DE60038025T2 - Hochaffinitäts-cholintransporter - Google Patents

Hochaffinitäts-cholintransporter Download PDF

Info

Publication number
DE60038025T2
DE60038025T2 DE60038025T DE60038025T DE60038025T2 DE 60038025 T2 DE60038025 T2 DE 60038025T2 DE 60038025 T DE60038025 T DE 60038025T DE 60038025 T DE60038025 T DE 60038025T DE 60038025 T2 DE60038025 T2 DE 60038025T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
choline transporter
affinity choline
activity
high affinity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60038025T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60038025D1 (en
Inventor
Tatsuya Zushi-shi HAGA
Takashi Hoya-shi OKUDA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26534836&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE60038025(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Application granted granted Critical
Publication of DE60038025D1 publication Critical patent/DE60038025D1/de
Publication of DE60038025T2 publication Critical patent/DE60038025T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
    • C07K14/4354—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes
    • C07K14/43545—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from nematodes from Caenorhabditis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)

Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, ein Gen, welches dieses Protein codiert, und die Verwendung derselben.
  • Stand der Technik
  • Das autonome Nervensystem, das sich auf die Organe innerhalb eines Körpers erstreckt und die grundlegendsten Funktionen eines lebenden Organismus, einschließlich Energiemetabolismus, Kreislauf, Atmung und Fortpflanzung, zusammen mit dem Endokrinsystem reguliert, ist in das sympathische und das parasympathische Nervensystem unterteilt. Alle autonomen Nervenfasern mit Ausnahme von postganglionären Fasern des Sympathikusnervs, Bewegungsnervenfasern und dehnbaren Fasern von Schweißdrüsen/Blutgefäßen im Sympathikusnerv sind cholinerg, und Acetylcholin ist für die Funktion des autonomen Nervs und des Bewegungsnervs unerläßlich. Es ist bekannt, daß das cholinerge Neuron, welches auch im Gehirn beobachtet wird, für die erkennende Funktion des Gehirns wichtig ist und daß es nach dem Einsetzen von Alzheimer'scher Krankheit degeneriert. Im cholinergen Neuron wird, da die Fähigkeit zur Biosynthese von Cholin fehlt, Cholin, ein Acetylcholin-Abbauprodukt, durch einen hochaffinen Cholintransporter an den präsynaptischen Terminalen in eine Zelle aufgenommen, um erneut für die Synthese von Acetylcholin verwendet zu werden. Die hochaffine Cholinaufnahme ist ein die Geschwindigkeit beschränkender Schritt bei der Synthese von Acetylcholin, und es wird angenommen, daß sie die Effizienz der Synapsenübertragung reguliert (J. Neurochem. 18, 781–798, 1971, Science 178, 626–628, 1972, Biochem. Biophys. Acta 291, 564–575, 1973, Mol. Pharmacol. 9, 630–639, 1973, J. Pharmacol. Exp. Ther. 192, 86–94, 1975, J. Neurochem. 30, 15–21, 1978, J. Neurochem. 44, 11–24, 1985, J. Neurochem. 60, 1191–1201, 1993, J. Neurochem. 20, 581–593, 1973, Eur. J. Pharmacol. 102, 369–370, 1984). Bislang wurden die meisten cDNAs von Transportern für große Neurotransmitter isoliert, eine cDNA des hochaffinen Cholintransporters, der physiologisch wichtig ist, wurde jedoch nicht identifiziert.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Bisher wurde die Existenz eines Proteins, welches im cholinergen Neuron liegt und die Funktion der Aufnahme von Cholin, einem Vorläufer von Acetylcholin, in eine Zelle hat, zwar erwartet, jedoch waren die molekularen Eigenschaften dieses Proteins, eines hochaffinen Cholintransporters, unbekannt. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein physiologisch wichtiges Protein, welches hochaffine Cholintransporter-Aktivität besitzt, ein Gen, welches das Protein codiert, und ein Screeningverfahren für einen Promotor der hochaffinen Cholintransporter-Aktivität unter Verwendung des Proteins, des Gens und dergleichen bereitzustellen.
  • Die Erfinder haben umfangreiche Forschung betrieben, um das oben genannte Ziel zu erreichen: Mit Informationen zum Genomprojekt (Science 282, 2012–2018, 1998) wurden Na+-abhängige Transporter-cDNAs, die aus der genomischen Sequenz eines Nematoden (C. elegans) erwartet wurden, nacheinander kloniert, und die hochaffine Cholinaufnahmeaktivität jeder cDNA wurde in dem Oozyten-Expressionssystem von Xenopus untersucht, und die cDNA von hochaffinem Nematoden-Cholintransporter (cho-1) wurde auf Basis der obigen Untersuchung identifiziert, dann wurden homologe Moleküle (CHT1) aus Rattenrückenmark unter Verwendung der Homologie einer Rasensequenz zu der cDNA als Index kloniert. Diese CHT1 besaßen keine Homologie zu Neurotransmittertransportern (J. Neurochem. 71, 1785–1803, 1998), sie besaßen jedoch 20 bis 25% Homologie zu Molekülen, die zur Familie der Na+-abhängigen Glucosetransporter gehören (Nature 330, 379–381, 1987).
  • Northern-Blot-Analyse ergab, daß Transkripte von CHT1 nur in Rückenmark, basalem Vorderhirn, Corpus striatum und Hirnstamm bestätigt wurden und daß CHT in cholinergen Neuronen exprimiert zu werden schienen. Dementsprechend wurden CHT1 in Oozyten von Xenopus exprimiert. Als Ergebnis wurde eine Cholinaufnahmeaktivität beobachtet, die Na+-abhängig ist und vollständig durch Hemicholinium-3 inhibiert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß CHT1 hochaffine Cholintransporter-Aktivität besitzen. Des weiteren haben die Erfinder von einem Menschen und von einer Maus abgeleitete Cholintransporter-cDNAs kloniert und deren Basensequenzen bestimmt und haben bestätigt, daß deren Expressionsprodukte eine hochaffine Cholinaufnahmeaktivität aufweisen. Die vorliegende Erfindung wurde somit fertiggestellt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, welches ein Protein codiert, das eine durch SEQ ID NO: 6 repräsentierte Aminosäuresequenz umfaßt, oder (b) ein Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, wobei in der durch SEQ ID NO: 6 repräsentierten Aminosäuresequenz eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, und hochaffine Cholintransporter-Aktivität besitzt (Anspruch 1), ein DNA-Molekül, welches eine durch SEQ ID NO: 5 oder deren komplementäre Sequenz repräsentierte Rasensequenz hat (Anspruch 2), von einem Menschen abgeleitete DNA, die mit DNA, welche ein Gen nach Anspruch 1 umfaßt, unter stringenten Bedingungen hybridisiert und ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert (Anspruch 3), ein Protein, welches eine durch SEQ ID NO: 6 repräsentierte Aminosäuresequenz umfaßt (Anspruch 4), ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, wobei in der durch SEQ ID NO: 6 repräsentierten Aminosäuresequenz eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, und welches die Aktivität eines humanen hochaffinen Cholintransporters aufweist (Anspruch 5).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Fusionsprotein, welches erzeugt wird durch das Exprimieren einer cDNA, die Fusionsproteine von einem oben aufgeführten Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität und einem Markerprotein und/oder einer Peptidmarkierung codiert (Anspruch 6).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Antikörper, der spezifisch an ein Protein, wie oben ausgeführt, mit der Aktivität eines hochaffinen Cholintransporters bindet (Anspruch 7). Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein (Anspruch 8).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, in welche ein DNA-Molekül, wie oben ausgeführt, eingebracht wurde (Anspruch 9). In der Wirtszelle kann die endogene DNA, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, durch Mutation inaktiviert sein (Anspruch 10).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein nicht-menschliches Tier, in dem es die Funktion eines Gens, welches ein Protein, wie oben ausgeführt, exprimiert, gibt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, welches gekennzeichnet ist durch das Einbringen des Gens oder der DNA, wie oben ausgeführt, in eine Zelle, deren endogenes DNA-Molekül, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, durch Mutation inaktiviert ist (Anspruch 12), das Verfahren zur Herstellung einer Zelle mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität nach Anspruch 12, wobei das DNA-Molekül in ein Chromosom der Zelle integriert ist, so daß die Zelle stabile hochaffine Cholintransporter-Aktivität zeigt (Anspruch 13).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Screenen eines Promotors oder eines Suppressors von hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, gekennzeichnet durch Messen/Evaluieren der hochaffinen Cholintransporter-Aktivität des Proteins, wie oben ausgeführt, mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität in der Gegenwart eines potentiellen Promotors/Suppressors (Anspruch 14), ein Verfahren zum Screenen eines Promotors oder eines Suppressors von hochaffiner Cholintransporter-Aktivität oder von hochaffiner Cholintransporter-Expression, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man eine Zellmembran oder eine Zelle, die in vitro ein Protein mit einer hochaffinen Cholintransporter-Aktivität exprimiert, mit einem potentiellen Promotor/Suppressor in Kontakt bringt und jede Veränderung in der Aktivität und/oder der Expression eines Proteins, wie oben definiert, in der Zellmembran oder der Zelle in der Gegenwart des potentiellen Promotors/Suppressors mißt/evaluiert (Anspruch 15). In dem Screeningverfahren kann die Zellmembran oder die Zelle, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität exprimiert, die Wirtszelle, wie oben definiert, sein (Anspruch 16), und das Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität kann ein rekombinantes Protein sein (Anspruch 17); ein Verfahren zum Screenen eines Promotors oder eines Suppressors von hochaffiner Cholintransporter-Aktivität oder von hochaffiner Cholintransporter-Expression kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es die Stufen umfaßt, bei denen man eine Zelle, die von einer Maus, wie oben definiert, erhalten wurde, in vitro in der Gegenwart eines potentiellen Promotors/Suppressors kultiviert und jede Veränderung in der Aktivität und/oder der Expressionsmenge eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität in der Zelle in der Gegenwart des potentiellen Promotors/Suppressors mißt/evaluiert (Anspruch 18).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen medizinischen Bestandteil, dadurch gekennzeichnet, daß er für eine medizinische Behandlung eines Patienten verwendet wird, der der Erhöhung der Aktivität oder der Verstärkung der Expression eines hochaffinen Cholintransporters bedarf, und dadurch, daß er das Protein, wie oben definiert, als eine aktive Komponente enthält (Anspruch 19).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Diagnoseverfahren für Erkrankungen, die mit der Expression oder der Aktivität eines hochaffinen Cholintransporters in Verbindung stehen, wobei das Verfahren umfaßt, daß man:
    eine genomische DNA-, RNA- oder cDNA-Sequenz, die einen hochaffinen Cholintransporter codiert, aus einer Blut-, Urin-, Speichel- oder Gewebeprobe aus einem Patienten erhält,
    die aus der Probe erhaltene genomische DNA-, RNA- oder cDNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz, die das oben definierte Protein codiert, vergleicht und
    jede Mutation in der aus der Probe erhaltenen Sequenz detektiert, wobei die Mutation in der aus der Probe erhaltenen Sequenz das Vorliegen einer Erkrankung, die mit der Expression oder der Aktivität eines hochaffinen Cholintransporters in Verbindung steht, in dem Patienten anzeigt (Anspruch 20).
