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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie.
Insbesondere beschreibt sie Verfahren zur Einschleusung von Fremd-DNA
in das Genom von eukaryontischen Zellen, wie Pflanzenzellen. Die Besonderheit
der vorliegenden Erfindung liegt im Aufbau der randständigen Wiederholungssequenzen,
die agrobakteriell übertragene
T-DNA flankieren, so dass das Durchlesen bis zum linken T-DNA-Rand
signifikant verringert ist und/oder dass das DNA-Grundgerüst des integrierten
Vektors leicht entfernt werden kann. So ist die Frequenz, transgene
eukaryontische Zellen, die nur T-DNA enthalten, zu erhalten, erhöht.
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Stand der Technik
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Verbesserte
Pflanzensorten wurden durch "klassische" Züchtung,
seit der Mensch die Existenz als Nomade gegen eine permanente Residenz
ausgetauscht hat, erhalten. In jüngerer
Vergangenheit begannen Wissenschaftler das Verhalten des genetischen
Materials während
Kreuzungen zu enträtseln
und Pflanzenzüchter konnten
vom Wissen, das im Rahmen der Mendelschen Gesetze zur Vorhersage
der Verteilung eines gegebenen genetischen Merkmals in den Nachkommen
einer Kreuzung erhalten wurden, profitieren und profitieren immer
noch davon. Mit dem Aufkommen der molekularen Pflanzenbiologie können Pflanzenzüchter mit
stetig zunehmender Präzision
neue chimäre
Gene in das Genom einer Pflanze inserieren. Eine Vielzahl von Techniken
ist heutzutage verfügbar,
um die genetische Transformation von Pflanzen zu vermitteln, einschließlich Agrolistik,
Mikroinjektion, Elektroporation, direkter Gentransfer und Beschuss
mit DNA beschichteten Teilchen. Ein bevorzugtes und weit verwendetes
Pflanzentransformationssystem nutzt das Bodenbakterium Agrobacterium
(Zupan und Zambryski 1995, Gelvin 1998a, Gheysen et al. 1998). Heutzutage
wird Agrobacterium nicht nur für
Transformation von Pflanzen, sondern auch zur Transformation von
Hefe, Schimmelkulturen und Fadenpilzen verwendet (Bundock et al.
1995, de Groot et al. 1998, Gouka et al. 1999,
WO 98/45455 ). Es wurde ferner gezeigt,
dass Komponenten der T-DNA-Produktion und des Transferapparats von
Agrobacterium zum Importieren von DNA in Kerne von Säugerzellen
nützlich
sind, was Perspektiven für
die Verwendung dieser Komponenten bei der Gentherapie eröffnet (Ziemienowicz
et al. 1999). Agrobacterium überträgt jede
DNA, die auf der T-DNA lokalisiert ist, in den Zellkern eukaryontischer
Zellen. Diese T-DNA ist Teil des Wildtyp Ti-(im Falle von Agrobacterium
tumefaciens) oder Ri-Plasmids
(im Falle von A. rhizogenes). Wildtyp-T-DNA trägt die Gene, die nach Integration
in das Pflanzengenom Galltumore der Baumkrone oder das Haarwurzelsyndrom im
Falle von Infektionen mit A. tumefaciens bzw. A. rhizogenes verursachen.
Ebenfalls auf den Wildtyp-Ti- oder -Ri-Plasmiden sind vir-Gene (Virulenzgene)
lokalisiert, die durch phenolische Verbindungen der Pflanze aktiviert
werden. Produkte der vir-Gene sind für den Transfer der T-DNA in
das eukaryontische Genom verantwortlich. Für Transformationszwecke wird
die T-DNA entmantelt (d.h. alle krankheitsverursachenden Gene werden entfernt)
und die vir-Gene werden entweder in trans auf einem Helferplasmid
(die T-DNA, die heterologe Gene bzw. das heterologe Gen umfasst,
wird dann auf einem sekundären
binären
Pflanzentransformationsvektor lokalisiert) oder in cis im Falle
eines co-integrierten Transformationsvektors bereitgestellt. Die
heterologen Gene von Interesse werden zwischen die zwei 22 bp langen
(im Falle von Octopin-Ti-Plasmiden) oder 25 bp langen (im Falle
von Nopalin-Ti-Plasmiden) unvollständigen randständigen Kernsequenzen
der T-DNA, die den rechten Rand (RB) und den linken Rand (LB) darstellen,
die die einzigen cis-ständigen Elemente,
die zur Steuerung des T-DNA-Processings
notwendig sind, darstellen, kloniert. Die randständigen Kernsequenzen in RB
und LB sind als unvollständige
Wiederholungssequenzen organisiert.
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Die
VirD1- und VirD2-Proteine produzieren ein einzelsträngiges Nick
zwischen der dritten und vierten Base am unteren Strang jeder randständigen Wiederholungssequenz
(Vanofsky et al. 1986). Erhöhte
Spiegel an VirD1 und VirD2 erhöhen
die Produktion von T-DNA-Komplexen im Agrobacterium und führen zu
einer erhöhten
Pflanzentransformationseffizienz (Wang et al. 1990).
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Für viele
Jahre wurde angenommen, dass nur die DNA zwischen den Wiederholungssequenzen,
die T-DNA, und nicht die bezüglich
der T-DNA externe Vektor-DNA in die eukaryontische Zelle übertragen
wird. Jedoch zeigt eine jüngere
und ausführlichere
Charakterisierung der DNA-Insertionen in transgenen Pflanzen, dass
sich auch Vektorgrundgerüstsequenzen
sehr häufig
in das Pflanzengenom integrieren (Martineau et al. 1994, Ramanathan
und Veluthambi 1995, Cluster et al. 1996, van der Graaff et al.
1996, Kononov et al. 1997, Wenck et al. 1997, Wolters et al. 1998).
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Die
Autoren der vorliegenden Erfindung haben früher gefunden, dass die Integrationsfrequenz
der Vektorsequenzen nicht durch die verwendete Pflanzenart oder
das verwendete Transformationsverfahren beeinflusst wird. Dies entspricht
der Ansicht, dass der Transfer von Vektorgrundgerüstse quenzen
die Folge des Durchlesens bis hinter LB ist, ein Prozess, der in
Agrobacterium-Zellen vorkommt, und höchst wahrscheinlich durch Faktoren
innerhalb dieser Zellen bestimmt wird. Es sollte jedoch festgestellt
werden, dass andere Forscher über
eine Integration des Vektorgrundgerüsts in 33 % der Arabidopsis-Transformanten,
die durch Wurzeltransformation, und in bis zu 62 % von Transformanten,
die durch Vakuuminfiltration erhalten worden sind (Wenck et al.
1997), berichteten. Dies impliziert, dass das verwendete Transformationsverfahren
ein weiterer Faktor sein könnte,
der die Häufigkeit
der Integration des Vektorgrundgerüsts beeinflusst. Es wurde berichtet, dass
die Integration von Sequenzen des Vektorgrundgerüsts in vielen Pflanzenarten
einschließlich
Petunia (Virts und Gelvin 1985, Cluster et al. 1996), Arabidopsis
(Van der Graaff et al. 1996, Wenck et al. 1997), Tabak (Ramanathan
und Veluthambi 1995, Kononov et al. 1997, Wenck et al. 1997) und
Kartoffel (Wolters et al. 1998) auftritt. Die Integration des Vektorgrundgerüsts ist
offensichtlich unabhängig
von dem Typ des Agrobacterium-Stamms, der für die Pflanzentransformation
verwendet wird (Kononov et al. 1997)
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Die
Erfinder haben früher
verschiedene Serien von Transformanten auf die Anwesenheit von Vektorgrundgerüstsequenzen
unter Verwendung spezifischer PCR-Reaktionen und DNA-Gel-Blotanalyse
analysiert. Drei verschiedene Transformationsverfahren in zwei verschiedenen
Pflanzenarten wurden bewertet, nämlich Arabidopsis
thaliana-Wurzel und Blatttransformation und Nicotiana tabacum-Protoplasten
und Blatttransformation. Schließlich
wurde der Einfluss des Replikontyps, die ColE1- und pVS1-Replikons,
bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass weder die Pflanzenarten noch
der zur Transformation verwendete Explantattyp, der Replikontyp
oder die Selektion einen größeren Einfluss
auf die Frequenz haben, mit der die Integration von Vektorsequenzen
auftrat. In der Vergangenheit wurde postuliert, dass dieser Transfer
von Vektor-DNA, die nicht zu der T-DNA gehört, das Ergebnis eines Durchlesens
am linken Rand sein könnte,
das die normale Termination des T-DNA-Transfers verhindern würde. Alternativ
könnte
der DNA-Transfer am linken Rand beginnen und bis zum rechten Rand
fortschreiten (Ramanathan und Veluthambi, 1995; van der Graaff et
al., 1996). Bei den vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzen
wurde jedoch beobachtet, dass viele Vektorgrundgerüstsequenzen
in Verknüpfung
an den linken Rand sowie Vektorverbindungen mit rechtsrandiger T-DNA
enthalten. DNA-Gel-Blots zeigen an, dass bei den meisten dieser
Pflanzen die vollständige
Vektorsequenz integriert ist. Daher wurde postuliert, dass die Integration
der vollständigen
Vektorgrundgerüstsequenzen
in das Pflanzengenom das Ergebnis eines konjugativen Transfers,
der am rechten Rand initiiert wurde und anschließend unter kontinuierlichem
Kopieren an den linken und rechten Rändern fortschritt, so genanntes
Durchlesen, sein könnte.
Dieses Modell impliziert, dass der linke Rand nicht häufig als
Initiationsstelle für
DNA-Transfer erkannt wird und dass der rechte Rand nicht effizient
als Terminationsstelle für
den DNA-Transfer
erkannt wird. Diese Beobachtungen entsprechen Ergebnissen früherer Arbeiten,
die zeigen, dass die rechte Randregion intrinsisch aktiver ist als
die linke Randregion bezüglich
der Förderung
der DNA-Transformation (Jen und Chilton 1986a,b, Caplan et al. 1985).
Aus allen verfügbaren
Daten kann gefolgert werden, dass die Transformation des T-Strangs
häufiger
in der Region des rechten Rands als in der Region des linken Rands
startet.
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In
der Zukunft wird es von höchster
Bedeutung sein, die Integration des Vektorgrundgerüsts als
Folge einer durch Agrobacterium vermittelten Transformation zu verhindern
oder zu heilen bzw demgegenüber
unempfindlich zu machen. Erstens verlangen die Aufsichtsbehörden, dass
auf dem Markt freigesetzte transgene Pflanzen frei von Vektorgrundgerüstsequenzen
sind. Solche Grundgerüstsequenzen
können
bakterielle Replikations-Origins, bakterielle Antibiotikaresistenz-Gene
und möglicherweise
eine Anzahl anderer (fremder) Gene enthalten. Die gleichen rigorosen
Bedenken werden auch von Verbrauchern geäußert, die sich zunehmend solcher
potentieller Gefahren in Zusammenhang mit der Pflanzenbiotechnologie
bewusst werden. Zweitens ist es auch in wissenschaftlicher Hinsicht
erwünscht,
keine Integration des Vektorgrundgerüsts in das Genom der Pflanzen
zu haben. Solche Sequenzen können
die Transgenexpression beeinflussen (Iglesias et al. 1997, Matzke
und Mathke 1998, Jakowitsch et al. 1999). Die Integration des Vektorgrundgerüsts stört wahrscheinlich
auch T-DNA-Tagging-Experimente.
Tags können
beachtlich länger
als erwartet sein (Martineau et al. 1994), und die Integration des
Vektorgrundgerüsts
könnte
auch die Erklärung
für die
Tatsache sein, dass in einem großen Prozentsatz T-DNA getaggter
Arabidopsis-Pflanzen die T-DNA mit einem mutierten Phänotyp nicht
co-segregiert wird (Errampali et al. 1991, Feldmann 1991, Koncz
et al. 1992, Van Lijsebettens et al. 1991).
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Obwohl
das Phänomen
der gelegentlichen Integration des Vektorgrundgerüsts bereits
1982 gemäß Ooms et
al. auftrat, dauerte es bis 1995 bis eine erste Lösung von
Ramanathan und Veluthambi (1995) vorgeschlagen wurde: "... neue binäre Vektoren
mit "Stop-Transfer-Signalen
in Nachbarschaft zum linken Rand können konstruiert werden". Seit dieser Zeit
versuchte man, den Mechanismus der Integration des Vektorgrundgerüsts zu verstehen.
Ein möglicher
Grund wurde von Wenck et al. (1997) diskutiert: "... ineffiziente Nick-Bildung kann die
Folge von niedrigen Mengen an Virulenzproteinen, primär VirD2,
sein". Nur sehr
jüngst
wurden jedoch Verfahren beschrieben, die das Durchlesen an den T-DNA-Rändern (
WO 99/01563 und von Hanson
et al. (1999)) verhindern. Diese Methoden basieren darauf, dass
Sequenzen außerhalb
der Ränder
einbezogen werden. Diese Sequenzen sind entweder Gene, die toxische
Verbindungen codieren, oder Sequenzen, die mit DNA-Bindeproteinen
Wechselwirken oder Sequenzen, die reich an G+C-Nucleotiden sind.
Ein Hauptnachteil der in
WO 99/01563 und
von Hanson et al. (1999) beschriebenen Methoden ist die Tatsache,
dass die Regeneration von Pflanzentransformanten, die mehr als die
T-DNA-Region in ihrem Genom tragen, verhindert wird. Es ist denkbar,
dass solche Methoden die gesamte Transformationseffizienz verschlechtern,
d.h. niedrigere Anzahlen von Transformanten werden aus einem gegebenen
Transformationsexperiment erhalten. Es wurde in der Tat von Hanson
et al. (1999) berichtet, dass die Effizienz von Tabaktransformation
bis zu 30 abnahm. Dennoch beschrieben Hanson et al. (1999) ihren
Ansatz als nützliches
Werkzeug "zur Elimination
von Nicht-T-DNA-Sequenzen aus transgenen Individuen".
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt eine Lösung für das technische Problem unerwünschter
Vektorgrundgerüstintegration
und bietet Vorteile gegenüber
vorhandenen Methoden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung beschreibt Transformationsvektoren, die eine T-DNA mit
flankierenden T-DNA-Rändern umfassen.
Die T-DNA-Vektoren
sind dadurch gekennzeichnet, dass sie so modifiziert sind, dass
die genetische Transformation einer eukaryontischen Zelle nur mit
der T-DNA und nicht mit Vektorgrundgerüstsequenzen erlauben. Dies
wird dadurch erzielt, dass entweder der Transfer von Vektorgrundgerüstsequenzen
in das Genom einer eukaryontischen Zelle verhindert wird, oder dass
der Vektor von Grundgerüstsequenzen,
die in das Genom einer eukaryontischen Zelle überführt wurden, befreit wird bzw.
demgegenüber
unempfindlich gemacht wird. Die modifizierten T-DNA-Vektoren erlauben
ein effizientes Processing des linken Rands im Nick-Komplex unter
Einbezug von mindestens VirD1 und VirD2 oder erlauben die Exzision
transferierter Vektorgrundgerüstsequenzen.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt optimierte T-DNA-Vektoren, umfassend
eine Modifikation des rechten T-DNA-Rands, umfassend eine einzelne rechtsrandige
Kernsequenz, flankiert von einem rechtsrandigen Außenbereich
und/oder einer Modifikation einschließlich einer Multiplikation
des linken T-DNA-Rands, bezeichnet als:
- a)
eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert von einem natürlichen
linksrandigen Außenbereich und
einer proximalen Region innerhalb des linken Rands der T-DNA mit
einer Länge
von 10 bis 100 bp, bevorzugt 20–100
bp, und die an der Anzahl der A- und T-Reste angereichert ist, wobei
der Prozentsatz der AT-Reste bevorzugt 60 bis 85 %, bevorzugter
64 bis 80 %, am bevorzugtesten 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 78 oder 79 % beträgt,
mit der Maßgabe,
dass die proximale Region innerhalb des linken Rands der T-DNA nicht
die des entsprechenden natürlichen
linksrandigen Innenbereichs vom Octopintyps ist; oder
- b) eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert nur durch
einen natürlichen
linksrandigen Innenbereich; oder
- c) eine einzelne linksrandige Kernsequenz; oder
- d) eine Tandemwiederholungssequenz aus mehreren linksrandigen
Kernsequenzen, flankiert nur durch einen natürlichen linksrandigen Außenbereich,
wobei die Tandemwiederholungssequenz bevorzugt 2–3 linksrandige Kernsequenzen
enthält,
wobei höhere
Kopienzahlen der unvollständigen
Wiederholungssequenz der linksrandigen Kernsequenz nicht ausgeschlossen
sind und wobei die wiederholten linksrandigen Kernsequenzen in dem
Tandem durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp, die gegebenenfalls
Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen tragen,
getrennt sind; oder
- e) ein integraler linksrandiger Bereich vom Nopalintyp benachbart
zu und stromaufwärts
oder stromabwärts des
integralen linksrandigen Bereichs vom Octopintyp.
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Die
Anmeldung beschreibt ferner optimierte T-DNA-Transformationsvektoren mit zusätzlichen DNA-Sequenzen
außerhalb
der randständigen
Kernwiederholungssequenzen der T-DNA, was die post-transformationelle
Entfernung integrierter Vektorgrundgerüstsequenzen erlaubt. Diese
zusätzlichen
DNA-Sequenzen modifizieren einschließlich multiplizieren die DNA-Randregionen
oder Teile davon und umfassen:
- f) Rekombinationsstellen,
organisiert als Wiederholungssequenzen stromabwärts der linksrandigen Kernsequenz
und stromaufwärts
der rechtsrandigen Kernsequenz; oder
- g) die DNA-Sequenzen von (f), weiter modifiziert durch Anfügen einer
zweiten Kopie eines linksrandigen Bereichs, positioniert stromaufwärts von
und bevorzugt benachbart zu der einzelnen rechtsrandigen Außenregion
und der Rekombinationsstelle stromaufwärts der Kernsequenz der zweiten
linksrandigen Region; oder
- h) die Rekombinationsstellen von (f) mit einem Rekombinase-Gen
stromabwärts
der Rekombinationsstelle stromabwärts der linksrandigen Kernsequenz
und bevorzugt, sofern vorhanden, benachbart zu und stromabwärts des
linksrandigen Außenbereichs;
oder
- i) eine DNA-Sequenz, angeordnet stromabwärts der linksrandigen Region,
wobei die DNA-Sequenz ein Rekombinase-Gen, flankiert von Wiederholungen
von Rekombinationsstellen, wie in (h) definiert, und weiter eine
zwei Kopie eines linksrandigen Bereichs stromabwärts der Rekombinase umfasst;
oder
- j) die DNA-Sequenz von (i) mit zusätzlichen Rekombinationsstellen,
organisiert als Wiederholungssequenzen stromabwärts der zweiten linksrandigen
Kernsequenz und stromaufwärts
der einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz.
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In
jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen
benachbart zu und stromab wärts
und/oder stromaufwärts
der links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen angeordnet oder sind
von den links- und/oder
rechtsrandigen Kernsequenzen durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp Länge, die
gegebenenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen
trägt,
getrennt.
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In
jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen
entweder ortsspezifische Rekombinationsstellen, die als direkte
Wiederholungs- oder Transposon-Randsequenzen angeordnet sind, und
das Rekombinase-Gen ist entweder ein ortsspezifisches Rekombinase-Gen
oder ein Transponase-Gen.
