injektion oder Freisetzung des Vektors mit Verfahren, die der Katheter möglich macht, wie Mehrfachinjektion, Einführung von radioaktiven Keimen, Gewebebruch und anderen Fachleuten bekannten Maßnahmen.
Vektorpartikel und formulierte Vektorkonstrukte können einer breiten Vielfalt von Geweben und/oder Zelltypen, wo Läsionen vorkommen können, verabreicht werden, einschließlich zum Beispiel dem Hirn und/oder Rückenmark, Knochenmark, Augen, der Leber, Nase, Rachen und Lunge, Herz und Blutgefäßen, Milz, Haut, Kreislauf, Muskeln, Prostata, Brust, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Zervix und anderen Organen.
EVALUIERUNG VON KREBSPATIENTEN
Jeder Patient mit einer beliebigen Tumorform wird überprüft und auf verschiedene Weisen in Abhängigkeit von den verfügbaren Mitteln und Verfahren und der Krankengeschichte eingestuft, um eine verlässliche Evaluierung und effektives Krankenmanagement zu ermöglichen (siehe zum Beispiel Medical Oncology: Basic Principles and Clinical Management of Cancer by Paul Calabresei, Philip S. Schein McGraw-Hill 1993, und Cancer, Principles and Practive of Oncology 5^th edition, Vincent T. DeVita, Jr., Samuel Hellman und Steven A. Rosenberg Eds. Lippincott-Raven 1997)). Beispielsweise ist Hodenkrebs anhand von Beta HCG, AFP und LDH, Darmkrebs häufig anhand des CEA-Spiegels, Prostatakrebs anhand des PSA-Spiegels und Eierstockkrebs anhand des CA-125-Spiegels nachweisbar. Tumore des Hals- und Nackenbereichs, der oberen Luftwege und des Verdauungstrakts können durch optische Inspektion ermittelt werden, da sie an hierfür leicht zugänglichen Örtlichkeiten auftreten. Dies trifft auch auf zervikalen Krebs zu. Bereiche, die nicht ohne Weiteres begutachtet oder abgetastet werden können, werden per Computertomographie oder Magnetresonanztomographie untersucht. Die Magnetresonanztomographie ist äußerst hilfreich bei der Bestimmung von Tumoren der Neuraxis und des Zentralen Nervensystems. Positronen-Emissions-Tomographie wird nicht routinemäßig zum Nachweis von Krebs eingesetzt. In den folgenden Abschnitten wird Prostatakrebs als ein Beispiel für die Entscheidungsfindung bei der Einstufung und für die Behandlung einer festen Tumorerkrankung verwendet.
PROSTATAKREBS, EINSTUFUNG DER PATIENTEN UND EINGESETZTE THERAPIEN
Wie vorstehend ausgeführt, betrifft Prostatakrebs eine große Zahl von Patienten mit annähernd 180000 neuen Diagnosen/Jahr in den USA. Die Einstufung und die Behandlung der Patienten ist standardisiert und gut definiert (siehe zum Beispiel J. E. Oesterlin, Z. Fuks, C. T. Lee und H. I. Scher „Cancer of the Prostate" in Vincent T. DeVita Jr. Et al eds op cit 1997, Chapter 33.4 und W. J. Catalona N. Eng J. Med. 331: 996-1004, 1994).

Prostatakrebs wird nach dem TNM-System (Tumorgröße, Knotenstatus, Metastasis) eingestuft. Tabelle 1: AJCC-Einstufungssystem für Prostatakrebs

Primärer Tumor
TX		Der primäre Tumor kann nicht beurteilt werden.
T0		Kein Hinweis auf primären Tumor
T1		klinisch nicht nachweisbarer Tumor, nicht tastbar oder mit Bild gebenden Verfahren sichtbar
	T1a	Zufallsbefund; Tumornachweis in < 5% des entfernten Gewebes
	T1b	Zufallsbefund, Tumornachweis in > 5% des entfernten Gewebes
	T1c	Tumor identifiziert mittels Nadelbiopsy (zum Beispiel anhand eines erhöhten PSA-Wertes)
T2		tastbarer Tumor begrenzt auf Prostata¹
	T2a	Tumor betrifft einen Lobus
	T2b	Tumor betrifft beide Lobi
T3		Tumorausdehnung über die Prostatakapsel²
	T3a	Extra-kapsuläre Ausdehnung (unilaterial oder bilateral)
	T3b	Invasion der Samenbläschen
T4		Tumor ist fixiert an oder infiltriert angrenzende Strukturen den Samenbläschen; Blasenhals, Sphincter externus, Rektum, Levatormuskel und/oder Beckenwand

¹Ein Tumor, der in keinem oder in beiden Lobi mittels Nadelbiopsie festgestellt wird, jedoch nicht tastbar oder zuverlässig nachweisbar mit Bild gebenden Verfahren ist, wird klassifiziert als T1c.
²Invasion der Prostataspitze oder der (jedoch nicht darüber hinaus) Prostatakapsel wird nicht als T3, sondern T2 klassifiziert.

