DE60034808T2 - Optimierter t-dna transfer und entsprechende vektoren - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie. Insbesondere beschreibt sie Verfahren zur Einschleusung von Fremd-DNA in das Genom von eukaryontischen Zellen, wie Pflanzenzellen. Die Besonderheit der vorliegenden Erfindung liegt im Aufbau der randständigen Wiederholungssequenzen, die agrobakteriell übertragene T-DNA flankieren, so dass das Durchlesen bis zum linken T-DNA-Rand signifikant verringert ist und/oder dass das DNA-Grundgerüst des integrierten Vektors leicht entfernt werden kann. So ist die Frequenz, transgene eukaryontische Zellen, die nur T-DNA enthalten, zu erhalten, erhöht.
  • Stand der Technik
  • Verbesserte Pflanzensorten wurden durch "klassische" Züchtung, seit der Mensch die Existenz als Nomade gegen eine permanente Residenz ausgetauscht hat, erhalten. In jüngerer Vergangenheit begannen Wissenschaftler das Verhalten des genetischen Materials während Kreuzungen zu enträtseln und Pflanzenzüchter konnten vom Wissen, das im Rahmen der Mendelschen Gesetze zur Vorhersage der Verteilung eines gegebenen genetischen Merkmals in den Nachkommen einer Kreuzung erhalten wurden, profitieren und profitieren immer noch davon. Mit dem Aufkommen der molekularen Pflanzenbiologie können Pflanzenzüchter mit stetig zunehmender Präzision neue chimäre Gene in das Genom einer Pflanze inserieren. Eine Vielzahl von Techniken ist heutzutage verfügbar, um die genetische Transformation von Pflanzen zu vermitteln, einschließlich Agrolistik, Mikroinjektion, Elektroporation, direkter Gentransfer und Beschuss mit DNA beschichteten Teilchen. Ein bevorzugtes und weit verwendetes Pflanzentransformationssystem nutzt das Bodenbakterium Agrobacterium (Zupan und Zambryski 1995, Gelvin 1998a, Gheysen et al. 1998). Heutzutage wird Agrobacterium nicht nur für Transformation von Pflanzen, sondern auch zur Transformation von Hefe, Schimmelkulturen und Fadenpilzen verwendet (Bundock et al. 1995, de Groot et al. 1998, Gouka et al. 1999, WO 98/45455 ). Es wurde ferner gezeigt, dass Komponenten der T-DNA-Produktion und des Transferapparats von Agrobacterium zum Importieren von DNA in Kerne von Säugerzellen nützlich sind, was Perspektiven für die Verwendung dieser Komponenten bei der Gentherapie eröffnet (Ziemienowicz et al. 1999). Agrobacterium überträgt jede DNA, die auf der T-DNA lokalisiert ist, in den Zellkern eukaryontischer Zellen. Diese T-DNA ist Teil des Wildtyp Ti-(im Falle von Agrobacterium tumefaciens) oder Ri-Plasmids (im Falle von A. rhizogenes). Wildtyp-T-DNA trägt die Gene, die nach Integration in das Pflanzengenom Galltumore der Baumkrone oder das Haarwurzelsyndrom im Falle von Infektionen mit A. tumefaciens bzw. A. rhizogenes verursachen. Ebenfalls auf den Wildtyp-Ti- oder -Ri-Plasmiden sind vir-Gene (Virulenzgene) lokalisiert, die durch phenolische Verbindungen der Pflanze aktiviert werden. Produkte der vir-Gene sind für den Transfer der T-DNA in das eukaryontische Genom verantwortlich. Für Transformationszwecke wird die T-DNA entmantelt (d.h. alle krankheitsverursachenden Gene werden entfernt) und die vir-Gene werden entweder in trans auf einem Helferplasmid (die T-DNA, die heterologe Gene bzw. das heterologe Gen umfasst, wird dann auf einem sekundären binären Pflanzentransformationsvektor lokalisiert) oder in cis im Falle eines co-integrierten Transformationsvektors bereitgestellt. Die heterologen Gene von Interesse werden zwischen die zwei 22 bp langen (im Falle von Octopin-Ti-Plasmiden) oder 25 bp langen (im Falle von Nopalin-Ti-Plasmiden) unvollständigen randständigen Kernsequenzen der T-DNA, die den rechten Rand (RB) und den linken Rand (LB) darstellen, die die einzigen cis-ständigen Elemente, die zur Steuerung des T-DNA-Processings notwendig sind, darstellen, kloniert. Die randständigen Kernsequenzen in RB und LB sind als unvollständige Wiederholungssequenzen organisiert.
  • Die VirD1- und VirD2-Proteine produzieren ein einzelsträngiges Nick zwischen der dritten und vierten Base am unteren Strang jeder randständigen Wiederholungssequenz (Vanofsky et al. 1986). Erhöhte Spiegel an VirD1 und VirD2 erhöhen die Produktion von T-DNA-Komplexen im Agrobacterium und führen zu einer erhöhten Pflanzentransformationseffizienz (Wang et al. 1990).
  • Für viele Jahre wurde angenommen, dass nur die DNA zwischen den Wiederholungssequenzen, die T-DNA, und nicht die bezüglich der T-DNA externe Vektor-DNA in die eukaryontische Zelle übertragen wird. Jedoch zeigt eine jüngere und ausführlichere Charakterisierung der DNA-Insertionen in transgenen Pflanzen, dass sich auch Vektorgrundgerüstsequenzen sehr häufig in das Pflanzengenom integrieren (Martineau et al. 1994, Ramanathan und Veluthambi 1995, Cluster et al. 1996, van der Graaff et al. 1996, Kononov et al. 1997, Wenck et al. 1997, Wolters et al. 1998).
  • Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben früher gefunden, dass die Integrationsfrequenz der Vektorsequenzen nicht durch die verwendete Pflanzenart oder das verwendete Transformationsverfahren beeinflusst wird. Dies entspricht der Ansicht, dass der Transfer von Vektorgrundgerüstse quenzen die Folge des Durchlesens bis hinter LB ist, ein Prozess, der in Agrobacterium-Zellen vorkommt, und höchst wahrscheinlich durch Faktoren innerhalb dieser Zellen bestimmt wird. Es sollte jedoch festgestellt werden, dass andere Forscher über eine Integration des Vektorgrundgerüsts in 33 % der Arabidopsis-Transformanten, die durch Wurzeltransformation, und in bis zu 62 % von Transformanten, die durch Vakuuminfiltration erhalten worden sind (Wenck et al. 1997), berichteten. Dies impliziert, dass das verwendete Transformationsverfahren ein weiterer Faktor sein könnte, der die Häufigkeit der Integration des Vektorgrundgerüsts beeinflusst. Es wurde berichtet, dass die Integration von Sequenzen des Vektorgrundgerüsts in vielen Pflanzenarten einschließlich Petunia (Virts und Gelvin 1985, Cluster et al. 1996), Arabidopsis (Van der Graaff et al. 1996, Wenck et al. 1997), Tabak (Ramanathan und Veluthambi 1995, Kononov et al. 1997, Wenck et al. 1997) und Kartoffel (Wolters et al. 1998) auftritt. Die Integration des Vektorgrundgerüsts ist offensichtlich unabhängig von dem Typ des Agrobacterium-Stamms, der für die Pflanzentransformation verwendet wird (Kononov et al. 1997)
  • Die Erfinder haben früher verschiedene Serien von Transformanten auf die Anwesenheit von Vektorgrundgerüstsequenzen unter Verwendung spezifischer PCR-Reaktionen und DNA-Gel-Blotanalyse analysiert. Drei verschiedene Transformationsverfahren in zwei verschiedenen Pflanzenarten wurden bewertet, nämlich Arabidopsis thaliana-Wurzel und Blatttransformation und Nicotiana tabacum-Protoplasten und Blatttransformation. Schließlich wurde der Einfluss des Replikontyps, die ColE1- und pVS1-Replikons, bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass weder die Pflanzenarten noch der zur Transformation verwendete Explantattyp, der Replikontyp oder die Selektion einen größeren Einfluss auf die Frequenz haben, mit der die Integration von Vektorsequenzen auftrat. In der Vergangenheit wurde postuliert, dass dieser Transfer von Vektor-DNA, die nicht zu der T-DNA gehört, das Ergebnis eines Durchlesens am linken Rand sein könnte, das die normale Termination des T-DNA-Transfers verhindern würde. Alternativ könnte der DNA-Transfer am linken Rand beginnen und bis zum rechten Rand fortschreiten (Ramanathan und Veluthambi, 1995; van der Graaff et al., 1996). Bei den vorstehend beschriebenen transgenen Pflanzen wurde jedoch beobachtet, dass viele Vektorgrundgerüstsequenzen in Verknüpfung an den linken Rand sowie Vektorverbindungen mit rechtsrandiger T-DNA enthalten. DNA-Gel-Blots zeigen an, dass bei den meisten dieser Pflanzen die vollständige Vektorsequenz integriert ist. Daher wurde postuliert, dass die Integration der vollständigen Vektorgrundgerüstsequenzen in das Pflanzengenom das Ergebnis eines konjugativen Transfers, der am rechten Rand initiiert wurde und anschließend unter kontinuierlichem Kopieren an den linken und rechten Rändern fortschritt, so genanntes Durchlesen, sein könnte. Dieses Modell impliziert, dass der linke Rand nicht häufig als Initiationsstelle für DNA-Transfer erkannt wird und dass der rechte Rand nicht effizient als Terminationsstelle für den DNA-Transfer erkannt wird. Diese Beobachtungen entsprechen Ergebnissen früherer Arbeiten, die zeigen, dass die rechte Randregion intrinsisch aktiver ist als die linke Randregion bezüglich der Förderung der DNA-Transformation (Jen und Chilton 1986a,b, Caplan et al. 1985). Aus allen verfügbaren Daten kann gefolgert werden, dass die Transformation des T-Strangs häufiger in der Region des rechten Rands als in der Region des linken Rands startet.
  • In der Zukunft wird es von höchster Bedeutung sein, die Integration des Vektorgrundgerüsts als Folge einer durch Agrobacterium vermittelten Transformation zu verhindern oder zu heilen bzw demgegenüber unempfindlich zu machen. Erstens verlangen die Aufsichtsbehörden, dass auf dem Markt freigesetzte transgene Pflanzen frei von Vektorgrundgerüstsequenzen sind. Solche Grundgerüstsequenzen können bakterielle Replikations-Origins, bakterielle Antibiotikaresistenz-Gene und möglicherweise eine Anzahl anderer (fremder) Gene enthalten. Die gleichen rigorosen Bedenken werden auch von Verbrauchern geäußert, die sich zunehmend solcher potentieller Gefahren in Zusammenhang mit der Pflanzenbiotechnologie bewusst werden. Zweitens ist es auch in wissenschaftlicher Hinsicht erwünscht, keine Integration des Vektorgrundgerüsts in das Genom der Pflanzen zu haben. Solche Sequenzen können die Transgenexpression beeinflussen (Iglesias et al. 1997, Matzke und Mathke 1998, Jakowitsch et al. 1999). Die Integration des Vektorgrundgerüsts stört wahrscheinlich auch T-DNA-Tagging-Experimente. Tags können beachtlich länger als erwartet sein (Martineau et al. 1994), und die Integration des Vektorgrundgerüsts könnte auch die Erklärung für die Tatsache sein, dass in einem großen Prozentsatz T-DNA getaggter Arabidopsis-Pflanzen die T-DNA mit einem mutierten Phänotyp nicht co-segregiert wird (Errampali et al. 1991, Feldmann 1991, Koncz et al. 1992, Van Lijsebettens et al. 1991).
  • Obwohl das Phänomen der gelegentlichen Integration des Vektorgrundgerüsts bereits 1982 gemäß Ooms et al. auftrat, dauerte es bis 1995 bis eine erste Lösung von Ramanathan und Veluthambi (1995) vorgeschlagen wurde: "... neue binäre Vektoren mit "Stop-Transfer-Signalen in Nachbarschaft zum linken Rand können konstruiert werden". Seit dieser Zeit versuchte man, den Mechanismus der Integration des Vektorgrundgerüsts zu verstehen. Ein möglicher Grund wurde von Wenck et al. (1997) diskutiert: "... ineffiziente Nick-Bildung kann die Folge von niedrigen Mengen an Virulenzproteinen, primär VirD2, sein". Nur sehr jüngst wurden jedoch Verfahren beschrieben, die das Durchlesen an den T-DNA-Rändern ( WO 99/01563 und von Hanson et al. (1999)) verhindern. Diese Methoden basieren darauf, dass Sequenzen außerhalb der Ränder einbezogen werden. Diese Sequenzen sind entweder Gene, die toxische Verbindungen codieren, oder Sequenzen, die mit DNA-Bindeproteinen Wechselwirken oder Sequenzen, die reich an G+C-Nucleotiden sind. Ein Hauptnachteil der in WO 99/01563 und von Hanson et al. (1999) beschriebenen Methoden ist die Tatsache, dass die Regeneration von Pflanzentransformanten, die mehr als die T-DNA-Region in ihrem Genom tragen, verhindert wird. Es ist denkbar, dass solche Methoden die gesamte Transformationseffizienz verschlechtern, d.h. niedrigere Anzahlen von Transformanten werden aus einem gegebenen Transformationsexperiment erhalten. Es wurde in der Tat von Hanson et al. (1999) berichtet, dass die Effizienz von Tabaktransformation bis zu 30 abnahm. Dennoch beschrieben Hanson et al. (1999) ihren Ansatz als nützliches Werkzeug "zur Elimination von Nicht-T-DNA-Sequenzen aus transgenen Individuen".
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Lösung für das technische Problem unerwünschter Vektorgrundgerüstintegration und bietet Vorteile gegenüber vorhandenen Methoden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung beschreibt Transformationsvektoren, die eine T-DNA mit flankierenden T-DNA-Rändern umfassen. Die T-DNA-Vektoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie so modifiziert sind, dass die genetische Transformation einer eukaryontischen Zelle nur mit der T-DNA und nicht mit Vektorgrundgerüstsequenzen erlauben. Dies wird dadurch erzielt, dass entweder der Transfer von Vektorgrundgerüstsequenzen in das Genom einer eukaryontischen Zelle verhindert wird, oder dass der Vektor von Grundgerüstsequenzen, die in das Genom einer eukaryontischen Zelle überführt wurden, befreit wird bzw. demgegenüber unempfindlich gemacht wird. Die modifizierten T-DNA-Vektoren erlauben ein effizientes Processing des linken Rands im Nick-Komplex unter Einbezug von mindestens VirD1 und VirD2 oder erlauben die Exzision transferierter Vektorgrundgerüstsequenzen.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt optimierte T-DNA-Vektoren, umfassend eine Modifikation des rechten T-DNA-Rands, umfassend eine einzelne rechtsrandige Kernsequenz, flankiert von einem rechtsrandigen Außenbereich und/oder einer Modifikation einschließlich einer Multiplikation des linken T-DNA-Rands, bezeichnet als:
    • a) eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert von einem natürlichen linksrandigen Außenbereich und einer proximalen Region innerhalb des linken Rands der T-DNA mit einer Länge von 10 bis 100 bp, bevorzugt 20–100 bp, und die an der Anzahl der A- und T-Reste angereichert ist, wobei der Prozentsatz der AT-Reste bevorzugt 60 bis 85 %, bevorzugter 64 bis 80 %, am bevorzugtesten 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78 oder 79 % beträgt, mit der Maßgabe, dass die proximale Region innerhalb des linken Rands der T-DNA nicht die des entsprechenden natürlichen linksrandigen Innenbereichs vom Octopintyps ist; oder
    • b) eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert nur durch einen natürlichen linksrandigen Innenbereich; oder
    • c) eine einzelne linksrandige Kernsequenz; oder
    • d) eine Tandemwiederholungssequenz aus mehreren linksrandigen Kernsequenzen, flankiert nur durch einen natürlichen linksrandigen Außenbereich, wobei die Tandemwiederholungssequenz bevorzugt 2–3 linksrandige Kernsequenzen enthält, wobei höhere Kopienzahlen der unvollständigen Wiederholungssequenz der linksrandigen Kernsequenz nicht ausgeschlossen sind und wobei die wiederholten linksrandigen Kernsequenzen in dem Tandem durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp, die gegebenenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen tragen, getrennt sind; oder
    • e) ein integraler linksrandiger Bereich vom Nopalintyp benachbart zu und stromaufwärts oder stromabwärts des integralen linksrandigen Bereichs vom Octopintyp.
  • Die Anmeldung beschreibt ferner optimierte T-DNA-Transformationsvektoren mit zusätzlichen DNA-Sequenzen außerhalb der randständigen Kernwiederholungssequenzen der T-DNA, was die post-transformationelle Entfernung integrierter Vektorgrundgerüstsequenzen erlaubt. Diese zusätzlichen DNA-Sequenzen modifizieren einschließlich multiplizieren die DNA-Randregionen oder Teile davon und umfassen:
    • f) Rekombinationsstellen, organisiert als Wiederholungssequenzen stromabwärts der linksrandigen Kernsequenz und stromaufwärts der rechtsrandigen Kernsequenz; oder
    • g) die DNA-Sequenzen von (f), weiter modifiziert durch Anfügen einer zweiten Kopie eines linksrandigen Bereichs, positioniert stromaufwärts von und bevorzugt benachbart zu der einzelnen rechtsrandigen Außenregion und der Rekombinationsstelle stromaufwärts der Kernsequenz der zweiten linksrandigen Region; oder
    • h) die Rekombinationsstellen von (f) mit einem Rekombinase-Gen stromabwärts der Rekombinationsstelle stromabwärts der linksrandigen Kernsequenz und bevorzugt, sofern vorhanden, benachbart zu und stromabwärts des linksrandigen Außenbereichs; oder
    • i) eine DNA-Sequenz, angeordnet stromabwärts der linksrandigen Region, wobei die DNA-Sequenz ein Rekombinase-Gen, flankiert von Wiederholungen von Rekombinationsstellen, wie in (h) definiert, und weiter eine zwei Kopie eines linksrandigen Bereichs stromabwärts der Rekombinase umfasst; oder
    • j) die DNA-Sequenz von (i) mit zusätzlichen Rekombinationsstellen, organisiert als Wiederholungssequenzen stromabwärts der zweiten linksrandigen Kernsequenz und stromaufwärts der einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz.