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Eine
erste Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen T-DNA-Transformationsvektor mit einer T-DNA
mit modifizierten linken und rechten flankierenden T-DNA-Rändern, dadurch
gekennzeichnet, dass der modifizierte rechte T-DNA-Rand aus einer
einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz besteht, die von einem rechtsrandigen
Außenbereich
flankiert wird, und der modifizierte linke T-DNA-Rand besteht aus:
- (i) einer einzelnen linksrandigen Kernsequenz,
einem linksrandigen Außenbereich
und einem dem Innenbereich nahe liegenden linksrandigen Bereich
mit einer bevorzugten Länge
von 10 bis 100 bp besteht, darüber
hinaus dadurch gekennzeichnet, dass der dem Innenbereich nahe liegende
linksrandige Bereich eine größere Anzahl
von A- und T-Resten aufweist, wobei der Prozentsatz der AT-Reste
bei 60 bis 85 liegt,
- (ii) einer Wiederholungssequenz der linken T-DNA-Ränder, wobei die Wiederholungssequenz
zumindest einen T-DNA-Rand vom Typ Nopalin und zumindest einen linken
T-DNA-Rand vom Typ Octopin umfasst, darüber hinaus dadurch gekennzeichnet,
dass der modifizierte linke T-DNA-Rand zumindest eine linksrandige
Kernsequenz, oder
- (iii) einen linksrandigen Außenbereich und eine Wiederholungssequenz
aus wenigstens zwei linksrandigen Kernsequenzen umfasst, die durch
eine Sequenz aus mindestens 10 bis 20 Basenpaaren voneinander getrennt
sind.
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Erfindungsgemäß kann in
dem vorstehend genannten Vektor die Sequenz von mindestens 10–20 Basenpaaren,
die die linksrandigen Kernsequenzen voneinander trennt, in den drei
Leserahmen und in beiden Richtungen Stopcodons tragen.
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Zusätzlich kann
der modifizierte linke T-DNA-Rand aus einer Wiederholungssequenz
von linken T-DNA-Rändern
bestehen, die zumindest einen integralen linksrandigen Bereich vom
Typ Nopalin umfassen, der an den integralen linksrandigen Bereich
vom Typ Octopin angrenzt und diesem nachgeschaltet oder vorgelagert
angeordnet ist.
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Eine
zweite Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen erfindungsgemäßen Vektor, wie in der ersten Ausführungsform
beschrieben, worin aber die modifizierten T-DNA-Ränder
darüber
hinaus Rekombinationsstellen umfassen, die der linksrandigen Kernsequenz
nachgeschaltet angeordnet sind, und Rekombinationsstellen, die der
rechtsrandigen Kernsequenz vorgelagert angeordnet sind, wobei die
Rekombinationsstellen als Wiederholungssequenzen organisiert sind.
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Erfindungsgemäß kann der
Vektor der zweiten Ausführungsform
weiter eine zweite Reproduktion eines linksrandigen Bereichs umfassen,
der dem einzelnen rechtsrandigen Außenbereich vorgelagert angeordnet
ist und wobei die Rekombinationsstelle der Kernsequenz des zweiten
linksrandigen Bereichs vorgelagert angeordnet ist.
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Eine
dritte Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen erfindungsgemäßen Vektor, wie in der zweiten Ausführungsform
beschrieben, der darüber
hinaus ein Rekombinase-Gen umfassen kann, das der Rekombinationsstelle
nachgeschaltet angeordnet ist, die der linksrandigen Kernsequenz
nachgeschaltet angeordnet ist. Das Rekombinase-Gen kann angrenzend
an den linksrandigen Außenbereich
und diesem nachgeschaltet angeordnet sein. Erfindungsgemäß kann das
Rekombinase-Gen von Wiederholungssequenzen aus Rekombinationsstellen
flankiert sein, und der Vektor kann darüber hinaus eine zweite Reproduktion
eines linksrandigen Bereichs umfassen, die dem von den Rekombinationsstellen
flankierten Rekombinase-Gen nachgeschaltet angeordnet ist. Der Vektor
kann darüber
hinaus zusätzliche
Rekombinationsstellen umfassen, die als Wiederholungssequenzen der
zweiten linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet und der einzelnen
rechtsrandigen Kernsequenz vorgelagert angeordnet sind. In allen
Vektoren der dritten Ausführungsform
der Erfindung können
die Rekombinationsstellen, angrenzend an die links- und/oder rechtsrandigen
Kernsequenzen und diesen nachgeschaltet und/oder vorgelagert angeordnet
sein, oder von den links- und/oder rechtsrandigen Kernse quenzen
nachgeschaltet und/oder vorgelagert durch eine Sequenz mit einer
Länge von
mindestens 10–20 bp
getrennt sein. Erfindungsgemäß kann die
Sequenz mit einer Länge
von mindestens 10–20
bp Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen tragen.
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Eine
vierte Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen erfindungsgemäßen Vektor, wie in der dritten Ausführungsform
beschrieben, wobei die als Wiederholungssequenzen organisierten
Rekombinationsstellen entweder als ortsgerichtete Rekombinationsstellen
definiert sind, die als direkte Wiederholungssequenzen organisiert
sind oder als Transposon-Randsequenzen, die als invertierte Wiederholungssequenzen
organisiert sind, und worin das Rekombinase-Gen als ortsgerichtetes
Rekombinase- bzw. Transponase-Gen definiert sein kann.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung umfasst Transformationsvektoren, in denen jede der
Modifikationen, wie in (i) bis (iii) definiert ist, einzeln oder
in Kombination angewendet wird. Diese Transformationsvektoren umfassen
Vektoren, die bei der Agrobacterium vermittelten Transformation
verwendet werden, einschließlich
binäre
Transformationsvektoren, co-integrierte Transformationsvektoren,
super-binäre
Transformationsvektoren, von Ri abgeleitete Transformationsvektoren
sowie T-DNA tragende Vektoren, die in der agrolistischen Transformation
oder Gentherapie verwendet werden.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt ein Verfahren zum Erhalt von transgenen
eukaryontischen Zellen, die nur mit der T-DNA tranformiert sind,
wobei der Transfer von Vektorgrundgerüstsequenzen verhindert wird,
wobei die opti mierten Transformationsvektoren, die eine der Modifikationen
(a) bis (j) enthalten, verwendet werden.
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Weiter
wird in der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren zum Erhalt von
transgenen eukaryontischen Zellen beschrieben, die nur mit der T-DNA
transformiert sind, wobei die Heilung bzw. Erzeugung von Unempfindlichkeit
des transformierten Vektors, der Vektorgrundgerüstsequenzen enthält, unter
Verwendung der optimierten Transformationsvektoren ermöglicht wird,
die DNA-Sequenzen von (f) oder (g) in Kombination mit der Zuführung einer
ortsspezifischen Rekombinase oder Transponase oder DNA-Sequenzen
von (h), (i) oder (j), gegebenenfalls in Kombination mit der Zufuhr
einer ortsspezifischen Rekombinase oder einer Transponase enthalten.
Unter Heilen bzw. Erzeugung von Unempfindlichkeit wird die Entfernung
von Grundgerüstsequenzen
des Transformationsvektors, die möglicherweise aus dem Vektor
stammen, ohne Entfernen des T-DNA-Transformationsereignisses verstanden.
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Ebenfalls
Teil der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalt von transgenen Pflanzen,
Hefen, Schimmelkulturen oder Fadenpilzen, die aus einer Agrobacterium
vermittelten Transformation dieser Pflanzen, Hefen, Schimmelkulturen
oder Fadenpilze bestehen, wobei ein Transformationsvektor aus folgender
Gruppe ausgewählt
ist:
- a) ein Transformationsvektor gemäß der ersten
Ausführungsform
der Erfindung; oder
- b) ein Transformationsvektor gemäß der zweiten Ausführungsform
der Erfindung in Kombination mit der Zufuhr einer Rekombinase oder
Transponase, um die sich erge benden transformierten Zellen gegenüber integrierten
Vektorgrundgerüstsequenzen,
die eventuell aus dem Vektor entstehen, unempfindlich zu machen;
oder
- c) ein Transformationsvektor gemäß der dritten Ausführungsform
der Erfindung, um die sich ergebenden transformierten Zellen gegenüber integrierten
Vektorgrundgerüstsequenzen,
die eventuell aus dem Vektor entstehen, unempfindlich zu machen,
optional in Kombination mit der Zufuhr einer Rekombinase oder Transponase;
oder
- d) ein Transformationsvektor gemäß der vierten Ausführungsform
der Erfindung.
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Ein
weiteres Verfahren der Erfindung ist ein Verfahren zur Verhinderung
der Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen in einer durch
Agrobacterium vermittelten transformierten Zelle, der den Einsatz
eines Vektors nach einer der Ausführungsformen eins bis vier
der Erfindung umfasst.
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Das
Verfahren kann darüber
hinaus die Erhöhung
der Produktion des Nick-Komplexes, der mindestens VirD1 und VirD2
umfasst, durch das Agrobacterium umfassen. Die Nick-Komplex-Komponenten
werden von dem virD-Operon (Octopintyp oder Nopalintyp) codiert.
Mindestens eine Extrakopie des VirD-Locus kann in chromosomale und/oder
extrachromosomale DNA-Einheiten, die in einem Agrobacterium-Stamm enthalten sind
und darin gehalten werden, integriert werden. Die Extrakopie des
VirD-Locus kann aus dem Octopintyp VirD- oder Nopalintyp VirD-Locus
ausgewählt
sein. Um das Durchlesen des linken Rands der T-DNA zu erhöhen, kann
das Verfahren allein oder zusammen mit Transformati onsvektoren,
die modifizierte T-DNA-Ränder enthalten,
verwendet werden.
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Weiter
von der vorliegenden Erfindung umfasst sind beliebige Kombinationen
von Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen gemäß der Erfindung,
um die Integration der Vektorgrundgerüstsequenzen zu verhindern oder
die Zelle demgegenüber
unempfindlich zu machen, mit anderen Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen,
die angewendet werden, um die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen zu
verhindern oder die Zelle demgegenüber unempfindlich zu machen.
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Rekombinante
Wirtszellen, die die Transformationsvektoren, die erfindungsgemäß modifiziert
sind, enthalten, wie Bakterien, bevorzugt Agrobacterium tumefaciens,
sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Erfindungsgemäß umfasst
sind auch beliebige Kombinationen des ortsspezifischen Rekombinationssystems
oder des Transponase vermittelten Rekombinationssystems der Erfindung,
um gegenüber
Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen
unempfindlich zu machen, mit dem gleichen oder jedem anderen ortsspezifischen
Rekombinationssystem oder Transponase vermittelten Rekombinationssystem,
das für
jeden anderen Zweck verwendet wird.
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Erfindungsgemäß umfasst
sind auch Verfahren für
die agrolistische Transformation von eukaryontischen Zellen unter
Verwendung eines erfindungsgemäßen T-DNA-Vektors.
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Ebenfalls
erfindungsgemäß umfasst
sind Verfahren zur Gentherapie unter Verwendung eines T-DNA-Vektors,
der gemäß den Ausführungsformen,
die für
die vorstehend genannten Vektoren definiert sind, modifiziert wurde.
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Transgene
Pflanzenzellen oder Pflanzen, die durch ein Agrobacterium vermitteltes
Trans formationsverfahren, wie vorstehend definiert, erhältlich sind,
ein Teil einer solchen Pflanze oder Nachkommen davon, sind ebenfalls
Gegenstand der Erfindung. Transgene Hefen, Schimmelpilze oder Fadenpilze,
erhältlich
durch ein vorstehend definiertes durch Agrobacterium vermitteltes
Transformationsverfahren sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Mit
den vorstehenden und weiteren Aufgaben, Vorteilen und Merkmalen
der Erfindung, die nachstehend offensichtlich werden, wird die Natur
der Erfindung klarer unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
der Erfindung und auf die beigefügten
Ansprüche
verstanden.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Agrobacterium
vermittelte Transformation oder agrolistische Transformation von
Pflanzen, Hefe, Schimmelkulturen und Fadenpilzen beruht auf dem
Transfer von Teilen der Transformationsvektorsequenzen, sogenannte
T-DNA, in den Zellkern und auf der Integration der T-DNA in das
Genom der Eukaryonte.
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Unter "Agrobacterium" wird ein Mitglied
der Agrobacteriaceae, bevorzugter Agrobacterium oder Rhizobacterium,
und am bevorzugtesten Agrobacterium tumefaciens verstanden.
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Unter "T-DNA" oder transferierter
DNA wird der Teil des Transformationsvektors verstanden, der von den
T-DNA- Rändern flankiert
ist, der nach Aktivierung der Agrobacterium-vir-Gene an den T-DNA-Rändern Nick-translatiert
wird und als einzelsträngige
DNA in den Zellkern einer eukaryontischen Zelle transferiert wird. Die
Produktion des T-DNA-Strangs ist das Ergebnis eines DNA-Prozessierungsereignisses,
das durch ein ortsspezifisches Nick in einem doppelsträngigen Molekül initiiert
wird. Eine Familie von unter einander verwandten DNA-Prozessierungsreaktionen
existiert in verschiedenen prokaryontischen Systemen. In jedem Fall ist
das Substrat ein super-gecoiltes zirkuläres DNA-Molekül, und das
Nick-Protein erkennt
eine kurze Sequenz, spaltet an einer konservierten Stelle (konservierte
Nick-Positionen und Consensus-Region 3' des Nicks) und heftet sich kovalent
an das 5'-Ende des
Nick-Strangs an. DNA-Prozessierungssysteme,
die dieser Familie angehören,
umfassen neben der Bildung von T-DNA in der und Transfer der T-DNA
in die eukaryontische Zelle durch das Agrobacterium, (1) die Initiation
von konjugativer DNA-Replikation und den anschließenden Transfer
von Plasmiden von Gramnegativen Bakterien, (2) Initiation von Plus-Strang-Synthese während der
Rolling Circle-Replikation von ϕX174-verwandten Phagen, und (3) die Initiation
von Rolling-Circle-Replikation
in bestimmten Plasmiden von Grampositiven Bakterien (Waters und
Guiney 1993). Das DNA-Prozessierungsereignis
wird durch einen Oligoprotein-Relaxosom-Komplex
katalysiert. Eines der Proteine in diesem Komplex, die Relaxase,
ist das Schlüsselenzym,
das die Orts- und strangspezifische DNA-Spaltung (Pansegrau und
Lanka 1996) katalysiert. Im Falle des konjugativen Transfers von
Plasmiden bindet die Relaxase kovalent an das 5'-Ende
der zu transferierenden DNA und kann keinen zweiten Nick produzieren,
der für
den Transfer einer einzelnen Ko pie der DNA notwendig ist. Man nimmt
an, dass mindestens ein Relaxasedimer für den DNA-Transfer einer einzelnen
Kopie erforderlich ist (Pansegrau und Lanka 1996).
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Im
Falle von Agrobacterium wird ein Minimum von zwei Proteinen für den Nick
und den anschließenden
T-DNA-Transfer benötigt. Diese
Relaxosomproteine sind VirD1 und VirD2. VirD1 ist eine Typ I-Topoisomerase
ohne Sequenzspezifität
(Ghai und Das 1989). Das VirD2-Protein ist auch auf der Basis von
Sequenzhomologie die Relaxase von Agrobacterium und wirkt als Nick-Endonuklease
(Pansegrau et al. 1994). Während des
Nick-Prozesses bindet sich VirD2 kovalent an beide 5'-Enden der prozessierten
T-DNA an dem rechten Rand und an den Rest des T-DNA-Plasmids an dem linken
Rand (Durrenberger et al. 1989, Young and Nester 1988). Sowohl der
linke als auch der rechte Rand der T-DNA wird durch VirD1 und VirD2
erkannt. Starke Wechselwirkungen zwischen VirD1 und VirD2 und unter
VirD2-Proteinen wurden nachgewiesen, und es wurde vorgeschlagen,
dass die T-DNA-Strangverschiebung (durch DNA-Replikation) durch Erzeugen eines zweiten Nicks
in Abhängigkeit
von VirD2-VirD2-Interaktion beendet wird. Dies impliziert, dass
separate Relaxosomkomplexe einschließlich mindestens VirD1 und
VirD2 an der Prozessierung jedes der zwei T-DNA-Ränder beteiligt
sein könnten
(Relic et al. 1998).
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Unter "T-DNA-Rändern", "T-DNA-Randregion" oder "Randregion" wird entweder der
rechte T-DNA-Rand (RB), auch als rechter Rand bezeichnet, oder der
linke T-DNA-Rand (LB), auch als linker Rand bezeichnet, verstanden.
Solche Ränder
umfassen eine Kernsequenz, flankiert von einem Randinnenbereich als
Teil der T-DNA, die den Rand flankiert, und/oder einen Randaußenbereich
als Teil des Vektorgrund gerüsts, die
den Rand flankiert. Die Kernsequenzen umfassen 22 bp im Falle von
Vektoren vom Octopintyp und 25 bp im Falle von Vektoren vom Nopalintyp.
Die Kernsequenzen in der Region des rechten Rands und der Region des
linken Rands bilden unvollständige
Wiederholungssequenzen. Die randständigen Kernsequenzen sind für die Erkennung
und das Prozessieren durch den Agrobacterium-Nick-Komplex, bestehend
mindestens aus VirD1 und VirD2, unerlässlich. Kernsequenzen, die
eine T-DNA flankieren, sind ausreichend, um den Transfer der T-DNA
zu fördern.
Jedoch ist die Transformationseffizienz unter Verwendung von Transformationsvektoren,
die die T-DNA nur flankiert durch die Kernsequenzen tragen, niedrig.
Bekanntlich modulieren die Randinnen- und -außenbereiche die Effizienz des
T-DNA-Transfers
(Wang et al. 1987). Ein Element, das den T-DNA-Transfer verstärkt, wurde charakterisiert
und liegt im rechtrandigen Außenbereich
und wird als Overdrive bezeichnet (Peralta et al. 1986, van Haaren
et al. 1987). Die Kernsequenzen sind wie folgt (inn: Teil der T-DNA-Sequenz;
out: Teil der Vektorgrundgerüstsequenz;
Kernsequenzen sind in fetten und unterstrichenen Großbuchstaben
angegeben; Gielen et al. 1984, 1999):
-Octopin-Typ RB: inn-tgatgctgactGGCAGGATATATACCGTTGTAATttgagctcgt-out
(SEQ ID NO: 1)
-Octopin-Typ LB: out-gcggcagcggcGGCAGGATATATTCAATTGTAAAtggcttcatg-inn (SEQ
ID NO: 2)
-Nopalin-Typ RB: inn-tatcagtgttTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACctaagagaa-out
(SEQ ID NO: 3)
-Nopalin-Typ LB: out-ggctggctggTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACaaattgacg-inn
(SEQ ID NO: 4)
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Unter "integralem Randbereich" wird ein natürlich vorkommender
T-DNA-Rand, umfassend die randständige
Kernsequenz und sowohl den Innen- als auch den Außenbereich
des Rands, verstanden.
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Unter "T-DNA-Transformationsvektor" oder "T-DNA-Vektor" wird jeder Vektor
verstanden, der eine T-DNA-Sequenz, flankiert von einem rechten
und einem linken T-DNA-Rand, umfassend mindestens die rechtsrandigen
bzw. die linksrandigen Kernsequenzen, und verwendet zur Transformation
beliebige eukaryontische Zellen, umfasst.
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Unter "Vektorgrundgerüstsequenz" oder "Vektorgrundgerüstsequenzen" wird die gesamte
DNA eines T-DNA enthaltenden Vektors, die außerhalb der T-DNA-Ränder liegt,
und insbesondere außerhalb
der Nick-Stellen der unvollständigen
Wiederholungssequenzen der randständigen Kernsequenz verstanden.