B. regionale Lymphknoten (N)

NX

die regionale Lymphknoten können nicht beurteilt werden

N0

Keine regionale Lymphknotenmetastasen

N1–N3

Metastasen in einem oder mehreren regionalen Lymphknoten

Patienten mit Erkrankung der fernen Lymphknoten oder Metastasen gelten nicht als Kandidaten für die Strahlentherapie. Diese Patienten wurden hormonell behandelt. In Abhängigkeit von ihrem T-Stadium werden die Patienten in zwei Gruppen eingeteilt (siehe Tabelle 1 des AJCC Cancer Staging Manual, 5^th Auflage, Seite 220, 1997, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pennsylvania, USA), Gleason Score vor Behandlung (pathologischer Score basierend auf der Bewertung bei niederenergetischer Vergrößerung wird ein Score zugewiesen – siehe Gleason D. F., „Histological grading and staging of prostatic carcinoma", in Urologic Pathology – The Prostate M. Tannenbaum Ed. 1977, 171-198 Lea & Febiger Philadelphia) und Vorbehandlung Prostata spezifischer Antigenwert (PSA) vor Behandlung im Blut. Für gut prognostizierte Patienten ist keine weitere Einstufung zur Untersuchung auf Metastasen erforderlich. Diese Patientengruppe hat eine T2a Erkrankung oder weniger, Gleason Score weniger als oder gleich 6 und PSA < 10 ng/ml vor Behandlung. Patienten, die nicht unter diese Gruppierung fallen, benötigen ein Knochenscanning und ein CT des Abdomen und der Pelvis mit einem Bruströntgengerät. Patienten der schlecht prognostizierten Gruppe erhalten eine neo-adjuvante Hormonbehandlung zusammen mit der Bestrahlung.
Patienten der gut prognostizierten Gruppe können alternativ chirurgisch oder mit Bestrahlung als primäre Behandlung behandelt werden. Basierend auf Alter und Risiko-Faktoren (wie schwerwiegende medizinische Probleme) entscheidet der Chirurg, ob der Patient ein Kandidat für die Chirurgie ist. Ein Patient von über 70 Jahren wird im Allgemeinen mit einer Strahlentherapie behandelt. Zur Beschreibung des Risikos eines Lymphknotenbefalls, Befalls der Samenbläschen oder extrakapsuläre Ausdehnung zum Zeitpunkt der Operation verwenden Chirurgen häufig die Partin-Tabellen.
Für ungünstig prognostizierte Patienten ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass sie diese pathologischen Befunde zum Zeitpunkt der vorgeschlagenen Operation aufweisen, und dies verhindert, dass sich der Patient der Operation unterzieht. Bei Patienten, die sich einer Strahlentherapie unterziehen, werden begleitend die PSA-Spiegel beobachtet. Es wird erwartet, dass der PSA-Spiegel im Blut etwa 18 Monate nach Beendigung der Bestrahlung einen Tiefpunkt (Nadir) aufweist. Der PSA-Spiegel im Blut sollte weniger als 1,0 ng/ml betragen. Die Patienten mit schlecht prognostizierten Befunden vor Behandlung erhalten vor der Bestrahlung zwei Monate lang Hormone. Die Hormone werden üblicherweise über den gesamten Zyklus der Strahlentherapie verabreicht. Zu diesem Zeitpunkt weiß keiner, wie lange der Patient der Hormonbehandlung unterzogen werden soll und diese wird häufig gleichzeitig mit der Strahlentherapie beendet. Ein PSA-Spiegel sollten wiederum ungefähr 18 Monate nach Beendigung der Bestrahlung einen Tiefpunkt aufweisen, es sei denn, der Patient befindet sich noch in einer sich hinziehenden Hormonbehandlung. In diesem Fall gibt es einen definierten Zeitstrahl wann der PSA-Tiefpunkt auftreten sollte. Der PSA-Tiefpunkt von weniger als eins ist über annähernd 80% der Zeit ein Indikator für die Krankheitskontrolle.
Die Ergebnisse sind gut definiert und dokumentiert für die verschiedenen Stadien und Behandlungen. Sie werden als Prozent Patienten, ohne Hinweis auf eine Erkrankung nach 5 und 10 Jahren nach der Behandlung aufgrund einer Messung des PSA-Spiegels und klinischen Untersuchungen angegeben (siehe J. E. Oesterling, Z. Fuks, C. T. Lee and H. I. Scher „Cancer of Prostate" in Vincent T. DeVita Jr. Et al eds op cit 1997 Chapter 33.4). Aus diesen Zahlen ist ersichtlich, dass die Ergebnisse weit davon entfernt sind, perfekt zu sein und dass ein beträchtlicher Raum für Verbesserungen existiert. Beispielsweise zeigen etwa 50% (abhängig von der Studie) der T2-Patienten 5 Jahre nach chirurgischer Behandlung oder Strahlentherapie Hinweise auf ein Wiederauftreten der Krankheit. Diese Zahl erhöht sich auf 70% nach Strahlentherapie bei T3/4 Erkrankung (für diese Patienten stellt die Chirurgie keine Alternative dar).
Beispiel 1: Adenovirale Vektoren und deren Konstruktion
AdV.RSV-tk ist ein Replikations-defizienter rekombinanter Adenovirus mit dem HSV-tk Gen, bei dem die Transkription durch den RSV-LTR Promoter gesteuert wird. AdV-βgal ist ein ähnlicher Vektor mit einer β-Galaktosidase (β-gal) Expressionskassette. Diese Vektoren sind beschrieben und wurden mittels Standardverfahren hergestellt (Chen et al, Proc. Natl. Acad Sci USA 92: 2577-25812, 1995, Nyberg-Hofffman et al, Nauture Nedicine 3: 506-511, 1998). Der Vektorpartikel-Titer (v. p.) wurde mittels spektrophotometrischer Absorption und der Titer der infektiösen Einheit (i. u.), wie beschrieben, mittels serieller Verdünnung mit End-Punkt cytopathischem Effekt der 293 Zelllinie bestimmt (Nyberg-Hoffman et al., 1998 op. cit.). Beide Vektoren hatten Titer in einem Bereich von 5 × 10¹² vp/ml mit einem Verhältnis von vp zur infektiösen Einheit (IU) von weniger als 20.
Beispiel 2: Tiertumormodelle, die mit Adeno TK, Prodrug und Strahlentherapie zusammenwirken
Die Mausprostatakrebszellenlinie RM-1 wurde aus Mausprostatarekonstitutionsturmorgewebe (MPR) wie beschrieben, erhalten (Lu et al, 1992; Baley et al, 1995). Die Zellen wurden bei routinemäßigen Medienwechsel gehalten, vermehrt und bei 8 oder 9 in flüssigen Stickstoff gelagert. Für jeden Versuch wurde ein frisches Fläschchen gefrorene RM-1 Zellen eingesetzt.
Tumormodell und Vektorinjektion
Immunkompetente C57BL/6 und Balb/c Mäuse des Jackson Labors wurden für die RM-1 Injektionen eingesetzt. Die Tiere wurden in Einrichtungen gehalten, die von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care genehmigt worden waren. Alle Tierversuche wurden nach den Prinzipien und Verfahren gemäß dem National institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Zum Zeitpunkt der Versuche waren die Tiere annähernd 6 Wochen alt und jedes wog etwa 20 g. Tumore wurden durch subkutane Inokulation von 1 × 10⁴ RM-1 oder TM-40D Zellen in 50 μl (Prostata beziehungsweise Brust) erzeugt. Diese Zelldosis ergab Tumore von 50–60 mm³ nach 5–7 beziehungsweise 21–28 Tagen. Die Tumorimplantate befanden sich in der hinteren Flanke, um Komplikationen durch Beeinträchtigung der inneren Organe durch Streustrahlung zu vermeiden. Die AdV.RSV-tk Dosis wurde durch Untersuchungen mit ansteigender Dosis mit Dosen von 1 × 10⁹ bis 1 × 10¹¹ v. p. in 20 μl pro Tumor ermittelt, gefolgt von einer intraperitonealen (IP) Verabreichung von GCV mit 20 mg/kg zweimal täglich über sechs Tage. Die Nadel wurde durch den intradermalen Trakt geführt bevor sie auf die Tumormasse traf, um ein Herausfließen des Vektors bei Zurückziehen der Nadel zu minimieren. Die Tumorgröße wurde alle vier Tage an zwei senkrechten Achsen mit Vernier Caliper gemessen und das Tumorvolumen wurde mit der Formel (a × b²)/2 berechnet, wobei a die längere und b die kürzere Achse des Tumors ist (Miller et al, 1988).
Die Tumor- und Zellinjektionen, Vektorinokulierungen und Strahlentherapie wurde unter Narkose mit Pentobarbital in einer Dosis von 50 μg/g durchgeführt. Im Rahmen der Nachbehandlung wurden die Tiere warmgehalten, indem sie auf ein Heizkissen gegeben wurden, um sich von der Narkose zu erholen. Die Tiere wurden auf lokale Infektionen hin, Futter- und Flüssigkeitsaufnahme, Fellpflege und Aktivität überwacht, um Spätfolgen erkennen zu können. Sobald die Tumorgröße einen maximalen Durchmesser von 25 mm für eine Achse überschritt oder ein Tier Anzeichen von gesundheitlichen Schäden wie schwerwiegenden Gewichtsverlust, Schwierigkeiten beim Atmen, körperliche Beeinträchtigungen oder spärliches Fell zeigte, wurden diese Tiere eingeschläfert.
Strahlentherapie
Tumore von 50–60 mm³ wurden mit einem Orthovoltage Röntgengerät mit Einzeldosen von 5, 10 und 15 Gy bestrahlt. Das umgebende Gewebe wurde ausreichend abgeschirmt, um eine unnötige Bestrahlung der inneren Organe und Strahlenschäden zu vermeiden.
Die Tiere wurden auf Anzeichen einer strahlungsinduzierten Toxizität hin überwacht.
Für Kombinationstherapiestudien wurden AdV/RSV-tk oder AdV/RSV-β-gal (3 × 10¹⁰ v. p./Tumor) wie vorstehend beschrieben direkt in den Tumor, injiziert. 72 Stunden nach der Vektorinjektion wurden die Tumore mit einer Einzeldosis von 5 Gy bestrahlt. Die Tiere und die Tumorgrößen wurden wie vorstehend beschrieben, überwacht.
Histologie und Immunologie
Gewebe wurde in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5-mm-dicke Scheiben geschnitten und anschließend mit Hematoxylin und Eosin für die histologische Evaluierung eingefärbt. Für die immun-histochemische Analyse wurden die Tumorproben mit flüssigem Stickstoff in Tissue-Tec OCT compound angefroren. Sie wurden in 6 μm-Schnitten auf mit Polylysin beschichtete Objektträger gegeben und in kaltem Aceton/Methanol (1:1) bei –20°C 20 Minuten fixiert. Die immun-histochemische Färbung wurde mit Avidin-Biotin-Peroxidase Vectastain Elite ABV kit (Vector Laborstories, Burlingame, CA) durchgeführt. Primäres Ratten-Antimaus CD4 und CD8 wurde von Pharmingen (San Diego, CA) und Anti-F4/80 (Antimakrophage) von Serotec, (Oxford, UK) bezogen. Die Verdünnung der Antikörper betrug 1:100 für Anti-CD4 und Anti-CD8 und 1:400 für Anti-F4/80.
Die Immunreaktionsprodukte wurden mit DAB/H₂O₂ sichtbar gemacht. Positiv gefärbte Zellen wurden blind unter einem Mikroskop durch Screening des Krebsbereichs gezählt.
Die Ergebnisse wurden als Anzahl immunpositive Zellen pro mm² Krebsbereich erfasst.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse der Daten in Bezug auf Tumorwachstum und Immunkomponenten, die bei den verschiedenen Behandlungsgruppen beobachtet worden sind, wurden mit dem Studenten T-Test und ANOVA (Analysis of Variance) durchgeführt. Zudem wurden die Überlebenskurven mit dem Wilcoxon-Test verglichen.
Bestimmung der AdV/RSV-tk- und Strahlendosen