  • In jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen benachbart zu und stromab wärts und/oder stromaufwärts der links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen angeordnet oder sind von den links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp Länge, die gegebenenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen trägt, getrennt.
  • In jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen entweder ortsspezifische Rekombinationsstellen, die als direkte Wiederholungs- oder Transposon-Randsequenzen angeordnet sind, und das Rekombinase-Gen ist entweder ein ortsspezifisches Rekombinase-Gen oder ein Transponase-Gen.
  • Eine erste Ausführungsform der Erfindung betrifft einen T-DNA-Transformationsvektor mit einer T-DNA mit modifizierten linken und rechten flankierenden T-DNA-Rändern, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte rechte T-DNA-Rand aus einer einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz besteht, die von einem rechtsrandigen Außenbereich flankiert wird, und der modifizierte linke T-DNA-Rand besteht aus:
    • (i) einer einzelnen linksrandigen Kernsequenz, einem linksrandigen Außenbereich und einem dem Innenbereich nahe liegenden linksrandigen Bereich mit einer bevorzugten Länge von 10 bis 100 bp besteht, darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass der dem Innenbereich nahe liegende linksrandige Bereich eine größere Anzahl von A- und T-Resten aufweist, wobei der Prozentsatz der AT-Reste bei 60 bis 85 liegt,
    • (ii) einer Wiederholungssequenz der linken T-DNA-Ränder, wobei die Wiederholungssequenz zumindest einen T-DNA-Rand vom Typ Nopalin und zumindest einen linken T-DNA-Rand vom Typ Octopin umfasst, darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte linke T-DNA-Rand zumindest eine linksrandige Kernsequenz, oder
    • (iii) einen linksrandigen Außenbereich und eine Wiederholungssequenz aus wenigstens zwei linksrandigen Kernsequenzen umfasst, die durch eine Sequenz aus mindestens 10 bis 20 Basenpaaren voneinander getrennt sind.
  • Erfindungsgemäß kann in dem vorstehend genannten Vektor die Sequenz von mindestens 10–20 Basenpaaren, die die linksrandigen Kernsequenzen voneinander trennt, in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen Stopcodons tragen.
  • Zusätzlich kann der modifizierte linke T-DNA-Rand aus einer Wiederholungssequenz von linken T-DNA-Rändern bestehen, die zumindest einen integralen linksrandigen Bereich vom Typ Nopalin umfassen, der an den integralen linksrandigen Bereich vom Typ Octopin angrenzt und diesem nachgeschaltet oder vorgelagert angeordnet ist.
  • Eine zweite Ausführungsform der Erfindung betrifft einen erfindungsgemäßen Vektor, wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, worin aber die modifizierten T-DNA-Ränder darüber hinaus Rekombinationsstellen umfassen, die der linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet angeordnet sind, und Rekombinationsstellen, die der rechtsrandigen Kernsequenz vorgelagert angeordnet sind, wobei die Rekombinationsstellen als Wiederholungssequenzen organisiert sind.
  • Erfindungsgemäß kann der Vektor der zweiten Ausführungsform weiter eine zweite Reproduktion eines linksrandigen Bereichs umfassen, der dem einzelnen rechtsrandigen Außenbereich vorgelagert angeordnet ist und wobei die Rekombinationsstelle der Kernsequenz des zweiten linksrandigen Bereichs vorgelagert angeordnet ist.
  • Eine dritte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen erfindungsgemäßen Vektor, wie in der zweiten Ausführungsform beschrieben, der darüber hinaus ein Rekombinase-Gen umfassen kann, das der Rekombinationsstelle nachgeschaltet angeordnet ist, die der linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet angeordnet ist. Das Rekombinase-Gen kann angrenzend an den linksrandigen Außenbereich und diesem nachgeschaltet angeordnet sein. Erfindungsgemäß kann das Rekombinase-Gen von Wiederholungssequenzen aus Rekombinationsstellen flankiert sein, und der Vektor kann darüber hinaus eine zweite Reproduktion eines linksrandigen Bereichs umfassen, die dem von den Rekombinationsstellen flankierten Rekombinase-Gen nachgeschaltet angeordnet ist. Der Vektor kann darüber hinaus zusätzliche Rekombinationsstellen umfassen, die als Wiederholungssequenzen der zweiten linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet und der einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz vorgelagert angeordnet sind. In allen Vektoren der dritten Ausführungsform der Erfindung können die Rekombinationsstellen, angrenzend an die links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen und diesen nachgeschaltet und/oder vorgelagert angeordnet sein, oder von den links- und/oder rechtsrandigen Kernse quenzen nachgeschaltet und/oder vorgelagert durch eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 10–20 bp getrennt sein. Erfindungsgemäß kann die Sequenz mit einer Länge von mindestens 10–20 bp Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen tragen.
  • Eine vierte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen erfindungsgemäßen Vektor, wie in der dritten Ausführungsform beschrieben, wobei die als Wiederholungssequenzen organisierten Rekombinationsstellen entweder als ortsgerichtete Rekombinationsstellen definiert sind, die als direkte Wiederholungssequenzen organisiert sind oder als Transposon-Randsequenzen, die als invertierte Wiederholungssequenzen organisiert sind, und worin das Rekombinase-Gen als ortsgerichtetes Rekombinase- bzw. Transponase-Gen definiert sein kann.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst Transformationsvektoren, in denen jede der Modifikationen, wie in (i) bis (iii) definiert ist, einzeln oder in Kombination angewendet wird. Diese Transformationsvektoren umfassen Vektoren, die bei der Agrobacterium vermittelten Transformation verwendet werden, einschließlich binäre Transformationsvektoren, co-integrierte Transformationsvektoren, super-binäre Transformationsvektoren, von Ri abgeleitete Transformationsvektoren sowie T-DNA tragende Vektoren, die in der agrolistischen Transformation oder Gentherapie verwendet werden.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein Verfahren zum Erhalt von transgenen eukaryontischen Zellen, die nur mit der T-DNA tranformiert sind, wobei der Transfer von Vektorgrundgerüstsequenzen verhindert wird, wobei die opti mierten Transformationsvektoren, die eine der Modifikationen (a) bis (j) enthalten, verwendet werden.
  • Weiter wird in der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren zum Erhalt von transgenen eukaryontischen Zellen beschrieben, die nur mit der T-DNA transformiert sind, wobei die Heilung bzw. Erzeugung von Unempfindlichkeit des transformierten Vektors, der Vektorgrundgerüstsequenzen enthält, unter Verwendung der optimierten Transformationsvektoren ermöglicht wird, die DNA-Sequenzen von (f) oder (g) in Kombination mit der Zuführung einer ortsspezifischen Rekombinase oder Transponase oder DNA-Sequenzen von (h), (i) oder (j), gegebenenfalls in Kombination mit der Zufuhr einer ortsspezifischen Rekombinase oder einer Transponase enthalten. Unter Heilen bzw. Erzeugung von Unempfindlichkeit wird die Entfernung von Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors, die möglicherweise aus dem Vektor stammen, ohne Entfernen des T-DNA-Transformationsereignisses verstanden.
  • Ebenfalls Teil der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalt von transgenen Pflanzen, Hefen, Schimmelkulturen oder Fadenpilzen, die aus einer Agrobacterium vermittelten Transformation dieser Pflanzen, Hefen, Schimmelkulturen oder Fadenpilze bestehen, wobei ein Transformationsvektor aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
    • a) ein Transformationsvektor gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung; oder
    • b) ein Transformationsvektor gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung in Kombination mit der Zufuhr einer Rekombinase oder Transponase, um die sich erge benden transformierten Zellen gegenüber integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen, die eventuell aus dem Vektor entstehen, unempfindlich zu machen; oder
    • c) ein Transformationsvektor gemäß der dritten Ausführungsform der Erfindung, um die sich ergebenden transformierten Zellen gegenüber integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen, die eventuell aus dem Vektor entstehen, unempfindlich zu machen, optional in Kombination mit der Zufuhr einer Rekombinase oder Transponase; oder
    • d) ein Transformationsvektor gemäß der vierten Ausführungsform der Erfindung.
  • Ein weiteres Verfahren der Erfindung ist ein Verfahren zur Verhinderung der Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen in einer durch Agrobacterium vermittelten transformierten Zelle, der den Einsatz eines Vektors nach einer der Ausführungsformen eins bis vier der Erfindung umfasst.
  • Das Verfahren kann darüber hinaus die Erhöhung der Produktion des Nick-Komplexes, der mindestens VirD1 und VirD2 umfasst, durch das Agrobacterium umfassen. Die Nick-Komplex-Komponenten werden von dem virD-Operon (Octopintyp oder Nopalintyp) codiert. Mindestens eine Extrakopie des VirD-Locus kann in chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Einheiten, die in einem Agrobacterium-Stamm enthalten sind und darin gehalten werden, integriert werden. Die Extrakopie des VirD-Locus kann aus dem Octopintyp VirD- oder Nopalintyp VirD-Locus ausgewählt sein. Um das Durchlesen des linken Rands der T-DNA zu erhöhen, kann das Verfahren allein oder zusammen mit Transformati onsvektoren, die modifizierte T-DNA-Ränder enthalten, verwendet werden.
  • Weiter von der vorliegenden Erfindung umfasst sind beliebige Kombinationen von Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen gemäß der Erfindung, um die Integration der Vektorgrundgerüstsequenzen zu verhindern oder die Zelle demgegenüber unempfindlich zu machen, mit anderen Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen, die angewendet werden, um die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen zu verhindern oder die Zelle demgegenüber unempfindlich zu machen.
  • Rekombinante Wirtszellen, die die Transformationsvektoren, die erfindungsgemäß modifiziert sind, enthalten, wie Bakterien, bevorzugt Agrobacterium tumefaciens, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Erfindungsgemäß umfasst sind auch beliebige Kombinationen des ortsspezifischen Rekombinationssystems oder des Transponase vermittelten Rekombinationssystems der Erfindung, um gegenüber Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen unempfindlich zu machen, mit dem gleichen oder jedem anderen ortsspezifischen Rekombinationssystem oder Transponase vermittelten Rekombinationssystem, das für jeden anderen Zweck verwendet wird.
  • Erfindungsgemäß umfasst sind auch Verfahren für die agrolistische Transformation von eukaryontischen Zellen unter Verwendung eines erfindungsgemäßen T-DNA-Vektors.
  • Ebenfalls erfindungsgemäß umfasst sind Verfahren zur Gentherapie unter Verwendung eines T-DNA-Vektors, der gemäß den Ausführungsformen, die für die vorstehend genannten Vektoren definiert sind, modifiziert wurde.
  • Transgene Pflanzenzellen oder Pflanzen, die durch ein Agrobacterium vermitteltes Trans formationsverfahren, wie vorstehend definiert, erhältlich sind, ein Teil einer solchen Pflanze oder Nachkommen davon, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Transgene Hefen, Schimmelpilze oder Fadenpilze, erhältlich durch ein vorstehend definiertes durch Agrobacterium vermitteltes Transformationsverfahren sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Mit den vorstehenden und weiteren Aufgaben, Vorteilen und Merkmalen der Erfindung, die nachstehend offensichtlich werden, wird die Natur der Erfindung klarer unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung und auf die beigefügten Ansprüche verstanden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Agrobacterium vermittelte Transformation oder agrolistische Transformation von Pflanzen, Hefe, Schimmelkulturen und Fadenpilzen beruht auf dem Transfer von Teilen der Transformationsvektorsequenzen, sogenannte T-DNA, in den Zellkern und auf der Integration der T-DNA in das Genom der Eukaryonte.
  • Unter "Agrobacterium" wird ein Mitglied der Agrobacteriaceae, bevorzugter Agrobacterium oder Rhizobacterium, und am bevorzugtesten Agrobacterium tumefaciens verstanden.
  • Unter "T-DNA" oder transferierter DNA wird der Teil des Transformationsvektors verstanden, der von den T-DNA- Rändern flankiert ist, der nach Aktivierung der Agrobacterium-vir-Gene an den T-DNA-Rändern Nick-translatiert wird und als einzelsträngige DNA in den Zellkern einer eukaryontischen Zelle transferiert wird. Die Produktion des T-DNA-Strangs ist das Ergebnis eines DNA-Prozessierungsereignisses, das durch ein ortsspezifisches Nick in einem doppelsträngigen Molekül initiiert wird. Eine Familie von unter einander verwandten DNA-Prozessierungsreaktionen existiert in verschiedenen prokaryontischen Systemen. In jedem Fall ist das Substrat ein super-gecoiltes zirkuläres DNA-Molekül, und das Nick-Protein erkennt eine kurze Sequenz, spaltet an einer konservierten Stelle (konservierte Nick-Positionen und Consensus-Region 3' des Nicks) und heftet sich kovalent an das 5'-Ende des Nick-Strangs an. DNA-Prozessierungssysteme, die dieser Familie angehören, umfassen neben der Bildung von T-DNA in der und Transfer der T-DNA in die eukaryontische Zelle durch das Agrobacterium, (1) die Initiation von konjugativer DNA-Replikation und den anschließenden Transfer von Plasmiden von Gramnegativen Bakterien, (2) Initiation von Plus-Strang-Synthese während der Rolling Circle-Replikation von ϕX174-verwandten Phagen, und (3) die Initiation von Rolling-Circle-Replikation in bestimmten Plasmiden von Grampositiven Bakterien (Waters und Guiney 1993). Das DNA-Prozessierungsereignis wird durch einen Oligoprotein-Relaxosom-Komplex katalysiert. Eines der Proteine in diesem Komplex, die Relaxase, ist das Schlüsselenzym, das die Orts- und strangspezifische DNA-Spaltung (Pansegrau und Lanka 1996) katalysiert. Im Falle des konjugativen Transfers von Plasmiden bindet die Relaxase kovalent an das 5'-Ende der zu transferierenden DNA und kann keinen zweiten Nick produzieren, der für den Transfer einer einzelnen Ko pie der DNA notwendig ist. Man nimmt an, dass mindestens ein Relaxasedimer für den DNA-Transfer einer einzelnen Kopie erforderlich ist (Pansegrau und Lanka 1996).
  • Im Falle von Agrobacterium wird ein Minimum von zwei Proteinen für den Nick und den anschließenden T-DNA-Transfer benötigt. Diese Relaxosomproteine sind VirD1 und VirD2. VirD1 ist eine Typ I-Topoisomerase ohne Sequenzspezifität (Ghai und Das 1989). Das VirD2-Protein ist auch auf der Basis von Sequenzhomologie die Relaxase von Agrobacterium und wirkt als Nick-Endonuklease (Pansegrau et al. 1994). Während des Nick-Prozesses bindet sich VirD2 kovalent an beide 5'-Enden der prozessierten T-DNA an dem rechten Rand und an den Rest des T-DNA-Plasmids an dem linken Rand (Durrenberger et al. 1989, Young and Nester 1988). Sowohl der linke als auch der rechte Rand der T-DNA wird durch VirD1 und VirD2 erkannt. Starke Wechselwirkungen zwischen VirD1 und VirD2 und unter VirD2-Proteinen wurden nachgewiesen, und es wurde vorgeschlagen, dass die T-DNA-Strangverschiebung (durch DNA-Replikation) durch Erzeugen eines zweiten Nicks in Abhängigkeit von VirD2-VirD2-Interaktion beendet wird. Dies impliziert, dass separate Relaxosomkomplexe einschließlich mindestens VirD1 und VirD2 an der Prozessierung jedes der zwei T-DNA-Ränder beteiligt sein könnten (Relic et al. 1998).
  • Unter "T-DNA-Rändern", "T-DNA-Randregion" oder "Randregion" wird entweder der rechte T-DNA-Rand (RB), auch als rechter Rand bezeichnet, oder der linke T-DNA-Rand (LB), auch als linker Rand bezeichnet, verstanden. Solche Ränder umfassen eine Kernsequenz, flankiert von einem Randinnenbereich als Teil der T-DNA, die den Rand flankiert, und/oder einen Randaußenbereich als Teil des Vektorgrund gerüsts, die den Rand flankiert. Die Kernsequenzen umfassen 22 bp im Falle von Vektoren vom Octopintyp und 25 bp im Falle von Vektoren vom Nopalintyp. Die Kernsequenzen in der Region des rechten Rands und der Region des linken Rands bilden unvollständige Wiederholungssequenzen. Die randständigen Kernsequenzen sind für die Erkennung und das Prozessieren durch den Agrobacterium-Nick-Komplex, bestehend mindestens aus VirD1 und VirD2, unerlässlich. Kernsequenzen, die eine T-DNA flankieren, sind ausreichend, um den Transfer der T-DNA zu fördern. Jedoch ist die Transformationseffizienz unter Verwendung von Transformationsvektoren, die die T-DNA nur flankiert durch die Kernsequenzen tragen, niedrig. Bekanntlich modulieren die Randinnen- und -außenbereiche die Effizienz des T-DNA-Transfers (Wang et al. 1987). Ein Element, das den T-DNA-Transfer verstärkt, wurde charakterisiert und liegt im rechtrandigen Außenbereich und wird als Overdrive bezeichnet (Peralta et al. 1986, van Haaren et al. 1987). Die Kernsequenzen sind wie folgt (inn: Teil der T-DNA-Sequenz; out: Teil der Vektorgrundgerüstsequenz; Kernsequenzen sind in fetten und unterstrichenen Großbuchstaben angegeben; Gielen et al. 1984, 1999):
    -Octopin-Typ RB: inn-tgatgctgactGGCAGGATATATACCGTTGTAATttgagctcgt-out (SEQ ID NO: 1)
    -Octopin-Typ LB: out-gcggcagcggcGGCAGGATATATTCAATTGTAAAtggcttcatg-inn (SEQ ID NO: 2)
    -Nopalin-Typ RB: inn-tatcagtgttTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACctaagagaa-out (SEQ ID NO: 3)
    -Nopalin-Typ LB: out-ggctggctggTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACaaattgacg-inn (SEQ ID NO: 4)
  • Unter "integralem Randbereich" wird ein natürlich vorkommender T-DNA-Rand, umfassend die randständige Kernsequenz und sowohl den Innen- als auch den Außenbereich des Rands, verstanden.