Unter "Vektor" wird ein Transformationsvektor
oder ein T-DNA-Vektor, der in einer Bakterienkultur, z.B. einer Escherichia
coli-Kultur oder einer Agrobacterium-Kultur stabil gehalten wird, verstanden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst Konstrukte von optimierten T-DNA-Vektoren,
so dass die Integration des Vektorgrundgerüsts in das Genom einer eukaryontischen
Zelle minimiert wird oder fehlt oder so ist, dass die Erzeugung
von Unempfindlichkeit gegenüber
der in eine eukaryontische Zelle integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen
möglich
ist. Die Vektoren, jedes Derivat davon oder jeder Vektor, der beliebige
der Modifikationen oder jede Kombination der Modifikationen der
Erfindung umfasst, kann dann als Ausgangsmaterial zur Klonierung
der DNA-Sequenzen von Interesse zwischen den zwei randständigen Wiederholungssequenzen
und für
anschließende
Anwendungen, wie Transformation z.B. einer Nutzpflanze, einer Hefe
oder eines Pilzes, und zur Gentherapie verwendet werden.
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Unter "optimiertem T-DNA-Vektor" wird ein T-DNA-Vektor
bezeichnet, der so ausgestaltet ist, dass er den Transfer von Vektorgrundgerüstsequenzen
in das Genom einer eukaryontischen Zelle entweder erniedrigt oder
beseitigt oder unempfindlich gegenüber von Vektorgrundgerüstsequenzen,
die in das Genom einer eukaryontischen Zelle transferiert worden
sind, macht.
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Bei
Analysen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden
(siehe Beispiele 1–3) wurde
die Frequenz des Transfers des Vektorgrundgerüsts in transgenen Pflanzen
verglichen, die mit T-DNA-Vektoren mit randständigen Wiederholungssequenzen
in der natürlichen
Octopinsequenz transformiert worden waren, und mit T-DNA-Vektoren
ohne die innere randständige
Region der randständigen
Wiederholungssequenzen verglichen. Wesentlich mehr Integration des
Vektorgrundgerüsts
wurde in der Serie der transformierten Pflanzen gefunden, in denen
T-DNA-Vektoren ohne innere randständige Wiederholungssequenzen verwendet
wurden, als in Serien von transformierten Pflanzen, in denen vollständige innere
und äußere Randregionen
verwendet wurden. Es wurde weiter beobachtet, dass viele transgene
Pflanzen Vektorgrundgerüstsequenzen
in Verknüpfung
an den linken T-DNA-Rand sowie Vektorverbindungen mit dem rechten T-DNA-Rand
enthalten (siehe Beispiel 2). DNA-Gel-Blotanalysen zeigen an, dass die vollständige Vektorsequenz
bei den meisten dieser Pflanzen integriert ist (siehe Beispiel 3).
Ferner wird die Häufigkeit
der Integration der vollständigen
Vektorgrundgerüstsequenzen
nicht durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der inneren Randregion
beeinflusst. Diese Daten legen nahe, dass die rechtsrandige innere
Region höchst
wahrscheinlich keine Determinanten enthält, die für ein effizientes Nick am linken
T-DNA-Rand wichtig sind. Diese Schlussfolgerung wird weiter durch
frühere
Ergebnisse, die von Shaw et al. (1984) erhalten wurden, substantiiert,
welche anzeigen, dass eine Deletion der inneren RB-Region die Effizienz
der Pflanzentransformation nicht beeinflusst. Determinanten für effiziente
Nick-Bildung an dem linken T-DNA-Rand liegen somit höchst wahrscheinlich
innerhalb LB selbst. Es wird angenommen, dass die Integration von
vollständigen
Vektorgrundgerüstsequenzen im
Pflanzengenom das Ergebnis eines konjugativen Transfers ist, der
am rechten Rand initiiert wurde und anschließend unter kontinuierlichem
Kopieren des linken und des rechten Rands fortschreitet, so genanntes Durchlesen
(read-through). Der Transfer des Vektorgrundgerüsts kann auch die Folge der
Erkennung von LB als Ausgangspunkt für DNA-Transfer und fortgesetztes
Kopieren an RB bis LB sein (van der Graaff et al. 1996). Es ist
daher wichtig, LB-Elemente
zu identifizieren, die an der effizienten Nick-Bildung in der Wiederholungssequenz
des LB-Kerns vorhanden sind. So könnte z.B. eine teilweise oder
vollständige
Deletion der linksrandigen Innenregion und/oder Außenregion
die linksständige
Kernwiederholungssequenz in einen Kontext bringen, der dessen Affinität für und Erkennung
durch VirD1 und VirD2 erhöht.
Eine auffällige
Beobachtung in dieser Hinsicht stammt aus einer Analyse der linken
(und rechten) Randsequenzen der Transformationsvektoren, die in
den in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Experimenten verwendet
wurden. In 1 sind die Prozentsätze für die A-
und T-Reste pro 100 bp Bereich um (und nicht einschließlich) die
LB- und RB-Kernwiederholungssequenzen sowohl für Transformationsvektoren mit
als auch ohne Kontext der natürlichen
Innenregion des Rands angegeben. Die beachtliche Beobachtung besteht
in der Tatsache, dass der Prozentsatz von AT-Resten der LB-proximalen
100 bp der na türlichen
Innenregion (K-T-DNA-Vektor in 1) beachtlich
höher ist
als der Prozentsatz der AT-Reste der LB-proximalen 100 bp des Vektors, in dem
die natürliche
Innenregion deletiert ist (Hsb-T-DNA-Vektor in 1),
d.h. 64 %, verglichen mit 56 % jeweils. Wie vorstehend erwähnt, treten
LB-Durchlesen und Teiltransfer des Vektorgrundgerüsts viel
häufiger
auf, wenn Pflanzen mit Hsb T-DNA-Vektoren
transformiert werden, verglichen mit Pflanzentransformation mit
dem K-T-DNA-Vektor. Mechanistisch ist es möglich, dass dieser niedrigere
Prozentsatz der AT-Reste
beträchtlich
die Nick-Bildungsaktivität
des LB-gebundenen
Relaxosoms, einschließlich
mindestens VirD1 und VirD2, attenuiert. Begleitend dazu würde die
DNA-Replikationsmaschinerie, die die Verschiebung des T-DNA-Strangs
bewirkt, zu relativ hohen Frequenzen in der Lage sein, das Relaxosom
von dem LB vor Realisierung des Nicks zu verdrängen. Eine erhöhte Frequenz
des Durchlesens an LB würde
die Folge eines solchen Prozesses sein. So ist der Prozentsatz der
AT-Reste der 10–100
bp (oder bevorzugt 20–100
bp langen) proximalen Region zu LB und Teil der T-DNA ein in Frage
kommendes Element von LB zur Bestimmung der Effizienz der Nick-Bildung
an der LB-Kernwiederholungssequenz.
Damit die Effizienz der Nick-Bildung
ausreichend hoch ist, muss der Prozentsatz der AT-Reste der proximalen
LB-Region ausreichend hoch sein, d.h. mindestens etwa 60–85 %, bevorzugter
mindestens etwa 64–80
%. Obwohl die proximalen 100 bp außerhalb der T-DNA-RB-Kernwiederholungssequenz
einen ähnlichen
Prozentsatz an AT-Resten enthalten, wie die proximalen 100 bp innerhalb
der T-DNA-LB-Kernwiederholungssequenz, d.h. 58 %, verglichen mit
56 % (siehe 1), ist ein korrekt und hoch effizientes
Prozessieren an dem RB nicht problematisch. Dies ist wahrscheinlich
auf den positiven Einfluss der Over drive-Sequenz, die in der Außenregion
des RB vorhanden ist, zurückzuführen (Peralta
et al. 1986, van Haaren et al. 1987). Es ist nicht auszuschließen, dass
Hilfsproteine des Relaxosomkomplexes an die Overdrive-Sequenz binden
und den Prozess der RB-Nick-Bildung verstärken. Dies würde erneut
der Situation des konjugativen Plasmidtransfers zwischen Bakterien ähneln, bei
dem solche Hilfsproteine identifiziert wurden (Waters und Guiney
1993). Es ist auch nicht auszuschließen, dass Hilfsproteine, die
zum gegenwärtigen
Zeitpunkt noch nicht identifiziert sind, am effizienten Prozessieren
von LB beteiligt sind.
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Das
erste modifizierte T-DNA-Vektorkonstrukt zur Verhinderung des vorstehend
beschriebenen Vektorgrundgerüsttransfers
umfasst eine proximale innere T-DNA-LB-Region, die reich an A- und
T-Resten ist. Ein solcher Ansatz wird jedoch nicht für alle T-DNA-Konstrukte
praktikabel sein. So ist in 2 eine Anzahl
von zusätzlichen
optimierten T-DNA-Vektorkonstrukten
schematisch dargestellt. Die Ergebnisse der Pflanzentransformation
mit dem ersten der Konstrukte von 2 sind in
Beispiel 1 beschrieben. Die anderen Konstrukte beruhen auf mehreren
Ansätzen,
um optimierte T-DNA-Vektoren zu erhalten. Die Optimierungen liegen
in Modifikationen des Aufbaus des linken Rands mit dem Ziel, die
Effizienz der LB-Nick-Bildung zu erhöhen und führen zu einer Integration des
Vektorgrundgerüsts
in das Genom einer eukaryontischen Zelle, die stark minimiert oder
fehlend ist. Bei den optimierten T-DNA-Vektorkonstrukten ist die RB-Region
konstant, d.h. sie umfasst die rechtsrandige Außenregion, aber die rechtsrandige
Innenregion ist deletiert. Diese rechtsrandige Region enthält die 25
bp lange RB-Kernsequenz, und die davor angeordneten 146 dp der rechtsrandigen
Außenregion, abgelei tet
von pTIAch5 (Gielen et al. 1984). Diese Augenregion enthält die Overdrive-Sequenz.
Es ist klar, dass die rechten Randregionen in ihrem natürlichen
Kontext, d.h. umfassend die rechtsrandige Innenregion, auch erfindungsgemäß verwendet
werden kann. Rechte Ränder,
aus denen die Randinnenregionen entfernt wurden, besitzen jedoch
den Vorteil, dass der Transfer von "Fremd"-DNA ohne klare Funktion und als Teil
der T-DNA in die Pflanze weiter limitiert ist. Ferner wurde vorstehend
diskutiert, dass die Abwesenheit der Innenregion von RB sehr unwahrscheinlich
die Effizienz des LB-Processings beeinflusst. Die LB-Regionen in
diesen beispielhaft optimierten T-DNA-Vektoren sind im Allgemeinen
von Ti-Plasmiden vom Octopintyp abgeleitet und alle enthalten eine
natürliche
linksrandige Kernsequenz. T-DNA-Ränder vom Nopalintyp sind üblicherweise von
Ti-Plasmiden, wie
pTiC58 (Gielen et al. 1999) abgeleitet. Weitere Details über beispielhafte
Randregionen, die in beispielhaft optimierten T-DNA-Vektoren verwendet
werden, sind in 2 und Beispiel 4 beschrieben.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt optimierte T-DNA-Vektoren, wie in 2 beispielhaft
dargestellt, und umfasst eine Modifikation des rechten Rands der
T-DNA, umfassend eine einzelne rechtsrandige Kernsequenz, flankiert
von einer rechtsrandigen Außenregion
und/oder einer Modifikation, einschließlich Multiplikation, des linken
T-DNA-Rands, bezeichnet
als:
- a) eine einzelne linksrandige Kernsequenz,
flankiert durch eine natürliche
linksrandige Außenregion
und eine innerhalb des linken Rands der T-DNA gelegene proximale
Region mit einer Länge
von 10 bis 100 bp, bevorzugt 20–100
bp und die an der Anzahl der A- und T-Reste angereichert ist, wobei
der Prozentsatz der AT-Reste bevorzugt 60 bis 85 %, bevorzugter
64 bis 80 %, am bevorzugtesten 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 78 oder 79 % ist, mit der Maßgabe, dass die proximale Region
innerhalb des linken Rands der T-DNA nicht die entsprechende innere
Region des linken Rands vom natürlichen
Octopintyp ist; oder
- b) eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert nur durch
eine natürliche
linksrandige Innenregion; oder
- c) eine einzelne linksrandige Kernsequenz; oder
- d) eine Tandem-Wiederholungssequenz von mehreren linksrandigen
Kernsequenzen, flankiert nur durch eine natürliche linksrandige Außenregion,
wobei die Tandemwiederholungssequenz bevorzugt 2–3 linksrandige Kernsequenzen
enthält,
die aber nicht eine höhere
Kopienzahl der linksrandigen unvollständigen Kernwiederholungssequenz
umfassen, und wobei die wiederholten linksrandigen Kernsequenzen
in dem Tandem durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp getrennt
sind, die gegebenenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in
beiden Richtungen tragen; oder
- e) eine integrale linksrandige Region vom Nopalintyp, benachbart
zu und nachgelagert oder vorgelagert zu der integralen linksrandigen
Region vom Octopintyp.
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Der
Einbau von modifizierten Randregionen, die eine effiziente Nick-Bildung
an der LB-Kernsequenz in üblicherweise
verwendeten Transformationsvektoren zeigen, verhindert ein Durchlesen
von LB. Ein zusätzlicher
Vorteil der Tandemanordnung der LB-Kernsequenzen oder der integralen Ordnung
der LB-Kernsequenzen oder der integralen linken Ränder liegt
in der Tatsache, dass gelegentliches Durchlesen oder ein DNA-Transfer,
beginnend an der ersten Kopie der LB-Kernsequenz oder der integralen
LB-Region, bei einer benachbarten Kopie der LB-Kernsequenz oder
integralen LB-Region in dem Tandem beendet werden. In beiden Fällen ist
die Frequenz des Transfers von Vektorgrundgerüstsequenzen und Integration
der Sequenzen in ein eukaryontisches Genom herabgesetzt.
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Unter "stromabwärts" und "stromaufwärts" bzw. "nachgelagert" und "vorgelagert" ist jede Sequenz
zu verstehen, die 5' bzw.
3' einer anderen
Sequenz liegt. Als Referenz wird der T-DNA-Strang genommen, der
an seinem 5'-Ende
mit RB beginnt und an seinem 3'-Ende
mit LB endet.
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Die
weitere Optimierung von T-DNA-Transformationsvektoren wird in Betracht
gezogen, sobald bekannt ist, ob die linksrandigen Innen- und/oder
Außenregionen
notwendig sind, um die Integration des Vektorgrundgerüsts zu vermeiden.
Mehrere Deletionsderivate der inneren und/oder äußeren Regionen können hergestellt
werden, um zu bestimmen, welche spezifische(n) Sequenz(en) in den
inneren und/oder äußeren Randregionen
wichtig ist bzw. sind, um die Beendigung des T-DNA-Transfers zu
bestimmen. Sobald diese Sequenz bzw. Sequenzen bekannt ist bzw.
sind, kann bzw. können
sie in mehreren Kopien um die LP-Wiederholungssequenz eingebaut
werden, was zu einer effizienteren Nick-Bildung führt. Solche
linken Ränder
sind in der Lage, die T-DNA-Transformationsvektoren
weiter zu optimieren und die Vektoren, die diese weiteren modifizierten
linken Ränder
enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch den Einbau aller Modifikationen,
die erfindungsgemäß beschrieben
sind, in jeden T-DNA-Vektor, umfassend binäre Transformationsvektoren,
super-binäre
Transformationsvektoren, co-integrierte Transformationsvektoren,
von Ri abgeleitete Transformationsvektoren, sowie T-DNA tragende
Vektoren zur Verwendung in agrolistischer Transformation oder Gentherapie.
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Unter "binärem Transformationsvektor" wird ein T-DNA-Transformationsvektor
verstanden, der umfasst:
- a) eine T-DNA-Region,
umfassend mindestens ein Gen von Interesse und/oder mindestens einen
selektierbaren Marker, der in der zu transformierenden eukaryontischen
Zelle aktiv ist; und
- b) eine Vektorgrundgerüstregion,
umfassend mindestens Replikations-Origins, die in E. coli und Agrobacterium
aktiv sind, und Marker zur Selektion in E. coli und Agrobacterium.
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Alternativ
hängt die
Replikation des binären
Transformationsvektors in Agrobacterium von der Anwesenheit eines
separaten Helferplasmids ab. Der binäre Vektor pGreen und das Helferplasmid
pSoup bilden ein Beispiel eines solchen Systems, wie beispielsweise
in Hellens et al. (2000), Plant Mol. Biol. 42, 819–832 beschrieben
ist, oder wie auf der Internetseite http://www.pgreen.ac.uk verfügbar ist.
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Die
T-DNA-Ränder
eines binären
Transformationsvektors können
von Ti-Plasmiden vom Octopintyp oder Nopalintyp oder von beiden
abgeleitet sein. Die T-DNA eines binären Vek tors wird nur in eine
eukaryontische Zelle zusammen mit einem Helferplasmid transferiert.
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Unter "Helferplasmid" wird ein Plasmid
verstanden, das in Agrobacterium stabil aufrechterhalten wird und
mindestens einen Satz von vir-Genen trägt, die notwendig sind, um
den Transfer der T-DNA zu erlauben. Dieser Satz von vir-Genen kann
entweder von Ti-Plasmiden vom Octopintyp oder Ti-Plasmiden vom Nopalintyp oder von beiden
abgeleitet sein.
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Unter "super-binärem Transformationsvektor" wird ein binärer Transformationsvektor
verstanden, der zusätzlich
in der Vektorgrundgerüstregion
eine vir-Region des Ti-Plasmids
pTiBo542 des super-virulenten A. tumefaciens-Stamms A281 (
EP 0 604 662 ,
EP 0 687 730 ) trägt. Superbinäre Transformationsvektoren
werden zusammen mit einem Helferplasmid verwendet.
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Unter "co-integriertem Transformationsvektor" wird ein T-DNA-Vektor verstanden,
der mindestens umfasst:
- a) eine T-DNA-Region,
umfassend mindestens ein Gen von Interesse und/oder einen in Pflanzen
aktiven selektierbaren Marker; und
- b) eine Vektorgrundgerüstregion,
umfassend mindestens Replikations-Origins, die in Escherichia coli
und Agrobacterium aktiv sind, und Marker zur Selektion in E. coli
und Agrobacterium.
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Die
T-DNA-Ränder
und der Satz von vir-Genen eines solchen T-DNA-Vektors können von
Ti-Plasmiden vom Octopin- oder Nopalintyp oder von beiden abgeleitet
sein.
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Unter "Ri abgeleitetem Pflanzentransformationsvektor" wird ein binärer Transformationsvektor
verstanden, in dem die T-DNA-Ränder
von einem Ti-Plasmid abgeleitet sind und wobei der binäre Transformationsvektor
zusammen mit einem "Helfer"-Ri-Plasmid, das
den notwendigen Satz von vir-Genen
trägt,
verwendet wird.
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Unter "Agrolistik", "agrolistischer Transformation" oder "agrolistischem Transfer" wird hier ein Transformationsverfahren
verstanden, das die Merkmale von Agrobacterium vermittelter Transformation
und von biolistischer DNA-Abgabe
vereint. Als solches wird ein T-DNA enthaltendes Zielplasmid zusammen
mit DNA/RNA, die in Pflanzen die Produktion von VirD1 und VirD2
mit oder ohne VirE2 erlaubt, abgegeben (Hansen und Chilton 1996;
Hansen et al. 1997;
WO 97/12046 ).
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Zwei
mögliche
Mechanismen, die zu Transfer und Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen
in einem eukaryontischen Genom führen,
sind bekannt. In einem ersten Mechanismus beginnt der T-DNA-Transfer legitim
an dem rechten T-DNA-Rand,
aber stoppt nicht an dem linken T-DNA-Rand, und es schließt sich
ein kontinuierliches Kopieren der Vektorgrundgerüstsequenzen an. Dieser Mechanismus
ist als linksrandiges Durchlesen bekannt. In einem zweiten Mechanismus
wird der DNA-Transfer illegitim an dem linken T-DNA-Rand unter kontinuierlichem
Kopieren, bis der linke T-DNA-Rand erneut erreicht wird, initiiert.