Um einen Synergismus des HSV-tk Gens und der Strahlentherapie bewerten zu können, war die Ermittlung der effektiven, aber nicht heilenden Dosis für jedes Mittel erforderlich. Um die Vektordosis für diese Studie auszuwählen, wurden subkutan erzeugte Mausprostata- oder Brusttumore direkt mit ansteigenden Vektordosen AdV-tk injiziert, und anschließend 24 Stunden später 6 Tage IP GCV mit 20 mg/kg b. i. d. injiziert. Es wurden AdV-tk Dosen von 1 × 10⁹, 3 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 3 × 10¹⁰ und 1 × 10¹¹ (v. p.) pro Tumor analysiert (1A). Alle behandelten Gruppen zeigten eine Verzögerung des Tumorwachstums ohne statistisch signifikanten Unterschied (p > 0,1) zwischen den drei höchsten Dosen am 4., 8. und 12. Tag nach der Vektorinjektion. Keine der behandelten Gruppe wurde geheilt und es wurde keine offenkundige Toxität beobachtet. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine Dosis von 3 × 10¹⁰ (v. p.) pro Tumor für die Kombinationstherapiestudien ausgewählt.
Um eine Strahlungsdosis auszuwählen, wurden 5, 10 und 15 Gy Einzeldosen verglichen. Für alle drei Dosen wurde eine Verzögerung des Tumorwachstums beobachtet, jedoch gab es einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen 5 Gy und den zwei höheren Dosisgruppen mit p < 0,002 (1B) am 8. und 12. Tag nach der Vektorinjektion. Die höheren Dosen ergaben eine signifikante Tumornekrose. Es konnte kein signifikanter Unterschied des Tumorwachstums zwischen 5 Gy und den Kontrollen beobachtet werden (p > 0,2). Für keine der Strahlendosen konnte eine systemische Toxizität beobachtet werden.
Ausgehend von diesen Daten wurde eine Strahlendosis von 5 Gy für die Kombinationstherapiestudien ausgewählt.
Kombinierte Therapie in vivo
Für die Kombinationstherapiestudien wurden sechs Gruppen erstellt. Die erste war eine Kontrollgruppe ohne Behandlung und erhielt lediglich PBS-Injektionen. Die zweite war eine Kontrollgruppe auf nichtspezifische Wirkungen des Vektors und erhielt AdV-β-gal Injektionen. Die dritte und vierte waren Kontrollgruppen auf die Wirkung der Einzeltherapien und erhielten entweder AdV-tk + GCV oder 5 Gy Röntgenstrahlung. Die fünfte war eine Kontrollgruppe auf potentielle nichtspezifische Wechselwirkungen zwischen der Röntgenstrahlung und den adenoviralen Vektoren. Diese Gruppe erhielt AdV-β-gal und 5 Gy Röntgenstrahlung. Die sechste Gruppe waren die Versuchstiere und erhielt AdV-tk + GCV und 5 Gy Röntgenstrahlung. Wie erwartet, zeigten die beiden Einzeltherapien eine Inhibierung des Tumorwachstums im Vergleich zu den Kontrollen (2A). Das Tumorvolumen stabilisierte sich und die Tiere machten über die 8 Tage nach der Behandlung im Vergleich zu den AdV-β-gal und PBS Kontrollgruppen einen gesunden Eindruck. Alle Tiere der AdV-tk + GCV plus Bestrahlungsgruppe erschienen bis 12 Tage nach der Behandlung gesund. Eine statistisch signifikante Inhibierung des Tumorwachstums konnte für die Gruppe mit der kombinierten Therapie im Vergleich zu allen anderen Gruppen beobachtet werden, p < 0,02 (2A). Bemerkenswert ist, dass die AdV-β-gal Kontrollgruppe eine Verzögerung des Tumorwachstums aufwies, die vergleichbar mit der der Gruppen mit Monotherapie am Tag 8 war, obwohl die Gruppe an Tag 4 und 12 ein signifikant erhöhtes Tumorwachstum zeigte (00,006). Zudem zeigte die Gruppe mit AdV-β-gal + Röntgenstrahlung eine größere Verzögerung des Tumorwachstums am Tag 8, als die anderen Gruppen mit Monotherapie einschließlich der AdV-tk Gruppe (p = 0,029) und der Gruppe mit Röntgenstrahlung (p = 0,077), ein Unterschied, der an Tag 4 und 12 der Behandlung nicht beobachtet wurde (p > 0,2).
Die Studien der Überlebensdauer ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen Tieren, denen PBS beziehungsweise AdV-β-gal verarbeitet worden war, mit einer Überlebenszeit von 13,8 beziehungsweise 14,3 Tagen. Die Einzeltherapien ergaben eine im Vergleich zu den Kontrollgruppen (p < 0,02) verbesserte Überlebensrate mit einer mittleren Überlebensdauer von 16,4, 16,8 und 18,5 Tagen für AdV.RSV-tk, Röntgenstrahlung- beziehungsweise AdV-β-gal + Röntgenstrahlung-Gruppen. Zwischen den drei Einzeltherapiegruppen konnte kein signifikanter Unterschied beobachtet werden (p > 0,1). Die Gruppe mit Kombinationstherapie zeigte mit einer mittleren Überlebensrate von 22 Tagen eine signifikante Verbesserung im Vergleich zu den Gruppen mit Einzeltherapie oder den Kontrollgruppen, p < 0,01.
Histologische Untersuchungen ergaben eine moderate bis hohe allgemeine lymphozytische Infiltration und fleckige nekrotische Bereiche für die Gruppe mit Kombinationstherapie. Ein statistisch signifikanter Anstieg der CD4+ Infiltration wurde für diese Gruppe im Vergleich zu den Gruppen mit Einzeltherapie und den Kontrollgruppen beobachtet, p < 0,01. Die CD8+ Zellen waren ebenfalls in der Gruppe mit Kombinationsbehandlung erhöht, jedoch war dies nicht signifikant. Es wurden keine signifikanten Unterschiede der Anzahl an Makrophagenmarker für positive Zellen zwischen den einzelnen Gruppen beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3: Verwendung von adenoviralen Vektoren in Verbindung mit radioaktiven Keimen
Adenovirale Vektoren wurden in drei 500 μl Aliquots in Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, die radioaktive Goldkeime mit wenigstens 100% rated Aktivität enthielten. Goldkeime haben eine Halbwertszeit von 2,5 Tagen. Als Kontrolle wurden Aliquots an einen von den Goldkeimen entfernten Platz gelagert. Die Aliquots wurden auf eine Rotationsplattform gesetzt, um eine konstante Mischung zu erhalten. 10 bis 25 μl Proben wurden nach 15, 30 und 60 Minuten sowie nach 8, 24, 48 und 72 Stunden genommen und anschließend titriert. Der Titer der Proben, die mit den radioaktiven Goldkeimen in Kontakt waren, war statistisch der gleiche, als der der Kontrollaliquots. Diese Ergebnisse zeigen, dass adenovirale Vektoren zusammen mit radioaktiven Keimen injiziert werden können, ohne dass die Wirksamkeit der adenoviralen Vektoren beeinträchtigt wird.
Beispiel 4: Wirkungen von Adeno TK, Prodrug und Strahlentherapie auf Metastasen
Tumore wurden durch subkutane Inokulation von 1 × 10⁴ und Schwanzvenen Inokulation von 5 × 10¹⁰ RM-1 Zellen erzeugt. Wir verglichen die Kombinationstherapie mit zwei Einzeltherapien und Kontrollen ohne Behandlung. AdV/RSV-tk wurde in einer Dosis von 3 × 10¹⁰ AdV-tk in 20 μl dem subkutanen Tumor injiziert. Die Behandlung mit Ganciclovir startete 24 Stunden nach der HSV-tk Injektion und eine Einzeldosis an Strahlung von 5 Gy wurde 72 Stunden später verabreicht. Die Brusthöhle wurde 10 Tage nach der Vektorinjektion auf Tumore hin untersucht. Es wurden Lungenschnitte angefertigt und mit Pikrinsäure fixiert und die Tumorknoten gezählt. Wie kürzlich (Timme TL et al., Cancer Gene Ther. Mar-Apr: 5 (2): 74-82. (1998)) und in den anliegenden Figuren gezeigt, ergab die Therapie mit HSV-tk eine signifikant reduzierte Lungenkolonisation (p < 0,05). Allerdings ergab die Kombinationstherapie eine weitere beträchtliche Verringerung der Anzahl an Metastasen in der Lunge (p < 0,05).
Beispiel 5: Hyper-Antigen-Wirkung von HSV-TK
Der Einsatz der viralen Vektoren löst eine Kaskade von T-Zellen vermittelten Reaktionen aus einschließlich einer zytotoxischen (CTL) T-Zelleneffektorfunktion sowie T-Zellen abhängige Antikörperproduktion als Reaktion auf spezifische Vektorproteine. Zelluläre Debris und mit Tumorabtötung assoziierte Apoptose bewirkten eine nichtspezifische Entzündungsreaktion. Makrophagen infiltrieren die unmittelbare Umgebung, nehmen apoptotische Körper auf und präsentieren verwandten T-Zellen Antigen. Dieses dynamische Milieu ermöglicht es dem Immunsystem eine komplexe Reaktion auf den Vektor, den Tumor und mögliche Transgene zu entwickeln. Immunantworten können mögliche Antitumorimmunreaktionen verstärken, was vorteilhaft ist.
Ein Großteil von Menschen hat zirkulierende Antikörper und Gedächtnis-T-Zellen, die für herkömmliche Adenovirusserotypen (*) spezifisch sind. Bei entsprechender Herausforderung entwickeln diese Menschen signifikante Reaktionen einschließlich Antikörpersekretion, Klassenwechsel bei B-Lymphozyten und T-Zelleffektorfunktion. Diese Reaktionen spielen eine signifikante Rolle für den Erfolg von in vivo klinischen Versuchen und experimentellen Modellen.
Weiter wurde eine Immunreaktion auf spezifische Transgene dokumentiert. Es wird angenommen, dass diese intrazellulären Proteine verarbeitet werden und in den herkömmlichen Major Histocompatibility Complex (MHC) der Klasse I als Peptidantigene eingreifen und zytotoxische Lymphozyt (CTL)-Reaktionen von verwandten T-Zellen hervorrufen. Es gibt einige Hinweise für die Entwicklung von Anti-Transgenantikörper, die von CD4 T-Zellen und dem MHC der Klasse II abhängen. Daher aktiviert die Verabreichung von Transgenen durch virale Vektoren das Immunsystem des Wirts mittels verschiedener Mechanismen signifikant. Wir wollten die Immunreaktion auf HSC-tk, dem am häufigsten eingesetzten Suizidgen, in einem adenoviralen Gerüst charakterisieren.
Zu unserer Überraschung kann HSV-tk die Proliferation von naiven T-Zellen lediglich in Gegenwart eines MHC-Klasse II Allels unterstützen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass HSV-tk ähnlich einer Gruppe von gut charakterisierten Proteinen, die Superantigene (SAgs) genannt werden, inhärente immunstimulierende Eigenschaften aufweisen. Definitionsgemäß lagern sich diese Proteine an viele MHC-Klasse-II Isotypen außerhalb der Antigenbindungsgrube an. Anschließend wird diese bipartite Wechselwirkung durch Bindung an relativ invariable Bereiche des TCR weiter stabilisiert. Polyklonale Aktivierung von T-Zellen mit dem geeigneten Element führt zu einer massiven Sekretion von Cytokinen. Dieses Zusammenspiel mit dem Immunsystem unterliegt Toxizitäten, die durch SAgs vermittelt werden. Diese Proteine werden von einer breiten Bandbreite von Phatogenen einschließlich von Gramm (+)-Cocci und Retroviren ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, hervorgerufen. Die Konservierung der Funktion und biologischen Aktivität, obwohl keine strukturelle Homologie zwischen sehr verschiedenen Organismen vorliegt, deutet darauf hin, dass diese Proteine während der Infektion des Wirts oder des Lebenszyklus des Pathogens einen selektiven Vorteil darstellt. Wir vermuten, dass HSV-tk ein neues virales Superantigen oder schwaches Mitogen für humane T-Lymphozyten ist. Diese Beobachtung kann einen profunden Einfluss auf die Sicherheit und/oder Wirksamkeit von HSV-tk als therapeutisches Mittel in der Gentherapie haben.
Stimulationsvermögen in vitro von Adenovirus mit HSV-tk t