  • Unter "T-DNA-Transformationsvektor" oder "T-DNA-Vektor" wird jeder Vektor verstanden, der eine T-DNA-Sequenz, flankiert von einem rechten und einem linken T-DNA-Rand, umfassend mindestens die rechtsrandigen bzw. die linksrandigen Kernsequenzen, und verwendet zur Transformation beliebige eukaryontische Zellen, umfasst.
  • Unter "Vektorgrundgerüstsequenz" oder "Vektorgrundgerüstsequenzen" wird die gesamte DNA eines T-DNA enthaltenden Vektors, die außerhalb der T-DNA-Ränder liegt, und insbesondere außerhalb der Nick-Stellen der unvollständigen Wiederholungssequenzen der randständigen Kernsequenz verstanden. Unter "Vektor" wird ein Transformationsvektor oder ein T-DNA-Vektor, der in einer Bakterienkultur, z.B. einer Escherichia coli-Kultur oder einer Agrobacterium-Kultur stabil gehalten wird, verstanden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Konstrukte von optimierten T-DNA-Vektoren, so dass die Integration des Vektorgrundgerüsts in das Genom einer eukaryontischen Zelle minimiert wird oder fehlt oder so ist, dass die Erzeugung von Unempfindlichkeit gegenüber der in eine eukaryontische Zelle integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen möglich ist. Die Vektoren, jedes Derivat davon oder jeder Vektor, der beliebige der Modifikationen oder jede Kombination der Modifikationen der Erfindung umfasst, kann dann als Ausgangsmaterial zur Klonierung der DNA-Sequenzen von Interesse zwischen den zwei randständigen Wiederholungssequenzen und für anschließende Anwendungen, wie Transformation z.B. einer Nutzpflanze, einer Hefe oder eines Pilzes, und zur Gentherapie verwendet werden.
  • Unter "optimiertem T-DNA-Vektor" wird ein T-DNA-Vektor bezeichnet, der so ausgestaltet ist, dass er den Transfer von Vektorgrundgerüstsequenzen in das Genom einer eukaryontischen Zelle entweder erniedrigt oder beseitigt oder unempfindlich gegenüber von Vektorgrundgerüstsequenzen, die in das Genom einer eukaryontischen Zelle transferiert worden sind, macht.
  • Bei Analysen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden (siehe Beispiele 1–3) wurde die Frequenz des Transfers des Vektorgrundgerüsts in transgenen Pflanzen verglichen, die mit T-DNA-Vektoren mit randständigen Wiederholungssequenzen in der natürlichen Octopinsequenz transformiert worden waren, und mit T-DNA-Vektoren ohne die innere randständige Region der randständigen Wiederholungssequenzen verglichen. Wesentlich mehr Integration des Vektorgrundgerüsts wurde in der Serie der transformierten Pflanzen gefunden, in denen T-DNA-Vektoren ohne innere randständige Wiederholungssequenzen verwendet wurden, als in Serien von transformierten Pflanzen, in denen vollständige innere und äußere Randregionen verwendet wurden. Es wurde weiter beobachtet, dass viele transgene Pflanzen Vektorgrundgerüstsequenzen in Verknüpfung an den linken T-DNA-Rand sowie Vektorverbindungen mit dem rechten T-DNA-Rand enthalten (siehe Beispiel 2). DNA-Gel-Blotanalysen zeigen an, dass die vollständige Vektorsequenz bei den meisten dieser Pflanzen integriert ist (siehe Beispiel 3). Ferner wird die Häufigkeit der Integration der vollständigen Vektorgrundgerüstsequenzen nicht durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der inneren Randregion beeinflusst. Diese Daten legen nahe, dass die rechtsrandige innere Region höchst wahrscheinlich keine Determinanten enthält, die für ein effizientes Nick am linken T-DNA-Rand wichtig sind. Diese Schlussfolgerung wird weiter durch frühere Ergebnisse, die von Shaw et al. (1984) erhalten wurden, substantiiert, welche anzeigen, dass eine Deletion der inneren RB-Region die Effizienz der Pflanzentransformation nicht beeinflusst. Determinanten für effiziente Nick-Bildung an dem linken T-DNA-Rand liegen somit höchst wahrscheinlich innerhalb LB selbst. Es wird angenommen, dass die Integration von vollständigen Vektorgrundgerüstsequenzen im Pflanzengenom das Ergebnis eines konjugativen Transfers ist, der am rechten Rand initiiert wurde und anschließend unter kontinuierlichem Kopieren des linken und des rechten Rands fortschreitet, so genanntes Durchlesen (read-through). Der Transfer des Vektorgrundgerüsts kann auch die Folge der Erkennung von LB als Ausgangspunkt für DNA-Transfer und fortgesetztes Kopieren an RB bis LB sein (van der Graaff et al. 1996). Es ist daher wichtig, LB-Elemente zu identifizieren, die an der effizienten Nick-Bildung in der Wiederholungssequenz des LB-Kerns vorhanden sind. So könnte z.B. eine teilweise oder vollständige Deletion der linksrandigen Innenregion und/oder Außenregion die linksständige Kernwiederholungssequenz in einen Kontext bringen, der dessen Affinität für und Erkennung durch VirD1 und VirD2 erhöht. Eine auffällige Beobachtung in dieser Hinsicht stammt aus einer Analyse der linken (und rechten) Randsequenzen der Transformationsvektoren, die in den in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Experimenten verwendet wurden. In 1 sind die Prozentsätze für die A- und T-Reste pro 100 bp Bereich um (und nicht einschließlich) die LB- und RB-Kernwiederholungssequenzen sowohl für Transformationsvektoren mit als auch ohne Kontext der natürlichen Innenregion des Rands angegeben. Die beachtliche Beobachtung besteht in der Tatsache, dass der Prozentsatz von AT-Resten der LB-proximalen 100 bp der na türlichen Innenregion (K-T-DNA-Vektor in 1) beachtlich höher ist als der Prozentsatz der AT-Reste der LB-proximalen 100 bp des Vektors, in dem die natürliche Innenregion deletiert ist (Hsb-T-DNA-Vektor in 1), d.h. 64 %, verglichen mit 56 % jeweils. Wie vorstehend erwähnt, treten LB-Durchlesen und Teiltransfer des Vektorgrundgerüsts viel häufiger auf, wenn Pflanzen mit Hsb T-DNA-Vektoren transformiert werden, verglichen mit Pflanzentransformation mit dem K-T-DNA-Vektor. Mechanistisch ist es möglich, dass dieser niedrigere Prozentsatz der AT-Reste beträchtlich die Nick-Bildungsaktivität des LB-gebundenen Relaxosoms, einschließlich mindestens VirD1 und VirD2, attenuiert. Begleitend dazu würde die DNA-Replikationsmaschinerie, die die Verschiebung des T-DNA-Strangs bewirkt, zu relativ hohen Frequenzen in der Lage sein, das Relaxosom von dem LB vor Realisierung des Nicks zu verdrängen. Eine erhöhte Frequenz des Durchlesens an LB würde die Folge eines solchen Prozesses sein. So ist der Prozentsatz der AT-Reste der 10–100 bp (oder bevorzugt 20–100 bp langen) proximalen Region zu LB und Teil der T-DNA ein in Frage kommendes Element von LB zur Bestimmung der Effizienz der Nick-Bildung an der LB-Kernwiederholungssequenz. Damit die Effizienz der Nick-Bildung ausreichend hoch ist, muss der Prozentsatz der AT-Reste der proximalen LB-Region ausreichend hoch sein, d.h. mindestens etwa 60–85 %, bevorzugter mindestens etwa 64–80 %. Obwohl die proximalen 100 bp außerhalb der T-DNA-RB-Kernwiederholungssequenz einen ähnlichen Prozentsatz an AT-Resten enthalten, wie die proximalen 100 bp innerhalb der T-DNA-LB-Kernwiederholungssequenz, d.h. 58 %, verglichen mit 56 % (siehe 1), ist ein korrekt und hoch effizientes Prozessieren an dem RB nicht problematisch. Dies ist wahrscheinlich auf den positiven Einfluss der Over drive-Sequenz, die in der Außenregion des RB vorhanden ist, zurückzuführen (Peralta et al. 1986, van Haaren et al. 1987). Es ist nicht auszuschließen, dass Hilfsproteine des Relaxosomkomplexes an die Overdrive-Sequenz binden und den Prozess der RB-Nick-Bildung verstärken. Dies würde erneut der Situation des konjugativen Plasmidtransfers zwischen Bakterien ähneln, bei dem solche Hilfsproteine identifiziert wurden (Waters und Guiney 1993). Es ist auch nicht auszuschließen, dass Hilfsproteine, die zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht identifiziert sind, am effizienten Prozessieren von LB beteiligt sind.
  • Das erste modifizierte T-DNA-Vektorkonstrukt zur Verhinderung des vorstehend beschriebenen Vektorgrundgerüsttransfers umfasst eine proximale innere T-DNA-LB-Region, die reich an A- und T-Resten ist. Ein solcher Ansatz wird jedoch nicht für alle T-DNA-Konstrukte praktikabel sein. So ist in 2 eine Anzahl von zusätzlichen optimierten T-DNA-Vektorkonstrukten schematisch dargestellt. Die Ergebnisse der Pflanzentransformation mit dem ersten der Konstrukte von 2 sind in Beispiel 1 beschrieben. Die anderen Konstrukte beruhen auf mehreren Ansätzen, um optimierte T-DNA-Vektoren zu erhalten. Die Optimierungen liegen in Modifikationen des Aufbaus des linken Rands mit dem Ziel, die Effizienz der LB-Nick-Bildung zu erhöhen und führen zu einer Integration des Vektorgrundgerüsts in das Genom einer eukaryontischen Zelle, die stark minimiert oder fehlend ist. Bei den optimierten T-DNA-Vektorkonstrukten ist die RB-Region konstant, d.h. sie umfasst die rechtsrandige Außenregion, aber die rechtsrandige Innenregion ist deletiert. Diese rechtsrandige Region enthält die 25 bp lange RB-Kernsequenz, und die davor angeordneten 146 dp der rechtsrandigen Außenregion, abgelei tet von pTIAch5 (Gielen et al. 1984). Diese Augenregion enthält die Overdrive-Sequenz. Es ist klar, dass die rechten Randregionen in ihrem natürlichen Kontext, d.h. umfassend die rechtsrandige Innenregion, auch erfindungsgemäß verwendet werden kann. Rechte Ränder, aus denen die Randinnenregionen entfernt wurden, besitzen jedoch den Vorteil, dass der Transfer von "Fremd"-DNA ohne klare Funktion und als Teil der T-DNA in die Pflanze weiter limitiert ist. Ferner wurde vorstehend diskutiert, dass die Abwesenheit der Innenregion von RB sehr unwahrscheinlich die Effizienz des LB-Processings beeinflusst. Die LB-Regionen in diesen beispielhaft optimierten T-DNA-Vektoren sind im Allgemeinen von Ti-Plasmiden vom Octopintyp abgeleitet und alle enthalten eine natürliche linksrandige Kernsequenz. T-DNA-Ränder vom Nopalintyp sind üblicherweise von Ti-Plasmiden, wie pTiC58 (Gielen et al. 1999) abgeleitet. Weitere Details über beispielhafte Randregionen, die in beispielhaft optimierten T-DNA-Vektoren verwendet werden, sind in 2 und Beispiel 4 beschrieben.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt optimierte T-DNA-Vektoren, wie in 2 beispielhaft dargestellt, und umfasst eine Modifikation des rechten Rands der T-DNA, umfassend eine einzelne rechtsrandige Kernsequenz, flankiert von einer rechtsrandigen Außenregion und/oder einer Modifikation, einschließlich Multiplikation, des linken T-DNA-Rands, bezeichnet als:
    • a) eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert durch eine natürliche linksrandige Außenregion und eine innerhalb des linken Rands der T-DNA gelegene proximale Region mit einer Länge von 10 bis 100 bp, bevorzugt 20–100 bp und die an der Anzahl der A- und T-Reste angereichert ist, wobei der Prozentsatz der AT-Reste bevorzugt 60 bis 85 %, bevorzugter 64 bis 80 %, am bevorzugtesten 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78 oder 79 % ist, mit der Maßgabe, dass die proximale Region innerhalb des linken Rands der T-DNA nicht die entsprechende innere Region des linken Rands vom natürlichen Octopintyp ist; oder
    • b) eine einzelne linksrandige Kernsequenz, flankiert nur durch eine natürliche linksrandige Innenregion; oder
    • c) eine einzelne linksrandige Kernsequenz; oder
    • d) eine Tandem-Wiederholungssequenz von mehreren linksrandigen Kernsequenzen, flankiert nur durch eine natürliche linksrandige Außenregion, wobei die Tandemwiederholungssequenz bevorzugt 2–3 linksrandige Kernsequenzen enthält, die aber nicht eine höhere Kopienzahl der linksrandigen unvollständigen Kernwiederholungssequenz umfassen, und wobei die wiederholten linksrandigen Kernsequenzen in dem Tandem durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp getrennt sind, die gegebenenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen tragen; oder
    • e) eine integrale linksrandige Region vom Nopalintyp, benachbart zu und nachgelagert oder vorgelagert zu der integralen linksrandigen Region vom Octopintyp.
  • Der Einbau von modifizierten Randregionen, die eine effiziente Nick-Bildung an der LB-Kernsequenz in üblicherweise verwendeten Transformationsvektoren zeigen, verhindert ein Durchlesen von LB. Ein zusätzlicher Vorteil der Tandemanordnung der LB-Kernsequenzen oder der integralen Ordnung der LB-Kernsequenzen oder der integralen linken Ränder liegt in der Tatsache, dass gelegentliches Durchlesen oder ein DNA-Transfer, beginnend an der ersten Kopie der LB-Kernsequenz oder der integralen LB-Region, bei einer benachbarten Kopie der LB-Kernsequenz oder integralen LB-Region in dem Tandem beendet werden. In beiden Fällen ist die Frequenz des Transfers von Vektorgrundgerüstsequenzen und Integration der Sequenzen in ein eukaryontisches Genom herabgesetzt.
  • Unter "stromabwärts" und "stromaufwärts" bzw. "nachgelagert" und "vorgelagert" ist jede Sequenz zu verstehen, die 5' bzw. 3' einer anderen Sequenz liegt. Als Referenz wird der T-DNA-Strang genommen, der an seinem 5'-Ende mit RB beginnt und an seinem 3'-Ende mit LB endet.
  • Die weitere Optimierung von T-DNA-Transformationsvektoren wird in Betracht gezogen, sobald bekannt ist, ob die linksrandigen Innen- und/oder Außenregionen notwendig sind, um die Integration des Vektorgrundgerüsts zu vermeiden. Mehrere Deletionsderivate der inneren und/oder äußeren Regionen können hergestellt werden, um zu bestimmen, welche spezifische(n) Sequenz(en) in den inneren und/oder äußeren Randregionen wichtig ist bzw. sind, um die Beendigung des T-DNA-Transfers zu bestimmen. Sobald diese Sequenz bzw. Sequenzen bekannt ist bzw. sind, kann bzw. können sie in mehreren Kopien um die LP-Wiederholungssequenz eingebaut werden, was zu einer effizienteren Nick-Bildung führt. Solche linken Ränder sind in der Lage, die T-DNA-Transformationsvektoren weiter zu optimieren und die Vektoren, die diese weiteren modifizierten linken Ränder enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch den Einbau aller Modifikationen, die erfindungsgemäß beschrieben sind, in jeden T-DNA-Vektor, umfassend binäre Transformationsvektoren, super-binäre Transformationsvektoren, co-integrierte Transformationsvektoren, von Ri abgeleitete Transformationsvektoren, sowie T-DNA tragende Vektoren zur Verwendung in agrolistischer Transformation oder Gentherapie.
  • Unter "binärem Transformationsvektor" wird ein T-DNA-Transformationsvektor verstanden, der umfasst:
    • a) eine T-DNA-Region, umfassend mindestens ein Gen von Interesse und/oder mindestens einen selektierbaren Marker, der in der zu transformierenden eukaryontischen Zelle aktiv ist; und
    • b) eine Vektorgrundgerüstregion, umfassend mindestens Replikations-Origins, die in E. coli und Agrobacterium aktiv sind, und Marker zur Selektion in E. coli und Agrobacterium.
  • Alternativ hängt die Replikation des binären Transformationsvektors in Agrobacterium von der Anwesenheit eines separaten Helferplasmids ab. Der binäre Vektor pGreen und das Helferplasmid pSoup bilden ein Beispiel eines solchen Systems, wie beispielsweise in Hellens et al. (2000), Plant Mol. Biol. 42, 819–832 beschrieben ist, oder wie auf der Internetseite http://www.pgreen.ac.uk verfügbar ist.
