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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das Gebiet reverse Blutgruppenuntersuchung.
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Die
Blutgruppen-Serologie benötigt
die Bestimmung der Blutzellenkompatibilität zwischen einem Blutspender
und einem Patienten vor einer den Patienten involvierenden Transfusion
oder Organtransplantation. Die Blutzellenkompatibilität wird durch
das Nichtauftreten einer immunologischen Reaktion zwischen Antikörpern, die
in dem Blutserum eines Patienten enthalten sind, und Antigenen,
die auf den Blutzellen des Spenders präsentiert werden, bestimmt.
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Es
werden viele verschiedene Blutgruppenantigene auf der Oberfläche der
roten Blutzellen aller Individuen gefunden. Diese Antigene, die
Produkte geerbter Gene sind, kommen in Kombinationen vor, die wahrscheinlich
einmalig zwischen allen Individuen außer eineiigen Zwillingen sind.
Die Blutgruppenbestimmung ist normalerweise das Untersuchungsverfahren
von roten Blutzellen, um zu bestimmen welche Antigene vorhanden
und welche abwesend sind, was normalerweise unter Verwendung von
Antikörpern
des zu testenden Antigens erfolgt. Zusätzlich, falls ein Individuum
nicht ein bestimmtes rotes Zellantigen auf seiner oder ihrer roten Blutzellen
aufweist, kann sein oder ihr Serum einen Antikörper zu diesem Antigen enthalten.
Ob oder ob nicht der Antikörper
in dem Serum vorhanden ist, hängt
davon ab, ob das Immunsystem des Individuums vorher durch das spezifische
Antigen oder etwas zu dem sehr ähnlichem
angeregt wurde und darauf geantwortet hat z. B. wird ein Individuum,
dessen rote Blutzellen Typ A, d. h. "A"-Antigene
auf den roten Zellen aufweisen, Anti-B-Antikörper in seinem oder ihrem Serum
aufweisen. Demzufolge wird, falls so einem Individuum Typ-B-Blut gegeben wird,
eine immunologische Reaktion mit möglichen schwerwiegenden klinischen
Folgen auftreten.
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Als
ein zusätzlicher
Gesichtspunkt sollte beachtet werden, daß der menschliche Körper konstant
Antigenen in Pollen, Nahrung, Bakterien und Viren ausgesetzt wird.
Einige dieser "natürlichen" Antigene sind scheinbar
so ähnlich
zu den menschlichen Blutgruppenantigenen, daß sie fast jedes empfindliches
Individuum stimulieren, Antikörper
zu produzieren. Demzu folge werden bestimmte Antikörper in
jedem beliebigen Serum erwartet, in dem roten Zellen das reziproke
Antigen fehlt. Das trifft besonders für das AB0-System zu. Demzufolge
wird häufig
ein zweiter Bestätigungstest
mit den Patienten/Spenderseren durchgeführt. Der Test für die erwarteten
Antikörper
des AB0-Blutgruppensystem in Seren wird "reverse" Blutgruppenbestimmung genannt.
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Antikörper von
dem AB0-Blutgruppensystem sind gewöhnlich Immunglobulin M (IgM).
Diese Antikörper
weisen zehn Antigen-Bindestellen pro Molekül auf. Der IgM-Antikörper ist
groß genug,
um sich über
den Abstand zwischen den roten Blutzellen zu erstrecken, so dass
sich die Zellen beim Zentrifugieren zu einem "Zelle-Antikörper-Zelle-Antikörper"-Gitter zusammenschließen und
als Agglutinate zusammengeklumpt bleiben. Wenn z. B. Anti-A zur
Blutgruppe A- oder Blutgruppe AB-Zellen zugegeben und die Mischung
zentrifugiert wird, bleiben die Zellen beim Resuspendieren in Klumpen
erhalten. Mit dem gleichen Antikörper
werden Gruppe 0- und B-Zellen als einzelne Zellen resuspendiert.