Ad5Tk wurde zur Transduktion von Maus-L-Zellen (MHC-Klasse II negativ) und L-Zellen verwendet, in die menschliches Klasse-II (DR, DP und DQ) eingeschleust worden war. Diese Zellen wurden als Antigen präsentierende Zellen (APC) für xenogene, allogene und syngene T-Lymphozyten verwendet. Mit DR-1 transfizierte (Klon D.5-3.1) oder parentale L-Zellen wurden mit Ad5 mit_-Galaktosidase, HSV-tk oder VSag-7 (ein retrovirales Maussuperantigen) transduziert. Wir untersuchten die Fähigkeit dieser Zellen, die T-Zellproliferation in Verbindung mit einem spezifischen präsentierenden Molekül zu unterstützen. HSV-tk jedoch nicht die Insertkontrolle unterstützte die T-Zellproliferation. Die Proliferation war lediglich in Gegenwart von menschlichem MHC-Klasse II evident. Der spezifische Parameter einer MHC-Klasse II-Abhängigkeit ist für Artefakte nicht charakteristisch. Als nächstes untersuchten wird, ob HSV-tk auf DR-1 beschränkt war, oder ob zwei weitere menschliche Isotypen die T-Zellproliferation unterstützen würden. Transfektanten der DQ- und DP-MHC-Klasse II wurden als Antigen präsentierende Zellen (APC) in vergleichbaren T-Zellassays eingesetzt. Alle drei Allele konnten eine ähnliche titrierbare Inkorporation von mit Tritium markierten Thymidin fördern. Das Ausmaß der T-Zellstimulierung war größer als die nominalen Antigenreaktionen. Charakteristisch für die Form der Dosis-Titrations-Kurven war ein moderater Anstieg und geringe maximale Amplitude und die Unabhängigkeit von T-Zelldonor und transfizierten Allel. Diese Eigenschaft weist darauf hin, dass die Wirksamkeit ein Charakteristikum von HSV-tk selbst wiederspiegelt. Die absoluten Bereiche der individuellen Reaktionen lag zwischen 15000 cpm bis 60000 cpm bei einem Durchschnitt von etwa 25000 cpm.
Vektor und Insert-Kontrollen
Wir zeigten, dass HSV-tk, das innerhalb eines adenoviralen Gerüstes enthalten war, die T-Zellproliferation in Gegenwart eines unbeschränkten MHC-Klasse II-Moleküls unterstützen konnte. Aufgrund der Beobachtung, dass β-Galaktosidase und andere Inserte den gleichen Typ an T-Zellproliferation nicht unterstützen konnten, wurde angenommen, dass diese T-Zellproliferation insertabhängig ist. Die Analyse der Inserts umfasste Anti-Trypsin (eine sekretiertes Protein) grün floureszierendes Protein (aus Quallen) oder IDS (menschliches Protein). Als zweites untersuchten wir Wildtyp-Ad5. Die T-Zellproliferation wurde durch verschiedenen Konzentrationen Wildtyp-Ad5 nicht unterstützt, jedoch reagierten Zellen des gleichen Donors auf AdTk. Diese Versuchsreihen stimmten mit der Beobachtung überein, dass HSV-tk die T-Zellproliferation spezifisch begünstigt. Jedoch war unklar, ob Ad5tk ein adenovirales Genprodukt transaktiviert und indirekt die MHC-Klasse II abhängige T-Zellproliferation fördert. Um zu untersuchen, ob HSV-tk seine Mitogenizität außerhalb eines adenoviralen Gerüsts beibehält, schufen wir doppelt stabile Transfektanten, die DR-1 (nachgewiesen durch Durchflusszytometrie) und HSV-tk (nachgewiesen aufgrund der Empfindlichkeit auf GCV) exprimieren, mittels plasmidvermittelter Transfektion und Arzneimittelselektion. Drei unabhängige Klone wurden auf ihre Fähigkeit hin gescreent, die T-Zellenproliferation zu unterstützen. C5, ein GCV-sensitiver DR-1⁺-Klon, unterstütze durchgängig die T-Zellproliferation mehr das Neomyzinplasmid. Im Vergleich zu DR-1 exprimierte 05 geringere Gehalte an MHC-Klasse II. Diese Beobachtung lässt uns annehmen, dass HSV-tk nicht nur eine gemischte Lymphozytenantwort auf MHC-Klasse II Determinaten verstärkt, die invariabel inkongruent sein würde. Wurde weiter ein individuell angepasstes MHC-Klasse II als Donor eingesetzt, wurden die T-Zellen als Reaktion auf HSV-tk vermehrt, jedoch nicht auf DR-1. Diese Beobachtungen zusammen mit der Größenordnung der Reaktion (ohne endogene Ko-Stimulation betrugen die MLR-Reaktionen generell weniger als 5000 cpm) sprechen gegen eine allogene Reaktion. Es ist interessant anzumerken, dass eine Korrelation zwischen der DR-1-Expression und T-Zellproliferation der drei stabil transfizierten Klone bestand. Bei der Mehrheit der Donoren wurde eine Reaktion auf HSV-tk beobachtet, diese war jedoch nicht absolut (20 im Test). Nichts desto trotz ist die Fähigkeit von vielen Donoren auf HSV-tk in Gegenwart von DR-1 und nicht den Haplotyp der MHC-Klasse II für die die T-Zellen ausgewählt waren, ein weiterer Hinweis, dass HSV-tk ein unbeschränktes MHC-Klasse II abhängiges T-Zellmitogen ist.
Blastogenese von T-Zellen nach Stimulierung mit HSV-tk exprimierenden DR-1⁺-Fibroblasen
Es wurde eine Durchflusszytometrie der T-Zellen durchgeführt, um den Prozentsatz von Zellen zu bestimmen, der eine Verschiebung des Vorwärtsstreulicht versus dem Seitwärtsstreulicht zeigte. Diese Art von Verschiebung ist konsistent mit verschiedenen Arten von Mitogenen und Superantigenen. Abhängig vom Donor findet sich ein 2–3-facher Anstieg der Gesamtzahl an Fibroblasten im Vergleich zu der allogenen Reaktion auf DR-1. Die Blastenseite enthielt Zellen, die mittels Propidiumiodidfärbung als zyklisierend bewertet wurden. Diese Zellen waren CD3⁺ und die meisten waren CD25⁺, dies deutet darauf hin, dass die Zellen aktiviert waren, und mit Tritium markiertes Thymidin ist ein wahres Maß für den DNA-Turnover, nicht jedoch zelluläre Thymidingehalte. Keine Zellfärbungen bei K^k, ein MHC-Klasse I-Marker auf L-Zellen. Der Mangel an K^k-positiven Zellen zeigt eindeutig, dass die Blasten von Natur aus keine Fibroblasten sind. Die mikroskopische Untersuchung stimmte mit den Daten der Durchflusszytometrie überein. Sichtbare Aggregate von Lymphozyten wurden in Lösung in Gegenwart von HSV-tk und DR-1 beobachtet. Einige kleinere Zellklumpen wurden am Langzeitpunkt mit DR-1 Stimulierung beobachtet, was mit einer allogenen Reaktion übereinstimmt.
Beispiel 6: Behandlung von Patienten mit Adeno-TK, Valacyclovir und externer Strahlentherapie
Dies ist ein Beispiel für Designs von bestehenden klinischen Studien mit denen die Wirkungen einer Kombination einer Adtk-Therapie und Strahlentherapie auf eine primäre und metastatische Erkrankung untersucht werden kann. Als Beispiel dient das Prostatamodell, jedoch ist dieser Ansatz nicht auf diese Erkrankung beschränkt.
Die Studie umfasst drei Teile (zur Personenauswahl siehe unten). Teil A betrifft Patienten mit geringem Risiko (mit günstiger Prognose), Teil B betrifft Patienten mit hohem Risiko (mit ungünstiger Prognose) und Teil C betrifft Patienten mit lokal fortgeschrittener Erkrankung. Patienten der Teile B und C erhielten eine neoadjuvante androgene Ablation als Teil der Standardbehandlung. Nach HSV-tk + Valacyclovir Behandlung wurde die klinische Reaktion überprüft anhand von Änderungen des PSA-Serumgehalts und digitaler Rektaluntersuchung sowie mittels histologischer Veränderungen in Folgebiopsien wie Vorliegen von Apoptose, Nekrose, Tumorproliferation und immunologischer Reaktion. Es wurden auch Blutproben zur Beurteilung der systemischen immunologischen Reaktion genommen. Serumtestosteron wurde gemessen. Zudem wurden die Patienten strikt überwacht, um den Tiefpunkt des PSA, das Nichtvorliegen einer PSA-Progression und das Nichtvorliegen einer lokalen Progression und Fernprogression sowie allgemein die Überlebensrate zu bewerten.
8.0 PROTOKOLLBESCHREIBUNG
8.1 Patientenregistrierung
Patienten konnten an dieser Untersuchung teilnehmen, indem sie das Informations- und Zustimmungsformular für dieses Protokoll ausfüllen. Deren Eignung (Anlage 2) wurde durch den Datenmanager des Department of Radiotherapy, Baylor College of Medicine, bestätigt. Die Patienten wurden den Gruppen durch den Datenmanager zugeteilt. Die Teilnahme oder Nichtteilnahme an dieser klinischen Studie hatte keinen Einfluss auf andere Therapien, für die der Patient geeignet sein könnte.
8.2 Datensammlung und Monitoring
8.2.1 Überwachung der Studie
Die Forscher erlauben den Überwachern der Studie und dem FDA die Einsicht in die Unterlagen dieser Studie (zum Beispiel Zustimmungsformulare, Analysenzertifikate, Fallberichte und sachdienlichen Krankenkarten).
8.2.2 Bericht über Nebenwirkungen
Nebenwirkungen (Adverse Reactions (ADRs)) werden unverzüglich der FDA, RAC und IRB mitgeteilt. Berichte über Nebenwirkungen sind erforderlich, selbst wenn lediglich ein Verdacht auf eine Arzneimittelwirkung vorliegt. Zuvor nicht bekannte Stufe 2- oder 3-Reaktionen werden schriftlich innerhalb von 10 Arbeitstagen mitgeteilt. Stufe-4-Reaktionen und Tod von Patienten während der Behandlung werden telefonisch innerhalb von 24 Stunden mitgeteilt. Ein schriftlicher Bericht folgt innerhalb von 10 Arbeitstagen.
8.2.3 Änderungsverfahren für das Protokoll
Änderungen des Protokolls werden von allen Forschern, der FDA und je nach Bedarf Weiteren diskutiert. Wird der Änderung des Protokolls zugestimmt, wird eine formale Liste der Änderungen dem verbesserten Protokoll beigefügt und der FDA, IRB am Baylor College of Medicine und anderen zuständigen Komitees übermittelt.
8.2.4 Veröffentlichungen aus dieser Studie
Jedes Manuskript, Zusammenfassung oder Präsentation wird allen Forschern der Studie, die an diesem Protokoll beteiligt sind, zur Verfügung gestellt. Innerhalb der gesetzlichen Schranken werden die Personen und die Daten dieser Studie vertraulich behandelt.
8.3 Verfahren (Anlage 3) und therapeutische Mittel
8.3.1 Übertragung des HSV-tk Gens
Vor der Injektion erhalten alle Patienten ein orales Breitbandantibiotikum, das b. i. d. einzunehmen ist, beginnend mit dem Tag vor der Injektion. Dies wird 3 bis 5 Tage fortgesetzt. Zur Lokalisierung von 4 Stellen für die intra-prostatische Injektion, jeweils zwei in jeden Prostata-Lobus, wird transrektaler Ultraschall eingesetzt. Am Tag 0 wird mit einer 20 gauge Nadel insgesamt 1 bis 2 cc AdV.HSV-tk adenovirs Vektor (ein zu dem für IND-6371, 6636 und 7311 eingesetzten Vektor identischer Vektor) (siehe Anlage 4) injiziert (bis zu 1 cc in jeden lateralen Lobus) Auf Basis der Toxizitätsergebnisse aus der Phase I Dosissteigerungsstudie am Baylor wurden insgesamt 5 × 10¹¹ Vektorpartikel pro Tumor injiziert. Zur Verhinderung einer möglichen Ausflussbehinderung als Folge der Prostatainjektion kann nach der Injektion ein Foleykatheter eingesetzt werden. Bei den Patienten von Teil A wurde die adenovirale Intra-Prostata Injektion am Tag 14 wiederholt. Bei Patienten von Teil B wurde die adenovirale Intra-Prostata Injektion an Tag 56 und 70 wiederholt.
8.3.2 Valacyclovir Verabreichung