Unabhängig
vom Vorliegen des jeweiligen Mechanismus zeigt die Analyse der transgenen
Pflanzen an, dass bei vielen von ihnen die vollständigen Vektorgrundgerüstsequenzen
in das Genom integriert sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt
weiter einen Ansatz, um transformierte Zellen, die Vektorgrundgerüstsequenzen
enthalten, durch Rekombination mit einer Rekombinase und Rekombinationsstellen
unempfindlich zu machen bzw. zu heilen.
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Unter "unempfindlich machen" bzw. „heilen" wird hier die Entfernung
von Grundgerüstsequenzen
des Transformationsvektors ohne Aufhebung des T-DNA-Integrationsereignisses
verstanden. Ein weiteres Werkzeug zur Entfernung von Nicht-T-DNA-Sequenzen
aus transgenen Individuen wurde von Hanson et al. (1999) beschrieben.
Dieses Werkzeug ist jedoch anders und steht in keinem Zusammenhang
mit dem erfindungsgemäß beschriebenen
Verfahren zur Erzeugung von Unempfindlichkeit. Wie vorstehend diskutiert,
besitzt die Entfernung von Nicht-T-DNA-Sequenzen gemäß den Verfahren
von Hanson et al. (1999) oder
WO
99/01563 den Nachteil, dass die Transformationseffizienz
erniedrigt wird (Hanson et al. 1999).
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So
wird gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung die Erzeugung von Unempfindlichkeit der transformierten
Zellen durch ein Rekombinationsereignis als Verfahren zur Entfernung
der illegitim integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen erhalten. Als Ergebnis
werden transformierte Zellen erhalten, die die T-DNA in ihrem Genom
zurückbehalten.
Im Gegensatz zu den Verfahren von Hanson et al. (1999) oder
WO 99/01563 rettet das Verfahren
zur Bereitstellung von Unempfindlichkeit gemäß der Erfindung die T-DNA enthaltenen
transgenen Zellen, die zuvor illegitim integrierte Vektorgrundgerüstsequenzen
trugen. Die Transformationseffizienzen werden so kaum beeinträchtigt.
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Unter "Rekombinationsereignis" wird entweder ein
ortsspezifisches Rekombinationsereignis oder ein Rekombinationsereignis,
das durch Transposon-"Jumping" erzielt wird, verstanden.
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Unter "Rekombinase" wird entweder eine
ortsspezifische Rekombinase oder eine Transponase verstanden.
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Unter "Rekombinationsstelle" wird entweder ortsspezifische
Rekombinationsstellen oder Transposonrandsequenzen verstanden.
-
Unter "ortsspezifischem
Rekombinationsereignis" wird
ein Ereignis verstanden, das durch ein System katalysiert wird,
das im Allgemeinen aus drei Elementen besteht: ein Paar von DNA-Sequenzen
(die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen oder -stellen) und
ein spezifisches Enzym (die ortsspezifische Rekombinase). Die ortsspezifische
Rekombinase katalysiert eine Rekombinationsreaktion nur zwischen
zwei ortsspezifischen Rekombinationssequenzen in Abhängigkeit
von der Orientierung der ortsspezifischen Rekombinationssequenzen.
Sequenzen, die zwischen den zwei ortsspezifischen Rekombinationsstellen
liegen, werden in Gegenwart der ortsspezifischen Rekombinase invertiert,
wenn die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen in entgegengesetzten
Richtungen relativ zueinander orientiert sind (d.h. inverted repeats).
Wenn die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen in gleicher Richtung
zueinander orientiert sind (d.h. direkte Repeats), dann wird jede
dazwischen liegende Sequenz nach Interaktion mit der ortsspezifischen
Rekombinase deletiert. Wenn so die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen
als direkte Repeats an beiden Enden der Vektorgrundgerüstsequenzen,
die in ein eukaryontisches Genom integriert sind, vorhanden sind,
kann eine solche Integration von Sequenzen anschließend durch
Wechselwirkung der ortsspezifischen Rekombinationssequenzen mit
der entsprechenden ortsspezifischen Rekombinase entfernt werden.
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Eine
Anzahl von verschiedenen ortsspezifischen Rekombinasesystemen kann
verwendet werden und umfasst ohne Beschränkung das Cre/lox-System von
Bakteriophage P1, das FLP/FRT-System von Hefe, die Gin-Rekombinase
des Phagen Mu, die Pin-Rekombinase von E. coli, die PinB, PinD und
PinF von Shigella und das R/RS-System von Zygosaccharomyces rouxii.
Rekombinasen sind im Allgemeinen Integrasen, Resolvasen oder Flippasen.
Ebenso können
bispezifische Rekombinasen zusammen mit direkten oder indirekten
Repeats von zwei verschiedenen ortsspezifischen Rekombinationsstellen
entsprechend der bispezifischen Rekombinase verwendet werden (
WO 99/25840 ). Die bevorzugten
ortsspezifischen Rekombinasesysteme sind der Bakteriophage P1-Cre/lox und die Hefe
FLP/FRT und die Z. rouxii-R/RS-Systeme.
In diesen Systemen interagiert eine Rekombinase (Cre, FLP bzw. R)
spezifisch mit ihrer ortsspezifischen Rekombinationssequenz (lox,
FRT bzw. RS), um die dazwischen liegenden Sequenzen zu invertieren
oder herauszuschneiden. Die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen
für jedes
dieser zwei Systeme sind relativ kurz (34 bp für lox und 47 bp für FRT).
Einige dieser Systeme wurden bereits mit hoher Effizienz in Pflanzen,
wie Tabak (Dale et al. 1990, Onouchi et al. 1991, Sugita et al.
2000) und Arabidopsis (Osborne et al. 1995, Onouchi et al. 1995)
verwendet. Ortsspezifische Rekombinationssysteme besitzen viele
Anwendungen in der Pflanzenmolekularbiologie, einschließlich Verfahren
zur Kontrolle der homologen Rekombi nation (z. B.
US 5,527,695 ), der zielgerichteten
Insertion, Gen-Stacking etc. (
WO
99/25821 ) und der Auflösung
von komplexen T-DNA-Integrationsmustern oder der Exzision eines
selektierbaren Markers (
WO 99/23202 ).
In diesen Anwendungen sind die ortsspezifischen Rekombinationsstellen
typischerweise Teil der in das eukaryontische Genom als T-DNA oder über homologe
Rekombination integrierten DNA und sind so nicht in der Vektorgrundgerüstsequenz
vorhanden.
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Obwohl
die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen an die Enden der herauszuschneidenden oder
zu invertierenden DNA geknüpft
werden müssen,
kann das Gen, das die ortsspezifische Rekombinase codiert, an anderer
Stelle lokalisiert sein. Beispielsweise könnte das Rekombinase-Gen bereits
in der Eukaryonten-DNA vorhanden sein oder könnte durch ein später eingeführtes DNA-Fragment,
das entweder direkt in den Zellen über Kreuzung oder durch Kreuzpollination
bereitgestellt wurde, geliefert werden. Alternativ könnte ein
im Wesentlichen gereinigtes Rekombinaseprotein direkt in die eukaryontische
Zelle, z.B. durch Mikroinjektion oder Partikelbeschuss, eingeschleust
werden. Typischerweise ist die die ortsspezifische Rekombinase codierende
Region funktionell an Regulatorsequenzen geknüpft, was die Expression der
ortsspezifischen Rekombinase in der eukaryontischen Zelle ermöglicht.
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Als
Teil der vorliegenden Erfindung werden ortsspezifische Rekombinationsstellen
in den T-DNA-Vektor eingeschleust, so dass sie außerhalb
der T-DNA liegen, aber es ermöglichen,
dass transferierte Vektorgrundgerüstsequenzen oder Teile davon,
die möglicherweise
aus dem T-DNA-Vektor stam men, post-transformational durch die Wirkung
einer ortsspezifischen Rekombinase herausgeschnitten werden.
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Unter "Rekombinationsereignis,
das durch Transposon-Jumping" bewirkt wird, oder
unter "Transponase
vermittelter Rekombination" wird
ein Rekombinationsereignis verstanden, das durch ein System katalysiert wird,
das aus drei Elementen besteht: einem Paar von DNA-Sequenzen (die
Transposon-Randsequenzen) und einem spezifischen Enzym (die Transponase).
Die Transponase katalysiert eine Rekombinationsreaktion nur zwischen
zwei Transposon-Randsequenzen,
die als inverted Repeats angeordnet sind.
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Eine
Anzahl von verschiedenen Transposon/Transponasesystemen kann verwendet
werden und umfasst, ohne Beschränkung,
das Ds/Ac-System, das Spm-System und das Mu-System. Diese Systeme stammen aus Mais,
aber es wurde gezeigt, dass mindestens das Ds/Ac- und das Spm-System
auch in anderen Pflanzen funktionieren (Fedoroff et al. 1993, Schlappi
et al. 1993, Van Sluys et al. 1987). Bevorzugt sind Transposons
von Ds- und dem Spm-Typ, die durch 11 bp lange bzw. 13 bp lange
Randsequenzen abgegrenzt sind.
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Obwohl
die Transposon-Randsequenzen an die Enden der herauszuschneidenden
DNA geknüpft werden
müssen,
kann das Gen, das die Transponase codiert, an anderer Stelle lokalisiert
sein. Beispielsweise könnte
das Rekombinase-Gen bereits in der Eukaryonten-DNA vorhanden sein
oder könnte
durch ein später eingeschleustes
DNA-Fragment, das entweder direkt in die Zelle durch Kreuzung oder
Kreuzpollination eingeführt
wird, bereitgestellt werden. Alternativ könnte ein im Wesentlichen gereinigtes
Transponaseprotein direkt in die Zellen eingeschleust werden, z.B.
durch Mikroinjektion oder durch Partikelbeschuss.
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Als
Teil der vorliegenden Erfindung werden Transposon-Randsequenzen in
den T-DNA-Vektor so eingeschleust, dass sie außerhalb der T-DNA liegen und
das Vektorgrundgerüst
oder einen Teil davon in eine transposonartige Einheit umwandeln,
die sich durch die Wirkung einer Transponase bewegen kann.
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Wie
Transposons, und so in der vorliegenden Erfindung, reintegrieren
sich das Vektorgrundgerüst oder
ein Teil davon oft an einer anderen Stelle des Wirtsgenoms, und
die Segregation der Nachkommen des Wirts, in dem die Transponase
wirken konnte, könnte
notwendig sein, um transformierte Wirte, die nur die T-DNA enthalten,
und transformierte Wirte, die nur das Vektorgrundgerüst oder
einen Teil davon, enthalten, zu trennen.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt weiter optimierte T-DNA-Transformationsvektoren
mit zusätzlichen
DNA-Sequenzen außerhalb
der randständigen
T-DNA-Kernwiederholungssequenzen, wie in 3 beispielhaft
dargestellt, und erlauben die post-transformationelle Entfernung
von integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen.
Diese zusätzlichen
DNA-Sequenzen modifizieren, einschließlich multiplizieren, die T-DNA-Randregionen
oder Teile davon und umfassen:
- f) Rekombinationsstellen,
organisiert als Wiederholungssequenzen, nachgelagert der linksrandigen
Kernsequenz und vorgelagert der rechtsrandigen Kernsequenz; oder
- g) die DNA-Sequenzen von (f) weiter modifiziert durch Hinzufügen einer
zweiten Kopie einer linksrandigen Region, positioniert vor und bevorzugt
neben der einzelnen rechtsrandigen Außenregion und der Rekombinationsstelle
vor der Kernsequenz der zweiten linksrandigen Region; oder
- (h) Rekombinationsstellen von (f) mit einem Rekombinase-Gen, nachgelagert
der Rekombinationsstelle nach der linksrandigen Kernsequenz und
bevorzugt, sofern vorhanden, neben und nachgelagert der linksrandigen
Außenregion;
oder
- (i) eine DNA-Sequenz lokalisiert nachgelagert der linksrandigen
Region, wobei die DNA-Sequenz ein Rekombinase-Gen umfasst, das von
Wiederholungssequenzen von Rekombinationsstellen, wie in (h) definiert,
flankiert ist und weiter eine zweite Kopie einer linksrandigen Region
nachgelagert der Rekombinase umfasst; oder
- (j) die DNA-Sequenz von (i) mit zusätzlichen Rekombinationsstellen,
organisiert als Wiederholungssequenzen, nachgelagert der zweiten
linksrandigen Kernsequenz und vorgelagert der einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz.
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In
jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen
benachbart zu und nachgelagert und/oder vorgelagert zu den links-
und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen lokalisiert oder sind von
den links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen durch eine Sequenz
von mindestens 10–20
bp Länge getrennt,
die gege benenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden
Richtungen tragen.
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In
jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen
entweder ortsspezifische Rekombinationsstellen, angeordnet als direkte
Wiederholungssequenzen oder Transposon-Randsequenzen oder angeordnet
als inverted Repeats, und das Rekombinase-Gen ist entweder ein ortsspezifisches Rekombinase-Gen
oder ein Transponase-Gen.
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Es
ist offensichtlich, dass die Modifikationen (f) oder (g) in den
T-DNA-Transformationsvektoren als einfache Modifikationen, einschließlich Multiplikation,
der T-DNA-Randregionen
oder Teilen davon gelten.
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Die
Einschleusung zusätzlicher
DNA-Sequenzen stromabwärts
der linksrandigen T-DNA-Kernwiederholungssequenz, um ein linksrandiges
Durchlesen zu verhindern (
WO
99/01563 ) oder um Nicht-T-DNA-Sequenzen zu eliminieren
(Hanson et al. 1999), wurden beschrieben, und diese Sequenzen verhindern
die Entwicklung von Transformanten, in die die Vektorgrundgerüstsequenzen
integriert sind. Zusätzlich
zu den Modifikationen (f) besitzt die Modifikation (g) des T-DNA-Vektors den Vorteil,
dass ein Durchlesen an der ersten LB-Kernsequenz an der zweiten LB-Kernsequenz
gestoppt werden kann, wodurch die Verdopplung des T-DNA-Fragments
verhindert wird. Insertierte Vektorgrundgerüstsequenzen werden anschließend durch
Wirkung einer geeigneten Rekombinase entfernt. Zusätzlich zu
den Modifikationen (f) führt
die Modifikation (h) in einen T-DNA-Vektor eine Rekombinase-Gensequenz stromabwärts der
linksrandigen Kernsequenz ein, um eine Auflösung der integrierten Vektorgrundgerüstse quenz,
die möglicherweise
von dem T-DNA-Vektor abstammt, an den in die modifizierten T-DNA-Ränder eingeschleusten
Rekombinationsstellen zu erlauben. So und im Gegensatz zu
WO 99/01563 können Transformanten
mit integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen nach
der Erzeugung von Unempfindlichkeit gerettet werden, d.h. nach Entfernung
der Vektorgrundgerüstsequenzen,
die von den Rekombinationsstellen flankiert werden, die in die modifizierten
T-DNA-Ränder
eingeführt
wurden. Begleitend dazu wird das Rekombinase-Gen herausgeschnitten.
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Die
Modifikationen (i) ändern
weiter den Aufbau der linken Randregion, d.h. eine zusätzliche
Kopie einer linken Randregion wird hinzugefügt. Beide Kopien sind jedoch
nicht im Tandem, wie vorstehend in dem ersten Ansatz zur Verhütung der
Vektorgrundgerüstintegration
beschrieben, angeordnet, sondern sind durch das Rekombinase-Gen
getrennt, und die randständigen
Kernsequenzen kommen in ihrem breiteren Randkontext vor. Die Modifikationen
(i) sind somit als eine Modifikation des vorstehend beschriebenen
T-DNA-Vektorkonstrukts zu sehen, in dem die einzelne LB-Region eine
Tandemanordnung der LB-Kernsequenz enthält. Die Anwesenheit einer zweiten
Kopie einer linken T-DNA-Randregion besitzt den Vorteil, dass illegitimer DNA-Transfer,
beginnend am oder lesend durch zur ersten linksrandigen Kernsequenz
an der zweiten linksrandigen Kernsequenz gestoppt werden kann. So
wird nur ein Teil der Vektorgrundgerüstsequenz in den eukaryontischen
Kern transferiert. Da diese Vektorgrundgerüstregion durch Rekombinationsstellen
flankiert ist, kann sie leicht durch die Wirkung einer Rekombinase
entfernt werden. Illegitimer DNA-Transfer, beginnend an oder lesend
durch zu der zweiten Kopie der linksrandigen Kernsequenz kann jedoch
immer noch auftreten.
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Daher
fügt die
Modifikation (j) weiter ein Paar von Rekombinationsstellen stromabwärts der
zweiten Kopie der linksrandigen Kernsequenz und stromaufwärts der
einzelnen rechtsrandigen Region an. Integrierte Vektorgrundgerüstsequenzen
können
wieder leicht durch Wirkung einer Rekombinase an den Rekombinationsstellen
entfernt werden. Im Falle eines illegitimen DNA-Transfers, beginnend
an der zweiten Kopie der linksrandigen Kernsequenz, wird die Rekombinase
nicht durch das Grundgerüst
des T-DNA-Transformationsvektors
geliefert. Sie muss so von anderer Seite bereitgestellt werden,
z.B. durch sexuelle Kreuzung mit einer Pflanze, die das Rekombinase-Gen
bereits in ihrem Genom enthält.
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Jede
der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) ist auch anwendbar,
um transgene Zellen gegenüber Vektorgrundgerüstsequenzen,
die in das Genom eines Eukaryonten unabhängig von der T-DNA integriert
wurden, d.h. nicht physikalisch mit der T-DNA verknüpft sind,
unempfindlich zu machen.
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Weiter
wird in der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren beschrieben, bei
dem die T-DNA-Transformationsvektoren, die die DNA-Sequenzen von
(f) oder (g) in Kombination mit der Bereitstellung einer Rekombinase
enthalten, verwendet werden, oder bei dem T-DNA-Transformationsvektoren
verwendet werden, die die DNA-Sequenzen (h), (i) oder (j) enthalten,
um transformierte Zellen, die Grundgerüstsequenzen der Vektorgrundgerüstsequenzen
gegebenenfalls in Kombination mit der Bereitstellung einer Rekombinase
enthalten, unempfindlich zu machen.
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Ortsspezifische
Rekombinasen oder Transponasen, die in das Wirtsgenom eingeschleust
wurden, um die Rekombination zu ermöglichen, können anschließend durch
Segregation der Nachkommen des transformierten Wirts, in dem die
Rekombination eintreten konnte, entfernt werden. Die Segretation
der Nachkommen ist auch ein Weg, um transformierte Wirte, die nur
die T-DNA enthalten, und transformierte Wirte, die nur das Vektorgrundgerüst oder
einen Teil davon enthalten, zu trennen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner die Einschleusung beliebiger
der zusätzlichen
DNA-Sequenzen in jedem T-DNA-Vektor,
umfassend binäre
Transformationsvektoren, super-binäre Transformationsvektoren,
co-integrierte Transformationsvektoren, von Ri abgeleitete Transformationsvektoren
sowie T-DNA tragende Vektoren zur Verwendung in agrolistischer Transformation
oder Gen-Therapie.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Rekombinase-Gen den transgenen Pflanzen,
die eine Vektorgrundgerüstsequenz,
flankiert von Rekombinationsstellen, enthalten, durch sexuelle Kreuzung
mit einer Pflanze, die das Rekombinase-Gen in ihrem Genom enthält, bereitgestellt.