Agglutination, die durch einen Antikörper, wie z. b. ein IgM-Antikörper, verursacht
wird, wird als direkte Agglutination bezeichnet.
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In
der Transfusionmedizin ist der aus den oben genannten Gründen am
häufigsten
durchgeführte
Test die Bestimmung der AB0-Blugruppe. Gegenwärtiger Stand der Technik ist
die getrennte Untersuchung von A, B und manchmal A + B zusammen,
Antigenen auf den roten Zellen (Forward-Typ); und Bestätigungs-(Gegenprobe)Untersuchung
für Anti-A
und Anti-B Antikörper
im Serum oder Plasma (Reverse-Typ). Daher werden ein Minimum von
vier getrennten Tests, aber nicht weniger als sieben separate Tests
(A, B, A + B Antigene von der Probe roter Zellen; Anti-A, Anti-B
in der Probe Serum/Plasma mittels A1, A2, B, 0 reagierenden roten Zellen) routinemäßig angewendet.
Die Ergebnisse von jedem dieser typisierenden Untersuchungen (Forward-
und Reverse-Typ) müssen übereinstimmen.
Daher werden alleine in den USA ungefähr 104 Millionen Tests jährlich durchgeführt, um
die Blutgruppen in Blutzentren zu bestimmen.
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Seit
dem frühen
19. Jahrhundert war der allgemeine Ansatz, der als die "Landsteiner"-Methode (Landsteiner, Science 73: 405
(1931)) bekannt ist, zusammen mit der Arbeit von Ashby (J. Exp.
Med. 29: 267 (1919)) und Coombs (Brit. J. Exp. Pathol. 26: 255 (1945)),
die roten Blutzellen eines Patienten in ein Standardlaborteströhrchen zu
geben, das einen Blutgruppenantikörper (wie z. B. Anti-A oder
Anti-B) enthält,
zu mischen, um es einer Antikör per/Antigen-Bindereaktionen
zu erlauben stattzufinden, und anschließend zu zentrifugieren. Falls
das zu untersuchende Antigen vorhanden ist, wird die Antikörper/Antigen-Bindung
stattfinden und zur Agglutination der roten Blutzellen des Patienten
führen.
Das Teströhrchen
wird manuell geschüttelt,
um das Zentrifugat der verklumpten Zellen am Boden aufzulockern.
Es wird anschließend
eine subjektive Bestimmung gemacht, ob oder ob nicht die aufgelockerten
Zellen verklumpt sind und bis zu welchem Ausmaß.
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Während der
Mitte des 19. Jahrhunderts wurden Versuche unternommen, diese Technik
zu vereinfachen, um die subjektive Natur des Tests zu minimieren
und Fehler zu reduzieren. Es wurde erkannt, daß man eine einigermaßen beständige Aufnahme
der Kompatibilitätuntersuchungsergebnisse
durch Anwendung von benetzbaren, entweder nicht-absorbierenden oder
in einigen Fällen
absorbierenden, Test-Objektträger
oder Test-Karten, die die erforderlichen immunchemischen Reagenzien
auf wenigstens einen Teil ihrer Oberfläche aufweisen, bekommen konnte.
In diesem Zusammenhang beschreiben
U.S.
Patent Nr. 2,770,572 ,
2,850,430 ,
3,074,853 ,
3,272,319 ,
3,424,558 ,
3,502,437 und
3,666,42 und die
europäische Patentanmeldung Nr. 0
104 881-A1 ausgewählte
Beispiele von solchen Test-Karten und darauf bezogene Apparaturen.
Die Vorteile von Blutgruppenbestimmungen auf Mikroplatten schließt leichtere
Handhabung einer großen
Anzahl von Proben, objektive Messung von Agglutinations-Reaktionen
mittels Instrumenten und Computer, die zur Erfassung und Verwaltung
der Ergebnisse gekoppelt sind, ein. Eine Anzahl von teueren und
zweckbestimmten Systemen mit computerkontrollierter Robotertechnik
und spektrophotometrischen Lesesystemen („Readers”) mit einem hohen Durchsatz
wurden für
die Blutbankautomation eingeführt
(Chung, et al., Transfusion 33: 384 (1992)).