  • Die T-DNA-Ränder eines binären Transformationsvektors können von Ti-Plasmiden vom Octopintyp oder Nopalintyp oder von beiden abgeleitet sein. Die T-DNA eines binären Vek tors wird nur in eine eukaryontische Zelle zusammen mit einem Helferplasmid transferiert.
  • Unter "Helferplasmid" wird ein Plasmid verstanden, das in Agrobacterium stabil aufrechterhalten wird und mindestens einen Satz von vir-Genen trägt, die notwendig sind, um den Transfer der T-DNA zu erlauben. Dieser Satz von vir-Genen kann entweder von Ti-Plasmiden vom Octopintyp oder Ti-Plasmiden vom Nopalintyp oder von beiden abgeleitet sein.
  • Unter "super-binärem Transformationsvektor" wird ein binärer Transformationsvektor verstanden, der zusätzlich in der Vektorgrundgerüstregion eine vir-Region des Ti-Plasmids pTiBo542 des super-virulenten A. tumefaciens-Stamms A281 ( EP 0 604 662 , EP 0 687 730 ) trägt. Superbinäre Transformationsvektoren werden zusammen mit einem Helferplasmid verwendet.
  • Unter "co-integriertem Transformationsvektor" wird ein T-DNA-Vektor verstanden, der mindestens umfasst:
    • a) eine T-DNA-Region, umfassend mindestens ein Gen von Interesse und/oder einen in Pflanzen aktiven selektierbaren Marker; und
    • b) eine Vektorgrundgerüstregion, umfassend mindestens Replikations-Origins, die in Escherichia coli und Agrobacterium aktiv sind, und Marker zur Selektion in E. coli und Agrobacterium.
  • Die T-DNA-Ränder und der Satz von vir-Genen eines solchen T-DNA-Vektors können von Ti-Plasmiden vom Octopin- oder Nopalintyp oder von beiden abgeleitet sein.
  • Unter "Ri abgeleitetem Pflanzentransformationsvektor" wird ein binärer Transformationsvektor verstanden, in dem die T-DNA-Ränder von einem Ti-Plasmid abgeleitet sind und wobei der binäre Transformationsvektor zusammen mit einem "Helfer"-Ri-Plasmid, das den notwendigen Satz von vir-Genen trägt, verwendet wird.
  • Unter "Agrolistik", "agrolistischer Transformation" oder "agrolistischem Transfer" wird hier ein Transformationsverfahren verstanden, das die Merkmale von Agrobacterium vermittelter Transformation und von biolistischer DNA-Abgabe vereint. Als solches wird ein T-DNA enthaltendes Zielplasmid zusammen mit DNA/RNA, die in Pflanzen die Produktion von VirD1 und VirD2 mit oder ohne VirE2 erlaubt, abgegeben (Hansen und Chilton 1996; Hansen et al. 1997; WO 97/12046 ).
  • Zwei mögliche Mechanismen, die zu Transfer und Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen in einem eukaryontischen Genom führen, sind bekannt. In einem ersten Mechanismus beginnt der T-DNA-Transfer legitim an dem rechten T-DNA-Rand, aber stoppt nicht an dem linken T-DNA-Rand, und es schließt sich ein kontinuierliches Kopieren der Vektorgrundgerüstsequenzen an. Dieser Mechanismus ist als linksrandiges Durchlesen bekannt. In einem zweiten Mechanismus wird der DNA-Transfer illegitim an dem linken T-DNA-Rand unter kontinuierlichem Kopieren, bis der linke T-DNA-Rand erneut erreicht wird, initiiert. Unabhängig vom Vorliegen des jeweiligen Mechanismus zeigt die Analyse der transgenen Pflanzen an, dass bei vielen von ihnen die vollständigen Vektorgrundgerüstsequenzen in das Genom integriert sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiter einen Ansatz, um transformierte Zellen, die Vektorgrundgerüstsequenzen enthalten, durch Rekombination mit einer Rekombinase und Rekombinationsstellen unempfindlich zu machen bzw. zu heilen.
  • Unter "unempfindlich machen" bzw. „heilen" wird hier die Entfernung von Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors ohne Aufhebung des T-DNA-Integrationsereignisses verstanden. Ein weiteres Werkzeug zur Entfernung von Nicht-T-DNA-Sequenzen aus transgenen Individuen wurde von Hanson et al. (1999) beschrieben. Dieses Werkzeug ist jedoch anders und steht in keinem Zusammenhang mit dem erfindungsgemäß beschriebenen Verfahren zur Erzeugung von Unempfindlichkeit. Wie vorstehend diskutiert, besitzt die Entfernung von Nicht-T-DNA-Sequenzen gemäß den Verfahren von Hanson et al. (1999) oder WO 99/01563 den Nachteil, dass die Transformationseffizienz erniedrigt wird (Hanson et al. 1999).
  • So wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Erzeugung von Unempfindlichkeit der transformierten Zellen durch ein Rekombinationsereignis als Verfahren zur Entfernung der illegitim integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen erhalten. Als Ergebnis werden transformierte Zellen erhalten, die die T-DNA in ihrem Genom zurückbehalten. Im Gegensatz zu den Verfahren von Hanson et al. (1999) oder WO 99/01563 rettet das Verfahren zur Bereitstellung von Unempfindlichkeit gemäß der Erfindung die T-DNA enthaltenen transgenen Zellen, die zuvor illegitim integrierte Vektorgrundgerüstsequenzen trugen. Die Transformationseffizienzen werden so kaum beeinträchtigt.
  • Unter "Rekombinationsereignis" wird entweder ein ortsspezifisches Rekombinationsereignis oder ein Rekombinationsereignis, das durch Transposon-"Jumping" erzielt wird, verstanden.
  • Unter "Rekombinase" wird entweder eine ortsspezifische Rekombinase oder eine Transponase verstanden.
  • Unter "Rekombinationsstelle" wird entweder ortsspezifische Rekombinationsstellen oder Transposonrandsequenzen verstanden.
  • Unter "ortsspezifischem Rekombinationsereignis" wird ein Ereignis verstanden, das durch ein System katalysiert wird, das im Allgemeinen aus drei Elementen besteht: ein Paar von DNA-Sequenzen (die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen oder -stellen) und ein spezifisches Enzym (die ortsspezifische Rekombinase). Die ortsspezifische Rekombinase katalysiert eine Rekombinationsreaktion nur zwischen zwei ortsspezifischen Rekombinationssequenzen in Abhängigkeit von der Orientierung der ortsspezifischen Rekombinationssequenzen. Sequenzen, die zwischen den zwei ortsspezifischen Rekombinationsstellen liegen, werden in Gegenwart der ortsspezifischen Rekombinase invertiert, wenn die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen in entgegengesetzten Richtungen relativ zueinander orientiert sind (d.h. inverted repeats). Wenn die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen in gleicher Richtung zueinander orientiert sind (d.h. direkte Repeats), dann wird jede dazwischen liegende Sequenz nach Interaktion mit der ortsspezifischen Rekombinase deletiert. Wenn so die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen als direkte Repeats an beiden Enden der Vektorgrundgerüstsequenzen, die in ein eukaryontisches Genom integriert sind, vorhanden sind, kann eine solche Integration von Sequenzen anschließend durch Wechselwirkung der ortsspezifischen Rekombinationssequenzen mit der entsprechenden ortsspezifischen Rekombinase entfernt werden.
  • Eine Anzahl von verschiedenen ortsspezifischen Rekombinasesystemen kann verwendet werden und umfasst ohne Beschränkung das Cre/lox-System von Bakteriophage P1, das FLP/FRT-System von Hefe, die Gin-Rekombinase des Phagen Mu, die Pin-Rekombinase von E. coli, die PinB, PinD und PinF von Shigella und das R/RS-System von Zygosaccharomyces rouxii. Rekombinasen sind im Allgemeinen Integrasen, Resolvasen oder Flippasen. Ebenso können bispezifische Rekombinasen zusammen mit direkten oder indirekten Repeats von zwei verschiedenen ortsspezifischen Rekombinationsstellen entsprechend der bispezifischen Rekombinase verwendet werden ( WO 99/25840 ). Die bevorzugten ortsspezifischen Rekombinasesysteme sind der Bakteriophage P1-Cre/lox und die Hefe FLP/FRT und die Z. rouxii-R/RS-Systeme. In diesen Systemen interagiert eine Rekombinase (Cre, FLP bzw. R) spezifisch mit ihrer ortsspezifischen Rekombinationssequenz (lox, FRT bzw. RS), um die dazwischen liegenden Sequenzen zu invertieren oder herauszuschneiden. Die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen für jedes dieser zwei Systeme sind relativ kurz (34 bp für lox und 47 bp für FRT). Einige dieser Systeme wurden bereits mit hoher Effizienz in Pflanzen, wie Tabak (Dale et al. 1990, Onouchi et al. 1991, Sugita et al. 2000) und Arabidopsis (Osborne et al. 1995, Onouchi et al. 1995) verwendet. Ortsspezifische Rekombinationssysteme besitzen viele Anwendungen in der Pflanzenmolekularbiologie, einschließlich Verfahren zur Kontrolle der homologen Rekombi nation (z. B. US 5,527,695 ), der zielgerichteten Insertion, Gen-Stacking etc. ( WO 99/25821 ) und der Auflösung von komplexen T-DNA-Integrationsmustern oder der Exzision eines selektierbaren Markers ( WO 99/23202 ). In diesen Anwendungen sind die ortsspezifischen Rekombinationsstellen typischerweise Teil der in das eukaryontische Genom als T-DNA oder über homologe Rekombination integrierten DNA und sind so nicht in der Vektorgrundgerüstsequenz vorhanden.
  • Obwohl die ortsspezifischen Rekombinationssequenzen an die Enden der herauszuschneidenden oder zu invertierenden DNA geknüpft werden müssen, kann das Gen, das die ortsspezifische Rekombinase codiert, an anderer Stelle lokalisiert sein. Beispielsweise könnte das Rekombinase-Gen bereits in der Eukaryonten-DNA vorhanden sein oder könnte durch ein später eingeführtes DNA-Fragment, das entweder direkt in den Zellen über Kreuzung oder durch Kreuzpollination bereitgestellt wurde, geliefert werden. Alternativ könnte ein im Wesentlichen gereinigtes Rekombinaseprotein direkt in die eukaryontische Zelle, z.B. durch Mikroinjektion oder Partikelbeschuss, eingeschleust werden. Typischerweise ist die die ortsspezifische Rekombinase codierende Region funktionell an Regulatorsequenzen geknüpft, was die Expression der ortsspezifischen Rekombinase in der eukaryontischen Zelle ermöglicht.
  • Als Teil der vorliegenden Erfindung werden ortsspezifische Rekombinationsstellen in den T-DNA-Vektor eingeschleust, so dass sie außerhalb der T-DNA liegen, aber es ermöglichen, dass transferierte Vektorgrundgerüstsequenzen oder Teile davon, die möglicherweise aus dem T-DNA-Vektor stam men, post-transformational durch die Wirkung einer ortsspezifischen Rekombinase herausgeschnitten werden.
  • Unter "Rekombinationsereignis, das durch Transposon-Jumping" bewirkt wird, oder unter "Transponase vermittelter Rekombination" wird ein Rekombinationsereignis verstanden, das durch ein System katalysiert wird, das aus drei Elementen besteht: einem Paar von DNA-Sequenzen (die Transposon-Randsequenzen) und einem spezifischen Enzym (die Transponase). Die Transponase katalysiert eine Rekombinationsreaktion nur zwischen zwei Transposon-Randsequenzen, die als inverted Repeats angeordnet sind.
  • Eine Anzahl von verschiedenen Transposon/Transponasesystemen kann verwendet werden und umfasst, ohne Beschränkung, das Ds/Ac-System, das Spm-System und das Mu-System. Diese Systeme stammen aus Mais, aber es wurde gezeigt, dass mindestens das Ds/Ac- und das Spm-System auch in anderen Pflanzen funktionieren (Fedoroff et al. 1993, Schlappi et al. 1993, Van Sluys et al. 1987). Bevorzugt sind Transposons von Ds- und dem Spm-Typ, die durch 11 bp lange bzw. 13 bp lange Randsequenzen abgegrenzt sind.
  • Obwohl die Transposon-Randsequenzen an die Enden der herauszuschneidenden DNA geknüpft werden müssen, kann das Gen, das die Transponase codiert, an anderer Stelle lokalisiert sein. Beispielsweise könnte das Rekombinase-Gen bereits in der Eukaryonten-DNA vorhanden sein oder könnte durch ein später eingeschleustes DNA-Fragment, das entweder direkt in die Zelle durch Kreuzung oder Kreuzpollination eingeführt wird, bereitgestellt werden. Alternativ könnte ein im Wesentlichen gereinigtes Transponaseprotein direkt in die Zellen eingeschleust werden, z.B. durch Mikroinjektion oder durch Partikelbeschuss.
  • Als Teil der vorliegenden Erfindung werden Transposon-Randsequenzen in den T-DNA-Vektor so eingeschleust, dass sie außerhalb der T-DNA liegen und das Vektorgrundgerüst oder einen Teil davon in eine transposonartige Einheit umwandeln, die sich durch die Wirkung einer Transponase bewegen kann.
  • Wie Transposons, und so in der vorliegenden Erfindung, reintegrieren sich das Vektorgrundgerüst oder ein Teil davon oft an einer anderen Stelle des Wirtsgenoms, und die Segregation der Nachkommen des Wirts, in dem die Transponase wirken konnte, könnte notwendig sein, um transformierte Wirte, die nur die T-DNA enthalten, und transformierte Wirte, die nur das Vektorgrundgerüst oder einen Teil davon, enthalten, zu trennen.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt weiter optimierte T-DNA-Transformationsvektoren mit zusätzlichen DNA-Sequenzen außerhalb der randständigen T-DNA-Kernwiederholungssequenzen, wie in 3 beispielhaft dargestellt, und erlauben die post-transformationelle Entfernung von integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen. Diese zusätzlichen DNA-Sequenzen modifizieren, einschließlich multiplizieren, die T-DNA-Randregionen oder Teile davon und umfassen:
    • f) Rekombinationsstellen, organisiert als Wiederholungssequenzen, nachgelagert der linksrandigen Kernsequenz und vorgelagert der rechtsrandigen Kernsequenz; oder
    • g) die DNA-Sequenzen von (f) weiter modifiziert durch Hinzufügen einer zweiten Kopie einer linksrandigen Region, positioniert vor und bevorzugt neben der einzelnen rechtsrandigen Außenregion und der Rekombinationsstelle vor der Kernsequenz der zweiten linksrandigen Region; oder
    • (h) Rekombinationsstellen von (f) mit einem Rekombinase-Gen, nachgelagert der Rekombinationsstelle nach der linksrandigen Kernsequenz und bevorzugt, sofern vorhanden, neben und nachgelagert der linksrandigen Außenregion; oder
    • (i) eine DNA-Sequenz lokalisiert nachgelagert der linksrandigen Region, wobei die DNA-Sequenz ein Rekombinase-Gen umfasst, das von Wiederholungssequenzen von Rekombinationsstellen, wie in (h) definiert, flankiert ist und weiter eine zweite Kopie einer linksrandigen Region nachgelagert der Rekombinase umfasst; oder
    • (j) die DNA-Sequenz von (i) mit zusätzlichen Rekombinationsstellen, organisiert als Wiederholungssequenzen, nachgelagert der zweiten linksrandigen Kernsequenz und vorgelagert der einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz.
  • In jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen benachbart zu und nachgelagert und/oder vorgelagert zu den links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen lokalisiert oder sind von den links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen durch eine Sequenz von mindestens 10–20 bp Länge getrennt, die gege benenfalls Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen tragen.
  • In jeder der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) sind die Rekombinationsstellen entweder ortsspezifische Rekombinationsstellen, angeordnet als direkte Wiederholungssequenzen oder Transposon-Randsequenzen oder angeordnet als inverted Repeats, und das Rekombinase-Gen ist entweder ein ortsspezifisches Rekombinase-Gen oder ein Transponase-Gen.
  • Es ist offensichtlich, dass die Modifikationen (f) oder (g) in den T-DNA-Transformationsvektoren als einfache Modifikationen, einschließlich Multiplikation, der T-DNA-Randregionen oder Teilen davon gelten.
  • Die Einschleusung zusätzlicher DNA-Sequenzen stromabwärts der linksrandigen T-DNA-Kernwiederholungssequenz, um ein linksrandiges Durchlesen zu verhindern ( WO 99/01563 ) oder um Nicht-T-DNA-Sequenzen zu eliminieren (Hanson et al. 1999), wurden beschrieben, und diese Sequenzen verhindern die Entwicklung von Transformanten, in die die Vektorgrundgerüstsequenzen integriert sind. Zusätzlich zu den Modifikationen (f) besitzt die Modifikation (g) des T-DNA-Vektors den Vorteil, dass ein Durchlesen an der ersten LB-Kernsequenz an der zweiten LB-Kernsequenz gestoppt werden kann, wodurch die Verdopplung des T-DNA-Fragments verhindert wird. Insertierte Vektorgrundgerüstsequenzen werden anschließend durch Wirkung einer geeigneten Rekombinase entfernt. Zusätzlich zu den Modifikationen (f) führt die Modifikation (h) in einen T-DNA-Vektor eine Rekombinase-Gensequenz stromabwärts der linksrandigen Kernsequenz ein, um eine Auflösung der integrierten Vektorgrundgerüstse quenz, die möglicherweise von dem T-DNA-Vektor abstammt, an den in die modifizierten T-DNA-Ränder eingeschleusten Rekombinationsstellen zu erlauben. So und im Gegensatz zu WO 99/01563 können Transformanten mit integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen nach der Erzeugung von Unempfindlichkeit gerettet werden, d.h. nach Entfernung der Vektorgrundgerüstsequenzen, die von den Rekombinationsstellen flankiert werden, die in die modifizierten T-DNA-Ränder eingeführt wurden. Begleitend dazu wird das Rekombinase-Gen herausgeschnitten.