Die Behandlung mit Valacyclovir (siehe Anlage 5) beginnt 24 Stunden nach jeder Virusinjektion mit einer Dosis von 2 gm p. o. tid und erfolgt über 14 Tage. Diese Dosis wurde so berechnet, dass sie eine vergleichbare Kurvenfläche ergab (auc, h-μg/ml) wie 10 mg/kg I. V. Acyclovir, das alle 8 Stunden verabreicht wurde. Das ist das gleiche Dosisregime wie in IND 7311 „Phase I Study of Concomitant Adenovirus-Mediated Transduction of Ovarian Cancer with HSV-tk Gene followed by Intravenous Administration of Acyclovir and Chemotherapy with Topotecan in Patients After Optimal Debulking Surgery for Recurrent Ovarian Cancer"). Daher erhalten Patienten von Teil A Valacyclovir vom 1. bis 14. und 15. bis 28. Tag. Patienten von Teil B erhalten Valacyclovir am 1. bis 14., 57. bis 70. und 71. bis 84. Tag.
8.3.3 Androgen Deprivation
Für die Patienten mit hohem Risiko beginnt die Androgen Deprivation zusammen mit der ersten adenoviralen Injektion am Tag 0. Die Behandlung besteht aus einer IM-Injektion von LHRH-Agonist Leuprolid Acetat Depot (Lupron Depot, 30 mg – Anlage 5) und Flutamid (Eulexin, 125 mg × 2 mündlich t. i. d. – Anlage 5). Dies ist unser Standard eines Androgen Deprivationsregimes. 30 mg Lupron halten vier Monate vor. Flutamid wird die ersten zwei Wochen zusammen mit Lupron verabreicht.
8.3.4 Strahlentherapie
Die Strahlentherapie beginnt 48 bis 72 Stunden nach der ersten Injektion für Teil A und 48 bis 72 Stunden nach der zweiten Adenovirus Vektorinjektion für Teil B und C. Hochenergetische Photonen (> 10 MV) und eine Gesamtdosis von 70,0 Gy verabreicht in 2 Gy/Fraktion wird der Isodoseis-Linie, die die Prostata der Teile A und B abdeckt, verabreicht. Teil C werden 45 Gy in 1,8 Gy/Fraktion der Pelvis verabreicht, um die Beckenlymphknoten zu erfassen und die Prostata wird zudem mit 26 Gy in 2 Gy/Fraktion bestrahlt.
9.0 TEILNEHMER UND EVALUIERUNG DER BEHANDLUNG
9.1 Patientenauswahl
Alle Patienten mussten ein durch Biopsie belegtes Adenokarzinom der Prostata aufweisen.
Patienten von Teil A sollten zudem die folgenden Merkmale aufweisen: PSA < 10, Gleason score ≤ 6 und Klinisches Stadium T2a.
Patienten von Teil B sollten wenigstens eines der folgenden Charakteristiken aufweisen: PSA ≥ 10, Gleason score > 6 und Klinisches Stadium T2b-T3.
Patienten von Teil C sollten eine pathologische regionale Lymphknotenbeeinträchtigung des Prostatakrebs aufweisen.
Keine vorhergehende chirurgische, hormonelle oder strahlentherapeutische Behandlung der Prostata.
Kein Hinweis auf metastatische Erkrankung oder andere Malignität (abgesehen von einem squamösen Karzinom oder Basalzellkarzinom).
PSA-Bestimmung innerhalb von 3 Monaten ab Einlieferung der Patienten.
Vor der Registrierung müssen die Patienten eine spezifische Informations- und Zustimmungserklärung durchlesen.
Die Patienten müssen eine angemessene organische Grundfunktion aufweisen, die mittels der folgenden Laborwerte vor Beginn des Protokolls beurteilt wurde:
Serumkreatin < 1,5 mg/dL
T.bilirubin < 2,5 mg/dL, ALT, AST, GGT und AP < 2 × normal
Pts > 100000/ml³, ANC > 1500/ml³, Hgb > 10 gm/dL
Normale partielle Thromoplastinzeit (PTT) und Pro-Thrombinzeit (PT)
9.2 Ausschlusskriterien
Hinweis auf metastatische Erkrankung oder Beeinträchtigung der Lymphknoten (außer regionale iliakale Lymphknotenbeeinträchtigung bei Teil C.
Vorhergehende Prostatachirurgie (Hyperthermia, Kryotherapie, etc.)
Vorhergehende Strahlentherapie der Pelvis
Vorhergehende androgene Ablationshormontherapie (mit Ausnahme von Finasterid, falls mehr als 3 Monate vor Registrierung abgesetzt)
Patienten, die mit Korticosteroiden oder einen immunsupressiven Arzneimittel behandelt werden
HIV + Patienten
Patienten mit akuten Infektionen (Virus-, Bakterien- oder Pilzinfektionen, die therapeutisch behandelt werden müssen)
Patienten mit Zirrhose.
9.3 Evaluierung vor Behandlung
Untersuchung der Krankheitsgeschichte und körperliche Untersuchung einschließlich Prostatadiagramm, Größe und Körpergewicht
Hämatologische-CBC, PLTS, PT, PTT
Labor-Na, K, CL, CO₂, BUN, Cr, LDH
Leberfunktionstests – AST, ALT, AP, GGT, Gesamtbilirubin
Urinanalyse
PSA innerhalb von 3 Monaten ab Registrierung
Sextantbiopsie der Prostata – außerhalb der Pathologie zur Überprüfung bei Baylor
CT der Pelvis bei Teil B Patienten, um eine Lymphknotenerkrankung auszuschließen.
Röntgenaufnahme des Brustkorbs (Rück- und Vorderansichten) und Knochenscans bei Teil B Patienten. Falls angezeigt, wird eine Totalaufnahme angefertigt. Kernspintomographie zur weiteren Untersuchung von verdächtigen Bereichen.
Bei Teil A Patienten wird der Testosteronspiegel geprüft.
Bei Teil B Patienten erfolgt ein Lymphknotenschnitt der Pelvis (entweder offen oder laparoskopisch). Lymphknotenmetastasen der Pelvis müssen pathologisch bestätigt werden.
9.4 Evaluierung während der Behandlung (Anlage 3)
Am Tag 0 erfolgt eine erste ADV HSV-tk Injektion. Blut wird für PSA- und immunologische Untersuchungen entnommen.
Harnabgangstest: Bei Bedarf kann unmittelbar nach viraler Injektion ein Foley Katheter gesetzt werden und innerhalb von 24 Stunden entfernt werden. Kann der Patient keinen Harn lassen, wird der Katheter wieder eingesetzt und Harnabgangstests werden wie angegeben wiederholt.
Physische Untersuchungen werden wöchentlich durchgeführt, um akute mit der Behandlung einhergehende Toxizität zu überwachen.
Chemische Untersuchungen: CBC der Blutkörperchen wird für alle Patienten über den gesamten Zeitraum der Behandlung wöchentlich überprüft. AST, ALT, AP, GGT, Gesamtbilirubin, LDH und Cr werden in Woche 2 und 4 (Teil A); Woche 2, 10, 12 (Teile B, C) überprüft. Bei Patienten der Teile Bund C wird der PSA-Spiegel wiederholt am Tag 56 geprüft bevor die zweite virale Injektion erfolgt und die Strahlentherapie beginnt. Falls klinisch angezeigt, erfolgen weitere Bluttests. Bei Patienten von Teil A wird der PSA-Wert bei Woche 2 und Woche 6 bestimmt.
Immunologische Untersuchungen (Anlage 6) werden an Tag 14 und 28 an Teil A Patienten und an Tagen 56, 70 und 84 an Teil B und C Patienten durchgeführt. Nach 6 Wochen wird für Patienten des Teils A der Testosteronspiegel überprüft. Während der Behandlung wird der Valacyclovirspiegel überprüft.
Prostatabiopsien: Eine transrektale Ultraschall begleitete Prostata-Biopsie erfolgt am Tag 14 bei Patienten von Teil A und an Tag 56 und 70 bei Patienten von Teil B und C.
9.5 Evaluierung nach Behandlung
Die Patienten werden 6 Wochen nach Beendigung der Strahlentherapie in Augenschein genommen.
Nachfolgeuntersuchungen erfolgen alle 3 bis 4 Monate im ersten Jahr und alle 6 Monate danach. Die Evaluierung jeder Visite umfasst:
Physische Untersuchung mit Prostatadiagramm
PSA
Prostatabiopsien nach ungefähr 6 Wochen, 6 Monaten, 12 Monaten, 18 Monaten und 24 Monaten nach Beendigung der Strahlentherapie zur Beurteilung einer anhaltenden oder einer wiederkehren lokalen Erkrankung.
Samenanalysen werden gesichtet und eine PCR-Analyse auf eine mögliche virale Kontamination nach 6 Wochen (erste Folgevisite) durchgeführt und, falls positiv, bei jeder Folgevisite bis sie negativ ist. Jedoch können einige Patienten derartige Proben nicht abgeben.
Immunologische Untersuchungen (Serum) nach 6 Wochen Der Testosteronspiegel wird für Patienten von Teil A nach sechs Wochen überprüft.
Es versteht sich, dass die Durchführung von einzelnen Untersuchungen oder Tests gemäß diesem Protokoll Faktoren wie dem Patientenzustand, Zeitschwierigkeiten, Gerätefehlfunktionen oder der klinischen Beurteilung der Hauptdurchführenden oder dem betreuenden Arzt unterliegen, und dass ein Test im Einzelfall nicht ohne Verletzung des Protokolls durchgeführt werden kann. Jedoch wird jede diesbezügliche systematische Änderung des Originalprotokolls, ob abhängig von der Patientensicherheit oder nicht, dem IRB vorgelegt. Es wird versucht, an jedem Patienten, der stirbt, eine vollständige Autopsie durchzuführen. Zusätzlich zu pathologischen Standarduntersuchungen können Gewebe für die PCR-Analyse zum Nachweis von verbliebener rekombinanter adenoviraler DNA genommen werden.
9.6 Kriterien für die Tumorreaktion auf Behandlung
Als vollständige Reaktion wird die Abnahme des Serum-PSA auf < 1,0 ng/ml definiert. Als teilweise Reaktion wird die Abnahme des Serum-PSA-Spiegels auf wenigstens 50% der Grundlinie vor Behandlung definiert.
Als minimale Reaktion wird die Abnahme des Serum-PSA-Spiegels um wenigstens 25% (jedoch weniger als 50%) definiert.
Eine stabile Erkrankung wird nach einem der folgenden Kriterien definiert:
Stabiler Serum-PSA-Spiegel, minimale Abnahme des Serum-PSA-Spiegels auf weniger als 25% oder eine minimale Zunahme des Serum-PSA-Spiegels auf nicht mehr als 20% des Anfangswertes.
Als fortschreitende Erkrankung wird die Zunahme des PSA auf über 20% der Basislinie vor Behandlung definiert.
Ebenso werden die Ergebnisse der DRE, wiederholten Biopsien, PSA-Abnahmeraten, Zeit und Dauer bis der Tiefpunkt von PSA erreicht worden ist, freies PSA für die Evaluierung der Tumorreaktion auf die Behandlung bewertet.
9.7 Rückfall
Jeweils drei aufeinanderfolgende Anstiege von PSA werden als Behandlungsrückfall bewertet. Die Zeit bis zum Rückfall ist die Zeitspanne vom Datum der viralen Injektion und Beginn der androgenen Deprivation bis zum Datum des ersten erhöhten PSA einer Reihe von ansteigenden PSAs.
Lokaler Rückfall: Eine positive Biopsie nach zwei Jahren wird als lokaler Rückfall bewertet. Patienten mit fortschreitender lokaler Erkrankung nach digitaler rektaler Untersuchung und einem ansteigenden PSA wie vorstehend beschrieben, werden gleichfalls als lokaler Rückfall bewertet.
Ferner Rückfall: Alle Patienten mit einer negativen DRE und einer negativen transrektalen Ultraschall begleiteten Biopsie mit steigendem PSA mit oder ohne röntgenographischen Hinweis auf metastatische Erkrankungen werden als ferne Rückfälle mit lokaler Kontrolle bewertet.
9.8. Toxizität und Lebensqualität (Quality of Life (QOL))
Die Toxizität von HSV-tk + Valacyclovir und androgen Deprivation werden mit den Common Toxitcity Criteria veröffentlicht durch das CTEP von NCI (Anlage 7) bewertet. Die Radiation Theraphy Oncology Group (RTOG) Acute and Late Morbidity Scorings (Anlage 8) werden zur Klassifizierung der Toxizität der Strahlentherapie eingesetzt. Zur Evaluierung werden den Patienten International Prostate Symptoms Score (I-PSS) und Quality of Life-Fragebögen (Anlagen 9 und 10) zugeteilt.
9.9 Kriterien für die Beendigung der Behandlung