WO98/21593 offenbart ein Verfahren
zur simultaner reverser Typisierung durch Flusszytometrie.
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Es
wurden kommerzielle Blutgruppenbestimmungskits mit verbessertem
Nachweis von Antigen- und Antikörperreaktionen
roter Zellen in besonderen Mikroröhrchen eingeführt, die
mit Reagenzien in Gelform gefüllt
sind. (Lapierre, et al., Transfusion 30: 109 (1990)). Der Nutzen
von Festphasentechniken, um die inhärenten Probleme bei der Verwendung
von Hämagglutination
als ein Endpunkt für
Blutgruppenbestimmung zu verwenden, wurde durch Scott (Transfusion
Med. Rev. 5: 60 (1991)) rezensiert. Erst kürzlich berichtete Growe et al.
(Transfusion Med. Rev. 10: 44 (1996)) die Einführung und Verwendung einer
automatisierten Bestimmung von RBC-Antigen- und Serum-Antikörper-Screening-Verfahren,
die nicht nur für
Blutzentren sondern auch für Transfusionslaboratorien
in Krankenhäusern
geeignet sind. In diesen Verfahren müssen mindestens sieben unterschiedliche
Wells mit speziellen Bestimmungsreagenzien zur Bestimmung der Blutgruppe
einer Probe verwendet werden. All die Verfahren, die für Blutgruppenbestimmung
im großen
Maßstab
verwendet werden, wenden im wesentlichen, auch für die Bestimmung von nur einem
Antigen- oder Antikörper-Typ
in einem einzelnen Röhrchen/Well,
Agglutination-basierte Verfahren an. In den
U.S. Patent Nr. 4,550,017 und
4,748,129 wurden auch von
getrennt identifizierbaren Reaktionen zur Blutgruppenbestimmung
berichtet, die fluoreszenzmakierte Reagenzien verwenden.
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Gegenwärtige Verfahren
verwenden als ein Endpunkt die Agglutination von roten Zellen. Wie
bereits oben diskutiert wird dies in Teströhrchen, auf Objektträgeroberflächen, in
Mikroplatten und in Säulen-Agglutinationstest
durchgeführt.
Die letzten zwei Verfahren können
manuell oder mittels automatisierter Instrumentation durchgeführt werden.
Alle Verfahren benötigen
die Trennung von Serum (oder Plasma) von den Zellen um sowohl den
Forward- als auch
Reverse-Typ durchzuführen.
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Eine
visuelle Nachweistechnologie kann in der hier genannten reversen
Blutgruppenbestimmung angewendet werden. So ein Verfahren, das einen
Säulenagglutinationstest
(CAT) verwendet, kann eine BioVueTM-Kassette
(Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY) verwenden. Solche
Kassetten enthalten Säulen
zu denen eine Mikropartikelmatrix zugegeben wurde.
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CAT
kann automatisierte Lesesysteme zum Interpretieren des Agglutinationsergebnisses
verwenden. So ein derartiges Lesesystem ist in dem Ortho AutoVueTM (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester,
NY) vorhanden, ein vollautomatisiertes System zum Duchführen des
CAT. Das Autolesesystem ist ein computerisiertes bildgebendes System,
das aus einer CCD (charge coupled device) monochromen Videokamera,
eine Bildbearbeitungseinheit und einem IBM-kompatiblen PC besteht.