Die Rekombinase kann entweder an einen konstitutiven oder einen
induzierbaren Promotor funktionell geknüpft sein. Das Rekombinase-Gen
kann alternativ unter der Kontrolle einer einzelnen Untereinheit
von Bakteriophagen RNA-Polymerase spezifischen Promotoren, wie einem
T7 oder einem T3 spezifischen Promotor, stehen, vorausgesetzt, dass
die Wirtszellen auch die entsprechende RNA-Polymerase in einer aktiven
Form umfassen. Ein noch weiteres alternatives Verfahren zur Expression
der Rekombinase besteht in der funktionellen Verknüpfung des
offenen Leserasters der Rekombinase mit einer stromaufwärts gelegenen
aktivierenden Sequenz, die durch einen transaktivierenden Transkriptionsfaktor,
wie GAL4 oder Derivate (
US 5,801,027 ,
WO 97/30164 ,
WO 98/59062 ) oder den Lac-Repressor
(
EP 0 823 480 ) stimuliert
wird, vorausgesetzt, dass die Wirtszelle in geeigneter Weise mit
dem Transkriptionsfaktor versehen ist.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird das Rekombinase-Gen auf einem Transformationsvektorgrundgerüst bereitgestellt,
und der Promotor des Rekombinase-Gens
ist bevorzugt ein induzierbarer Promotor. Solche Promotoren sind
einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und umfassen z.B. einen Hitzeschock
reaktiven Promotor, einen Glukokortikoid induzierbaren Promotor
oder einen durch eine andere chemische Verbindung induzierbaren
Promotor (z.B. wie in
EP 0 332
104 und
WO 90/08826 offenbart).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Expression des Rekombinase-Gens in bakteriellen Wirten
durch Einschließen
einer Intronsequenz bzw. Intronsequenzen in der codierenden Region
des Rekombinase-Gens verhindert.
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Es
ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass erhöhte Spiegel an VirD1 und VirD2
in Agrobacterium zu höheren
Werten an Pflanzentransformation führen (Wang et al. 1990). VirD1
und VirD2 wurden auch nach einem Verfahren zur verbesserten Integration
exogener DNA, die an eukaryontische Zellen mittels Transformation
der eukaryontischen Zellen mit chimären virD1 und/oder virD2-Genen
abgegeben wurden, integriert (
WO 97/12046 ).
Es wurde jedoch bis jetzt nicht gezeigt, dass eine erhöhte Produktion
von VirD1 und/oder VirD2 die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen
verhindern kann.
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So
wird gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung die Integration von Vektorgrundgerüstsequenz durch Verstärken der
Effizienz der Nick-Bildung an der linksrandigen Kernsequenz eines
T-DNA-Vektors durch Erhöhen
der Produktion des T-DNA-Nick-Komplexes unter Beteiligung mindestens
der Endonukleasen VirD1 und VirD2 verhindert.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden zusätzliche
Kopien des Octopintyp virD-Locus entweder in das Genom von Agrobacterium
und/oder in ein Helferplasmid und/oder in einen binären Transformationsvektor
und/oder in einen super-binären
Transformationsvektor und/oder in einen co-integrierten Transformationsvektor
und/oder einen von Ri abgeleiteten Pflanzentransformationsvektor
integriert. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung können
zusätzliche
Kopien des virD-Locus vom Nopalintyp, wie erwähnt, bereitgestellt werden.
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Die
vorliegende Anmeldung betrifft somit drei Verfahren, entweder um
die Integration von Transformationsvektorgrundgerüstsequenzen
zu verhindern oder demgegenüber
unempfindlich zu machen, wobei verwendet wird:
- 1)
beliebige der T-DNA-Vektoren (a) bis (e), modifiziert an der linken
T-DNA-Randregion, so dass ein Durchlesen verhindert oder gestoppt
wird oder dass der DNA-Transfer,
der an diesem Rand beginnt, verhütet oder
gestoppt wird; oder
- 2) beliebige der T-DNA-Vektoren (f) bis (j), die die Auflösung der
in das Genom der transgenen Zellen integrierten Grundgerüstsequenzen
des Transformationsvektors durch Rekombination ermöglichen;
oder
- 3) mindestens eine Extrakopie des virD-Locus in Agrobacterium,
um die Gehalte von VirD1 und VirD2 als minimale Bestandteile des
T-DNA-Rand-Nick-Komplexes zu erhöhen.
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Es
ist einem Fachmann auf dem Gebiet klar, dass jedes dieser Verfahren
oder Teile davon entweder alleine, in Kombination von zwei oder
als Kombination aller drei verwendet werden kann. Beispielhafte
Darstellungen des T-DNA-Vektors,
die einige solcher Kombinationen widerspiegeln, sind in 3 angegeben.
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Bevorzugte
Kombinationen der erfindungsgemäßen Verfahren
(1) oder (2) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren (3) bestehen
aus einem Transformationsvektor, der eine modifizierte LB-Region
trägt,
die eine Tandem-Anordnung der LB-Kernsequenz
oder mehrfache Kopien der LB-Region trägt, und der erhöhten Produktion
von VirD1 und VirD2 durch Agrobacterium. Es kann in der Tat erwartet
werden, dass das Tandem aus LB-Kernsequenzen oder den Mehrfachkopien
der LB-Region, die
in einem Agrobacterium-Stamm, der normalerweise zur Transformation
verwendet wird, verfügbaren
VirD1- und VirD2-Proteine
titriert. Als Ergebnis würden
diese Proteine nicht länger
zur Herstellung eines Nicks an der einzelnen RB-Kernsequenz verfügbar sein.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt die Verwendung jedes der Verfahren
und/oder jede der T-DNA- Vektormodifikationen,
entweder separat oder in beliebiger Kombination, um die Integration
des Grundgerüsts
des Transformationsvektors zu verhindern oder dagegen unempfindlich
zu machen. Bevorzugte Kombinationen sind diejenigen, in denen erhöhte Spiegel
an VirD-Proteinen, die von Agrobacterium produziert werden, auf
T-DNA-Vektoren einwirken können,
die mehrfache Kopien der LB-Kernsequenz oder mehrfache Kopien der
LB-Regionen beherbergen.
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Es
ist auch klar, dass jedes der Verfahren und/oder Modifikationen
des T-DNA-Vektors, um die Integration des Vektorgrundgerüsts zu verhindern
oder demgegenüber
unempfindlich zu machen, mit jedem anderen Verfahren, um die Integration
des Vektorgrundgerüsts
zu verhindern oder demgegenüber
unempfindlich zu machen, kombiniert werden kann. Solche Verfahren
und Modifikationen des T-DNA-Vektors umfassen die Addition von Genen
oder DNA-Sequenzen stromabwärts
des linken Randes, wie z.B. in der
WO
99/01563 offenbart. Solche Gene/DNA-Sequenzen umfassen
Gene, die zytotoxische Verbindungen, Antisense-Haushaltsgene, Sequenzen,
die das Entwinden der DNA hinter der linken Randregion verhindern,
z.B. Sequenzen mit hohem GC-Gehalt oder vir-Boxsequenzen, die mit
DNA-Bindeproteinen Wechselwirken, codieren.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung umfasst somit die Verwendung jedes der Verfahren und/oder
T-DNA-Vektormodifikationen
der Erfindung, um die Integration von Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors
zu verhindern oder demgegenüber
unempfindlich zu machen, in Kombination mit jedem anderen Verfahren
und/oder Modifikation des T-DNA-Transformationsvektors, um die Integration
des Grundgerüsts
des Transformationsvektors zu verhindern oder demgegenüber unempfindlich
zu machen.
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Es
ist weiter einem Fachmann auf dem Gebiet klar, dass jedes der erfindungsgemäßen Verfahren und/oder
Modifikationen des T-DNA-Vektors, um gegenüber der Integration von Grundgerüstsequenzen
des Transformationsvektors unempfindlich zu machen, mit jedem anderen
Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikation
unter Verwendung oder Einbezug beliebiger Rekombinationssysteme,
z.B. um in Pflanzen aktive selektierbare Marker auszuschneiden,
kombiniert werden kann. Das Verfahren zur Erzeugung von Unempfindlichkeit
kann in der Tat kombiniert werden mit beispielsweise dem Ausschneiden
eines selektierbaren Markers durch Flankieren beispielhafter selektierbarer
Marker entweder mit der gleichen oder mit verschiedenen Rekombinationsstelle(n),
wie derjenigen, die die Vektorgrundgerüstsequenz flankieren. Bei dem
Verfahren zur Erzeugung von Unempfindlichkeit kann die Vektorgrundgerüstsequenz
auch durch zwei verschiedene ortsspezifische Rekombinationsstellen
flankiert sein, und die Erzeugung von Unempfindlichkeit kann durch
bispezifische Rekombinase mit Spezifitäten entsprechend den verwendeten
ortsspezifischen Rekombinationsstellen durchgeführt werden.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst somit die Verwendung von Verfahren
und/oder T-DNA-Vektormodifikationen
gemäß der Erfindung,
um gegenüber
Integration von Grundgerüstsequenzen
des Transformationsvektors unempfindlich zu machen, in Kombination
mit Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen unter Verwendung
oder Einbeziehung beliebiger Rekombinationssysteme für andere
Zwecke als die Erzeugung von Unempfindlichkeit gegenüber der
Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst die Erzeugung von Unempfindlichkeit
gegenüber
integrierten Grundgerüstsequenzen
des Transformationsvektors unter Einbeziehung von Modifikationen
der T-DNA-Ränder
durch Hinzufügen
eines beliebigen Paars von wechselseitig unterschiedlichen ortsspezifischen
Rekombinationsstellen und unter Verwendung zusammen mit einer mindestens
bispezifischen Rekombinase mit Spezifitäten, die mindestens den verwendeten
ortsspezifischen Rekombinationsstellen entsprechen.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird jedes der erfindungsgemäßen T-DNA-Vektorkonstrukte
in einen Agrobacterium-Stamm überführt. Die
so erhaltenen Stämme
sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Gemäß einer
noch weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird jeder der erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren in einer
Agrobacterium vermittelten oder agrolistischen Transformation verwendet,
wobei solche Transformationsverfahren einem Fachmann auf dem Gebiet
bekannt sind. Die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren
können
zur Transformation mehrerer Pflanzengewebe, umfassend Wurzeln, Protoplasten, Blätter etc.
von verschiedenen monocotylen und dicotylen Pflanzenarten, wie beispielsweise,
ohne Beschränkung,
Arabidopsis, Tabak, Petunie, Tomate, Kartoffel, Bohnen, Reis und
Weizen, verwendet werden. Allgemeiner kann es jede beliebige monocotyle
oder dicotyle Pflanze sein, die bevorzugt einer Pflanzenart von
Interesse in der Landwirtschaft, der Holzwirtschaft, dem Gartenbau
oder einer Pflanzenart, die für
die Produktion von Arzneimitteln, Biochemika, Antikörper oder
Parfüms
verwendet wird, angehört.
Solche Pflanzen umfassen Nutzpflanzen, Wurzelpflanzen, Öl produzierende Pflanzen,
Holz produzierende Pflanzen, landwirtschaftlich angebaute Pflanzen,
Früchte
produzierende Pflanzen, Leguminosen für Trocken- und Feuchtfutter,
Begleitpflanzen oder gartenbaumäßig angebaute
Pflanzen. Solche Pflanzen umfassen weiterhin Aprikose, Artichoke, Spargel,
Apfel, Banane, Gerste, Broccoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Karotte,
Cassava, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicoree, Grünkohl, Baumwolle,
Douglas-Tanne, Fichte (Arten Abies und Picea), Flachs, Knoblauch, Trauben,
Kohl, Linsen, Mais, Eiche, Hafer, Ölsaaten, Okra, Zwiebel, Birne,
Paprika, Pappel, Roggen, Sorgum, Sojabohnen, Kürbis, Zuckerrübe, Zuckerrohr,
Sonnenblume.
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Die
erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren
können
auch in Kombination mit dem "Flower
Dip"-Pflanzentransformationsverfahren
(Clough und Bent 1998) oder mit dem "in planta apical shoot"-Transformationsverfahren
(
WO 99/14348 ) verwendet
werden. Die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren
können
auch zur Transformation anderer eukaryontischer Zellen, einschließlich Hefen,
Schimmelkulturen, Fadenpilze, und ihre Conidien, Hyphen oder Protoplasten,
die davon abgeleitet sind, verwendet werden. Die Agrobacterium vermittelte Transformation
der anderen eukaryontischen Zellen ist einem Fachmann auf dem Gebiet
bekannt (z.B.
WO 98/45455 ).
Ein Schlüsselcharakteristikum
der mittels Agrobacterium vermittelten Transfers oder agrolistischem
Transfer mit jedem der erfindungsgemäßen T-DNA-Transformationsvektoren transformierten
eukaryontischen Zellen ist eine signifikant erniedrigte Frequenz
von integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen,
ohne stark die Frequenz der Integration der T-DNA-Sequenzen zu beeinflussen.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung umfasst transgene Pflanzenzellen, die nach jedem Verfahren
des Agrobacterium vermittelten Transfers oder agrolistischen Transfers
mit jedem der erfindungsgemäßen T-DNA-Transformationsvektoren
erhalten wurden. Ebenfalls umfasst sind die gemäß irgendeinem Verfahren nach
jedem Verfahren des Agrobacteriums vermittelten Transfers oder agrolistischen
Transfers mit jedem der erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren erhaltenen oder regenerierten
transgenen Pflanzen. Solche Pflanzen sind dadurch gekennzeichnet,
dass sie T-DNA-Sequenzen, aber nicht Vektorgrundgerüstsequenzen in
ihrem Genom enthalten. Weiter umfasst sind die Nachkommen der transgenen
Pflanzen, sowie Zellen, Protoplasten, Kalli, Gewebe, Organe, Samen,
Früchte,
Pollen, Eizellen, Zygoten, zygotische oder somatische Embryos, die
davon abgeleitet sind oder von den transgenen Pflanzenzellen abgeleitet
sind.
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Das
Potential zur Verwendung der erfindungsgemäßen T-DNA enthaltenden Vektoren
in der Gen-Therapie kann wie folgt erklärt werden. Es wurde beschrieben,
dass die in vitro rekonstituierten Komplexe, bestehend aus VirD2-ssDNA-VirE2, in der Lage
sind, die ssDNA intakt in Säugerzellen
zu transferieren (Ziemienowicz et al. 1999).
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VirD2
schützt
ssDNA gegenüber
exonukleolytischen Abbau, weil sie kovalent an das 5'-Ende der ssDNA geknüpft ist
(Durrenberger et al. 1989, Young und Nester 1988) und durch zwei
Kernlokalisationssequenzen (NLSs) die ssDNA in den Pflanzenzellkern
(Narasimhulu et al. 1996, Rossi et al. 1993, Shurvinton et al. 1992)
targetieren. VirD2 enthält
ferner eine "omega"-Domäne, die
für die
effiziente Integration der T-DNA in das Wirtsgenom wichtig ist (Nara simhulu
et al. 1996, Mysore et al. 1998, Tinland et al. 1995). Es wurde
gezeigt, dass NLSs von VirD2 in Tierzellen einschließlich menschlicher
HeLa-Zellen, Drosophila-Embryonen
und Xenopus-Oozyten aktiv ist (Guralnick et al. 1996, Ziemienowicz
et al. 1999). VirD1 bleibt in dem Zytoplasma von Säugerzellen
lokalisiert, kann aber in den Zellkern über einen piggy-back-Mechanismus
unter Beteiligung von VirD2 importiert werden (Ziemienowicz et al.
1999).
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VirE2
schützt
die ssDNA gegenüber
(endo)nukleolytischem Abbau und erhält die Integrität der T-DNA (Gelvin
1998b, Rossi et al. 1996). Das VirE2-Protein ist weiter aktiv an
dem Targetieren der T-DNA in den Pflanzenzellkern beteiligt (Gelvin
1998b). Die NLSs von VirE2 kann pflanzenspezifisch sein, aber die
Repositionierung einer einzelnen Aminosäure innerhalb VirE2 NLSs targetiert
diese modifizierten Proteine in die Zellkerne von tierischen Zellen
(Guralnick et al. 1996). VirE2-Proteine zeigen Wechselwirkung mit
sich selbst, aber die Wechselwirkung von VirE1 mit VirE2 ist viel
stärker
und VirE1 hemmt die VirE2-Selbst-Wechselwirkung.
In Agrobacterium-Zellen verhindert VirE1 die Aggregation von VirE2.
VirE1 scheint so als molekularer Chaperon von VirE2 zu wirken (Deng
et al. 1999).
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Die
Eigenschaften dieser Vir-Proteine machen sie zu idealen Kandidaten
für ihre
Anwendung in gentherapeutischen Experimenten, wie von Ziemienowicz
et al. (1999) angegeben. Eines der Hauptprobleme bei der Gentherapie
besteht in der Tat in der Schwierigkeit der DNA-Abgabe durch die
intrazellulären
Barrieren, einschließlich
nukleolytischem Abbau und Kernaufnahme.
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Virale
Vektoren sind eine der Hauptvehikel, die von Wissenschaftlern bei
der Gen-Therapie verwendet werden, um eine DNA-Sequenz in einem
geeigneten Wirt zur Expression zu bringen. Retrovirale Vektoren
(einschließlich
HIV und MMLV) werden in 63 % der Gen-Therapieprotokolle, die von
Recombinant DNA Advisory Committee (eine Abteilung des NIH) anerkannt
sind, verwendet, wohingegen adenovirale Vektoren in 16 % solcher
Protokolle verwendet werden. Andere virale Vektoren umfassen solche,
die auf AAV, HSV und Vaccinia beruhen. Virale Vektoren stellen einen
Bereich kontinuierlicher Neuentwicklung in der Gen-Therapie dar.
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Es
kann in Betracht gezogen werden, dass die Gene für die Agrobacterium-Proteine
VirD1, VirD2 und VirE2 (und schließlich VirE1) in einen viralen
Vektor so eingebaut werden (d.h. einschließlich angepasstem Codongebrauch
und geeigneter Regulatorsequenzen), dass sie in Tierzellen bevorzugt
vorübergehend
exprimiert werden können,
und dies bevorzugt ohne Integration der vir-Gene in das Wirtsgenom.
Wenn eine T-DNA, die das Gen von Interesse für gentherapeutische Zwecke
enthält,
in dem gleichen viralen Vektor vorhanden ist oder gleichzeitig auf
einem separaten viralen Vektor oder einem anderen Typ eines viralen
Vektors abgegeben wird, könnte
die T-DNA dann effizient in das Genom in Zellkernen tierischer Zellen überführt werden.
Ein striktes Anfordernis für
die Anerkennung einer solchen gentherapeutischen Strategie würde jedoch
sein, dass nur die T-DNA und nicht jede andere externe DNA in den
Zellkern transferiert wird. Jede in der vorliegenden Erfindung dargestellte
Modifikation, um den Transfer von DNA-Sequenzen, die nicht zu der T-DNA gehören, zu
verhindern, oder demgegenüber
unempfindlich zu machen, würde
somit von großem
Wert zur Erhöhung
der Akzeptabilität
von genthera peutischen Strategien sein, die die Verwendung von Agrobacterium-Proteinen
zur Bereitstellung und zur Übertragung
der DNA von Interesse umfassen. Daher umfasst die vorliegende Erfindung T-DNA
enthaltende Vektoren, die gemäß beliebigen
Modifikationen oder Kombinationen von Modifikationen der vorliegenden
Erfindung modifiziert wurden und für gentherapeutische Zwecke
verwendet werden.
-
Es
ist ferner einem Fachmann klar, dass mindestens die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren,
die modifizierte LBs enthalten, welche zu einer hoch effizienten
Nick-Bildung in diesem LB führen,
als Quelle für beispielsweise
VirD2-ss-T-DNA-VirE2-Komplexe
verwendet werden können,
die in anderen gentherapeutischen Techniken, einschließlich Mikroinjektion,
Elektroporation, Träger
vermittelter Abgabe und ballistischer DNA-Injektion verwendet werden
können.
Diese Komplexe könnten
beispielsweise aus einer mit Acetosyringon induzierten Agrobacterium-Kultur
oder einer E. coli-Kultur, die zumindest die VirD1-, VirD2- und
VirE2-Proteine exprimiert,
mittels beispielsweise Affinitätschromatographie,
unter Verwendung eines Antikörpers,
der das VirD2-Protein erkennt, angereichert werden.