  • Die Modifikationen (i) ändern weiter den Aufbau der linken Randregion, d.h. eine zusätzliche Kopie einer linken Randregion wird hinzugefügt. Beide Kopien sind jedoch nicht im Tandem, wie vorstehend in dem ersten Ansatz zur Verhütung der Vektorgrundgerüstintegration beschrieben, angeordnet, sondern sind durch das Rekombinase-Gen getrennt, und die randständigen Kernsequenzen kommen in ihrem breiteren Randkontext vor. Die Modifikationen (i) sind somit als eine Modifikation des vorstehend beschriebenen T-DNA-Vektorkonstrukts zu sehen, in dem die einzelne LB-Region eine Tandemanordnung der LB-Kernsequenz enthält. Die Anwesenheit einer zweiten Kopie einer linken T-DNA-Randregion besitzt den Vorteil, dass illegitimer DNA-Transfer, beginnend am oder lesend durch zur ersten linksrandigen Kernsequenz an der zweiten linksrandigen Kernsequenz gestoppt werden kann. So wird nur ein Teil der Vektorgrundgerüstsequenz in den eukaryontischen Kern transferiert. Da diese Vektorgrundgerüstregion durch Rekombinationsstellen flankiert ist, kann sie leicht durch die Wirkung einer Rekombinase entfernt werden. Illegitimer DNA-Transfer, beginnend an oder lesend durch zu der zweiten Kopie der linksrandigen Kernsequenz kann jedoch immer noch auftreten.
  • Daher fügt die Modifikation (j) weiter ein Paar von Rekombinationsstellen stromabwärts der zweiten Kopie der linksrandigen Kernsequenz und stromaufwärts der einzelnen rechtsrandigen Region an. Integrierte Vektorgrundgerüstsequenzen können wieder leicht durch Wirkung einer Rekombinase an den Rekombinationsstellen entfernt werden. Im Falle eines illegitimen DNA-Transfers, beginnend an der zweiten Kopie der linksrandigen Kernsequenz, wird die Rekombinase nicht durch das Grundgerüst des T-DNA-Transformationsvektors geliefert. Sie muss so von anderer Seite bereitgestellt werden, z.B. durch sexuelle Kreuzung mit einer Pflanze, die das Rekombinase-Gen bereits in ihrem Genom enthält.
  • Jede der Modifikationen (f), (g), (h), (i) oder (j) ist auch anwendbar, um transgene Zellen gegenüber Vektorgrundgerüstsequenzen, die in das Genom eines Eukaryonten unabhängig von der T-DNA integriert wurden, d.h. nicht physikalisch mit der T-DNA verknüpft sind, unempfindlich zu machen.
  • Weiter wird in der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren beschrieben, bei dem die T-DNA-Transformationsvektoren, die die DNA-Sequenzen von (f) oder (g) in Kombination mit der Bereitstellung einer Rekombinase enthalten, verwendet werden, oder bei dem T-DNA-Transformationsvektoren verwendet werden, die die DNA-Sequenzen (h), (i) oder (j) enthalten, um transformierte Zellen, die Grundgerüstsequenzen der Vektorgrundgerüstsequenzen gegebenenfalls in Kombination mit der Bereitstellung einer Rekombinase enthalten, unempfindlich zu machen.
  • Ortsspezifische Rekombinasen oder Transponasen, die in das Wirtsgenom eingeschleust wurden, um die Rekombination zu ermöglichen, können anschließend durch Segregation der Nachkommen des transformierten Wirts, in dem die Rekombination eintreten konnte, entfernt werden. Die Segretation der Nachkommen ist auch ein Weg, um transformierte Wirte, die nur die T-DNA enthalten, und transformierte Wirte, die nur das Vektorgrundgerüst oder einen Teil davon enthalten, zu trennen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Einschleusung beliebiger der zusätzlichen DNA-Sequenzen in jedem T-DNA-Vektor, umfassend binäre Transformationsvektoren, super-binäre Transformationsvektoren, co-integrierte Transformationsvektoren, von Ri abgeleitete Transformationsvektoren sowie T-DNA tragende Vektoren zur Verwendung in agrolistischer Transformation oder Gen-Therapie.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Rekombinase-Gen den transgenen Pflanzen, die eine Vektorgrundgerüstsequenz, flankiert von Rekombinationsstellen, enthalten, durch sexuelle Kreuzung mit einer Pflanze, die das Rekombinase-Gen in ihrem Genom enthält, bereitgestellt. Die Rekombinase kann entweder an einen konstitutiven oder einen induzierbaren Promotor funktionell geknüpft sein. Das Rekombinase-Gen kann alternativ unter der Kontrolle einer einzelnen Untereinheit von Bakteriophagen RNA-Polymerase spezifischen Promotoren, wie einem T7 oder einem T3 spezifischen Promotor, stehen, vorausgesetzt, dass die Wirtszellen auch die entsprechende RNA-Polymerase in einer aktiven Form umfassen. Ein noch weiteres alternatives Verfahren zur Expression der Rekombinase besteht in der funktionellen Verknüpfung des offenen Leserasters der Rekombinase mit einer stromaufwärts gelegenen aktivierenden Sequenz, die durch einen transaktivierenden Transkriptionsfaktor, wie GAL4 oder Derivate ( US 5,801,027 , WO 97/30164 , WO 98/59062 ) oder den Lac-Repressor ( EP 0 823 480 ) stimuliert wird, vorausgesetzt, dass die Wirtszelle in geeigneter Weise mit dem Transkriptionsfaktor versehen ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Rekombinase-Gen auf einem Transformationsvektorgrundgerüst bereitgestellt, und der Promotor des Rekombinase-Gens ist bevorzugt ein induzierbarer Promotor. Solche Promotoren sind einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und umfassen z.B. einen Hitzeschock reaktiven Promotor, einen Glukokortikoid induzierbaren Promotor oder einen durch eine andere chemische Verbindung induzierbaren Promotor (z.B. wie in EP 0 332 104 und WO 90/08826 offenbart).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des Rekombinase-Gens in bakteriellen Wirten durch Einschließen einer Intronsequenz bzw. Intronsequenzen in der codierenden Region des Rekombinase-Gens verhindert.
  • Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass erhöhte Spiegel an VirD1 und VirD2 in Agrobacterium zu höheren Werten an Pflanzentransformation führen (Wang et al. 1990). VirD1 und VirD2 wurden auch nach einem Verfahren zur verbesserten Integration exogener DNA, die an eukaryontische Zellen mittels Transformation der eukaryontischen Zellen mit chimären virD1 und/oder virD2-Genen abgegeben wurden, integriert ( WO 97/12046 ). Es wurde jedoch bis jetzt nicht gezeigt, dass eine erhöhte Produktion von VirD1 und/oder VirD2 die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen verhindern kann.
  • So wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Integration von Vektorgrundgerüstsequenz durch Verstärken der Effizienz der Nick-Bildung an der linksrandigen Kernsequenz eines T-DNA-Vektors durch Erhöhen der Produktion des T-DNA-Nick-Komplexes unter Beteiligung mindestens der Endonukleasen VirD1 und VirD2 verhindert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zusätzliche Kopien des Octopintyp virD-Locus entweder in das Genom von Agrobacterium und/oder in ein Helferplasmid und/oder in einen binären Transformationsvektor und/oder in einen super-binären Transformationsvektor und/oder in einen co-integrierten Transformationsvektor und/oder einen von Ri abgeleiteten Pflanzentransformationsvektor integriert. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können zusätzliche Kopien des virD-Locus vom Nopalintyp, wie erwähnt, bereitgestellt werden.
  • Die vorliegende Anmeldung betrifft somit drei Verfahren, entweder um die Integration von Transformationsvektorgrundgerüstsequenzen zu verhindern oder demgegenüber unempfindlich zu machen, wobei verwendet wird:
    • 1) beliebige der T-DNA-Vektoren (a) bis (e), modifiziert an der linken T-DNA-Randregion, so dass ein Durchlesen verhindert oder gestoppt wird oder dass der DNA-Transfer, der an diesem Rand beginnt, verhütet oder gestoppt wird; oder
    • 2) beliebige der T-DNA-Vektoren (f) bis (j), die die Auflösung der in das Genom der transgenen Zellen integrierten Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors durch Rekombination ermöglichen; oder
    • 3) mindestens eine Extrakopie des virD-Locus in Agrobacterium, um die Gehalte von VirD1 und VirD2 als minimale Bestandteile des T-DNA-Rand-Nick-Komplexes zu erhöhen.
  • Es ist einem Fachmann auf dem Gebiet klar, dass jedes dieser Verfahren oder Teile davon entweder alleine, in Kombination von zwei oder als Kombination aller drei verwendet werden kann. Beispielhafte Darstellungen des T-DNA-Vektors, die einige solcher Kombinationen widerspiegeln, sind in 3 angegeben.
  • Bevorzugte Kombinationen der erfindungsgemäßen Verfahren (1) oder (2) mit dem erfindungsgemäßen Verfahren (3) bestehen aus einem Transformationsvektor, der eine modifizierte LB-Region trägt, die eine Tandem-Anordnung der LB-Kernsequenz oder mehrfache Kopien der LB-Region trägt, und der erhöhten Produktion von VirD1 und VirD2 durch Agrobacterium. Es kann in der Tat erwartet werden, dass das Tandem aus LB-Kernsequenzen oder den Mehrfachkopien der LB-Region, die in einem Agrobacterium-Stamm, der normalerweise zur Transformation verwendet wird, verfügbaren VirD1- und VirD2-Proteine titriert. Als Ergebnis würden diese Proteine nicht länger zur Herstellung eines Nicks an der einzelnen RB-Kernsequenz verfügbar sein.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Verwendung jedes der Verfahren und/oder jede der T-DNA- Vektormodifikationen, entweder separat oder in beliebiger Kombination, um die Integration des Grundgerüsts des Transformationsvektors zu verhindern oder dagegen unempfindlich zu machen. Bevorzugte Kombinationen sind diejenigen, in denen erhöhte Spiegel an VirD-Proteinen, die von Agrobacterium produziert werden, auf T-DNA-Vektoren einwirken können, die mehrfache Kopien der LB-Kernsequenz oder mehrfache Kopien der LB-Regionen beherbergen.
  • Es ist auch klar, dass jedes der Verfahren und/oder Modifikationen des T-DNA-Vektors, um die Integration des Vektorgrundgerüsts zu verhindern oder demgegenüber unempfindlich zu machen, mit jedem anderen Verfahren, um die Integration des Vektorgrundgerüsts zu verhindern oder demgegenüber unempfindlich zu machen, kombiniert werden kann. Solche Verfahren und Modifikationen des T-DNA-Vektors umfassen die Addition von Genen oder DNA-Sequenzen stromabwärts des linken Randes, wie z.B. in der WO 99/01563 offenbart. Solche Gene/DNA-Sequenzen umfassen Gene, die zytotoxische Verbindungen, Antisense-Haushaltsgene, Sequenzen, die das Entwinden der DNA hinter der linken Randregion verhindern, z.B. Sequenzen mit hohem GC-Gehalt oder vir-Boxsequenzen, die mit DNA-Bindeproteinen Wechselwirken, codieren.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst somit die Verwendung jedes der Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen der Erfindung, um die Integration von Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors zu verhindern oder demgegenüber unempfindlich zu machen, in Kombination mit jedem anderen Verfahren und/oder Modifikation des T-DNA-Transformationsvektors, um die Integration des Grundgerüsts des Transformationsvektors zu verhindern oder demgegenüber unempfindlich zu machen.
  • Es ist weiter einem Fachmann auf dem Gebiet klar, dass jedes der erfindungsgemäßen Verfahren und/oder Modifikationen des T-DNA-Vektors, um gegenüber der Integration von Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors unempfindlich zu machen, mit jedem anderen Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikation unter Verwendung oder Einbezug beliebiger Rekombinationssysteme, z.B. um in Pflanzen aktive selektierbare Marker auszuschneiden, kombiniert werden kann. Das Verfahren zur Erzeugung von Unempfindlichkeit kann in der Tat kombiniert werden mit beispielsweise dem Ausschneiden eines selektierbaren Markers durch Flankieren beispielhafter selektierbarer Marker entweder mit der gleichen oder mit verschiedenen Rekombinationsstelle(n), wie derjenigen, die die Vektorgrundgerüstsequenz flankieren. Bei dem Verfahren zur Erzeugung von Unempfindlichkeit kann die Vektorgrundgerüstsequenz auch durch zwei verschiedene ortsspezifische Rekombinationsstellen flankiert sein, und die Erzeugung von Unempfindlichkeit kann durch bispezifische Rekombinase mit Spezifitäten entsprechend den verwendeten ortsspezifischen Rekombinationsstellen durchgeführt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst somit die Verwendung von Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen gemäß der Erfindung, um gegenüber Integration von Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors unempfindlich zu machen, in Kombination mit Verfahren und/oder T-DNA-Vektormodifikationen unter Verwendung oder Einbeziehung beliebiger Rekombinationssysteme für andere Zwecke als die Erzeugung von Unempfindlichkeit gegenüber der Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Erzeugung von Unempfindlichkeit gegenüber integrierten Grundgerüstsequenzen des Transformationsvektors unter Einbeziehung von Modifikationen der T-DNA-Ränder durch Hinzufügen eines beliebigen Paars von wechselseitig unterschiedlichen ortsspezifischen Rekombinationsstellen und unter Verwendung zusammen mit einer mindestens bispezifischen Rekombinase mit Spezifitäten, die mindestens den verwendeten ortsspezifischen Rekombinationsstellen entsprechen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird jedes der erfindungsgemäßen T-DNA-Vektorkonstrukte in einen Agrobacterium-Stamm überführt. Die so erhaltenen Stämme sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird jeder der erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren in einer Agrobacterium vermittelten oder agrolistischen Transformation verwendet, wobei solche Transformationsverfahren einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren können zur Transformation mehrerer Pflanzengewebe, umfassend Wurzeln, Protoplasten, Blätter etc. von verschiedenen monocotylen und dicotylen Pflanzenarten, wie beispielsweise, ohne Beschränkung, Arabidopsis, Tabak, Petunie, Tomate, Kartoffel, Bohnen, Reis und Weizen, verwendet werden. Allgemeiner kann es jede beliebige monocotyle oder dicotyle Pflanze sein, die bevorzugt einer Pflanzenart von Interesse in der Landwirtschaft, der Holzwirtschaft, dem Gartenbau oder einer Pflanzenart, die für die Produktion von Arzneimitteln, Biochemika, Antikörper oder Parfüms verwendet wird, angehört. Solche Pflanzen umfassen Nutzpflanzen, Wurzelpflanzen, Öl produzierende Pflanzen, Holz produzierende Pflanzen, landwirtschaftlich angebaute Pflanzen, Früchte produzierende Pflanzen, Leguminosen für Trocken- und Feuchtfutter, Begleitpflanzen oder gartenbaumäßig angebaute Pflanzen. Solche Pflanzen umfassen weiterhin Aprikose, Artichoke, Spargel, Apfel, Banane, Gerste, Broccoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Karotte, Cassava, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicoree, Grünkohl, Baumwolle, Douglas-Tanne, Fichte (Arten Abies und Picea), Flachs, Knoblauch, Trauben, Kohl, Linsen, Mais, Eiche, Hafer, Ölsaaten, Okra, Zwiebel, Birne, Paprika, Pappel, Roggen, Sorgum, Sojabohnen, Kürbis, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume.
  • Die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren können auch in Kombination mit dem "Flower Dip"-Pflanzentransformationsverfahren (Clough und Bent 1998) oder mit dem "in planta apical shoot"-Transformationsverfahren ( WO 99/14348 ) verwendet werden. Die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren können auch zur Transformation anderer eukaryontischer Zellen, einschließlich Hefen, Schimmelkulturen, Fadenpilze, und ihre Conidien, Hyphen oder Protoplasten, die davon abgeleitet sind, verwendet werden. Die Agrobacterium vermittelte Transformation der anderen eukaryontischen Zellen ist einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (z.B. WO 98/45455 ). Ein Schlüsselcharakteristikum der mittels Agrobacterium vermittelten Transfers oder agrolistischem Transfer mit jedem der erfindungsgemäßen T-DNA-Transformationsvektoren transformierten eukaryontischen Zellen ist eine signifikant erniedrigte Frequenz von integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen, ohne stark die Frequenz der Integration der T-DNA-Sequenzen zu beeinflussen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst transgene Pflanzenzellen, die nach jedem Verfahren des Agrobacterium vermittelten Transfers oder agrolistischen Transfers mit jedem der erfindungsgemäßen T-DNA-Transformationsvektoren erhalten wurden. Ebenfalls umfasst sind die gemäß irgendeinem Verfahren nach jedem Verfahren des Agrobacteriums vermittelten Transfers oder agrolistischen Transfers mit jedem der erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren erhaltenen oder regenerierten transgenen Pflanzen. Solche Pflanzen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie T-DNA-Sequenzen, aber nicht Vektorgrundgerüstsequenzen in ihrem Genom enthalten. Weiter umfasst sind die Nachkommen der transgenen Pflanzen, sowie Zellen, Protoplasten, Kalli, Gewebe, Organe, Samen, Früchte, Pollen, Eizellen, Zygoten, zygotische oder somatische Embryos, die davon abgeleitet sind oder von den transgenen Pflanzenzellen abgeleitet sind.
  • Das Potential zur Verwendung der erfindungsgemäßen T-DNA enthaltenden Vektoren in der Gen-Therapie kann wie folgt erklärt werden. Es wurde beschrieben, dass die in vitro rekonstituierten Komplexe, bestehend aus VirD2-ssDNA-VirE2, in der Lage sind, die ssDNA intakt in Säugerzellen zu transferieren (Ziemienowicz et al. 1999).