a. Permanente Stufe 3 Toxizität oder wiederkehrende Stufe 4 Toxizität wie in CTEP oder RTOG spezifiziert.
b. Andere angenommene toxische Phänomene, die nicht unmittelbar mit der viralen Einschleusung in den Prostatatumor zusammenhängen (wie Toxizität sekundär zur Valacyclovirverabreichung) oder Komplikationen, die aufgrund der natürlichen Historie des malignen Prostatatumors erklärt werden können, werden nicht als ausreichende Indikation für die Beendigung der Studie angesehen. Jedes zusätzliche Auftreten von Toxizität wird mit dem Vorsitzenden von IRB diskutiert.
c. Auf Antrag des Patienten oder einer Person mit anwaltlicher Vollmacht wird der Patient aus der Studie genommen.

10.0 Mögliche Risiken und Unannehmlichkeiten
10.1 Mögliche Komplikationen der Vektorinjektion

a. Infektionen des Prostata- und Urintraktes und systemische Sepsis sind aufgrund der transrektalen Verabreichung möglich, treten jedoch bei weniger als 1% der Patienten auf, die einer Prostatabiopsie unterzogen werden. Die Behandlung mit Antibiotika erfolgt als Prophylaxe vor und nach der Injektion des Virus in die Prostata.
b. Hämaturie nach der Prostatabiopsie tritt bei weniger als 1% der Patienten auf und ist üblicherweise selbst-beschränkt.
c. Urinretention kann aufgrund lokaler Schwellung auftreten. Ein Foleykatheter kann zur Zeit der Behandlung eingeführt werden und für 24 Stunden verbleiben.

10.2 Mögliche Komplikationen, die für die adenovirus Vektorinjektion spezifisch ist.
Zusätzlich zu den Komplikationen, die durch die Injektion in die Prostata verursacht werden, kann es zu Komplikationen kommen, die spezifisch für die Vektorbehandlung sind.
Bis jetzt wurde keine Signifikanz für solche Komplikationen bei Patienten beobachtet, die mit der vorgeschlagenen Dosis an AdV-HSV.tk behandelt worden sind.
10.3 Mögliche biologische Risiken für das Pflegepersonal:

a. An der Vektorinjektion beteiligtes Personal: Die Möglichkeit einer biologisch riskanten Exposition des Personals, das an der Vektorinjektion beteiligt ist, ist gering. Der virale Vektor ist in einem geringen Volumen (annähernd 1,6 ml) Puffer suspendiert und ist in einem kryovial enthalten. Die Spritze wird in der Flasche ohne Vektorverlust aufgezogen. Es erfolgt eine intratumorale Injektion und die Leckagemenge entlang der Nadel ist äußerst gering. Im Fall eines versehentlichen Ausgießens des Vektors aus dem Vial können herkömmliche Desinfektionsmittel zur Inaktivierung des Mittels verwendet werden. Das Personal wurde in dem sicheren Umgang und auf die möglichen biologischen Risiken des Vektors vor Durchführung der Behandlung unterrichtet.
b. Personal der postchirurgischen Behandlung: Es besteht die Möglichkeit, dass der ADV/HSV-tk Virus aus dem Patienten über den Urin, den Stuhl, Speichel, Schleim, Tränenflüssigkeit oder andere Ausscheidungen austritt. Studien an nichtmenschlichen Primaten ergaben, dass die Wahrscheinlichkeit gering ist. Bei Studien an sechs Pavianen wurde lediglich ein Plaque im Serum eines Pavians entdeckt, dem 2 Tage zuvor der Vektor injiziert worden war (vergleiche IND application 6371 oder RAC Protokoll 1294-098). In einem semi-permissiven Wirt, Baumwollratten, wurden nach intrakardialer Injektion (Rojas et al.) lediglich minimale Mengen Virus nachgewiesen. Exposition gegenüber verschütteten replikations-defizienten Virus bedeutet ein sehr beschränktes Risiko, da die Titer extrem gering sind. Es besteht die theoretische Möglichkeit, dass der Vektor mit Wildtyp Adenovirus im Patienten rekombiniert (siehe oben). Infektion mit diesem Virus würde eine schwache, selbst-beschränkte Infektion vergleichbar mit einer herkömmlichen Adenovirusinfektion hervorrufen. Pflegepersonal wird in dem sicheren Umgang und auf die möglichen biologischen Risiken des Virusvektors unterwiesen, bevor sie mit den Patienten arbeiten dürfen.