Das Lesesystem erfaßt
zunächst
ein Bild der Reaktion, das digitalisiert und durch die Bildbearbeitungssoftware
verarbeitet wird, um die Reaktionsmerkmale zu extrahieren, die anschließend von
dem Reaktions-Klassifizierungsprogramm verwendet werden. Diese Merkmale
werden verwendet, um die Reaktionen in negative und positive Klassen
zu trennen, und in eine von sieben herkömmlichen Reaktionsklassen oder
-stufen zu übersetzen.
Es wird eine Unterscheidungsanalyse, eine linearstatistische Mustererkennung,
verwendet, um zwischen negativen und schwachen Reaktionen zu unterscheiden.
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Ein
noch anderes Lesesystem, der im CAT verwendet wird, ist das BioVueTM Lesesystem 2 (Ortho-Clinical Diagnostics,
Inc., Rochester, NY). Dieses Lesesystem weist ein automatisiertes
Ladeprogramm für
zwölf BioVueTM-Kassetten und eine Halogenlampenquelle
und Bildanalysemerkmale auf, die eine Zellenidentifizierung erlauben,
die auf RBC-Wellenlänge
basiert, und dadurch das Agglutinationsergebnis interpretiert. Die
Bilderfassung wird durch eine CCD Kamera und eine digitalisierender
Einheit durchgeführt.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur simultanen Antiköperuntersuchung
in Blut, wie in Anspruch 1 definiert, bereit. Die Erfindung umfaßt auch
einen Blutanalysekit, wie in Anspruch 5 definiert.
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1 ist
eine schematische Darstellung eines visuellen Nachweises der reversen
Untersuchung eines B-Serums in einem CAT-System. Markiertes Reagenzien
aus A und B-Zellen werden mit B-Serum gemischt, was zu braunen Agglutinaten
führt,
die im Anschluß einer
Zentrifugation oben auf der Gel-Säule des CAT-Systems erhalten
werden; nicht-reagiertes markiertes Reagenz aus B-Zellen wird unten
an der Säule
erhalten.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine reverse AB0-Blutgruppenbestimmung beschrieben.
Die Erfindung kann mit der Säulenagglutinationstest(CAT)-Reaktion
und den Trennungsbehältern
angewendet werden, die in Kassettenform durch Ortho-Clinical Diagnostics,
Inc., Rochester, New York, unter dem Handelsnamen BIOVUETM hergestellt und verkauft werden. Die Ergebnisse
können
durch die beiden oben beschriebenen Systeme, das computerisierte
Bildsystem AutoVueTM Autolesesystem oder
dem BioVueTM Leser 2 bestimmt werden.
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Die
Reagenzien aus roten Blutzellen (RBCs), die üblicherweise für die reverse
Bestimmung verwendet werden, weisen auf ihrer Oberfläche entweder
A1, A2, B oder keine
AB0-Antigene (Typ A1, Typ A2,
Typ B, Typ 0) auf. Diese Zellen sind zum Nachweisen von bereits
gebildeten Antikörpern
nützlich,
die Agglutination mit dem Reagenz RBCs verursachen würden.
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Die
Verfahren der gegenwärtigen
Erfindung ermöglichen
den visuellen Nachweis einer reversen Blutgruppenbestimmung.
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Visuelles Nachweissystem
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Die
Fähigkeit
die Farbe einer roten Zelle zu ändern,
würde es
erlauben, eine simultane Untersuchung von zwei Zellpopulationen
visuell oder spektrophotometrisch (durch Absorption oder Reflektion)
durchzuführen,
d. h. ohne die Notwendigkeit eine Fluoreszenz nachzuweisen. Es wird
z. B. erwartet, daß rote
Zellen die Zyanid oder Azid ausgesetzt werden, ihre Farbe von hellem
Rot zu Braun wechseln. Rote Agglutinate könnten anschließend visuell
von braunen Agglutinaten unterschieden werden. Während die Modifizierung der
intrinsischen Farbe des roten Zellhämoglobins durch diese Ausführungsform
in Erwägung
gezogen wird, könnten
einfaches Anfügen
oder ein anderweitige Assoziierung von Chromophoren an die roten
Zellen anderweitig nachweisbar ihre spektralen Eigenschaften ändern.