-
Die
Erfindung wurde nun allgemein geschrieben und wird klarer unter
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden, die nur dem Zweck
der Erläuterung
bestimmter Aspekte und Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung dienen und die Erfindung nicht beschränken sollen.
Auf den Inhalt aller in diesem Text in Bezug genommenen Literaturstellen
wird hiermit expressiv verbis Bezug genommen.
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Beschreibung der Figuren
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1.
Schematische Darstellung des Prozentsatzes der A- und T-Reste (indiziert über und
unter der horizontalen Linie, die den Vektor bezeichnet) pro 100
bp Blöcken
um (und nicht einschließlich)
die links- und rechtsrandigen imperfekten Kernwiederholungssequenzen
der in den Beispielen 1–3
beschriebenen und verwendeten K- und Hsb-T-DNA-Vektoren.
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2.
Schematische Darstellung von T-DNA-Konstrukten, die so entwickelt
sind, dass die Effizienz der Nick-Bildung an dem modifizierten linken
Rand zusammen mit einem rechten Rand, dem die innere Region des
Rands fehlt, bewertet werden kann. Gus: β-Glucuronidase codierende Sequenz;
nptII: Neomycinphosphotransferase II codierende Sequenz; 3' ocs: 3'-Terminator des Octopinsynthase-Gens;
Pnos: Promotor des Nopalinsynthase-Gens; 3'nos: 3'-Terminator
des Nopalinsynthase-Gens; P35S: konstitutiver 35S-RNA-Promotor des
Blumenkohlmosaikvirus.
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3.
Schematische Darstellung der T-DNA-Konstrukte, die so ausgelegt
sind, dass sie die Erzeugung von Unempfindlichkeit gegenüber in das
Genom eines Eukaryonten integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen
erlauben. LB: linker Rand; RB: rechter Rand.
-
4.
Schematische Darstellung beispielhafter T-DNA-Konstrukte. LB: linker Rand; RB: rechter Rand;
modLB: modifizierter linker Rand (vgl. 2 für mögliche Modifikationen).
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5.
DNA-Gel-Blotanalyse.
- (A) Schematische Darstellung
des Verdaus und der in der DNA-Gel-Blotanalyse verwendeten Sonde
(nicht maßstabsgetreu
gezeichnet). Jede Probe der Pflanzengenom-DNA und die als positive
Kontrollen verwendeten Plasmide wurden mit KpnI und SacI gespalten,
die beide das Vektorgrundgerüst
außerhalb
LB und RB spalten. Als Sonde wurde die Vektorsequenz des K-Plasmids,
gezeigt als gestrichelter Balken, nach Restriktion mit KpnI und
SacI, verwendet.
- (B) DNA-Gel-Blotanalyse. Die T-DNA-Vektoren, von denen ein mindestens
1000 bp langes Vektorgrundgerüst
mittels PCR-Analyse
der transgenen Pflanzen gefunden wurde, sind über jeder Bande angezeigt.
Ein Fragment zu 8476 bp (Pfeil 1) wird beobachtet, wenn die gesamte
Vektorgrundgerüstsequenz
des K-Plasmids (K1 und K2 tragen ein unterschiedliches Strukturgen
in ihrer T-DNA, aber sind ansonsten identisch) integriert wird,
wohingegen Fragmente zu 7066 bp (Pfeil 2) nachgewiesen werden, wenn
die gesamte Vektorgrundgerüstsequenz
des Hsb-Plasmids integriert wird. Die K- und Hsb-T-DNA-Plasmide sind
in Beispiel 1 beschrieben. Die genomischen DNA-Proben in den Bahnen
1, 2 und 5 sind von Pflanzen aus anderen als den beschriebenen Experimenten
abgeleitet.
Bahn C: genomische DNA von nicht-transformierter
A. thaliana.
Plasmidbahnen: enthalten reine DNA der angegebenen
Plasmide, die mit KpnI und SacI gespalten wurden.
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Beispiele
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Beispiel 1
-
Transformation von A. thaliana (L.) Heynh
und Nicotiana tabacum (L.)
-
Die
Plasmide pK2L610 ('K'-T-DNA-Vektor; De
Buck et al. 1998), pSingle gus ('Ksb1'-T-DNA-Vektor; siehe
nachstehend) und pHSB610 ('Hsb'-T-DNA-Vektor; De
Buck et al. 1999) wurden zur Transformation der Pflanzen verwendet.
Der Vektor pSingle gus ('Ksb1') ist ähnlich dem
Vektor pHSB610 ('Hsb'), aber das Pnos-hpt-3'-nos-Fragment von
pHSB610 ('Hsb') ist gegen eine
Pnos-nptII-3'-nos-Kassette
in pSingle gus ('Ksb1') ausgetauscht. Als
selektierbarer Marker für
die Pflanzentransformation enthalten die K- und Ksb1-Vektoren das
Neomycinphosphotransferase II-Gen (nptII) und der Hsb-Vektor enthält das Hygromycinphosphotransferase-Gen
(hpt). A. thaliana wurde mit den Plasmiden K und Hsb gemäß dem Agrobacterium
vermittelten Arabidopsis-Wurzeltransformationsverfahren cotransformiert
(De Buck et al. 1999, Valvekens et al. 1988). Tabak (N. tabacum)
wurde mit dem Plasmid Ksb gemäß dem Agrobacterium
vermittelten Blattscheibentransformationsverfahren (Horsch et al.
1985) transformiert. Die transgenen Pflanzen wurden auf Medien regeneriert, die
die geeigneten Pflanzenwachstumshormone und das geeignete Selektionsmittel
enthalten. In der Serie 1 wurden 18 transgene A. thaliana-Pflanzen,
die mit den K- und Hsb-T-DNA-Vektoren
co-transformiert worden waren, erhalten. In Serie 2 wurden 36 N.
tabacum-Pflanzen, die mit dem Ksb-T-DNA-Vektor transformiert worden waren, erhalten.
In einer weiteren Serie wurden 26 N. tabacum-Pflanzen, die mit dem
Ksb-T-DNA-Vektor transformiert worden waren, erhalten.
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Beispiel 2
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Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen,
bewertet mittels PCR
-
Für die PCR-Analyse
wurde die DNA aus Blattmaterial von N. tabacum, wie von Jones et
al. (1985) beschrieben und von A. thaliana gemäß De Neve et al. (1997) isoliert.
Um die transgenen Pflanzen auf die Integration von Vektorse quenzen
durchzumustern, wurden verschiedene PCR-Reaktionen durchgeführt. Die DNA
(100 ng) wurde mit 500 ng jedes Primers in 1x Taq-Polymeraseinkubationspuffer
(Roche Diagnostics, Brüssel,
Belgien) inkubiert. Zweieinhalb Einheiten Taq-Polymerase wurden
zu einem Endvolumen von 100 μL zugegeben.
Die Proben wurden 5 min auf 94°C
vor der PCR erhitzt. Die Denaturierung wurde 1 min bei 94 durchgeführt. Die
Assoziierung trat während
2 min bei 57°C
ein, und die Extensionsreaktion wurde bei 72°C für 5 min durchgeführt, während 30
Zyklen durchgeführt
wurden. Die Primerkombinationen wurden so gewählt, dass die Anwesenheit von
mindestens 100 bp ('RB100' und 'LB100' in Tabellen 1 und
2) oder mindestens 1000 bp ('LB1000' und 'RB1000' in Tabellen 1 und
2) Vektorgrundgerüst
zu einem diagnostischen PCR-Fragment bekannter Größe führt. Um
sicherzustellen, dass das amplifizierte PCR-Produkt nicht von kontaminierenden Agrobacterium-Zellen
abgeleitet ist, die noch in dem Pflanzengewebe vorhanden wären, wurde
eine PCR-Reaktion
mit jeder DNA mit zwei Primern, die spezifisch für das chromosomale A. tumefaciens-Gen
picA sind, durchgeführt
(Yusibov et al. 1994).
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Die
A. thaliana-Pflanzen der Serie 1 enthalten 18 transgene Pflanzen,
die mit den K- und Hsb-T-DNA-Vektoren transformiert wurden. Der
K-Vektor enthält
Ränder
im natürlichen
Octopinkontext mit inneren und äußeren Randregionen
von jeweils 150 bp bzw. 255 (RB)–300 (LB) bp, wohingegen der
Hsb-Vektor nur die äußeren Randregionen
enthält.
Ein Screening auf die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen zeigte,
dass Vektorsequenzen aus den K- und den Hsb-T-DNAs in 33 % (6/18) bzw. in 61 % (11/18)
der transgenen Pflanzen gefunden wurden. Nur in einer Transformante
waren die Vektorsequenzen nicht mit der T-DNA verknüpft. Keine größeren Unterschiede
wurden in den Frequenzen des mit der RB-Region des Hsb (6/18) und der
RB-Region (4/18) des K-Plasmid
verknüpften
Vektors nachgewiesen (siehe Tabelle 1). Jedoch wurde viel mehr Vektor
an der LB-Region der Hsb-T-DNA (11/18) als der der K-T-DNA integriert.
In allen Fällen,
in denen eine integrierte T-DNA Vektorsequenzen in RB enthält, konnten
auch Vektorsequenzen in LB nachgewiesen werden.
-
Die
Tabakpflanzen der Serie 2 enthalten 36 transgene Pflanzen, die mit
einem Ksb-Vektor transformiert wurden. Dieser Vektor enthält auch
RB und LB ohne innere Randregionen und ist daher mit dem Hsb-Vektor
vergleichbar. In 53 % (19/36) der analysierten Transformanten (siehe
Tabelle 2) wurden Vektorsequenzen gefunden; diese waren nur an LB
(8/19), nur das rechte Ende der T-DNA (1/19) oder an beide Enden (10/19)
gebunden.
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In
einer weiteren Serie von Tabaktransformanten, die die Ksb-T-DNA
(Daten nicht gezeigt) enthalten, enthielten 81 % der Transformanten
(21/26) Vektorsequenzen, die an LB geknüpft waren und 61 % (16/26) Sequenzen,
die an RB geknüpft
waren (Daten nicht gezeigt). Es ist jedoch auffällig, dass von diesen 16 Transformanten,
die RB-Grundgerüstsequenzen
enthalten, 15 % auch integrierte LB-Vektorsequenzen umfassen (Daten nicht
gezeigt).
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Zusammengefasst
enthielten in den drei verschiedenen Serien von Transformanten,
in denen ein T-DNA-Vektor ohne innere Randsequenzen verwendet wurde,
mehr als 50 % der Transformanten Vektorgrundgerüst-DNA. Nur wenige Transformanten
enthielten Vektor-DNA in Verknüpfung
nur an das rechte T-DNA-Ende. Im Allgemeinen konnte, wenn an den rechten
Rand gebundene Vektor-DNA vorhanden war, auch an das linke T-DNA-Ende
gebundene Vektor-DNA nachgewiesen werden. Dies impliziert, dass
insbesondere das Durchlesen an der linksrandigen Wiederholungssequenz
infolge unzureichender Nick-Bildung für die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen
verantwortlich ist. Es ist möglich,
dass die Deletion der inneren Randregion einem Stück der T-DNA,
die in dem ursprünglichen
Ti-Plasmid vorhanden war, aus dem der Vektor abgeleitet wurde, eine
ineffiziente Nick-Bildung
des LB-Repeats verursacht, was zu einem Durchlesen hinter LB und
dem Transfer von stromabwärts
angeordneten Vektorsequenzen führt.
In Übereinstimmung
damit beobachteten Horsch und Klee (1986), dass die Gesamtrate des
Transfers von Plasmiden, die nur die 25 bp große Wiederholungssequenz enthalten,
in Pflanzen nicht so hoch ist, wie bei den größeren von Ti abgeleiteten Randfragmenten,
was nahe legt, dass zusätzliche
Sequenzen, die die randständigen
Wiederholungssequenzen umgeben, eine gewisse Rolle bei dem Transfer
spielen. Diese Autoren haben jedoch nicht die Frage einer möglichen
Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen
in transgene Pflanzen unter Verwendung des Vektors angesprochen.
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Beispiel 3
-
Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen,
bewertet mittels DNA-Gel-Blotting
-
Eine
DNA-Gel-Blotanalyse wurde im Wesentlichen nach Maniatis et al. (1982)
auf etwa 0,6 μg
genomischer DNA durchgeführt.
Die verwendeten Restriktionsspaltstellen (KpnI-SacI) sind in 5A angegeben. Als
Sonde wurde die Vektorsequenz des K-Plasmids nach Restriktion mit
KpnI und SacI verwendet. Das nicht-radioaktive "Gene images" random prime labelling-Modul und das "Gene images" CDP Star detection-Modul
(Amersham, Aylesbury, UK) wurden für die Hybridisierung bzw. die
Detektion verwendet.
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Wie
in Beispiel 2 dargestellt, wurde eine Verknüpfung sowohl der RB- als auch
der LB-Regionen an ein mindestens 1000 bp großes Vektorgrundgerüstfragment
von einem oder beiden Plasmiden in verschiedenen Transformanten
der Serie 1 beobachtet (siehe Tabelle 1). Um zu bestimmen, ob das
vollständige
binäre T-DNA-Plasmid
(T-DNA + Vektorgrundgerüstsequenzen)
in das Genom dieser Transformanten integriert ist, wurde eine DNA-Gel-Blotanalyse
mit der K-Vektorsequenz
als Sonde durchgeführt.
Wenn die ganze Vektorsequenz vorhanden ist, sollte die Restriktion
der genomischen DNA mit KpnI und SacI zur Detektion eines Fragments
von etwa 8467 bp Länge
für K (Pfeil
1 in 5B) und von 7066 bp Länge für Hsb (Pfeil
2 in 5B) führen. Die in 3B dargestellte
DNA-Gel-Blotanalyse zeigt, dass in 10 der 11 analysierten Pflanzen
die gesamte Vektorgrundgerüstsequenz
in das Pflanzengenom integriert war. Die Proben in den Bahnen 1,
2 und 5 sind von Pflanzen aus anderen als den beschriebenen Experimenten
abgeleitet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass vollständige Vektorsequenzen
häufig
in das Pflanzengenom integriert werden.
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Beispiel 4
-
Konstruktion
optimierter T-DNA-Vektoren mit modifizierten linken Rändern.
-
Beispielhaft
optimierte binäre
T-DNA-Vektoren mit Modifikationen der in 2 angegebenen
Typen wurden wie folgt konstruiert.
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In
diesem Beispiel sind alle optimierten T-DNA-Vektoren, die in diesem
Beispiel beschrieben sind, von pTHW136 abgeleitet. Der binäre Vektor
pTHW136 enthält
rechtsrandige und linksrandige Kernsequenzen vom Octopintyp, die
eine unvollständige
Wiederholungssequenz bilden und jeweils von randständigen Außenregionen
vom Octopintyp, die aus pTi15955 (224 bp im Falle der RB-Außenregion
und 268 bp im Falle der LB-Außenregion)
stammen, flankiert sind. Auf der T-DNA von pTHW136 sind eine GUS-Intronexpressionskassette (35S-Promotor-GUS-offener
Leserahmen, unterbrochen durch einen Intron-35S-Terminator) und
ein nptII selektierbares Markergen (nos-Promotor-nptII-offener Leserahmen-ocs-Terminator) lokalisiert.
-
Um
beispielhafte binäre
T-DNA-Vektoren der in 2 angegebenen Typen zu erzeugen,
wurde die GUS-Intronexpressionskassette
aus pTHW136 durch Spaltung mit XbaI und HindIII, gefolgt von einem
Auffüllen
der Überhänge mit
der Klenow-Polymerase und Religation der so erhaltenen glatten Enden,
entfernt. Der nach diesem Verfahren erhaltene Vektor wird weiter
als p0130 bezeichnet.
-
In
einem folgenden Schritt wurde das nptII-selektierbare Marker-Gen
aus p0130 durch Spaltung mit BamHI und anschließende Religation der kompatiblen
Vektor-Überhänge entfernt.
Dieses Verfahren ergab einen binären
T-DNA-Vektor, der
als pCDVIB bezeichnet wurde. Der Vektor pCDVIB enthält so eine
LB-Region vom Octopintyp, die eine Kernsequenz umfasst, die durch
eine randständige
Außenregion
flankiert ist, und so ein Konstrukt des B-Typs, wie in 2 angezeigt,
ist. Um ein Konstrukt des E-Typs, wie in 2 angezeigt, zu
erzeugen, wurden zwei lange Oligo nukleotide, prmCDVIBIF und prmCDVIBIR,
mit den folgenden Sequenzen entwickelt:
5'(1) CATGGAGCGGCGGCAGGATATATTCAATTGTAAATGGCTAGCGGCGGCAGG ATATATTCAATTGTAAATGGCTG(84)3' SEQ ID NO: 5); partielle
Ncol-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen, linksrandige
Kernsequenzen kursiv und einfach unterstrichen, 3'-Ende G-Rest-Teil
einer BamHI-Spaltstelle; und -prmCDVIBIR
5'(1) GATCCAGCCATTTACAATTGAATATATCCTGCCGCCGCTAGCCATTTACAATT GAATATATCCTGCCGCCGCTC(84)3' (SEQ ID NO: 6);
partielle Bam-HI-Spaltstelle
in fett und doppelt unterstrichen, linksrandige Kernsequenzen kursiv
und einfach unterstrichen, 3'-Ende
C-Rest-Teil einer NcoI-Spaltstelle.
-
Die
Oligonukleotide prmCDVIB1F und prmCDVIB1R sind über eine Entfernung von 80
Nukleotiden komplementär
und ergeben nach Assoziieren ein dsDNA-Fragment mit einem 5'-NcoI-Überhang ('CATG')
an dessen 5'-Ende
(bezogen auf prmCDVIBIF) und mit einem 5'-BamHI-Überhang ('GATC')
an dessen 3'-Ende (bezogen
auf prmCDVIBIF). Dieses dsDNA-Fragment
enthält
ferner ein Tandem aus zwei LB-Kernsequenzen vom
Octopintyp entsprechend den Nukleotiden 12–33 und 46–67 von prmCDVIB1F. Beide LB-Kernsequenzen sind
stromaufwärts
und stromabwärts
durch weitere 6 Basenpaare, die aus dem natürlichen LB von pTi15955 stammen
und identisch wie in pTiAch5 (Gielen et al. 1984) sind, extendiert.
Die Wiederholungssequenzen in dem Tandem der LB-Kernsequenzen sind somit durch 12 bp
getrennt. Das dsDNA-Fragment
mit den tandemartig angeordneten LB-Kernsequenzen wurde stromaufwärts von
und benachbart zu der LB-Kernsequenz von
p0130, das mit NcoI und BamHI gespalten worden war, insertiert,
was pCDVIB1 ergab. pCDVIB1 enthält somit
eine linke Randregion vom Octopintyp, die eine LB- Außenregion
und drei tandemartig angeordnete LB-Kernsequenzen umfasst.
-
Um
ein Konstrukt des in 2 angegebenen A-Typs zu erzeugen,
wurden zwei lange Oligonukleotide, prmCDVIB2F und prmCDVIB2R, mit
den folgenden Sequenzen erzeugt:
5'(1) CATGGCCGGGAAATCTACATGGATCAGCAATGAGTATGATGGTCAATATGGA GAAAAAGAAAGAGTAATTACCAATTTTTTTTCAATTCAAAAATGTAGATGTCCG
(116)3' (SEQ ID
NO: 7); partielle NcoI-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen;
3'-Ende G-Rest-Teil
einer BamHI-Spaltstelle; und
-pCDVIB2R:
5'(1) GATCCGGACATCTACATTTTTGAATTGAAAAAAAATTGGTAATTACTCTTTC TTTTTCTCCATATTGACCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGC
(116)3' (SEQ ID
NO: 8); partielle BamHI-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen,
3'-Ende C-Rest-Teil
einer NcoI-Spaltstelle.