  • Die Erfindung betrifft auch eine Diagnosesonde für die Alzheimer'sche Krankheit, welche einen Teil eines Antisense-Stranges von DNA oder RNA, welche das Protein, wie oben definiert, codiert, umfaßt, wobei dieser Teil wenigstens 20 Basen umfaßt (Anspruch 21), und ein Diagnosemittel für die Alzheimer'sche Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß es die Diagnosesonde, wie oben definiert, und/oder den Antikörper, wie oben definiert, enthält (Anspruch 22).
  • Kurze Erläuterung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Ansicht, die das Ergebnis von [3H]-Cholinaufnahme von Oozyten von Xenopus gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, in die Nematoden-cho-1 (C48D1.3-cRNA) oder Wasser injiziert wurde.
  • 2 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der Auswirkung von Na+ auf die Cholinaufnahme von Oozyten von Xenopus gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, in die Nematoden-cho-1 (C48D1.3-cRNA) oder Wasser injiziert wurde.
  • 3 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der HC3-induzierten Inhibition der Cholinaufnahme von Oozyten von Xenopus gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, in die Nematodencho-1 (C48D1.3-cRNA) oder Wasser injiziert wurde.
  • 4 ist eine Ansicht, die Aminosäuresequenzen von Ratten-CHT1 bzw. Nematoden-CHO-1 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 5 ist eine Ansicht, die die Verteilung von Neuronen, die cho-1::gfp gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren, im Nervensystem von Nematoden zeigt.
  • 6 ist eine Ansicht, die den Stammbaum der Familie der Na+-abhängigen Glucosetransporter zeigt.
  • 7 ist eine Ansicht, die die erwartete Topologie von Ratten-CHT1 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 8 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der Northern-Blot-Analyse eines CHT1-mRNA-Transkripts in Rattengewebe gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 9 ist eine Ansicht, die das Ergebnis einer in situ-Hybridisierungsanalyse eines CHT1-Transkripts in einem Rattengehirn gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 10 ist eine Ansicht, die das Ergebnis einer in situ-Hybridisierungsanalyse eines CHT1-Transkripts in einem Rückenmark gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 11 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der [3H]-Cholinaufnahme von Oozyten von Xenopus gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, in die CHT1-cRNA gemäß der vorliegenden Erfindung oder Wasser injiziert wurde.
  • 12 ist eine Ansicht, die die Auswirkung der Cholinkonzentration auf die Cholinaufnahme in CHT1 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 13 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der HC3-induzierten Inhibition der Cholinaufnahme von CHT1 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 14 ist eine Ansicht, die das Ergebnis von Na+- und Cl–-abhängiger Cholinaufnahme von CHT1 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • 15 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der [3H]-HC3-Bindung an die Membran, hergestellt aus COS7-Zellen, in die CHT1-cDNA gemäß der vorliegenden Erfindung oder VektorpcDNA 3.1 separat eingebracht wurde, zeigt.
  • 16 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der Sättigungsanalyse von spezifischer [3H]-HC3-Bindung an die Membran, hergestellt aus COS7-Zellen, in die CHT1-cDNA gemäß der vorliegenden Erfindung oder Vektor-pcDNA 3.1 separat eingebracht wurde, zeigt.
  • 17 ist eine Ansicht, die das Ergebnis der Verdrängung von spezifischer [3H]-HC3-Bindung durch HC3 gemäß der vorliegenden Erfindung, Cholin (Cho) und Acetylcholin (ACh) zeigt.
  • Bester Ausführungsmodus der Erfindung
  • Die cDNA von hochaffinem Nematoden-Cholintransporter, die in SEQ ID NO: 1 beschrieben ist, kann erhalten werden, indem man jede cRNA, hergestellt aus Kandidaten-cDNAs voller Länge, von denen erwartet wird, daß sie ein Mitglied der Familie der Na+-abhängigen Transporter gemäß dem C. elegans-Genomprojekt sind, in Oozyten von Xenopus injiziert und die Cholinaufnahme untersucht. Die hochaffine Aufnahme von Cholin in Gehirn-Synaptosomen von Säugern wurde durch 1 μM Hemicholinium-3 (HC3)(Ki = 10–100 nM) vollständig inhibiert, während die niedrigaffine Aufnahme von Cholin, das in allen Zellen verteilt ist, nur durch HC3 in höherer Konzentration (Ki = 50 μM) inhibiert wurde. Daher kann die Empfindlichkeit gegenüber 1 μM HC3 als Kriterium für die hochaffine Cholinaufnahme während des Verfahrens verwendet werden. Beispielsweise ist es möglich, die Identifizierung, die Expression und die Lage eines Objektgens aus der Kandidaten-cDNA eines Nematoden (C. elegans) wie folgt zu bestätigen.
  • Es wurde herausgefunden, daß bei dem Vorgang der hochaffinen Cholinaufnahme cDNA, die dem Gen, welches als C48D1.3 erwartet wird, entspricht, eine signifikante Cholinaufnahme fördert, die durch 1 μM HC3 inhibiert wird. 1 zeigt das Ergebnis der [3H]-Cholinaufnahme von Oozyten von Xenopus, in die C48D1.3-cRNA oder Wasser injiziert wurde. In 1 zeigen die ausgefüllten und die leeren Säulen die Cholinaufnahme in Abwesenheit bzw. in Gegenwart von 1 μM HC3, und jede Säule zeigt einen Mittelwert ± SEM (n = 6 bis 8 Oozyten). 2 zeigt die Auswirkung von Na+ auf die Cholinaufnahme, und die ausgefüllten Säulen zeigen die Cholinaufnahme, gemessen in der Standardlösung ([Na+] = 100 mM), die leeren Säulen zeigen die Cholinaufnahme in Abwesenheit von Na+ (Na+ wurde durch Li+ ersetzt). Zusätzlich zeigt 3 die Inhibition der Cholinaufnahme, die durch HC3 induziert wird. Auf Basis der oben genannten 2 und 3 wird angenommen, daß die Aufnahme von Na+ abhängig ist und daß der Ki von HC3 50 nM beträgt. Der cDNA-Klon wurde mit cho-1 (hochaffiner Cholintransporter-1) bezeichnet.
  • Durch Vergleichen einer Rasensequenz von cDNA mit derjenigen des Genoms wurde herausgefunden, daß das cho-1-Gen 9 Exons umfaßt. Ein aus einer Rasensequenz von cDNA von cho-1 erwartetes Protein enthält 576 Aminosäurereste (siehe 4), und dieses Protein, das durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, kann durch ein übliches Verfahren erzeugt werden. Als die verfügbare Datenbank durchsucht wurde, zeigten die Aminosäuresequenzen von cho-1 eine schwache, jedoch signifikante Homologie zu Mitgliedern der Familie der Na+-abhängigen Glucosetransporter. Hydrophobe Analyse und Vergleich mit anderen Transportern deuten darauf hin, daß es eine Zwölffach-Transmembranregion gibt (siehe 7).