  • VirD2 schützt ssDNA gegenüber exonukleolytischen Abbau, weil sie kovalent an das 5'-Ende der ssDNA geknüpft ist (Durrenberger et al. 1989, Young und Nester 1988) und durch zwei Kernlokalisationssequenzen (NLSs) die ssDNA in den Pflanzenzellkern (Narasimhulu et al. 1996, Rossi et al. 1993, Shurvinton et al. 1992) targetieren. VirD2 enthält ferner eine "omega"-Domäne, die für die effiziente Integration der T-DNA in das Wirtsgenom wichtig ist (Nara simhulu et al. 1996, Mysore et al. 1998, Tinland et al. 1995). Es wurde gezeigt, dass NLSs von VirD2 in Tierzellen einschließlich menschlicher HeLa-Zellen, Drosophila-Embryonen und Xenopus-Oozyten aktiv ist (Guralnick et al. 1996, Ziemienowicz et al. 1999). VirD1 bleibt in dem Zytoplasma von Säugerzellen lokalisiert, kann aber in den Zellkern über einen piggy-back-Mechanismus unter Beteiligung von VirD2 importiert werden (Ziemienowicz et al. 1999).
  • VirE2 schützt die ssDNA gegenüber (endo)nukleolytischem Abbau und erhält die Integrität der T-DNA (Gelvin 1998b, Rossi et al. 1996). Das VirE2-Protein ist weiter aktiv an dem Targetieren der T-DNA in den Pflanzenzellkern beteiligt (Gelvin 1998b). Die NLSs von VirE2 kann pflanzenspezifisch sein, aber die Repositionierung einer einzelnen Aminosäure innerhalb VirE2 NLSs targetiert diese modifizierten Proteine in die Zellkerne von tierischen Zellen (Guralnick et al. 1996). VirE2-Proteine zeigen Wechselwirkung mit sich selbst, aber die Wechselwirkung von VirE1 mit VirE2 ist viel stärker und VirE1 hemmt die VirE2-Selbst-Wechselwirkung. In Agrobacterium-Zellen verhindert VirE1 die Aggregation von VirE2. VirE1 scheint so als molekularer Chaperon von VirE2 zu wirken (Deng et al. 1999).
  • Die Eigenschaften dieser Vir-Proteine machen sie zu idealen Kandidaten für ihre Anwendung in gentherapeutischen Experimenten, wie von Ziemienowicz et al. (1999) angegeben. Eines der Hauptprobleme bei der Gentherapie besteht in der Tat in der Schwierigkeit der DNA-Abgabe durch die intrazellulären Barrieren, einschließlich nukleolytischem Abbau und Kernaufnahme.
  • Virale Vektoren sind eine der Hauptvehikel, die von Wissenschaftlern bei der Gen-Therapie verwendet werden, um eine DNA-Sequenz in einem geeigneten Wirt zur Expression zu bringen. Retrovirale Vektoren (einschließlich HIV und MMLV) werden in 63 % der Gen-Therapieprotokolle, die von Recombinant DNA Advisory Committee (eine Abteilung des NIH) anerkannt sind, verwendet, wohingegen adenovirale Vektoren in 16 % solcher Protokolle verwendet werden. Andere virale Vektoren umfassen solche, die auf AAV, HSV und Vaccinia beruhen. Virale Vektoren stellen einen Bereich kontinuierlicher Neuentwicklung in der Gen-Therapie dar.
  • Es kann in Betracht gezogen werden, dass die Gene für die Agrobacterium-Proteine VirD1, VirD2 und VirE2 (und schließlich VirE1) in einen viralen Vektor so eingebaut werden (d.h. einschließlich angepasstem Codongebrauch und geeigneter Regulatorsequenzen), dass sie in Tierzellen bevorzugt vorübergehend exprimiert werden können, und dies bevorzugt ohne Integration der vir-Gene in das Wirtsgenom. Wenn eine T-DNA, die das Gen von Interesse für gentherapeutische Zwecke enthält, in dem gleichen viralen Vektor vorhanden ist oder gleichzeitig auf einem separaten viralen Vektor oder einem anderen Typ eines viralen Vektors abgegeben wird, könnte die T-DNA dann effizient in das Genom in Zellkernen tierischer Zellen überführt werden. Ein striktes Anfordernis für die Anerkennung einer solchen gentherapeutischen Strategie würde jedoch sein, dass nur die T-DNA und nicht jede andere externe DNA in den Zellkern transferiert wird. Jede in der vorliegenden Erfindung dargestellte Modifikation, um den Transfer von DNA-Sequenzen, die nicht zu der T-DNA gehören, zu verhindern, oder demgegenüber unempfindlich zu machen, würde somit von großem Wert zur Erhöhung der Akzeptabilität von genthera peutischen Strategien sein, die die Verwendung von Agrobacterium-Proteinen zur Bereitstellung und zur Übertragung der DNA von Interesse umfassen. Daher umfasst die vorliegende Erfindung T-DNA enthaltende Vektoren, die gemäß beliebigen Modifikationen oder Kombinationen von Modifikationen der vorliegenden Erfindung modifiziert wurden und für gentherapeutische Zwecke verwendet werden.
  • Es ist ferner einem Fachmann klar, dass mindestens die erfindungsgemäßen T-DNA-Vektoren, die modifizierte LBs enthalten, welche zu einer hoch effizienten Nick-Bildung in diesem LB führen, als Quelle für beispielsweise VirD2-ss-T-DNA-VirE2-Komplexe verwendet werden können, die in anderen gentherapeutischen Techniken, einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation, Träger vermittelter Abgabe und ballistischer DNA-Injektion verwendet werden können. Diese Komplexe könnten beispielsweise aus einer mit Acetosyringon induzierten Agrobacterium-Kultur oder einer E. coli-Kultur, die zumindest die VirD1-, VirD2- und VirE2-Proteine exprimiert, mittels beispielsweise Affinitätschromatographie, unter Verwendung eines Antikörpers, der das VirD2-Protein erkennt, angereichert werden.
  • Die Erfindung wurde nun allgemein geschrieben und wird klarer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden, die nur dem Zweck der Erläuterung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dienen und die Erfindung nicht beschränken sollen. Auf den Inhalt aller in diesem Text in Bezug genommenen Literaturstellen wird hiermit expressiv verbis Bezug genommen.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1. Schematische Darstellung des Prozentsatzes der A- und T-Reste (indiziert über und unter der horizontalen Linie, die den Vektor bezeichnet) pro 100 bp Blöcken um (und nicht einschließlich) die links- und rechtsrandigen imperfekten Kernwiederholungssequenzen der in den Beispielen 1–3 beschriebenen und verwendeten K- und Hsb-T-DNA-Vektoren.
  • 2. Schematische Darstellung von T-DNA-Konstrukten, die so entwickelt sind, dass die Effizienz der Nick-Bildung an dem modifizierten linken Rand zusammen mit einem rechten Rand, dem die innere Region des Rands fehlt, bewertet werden kann. Gus: β-Glucuronidase codierende Sequenz; nptII: Neomycinphosphotransferase II codierende Sequenz; 3' ocs: 3'-Terminator des Octopinsynthase-Gens; Pnos: Promotor des Nopalinsynthase-Gens; 3'nos: 3'-Terminator des Nopalinsynthase-Gens; P35S: konstitutiver 35S-RNA-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus.
  • 3. Schematische Darstellung der T-DNA-Konstrukte, die so ausgelegt sind, dass sie die Erzeugung von Unempfindlichkeit gegenüber in das Genom eines Eukaryonten integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen erlauben. LB: linker Rand; RB: rechter Rand.
  • 4. Schematische Darstellung beispielhafter T-DNA-Konstrukte. LB: linker Rand; RB: rechter Rand; modLB: modifizierter linker Rand (vgl. 2 für mögliche Modifikationen).
  • 5. DNA-Gel-Blotanalyse.
    • (A) Schematische Darstellung des Verdaus und der in der DNA-Gel-Blotanalyse verwendeten Sonde (nicht maßstabsgetreu gezeichnet). Jede Probe der Pflanzengenom-DNA und die als positive Kontrollen verwendeten Plasmide wurden mit KpnI und SacI gespalten, die beide das Vektorgrundgerüst außerhalb LB und RB spalten. Als Sonde wurde die Vektorsequenz des K-Plasmids, gezeigt als gestrichelter Balken, nach Restriktion mit KpnI und SacI, verwendet.
    • (B) DNA-Gel-Blotanalyse. Die T-DNA-Vektoren, von denen ein mindestens 1000 bp langes Vektorgrundgerüst mittels PCR-Analyse der transgenen Pflanzen gefunden wurde, sind über jeder Bande angezeigt. Ein Fragment zu 8476 bp (Pfeil 1) wird beobachtet, wenn die gesamte Vektorgrundgerüstsequenz des K-Plasmids (K1 und K2 tragen ein unterschiedliches Strukturgen in ihrer T-DNA, aber sind ansonsten identisch) integriert wird, wohingegen Fragmente zu 7066 bp (Pfeil 2) nachgewiesen werden, wenn die gesamte Vektorgrundgerüstsequenz des Hsb-Plasmids integriert wird. Die K- und Hsb-T-DNA-Plasmide sind in Beispiel 1 beschrieben. Die genomischen DNA-Proben in den Bahnen 1, 2 und 5 sind von Pflanzen aus anderen als den beschriebenen Experimenten abgeleitet. Bahn C: genomische DNA von nicht-transformierter A. thaliana. Plasmidbahnen: enthalten reine DNA der angegebenen Plasmide, die mit KpnI und SacI gespalten wurden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Transformation von A. thaliana (L.) Heynh und Nicotiana tabacum (L.)
  • Die Plasmide pK2L610 ('K'-T-DNA-Vektor; De Buck et al. 1998), pSingle gus ('Ksb1'-T-DNA-Vektor; siehe nachstehend) und pHSB610 ('Hsb'-T-DNA-Vektor; De Buck et al. 1999) wurden zur Transformation der Pflanzen verwendet. Der Vektor pSingle gus ('Ksb1') ist ähnlich dem Vektor pHSB610 ('Hsb'), aber das Pnos-hpt-3'-nos-Fragment von pHSB610 ('Hsb') ist gegen eine Pnos-nptII-3'-nos-Kassette in pSingle gus ('Ksb1') ausgetauscht. Als selektierbarer Marker für die Pflanzentransformation enthalten die K- und Ksb1-Vektoren das Neomycinphosphotransferase II-Gen (nptII) und der Hsb-Vektor enthält das Hygromycinphosphotransferase-Gen (hpt). A. thaliana wurde mit den Plasmiden K und Hsb gemäß dem Agrobacterium vermittelten Arabidopsis-Wurzeltransformationsverfahren cotransformiert (De Buck et al. 1999, Valvekens et al. 1988). Tabak (N. tabacum) wurde mit dem Plasmid Ksb gemäß dem Agrobacterium vermittelten Blattscheibentransformationsverfahren (Horsch et al. 1985) transformiert. Die transgenen Pflanzen wurden auf Medien regeneriert, die die geeigneten Pflanzenwachstumshormone und das geeignete Selektionsmittel enthalten. In der Serie 1 wurden 18 transgene A. thaliana-Pflanzen, die mit den K- und Hsb-T-DNA-Vektoren co-transformiert worden waren, erhalten. In Serie 2 wurden 36 N. tabacum-Pflanzen, die mit dem Ksb-T-DNA-Vektor transformiert worden waren, erhalten. In einer weiteren Serie wurden 26 N. tabacum-Pflanzen, die mit dem Ksb-T-DNA-Vektor transformiert worden waren, erhalten.
  • Beispiel 2
  • Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen, bewertet mittels PCR
  • Für die PCR-Analyse wurde die DNA aus Blattmaterial von N. tabacum, wie von Jones et al. (1985) beschrieben und von A. thaliana gemäß De Neve et al. (1997) isoliert. Um die transgenen Pflanzen auf die Integration von Vektorse quenzen durchzumustern, wurden verschiedene PCR-Reaktionen durchgeführt. Die DNA (100 ng) wurde mit 500 ng jedes Primers in 1x Taq-Polymeraseinkubationspuffer (Roche Diagnostics, Brüssel, Belgien) inkubiert. Zweieinhalb Einheiten Taq-Polymerase wurden zu einem Endvolumen von 100 μL zugegeben. Die Proben wurden 5 min auf 94°C vor der PCR erhitzt. Die Denaturierung wurde 1 min bei 94 durchgeführt. Die Assoziierung trat während 2 min bei 57°C ein, und die Extensionsreaktion wurde bei 72°C für 5 min durchgeführt, während 30 Zyklen durchgeführt wurden. Die Primerkombinationen wurden so gewählt, dass die Anwesenheit von mindestens 100 bp ('RB100' und 'LB100' in Tabellen 1 und 2) oder mindestens 1000 bp ('LB1000' und 'RB1000' in Tabellen 1 und 2) Vektorgrundgerüst zu einem diagnostischen PCR-Fragment bekannter Größe führt. Um sicherzustellen, dass das amplifizierte PCR-Produkt nicht von kontaminierenden Agrobacterium-Zellen abgeleitet ist, die noch in dem Pflanzengewebe vorhanden wären, wurde eine PCR-Reaktion mit jeder DNA mit zwei Primern, die spezifisch für das chromosomale A. tumefaciens-Gen picA sind, durchgeführt (Yusibov et al. 1994).
  • Die A. thaliana-Pflanzen der Serie 1 enthalten 18 transgene Pflanzen, die mit den K- und Hsb-T-DNA-Vektoren transformiert wurden. Der K-Vektor enthält Ränder im natürlichen Octopinkontext mit inneren und äußeren Randregionen von jeweils 150 bp bzw. 255 (RB)–300 (LB) bp, wohingegen der Hsb-Vektor nur die äußeren Randregionen enthält. Ein Screening auf die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen zeigte, dass Vektorsequenzen aus den K- und den Hsb-T-DNAs in 33 % (6/18) bzw. in 61 % (11/18) der transgenen Pflanzen gefunden wurden. Nur in einer Transformante waren die Vektorsequenzen nicht mit der T-DNA verknüpft. Keine größeren Unterschiede wurden in den Frequenzen des mit der RB-Region des Hsb (6/18) und der RB-Region (4/18) des K-Plasmid verknüpften Vektors nachgewiesen (siehe Tabelle 1). Jedoch wurde viel mehr Vektor an der LB-Region der Hsb-T-DNA (11/18) als der der K-T-DNA integriert. In allen Fällen, in denen eine integrierte T-DNA Vektorsequenzen in RB enthält, konnten auch Vektorsequenzen in LB nachgewiesen werden.
  • Die Tabakpflanzen der Serie 2 enthalten 36 transgene Pflanzen, die mit einem Ksb-Vektor transformiert wurden. Dieser Vektor enthält auch RB und LB ohne innere Randregionen und ist daher mit dem Hsb-Vektor vergleichbar. In 53 % (19/36) der analysierten Transformanten (siehe Tabelle 2) wurden Vektorsequenzen gefunden; diese waren nur an LB (8/19), nur das rechte Ende der T-DNA (1/19) oder an beide Enden (10/19) gebunden.
  • In einer weiteren Serie von Tabaktransformanten, die die Ksb-T-DNA (Daten nicht gezeigt) enthalten, enthielten 81 % der Transformanten (21/26) Vektorsequenzen, die an LB geknüpft waren und 61 % (16/26) Sequenzen, die an RB geknüpft waren (Daten nicht gezeigt). Es ist jedoch auffällig, dass von diesen 16 Transformanten, die RB-Grundgerüstsequenzen enthalten, 15 % auch integrierte LB-Vektorsequenzen umfassen (Daten nicht gezeigt).
  • Zusammengefasst enthielten in den drei verschiedenen Serien von Transformanten, in denen ein T-DNA-Vektor ohne innere Randsequenzen verwendet wurde, mehr als 50 % der Transformanten Vektorgrundgerüst-DNA. Nur wenige Transformanten enthielten Vektor-DNA in Verknüpfung nur an das rechte T-DNA-Ende. Im Allgemeinen konnte, wenn an den rechten Rand gebundene Vektor-DNA vorhanden war, auch an das linke T-DNA-Ende gebundene Vektor-DNA nachgewiesen werden. Dies impliziert, dass insbesondere das Durchlesen an der linksrandigen Wiederholungssequenz infolge unzureichender Nick-Bildung für die Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen verantwortlich ist. Es ist möglich, dass die Deletion der inneren Randregion einem Stück der T-DNA, die in dem ursprünglichen Ti-Plasmid vorhanden war, aus dem der Vektor abgeleitet wurde, eine ineffiziente Nick-Bildung des LB-Repeats verursacht, was zu einem Durchlesen hinter LB und dem Transfer von stromabwärts angeordneten Vektorsequenzen führt. In Übereinstimmung damit beobachteten Horsch und Klee (1986), dass die Gesamtrate des Transfers von Plasmiden, die nur die 25 bp große Wiederholungssequenz enthalten, in Pflanzen nicht so hoch ist, wie bei den größeren von Ti abgeleiteten Randfragmenten, was nahe legt, dass zusätzliche Sequenzen, die die randständigen Wiederholungssequenzen umgeben, eine gewisse Rolle bei dem Transfer spielen. Diese Autoren haben jedoch nicht die Frage einer möglichen Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen in transgene Pflanzen unter Verwendung des Vektors angesprochen.