10.4 Valacyclovir (Valtrex^®)
Valacyclovir-Tabletten werden oral verabreicht. Valacyclovir ist ein Valinester von Acyclovir, der bei der ersten Darmpassage und/oder dem hepatischen Metabolismus schnell zu Acyclovir umgewandelt wird.
Peakplasmakonzentrationen an Valacyclovir sind üblicherweise geringer als 0,5 mcg/ml bei allen Dosierungen.
Klinische Studien, die IV Acyclovir mit einer oralen Verabreichung von Valacyclovir vergleichen, haben gezeigt, dass 10 mgr/kg IV Acyclovir über 1 Stunde alle 8 Stunden und 2 g Valacyclovir alle 8 Stunden eine vergleichbare Fläche der Acyclovirkonzentration-Zeit-Kurve ergeben (auc, h-(g.ml), (Phase I Studie of Concomitant Adenovirus-Mediated Transduction of Ovarian cancer with HSV-tk Gene followed by Intravenous Administration of Acyclovir and Chemotherapy with with Topotecan in Patients after Optimal Debulking Surgery for Recurrent Ovarian Cancer, NIH/Office of Recombinant DANN# 9801-228). Auf Grundlage der vorstehenden Studie wird für dieses Protokoll eine Dosis von 2 g alle 8 Stunden über 14 Tage verwendet.
Die häufigsten Nebenwirkungen von Valacyclovir waren Übelkeit bei 6 bis 15% der Patienten, Kopfschmerzen bei 14 bis 35%, Erbrechen bei 1 bis 6%, Schwindel oder Bauchschmerzen bei 2 bis 11%, Gelenkschmerzen bei 1 bis 6% und Depressionen bei 1 bis 7%. Laboranomalien wie anormale Leberfunktionstests wurden bei 1 bis 4% der Patienten beobachtet, wohingegen Anämie, Leukopenie, Thombopenie und erhöhtes Serumkreatin bei 1% der Patienten oder weniger auftrat. Zudem wurden die folgenden Nebenwirkungen in der klinischen Praxis beobachtet. Allergische Reaktionen (anaphylaktische-angioedemische Reaktionen, Angioödem, Juckreiz, Rash und Quattelbildung), CNS-Symptome (Verwirrung, Halluzinationen, Agitation, aggressives Verhalten, Manien), gastrointestinale Reaktionen (Durchfall), Niereninsuffizienz, Erythemmultiformen, Ödeme des Gesichts, Hypertonie und Tachykardie beobachtet.
10.5 Strahlentherapie
Risiken aufgrund der Strahlentherapie umfassen mögliche strahlenbedingte Zystitis, Urethritis und Proktitis während der Strahlentherapie. Diese sind im Allgemeinen selbstbeschränkend und verbessern sich zwei bis drei Wochen nach der Strahlentherapie. Spätfolgen der Strahlentherapie sind ausgesprochen selten und umfassen persistenten Durchfall, rektale Blutung oder Blut im Urin, Geschwüre des Rektums, Nekrosis der Rektumwand und avaskuläre Nekrose der Hüften. Komplikationen, die einen wesentlichen chirurgischen Eingriff erfordern (Kolostomie, Hüftersatz usw.) wurden für weniger als 1% der Fälle berichtet.
10.6 Androgene Deprivation
10.6.1 Flutamid
Die am häufigsten beschriebenen Nebeneffekte (mehr als 5%) während der Behandlung mit Eulexinkapseln in Verbindung mit einem LHRH-Agonisten sind: Hitzewallungen, 61%; Libidoverlust 36%; Impotenz 33%; Durchfall 12%; Übelkeit/Erbrechen 11%; Gynekomastie 9%; andere 7% und andere GI 60%. Da Transaminase-Anomalien, Ikterus, hepatische Nekrose und hepatische Encephalopatie bei Verwendung von Flutamid beschrieben worden sind, sollten periodische Leberfunktionstest in Betracht gezogen werden. Geeignete Labortests sollten bei den ersten Symptomen/Anzeichen einer Leberfehlfunktion (zum Beispiel Juckreiz, dunkler Urin, andauernde Anorexie, Ikterus, Schmerzen im rechten oberen Quadranten oder unerklärliche grippeartige Symptome) erfolgen. Falls der Patient Ikterus oder Laboranzeichen einer Lebererkrankung aufweist, sollte bei Fehlen von mit Biopsie bestätigten Lebermetastasen die Therapie mit Eulexin beendet oder die Dosierung reduziert werden. Eine hepatische Erkrankung ist üblicherweise reversibel nach Beendigung der Therapie, und bei einigen Patienten nach Reduktion der Dosierung. Allerdings gibt es Berichte über Todesfälle nach schweren hepatischen Erkrankungen in Folge der Flutamidbehandlung.
10.6.2 Leuprolid Acetat
Bei klinischen Versuchen mit Lupron Depot (Leuprolid Acetat als Depotsuspension) wurden die folgenden Nebenwirkungen von dem behandelnden Arzt mit dem Arzneimittel in eine mögliche oder wahrscheinliche Beziehung gestellt: Ödem 12,5%; Übelkeit/Erbrechen 5,4%; Testikelvergrößerung 5,4%; Hitzewallungen/Schweißausbrüche 58,9%; Impotenz 5,4%; allgemeiner Schmerz 7,1%; Atemnot 5,4% und Astheatosis 5,4%. Erhöhungen der folgenden Laborwerte wurden festgestellt: SGOT (> 2 × normal), 5,4%; LDH (> 2 × normal), 19,6% und alkalische Phosphatase (> 1,5 × normal), 5,4%.
11.0 KOSTEN
Die Patienten, über Versicherung oder andere Mittel, tragen die Kosten für alle Standardarzneimittel und Verfahren. Die Patienten tragen keine Kosten für den Vektor, Vektorübertragung oder jedes andere für das Protokoll spezifische Arzneimittel oder Verfahren.
12.0 ZUSTIMMUNGSVERFAHREN
Alle Patienten müssen ein anerkanntes Informations- und Zustimmungsformular unterschreiben, um für diese Studie ausgesucht zu werden (Anlage 11 für geringes Risiko, Teil A; Anlage 12 für hohes Risiko, Teil B; Anlage 13 für D1, Teil c).
13.0 VERTRAULICHKEIT
Innerhalb der gesetzlichen Beschränkungen werden die Patientendaten vertraulich behandelt.
Die Daten dieser Studie dürfen veröffentlicht werden, wobei jedoch keine Patienten genannt oder identifiziert werden.
14. MÖGLICHER NUTZEN
Die vorliege Studie kann für die beteiligten Personen ohne Nutzen sein. Allerdings zeigen die präklinischen Studien eine signifikante Zelltötung bei menschlichen Prostatakrebstumormodellen.
Ein andere Phase I-Studie bei Menschen belegt eine minimale Toxizität bei Einsatz von ADV Delivery von HSV-tk und anschließender GCV bei wiederaufgetretenen Prostatakrebs. Im Fall von Prostatakrebs mit einer großvolumigen Erkrankung bewirkt die Strahlentherapie weniger als eine optimale lokale Kontrolle. Daher kann durch Kombination von zwei lokalen Behandlungen mit nicht überlappenden Toxizitäten die lokale Kontrolle bei kleiner zusätzlicher Toxizität verbessert werden.
Eine Verbesserung der lokalen Kontrolle bei Patienten mit klinisch lokalisiertem Prostatakrebs kann zu verbesserten krankheitsfreien Überleben führen.
15.0 RISIKO-NUTZEN-VERHÄLTNIS
Eine Phase I-II Studie mit ausschließlicher AdV/HSV-tk Gentherapie zeigte keine anhaltende Toxizität und minimale Unbequemlichkeiten für den Patienten. Die Patientengruppe dieser Studie würden normalerweise als Standardbehandlung eine Androgenablation und/oder Strahlentherapie erhalten, deshalb führt dieser Behandlungsteil nicht zu zusätzlichen Risiken. Gemessen an dem möglichen klinischen Nutzen einer Verbesserung der lokalen Kontrolle erscheint das Risiko/Nutzen-Verhältnis günstig.
Dieses Protokoll entspricht den OSHA/HHS Richtlinien für HIV/HBV Betriebssicherheit.
Anlage 2 AUSWAHLFORMULAR FÜR DIE GENTHERAPIE
Beispiel 7. Behandlung von Patienten mit Adeno TK, Valacyclovir und Brachytherapie
Das ist ein Beispiel für das Design einer klinischen Studie zur Analyse der Wirkungen einer Kombination aus Adtk-Therapie und Strahlentherapie, wobei radioaktive Keime eingesetzt werden.
Als Beispiel nutzen wir das Prostatamodell, da das Protokoll ähnlich dem zuvor beschriebenen ist und daher als Beispiel lediglich ein Teilbereich umfasst ist, der Ansatz jedoch nicht auf diese Erkrankung beschränkt ist und zurzeit für andere Positionen, einschließlich Bauchspeicheldrüsenkrebs untersucht wird, ohne darauf beschränkt zu sein.
8.0 BESCHREIBUNG DES PROTOKOLLS
8.1 Registrierung der Patienten
Patienten können dieser Studie beitreten, indem sie das Informations- und Zustimmungsformular dieses Protokolls ausfüllen. Deren Auswahl wird durch den Datenmanager der Strahlentherapieabteilung des Baylor College of Medicine bestätigt. Die Patienten werden durch den Datenmanager Gruppen zugeteilt. Die Teilnahme oder Nichtteilnahme an dieser klinischen Studie beeinflusst andere Therapien nicht, für die der Patient in Frage kommen könnte.
8.2 Datensammlung und Überwachung
8.2.1 Überwachung der Studie
Die Forscher lassen Studienbeobachter zu und erlauben die Inspektion der Studiendokumente (zum Beispiel Zustimmungsformulare, Analysezertifikate, Fallstudienformulare und klinische Krankenkarten) durch die FDA.
8.2.2 Bericht über Nebenwirkungen
Nebenwirkungen (Adverse Reactions) (ADRs) werden unmittelbar der FDA, RAC und IRB mitgeteilt. ADR-Mitteilungen sind auch dann erforderlich, wenn lediglich ein Verdacht auf eine Arzneimittelwirkung vorliegt. Vorher unbekannte Stufe 2 oder 3 Reaktionen werden schriftlich innerhalb von 10 Arbeitstagen mitgeteilt. Reaktionen der Stufe 4 und der Tod des Patienten während der Behandlung wird telefonisch innerhalb 24 Sunden mitgeteilt. Ein schriftlicher Bericht folgt innerhalb von 10 Arbeitstagen.
8.2.3 Verfahren zur Änderung des Protokolls
Überarbeitungen des Protokolls werden von allen Forschern, dem FDA und bei Bedarf weiteren diskutiert. Herrscht Einigkeit das vorliegende Protokoll zu ändern, wird eine formale Liste der Änderungen dem verbesserten Protokoll beigefügt und den FDA, IRB des Baylor College of Medicine und anderen zuständigen Komitees vorgelegt.
8.2.4 Veröffentlichungen, die die Versuche betreffen
Jedes Manuskript, Zusammenfassung oder Präsentation ist allen an der Studie beteiligten Forschern, die an diesem Protokoll beteiligt sind, zugänglich. Vertraulichkeit der Personen und der Daten dieser Studie wird innerhalb der gesetzlichen Grenzen aufrechterhalten.
8.3 Verfahren und therapeutische Mittel
8.3.1 Delivery des HSV-tk Gens
Vor der Injektion erhalten alle Patienten am Abend davor und am Morgen der Injektion oral ein Breitbandantibiotikum. Das wird 5 Tage fortgesetzt. Zur Lokalisierung von bis zu 4 Stellen für die intra-prostatische Injektion, zwei in jeden Prostatalobus, wird transrektaler Ultraschall eingesetzt. Am Tag 0 wird insgesamt 1-2 cc AdV.HSV-tk Adenovirusvektor (der Vektor ist identisch mit dem der bei IND-6371, 6636 und 7311 eingesetzt worden ist) (siehe Anlage 1) mit einer 20 Gauge Nadel injiziert (bis zu 1 cc in jeden lateralen Lobus). Basierend auf den Toxizitätsergebnissen der Dosissteigerungsstudie der Phase I bei Baylor werden insgesamt 5 × 10¹¹ Vektorpartikel pro Tumor injiziert. Zur Verhinderung einer möglichen Ausscheidungsbehinderung infolge der Prostatainjektion kann ein Foley Katheter nach der Injektion gesetzt werden. Bei Patienten von Teil A werden die adenoviralen intra-prostatischen Injektionen innerhalb 2–3 Wochen wiederholt. Für Patienten von Teil B werden die adenoviralen intra-prostatischen Injektionen am 54 und 70 Tag wiederholt.
8.3.2 Valacyclovir Verabreichung
Behandlung mit Valacyclovir (siehe Anlage 2) beginnt 24 Stunden nach jeder Virusinjektion mit einer Dosis von 2 gm p. o. tid und dauert 14 Tage. Diese Dosis wurde so berechnet, dass sie eine vergleichbare Kurzvenfläche (auc, h-μg/ml) wie 10 mg/kg I. V. Acyclovir, das alle 8 Stunden verabreicht wird, ergibt. Das ist das selbe Dosisregime wie in IND 7311, „Phase I Studie of Concomitant Adenovirus-Mediated Transduction of Ovarian Cancer with HSV-tk Gene followed bx Intravenous Administration of Acyclovir and Chemotherapy with Topotecan in Patients after Optimal debulking Surgery for Recurrent Ovarian Cancer"). Patienten von Teil A erhalten daher Valacyclovir an den Tagen 1 bis 14 und 15 bis 29. Patienten von Teil B erhalten Valacyclovir an Tagen 1 bis 14, 56 bis 69 und 70 bis 84.
8.3.3 Androgen Deprivation
Für Patienten mit hohem Risiko beginnt die androgene Deprivation zusammen mit der ersten adenoviralen Injektion am Tag 0. Die Behandlung besteht aus monatlichen Injektionen von LHRH Agonist Leuprolid Acetat Depot (Lupron Depot, 30 mg – Anlage 2) und Flutamid (Eulexin, 250 mg po tid – Anlage 2). Das ist unser Standardregime der androgen Deprivation und dauert insgesamt 4 Monate.
8.3.4 Strahlentherapie
Für Teil A: Eine radioaktive Goldkeimimplantation (RGSI) (unter transrektaler Ultraschall und fluoroskopischer Überwachung) wird zur selben Zeit wie die erste intra-prostatische Injektion eines HSV-tk adenoviralen Vektors am Tag 0 durchgeführt. Eine äußere Strahlentherapie (IMRT) beginnt 2 bis 3 Wochen nach der radioaktiven Goldkeimimplantation (die erste Behandlung mit einer externen Strahlentherapie wird innerhalb von 72 Stunden nach der zweiten adenoviralen intra-prostatischen Injektion verabreicht).
Für Teil B: RGSI erfolgt gleichzeitig mit der zweiten intra-prostatischen Injektion von AdV-HSV-tk adenoviralen Vektor am 54. Tag. Eine externe Strahlentherapie (IMRT) beginnt innerhalb 2 bis 3 Wochen nach der radioaktiven Goldkeimimplantation (die erste Behandlung der Strahlentherapie erfolgt innerhalb 72 Stunden nach der dritten adenoviralen intra-prostatischen Injektion verabreicht). Die Verabreichung der radioaktiven Goldkeimimplantate erfolgt, indem etwa 40 Keime transperineal in die Vorsteherdrüse unter transrektaler Ultraschallbeobachtung implantiert wird.
Jeder radioaktive Goldkeim ergibt etwa 2 mCi, und damit insgesamt annähernd 80 mCi, die üblicherweise 20 bis 30 Gy ergeben.
Hochenergetische Photonen (> 10 MV) und eine Gesamtdosis von 50 Gy in 2 Gy/Fraktion werden der Isodosislinie verabreicht, die die Prostata umfasst. Bereiche mit cold spots werden mittels intensitätsmodulierter Bestrahlung kompensiert.
9.0 PATIENTENZUSAMMENSETZUNG UND EVALUIERUNG DER BEHANDLUNG
9.1 Patientenauswahl
Alle Patienten müsse ein durch Biopsie belegte Adenokarzinom der Prostata aufweisen.
Patienten von Teil A sollten die folgenden Merkmale aufweisen: PSA < 10, Gleason score ≤ 6 und klinisches Stadium T2a oder darunter.
Patienten von Teil B sollten wenigstens eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen: PSA ≥ 10, Gleason score > 6 und klinisches Stadium T2b-T3.
Keine vorhergehende chirurgische, hormonelle oder Strahlenbehandlung der Prostata.
Kein Hinweis auf Metastasen oder eine andere Malignität (außer einem squamösen Karzinom oder Basalzellenkarzinom).
Die Patienten müssen eine PSA innerhalb von 3 Monaten ab Zugang erhalten.
Die Patienten müssen ein studienspezifisches Informations- und Zustimmungsformular vor der Registrierung erhalten.
Die Patienten müssen eine adäquate organische Grundfunktion aufweisen, die mit den folgenden Laborwerten vor Beginn des Protokolls bestimmt wird:
Serumkreatin < 1,5 mg%
T.bilirubin < 2,5 mg%, ALT und AST < 2 × normal
Pts > 100000/mm³, ANC > 1500/mm³, Hgb > 10 gm%
Normale partielle Thromboplastinzeit (PTT) und Pro-Thrombinzeit (PT)
9.2 Ausschlusskriterien
Hinweis auf Metastasen oder Beeinträchtigung der Lymphknoten.
Vorangegangene Prostataoperation (Hyperthermie, Kryotherapie usw.)
Vorangegangene Bestrahlung des Pelvis
Vorangegangene androgene Ablation Hormontherapie (außer Finasterid, sofern mehr als 3 Monate vor Registrierung beendet)
Patienten, die Corticosteroide oder immunsupressive Arzneimittel erhalten.
HIV + Patienten
Patienten mit akuten Infektionen (Virus-, Bakterien- oder Pilzinfektionen, die eine Behandlung erfordern)
Patienten mit Zirrhose
9.3 Evaluierung vor Behandlung
Untersuchung der Krankengeschichte und physische Untersuchung einschließlich Prostatadiagramm, Größe und Körpergewicht
Hämatologisch: CBC, PL, PT, PTT
Chemisch: Na, K, CL, CO2, Cr, AST, ALT, LDH, Bilirubin, Ca
Urinanalyse
PSA innerhalb von 3 Monaten ab Registrierung
Röntgenaufnahme des Brustkorbs (Rücken-, Vorder- und Seitenansichten)
Knochenscan mit Kernspinresonanztomographie zur Bewertung von verdächtigen Bereichen
Sextantbiopsie der Prostata
Immunologische Untersuchungen: Vorliegen von neutralisierenden Antikörpern gegen Wildtyp Adenovirus im Serum
Pelvis-CT erfolgt bei Hochrisikopatienten, um eine Adenopathie der Pelvis ausschließen zu können.
9.4 Evaluierung während der Behandlung
Physische Untersuchung. Eine Untersuchung erfolgt bei jeder Patientenvisite. Es erfolgt eine monatliche Bewertung der Patienten für die Verabreichung einer LHRH Agonistinjektion hinsichtlich ihrer Toleranz auf Androgenentzug und arzneimittelbedingte Toxizitäten. Während der Strahlentherapie werden die Patienten wöchentlich auf akute Toxizität überprüft.
Untersuchung des Harnabgangs: Bei Bedarf wird ein Foley Katheter unmittelbar nach viraler Injektion gesetzt und innerhalb von 24 Stunden entfernt. Falls der Patient keinen Harn lassen kann, wird der Katheter erneut gesetzt und Behandlung des Harnabgangs wird, falls angezeigt, wiederholt.
Chemisch: Serumkreatinin, Leberfunktionstests, CBC, Koagulationsuntersuchungen und Blutchemie werden während der Behandlung bei allen Patienten wöchentlich überprüft. Bei Patienten von Teil B erfolgt eine wiederholte PSA-Spiegelbestimmung am Tag 56 vor der zweiten Virusinjektion und Beginn der Strahlentherapie. Falls klinisch angezeigt, werden weitere Bluttests durchgeführt.
Immunologische Untersuchungen: Titer der Serumantikörper gegen Adenovirus am Tag 15 bei Teil A Patienten und an Tagen 56 und 71 bei Teil B Patienten.
Prostatabiopsie: Eine mit transrektalen Ultraschall überwachte Prostatabiopsie wird im Anschluss an die zweite intra-prostatische Injektion von HSV-tk Gen bei Patienten von Teil A und im Anschluss an die zweite und dritte Injektion von HSV-tk Gen bei Patienten von Teil B durchgeführt.
Cystokopische Untersuchung während der Implantierung der radioaktiven Goldkeime zur Bestimmung der Keime in der Blase und des Auswaschens des Virus in die Blase.
9.5 Evaluierung nach Behandlung
Nach Beendigung der Strahlentherapie werden die Patienten alle 6 Wochen begutachtet. Nachfolgende Begutachtungen erfolgen alle 3 Monate im ersten Jahr und alle 6 Monate danach. Die Evaluierung bei jeder Visite umfasst:
Physische Untersuchung mit Prostatadiagramm
PSA
Prostatabiopsie in der 6. Woche und im 6., 12., 18. und 24 Monat nach Beendigung der Strahlentherapie zur Beurteilung einer anhaltenden oder wiederkehrenden lokalen Erkrankung.
Samenproben werden genommen und einer PCR-Analyse auf eine mögliche Viruskontamination nach 6 Monaten (erste Nachfolgevisite) und bei positivem Befund bei jeder nachfolgenden Nachfolgevisite durchgeführt, bis sie negativ wird. Allerdings sind einige Patienten nicht in der Lage derartige Proben abzugeben.
Es versteht sich, dass die Durchführung der einzelnen Studien oder Tests gemäß diesem Protokoll Faktoren wie dem Patientenzustand, Zeitschwierigkeiten, Fehlfunktionen der Ausrüstung, der klinischen Beurteilung des führenden Forschers oder der behandelnden Patienten unterliegt und dass im Einzelfall ein Test nicht ohne Verletzung des Protokolls durchgeführt werden darf. Jede systematische diesbezügliche Änderung des Originalprotokolls unabhängig davon, ob sie der Patientensicherheit dient oder nicht, wird dem IRB vorgelegt. Es wird versucht, bei Patienten, die sterben, eine vollständige Autopsie durchzuführen. Zusätzlich zu pathologischen Standarduntersuchungen können Gewebe für die PCR-Analyse zum Nachweis von vorhandener rekombinanter Adenovirus DNA genommen werden.
9.6 Kriterien für die Tumorreaktion auf die Behandlung
Eine vollständige Reaktion ist definiert als Abnahme des Serum-PSA bis zu den normalen Grenzen (≤ 1,0 ng/ml).
Teilweise Reaktion ist definiert als Abnahme des Serum-PSA-Spiegels um wenigstens 50% im Vergleich zur Grundlinie vor Behandlung.
Minimalreaktion ist definiert als Abnahme des Serum-PSA-Spiegels um wenigstens 25% (aber weniger als 50%).
Eine stabile Erkrankung wird über ein oder mehrere der der folgenden Merkmale definiert: Ein stabiler Serum-PSA-Spiegel, eine minimale Abnahme des Serum-PSA-Spiegels auf weniger als 25% oder eine minimale Zunahme des Serum-PSA-Spiegels auf nicht mehr als 20% des Anfangswertes.
Eine fortschreitende Erkrankung wird über eine Zunahme von PSA auf über 20% der Grundlinie vor Behandlung definiert.
Zur Evaluierung der Tumorreaktion auf die Behandlung können auch die Ergebnisse von DRE, wiederholte Biopsien, Ausmaß der PSA-Abnahme, Zeitpunkt und Dauer bis zum Tiefstand von PSA, freies PSA, PAP und alkalische Phosphatase herangezogen werden.
9.7 Krankheitsrückfall
Zwei aufeinanderfolgende Anstiege des PSA werden als Behandlungsfehlschlag bewertet. Die Zeit bis zum Behandlungsfehlschlag ist das Zeitintervall vom Datum der viralen Injektion und Beginn der androgenen Deprivation bis zum Zeitpunkt des ersten erhöhten PSA in der Reihe von ansteigenden PSAs.
Lokaler Fehlschlag: Eine positive Biopsie nach zwei Jahren wird als lokaler Fehlschlag gewertet.
Patienten mit wachsender lokaler Erkrankung gemäß digitaler Rektaluntersuchung und einem ansteigenden PSA wie vorstehend beschrieben, werden gleichfalls als lokale Fehlschläge bewertet.
Ferner Fehlschlag: Alle Patienten mit negativen DRE und einer negativen Biopsie unter transrektaler Ultraschallbeobachtung, die einen ansteigenden PSA mit oder ohne durch Röntgenaufnahme belegten Metastasen aufweisen, werden als ferner Fehlschlag, jedoch lokal kontrolliert, bewertet.
9.8 Toxizität:
Die Toxizität von HSV-tk + Valacyclovir und androgenen Deprivation werden anhand der Common Toxicity Criteria veröffentlicht durch CTEP von NCI (Anlage 3) bewertet. Die Einstufung der Toxizität der Strahlentherapie erfolgt anhand des Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) Acute and Late Mobility Scorings (Anlage 4).
9.9 Kriterien für die Beendigung der Behandlung