  • Dann wurde, um Zellen zu identifizieren, die cho-1 im Nervensystem eines Nematoden (C. elegans) exprimieren, ein Gen eines grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), welches mit einer Region 5,1 kb stromaufwärts von dem cho-1-Gen fusioniert war, in einen Nematoden eingebracht, und die Verteilung der Neuronen, die cho-1::gfp exprimierten, wurde untersucht. Eine Fotografie von L1-Larven, die cho-1::gfp-Reporter-DNA an der Außenseite des Chromosoms aufweisen, ist als 5 gezeigt (Maßstabsbalken, 50 μm). In 5 zeigt die Pfeilspitze einen Nervenring. In der Bauchganglienkette wird GFP nur im cholinergen Bewegungsnerv exprimiert, einige der DA-, DB-Nervenzellen exprimieren GFP jedoch nicht, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, daß die Reporter-DNA an der Außenseite des Chromosoms Defekte aufweist. Dies stützt den Gedanken, daß cho-1 ein hochaffiner Cholintransporter des cholinergen Neurons ist.
  • Die cDNA von hochaffinem Cholintransporter von Ratten, die in SEQ ID NO: 3 beschrieben ist, kann beispielsweise durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die Stufen umfaßt, bei denen man auf homologe cho-1-Moleküle von Wirbeltieren achtet und die Datenbank mit Aminosäuresequenzen, die von cho-1 erwartet werden, durchsucht und einen Kandidaten (Gen-Bank-Hinterlegungsnummer: AQ 316435) in der humanen Genomic Survey Sequence (GSS) identifiziert, cDNA-Fragmente aus Rattenrückenmark-cDNA mittels PCR mit degenerierten Primern auf Basis von Homologie von Rasensequenzen zwischen der DNA des menschlichen Genoms und cho-1 vervielfältigt, eine Rattenrückenmark-cDNA-Bibliothek mit diesem Fragment screent, und es wurde ein positiver cDNA-Klon erhalten. Ein Protein mit 580 Aminosäureresten, welches 51% Identität und 70% Ähnlichkeit zu cho-1 zeigt, wurde aus der Rasensequenz des längsten Leserahmens erwartet (siehe 4). Dieser Ratten-cDNA-Klon wurde mit CHT1 bezeichnet. In 4 sind alle Aminosäuresequenzen von Ratten-CHT1 und Nematoden-CHO-1 gezeigt, und die identischen und die ähnlichen Reste sind vor einem schwarzen Hintergrund bzw. einem grauen Hintergrund gezeigt. Die erwartete Transmembranregion I–XII ist unterstrichen. Dieses durch SEQ ID NO: 4 repräsentierte Protein kann durch ein übliches Verfahren erzeugt werden.
  • Die oben genannte Aminosäuresequenz von CHT1 ist in signifikantem Maße homolog zu Mitgliedern der Familie der Na+-abhängigen Glucosetransporter (20 bis 25%). Der Stammbaum der Familie der Na+-abhängigen Glucosetransporter, der durch das Neighbour-Joining-Verfahren unter Verwendung des Programms CLUSTALW vom National Institute of Genetics (Mishima, Japan) erzeugt wurde, ist in 6 gezeigt. In 6 ist der Prozentanteil an identischen Aminosäuren, die in jedem Protein enthalten sind, zu Ratten-CHT1 auf der rechten Seite gezeigt. Dagegen wurde keine Homologie zu einem Hefe-Cholintransporter (J. Biol. Chem. 265, 15996–16003, 1990), einem Creatintransporter, über den ursprünglich als ein hochaffiner Cholintransporter berichtet wurde (Biochem. Biophys. Res. Commun. 198, 637–645, 1994), und anderen Neurotransmittertransportern beobachtet.
  • Es wird angenommen, daß die erwartete Topologie von CHT1 im wesentlichen die gleiche ist wie die von Nematoden-CHO-1. 7 zeigt die erwartete Topologie von Ratten-CHT1. In 7 zeigen die ausgefüllten Kreise die identischen Reste, die schattierten Kreise zeigen hochgradig konservierte Reste, und die leeren Kreise zeigen nicht-ähnliche Reste. Die Verzweigungen zeigen die erwarteten Glycosylierungsstellen. P in den Kreisen zeigt die erwarteten Teile von Phosphorylierung, die durch Proteinkinase C induziert wird.
  • Als nächstes wurde die Verteilung der CHT1-mRNA-Expression mittels Northern-Blot-Analyse und in situ-Hybridisierung untersucht. Die Expression von Transkripten mit einer Länge von etwa 5 kb wurde mittels Northern-Blot-Analyse mit verschiedenen Geweben von Ratten bestätigt. 8 zeigt das Ergebnis der Northern-Blot-Analyse eines mRNA-Transkripts von CHT1 in Rattengewebe, und die Länge der Standard-RNA (0,24 bis 9,5 kb; GIBCO BRL) ist auf der linken Seite gezeigt. Wie in 8 gezeigt, wurde eine Fülle von Transkripten in basalem Vor derhirn, Hirnstamm und Rückenmark bestätigt, und wenig Transkripte wurden im Corpus striatum bestätigt. Von diesen Geweben ist bekannt, daß sie cholinerge Neuronen enthalten. Dagegen wurde in anderen Regionen des Gehirns oder in nicht zu den Nervensystemen gehörenden Geweben kein Transkript beobachtet.
  • In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen bestätigte die in situ-Hybridisierung die Expression von CHT1-mRNA in Zellgruppen von cholinergen Hauptneuronen, einschließlich Corpus striatum, Zellpopulationen im basalen Vorderhirn und im Vorderhorn in Rückenmark. Die 9 und 10 (Maßstabsbalken, 1 mm) zeigen Mikrofotografien von Schnitten im Hellfeld, die mit einer Digoxigenin-markierten Antisense-cRNA-Sonde hybridisiert waren. Diese Mikrofotografien beziehen sich auf die in situ-Hybridisierungsanalyse von CHT1-Transkripten in Rattenhirn und -rückenmark. 9 zeigt, daß mRNA-Transkripte von CHT1 in vertikalen und horizontalen Gliedern des Diagonalbands (VDB, HDB), im medialen Septumkern (MS), im Caudatus und Putamen (Cpu) und im olfaktorischen Tuberkel (Tu) detektiert wurden. 10 zeigt, daß eine Expression im Vorderhorn (VH) in Rückenmark beobachtet wurde. Weiterhin zeigte der benachbarte Schnitt, der mit einer Sonde von Vesikel-Acetylcholintransporter hybridisiert war, im wesentlichen die gleiche Verteilung. Diese Verteilung der Expression ist im wesentlichen die gleiche wie die berichtete Verteilung der Cholinacetyl-Gruppen-Transferase oder des Vesikel-Acetylcholintransporters. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Expression von CHT1-mRNA auf cholinerge Neuronen beschränkt ist.
  • Als nächstes wurde die Cholinaufnahme von CHT1 unter Verwendung von Oozyten von Xenopus untersucht. Die Cholinaufnahme der Oozyten, in die CHT1-cRNA injiziert worden war, betrug das 2- bis 4-fache derjenigen von Kontrollen, in die Wasser injiziert worden war. 11 zeigt das Ergebnis der [3H]-Cholinaufnahme von Oozyten von Xenopus, in die CHT1-cRNA oder Wasser injiziert worden war. In 11 zeigen die leeren bzw. die ausgefüllten Säulen die Cholinaufnahme in den Standardlösungen, die 100 mM NaCl oder LiCl enthielten, und jede Säule zeigt einen Mittelwert ± SEM (n = 6 bis 8 Oozyten). Die Auswirkung der Cholinkonzentration auf die Cholinaufnahme ist in 12 gezeigt. In 12 wurde die Cholinaufnahme von Oozyten, in die Wasser injiziert worden war, von derjenigen von Oozyten, in die cRNA injiziert worden war, subtrahiert, um die durch CHT1 induzierte Cholinaufnahme auszurechnen, und die Cholinaufnahme wurde in eine Michaelis-Menten-Kurve eingepaßt. Wie in 12 gezeigt, gab es bei der Cholinaufnahme von CHT1 eine Sättigung, wenn die Cholinkonzentration stieg (Km = 2,2 ± 0,2 μM, n = 3). Der Km der endogenen Cholinaufnahme der Kontrolle ist größer als 10 μM.
  • Das Ergebnis der HC3-induzierten Inhibition der Cholinaufnahme ist in 13 gezeigt. 13 zeigt, daß die Cholinaufnahme von CHT1 durch 0,1 μM HC3 (Ki = 2–3 nM) vollständig inhibiert wird, wohingegen 10 μM HC3 nur eine leichte Inhibition in der Kontrolle induzierten. Wie in 14 gezeigt, wurde die Zonenabhängigkeit der Cholinaufnahme von CHT1 untersucht, und es wurde herausgefunden, daß sie sowohl von Cl– abhängig ist als auch von Na+ abhängig ist. Die ausgefüllten und die leeren Säulen zeigen die Cholinaufnahme von Oozyten, in die Wasser bzw. cRNA injiziert worden war (100 mM NaCl in der Standardlösung sind durch 100 mM jedes Salzes ersetzt), wie in der Figur gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß CHT1 die von der hochaffinen Cholinaufnahme in den Gehirn-Synaptosomen erwarteten Charakteristika (hohe Affinität für Cholin, hohe Empfindlichkeit gegenüber HC3 und Na+-Cl–-Abhängigkeit) aufweist (J. Neurochem. 27, 93–99, 1976).