  • Beispiel 3
  • Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen, bewertet mittels DNA-Gel-Blotting
  • Eine DNA-Gel-Blotanalyse wurde im Wesentlichen nach Maniatis et al. (1982) auf etwa 0,6 μg genomischer DNA durchgeführt. Die verwendeten Restriktionsspaltstellen (KpnI-SacI) sind in 5A angegeben. Als Sonde wurde die Vektorsequenz des K-Plasmids nach Restriktion mit KpnI und SacI verwendet. Das nicht-radioaktive "Gene images" random prime labelling-Modul und das "Gene images" CDP Star detection-Modul (Amersham, Aylesbury, UK) wurden für die Hybridisierung bzw. die Detektion verwendet.
  • Wie in Beispiel 2 dargestellt, wurde eine Verknüpfung sowohl der RB- als auch der LB-Regionen an ein mindestens 1000 bp großes Vektorgrundgerüstfragment von einem oder beiden Plasmiden in verschiedenen Transformanten der Serie 1 beobachtet (siehe Tabelle 1). Um zu bestimmen, ob das vollständige binäre T-DNA-Plasmid (T-DNA + Vektorgrundgerüstsequenzen) in das Genom dieser Transformanten integriert ist, wurde eine DNA-Gel-Blotanalyse mit der K-Vektorsequenz als Sonde durchgeführt. Wenn die ganze Vektorsequenz vorhanden ist, sollte die Restriktion der genomischen DNA mit KpnI und SacI zur Detektion eines Fragments von etwa 8467 bp Länge für K (Pfeil 1 in 5B) und von 7066 bp Länge für Hsb (Pfeil 2 in 5B) führen. Die in 3B dargestellte DNA-Gel-Blotanalyse zeigt, dass in 10 der 11 analysierten Pflanzen die gesamte Vektorgrundgerüstsequenz in das Pflanzengenom integriert war. Die Proben in den Bahnen 1, 2 und 5 sind von Pflanzen aus anderen als den beschriebenen Experimenten abgeleitet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass vollständige Vektorsequenzen häufig in das Pflanzengenom integriert werden.
  • Beispiel 4
  • Konstruktion optimierter T-DNA-Vektoren mit modifizierten linken Rändern.
  • Beispielhaft optimierte binäre T-DNA-Vektoren mit Modifikationen der in 2 angegebenen Typen wurden wie folgt konstruiert.
  • In diesem Beispiel sind alle optimierten T-DNA-Vektoren, die in diesem Beispiel beschrieben sind, von pTHW136 abgeleitet. Der binäre Vektor pTHW136 enthält rechtsrandige und linksrandige Kernsequenzen vom Octopintyp, die eine unvollständige Wiederholungssequenz bilden und jeweils von randständigen Außenregionen vom Octopintyp, die aus pTi15955 (224 bp im Falle der RB-Außenregion und 268 bp im Falle der LB-Außenregion) stammen, flankiert sind. Auf der T-DNA von pTHW136 sind eine GUS-Intronexpressionskassette (35S-Promotor-GUS-offener Leserahmen, unterbrochen durch einen Intron-35S-Terminator) und ein nptII selektierbares Markergen (nos-Promotor-nptII-offener Leserahmen-ocs-Terminator) lokalisiert.
  • Um beispielhafte binäre T-DNA-Vektoren der in 2 angegebenen Typen zu erzeugen, wurde die GUS-Intronexpressionskassette aus pTHW136 durch Spaltung mit XbaI und HindIII, gefolgt von einem Auffüllen der Überhänge mit der Klenow-Polymerase und Religation der so erhaltenen glatten Enden, entfernt. Der nach diesem Verfahren erhaltene Vektor wird weiter als p0130 bezeichnet.
  • In einem folgenden Schritt wurde das nptII-selektierbare Marker-Gen aus p0130 durch Spaltung mit BamHI und anschließende Religation der kompatiblen Vektor-Überhänge entfernt. Dieses Verfahren ergab einen binären T-DNA-Vektor, der als pCDVIB bezeichnet wurde. Der Vektor pCDVIB enthält so eine LB-Region vom Octopintyp, die eine Kernsequenz umfasst, die durch eine randständige Außenregion flankiert ist, und so ein Konstrukt des B-Typs, wie in 2 angezeigt, ist. Um ein Konstrukt des E-Typs, wie in 2 angezeigt, zu erzeugen, wurden zwei lange Oligo nukleotide, prmCDVIBIF und prmCDVIBIR, mit den folgenden Sequenzen entwickelt:
    5'(1) CATGGAGCGGCGGCAGGATATATTCAATTGTAAATGGCTAGCGGCGGCAGG ATATATTCAATTGTAAATGGCTG(84)3' SEQ ID NO: 5); partielle Ncol-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen, linksrandige Kernsequenzen kursiv und einfach unterstrichen, 3'-Ende G-Rest-Teil einer BamHI-Spaltstelle; und -prmCDVIBIR
    5'(1) GATCCAGCCATTTACAATTGAATATATCCTGCCGCCGCTAGCCATTTACAATT GAATATATCCTGCCGCCGCTC(84)3' (SEQ ID NO: 6); partielle Bam-HI-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen, linksrandige Kernsequenzen kursiv und einfach unterstrichen, 3'-Ende C-Rest-Teil einer NcoI-Spaltstelle.
  • Die Oligonukleotide prmCDVIB1F und prmCDVIB1R sind über eine Entfernung von 80 Nukleotiden komplementär und ergeben nach Assoziieren ein dsDNA-Fragment mit einem 5'-NcoI-Überhang ('CATG') an dessen 5'-Ende (bezogen auf prmCDVIBIF) und mit einem 5'-BamHI-Überhang ('GATC') an dessen 3'-Ende (bezogen auf prmCDVIBIF). Dieses dsDNA-Fragment enthält ferner ein Tandem aus zwei LB-Kernsequenzen vom Octopintyp entsprechend den Nukleotiden 12–33 und 46–67 von prmCDVIB1F. Beide LB-Kernsequenzen sind stromaufwärts und stromabwärts durch weitere 6 Basenpaare, die aus dem natürlichen LB von pTi15955 stammen und identisch wie in pTiAch5 (Gielen et al. 1984) sind, extendiert. Die Wiederholungssequenzen in dem Tandem der LB-Kernsequenzen sind somit durch 12 bp getrennt. Das dsDNA-Fragment mit den tandemartig angeordneten LB-Kernsequenzen wurde stromaufwärts von und benachbart zu der LB-Kernsequenz von p0130, das mit NcoI und BamHI gespalten worden war, insertiert, was pCDVIB1 ergab. pCDVIB1 enthält somit eine linke Randregion vom Octopintyp, die eine LB- Außenregion und drei tandemartig angeordnete LB-Kernsequenzen umfasst.
  • Um ein Konstrukt des in 2 angegebenen A-Typs zu erzeugen, wurden zwei lange Oligonukleotide, prmCDVIB2F und prmCDVIB2R, mit den folgenden Sequenzen erzeugt:
    5'(1) CATGGCCGGGAAATCTACATGGATCAGCAATGAGTATGATGGTCAATATGGA GAAAAAGAAAGAGTAATTACCAATTTTTTTTCAATTCAAAAATGTAGATGTCCG (116)3' (SEQ ID NO: 7); partielle NcoI-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen; 3'-Ende G-Rest-Teil einer BamHI-Spaltstelle; und
    -pCDVIB2R:
    5'(1) GATCCGGACATCTACATTTTTGAATTGAAAAAAAATTGGTAATTACTCTTTC TTTTTCTCCATATTGACCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGC (116)3' (SEQ ID NO: 8); partielle BamHI-Spaltstelle in fett und doppelt unterstrichen, 3'-Ende C-Rest-Teil einer NcoI-Spaltstelle.
  • Die Oligonukleotide prmCDVIB2F und prmCDVIB2R sind über eine Entfernung von 112 Nukleotiden komplementär und ergeben nach Assoziierung ein dsDNA-Fragment mit einem 5'-NcoI-Überhang ('CATG') an dessen 5'-Ende (bezogen auf prmCDVIB1F) und mit einem 5'-BamHI-Überhang ('GATC') an dessen 3'-Ende (bezogen auf prmCDVIB1F). Das dsDNA-Fragment enthält ferner eine Innenregion von 112 bp aus pTi15955. Dieses Fragment wurde stromaufwärts und benachbart zu der LB-Kernsequenz von p0130, gespalten mit NcoI und BamHI, insertiert, wobei pCDVIB2 erhalten wurde. PCDVIB2 enthält so eine LB-Region vom Octopintyp, die eine LB-Kernsequenz eingebettet in äußere und innere LB-Regionen umfasst.
  • Ein weiteres T-DNA-Vektorkonstrukt wurde mit einem modifizierten LB erzeugt und kombiniert die Merkmale der Konstrukte vom E-Typ und F-Typ, wie in 2 angegeben. Eine integrale LB-Region vom Nopalintyp wurde als 331 bp langes BclI-EcoRI-Fragment des binären T-DNA-Vektors pPZP200 erhalten. Dieses Fragment umspannt die äußere LB-Region vom Nopalintyp, die LB-Kernsequenz und die innere LB-Region, die aus pTiC58 stammt (Gielen et al. 1999). Die LB-Region vom Nopalintyp, wurde stromaufwärts von und benachbart zu der LB-Region vom Octopintyp von pCDVIB2 (enthaltend tandemartig wiederholte LB-Kernsequenzen vom Octopintyp), die mit BamHI (lokalisiert am 3'-Ende des LB-Kernsequenz-Tandems, bezogen auf prmCDVIB2F) und EcoRI, gespalten worden war, insertiert, wodurch pCDVIB3 erhalten wurde. pCDVIB3 enthält so eine LB-Region, die eine Kopie einer integralen LB-Region vom Octopintyp mit drei tandemartig angeordneten Kernsequenzen und einer Kopie einer integralen LB-Region vom Nopalintyp umfasst.
  • Alle beschriebenen beispielhaften T-DNA-Vektoren mit einer modifizierten LB-Region, d.h. pCDVIB, pCDVIB1, pCDVIB2 und pCDVIB3 dienen als Ausgangspunkt, um ein Gen bzw. Gene von Interesse und/oder ein selektierbares Marker-Gen bzw. -Gene zwischen RB und LB der T-DNA-Vektoren zu insertieren.
  • Das selektierbare Marker-Gen Neomycinphosphotransferase (nptII) unter der Kontrolle des Nopalinsynthease-(nos)-Promotors (Pnos-nptII-3'ocs) und der β-Glucuronidase(gus)-Expressionskassette unter der Kontrolle des 35S-Blumenkohlmosaikvirus-Promotors (P35S-gus-3'nos) wurden zwischen RB und LB der T-DNA-Vektoren insertiert.
  • Die nptII-gus-Kassette wurde von dem Plasmid pXD610 (De Loose et al., 1995) als ein EcoRI-AgeI-Fragment abgeleitet. Dieses Fragment wurde in die SalI/EcoRI-Spaltstellen von pCDVIB; pCDVIB1; pCDVIB2 und PCDVIB3 insertiert. Um kompatible klebrige Enden zu erhalten, wurden zwei Adapteroligonukleotide zwischen den offenen AgeI- und SalI-Spaltstellen mit den folgenden Sequenzen verwendet:
    *Napod3:
    CCGGTGGCTCGAGG (SEQ ID NO: 9); partielle AgeI-Spaltstelle in fett, 3'-Ende, G-Rest, Teil von SalI-Spaltstelle
    und
    *Napod4:
    TCGACCTCGAGCCA (SEQ ID NO: 10), partielle SalI-Spaltstelle unterstrichen, 3'-Ende, A-Rest, Teil einer AgeI-Spaltstelle.
  • Die Oligonukleotide Napod3 und Napod4 sind über eine Entfernung von 8 Nukleotiden komplementär und ergeben nach Assoziierung ein dsDNA-Fragment mit einem 5'-AgeI-Überhang ('CCGG') an dessen 5'-Ende (bezogen auf Napod3) und mit einem SalI-Überhang ('TCGA') an dessen 3'-Ende (bezogen auf Napod3). Die so erhaltenen Vektoren wurden als pCDVIB+gusnpt, pCDVIB1+gusnpt, pCDVIB2+gusnpt, pCDVIB3+gusnpt bezeichnet.
  • Beispiel 5
  • Konstruktion von optimierten T-DNA-Vektoren mit integrierten Rekombinationsstellen.
  • Beispielhaft optimierte binäre T-DNA-Vektoren der in 3 angegebenen Typen werden wie folgt konstruiert. In diesem Beispiel ist der optimierte binäre T-DNA-Vektor von pCDVIB (siehe Beispiel 4) abgeleitet.
  • Eine Strategie zur Einschleusung von Rekombinationsstellen umfasst:
    • 1. Entwickeln von Paaren von Primern für die PCR-Amplifikation von Vektordomänen stromaufwärts von RB und stromabwärts von LB. Die Domänen sollen eine einzigartige Restriktionsspaltstelle stromaufwärts von RB (z.B. die NarI-Spaltstellen in dem pVS1-Replikon, enthalten in dem Vektorgrundgerüst von pCDVIB) und stromabwärts des LB (z.B. die BclI-Spaltstelle in dem Sm/Sp-Resistenzmarker, enthalten in dem Vektorgrundgerüst von pCDVIB) umfassen. Die an oder nahe bei RB oder LB lokalisierten PCR-Primer werden so entwickelt, dass sie eine einzigartige 5'-Restriktionsspaltstelle, gefolgt von der Rekombinationsstelle (z.B. der FRT-Stelle) in ihrer richtigen Orientierung (als direkte Wiederholungssequenzen außerhalb der T-DNA-Ränder im Falle von FRT-Stellen) und gefolgt von einem Teil der Außenregionen des Rands enthalten. Die so erhaltenen PCR-Produkte werden anschließend mit den geeigneten Enzymen verdaut.
    • 2. Entwickeln komplementärer Oligonukleotidpaare (ähnlich wie in Beispiel 4) nach Assoziieren, was dsDNA-Moleküle ergibt, die entweder die RB- oder die LB-Kernsequenz umfassen, und mit einem Überhang komplementär zu der einzigartigen 5'-Restriktionsspaltstelle der Primer in (1), lokalisiert an oder in der Nähe zu den Rändern, und mit einem zweiten Überhang komplementär zu einer einzigen Restriktionsspaltstelle stromabwärts der RB-Kernsequenz (z.B. ScaI in pCDVIB) oder komplementär zu einer einzigartigen Restriktionsspaltstelle stromaufwärts der LB-Kernsequenz (z.B. NcoI in pCDVIB) versehen ist.
    • 3(a) Spalten von pCDVIB mit NarI (in dem pVS-Replikon) und ScaI (stromabwärts der RB-Kernsequenz), gefolgt von einer trimolekularen Ligierung des 1) erhaltenen Vektors, mit 2), dem gespaltenen PCR-Produkt, das das deletierte pCDVIB-Fragment umfasst und die Rekombinationsstellen einführt, und 3) der dsDNA, basierend auf den assoziierten Oligonukleotiden und Wiedereinschleusen der RB-Kernsequenz.
    • 3(b) Spalten des abschließend in (3a) erhaltenen Vektors mit BclI (im Sm/Sp-Resistenzmarker) und NcoI (stromaufwärts der LB-Kernsequenz), gefolgt von einer trimolekularen Legierung des 1) so erhaltenen Vektors mit 2), dem gespaltenen PCR-Produkt, das das deletierte pCDVIB-Fragment umfasst und die Rekombinationsstellen einführt, und 3) der dsDNA, basierend auf den assoziierten Oligonukleotiden, und Wiedereinschleusen der LB-Kernsequenz.
  • Die beschriebenen beispielhaften T-DNA-Vektoren mit eingeführten Rekombinationsstellen dienen als Ausgangspunkt, um ein Gen bzw. Gene von Interesse und/oder ein Gen bzw. Gene für einen selektierbaren Marker zwischen RB und LB des T-DNA-Vektors zu insertieren.
  • Beispiel 6
  • Vorhersage der Häufigkeiten von Vektorgrundgerüsttransfer unter Verwendung induzierter Agrobacterium-Kulturen.
  • Agrobacterium-Stämme, die irgendeinen T-DNA-Vektor enthalten, können zur Produktion von ssT-DNA-Strängen durch Hinzufügen von Acetosyringon in einer Konzentration von 100 μM zum Kulturmedium (Durrenberger et al. 1989) induziert werden. Die Produktion von ssT-DNA-Strängen kann unter Verwendung einer der folgenden Methoden analysiert werden (siehe beigeschlossene Figur für einen schematischen Überblick).
    • 1. Gesamt-DNA wird aus den Agrobacterium-Zellen, die einen gegebenen T-DNA-Vektor enthalten, isoliert. Duplizierte nicht-denaturierende Southern-Blots (Tinland et al. 1995) von etwa 5 μg dieser DNA, die aus den verschiedenen Agrobacterium-Stämmen isoliert wurden, werden an zwei verschiedene Sonden hybridisiert: eine erkennt eine DNA-Sequenz, die Teil der T-DNA ist, und eine erkennt eine DNA-Sequenz, die Teil des Vektorgrundgerüsts ist, das den linken Rand flankiert. Das Hybridisierungssignal der Sonde, die die Vektorgrundgerüstsequenzen erkennt, ist im Falle eines T-DNA-Vektors, aus dem der linke Rand mit hoher Effizienz prozessiert ist, fehlend oder stark reduziert. Das Hybridisierungssignal der Sonde, die die T-DNA erkennt, ist jedoch konstant.