-
Die
Oligonukleotide prmCDVIB2F und prmCDVIB2R sind über eine Entfernung von 112
Nukleotiden komplementär
und ergeben nach Assoziierung ein dsDNA-Fragment mit einem 5'-NcoI-Überhang ('CATG')
an dessen 5'-Ende
(bezogen auf prmCDVIB1F) und mit einem 5'-BamHI-Überhang ('GATC')
an dessen 3'-Ende (bezogen
auf prmCDVIB1F). Das dsDNA-Fragment
enthält
ferner eine Innenregion von 112 bp aus pTi15955. Dieses Fragment
wurde stromaufwärts
und benachbart zu der LB-Kernsequenz von p0130, gespalten mit NcoI und
BamHI, insertiert, wobei pCDVIB2 erhalten wurde. PCDVIB2 enthält so eine
LB-Region vom Octopintyp, die eine LB-Kernsequenz eingebettet in äußere und
innere LB-Regionen
umfasst.
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Ein
weiteres T-DNA-Vektorkonstrukt wurde mit einem modifizierten LB
erzeugt und kombiniert die Merkmale der Konstrukte vom E-Typ und
F-Typ, wie in 2 angegeben. Eine integrale
LB-Region vom Nopalintyp wurde als 331 bp langes BclI-EcoRI-Fragment
des binären
T-DNA-Vektors pPZP200 erhalten. Dieses Fragment umspannt die äußere LB-Region
vom Nopalintyp, die LB-Kernsequenz und die innere LB-Region, die
aus pTiC58 stammt (Gielen et al. 1999). Die LB-Region vom Nopalintyp,
wurde stromaufwärts
von und benachbart zu der LB-Region vom Octopintyp von pCDVIB2 (enthaltend
tandemartig wiederholte LB-Kernsequenzen vom Octopintyp), die mit
BamHI (lokalisiert am 3'-Ende
des LB-Kernsequenz-Tandems,
bezogen auf prmCDVIB2F) und EcoRI, gespalten worden war, insertiert,
wodurch pCDVIB3 erhalten wurde. pCDVIB3 enthält so eine LB-Region, die eine
Kopie einer integralen LB-Region vom Octopintyp mit drei tandemartig
angeordneten Kernsequenzen und einer Kopie einer integralen LB-Region
vom Nopalintyp umfasst.
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Alle
beschriebenen beispielhaften T-DNA-Vektoren mit einer modifizierten
LB-Region, d.h. pCDVIB, pCDVIB1, pCDVIB2 und pCDVIB3 dienen als
Ausgangspunkt, um ein Gen bzw. Gene von Interesse und/oder ein selektierbares
Marker-Gen bzw. -Gene zwischen RB und LB der T-DNA-Vektoren zu insertieren.
-
Das
selektierbare Marker-Gen Neomycinphosphotransferase (nptII) unter
der Kontrolle des Nopalinsynthease-(nos)-Promotors (Pnos-nptII-3'ocs) und der β-Glucuronidase(gus)-Expressionskassette
unter der Kontrolle des 35S-Blumenkohlmosaikvirus-Promotors
(P35S-gus-3'nos)
wurden zwischen RB und LB der T-DNA-Vektoren insertiert.
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Die
nptII-gus-Kassette wurde von dem Plasmid pXD610 (De Loose et al.,
1995) als ein EcoRI-AgeI-Fragment abgeleitet. Dieses Fragment wurde
in die SalI/EcoRI-Spaltstellen von pCDVIB; pCDVIB1; pCDVIB2 und
PCDVIB3 insertiert. Um kompatible klebrige Enden zu erhalten, wurden
zwei Adapteroligonukleotide zwischen den offenen AgeI- und SalI-Spaltstellen mit
den folgenden Sequenzen verwendet:
*Napod3:
CCGGTGGCTCGAGG
(SEQ ID NO: 9); partielle AgeI-Spaltstelle in fett, 3'-Ende, G-Rest, Teil
von SalI-Spaltstelle
und
*Napod4:
TCGACCTCGAGCCA (SEQ ID NO: 10), partielle
SalI-Spaltstelle unterstrichen, 3'-Ende, A-Rest, Teil einer AgeI-Spaltstelle.
-
Die
Oligonukleotide Napod3 und Napod4 sind über eine Entfernung von 8 Nukleotiden
komplementär und
ergeben nach Assoziierung ein dsDNA-Fragment mit einem 5'-AgeI-Überhang
('CCGG') an dessen 5'-Ende (bezogen auf
Napod3) und mit einem SalI-Überhang
('TCGA') an dessen 3'-Ende (bezogen auf
Napod3). Die so erhaltenen Vektoren wurden als pCDVIB+gusnpt, pCDVIB1+gusnpt,
pCDVIB2+gusnpt, pCDVIB3+gusnpt bezeichnet.
-
Beispiel 5
-
Konstruktion von optimierten T-DNA-Vektoren
mit integrierten Rekombinationsstellen.
-
Beispielhaft
optimierte binäre
T-DNA-Vektoren der in 3 angegebenen Typen werden wie
folgt konstruiert. In diesem Beispiel ist der optimierte binäre T-DNA-Vektor
von pCDVIB (siehe Beispiel 4) abgeleitet.
-
Eine
Strategie zur Einschleusung von Rekombinationsstellen umfasst:
- 1. Entwickeln von Paaren von Primern für die PCR-Amplifikation von
Vektordomänen
stromaufwärts
von RB und stromabwärts
von LB. Die Domänen
sollen eine einzigartige Restriktionsspaltstelle stromaufwärts von
RB (z.B. die NarI-Spaltstellen in dem pVS1-Replikon, enthalten in
dem Vektorgrundgerüst
von pCDVIB) und stromabwärts
des LB (z.B. die BclI-Spaltstelle in dem Sm/Sp-Resistenzmarker,
enthalten in dem Vektorgrundgerüst
von pCDVIB) umfassen. Die an oder nahe bei RB oder LB lokalisierten
PCR-Primer werden so entwickelt, dass sie eine einzigartige 5'-Restriktionsspaltstelle, gefolgt von
der Rekombinationsstelle (z.B. der FRT-Stelle) in ihrer richtigen
Orientierung (als direkte Wiederholungssequenzen außerhalb
der T-DNA-Ränder
im Falle von FRT-Stellen) und gefolgt von einem Teil der Außenregionen
des Rands enthalten. Die so erhaltenen PCR-Produkte werden anschließend mit
den geeigneten Enzymen verdaut.
- 2. Entwickeln komplementärer
Oligonukleotidpaare (ähnlich
wie in Beispiel 4) nach Assoziieren, was dsDNA-Moleküle ergibt, die entweder die
RB- oder die LB-Kernsequenz
umfassen, und mit einem Überhang komplementär zu der
einzigartigen 5'-Restriktionsspaltstelle
der Primer in (1), lokalisiert an oder in der Nähe zu den Rändern, und mit einem zweiten Überhang
komplementär
zu einer einzigen Restriktionsspaltstelle stromabwärts der
RB-Kernsequenz (z.B.
ScaI in pCDVIB) oder komplementär zu
einer einzigartigen Restriktionsspaltstelle stromaufwärts der
LB-Kernsequenz (z.B. NcoI in pCDVIB) versehen ist.
- 3(a) Spalten von pCDVIB mit NarI (in dem pVS-Replikon) und ScaI
(stromabwärts
der RB-Kernsequenz), gefolgt von einer trimolekularen Ligierung
des 1) erhaltenen Vektors, mit 2), dem gespaltenen PCR-Produkt,
das das deletierte pCDVIB-Fragment umfasst und die Rekombinationsstellen
einführt,
und 3) der dsDNA, basierend auf den assoziierten Oligonukleotiden
und Wiedereinschleusen der RB-Kernsequenz.
- 3(b) Spalten des abschließend
in (3a) erhaltenen Vektors mit BclI (im Sm/Sp-Resistenzmarker) und
NcoI (stromaufwärts
der LB-Kernsequenz), gefolgt von einer trimolekularen Legierung
des 1) so erhaltenen Vektors mit 2), dem gespaltenen PCR-Produkt,
das das deletierte pCDVIB-Fragment umfasst und die Rekombinationsstellen
einführt,
und 3) der dsDNA, basierend auf den assoziierten Oligonukleotiden,
und Wiedereinschleusen der LB-Kernsequenz.
-
Die
beschriebenen beispielhaften T-DNA-Vektoren mit eingeführten Rekombinationsstellen
dienen als Ausgangspunkt, um ein Gen bzw. Gene von Interesse und/oder
ein Gen bzw. Gene für
einen selektierbaren Marker zwischen RB und LB des T-DNA-Vektors
zu insertieren.
-
Beispiel 6
-
Vorhersage der Häufigkeiten von Vektorgrundgerüsttransfer
unter Verwendung induzierter Agrobacterium-Kulturen.
-
Agrobacterium-Stämme, die
irgendeinen T-DNA-Vektor enthalten, können zur Produktion von ssT-DNA-Strängen durch
Hinzufügen
von Acetosyringon in einer Konzentration von 100 μM zum Kulturmedium
(Durrenberger et al. 1989) induziert werden. Die Produktion von
ssT-DNA-Strängen
kann unter Verwendung einer der folgenden Methoden analysiert werden
(siehe beigeschlossene Figur für
einen schematischen Überblick).
- 1. Gesamt-DNA wird aus den Agrobacterium-Zellen,
die einen gegebenen T-DNA-Vektor enthalten, isoliert. Duplizierte
nicht-denaturierende Southern-Blots (Tinland et al. 1995) von etwa
5 μg dieser
DNA, die aus den verschiedenen Agrobacterium-Stämmen isoliert wurden, werden
an zwei verschiedene Sonden hybridisiert: eine erkennt eine DNA-Sequenz,
die Teil der T-DNA ist, und eine erkennt eine DNA-Sequenz, die Teil
des Vektorgrundgerüsts
ist, das den linken Rand flankiert. Das Hybridisierungssignal der
Sonde, die die Vektorgrundgerüstsequenzen
erkennt, ist im Falle eines T-DNA-Vektors, aus dem der linke Rand mit
hoher Effizienz prozessiert ist, fehlend oder stark reduziert. Das
Hybridisierungssignal der Sonde, die die T-DNA erkennt, ist jedoch
konstant.
- 2. Gesamt-DNA wird aus den Agrobacterium-Zellen, die einen gegebenen
T-DNA-Vektor enthalten, isoliert. Zwei separate Spaltungsansätze, die
gleiche Mengen an Gesamt-DNA enthalten, werden angesetzt, eine mit
einem Restriktionsenzym, das die T-DNA an oder sehr nahe zu dem
linken Rand spaltet, der andere mit einem Restriktionsenzym, das
innerhalb der T-DNA-Sequenz spaltet. Die ssT-DNA-Stränge werden
jedoch intakt bleiben. Spezifische Primerpaare werden in einer quantitativen
PCR verwendet, um eine aus der T-DNA stammende Sequenz und eine
aus dem Vektor stammende Sequenz stromabwärts des linken Rands zu amplifizieren.
Wieder wird keines oder viel weniger Vektorgrundgerüst-Amplifikationsprodukt
im Falle eines T-DNA-Vektors
erhalten, aus dem der linke Rand mit hoher Effizienz prozessiert
ist. Die Mengen an T-DNA-spezifischem
Amplifikationsprodukt sind jedoch konstant.
-
Für beide
Typen von Analysen wird eine zusätzliche
GFP-(grünes fluoreszierendes
Protein)Expressionskassette unmittelbar stromabwärts des linken Rands der zwei
verschiedenen T-DNA-Vektoren kloniert. Diese Kassette liefert eine
vollständig
bekannte "Vektorgrundgerüst"-Sequenz stromabwärts des
linken Rands. Die GUS-Expressionskassette wird als T-DNA-spezifisches
Target verwendet. Beide Expressionskassetten enthalten ein Intron
in den GFP- und den GUS-codierenden
Regionen, um die Expression beider Marker in Agrobacterium zu verhindern.
-
In 6 sind
beide experimentellen Anordnungen schematisch gezeigt. Über der
durchgezogenen schwarzen Linie, die den T-DNA-Vektor bezeichnet,
ist der Hybridisierungsansatz gezeigt, und unter der durchgezogenen
Linie ist der quantitative PCR-Ansatz gezeigt.
-
Beispiel 7
-
Frühe
Analyse der Transfersequenzen des Vektorgrundgerüsts in Pflanzenzellen
-
Die
in Beispiel 6 dargestellten Konstrukte, die eine zusätzliche
GFP-Expressionskassette stromabwärts
des linken Rands enthalten, werden in einem Assay auf vorübergehende
Expression zur Bewertung des Transfers des Vektorgrundgerüsts in die
Pflanzenzellen verwendet. Dazu werden Arabidopsis-Wurzelfragmente
mit Agrobacterium (De Buck et al. 1999, Valvekens et al. 1988),
das einen vorstehend beschriebenen T-DNA-Vektor enthält, transformiert.
Nach 3 Tagen Co-Kultivation werden die Wurzeln zuerst auf vorübergehende
Expression von GFP, gefolgt von einer Bewertung von vorübergehend
exprimiertem GUS, bewertet. Der Gehalt an GFP-Expression ist niedrig
oder Null im Falle eines T-DNA-Vektors, aus dem der linke Rand mit
hoher Effizienz prozessiert ist. Die Gehalte an GUS-Aktivitäten sind
jedoch konstant.
-
Alternativ
wird das Verfahren der reversen Transkription, gefolgt von PCR,
zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Gehalte an vorübergehend
akkumulierten GFP- und
GUS-Iranskripten befolgt (Narasimhulu et al. 1996). Wieder wird
kein oder viel weniger GFP-spezifisches Amplikationsprodukt im Falle eines
T-DNA-Vektors, aus dem der linke Rand mit hoher Effizienz prozessiert
ist, erhalten. Die Mengen an GUS-spezifischem Amplifikationsprodukt
sind jedoch konstant.
-
Beispiel 8
-
Erzeugung von Unempfindlichkeit der transformierten
Pflanzen gegenüber
integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen.
-
Pflanzen
(z.B. Arabidopsis) werden mit dem beispielhaften T-DNA-Vektor von
Beispiel 5, der die FRT-Rekombinationsstellen enthält, transformiert
(siehe Beispiel 1).
-
Regenerierte
Pflanzen werden auf Integration von Vektorgrundgerüst gemäß einem
der in den Beispielen 2–3
oder 6–7
beschriebenen Verfahren getestet, und transgene Pflanzen, die die
T-DNA und Vektorgrundgerüst
in ihrem Genom enthalten, werden selektiert.
-
Beim
Blühen
wird ein Satz der selektierten transgenen Pflanzen mit Pollen, der
von einer anderen transgenen Pflanze, die konstitutiv die FLP-ortsspezifische
Rekombinase exprimiert, stammt, kreuzbestäubt, während ein zweiter Satz ausgewählter transgener
Pflanzen mit Pollen, der von einer Wildtyp-Pflanze stammt, kreuzbestäubt wird.
Die Samen werden gewonnen und auf Medium, das ein Selektionsmittel
enthält,
ausgesät. Die überlebenden
Pflanzen (infolge des selektierbaren Markers in der T-DNA) beider
Kreuzungen werden erneut auf die Anwesenheit von T-DNA und auf die
Anwesenheit von Vektorgrundgerüst
analysiert. In einem wesentlichen Teil der Nachkommen der Kreuzungen
unter Beteiligung des FLP-exprimierenden Elternteils und unter Erhalt
der T-DNA sind die Vektorgrundgerüstsequenzen entfernt. In den
Nachkommen der Kreuzungen unter Beteiligungen der Wildtyp-Eltern
und unter Erhalt der T-DNA sind die Vektorgrundgerüstsequenzen
immer noch vorhanden.
-
Beispiel 9
-
Klonierung des virD-Locus und Einfluss
einer Extrakopie des Locus auf den Transfer des Vektorgrundgerüsts.
-
Die
Sequenzen der virD-Loci vom Octopintyp und Nopalintyp sind bekannt
(Yanofsky et al. 19986, Jayaswal et al. 1987; bzw. Wang et al. 1990).
Spezifische Primer werden entwickelt, um die PCR-Amplifikation der
vollständigen
virD-Loci zu ermöglichen.
Diese Loci werden anschließend
in ein Plasmid, das das P15a-Replikon trägt (Chang und Cohen 1987) und
einen von pAlter (Promega) abgeleiteten Tetracyclin-Resistenzmarker
trägt,
subkloniert. Die Plasmide werden anschließend in Agrobacterium, das
einen T-DNA-Vektor
enthält, überführt. Der
Transfer der Vektorgrundgerüstsequenzen
durch die Agrobacterium-Stämme
wird gemäß einem
der in den Beispielen 2, 3, 5 oder 6 beschriebenen Verfahren analysiert.
-
Beispiel 10
-
Bestimmung der Frequenz der Initiation
des Transfers am linken Rand
-
Pflanzen
werden mit den in
2 beschriebenen T-DNA-Vektoren transformiert.
Gesamt-DNA wird präpariert
und drei Primersätze
werden synthetisiert, um verschiedene PCR-Reaktionen durchzuführen. Der erste
Primersatz amplifiziert ein internes T-DNA-Fragment, das der Wiederholungssequenz
am linken Rand benachbart ist (PCR-Fragment 1). Der zweite Primersatz
amplifiziert ein T-DNA/Vektorfragment,
das die linksrandige Region der T-DNA und die Vektorregion benachbart
zu der linksrandigen Wiederholungssequenz umfasst (PCR-Fragment
2). Schließlich
amplifiziert der dritte Primersatz ein Vektorfragment, das der linksrandigen
Wiederholungssequenz benachbart ist (PCR-Fragment 3). In Abhängigkeit
davon, ob der Vektortransfer aus einem Durchlesen am linken Rand
oder der Initiation am linken Rand entstammt, werden verschiedene PCR-Fragmente amplifiziert.
Wenn nur das PCR-Fragment 1 vorhanden ist, begann der T-DNA-Transfer
am rechten Rand und endete am linken Rand, und keine Vektor-DNA
wurde transferiert. Wenn die PCR-Fragmente 1, 2 und 3 vorhanden
sind, begann der T-DNA-Transfer am rechten Rand, aber stoppte nicht
am linken Rand. Wenn die PCR-Fragmente 1 und 3, aber nicht das Fragment
2, vorhanden sind, startete der Vektortransfer am linken Rand, unabhängig vom
T-DNA-Transfer vom rechten Rand. Die Durchführung dieser verschiedenen
PCR-Reaktionen für etwa 50
Transformanten ergibt so die Häufigkeit
des Durchlesens am linken Rand und die Häufigkeit der Initiation an
der linksrandigen Wiederholungssequenz. Die Häufigkeit des Durchlesens und
die Initiation von Vektortransfer werden für die verschiedenen T-DNA-Vektoren
mit der linksrandigen Wiederholungssequenz in verschiedenen Kontexten
bestimmt. Tabelle 1. Anwesenheit (+) oder Abwesenheit
(–) von
Vektorsequenzen, die mit LB und RB der T-DNA in den transgenen A.
thaliana-Pflanzen, die mit den K- und Hsb-T-DNA-Vektoren co-transformiert wurden, verknüpft sind.