  • Zusätzlich wurde die [3H]-HC3-Bindungsaktivität von Membranen, hergestellt aus COS7-Zellen, in die CHT1-cDNA bzw. ein Vektor (Kontrolle) eingebracht worden war, untersucht. Das Ergebnis ist in 15 gezeigt. Wie in 15 gezeigt, wurde eine Na+-abhängige [3H]-HC3-Bindung in einer Membran einer Zelle, in der CHT1 exprimiert wurde, nicht jedoch in einer Kontrollmembran beobachtet. Anschließend wurde eine Sättigungsanalyse auf spezifische [3H]-HC3-Bindung durchgeführt. Wie in 16 gezeigt, wurde die Dissoziationsgleichgewichtskonstante (Kd) auf 1,6 ± 0,2 μM (n = 3) geschätzt. Dieser Wert war ähnlich demjenigen, über den in Gehirn-Synaptosomen berichtet wurde (J. Neurochem. 60, 1191–1201, 1993, Life Sci. 35, 2335–2343, 1984, Brain Res. 348, 321–330, 1985). Des weiteren wurde die Verdrängung von spezifischer [3H]-HC3-Bindung durch HC3, Cholin (Cho) und Acetylcholin (Ach) untersucht. Acetylcholin wurde in Gegenwart von 1 μM Physostigmin gemessen. Das Ergebnis ist in 17 gezeigt. 17 zeigt, daß eine spezifische [3H]-HC3-Bindung verdrängt wurde, wenn die Konzentration von Cholin wenigstens um das etwa 10-fache niedriger war als die von Acetylcholin. Diese Ergebnisse zeigen, daß CHT1 eine HC3-Bindungsstelle sowie auch ein hochaffiner Cholintransporter ist.
  • Die cDNA von humanem hochaffinem Cholintransporter gemäß der vorliegenden Erfindung, die durch SEQ ID NO: 5 repräsentiert wird, kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden: Eine Datenbanksuche wurde mit der Aminosäuresequenz von Nematoden- (C. elegans) CHO-1 durchgeführt, um eine Sequenz eines spezifischen DNA-Fragments des menschlichen Genoms mit signifikanter Homologie zu finden (R-107P12, ein Klon der humanen Genomic Survey Sequence; GenBank-Hinterlegungsnummer: AQ316435), genspezifische Primer für PCR wurden auf Basis einer Rasensequenz des DNA-Fragments hergestellt, 5'-RACE (rasche Vervielfältigung von cDNA-Enden) und 3'-RACE wurden unter Verwendung von Marathon-ReadyTM-cDNA (Clontech) von menschlichem Gesamthirn zusammen mit einem angebundenen Adapterprimer durchgeführt, das erhaltene PCR-Produkt wurde für die PCR in einen Klonierungsvektor kloniert, und die Rasensequenz der eingebrachten DNA wurde bestimmt. Zusätzlich wird eine aus dieser Sequenz erwartete Aminosäuresequenz durch SEQ ID NO: 6 repräsentiert. Ein Protein mit der Aktivität eines humanen hochaffinen Cholintransporters, das durch SEQ ID NO: 6 repräsentiert wird, kann unter Verwendung eines üblichen Verfahrens auf Basis der in SEQ ID NO: 5 gezeigten DNA-Sequenzinformation erzeugt werden.
  • Beispiele eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein von natürlichen Materialien abgeleitetes Protein und ein rekombinantes Protein. Zusätzlich zu dem durch SEQ ID NO: 6 repräsentierten Protein, welches oben spezifisch beschrieben wird, ist auch ein Protein umfaßt, welches eine Aminosäuresequenz hat, wobei in der durch SEQ ID NO: 6 repräsentierten Aminosäuresequenz eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, und welches hochaffine Cholintransporter-Aktivität aufweist. Diese Proteine können durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Des weiteren umfassen Beispiele eines Gens oder einer DNA, das bzw. die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, zusätzlich zu dem bzw. der durch SEQ ID NO: 5 repräsentierten Gen bzw. DNA, das bzw. die oben spezifisch beschrieben wird, ein Gen oder eine DNA, das bzw. die ein Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, wobei in der durch SEQ ID NO: 6 repräsentierten Aminosäuresequenz eine Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, und welches hochaffine Cholintransporter-Aktivität besitzt, und DNA, die ein Protein codiert, welches mit dem Gen oder der DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert und hochaffine Cholintransporter-Aktivität aufweist. Diese Gene und DNAs können mittels bekannter Verfahren hergestellt werden.
  • Cholinerge Neuronen spielen eine überaus wichtige Rolle für das Lernen und das Gedächtnis. Eine Schädigung dieser Neuronen korreliert mit der Schwere von Demenz. Es wird angenommen, daß der die Geschwindigkeit beschränkende Schritt bei der Acetylcholinsynthese die Aufnahme von Cholin ist und seine Aktivität durch die neurale Aktivität oder verschiedene Arten von Stimuli gesteuert wird. Im Gehirn von Patienten, die an der Alzheimer'schen Krankheit leiden, werden eine Überfunktion von hochaffiner Cholinaufnahme und HC3-Bindungsaktivität beobachtet (Trends Neurosci. 15, 117–122, 1992, Ann. NY Acad. Sci. 777, 197–204, 1996, J. Neurochem. 69, 2441–2451, 1997). Das Klonieren des Gens oder der DNA, das bzw. die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, und des Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität ist wichtig für die Aufklärung des molekularen Mechanismus des hochaffinen Cholintransporters und für die Entwicklung neuer Therapien für die Alzheimer'sche Krankheit.
  • Das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Substanz, die erzeugt wird, indem man ein Protein von einem Menschen, welches hochaffine Cholintransporter-Aktivität besitzt, an ein Markerprotein und/oder eine Peptidmarkierung bindet. Als das Markerprotein kann jedes herkömmlicherweise bekannte Markerprotein verwendet werden, und spezifische Beispiele sind alkalische Phosphatase, die Fc-Region eines Antikörpers, HRP und GFP. Herkömmlicherweise bekannte Peptidmarkierungen, wie die Myc-Markierung, die His-Markierung, die FLAG-Markierung und die GST-Markierung, werden als spezifische Beispiele der Peptidmarkierung gemäß der vorliegenden Erfindung beispielhaft beschrieben. Die Fusionsproteine können durch ein übliches Verfahren erzeugt werden und eignen sich für die Reinigung eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität unter Verwendung der Affinität zwischen Ni-NTA und der His-Markierung, für die Detektion eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, für die Quantifizierung eines Antikörpers gegen ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität und als ein diagnostischer Marker für die Alzheimer'sche Krankheit und als Reagens für die experimentelle Forschung auf dem betreffenden Gebiet.
  • Als ein Antikörper, der spezifisch an ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, werden ein immunspezifischer Antikörper, wie ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein chimärer Antikörper, ein einzelstrangiger Antikörper, ein humanisierter Antikörper und dergleichen konkret beispielhaft angegeben. Obwohl diese Antikörper durch ein übliches Verfahren mit dem oben genannten Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität als Antigen erzeugt werden können, ist hiervon ein monoklonaler Antikörper aufgrund seiner Spezifität eher bevorzugt. Der Antikörper, der spezifisch an ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität bindet, wie ein monoklonaler Antikörper oder dergleichen, eignet sich beispielsweise für die Diagnose der Alzheimer'schen Krankheit und für die Aufklärung des molekularen Mechanismus eines hochaffinen Cholintransporters.
  • Ein Antikörper gegen ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität wird entwikkelt, indem man Fragmente, die das Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität oder dessen Epitop enthalten, oder Zellen, die das Protein an der Oberfläche der Membran exprimieren, gemäß dem üblichen Protokoll an Tiere (vorzugsweise unter Ausschluß von Menschen) verabreicht. Beispielsweise kann ein monoklonaler Antikörper durch ein beliebiges Verfahren hergestellt werden, welches Antikörper, die durch kultivierte Materialien von kontinuierlichen Zellinien erstellt werden, hervorbringt, wie z. B. das Hybridom-Verfahren (Nature 256, 495–497, 1975), das Triom-Verfahren, das humane B-Zell-Hybridom-Verfahren (Immunology Today 4, 72, 1983) und das EBV-Hybridom-Verfahren (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, S. 77–96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
  • Um einen einzelstrangigen Antikörper gegen das oben genannte Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung zu entwickeln, kann das Verfahren zur Herstellung einzelstrangiger Antikörper ( US-Patent Nr. 4,946,778 ) verwendet werden. Weiterhin ist es möglich, transgene Mäuse, andere Säugetiere oder dergleichen zu verwenden, um einen humanisierten Antikörper zu exprimieren und die Klone, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität exprimieren, mit den oben genannten Antikörpern zu isolieren und zu identifizieren und das Polypeptid mittels Affinitätschromatographie zu reinigen. Ein Antikörper gegen ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität könnte insbesondere für die Diagnose und die medizinische Behandlung der Alzheimer'schen Krankheit und dergleichen verwendet werden.