    • 2. Gesamt-DNA wird aus den Agrobacterium-Zellen, die einen gegebenen T-DNA-Vektor enthalten, isoliert. Zwei separate Spaltungsansätze, die gleiche Mengen an Gesamt-DNA enthalten, werden angesetzt, eine mit einem Restriktionsenzym, das die T-DNA an oder sehr nahe zu dem linken Rand spaltet, der andere mit einem Restriktionsenzym, das innerhalb der T-DNA-Sequenz spaltet. Die ssT-DNA-Stränge werden jedoch intakt bleiben. Spezifische Primerpaare werden in einer quantitativen PCR verwendet, um eine aus der T-DNA stammende Sequenz und eine aus dem Vektor stammende Sequenz stromabwärts des linken Rands zu amplifizieren. Wieder wird keines oder viel weniger Vektorgrundgerüst-Amplifikationsprodukt im Falle eines T-DNA-Vektors erhalten, aus dem der linke Rand mit hoher Effizienz prozessiert ist. Die Mengen an T-DNA-spezifischem Amplifikationsprodukt sind jedoch konstant.
  • Für beide Typen von Analysen wird eine zusätzliche GFP-(grünes fluoreszierendes Protein)Expressionskassette unmittelbar stromabwärts des linken Rands der zwei verschiedenen T-DNA-Vektoren kloniert. Diese Kassette liefert eine vollständig bekannte "Vektorgrundgerüst"-Sequenz stromabwärts des linken Rands. Die GUS-Expressionskassette wird als T-DNA-spezifisches Target verwendet. Beide Expressionskassetten enthalten ein Intron in den GFP- und den GUS-codierenden Regionen, um die Expression beider Marker in Agrobacterium zu verhindern.
  • In 6 sind beide experimentellen Anordnungen schematisch gezeigt. Über der durchgezogenen schwarzen Linie, die den T-DNA-Vektor bezeichnet, ist der Hybridisierungsansatz gezeigt, und unter der durchgezogenen Linie ist der quantitative PCR-Ansatz gezeigt.
  • Beispiel 7
  • Frühe Analyse der Transfersequenzen des Vektorgrundgerüsts in Pflanzenzellen
  • Die in Beispiel 6 dargestellten Konstrukte, die eine zusätzliche GFP-Expressionskassette stromabwärts des linken Rands enthalten, werden in einem Assay auf vorübergehende Expression zur Bewertung des Transfers des Vektorgrundgerüsts in die Pflanzenzellen verwendet. Dazu werden Arabidopsis-Wurzelfragmente mit Agrobacterium (De Buck et al. 1999, Valvekens et al. 1988), das einen vorstehend beschriebenen T-DNA-Vektor enthält, transformiert. Nach 3 Tagen Co-Kultivation werden die Wurzeln zuerst auf vorübergehende Expression von GFP, gefolgt von einer Bewertung von vorübergehend exprimiertem GUS, bewertet. Der Gehalt an GFP-Expression ist niedrig oder Null im Falle eines T-DNA-Vektors, aus dem der linke Rand mit hoher Effizienz prozessiert ist. Die Gehalte an GUS-Aktivitäten sind jedoch konstant.
  • Alternativ wird das Verfahren der reversen Transkription, gefolgt von PCR, zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Gehalte an vorübergehend akkumulierten GFP- und GUS-Iranskripten befolgt (Narasimhulu et al. 1996). Wieder wird kein oder viel weniger GFP-spezifisches Amplikationsprodukt im Falle eines T-DNA-Vektors, aus dem der linke Rand mit hoher Effizienz prozessiert ist, erhalten. Die Mengen an GUS-spezifischem Amplifikationsprodukt sind jedoch konstant.
  • Beispiel 8
  • Erzeugung von Unempfindlichkeit der transformierten Pflanzen gegenüber integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen.
  • Pflanzen (z.B. Arabidopsis) werden mit dem beispielhaften T-DNA-Vektor von Beispiel 5, der die FRT-Rekombinationsstellen enthält, transformiert (siehe Beispiel 1).
  • Regenerierte Pflanzen werden auf Integration von Vektorgrundgerüst gemäß einem der in den Beispielen 2–3 oder 6–7 beschriebenen Verfahren getestet, und transgene Pflanzen, die die T-DNA und Vektorgrundgerüst in ihrem Genom enthalten, werden selektiert.
  • Beim Blühen wird ein Satz der selektierten transgenen Pflanzen mit Pollen, der von einer anderen transgenen Pflanze, die konstitutiv die FLP-ortsspezifische Rekombinase exprimiert, stammt, kreuzbestäubt, während ein zweiter Satz ausgewählter transgener Pflanzen mit Pollen, der von einer Wildtyp-Pflanze stammt, kreuzbestäubt wird. Die Samen werden gewonnen und auf Medium, das ein Selektionsmittel enthält, ausgesät. Die überlebenden Pflanzen (infolge des selektierbaren Markers in der T-DNA) beider Kreuzungen werden erneut auf die Anwesenheit von T-DNA und auf die Anwesenheit von Vektorgrundgerüst analysiert. In einem wesentlichen Teil der Nachkommen der Kreuzungen unter Beteiligung des FLP-exprimierenden Elternteils und unter Erhalt der T-DNA sind die Vektorgrundgerüstsequenzen entfernt. In den Nachkommen der Kreuzungen unter Beteiligungen der Wildtyp-Eltern und unter Erhalt der T-DNA sind die Vektorgrundgerüstsequenzen immer noch vorhanden.
  • Beispiel 9
  • Klonierung des virD-Locus und Einfluss einer Extrakopie des Locus auf den Transfer des Vektorgrundgerüsts.
  • Die Sequenzen der virD-Loci vom Octopintyp und Nopalintyp sind bekannt (Yanofsky et al. 19986, Jayaswal et al. 1987; bzw. Wang et al. 1990). Spezifische Primer werden entwickelt, um die PCR-Amplifikation der vollständigen virD-Loci zu ermöglichen. Diese Loci werden anschließend in ein Plasmid, das das P15a-Replikon trägt (Chang und Cohen 1987) und einen von pAlter (Promega) abgeleiteten Tetracyclin-Resistenzmarker trägt, subkloniert. Die Plasmide werden anschließend in Agrobacterium, das einen T-DNA-Vektor enthält, überführt. Der Transfer der Vektorgrundgerüstsequenzen durch die Agrobacterium-Stämme wird gemäß einem der in den Beispielen 2, 3, 5 oder 6 beschriebenen Verfahren analysiert.
  • Beispiel 10
  • Bestimmung der Frequenz der Initiation des Transfers am linken Rand
  • Pflanzen werden mit den in 2 beschriebenen T-DNA-Vektoren transformiert. Gesamt-DNA wird präpariert und drei Primersätze werden synthetisiert, um verschiedene PCR-Reaktionen durchzuführen. Der erste Primersatz amplifiziert ein internes T-DNA-Fragment, das der Wiederholungssequenz am linken Rand benachbart ist (PCR-Fragment 1). Der zweite Primersatz amplifiziert ein T-DNA/Vektorfragment, das die linksrandige Region der T-DNA und die Vektorregion benachbart zu der linksrandigen Wiederholungssequenz umfasst (PCR-Fragment 2). Schließlich amplifiziert der dritte Primersatz ein Vektorfragment, das der linksrandigen Wiederholungssequenz benachbart ist (PCR-Fragment 3). In Abhängigkeit davon, ob der Vektortransfer aus einem Durchlesen am linken Rand oder der Initiation am linken Rand entstammt, werden verschiedene PCR-Fragmente amplifiziert. Wenn nur das PCR-Fragment 1 vorhanden ist, begann der T-DNA-Transfer am rechten Rand und endete am linken Rand, und keine Vektor-DNA wurde transferiert. Wenn die PCR-Fragmente 1, 2 und 3 vorhanden sind, begann der T-DNA-Transfer am rechten Rand, aber stoppte nicht am linken Rand. Wenn die PCR-Fragmente 1 und 3, aber nicht das Fragment 2, vorhanden sind, startete der Vektortransfer am linken Rand, unabhängig vom T-DNA-Transfer vom rechten Rand. Die Durchführung dieser verschiedenen PCR-Reaktionen für etwa 50 Transformanten ergibt so die Häufigkeit des Durchlesens am linken Rand und die Häufigkeit der Initiation an der linksrandigen Wiederholungssequenz. Die Häufigkeit des Durchlesens und die Initiation von Vektortransfer werden für die verschiedenen T-DNA-Vektoren mit der linksrandigen Wiederholungssequenz in verschiedenen Kontexten bestimmt. Tabelle 1. Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (–) von Vektorsequenzen, die mit LB und RB der T-DNA in den transgenen A. thaliana-Pflanzen, die mit den K- und Hsb-T-DNA-Vektoren co-transformiert wurden, verknüpft sind.
    Anzahl der CoTransformanten LB100 LB1000 RB100 RB1000 LB100 LB1000 RB100 RB1000 PicA Unlb
    Serie 1 (18 Pflanzen) K Hsb
    3 – – – – – – – – – –
    1 – – – – – – – – – +(R)
    1 – – – – + – – – – +(R)
    3 – – – – + + – – – +(R)
    1 – – – – + + – – – –
    1 + + – – – – – – – –
    1 – – – – + – + + – ntc
    1 + + – – + – + – – nt
    2 – – – – + + + + – nt
    1 + + + – – – – – – nt
    1 + + + + – – – – – nt
    1 + + + + + + – – – nt
    1 + + + + + + + + – nt
    • a bezeichnet die Anzahl der Transformanten mit einem speziellen Muster an Vektorsequenzen, die in den transformierten Pflanzen vorhanden sind.
    • b Wiederholungssequenzfragmente zum rechten (R) oder linken (L) externen Rand sind von einem der T-DNA-Vektoren vorhanden, nicht verknüpft mit einem der beiden Ränder. nicht getestet
    Tabelle 2. Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (–) von Vektorsequenzen, die mit LB und RB der T-DNA in den transgenen N. tabacum-Pflanzen, die mit dem Ksb-T-DNA-Vektor transformiert wurden, verknüpft sind.
    Anzahl der Co-Transformantena LB100 LB1000 RB100 RB1000 PicA Unlb
    Seite 2 (36 Pflanzen) Ksb
    17 – – – – – –
    3 + – – – – –
    2 + + – – – +(R)
    3 + + – – – –
    1 – – + + – –
    1 + – + – – ntc
    1 + + + – – nt
    8 + + + + – nt
    • a bezeichnet die Anzahl der Transformanten mit einem speziellen Muster an Vektorsequenzen, die in den transformierten Pflanzen vorhanden sind.
    • b Wiederholungssequenzfragmente zum rechten (R) oder linken (L) externen Rand sind von einem der T-DNA-Vektoren vorhanden, nicht verknüpft mit einem der beiden Ränder. nicht getestet
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Claims (23)

  1. T-DNA-Transformationsvektor mit einer T-DNA mit modifizierten linken und rechten flankierenden T-DNA-Rändern, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte rechte T-DNA-Rand aus einer einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz besteht, die von einem rechtsrandigen Außenbereich flankiert wird, und der modifizierte linke T-DNA-Rand aus (i) einer einzelnen linksrandigen Kernsequenz, einem linksrandigen Außenbereich und einem dem Innenbereich nahe liegenden linksrandigen Bereich mit einer bevorzugten Länge von 10 bis 100 bp besteht, darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass der dem Innenbereich nahe liegende linksrandige Bereich eine größere Anzahl von A- und T-Resten aufweist, wobei der Prozentsatz der AT-Reste bei 60 bis 85 % liegt, (ii) einer Wiederholungssequenz der linken T-DNA-Ränder, wobei die Wiederholungssequenz zumindest einen T-DNA-Rand vom Typ Nopalin und zumindest einen linken T-DNA-Rand vom Typ Octopin umfasst, darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte linke T-DNA-Rand zumindest eine linksrandige Kernsequenz, oder (ii) einen linksrandigen Außenbereich und eine Wiederholungssequenz aus wenigstens zwei linksrandigen Kernsequenzen umfasst, die durch eine Sequenz aus mindestens 10 bis 20 Basenpaaren voneinander getrennt sind.
  2. Vektor nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz aus mindestens 10 bis 20 Basenpaaren, die die linksrandigen Kernsequenzen voneinander trennt, in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen Stopcodons trägt.
  3. Vektor nach Anspruch 1, bei dem der modifizierte linke T-DNA-Rand aus einer Wiederholungssequenz von linken T-DNA-Rändern besteht, die zumindest eine integralen linksrandigen Bereich vom Typ Nopalin umfassen, der an den integralen linksrandigen Bereich vom Typ Octopin angrenzt und diesem nachgeschaltet oder vorgelagert angeordnet ist.
  4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten T-DNA-Ränder darüber hinaus Rekombinationsstellen umfassen, die der linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet angeordnet sind, und Rekombinationsstellen, die der rechtsrandigen Kernsequenz vorgelagert angeordnet sind, wobei die Rekombinationsstellen als Wiederholungssequenzen organisiert sind.
  5. Vektor nach Anspruch 4, darüber hinaus eine zweite Reproduktion eines linksrandigen Bereichs umfassend, der dem einzelnen rechtsrandigen Außenbereich vorgelagert angeordnet ist, und wobei die Rekombinationsstelle der Kernsequenz des zweiten linksrandigen Bereichs vorgelagert angeordnet ist.
  6. Vektor nach einem der Ansprüche 4 oder 5, darüber hinaus ein Rekombinase-Gen umfassend, das der Rekombinationsstelle nachgeschaltet angeordnet ist, die der linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet angeordnet ist.
  7. Vektor nach Anspruch 6, bei dem das Rekombinase-Gen angrenzend an den linksrandigen Außenbereich und diesem nachgeschaltet angeordnet ist.
  8. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, mit dem Rekombinase-Gen, das von Wiederholungssequenzen aus Rekombinationsstellen flankiert wird, und wobei der Vektor darüber hinaus eine zweite Reproduktion eines linksrandigen Bereichs umfasst, die dem von den Rekombinationsstellen flankierten Rekombinase-Gen nachgeschaltet angeordnet ist.
  9. Vektor nach Anspruch 8, darüber hinaus zusätzliche Rekombinationsstellen umfassend, die als Wiederholungssequenzen der zweiten linksrandigen Kernsequenz nachgeschaltet und der einzelnen rechtsrandigen Kernsequenz vorgelagert angeordnet sind.
  10. Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinationsstellen angrenzend an die links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen und diesen nachgeschaltet und/oder vorgelagert angeordnet sind, oder von den links- und/oder rechtsrandigen Kernsequenzen, diesen Kernsequenzen nachgeschaltet und/oder vorgelagert, um eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 10 bis 20 bp getrennt sind.
  11. Vektor nach Anspruch 10, bei dem die Sequenz mit einer Länge von mindestens 10 bis 20 bp Stopcodons in den drei Leserahmen und in beiden Richtungen trägt.
  12. Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 11, bei dem die als Wiederholungssequenzen organisierten Rekombinationsstellen entweder als ortsgerichtete Rekombinationsstellen definiert sind, die als direkte Wiederholungssequenzen organisiert sind, oder als Transposon-Randsequenzen, die als invertierte Wiederholungssequenzen organisiert sind; und bei dem das Rekombinase-Gen als ortsgerichtetes Rekombinase- bzw. Transponase-Gen definiert ist.
  13. Vektor für eine durch Agrobacterium vermittelte Transformation, für die agrolistische Transformation oder gentherapeutische Zwecke, mit modifizierten T-DNA-Rändern nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Vektor aus binären Transformationsvektoren, super-binären Transformationsvektoren, co-integrierten Trans formationsvektoren, von Ri abgeleiteten Transformationsvektoren und aus T-DNA tragenden Vektoren ausgewählt ist, die in der agrolistischen Transformation oder Gentherapie verwendet werden.
  14. Verfahren zur Gewinnung von transgenen Pflanzen, Hefen, Schimmelkulturen oder Fadenpilzen, die aus einer durch Agrobacterium vermittelten Transformation dieser Pflanzen, Hefen, Schimmelkulturen oder Fadenpilze bestehen, wobei ein Transformationsvektor aus folgender Gruppe ausgewählt ist: a) ein Transformationsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3; oder b) ein Transformationsvektor nach einem der Ansprüche 4 oder 5 in Kombination mit dem Zusatz einer Rekombinase oder Transposase, um die sich ergebenden transformierten Zellen gegenüber integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen, die eventuell aus dem Vektor entstehen, unempfindlich zu machen; oder c) ein Transformationsvektor nach einem der Ansprüche 6 bis 12, um die sich ergebenden transformierten Zellen gegenüber integrierten Vektorgrundgerüstsequenzen, die eventuell aus dem Vektor entstehen, unempfindlich zu machen, optional in Kombination mit dem Zusatz einer Rekombinase oder Transposase; oder d) ein Transformationsvektor nach Anspruch 13.
  15. Verfahren zur Verhinderung der Integration von Vektorgrundgerüstsequenzen in einer durch Agrobacterium vermittelten, transformierten Zelle, das den Einsatz eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, darüber hinaus umfassend, die Erzeugung der VirD1- und/oder VirD2-Proteine zu erhöhen, die innerhalb des T-DNA-Nick-Komplexes enthalten sind.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, das die Integration zumindest einer zusätzlichen Reproduktion des virD-Locus in das Genom oder in eine extrachromosomale Einheit von Agrobacterium einschließt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die zusätzliche Reproduktion des virD-Locus ein virD- Locus vom Typ Octopin oder ein virD-Locus vom Typ Nopalin ist.
  19. Verfahren zur agrolistischen Transformation einer eukaryotischen Zelle unter Verwendung eines T-DNA-Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
  20. Rekombinante Wirtszelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält.
  21. Wirtszelle nach Anspruch 20, die als Agrobacterium tumefaciens bezeichnet wird.
  22. Transgene Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch ein durch Agrobacterium vermitteltes Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19 erhalten werden kann, wobei ein Teil oder ein Abkömmling davon die T-DNA enthält, die sich aus dem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13 ergibt.
  23. Transgene Hefe, transgene Schimmelkultur oder transgener Fadenpilz, die T-DNA enthaltend, die sich aus dem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13 ergibt und durch ein durch Agrobacterium vermitteltes Transformationsverfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19 erhalten werden kann.
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