a. Andauernde Toxizität der Stufe 3 oder wiederkehrende Toxizität der Stufe 4 nach CTEP oder RTOG.
b. Andere vermutete toxische Phänomene, die nicht unmittelbar auf die virale Transduktion des Prostatatumors, (wie sekundäre Toxizität auf Valacyclovirverabreichung) zurückzuführen sind, oder Komplikationen, die anhand der natürlichen Geschichte des malignen Prostatatumors erklärt werden können, werden nicht als ausreichende Anzeichen für die Beendigung der Studie angesehen. Jedes weitere Auftreten einer Toxizität wird mit dem Vorstand des IRB besprochen.
c. Auf Antrag des Patienten oder einer Person mit Anwaltsvollmacht wird der Patient aus der Studie genommen.

Claims

Verwendung eines replikationsdefizienten adenoviralen Gen-Delivery-Vektors für die Herstellung eines Medikaments zur Anwendung bei menschlichen Krebspatienten zur Verringerung oder Verzögerung der Zunahme einer lokalen oder metastasierenden Tumormasse, wobei der Vektor einem Tumor verabreicht wird, und der Vektor eine Nukleotidsequenz enthält, die für Thymidinkinase kodiert, und der menschliche Krebspatient Gancyclovir oder ein analoges Prodrug im Anschluss an die Verabreichung des Vektors erhält, dadurch gekennzeichnet, dass der Gen-Delivery-Vektor und das Produg dem Krebspatienten in Verbindung mit einer Strahlentherapie verabreicht werden, um eine systematische Antitumorimmunantwort zu induzieren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Vektor zudem ein zusätzliches Prodrug aktivierendes Gen, ein immunstimmulierendes Gen, ein Xenoantigen, ein Hyperantigen oder ein Superantigen für den Tumor aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Prodrug Valcyclovir, Famcyclovir oder ein beliebiges anderes oral verfügbares Analog ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3 wobei der Vektor zusätzlich Interferone, kolonie-stimulierende Faktoren, Interleukine, Chemokine oder kostimulierende Moleküle als exogene Gene aufweist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zieltumor ein Prostatatumor, ein Hals- und Nackentumor, ein Gebärmutterhalstumor, ein Hirntumor, Blasentumor, Rektaltumor, Bauchspeicheldrüsentumor, Darmtumor, Lungen- oder Brusttumor ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Tumor ein Prostatatumor ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor so formuliert ist, um in einer Dosis von 10⁹ bis 10¹⁵ effektiven Partikeln verabreicht zu werden.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor so formuliert ist, um in einer Dosis von 10⁹ bis 10¹³ effektiven Partikeln verabreicht zu werden.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor so formuliert ist, um in einer Dosis von 10⁹ bis 10¹¹ effektiven Partikeln verabreicht zu werden.