  • Diese Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die ein Expressionssystem enthält, welches das Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität exprimieren kann. Das Gen, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, kann durch eine Anzahl von Verfahren, die in vielen standardmäßigen Laborhandbüchern, wie z. B. von Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) und von Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), beschrieben sind, in eine Wirtszelle eingebracht werden. Beispiele dieser Verfahren umfassen Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjekti on, kationische lipidvermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape Loading, ballistische Einbringung und Infektion. Beispiele der Wirtszellen umfassen bakterielle prokaryotische Zellen, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus und dergleichen, Pilzzellen, wie Hefe, Aspergillus und dergleichen, Insektenzellen, wie Drosophila S2, Spodoptera Sf9 und dergleichen, und Tier- oder Pflanzenzellen, wie L-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, HeLa-Zellen, C127-Zellen, BALG/c3T3-Zellen (einschließlich mutanter Stämme, die Dihydrofolatreductase-defizient, Thymidinkinase-defizient oder dergleichen sind), BHK21-Zellen, HEK293-Zellen, Bowes-Melanom-Zellen und dergleichen.
  • Als Expressionssystem genügt jedes Expressionssystem, das ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität exprimieren kann. Beispiele des Expressionssystems umfassen Expressionssysteme, abgeleitet von Chromosom, Episom und Virus, beispielsweise Vektoren, abgeleitet von bakteriellem Plasmid, Hefeplasmid, Papovavirus-artigem SV40, Vacciniavirus, Adenovirus, Windpockenvirus, Pseudorabies-Virus oder Retrovirus, Vektoren, abgeleitet von Bakteriophagen, Transposon und Kombinationen davon, beispielsweise Vektoren, abgeleitet von genetischen Faktoren von Plasmid und von Bakteriophagen, wie Cosmid oder Phagemid. Diese Expressionssysteme können eine regulatorische Sequenz enthalten, die nicht nur als Promotor, sondern auch als Steuerung der Expression dient.
  • Eine Wirtszelle, die das oben genannte Expressionssystem enthält, eine Zellmembran der Wirtszelle und ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, welches durch Kultivieren der Wirtszelle erhalten werden kann, können in dem Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie es nachfolgend beschrieben wird. Beispielsweise kann das Verfahren von F. Pietri-Rouxel et al. (Eur. J. Biochem., 247, 1174–1179, 1997) oder dergleichen als das Verfahren zum Erhalten von Zellmembranen verwendet werden, und der Öffentlichkeit bekannte Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphozellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie, vorzugsweise Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie, können verwendet werden, um das Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität aus kultiviertem Zellmaterial aufzunehmen und zu reinigen. Die für die Affinitätschromatographie verwendeten Säulen sind insbesondere Säulen, an die ein Proteinantikörper mit Anti-hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gebunden ist, oder, falls eine normale Peptidmarkierung zu dem hochaffinen Cholintransporter hinzugefügt wird, es handelt sich um Säulen, an die Materialien gebunden sind, welche Affinität für die Peptidmarkierung besitzen. Proteine mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität können unter Verwendung dieser Säulen erhalten werden.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet das nicht-menschliche Tier, bei dem die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf seinem Chromosom defizient ist, ein nicht-menschliches Tier, worin ein Teil des Gens oder das gesamte Gen, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf dem Chromosom durch Genmutation, wie Disruption, Defizienz, Substitution usw. inaktiviert ist und die Funktion des Exprimierens eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität verlorengeht. Zusätzlich bedeutet ein nicht-menschliches Tier, welches die Funktion eines Gens, das ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität auf seinem Chromosom überexprimiert, ein nicht-menschliches Tier, welches eine größere Menge eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität produziert, als es bei einem nicht-menschlichen Tier vom Wildtyp der Fall ist. Obwohl spezifische Beispiele eines nicht-menschlichen Tiers gemäß der vorliegenden Erfindung Nagetiere, wie Mäuse, Ratten und dergleichen, umfassen, ist ein nicht-menschliches Tier gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Tiere beschränkt.
  • Homozygote nicht-menschliche Tiere, die gemäß dem Mendel'schen Verhältnis erzeugt wurden, umfassen einen defizienten Typ oder einen überexprimierenden Typ für ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität und deren Wildtyp-Wurfgeschwister, und es ist möglich, präzise Vergleichsexperimente auf individueller Ebene durchzuführen, indem man die defizienten Typen, die überexprimierenden Typen und die Wildtyp-Wurfgeschwister dieser homozygoten nicht-menschlichen Tiere gleichzeitig verwendet. Somit ist es bevorzugt, Tiere derselben Spezies, vorzugsweise die Wurfgeschwister, als die nicht-menschlichen Tiere vom Wildtyp zu verwenden, mit anderen Worten, die nicht-menschlichen Tiere, bei denen die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf ihrem Chromosom defizient ist oder die dieses überexprimieren, gemeinsam z. B. in dem im folgenden beschriebenen Screening gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Das Verfahren zur Erzeugung der nicht-menschlichen Tiere, bei denen die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf ihrem Chromosom defizient ist oder die dieses überexprimieren, wird unten anhand eines Beispiels von Knockout-Mäusen und transgenen Mäusen mit einem Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität erläutert.
  • Beispielsweise kann eine Maus, in der die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf ihrem Chromosom defizient ist, mit anderen Worten, eine Knockout-Maus eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität auf ihrem Chromosom, kann wie folgt erzeugt werden. Ein Gen, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, wird unter Verwendung eines aus einer Maus-Genbibliothek erhaltenen Genfragments mit einem Verfahren wie PCR gescreent. Das gescreente Gen, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, wird mit einem viralen Vektor oder dergleichen subkloniert und mittels DNA-Sequenzierung spezifiziert. Ein Zielvektor wird erzeugt, indem man das gesamte Gen oder einen Teil eines Gens dieses Klons, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, durch eine pMC1-neo-Genkassette oder dergleichen ersetzt und ein Diphtherie-Toxin A-(DT-A-)Fragmentgen, ein Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-(HSV-tk-)Gen oder andere solche Gene an der 3'-terminalen Seite einbringt.
  • Der so erzeugte Zielvektor wird linearisiert und mittels Elektroporation oder dergleichen in ES-Zellen eingebracht, um die homologe Rekombination zu induzieren. Die ES-Zellen, in denen die homologe Rekombination durch ein Antibiotikum, wie G418, Ganciclovir (GANC) oder dergleichen, induziert wird, werden aus den homologen Rekombinanten ausgewählt. Es ist bevorzugt, mittels Southern-Blot oder dergleichen zu bestätigen, ob die ausgewählten ES-Zellen die Rekombinanten des Objekts sind. Eine chimäre Maus wird erzeugt, indem man einen Klon der bestätigten ES-Zellen in eine Blastozyste einer Maus mikroinjiziert und dann die Blastozyste in eine Empfängermaus transplantiert. Eine heterozygote Maus kann erhalten werden, indem man die chimäre Maus mit einer Wildtyp-Maus kreuzt, und eine Knockout-Maus eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung kann erzeugt werden, indem man die heterozygoten Mäuse kreuzt. Es ist möglich, zu bestätigen, ob eine Knockout-Maus eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität erzeugt wurde, indem man beispielsweise RNA aus der durch dieses Verfahren erhaltenen Maus isoliert und sie mittels Northern-Blot-Analyse oder dergleichen untersucht oder indem man die Expression der Maus mittels Western-Blot-Analyse oder dergleichen untersucht.
  • Die transgenen Mäuse eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität können in den folgenden Verfahren erzeugt werden. Ein Transgen wird erzeugt, indem man Hühner-β-Actin, Maus-Neurofilament, SV40 oder andere solche Promotoren und Kaninchen-β-Globin, SV40 oder andere solche Poly A oder Introns mit cDNA, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, fusioniert. Das Transgen wird in den Pronukleus eines befruchteten Eis einer Maus mikroinjiziert, und die erhaltene Eizelle wird kultiviert und dann in den Eileiter einer Empfängermaus transplantiert. Nach Züchten des Empfängertiers werden Babymäuse, die die obige cDNA aufweisen, unter den von dem Empfängertier geborenen Mäusen ausgewählt. So können transgene Mäuse erzeugt werden. Die Babymaus, die cDNA aufweist, kann ausgewählt werden, indem man rohe DNA aus einem Schwanz oder dergleichen einer Maus extrahiert und dann Verfahren wie Punkthybridisierung unter Verwendung des eingebrachten Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, als Sonde oder ein PCR-Verfahren unter Verwendung eines spezifischen Primers und dergleichen durchführt.