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1 stellt
eine reverse Bestimmung dar, die das Säulenagglutinationsverfahren
verwendet, wobei die Reagenzien aus A- und B-Zellen getrennt markiert
werden. Das Probenserum wird gemäß den Herstellerangaben
oben auf die Säule
gegeben und das Röhrchen
wird entsprechend inkubiert und zentrifugiert. Das Reagenz aus A-Zellen
agglutiniert mit vorhandenem Anti-A-Antikörper während das Reagenz aus B-Zellen zum
Boden der Säule
läuft,
was anzeigt, daß das
Probenserum Typ B war.
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Die
Reagenzien aus RBCs (Affirmgen A1 und B
Zellen, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ) wurden mit Natriumazid
(NaN3) bei einer Endkonzentration von 0,2%
behandelt. Das NaN3 reduziert das Eisen
im Hämoglobin,
was zu einem Farbwechsel von typischem Rot zu einem tiefen Braun
oder einer kastanienbraunen Farbe führt. Nichtbehandelte Zellen
aus der gleichen Affirmagen-Charge dienten als Kontrolle. Die nichtbehandelte
Kontrolle und die behandelten Testzellen wurden unabhängig voneinander
mit Gruppe B Seren in einer BioVueTM reverse
Kassette gemäß den Herstellerangaben
untersucht (10 μl
3–5% rote
Zellen und 40 μl
Serum; anschließend
fünf Minuten
in einer BioVue-Zentrifuge gemäß den Herstellerangaben
zentrifugiert). Von den B-Seren wird erwartet mit A1-Zellen
aber nicht mit den B-Zellen
zu agglutinieren. Es wurden keine Unterschiede in der Agglutination
von nichtbehan delten versus behandelten Zellen beobachtet, außer daß die nichtbehandelten
Zellen Rot waren und die behandelten Zellen Braun. Siehe Beispiel
1 und Tabelle 1. Die automatisierte Bestimmung von Agglutinationsergebnissen
mittels der beschriebenen visuellen Nachweissysteme kann durch die
Verwendung der beiden oben beschriebnen System, die computerisierten
Bildsysteme AutoVueTM Autoleser oder das
BioVueTM Leser 2, durchgeführt werden.
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Das
nachfolgende Beispiel wird nur zum Zweck der Illustration und nicht
zur Limitierung des Bereichs der Erfindung bereitgestellt.
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Beispiel 1
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Teil A – Herstellung von gefärbten roten
Zellen
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Kommerzielle
Zubereitungen von Gruppe A1 und B rote Zellen
(Affirmagen) wurden von Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. (Raritan,
NJ) erhalten. Es wurden zwei 1 mL Aliquote von A1-RBCs
von der Ampulle entfernt und in ein separates Röhrchen plaziert. Ein Aliquot
wurde mit 20 μl
10%igem NaN3 (Mallinckrodt, Paris, KY) gemischt.
Das andere Aliquot wurde nicht behandelt und diente als Kontrolle.
Jedes Röhrchen
wurde gedeckelt und die Inhalte wurden für 16 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach Übernachtbehandlung
erschienen die NaN3-behandelten RBC in der
Farbe Braun während
die nichtbehandelten Kontrollzellen Rot blieben.