Anzahl der CoTransformanten | LB100 | LB1000 | RB100 | RB1000 | LB100 | LB1000 | RB100 | RB1000 | PicA | Unlb |
Serie
1 (18 Pflanzen) | K | Hsb | | |
3 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | – |
1 | – | – | – | – | – | – | – | – | – | +(R) |
1 | – | – | – | – | + | – | – | – | – | +(R) |
3 | – | – | – | – | + | + | – | – | – | +(R) |
1 | – | – | – | – | + | + | – | – | – | – |
1 | + | + | – | – | – | – | – | – | – | – |
1 | – | – | – | – | + | – | + | + | – | ntc |
1 | + | + | – | – | + | – | + | – | – | nt |
2 | – | – | – | – | + | + | + | + | – | nt |
1 | + | + | + | – | – | – | – | – | – | nt |
1 | + | + | + | + | – | – | – | – | – | nt |
1 | + | + | + | + | + | + | – | – | – | nt |
1 | + | + | + | + | + | + | + | + | – | nt |
- a bezeichnet die Anzahl der
Transformanten mit einem speziellen Muster an Vektorsequenzen, die
in den transformierten Pflanzen vorhanden sind.
- b Wiederholungssequenzfragmente zum rechten (R) oder linken
(L) externen Rand sind von einem der T-DNA-Vektoren vorhanden, nicht
verknüpft
mit einem der beiden Ränder.
nicht getestet
Tabelle
2. Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (–) von Vektorsequenzen, die
mit LB und RB der T-DNA in den transgenen N. tabacum-Pflanzen, die
mit dem Ksb-T-DNA-Vektor transformiert wurden, verknüpft sind. Anzahl
der Co-Transformantena | LB100 | LB1000 | RB100 | RB1000 | PicA | Unlb |
Seite
2 (36 Pflanzen) | Ksb | | |
17 | – | – | – | – | – | – |
3 | + | – | – | – | – | – |
2 | + | + | – | – | – | +(R) |
3 | + | + | – | – | – | – |
1 | – | – | + | + | – | – |
1 | + | – | + | – | – | ntc |
1 | + | + | + | – | – | nt |
8 | + | + | + | + | – | nt |
-
- a bezeichnet die Anzahl
der Transformanten mit einem speziellen Muster an Vektorsequenzen,
die in den transformierten Pflanzen vorhanden sind.
- b Wiederholungssequenzfragmente zum
rechten (R) oder linken (L) externen Rand sind von einem der T-DNA-Vektoren
vorhanden, nicht verknüpft
mit einem der beiden Ränder.
nicht getestet
-
Referenzen
-
- EP0332104 Montoya,
A., Duesing, J., Harms, C., Meins, F., Payne, G., Ryals, J. and
Sperisen, C. 1989. Chemically regulatable DNA sequences and genes
and uses thereof.
- EP0823480 Gaelweiler,
L., Palme, K., Grosskopf-Kroiler, D., Schell, J. and Moore, I. 1998.
Controlled gene expression in plants.
- US5527695 Hodges
T.K. and Lyznik L. 1996. Controlled modification of eukaryotic genomes.
- US5801027 Ramsay,
N., Bennett, M. and May, S. 1998. Method of using transactivation
proteins to control gene expression in transgenic plants.
- WO90/08826 Bright,
S.W.J., Greenland, A.J., Schuch, W.W. and Bridges, I.G. 1990. Gene
switch.
- WO97/12046 Hansen,
G. and Chilton, M.-D. 1997. Improved integration of exogenous DNA
delivered to eukaryotic cells.
- WO97/30164 Haseloff,
J.P. and Hodge, S. 1997. Improvements in or relating to gene expression.
- WO98/45455 Beijersbergen,
A.G., de Groot, M.J.A., Gouka, R.J., Hooykaas, P.J. and Bundock,
P. 1998. Agrobacterium-mediated transformation of moulds, in particular
those belonging to the genus Aspergillus.
- WO98/59062 Liu,
Z.-B. and Odell, J.T. 1998. Specific gene activation by chimeric
GAL4 transcription factors in stable transgenic plants.
- WO99/01563 Stuiver,
M.H., Ponstein, A.S., Ohl, S.A., Goddijn, O.J.M., Simons, L.H.,
Dekker, B.M.M., Hoekstra, S. and Tigelaar, H. 1999. Plasmids for
plant transformation and method for using the same.
- WO99/14348 Lefebvre,
D., Ko, K., Ko, Z. and Tremblay, L. 1999. In planta transformation
of plants.
- WO99/23202 Ow, D.,
and Srivastava, V. 1999. Resolution of complex integration patterns
to obtain single copy transgenes.
- WO99/25821 Baszczynski,
C.L., Bowen, B.A., Peterson, D.J. and Tagliani, L.A. 1999. Compositions
and methods for genetic modification of plants.
- WO99/25840 Baszczynski
C.L., Lyznik L., Gordon-Kamm W.J., Rao A.G., Tagliani, L.A. and
Guan, X. 1999. A novel method for the integration of foreign DNA
into eukaryotic genomes.
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A. and Hooykaas,
P.J. 1995. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens
to Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 14: 3206–3214.
- Caplan, A.B., Van Montagu, M. and Schell, J. 1985. Genetic analysis
of integration mediated by single T-DNA borders. J Bacteriol 161,
655–664.
- Chang, A.C. and Cohen, S.N. 1987. Construction and characterization
of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A
cryptic miniplasmid. J Bactedol 134: 1141–1156.
- Clough, S.J. and Bent, A.F. 1998. Floral dip: a simplified method
for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J 16: 735–743.
- Cluster, P.D., O'Dell,
M., Metzlaff, M. and Flavell, R.B. 1996. Details of T-DNA structural
organization from a transgenic Petunia population exhibiting co-suppression.
Plant Mol Biol 32: 1197–1203.
- Dale, E.C. and Ow, D.W. 1990. Intra- and intermolecular site-specific
recombination in plant cells mediated by bacteriophage P1 recombinase.
Gene 91: 79–85.
- De Buck, S., Jacobs, A., Van Montagu, M. and Depicker, A. 1998.
Agrobacierium fumefaciens transformation and cotransformation frequencies
of Arabidopsis thaliana root explants and tobacco protoplasts. Mol
Plant-Microbe Interact 11: 449–457.
- De Buck, S., Jacobs, A., Van Montagu, M. and Depicker, A. 1999.
The DNA sequences of T-DNA junctions suggest that complex T-DNA
loci are formed by a recombination process resembling T-DNA integration.
Plant J (in press)
- de Groot, M.J., Bundock, P., Hooykaas, P.J. and Beijersbergen,
A.G. 1998. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of
filamentous fungi. Nat Biotechnol 16: 839–842.
- De Neve, M., De Buck, S., Jacobs, A., Van Montagu, M. and Depicker
A. 1997. T-DNA integration patterns in co-transformed plant cells
suggest that T-DNA repeats originate from ligation of separate T-DNAs.
Plant J 11: 15–29.
- Deng, W., Chef, L., Peng, W.T., Lang, X., Sekiguchi, S., Gordon,
M.P., Comai, L. and Nester, E.W. 1999. VirE1 is a specific molecular
chaperone for the exported singlestranded-DNA-binding protein VirE2
in Agrobacterium. Mol Microbiol 31: 1795–1807.
- Durrenberger, F., Crameri, A., Hohn, B. and Koukolikova-Nicola,
Z. 1989. Covalently bound VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens
protects the T-DNA from exonucleolytic degradation. Proc Natl Acad
Sci USA 86: 9154–9158.
- Errampali, D., Patton, D., Castle, L., Mickelson, K., Hansen,
K., Schnall, J., Feldmann, K. and Meinke, D. 1991. Embyrogenic lethals
and T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis. Plant Cell 3:
149–157.
- Fedoroff, N.V. and Smith, D.L. 1993. A versatile system for
detecting transposition in Arabidopsis. Plant J 3: 273–289.
- Feldmann, K.A. 1991. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis
a mutational spectrum. Plant J 1:71-82.
- Gelvin, S.B. 1998a. The introduction and expression of transgenes
in plants. Curr Opin Biotechnol 9: 227–232.
- Gelvin, S.B. 1998b. Agrobaclerium VirE2 proteins can form a
complex with T strands in the plant cytoplasm. J Bacteriol 180:
4300–4302.
- Ghai, J. and Das, A. 1989. The virD operon of Agrobactorium
tumefaciens Ti plasmid encodes a DNA-relaxing enzyme. Proc Natl
Acad Sci USA 86: 3109–3113.
- Gheysen, G., Angenon, G. and Van Montagu, M. 1998. Agrobacterium-mediated
plant transformation: a scientifically intriguing story with significant
applications. In K. Lindsey (Ed.), Transgenic Plant Research. Harwood Academic
Publishers, Amsterdam, pp. 1–33.
- Gielen, J., De Beuckeleer, M., Seurinck, J., Deboeckl, F., De
Greve, H., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. 1984. The
complete nucleotide sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium
tumefaciens plasmid pTiAch5. EMBO J 3: 835–846.
- Gielen, J., Terryn, N., Villaroel, R. and Van Montagu, M. 1999.
Complete nucleotide sequence of the T-DNA region of the plant tumour-inducing
Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiC58. J Exper Bot 50: 1421–1422.
- Gouka, R.J., Gerk, C., Hooykaas, P.J., Bundock, P., Musters,
W., Verrips, C.T. and de Groot, M.J. 1999. Transformation of Aspergillus
awamori by Agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination.
Nat Biotechnol 17, 598–601.
- Guralnick, B., Thomsen, G. and Citovsky, V. 1996. Transport
of DNA into the nuclei of Xenopus oocytes by a modified VirE2 protein
of Agrobacterium. Plant Cell 8: 363–373.
- Hansen, G. and Chilton, M.-D. 1996. 'Agrolistic' transformation of plant cells: integration
of T-strands generated in planta. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14978–14983.
- Hansen, G., Shilito, R.D. and Chilton, M.D. 1997. T-strand integration
in maize protoplasts after codelivery of a T-DNA substrate and virulence
genes. Proc Natl Acad Sci USA 94: 11726–11730.
- Hanson, B., Engler, D., Moy, Y., Newman, B., Ralston, E. and
Gutterson, N. 1999. A simple method to enrich an Agrobacterium-trans
formed population for plants containing only T-DNA sequences. Plant
J 19: 727–734.
- Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers,
S.G. and Fraley, R.T. 1985. A simple and general method for transferring
genes into plants. Science 227: 1229–1231.
- Horsch, R.B. and Klee, H.J. 1986. Rapid assay of foreign gene
expression in leal discs transformed by Agrobacterium tumefaciens:
role of T-DNA borders in the transfer process. Proc Natl Acad Sci
USA 83: 4428–4432.
- Iglesias, V.A., Moscone, E.A., Papp, I., Neuhuber, F., Michalowski,
S., Phelan, T., Spiker, S. Matzke, M. and Matzke, A.J.M. 1997. Molecular
and cytogenetic analyses of stably and unstably expressed transgene
loci in tobacco. Plant Cell 9: 1251–1264.
- Jayaswal, R.K., Veluthambi, K., Gelvin, S.B. and Slightom, J.L.
1987. Double-stranded cleavage of T-DNA and generation of single-stranded
T-DNA molecules in Escherichia coli by a virD-encoded border-specific
endonuclease from Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 169: 5035–5045. Jakowitsch,
J., Papp, I., Moscone, E.A., van der Winden, J., Matzke, M. and
Matzke,
- A.J.M. 1999. Molecular and cytogenetic characterization of a
transgene locus that induces silencing and methylation of homologous
promoters in trans. Plant J 17: 131–140.
- Jen, G.C. and Chilton, M.D. 1986a. Activity of T-DNA borders
in plant cell transformation by mini-T plasmids. J Bacteriol 166:
491–499.
- Jen, G.C. and Chilton, M.D. 1986b. The right border region of
pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border region
in promoting T-DNA transformation. Proc Natl Acad Sci USA 83: 3895–3899.
- Jones, J. D. G., Dunsmuir, P., and Bedbrook, J. (1985). High
level expression of introduced chimaeric genes in regenerated transformed
plants. EMBO J. 4, 2411–2418.
- Koncz, C., Nemeth, K., Redei, G.P. and Schelf, J. 1992. T-DNA
insertional mutagenesis in Arabidopsis. Plant Mol. Biol 20: 963–976.
- Kononov, M.E., Bassuner, B. and Gelvin, S.B. 1997. Integration
of T-DNA binary vector 'backbone' sequences into the
tobacco genome: evidence for multiple complex patterns of integration.
Plant J 11: 945–957.
- Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1982. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor.
- Martineau, B., Voelker, T.A. and Sanders, R.A. 1994. On defining
T-DNA. Plant Cell 6: 1032–1033
(Letter to the editor).
- Matzke, A.J.M. and Matzke, M.A.1998. Position effects and epigenetic
silencing of plant transgenes. Curr Opin Plant Biol 1: 142–148.
- Mysore, K.S., Bassuner, B., Deng, X.B., Darbinian, N.S., Motchoulski,
A., Ream, W. and Gelvin, S.B. 1998. Rote of the Agrobacterium fumefaciens
VirD2 protein in T-DNA transfer and integration. Mol Plant Microbe
Interact 11: 668–683.
- Narasimhulu, S.B., Deng, X.B., Sarria, R. and Gelvin, S.B. 1996.
Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and
maize. Plant Cell 8: 873–886.
- Onouchi, H., Nishihama, R., Kudo, M., Machida, Y., and Machida,
C. (1995). Visualization of site-specific recombination catalyzed
by a recombinase from Zygosaccharomyces rouxii in Arabidopsis thaliana. Mol.Gen.Genet.
247, 653–660.
- Onouchi, H., Yokoi, K., Machida, C., Matsuzaki, H., Oshima,
Y., Matsuoka, K., Nakamura, K., and Machida, Y. (1991). Operation
of an efficient site-specific recombination system of Zygosaccharomyces
rouxii in tobacco cells. Nucleic Acids Res. 19, 6373–6378.
- Ooms, G., Bakker, A., Molendijk, L, Wullems, G.J., Gordon, M.P.,
Nester, E.W. and Schilperoort, R.A. 1982. T-DNA organization in
homogeneous and heterogeneous octopine-type crown gall tissues of
Nicotiana tabacum. Cell 30: 589–597.
- Osborne, B.I., Wirtz, U. and Baker, B. 1995. A system for insertional
mutagenesis and chromosomal rearrangement using the Ds transposon
and Cre-lox. Plant J 7: 687–701.
- Pansegrau, W. and Lanka, E. 1996. Mechanisms of intitiation
and termination reactions in conjugative DNA processing. J Biol
Chem 271: 13068–13076.
- Peralta, E.G., Hellmiss, R. and Ream, W. 1986. Overdrive, a
T-DNA transmission enhancer on the A. tumefacions tumour-inducing
plasmid. EMBO J 5, 1137–1142.
- Ramanathan, V. and Veluthambi, K. 1995. Transfer of non-T-DNA
portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from
the left terminus of TL-DNA. Plant Mol Biol
28: 1149–1154.
- Relic, B., Andjelkovic, M., Rossi, L., Nagamine, Y. and Hohn,
B. 1998. Interaction of the DNA modifying proteins VirD1 and VirD2
of Agrobacterium tumefaciens: analysis by subcellular localization
in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 95: 9105–9110.
- Rossi, L., Hohn, B. and Tinland, B. 1993. The VirD2 protein
of Agrobacterium tumefaciens carries nuclear localization signals
important for transfer of T-DNA to plant. Mol Gen Genet 239: 345–353.
- Rossi, L., Hohn, B. and Tinland, B. 1996. Integration of complete
transferred DNA units is dependent on the activity of virulence
E2 protein of Agrobacterium tumofaciens. Proc Natl Acad Sci USA
93: 126–130.
- Schlappi, M., Smith, D. and Fedoroff, N. 1993. TnpA trans-activates
methylated maize Suppressor-mutator transposable elements in transgenic
tobacco. Genetics 133: 1009–1021.
- Shaw, C.H., Watson, M.D., Carter, G.H. and Shaw, C.H. 1984.
The right hand copy of the nopaline Ti-plasmid 25 bp repeat is required
for tumour formation. Nucleic Acids Res 12: 6031–6041.
- Shurvinton, C.E., Hodges, L., Ream, W. 1992. A nuclear localization
signal and the C-terminal
omega sequence in the Agrobacterium tumefaciens VirD2 endonuclease
are important for tumor formation. Proc Natl Acad Sci USA 89:11837–11841.
- Sugita, K., Kasahara, T., Matsunaga, E., and Ebinuma, H. (2000).
Technical advance: A transformation vector for the production of
marker-free transgenic plants containing a single copy transgene
at high frequency [In Process Citation]. Plant J. 22, 461–469.
- Tinland, B., Schoumacher, F., Gloeckler, V., Bravo-Angel, A.M.
and Hohn, B. 1995. The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein
is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome.
EMBO J 14: 3585–3595.
- Valvekens, D., Van Montagu, D. and Van Lijsebettens, M. 1988.
Agrobacterium tumefaciens-medialed transformation of Arabidopsis
thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc Natl Acad
Sci USA 85: 5536–5540.
- van der Graaff, E., den Dulk-Ras, A. and Hooykaas, P.J.J. 1996.
Deviating T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants.
Plant Mol Biol 31: 677–681.
- van Haaren, M.J.J., Sedee, N.J.A., Schilperoort, R.A. and Hooykaas,
P.J.J. 1987. Overdrive is a T-region transfer enhancer which stimulates
T-strand production in Agrobacterium tumefaciens. Nucl Acids Res
15: 8983–8997.
- Van Lijsebettens, M., Vanderhaegen, R., and Van Montagu, M.
1991. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana: isolation
of a T-DNA-linked mutation that alters leaf morphology. Theor Appl
Genet 81: 277–284.
- Van Stuys, M.A., Tempe, J. and Fedoroff, N. 1987. Studies on
the introduction and mobility of the maize Activator element in
Arabidopsis thaliana and Daucus carota. EMBO J 6: 3881–3889.
- Virts, E.L. and Gelvin, S.B. 1985. Analysis of transfer of tumor-inducing
plasmids from Agrobacterium tumefaciens to Petunia protoplasts.
J. Bacteriol 162: 1030–1038.
- Wang, K., Genetello, C., Van Montagu, M. and Zambryski, P.C.
1987. Sequence context of the T-DNA border repeat element determines
its relative activity during T-DNA transfer to plant cells. Mol
Gen Genet 210: 338–346.
- Wang, K., Herrera-Estrella, A. and Van Montagu, M. 1990. Overexpression
of virD1 and virD2 genes in Agrobacterium tumefaciens enhances T-complex
formation and plant transformation. J Bacteriol 172: 4432–4440.
- Waters, V.L. and Guiney, D.G. 1993. Processes at the nick region
link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication.
Mol Microbiol 9: 1123–1130.
- Wenck, A., Czakó,
M., Kanevski, I. and Márton,
L. 1997. Frequent collinear long transfer of DNA inclusive of the
whole binary vector during Agrobacterium-mediate transformation.
Plant Mol Biol 34: 913–922.
- Wolters, A.-M.A., Trindade, L.M., Jacobsen, E. and Visser, R.G.F.
1998. Fluorescence in situ hybridization on extended DNA fibres
as a tool to analyse complex T-DNA loci in potato. Plant J 13: 837–847.
- Yanofsky, M.F., Porter, S.G., Young, C., Albright, L.M., Gordon,
M.P. and Nester, E.W. 1986. The virD operon of Agrobacterium tumefaciens
encodes a site-specific endonuclease. Cell 47: 471–477.
- Young, C. and Nester, E.W. 1988. Association of the virD2 protein
with the 5' end
of T strands in Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 170: 3367–3374.
- Yusibov, V.M., Steck, T.R., Gupta, V. and Gelvin, S.B. 1994.
Association of singlestranded transferred DNA from Agrobacterium
tumefaciens with tobacco cells. Proc Natl Acad Sci USA 91: 2994–2998.
- Ziemienowicz, A., Gorlich, D., Lanka, E., Hohn, B., and Rossi,
L. (1999). Import of DNA into mammalian nuclei by proteins originating
from a plant pathogenic bacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
96, 3729–3733.
- Zupan, J.R. and Zambryski. P. 1995. Transfer of T-DNA from Agrobacterium
to the plant cell. Plant Physiol 107: 1041–1047.