  • Zusätzlich können Zellen, die für die Gentherapie von Alzheimer'scher Krankheit und dergleichen geeignet sind, unter Verwendung eines vollständigen Gens oder einer vollständigen DNA oder eines Teils davon, das bzw. die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, hergestellt werden. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Herstellung dieser Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren, bei dem das vollständige Gen oder die vollständige DNA oder ein Teil davon gemäß der vorliegenden Erfindung in eine Zelle, bei der die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf ihrem Chromosom defizient ist, mittels Transfektion oder dergleichen eingebracht wird, um eine Zelle mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität zu erhalten. Als Zelle mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität ist es insbesondere bevorzugt, eine Zelle zu verwenden, worin das Gen oder die DNA in ein Chromosom integriert ist und die stabile hochaffine Cholintransporter-Aktivität zeigt.
  • Unter Verwendung des oben genannten Gens oder der DNA, das bzw. die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, eines Fusionsproteins, erzeugt durch Kombinieren eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität und eines Markerproteins und/oder einer Peptidmarkierung, eines Antikörpers gegen ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, einer Wirtszelle, die ein Expressionssystem, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität exprimieren kann, enthält, einer Zelle mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität oder dergleichen wird es möglich, ein pharmazeutisches Material, welches für die Behandlung von Symptomen wie bei der Alzheimer'schen Krankheit oder dergleichen geeignet ist, mit anderen Worten, ein Material, welches die Aktivität oder die Expression eines hochaffinen Cholintransporters fördert oder unterdrückt, zu screenen.
  • Beispiele solcher Screeningverfahren umfassen die folgenden: ein Verfahren, bei dem die hochaffine Cholintransporter-Aktivität des oben genannten Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung in der Gegenwart eines Subjektmaterials gemessen/evaluiert wird, ein Verfahren, bei dem eine Zellmembran oder eine Zelle, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, in der Gegenwart eines Subjektmaterials in vitro kultiviert wird und die Aktivität und/oder die Expressionsmenge eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität in der Zelle gemessen/evaluiert wird, und ein Verfahren, bei dem ein Subjektmaterial an das nicht-menschliche Tier, bei dem die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf seinem Chromosom defizient ist oder das dieses überexprimiert, und/oder ein nicht-menschliches Tier vom Wildtyp verabreicht wird und dann die Aktivität und/oder die Expressionsmenge eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen/evaluiert wird. Als die Zellmembran oder die Zelle können eine Zelle, wie eine Primärkulturzelle, erhalten von dem nicht-menschlichen Tier, bei dem die Funktion eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, auf seinem Chromosom defizient ist oder das dieses überexprimiert, oder einem nicht-menschlichen Tier vom Wildtyp usw., eine Wirtszelle, die ein Expressionssystem enthält, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung exprimieren kann, eine Zelle mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung und Zellmembranen dieser Zellen spezifisch beispielhaft genannt werden.
  • Die Screeningverfahren mit dem Subjektmaterial und dem Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität werden nun anhand von Beispielen spezifisch erläutert, jedoch sind die Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt. Zellen, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität exprimieren, werden in der Gegenwart eines Subjektmaterials kultiviert, und die Steigerung oder Verringerung der Menge eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, die nach einer bestimmten Zeitdauer des Kultivierens auf der Zelloberfläche exprimiert wird, kann mittels ELISA oder einem anderen solchen Verfahren mit einem Antikörper, der spezifisch an ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, immunochemisch detektiert werden, oder sie kann unter Verwendung von Unterdrückung oder Förderung der mRNA-Expression als ein Index evaluiert werden. Die mRNA kann mittels Verfahren wie DNA-Chip, Northern-Hybridisierung oder dergleichen detektiert werden. Darüber hinaus kann mit einer Zelle, in die ein Gen, worin Luciferase oder ein anderes solches Reportergen mit dem abstromigen Ende des Promotors eines Gens, welches einen hochaffinen Cholintransporter codiert, verknüpft ist, eingebracht wird, die Unterdrückung oder die Förderung der Expression eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, induziert durch ein Subjektmaterial, detektiert werden, indem man die Aktivität des Reportergens als Index verwendet.
  • Ein medizinischer Bestandteil, welcher ein Subjektmaterial, das ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität enthält, ein Material, welches die Aktivität oder die Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität fördert, oder ein Material, welches die Aktivität oder Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität unterdrückt, als aktive Komponente umfaßt, kann für die medizinische Behandlung eines Patienten, der der Förderung der Aktivität oder der Expression eines Proteins mit hochaffinem Cholintransporter bedarf, verwendet werden, oder als ein medizinischer Bestandteil, welcher für die medizinische Behandlung eines Patienten, der der Unterdrückung der Aktivität oder der Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität bedarf, verwendet werden. Da ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität an vielen biologischen Funktionen, einschließlich vieler pathologischer Funktionen, beteiligt ist, wird erwartet, daß eine Verbindung, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität stimulieren kann, und eine Verbindung, die die Funktion dieses Proteins inhibieren kann, als Pharmazeutika verwendet werden können.
  • Als das Material, welches die Aktivität oder die Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität fördert oder unterdrückt, kann jedes Material verwendet werden, solange es an ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität bindet oder auf ein aufstromiges signalübertragendes Molekül einwirkt und dann die Aktivität oder die Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität fördert oder die Aktivität oder die Expression des Proteins selbst inhibiert/antagonisiert. Spezifische Beispiele umfassen einen Antikörper, einen Liganden eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, ein Fragment dieses Proteins und ein dieses Fragment codierendes Oligonukleotid, und diese Materialien können als Pharmazeutika für die Behandlung, Prävention oder dergleichen von Symptomen, wie sie im Falle von Alzheimer'scher Krankheit oder anderer solcher Erkrankungen beobachtet werden, verwendet werden, jedoch ist ihre Verwendung nicht auf die obigen Beispiele beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Diagnoseverfahren für Erkrankungen, die mit der Aktivität oder der Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität in Verbindung stehen, wobei das Verfahren das Vergleichen einer DNA-Sequenz, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität in einer Probe codiert, mit einer DNA-Sequenz, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, umfaßt. Der mutante Typ von DNA, die ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, kann durch Auffinden von genmutierten Individuen auf DNA-Ebene detektiert werden, und dies ist geeignet für die Diagnose von Erkrankungen, die durch eine Unterexpression, überexpression oder mutante Expression eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität verursacht werden. Spezifische Beispiele einer Probe der Detektion umfassen Zellen von Versuchssubjekten, beispielsweise genomische DNA, RNA oder cDNA, erhalten aus der Biopsie von Blut, Urin, Speichel, Gewebe oder dergleichen, jedoch ist die Probe nicht auf diese Beispiele beschränkt. Es ist auch möglich, die Probe zu verwenden, wenn sie mittels PCR oder anderen solchen Verfahren vervielfältigt wurde. Defizienz- und Insertionsmutation von Rasensequenzen können anhand der Größenveränderung des vervielfältigten Produkts, die im Vergleich zum normalen Genotyp beobachtet wird, detektiert werden, und eine Punktmutation kann durch Hybridisieren von vervielfältigter DNA mit einem markierten Gen, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, identifiziert werden. Somit kann eine Diagnose oder Beurteilung von Symptomen, die im Falle der Alzheimer'schen Krankheit oder anderer solcher Erkrankungen beobachtet werden, durch Detektieren der Mutation eines Gens, welches ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität codiert, vorgenommen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Diagnosesonde für Erkrankungen, die Symptome ähnlich denjenigen von Alzheimer'scher Krankheit oder dergleichen zeigen, wobei die Sonde einen Teil eines Antisense-Stranges von DNA oder RNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, wobei der Teil wenigstens 20 Basen umfaßt, aufweist, und ein Diagnosemittel für Erkrankungen, die Symptome ähnlich denjenigen von Alzheimer'scher Krankheit zeigen, wobei das Mittel die Diagnosesonde und/oder einen Antikörper, welcher spezifisch an ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, enthält.
  • Um ein Diagnosemittel für Symptome ähnlich denjenigen von Alzheimer'scher Krankheit herzustellen, welches die Sonde und/oder einen Antikörper, welcher spezifisch an ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung bindet, als aktive Komponenten enthält, ist es bevorzugt, die Sonde in einem geeigneten Puffer oder sterilisiertem Wasser zu lösen, um zu verhindern, daß die Sonde abgebaut wird. Des weiteren ist es auch möglich, Erkrankungen, die Symptome ähnlich denjenigen von Alzheimer'scher Krankheit zeigen, zu diagnostizieren, indem man Verfahren einsetzt, die diese Diagnosemittel verwenden, wie beispielsweise Immunfärbung (Dev. Biol. 170, 207–222, 1995, J. Neurobiol. 29, 1–17, 1996), in situ-Hybridisierung (J. Neurobiol. 29, 1–17, 1996), in situ-PCR oder dergleichen.
  • Experimentelle Verfahren oder dergleichen der oben genannten verschiedenen Experimente werden nun unten ausführlicher beschrieben.