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Teil B – Reverse BioVue-Säulenuntersuchung – Doppelsäulentest
(kein Teil der Erfindung)
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Natriumazid-behandelte
Zellen wurden in einer Standard-BioVue reverse Kassette unter Verwendung von
10 μl A1-Zellen plus 40 μl Gruppe B Seren in einer Säule und
10 μl B-Zellen
plus 40 μl
Gruppe B Serum in einer unterschiedlichen Säule (Säulen 3 und 4 in Tabelle 1)
untersucht. Die Kontrollzellen, nichtbehandelte A1- und
B-Zellen wurden in Säule
1 bzw. 2 untersucht. Im Anschluß an
einer Zentrifugation gemäß den Herstellerangaben
wurden agglutinierte A1-Zellen sowohl nichtbehandelte
Kontrollzellen (Säule
1) als auch behandelte Testzellen (Säule 3) oben auf der "bead"-Säule erhalten,
was die Anwesenheit von Anti-A in den Gruppen B Seren anzeigt. Es
wurden nicht-agglutinierte B Zellen, sowohl nichtbehandelte Kon trollzellen
(Säule
2) als auch behandelte Testzellen (Säule 4) am Boden der Säule erhalten,
was die Abwesenheit von Anti-B anzeigt. Die nichtbehandelten Kontrollzellen
waren in ihrer Erscheinung Rot und die behandelten Testzellen erschienen Braun.
Die Ergebnisse zeigten an, daß die
Behandlung der A1 und B Zellen nicht ihre
Fähigkeit
in der "bead"-Säule zu agglutinieren
beeinflußt.
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Teil C – Reverse BioVue Säulenuntersuchung – einzelner
Säulentest
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Im
Teil B wurden A1- und B-Zellen in einzelnen
Säulen
untersucht, um die reverse Gruppe der Probe zu bestimmen. Als nächstes kombinierten
wir in einer Säule
10 μl A1 nichtbehandelte Zellen (rot) und 10 μl B behandelte
Zellen (braun) mit 40 μl
Gruppe B Seren. Im Anschluß an
einer Zentrifugation wurden zwei unterschiedliche Zellpopulationen
erhalten. Agglutinierte (A1) Zellen wurden
oben auf der "bead"-Säule erhalten
und nicht-agglutinierte braune (B) Zellen wurden am Boden der Säule (Säule 5 in
Tabelle 1) erhalten. Die Ergebnisse zeigen an, daß die korrekte
reverse Gruppe in einer Säule
(ein Test) anstelle von den normalen zwei Säulen bestimmt werden konnte.
Umgekehrt wurden 10 μl
behandelte A1-Zellen und 10 μl nichtbehandelte
B Zellen gemäß dem hier
beschriebenen Teil B untersucht und die Ergebnisse waren geeignet,
agglutinierte braune (A1) Zellen und nicht-agglutinierte
rote (B) Zellen (Säule
6 in Tabelle 1) nachzuweisen.
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Die
Ergebnisse der hier beschriebenen Teile B und C werden in Tabelle
1 gezeigt. Siehe
1. Tabelle 1 Visueller Nachweis und Unterscheidung
von 2 unterschiedlichen Zellpopulationen
BioVue reverse
Säulennummer |
| 1* | 2* | 3* | 4* | 5 | 6 |
RBC
(jeweils 10 μl) | A1 nichtbehandelt | B
nichtbehandelt | A1 behandelt | B
behandelt | A1 nichtbehandelt + B behandelt | A1 behandelt + B nicht behandelt |
Beobachtete
Reaktion im Anschluß an
Zentrifugation | 4+ | 0 | 4+ | 0 | 3–4+ gemischt | 3–4+ gemischt |
Beschreibung | Rote
Zelen oben auf der "bead"-Säule | Rote
Zellen am Boden der "bead"-Säule | Braune
Zellen oben auf der "bead"-Säule | Braune
Zellen am Boden der "bead"-Säule | Rote
Zellen oben auf und braune Zellen am Boden der "bead"-Säule. Einige Zellen verstreut
in der Säule. | Braune
Zellen oben auf und rote Zellen am Boden der "bead"-Säule. Einige Zellen versträut in der
Säule |
- Beachte: Alle Säulen enthielten 40 μl B-Seren
zusätzlich
zu den angezeigten roten Zellen.
- Nichtbehandelt, nichtbehandelte Kontrollzellen
- Behandelt, NaN3, behandelte Zellen
- * kein Teil der Erfindung