  • (Klonieren von hochaffiner Cholintransporter-cDNA)
  • Die Kandidaten-cDNA von hochaffinem Nematoden-Cholintransporter wurde unter Verwendung von Reverse-Transkription-PCR und 3'-RACE aus Poly(A)+RNA eines Nematodengemischs aus verschiedenen Entwicklungsstadien isoliert. Der MarathonTM-cDNA-Vervielfältigungskit (Clontech) wurde gemäß seinem Protokoll verwendet. Ein Primer für die Sense-Richtung der PCR wurde an einem provisorischen Translationsinitiationspunkt eines vorhergesagten Gens auf Basis einer DNA-Rasensequenz, erhalten aus dem C. elegans-Genomprojekt, hergestellt. Das vervielfältigte PCR-Produkt wurde in die Ncol-Stelle (Glättung) und die Notl-Stelle eines modifizierten pSPUTK-Vektors (Stratagene) subkloniert, und die Basensequenz der eingebrachten DNA wurde bestimmt. CHT1-cDNA der Ratte wurde unter Verwendung des positiven cDNA-Selektionssystems GeneTrapper (GIBCO Bio-Rad Laborstory: GIBCO BRL) gemäß seinem Protokoll aus einer Rattenrückenmark-cDNA-Bibliothek isoliert. Der verwendete Primer wurde aus der Rasensequenz eines cDNA-Fragments, erhalten durch degenerierte PCR, hergestellt. Die erhaltenen cDNA-Klone wurden analysiert. Daraus wurden positive Klone ausgewählt und in pSPUTK-Vektor und pcDNA3.1+-Vektor (Invitrogen Corporation) subkloniert.
  • (Expression in Oozyten von Xenopus)
  • In der Gegenwart des cap-Analogons wurde cRNA in vitro mit SP6- oder T7-RNA-Polymerase synthetisiert. 20 bis 30 ng mit cap versehene RNA wurden in Oozyten (Stadium V bis VI) von Xenopus mikroinjiziert. Die Aufnahme wurde im wesentlichen auf die gleiche Weise gemessen, wie es zuvor beschrieben wurde (Nature 360, 467–471, 1992). Zwei oder drei Tage nach der Injektion von RNA wurde Cholinaufnahme für 30 bis 60 Min. mit Oozyten (6 bis 8) in 0,75 ml Standardlösung (0,01 bis 1 μM [3H]-Cholin, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 5 mM Tris: pH 7,4) durchgeführt. Die Oozyten, bei denen die Aufnahme abgeschlossen war, wurden mit 10% SDS gelöst, und die Menge an [3H] wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen.
  • (GFP-Expressionskonstrukt)
  • Das transkriptionale Fusionskonstrukt von cho-1::gfp wurde durch PCR auf die gleiche Weise erzeugt, wie es zuvor beschrieben wurde (Gene 212, 127–135, 1998). Ein Gen, welches ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) codiert, das sich an der abstromigen Seite einer Signalsequenz für die nukleare Lokalisation (NLS) befindet, wurde in eine Position 3 Reste stromabwärts von dem cho-1-Translationsinitiationspunkt eingebracht, so daß der Leserahmen angepaßt war. NLS und das gfp-Gen wurden aus dem pPD104.53-Vektor vervielfältigt. Um die aufstromige 5,1 kb-Region des cho-1-Translationsinitiationspunkts herzustellen, wurde ein PCR-Primer verwendet, der so ausgestaltet war, daß er die ersten 3 Aminosäurereste von cho-1 umfaßte. Durch das gleiche Verfahren wie zuvor beschrieben (EMBO J. 10, 3959–3970, 1991) wurden rol-6 (su1006)-Marker und erzeugte DNA gleichzeitig in Gonaden eines Nematoden injiziert.
  • (Northern-Blot-Analyse)
  • 6 μg Poly(A)+RNA, hergestellt aus verschiedenen Geweben von Ratten, wurden mittels Formaldehyd-Agaroseelektroforese abgetrennt und auf eine Nylonmembran überführt, dann mit einem CHT1-cDNA-Fragment, welches mit [32P] markiert worden war, durch das Random-Priming-Verfahren in Hybridisierungslösung (Lösung, die eine Endkonzentration von 50% Formamid, 5x SSPE, 5x Denhardt'sche Lösung, 0,5% SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthält) bei 42°C für 16 Stunden hybridisiert. Die Nylonmembran wurde unter Endbedingungen (0,1x SSPE, 0,1% SDS: 65°C) gewaschen, und dann wurde Autoradiographie für 7 Tage mit einem Verstärkerfolie durchgeführt.
  • (In situ-Hybridisierung)
  • Das mit Digoxigenin markierte Antisense-Transkript wurde in vitro synthetisiert. Alkalische Hydrolyse wurde für die Transkripte wiederholt, bis ihre mittlere Länge so hergestellt war, daß sie 200 bis 400 b betrug. Kryomikrotomschnitte von frischem eingefrorenem Gewebe (10 bis 20 μm) wurden verwendet. Hybridisierung wurde mit einer markierten cRNA-Sonde (etwa 1 μg/ml), gelöst in 1x Denhardt'scher Lösung [Lösung, die eine Endkonzentration von 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2,5 mM EDTA, 0,3 mM NaCl, 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1 mg/ml E. coli-tRNA enthält], bei 45°C für 20 Stunden durchgeführt. Dann wurden die Schnitte zweimal in 2x SSC/50% Formamid bzw. einmal in 1x SSC/50% Formamid bei 45°C gewaschen. Die hybridisierte Sonde wurde unter Verwendung eines Anti-Digoxigenin-Fab-Fragments (Boehringer-Mannheim) und NBT/BCIP-Substrat sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden für 24 bis 48 Stunden in Substratlösung zur Reaktion gebracht.
  • (Bindungstest)
  • [3H]-Hemicholinium-3 (HC3; 128 Ci/mmol) wurde von NEN Life Science Products erhalten. Entweder pcDNA3.1-CHT1 oder pcDNA3.1 wurde jeweils in COS7-Zellen transient exprimiert. TransFast-Reagens (Promega) wurde eingebracht und gemäß dem Protokoll verwendet. Membrane wurden durch die folgenden Stufen hergestellt: Homogenisieren von Zellen in 0,32 M Saccharose, Zentrifugieren der Zellen für 1 Stunde bei 200.000 g und Suspendieren des Präzipitats. Der Bindungstest wurde im wesentlichen auf die gleiche Weise durchgeführt, wie es zuvor beschrieben wurde. Die spezifische Bindungsmenge wurde berechnet, indem man die nichtspezifische Bindungsmenge, bestimmt in der Gegenwart von 10 μM HC3, von der Bindungsmenge insgesamt subtrahierte. Der Kd-Wert wurde durch Analysieren der spezifischen [3H]-HC3-Bindungsmenge aus Daten eines Sättigungsbindungstests mit nicht-linearer Approximation berechnet.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, ein Protein mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, welches physiologisch wichtig ist, und eine dieses Protein codierende Gen-DNA bereitzustellen. Zusätzlich wird es unter Verwendung des Proteins und der Gen-DNA möglich, Materialien zu screenen, die für die Prävention oder Behandlung von Alzheimer'scher Krankheit geeignet sind, und Zellen herzustellen, die für die Gentherapie geeignet sind. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00210001
    Figure 00220001
    Figure 00230001
    Figure 00240001
    Figure 00250001
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    Figure 00280001
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    Figure 00320001
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Figure 00350001
    Figure 00360001
    Figure 00370001
    Figure 00380001
    Figure 00390001
    Figure 00400001
    Figure 00410001
    Figure 00420001
    Figure 00430001
    Figure 00440001
    Figure 00450001
    Figure 00460001
    Figure 00470001
    Figure 00480001
    Figure 00490001

Claims (22)

  1. DNA-Molekül, welches: (a) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die repräsentiert wird durch Seq. ID. No. 6, oder (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, bei der eine Aminosäure in der Aminosäuresequenz, die durch Seq. ID No. 6 repräsentiert wird, deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, und das eine hochaffine Cholintransporter-Aktivität aufweist, codiert.
  2. DNA-Molekül, welches eine Rasensequenz enthält, die repräsentiert wird durch Seq. ID No. 5 oder deren komplementärer Sequenz.
  3. Von einem Menschen abgeleitetes DNA-Molekül, welches mit DNA, die ein Gen nach Anspruch 1 umfaßt, unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welches ein Protein codiert, das eine hochaffine Cholintransporter-Aktivität aufweist.
  4. Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die repräsentiert wird durch Seq. ID No. 6.
  5. Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, bei der eine Aminosäure in der Aminosäuresequenz, die durch Seq. ID No. 6 repräsentiert wird, deletiert, substituiert oder hinzugefügt ist, und welches die Aktivität eines humanen hochaffinen Cholintransporters aufweist.
  6. Fusionsprotein, welches erzeugt wird durch das Exprimieren einer cDNA, die Fusionsproteine von einem Protein nach Anspruch 4 oder 5 und einem Markerprotein und/oder einer Peptidmarkierung codiert.
  7. Antikörper, welcher spezifisch an ein Protein nach Anspruch 4 oder 5 bindet.
  8. Antikörper nach Anspruch 7, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  9. Wirtszelle, in welche ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 eingebracht wurde.
  10. Wirtszelle nach Anspruch 9, deren endogene DNA, welche ein Protein codiert, das eine hochaffine Cholintransporter-Aktivität aufweist, durch Mutation inaktiviert wird.
  11. Transgene Maus, die ein Protein nach Anspruch 4 oder 5 exprimiert.
  12. Verfahren zur Herstellung einer Zelle mit einer hochaffinen Cholintransporter-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in eine Zelle, deren endogenes DNA-Molekül, welches ein Protein mit einer hochaffinen Cholintransporter-Aktivität codiert, durch Mutation inaktiviert ist, einbringt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 in ein Chromosom der Zelle integriert wird, so daß die Zelle eine stabile hochaffine Cholintransporter-Aktivität zeigt.
  14. Verfahren zum Screening nach einem Promotor oder einem Suppressor von hochaffiner Cholintransporter-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man jede Veränderung der Aktivität des Proteins mit einer hochaffinen Cholintransporter-Aktivität nach Anspruch 4 oder 5 in der Gegenwart eines potentiellen Promotors/Suppressors mißt/evaluiert.
  15. Verfahren zum Screening nach einem Promotor oder einem Suppressor von hochaffiner Cholintransporter-Aktivität oder der Expression eines hochaffinen Cholintransporters, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen aufweist, bei denen man eine Zellmembran oder eine Zelle, die in vitro ein Protein mit einer hochaffinen Cholintransporter-Aktivität exprimiert, mit einem potentiellen Promotor/Suppressor in Kontakt bringt und jede Veränderung in der Aktivität und/oder der Expressionsmenge eines Proteins nach Anspruch 4 oder 5 in der Zellmembran oder der Zelle in der Gegenwart des potentiellen Promotors/Suppressors mißt/evaluiert.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zellmembran oder die Zelle, die ein Protein mit einer hochaffinen Cholintransporter-Aktivität exprimiert, die Wirtszelle nach Anspruch 9 oder 10 ist.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Protein mit der hochaffinen Cholintransporter-Aktivität ein rekombinantes Protein ist.
  18. Screening-Verfahren nach einem Promotor oder einem Suppressor der hochaffinen Cholintransporter-Aktivität oder der Expression eines hochaffinen Cholintransporters, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen umfaßt, bei denen man eine Zelle, die von einer Maus nach Anspruch 11 erhalten wurde, in vitro in der Gegenwart eines potentiellen Promotors/Suppressors kultiviert und jede Veränderung in der Aktivität und/oder der Expressionsmenge eines Proteins mit hochaffiner Cholintransporter-Aktivität in der Zelle in der Gegenwart des potentiellen Promotors/Suppressors mißt/evaluiert.
  19. Arzneimittelbestandteil, dadurch gekennzeichnet, daß er für die medizinische Behandlung eines Patienten verwendet wird, der der Erhöhung der Aktivität oder der Verstärkung der Expression eines hochaffinen Cholintransporters bedarf, und dadurch, daß er das Protein nach Anspruch 4 oder 5 als eine aktive Komponente enthält.
  20. Diagnoseverfahren für Erkrankungen, die mit der Expression oder der Aktivität eines hochaffinen Cholintransporters in Verbindung stehen, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine genomische DNA-, RNA- oder cDNA-Sequenz, die einen hochaffinen Cholintransporter codiert, aus einer Blut-, Urin-, Speichel- oder Gewebeprobe aus einem Patienten erhält, die aus der Probe erhaltene genomische DNA-, RNA- oder cDNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz, die das Protein nach Anspruch 4 oder 5 codiert, vergleicht und jede Mutation in der aus der Probe erhaltenen Sequenz erfaßt, wobei die Mutation in der aus der Probe erhaltenen Sequenz das Vorliegen einer Erkrankung, die mit der Expression oder der Aktivität eines hochaffinen Cholintransporters in Verbindung steht, in dem Patienten anzeigt.
  21. Diagnosesonde für die Alzheimer-Krankheit, welche einen Teil eines Antisense-Stranges von DNA oder RNA, welche das Protein nach den Ansprüchen 4 oder 5 codiert, umfaßt, wobei dieser Teil wenigstens 20 Basen umfaßt.
  22. Diagnosemittel für die Alzheimer-Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Diagnosesonde nach Anspruch 21 und/oder den Antikörper nach Anspruch 7 oder 8 enthält.
DE60038025T 1999-08-27 2000-08-18 Hochaffinitäts-cholintransporter Expired - Lifetime DE60038025T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP24064299 1999-08-27
JP24064299 1999-08-27
JP36899199 1999-12-27
JP36899199A JP4018304B2 (ja) 1999-08-27 1999-12-27 高親和性コリントランスポーター
PCT/JP2000/005545 WO2001016315A1 (fr) 1999-08-27 2000-08-18 Transporteur de choline a forte activite

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60038025D1 DE60038025D1 (en) 2008-03-27
DE60038025T2 true DE60038025T2 (de) 2009-02-05

Family

ID=26534836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60038025T Expired - Lifetime DE60038025T2 (de) 1999-08-27 2000-08-18 Hochaffinitäts-cholintransporter

Country Status (6)

Country Link
US (2) US7432077B1 (de)
EP (1) EP1207200B1 (de)
JP (1) JP4018304B2 (de)
CA (1) CA2382464C (de)
DE (1) DE60038025T2 (de)
WO (1) WO2001016315A1 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030114399A1 (en) * 2001-07-23 2003-06-19 Blakely Randy D. Human and mouse choline transporter cDNA
CA2456594A1 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Mitsubishi Pharma Corporation Preventives/remedies for cholinergic neuropathy
DE102005001784A1 (de) * 2005-01-13 2006-10-05 Beiersdorf Ag Oligoribonukleotide zur Reduktion der Schweißbildung durch RNA-Interferenz

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
ATE320505T1 (de) * 1997-05-30 2006-04-15 Xenomics Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuresequenzen in urin
US20030022195A1 (en) * 2001-02-01 2003-01-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 59914 and 59921, choline transporters and uses therefor
US6500643B1 (en) * 2000-09-07 2002-12-31 University Of Florida Human high affinity choline transporter
US20030114399A1 (en) * 2001-07-23 2003-06-19 Blakely Randy D. Human and mouse choline transporter cDNA

Also Published As

Publication number Publication date
JP4018304B2 (ja) 2007-12-05
JP2001136976A (ja) 2001-05-22
US7432077B1 (en) 2008-10-07
US7294710B2 (en) 2007-11-13
CA2382464C (en) 2010-03-09
WO2001016315A1 (fr) 2001-03-08
US20070101450A1 (en) 2007-05-03
CA2382464A1 (en) 2001-03-08
EP1207200B1 (de) 2008-02-13
EP1207200A4 (de) 2003-05-21
EP1207200A1 (de) 2002-05-22
DE60038025D1 (en) 2008-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69819345T2 (de) Für den capsaicin rezeptor kodierende nukleinsäuresequenzen und dem capsaicin rezeptor ähnliche polypeptide und ihre verwendung
DE69837542T2 (de) Ldl-rezeptor
DE69838905T2 (de) Transkriptionsfaktor islet-brain 1 (ib1)
DE69334187T2 (de) Stabil transfizierte Zelllinien welche Humane GABA-A Rezeptoren mit der Untereinheitskombination Alpha-2, Beta-3 und Gamma-2 exprimieren
DE69837267T2 (de) Kcnq kaliumkanäle und verfahren zur deren modulierung
DE69722035T2 (de) Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen.
DE69819505T2 (de) Mit smad wechselwirkende polypeptide und verwendungen davon
EP0613497B1 (de) Lymphoides cd30-antigen
DE60031241T2 (de) Kaliumkanäle und für diese kaliumkanäle kodierende gene
DE69738302T2 (de) Neues semaphorin-gen: semaphorin y
DE69924120T2 (de) Für ataxin-2-bindende proteine kodierende nukleinsäure, damit verwandten produkten und verfahren zur deren anwendung
DE60036548T2 (de) Neue kalium-kanäle und dafür kodierende gene
DE60038025T2 (de) Hochaffinitäts-cholintransporter
DE10004815B4 (de) Menschliche intestinale Natriumphosphat-Kotransporter
DE69833189T2 (de) Nukleinsäuresequenzen für atp-bindungs cassette-transporter
DE60225699T2 (de) Nierenspezifischer urattransporter und dessen gen
DE69930545T2 (de) Verfahren zur diagnose und behandlung neurologischer erkrankungen
DE69734890T2 (de) Rdgb-proteine
EP0962528A2 (de) Nukleisäuren, die für Acetylcholinrezeptor-Untereinheiten von Insekten kodieren
EP1436327B1 (de) Ee3-proteinfamilie und zugrundeliegende dna-sequenzen
EP1102847B1 (de) Neuer spannungsabhängiger kaliumkanal und seine verwendung zur entwicklung von therapeutika
DE60038531T2 (de) Transporter organischer anionen der plazenta und dessen gen
DE60024862T2 (de) "insulinabhängiges sequenz dna bindendes protein-1" (irsdbp-1), dafür kodierendes gen und ihre verwendungen
DE10232151A1 (de) Neuronal exprimierte Tryptophanhydroxylase und ihre Verwendung
DE10211369A1 (de) Screeningverfahren zum Identifizieren protektiver Substanzen für die Behandlung neurodegenerativer und/oder ischämischer Erkrankungen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition