DE60034564T2

DE60034564T2 - Menschlicher cytokinrezeptor

Info

Publication number: DE60034564T2
Application number: DE60034564T
Authority: DE
Inventors: Scott R. Tacoma PRESNELL; Steven K. San Antonio BURKHEAD; Sarah L. Pullman POWNDER
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2020-07-01
Also published as: EP1190056A1; EP1860188A3; ES2364086T3; AU6069800A; CA2378519A1; JP2003504058A; IL147336A0; DE60045931D1; CA2378519C; EP1860188A2; ATE360692T1; JP4737903B2; EP2241623A3; EP2241623A2; EP1190056B1; ES2286029T3; EP1860188B1; DE60034564D1; DK1860188T3; ATE508193T1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft generell ein neues, von Humanzellen exprimiertes Protein. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Gen, das einen Rezeptor kodiert, der als „Zcytor14" bezeichnet wird, sowie Nukleinsäuremoleküle, die Zcytor14-Polypeptide kodieren.
STAND DER TECHNIK
Zytokine sind lösliche, kleine Proteine, die eine Vielfalt von biologischen Wirkungen vermitteln, u. a. die Regelung des Wachstums und die Differenzierung vieler Zelltypen (siehe z. B. Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)). Proteine der Zytokingruppe sind u. a. Interleukine, Interferone, Colony-Stimulating-Faktoren, Tumornekrosefaktoren und andere regulatorische Moleküle. So ist z. B. humanes Interleukin-17 ein Zytokin, das die Expression von Interleukin-6, intrazellulärem Adhäsionsmolekül 1, Interleukin-8, Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Faktor und Prostaglandin E2-Expression stimuliert und eine Rolle bei der präferenziellen Reifung von hämatopoetischen CD34+ Vorläufern in Neutrophilen spielt (Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).
Zytokinbindende Rezeptoren setzen sich normalerweise aus einem oder mehreren integrierten Membranproteinen zusammen, die das Zytokin mit hoher Affinität binden und dieses Bindungsereignis durch die zytoplasmischen Teile bestimmter Rezeptoruntereinheiten auf die Zelle umsetzen. Zytokinrezeptoren wurden auf Basis der Ähnlichkeiten in ihren extrazellulären ligandbindenden Domänen in mehrere Klassen eingeteilt. So gehören beispielsweise die Rezeptorketten, die für die Bindung und/oder Umsetzung der Wirkung von Interferonen zuständig sind, basierend auf einer charakteristischen extrazellulären 200-Reste-Domäne zur Familie der Zytokinrezeptoren Typ II.
Die nachgewiesenen in-vivo-Aktivitäten der Zytokine und ihrer Rezeptoren verdeutlichen das klinische Potenzial von und den Bedarf für andere Zytokine, Zytokinrezeptoren, Zytokinagonisten und Zytokinantagonisten.
Die Datenbank EMBL (Online) EBI; 16. November 1998, XP002154807, bietet einen humanen 399bp cDNA-Klon mit der Bezeichnung „gk39g09.x1 NCI_CGAP_Co8 Homo sapiens cDNA clone".
Die vorliegende Erfindung bietet ein isoliertes Polypeptid, welches eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die mindestens 90 % identisch mit eine Aminosäuresequenz ist, die aus einer Gruppe ausgewählt wurde, die Folgendes umfasst: (a) Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2, (b) Aminosäurereste 21 bis 435 der SEQ ID-NR:10, (c) Aminosäurereste 21 bis 677 der SEQ ID-NR:2 und (d) Aminosäurereste 1 bis 692 der SEQ ID-NR:2.
Eine beispielhafte Nukleotidsequenz, die Zcytor14 kodiert, wird von SEQ ID-NR:1 geboten. Das kodierte Polypeptid hat folgende Aminosäurensequenz:
Somit kodiert das Zcytor14-Gen ein Polypeptid der 692 Aminosäuren. Merkmale des Zcytor14 umfassen eine putative Signalsequenz (Aminosäurereste 1 bis 20 der SEQ ID-NR:2), eine extrazelluläre Domäne (Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2), eine Transmembrandomäne (Aminosäurereste 453 bis 473 der SEQ ID-NR:2) und eine intrazelluläre Domäne (welche die Aminosäurereste 474 bis 677 der SEQ ID-NR:2 umfasst).
Ein variantes Zcytor14-Protein, das als „Zcytor14-1" bezeichnet wird, wurde identifiziert und hat die folgende Aminosäurensequenz: EEPRNASLQA

RGVGPGAGPG AGDGT (SEQ ID-NR:5). Eine beispielhafte Nukleotidsequenz, welche dieses Polypeptid kodiert, wird durch SEQ ID-NR:4 bereitgestellt.
Eine Sequenzanalyse zeigte, dass Zcytor14-1 eine gekürzte Form des Rezeptorpolypeptids ist. Das bedeutet, dass im Zcytor14-1 die Aminosäurereste 1-113 der SEQ ID-NR:2 fehlen. SEQ ID-NR:10 bietet eine Aminosäurensequenz eines Zcytor14-1-Polypeptids, welches den N-terminalen Teil des Zcytor14 umfasst.
Ein Vergleich der Zcytor14- und Zcytor14-1-Aminosäurensequenzen weist auch darauf hin, dass die zwei Polypeptide alternativ gespleißte Varianten darstellen. Die Aminosäurensequenz von Zcytor14 umfasst ein Segment mit 17 Aminosäuren (Aminosäurereste 339 bis 355 der SEQ ID-NR:2), welches im Zcytor14-1 fehlt, während beim Zcytor14, nach der Aminosäure 479, ein Segment mit 13 Aminosäuren fehlt, welches im Zcytor14-1 vorhanden ist (Aminosäurereste 350 bis 362 der SEQ ID-NR:5). Ein Polypeptid, das beide Aminosäurensegmente enthält, wird durch SEQ ID-NR:11 geboten, wogegen die SEQ ID-NR:12 die Aminosäurensequenz eines Polypeptids bietet, in dem die 13- und 17-Aminosäurensequenzen fehlen.
Das Zcytor14-Gen befindet sich im Chromosom 3p25-3p24. Wie unten erläutert, ist diese Region mit verschiedenen Störungen und Krankheiten verbunden.
Northern-Analysen zeigen eine starke Expression des Zcytor14-Gens in Schilddrüsen-, Nebennieren-, Prostata- und Lebergewebe sowie eine geringere Expression in Herz-, Dünndarm-, Magen- und Tracheagewebe. Im Gegensatz dazu besteht nur wenig oder gar keine Expression in Gehirn, Plazenta, Lunge, Skelettmuskulatur, Nieren, Speicheldrüse, Milz, Thymus, Hoden, Eierstock, Kolon, periphere Leukozyten, Wirbelsäule, Lymphknoten und Knochenmark. Diese Beobachtungen zeigen, dass Zcytor14-Sequenzen differenziert zwischen verschiedenen Geweben eingesetzt werden können.
Wie unten beschrieben, bietet die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide, welche eine Aminosäurensequenz umfassen, die mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % identisch mit einer Referenzaminosäurensequenz ist, die aus einer Gruppe ausgewählt wurde, die Folgendes umfasst: (a) Aminosäurenreste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2, (b) Aminosäurenreste 21 bis 435 der SEQ ID-NR:10, (c) Aminosäurenreste 21 bis 677 der SEQ ID-NR:2 und (d) Aminosäurenreste 1 bis 692 der SEQ ID-NR:2, wobei das isolierte Polypeptid spezifisch an einen Antikörper bindet, welcher spezifisch an ein Polypeptid bindet, das entweder die Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 oder die Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:10 umfasst. Beispielhafte Polypeptide sind u. a. ein Polypeptid, das die Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2, SEQ ID-NR:10, SEQ ID-NR:11 oder SEQ ID-NR:12 umfasst.
Die vorliegende Erfindung bietet auch isolierte Polypeptide, die eine extrazelluläre Domäne umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Domäne entweder die Aminosäurereste 21 bis 452 der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 oder die Aminosäurereste 21 bis 435 der Aminosäurensequenz SEQ ID-NR:10 umfasst. Solche Polypeptide können des Weiteren eine transmembrane Domäne umfassen, die in einer Carboxyl-terminalen Position relativ zur extrazellulären Domäne sitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die transmembrane Domäne die Aminosäurereste 453 bis 473 der SEQ ID-NR:2 umfasst. Diese Polypeptide können auch eine intrazelluläre Domäne umfassen, die in einer Carboxyl-terminalen Position relativ zur transmembranen Domäne sitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die intrazelluläre Domäne entweder die Aminosäurereste 474 bis 677 der SEQ ID-NR:2 oder die Aminosäurereste 457 bis 673 der SEQ ID-NR:10 umfasst und optional eine sekretorische Signalsequenz, welche in einer Amino-terminalen Position relativ zur extrazellulären Domäne sitzt, dadurch gekennzeichnet, dass die sekretorische Signalsequenz die Aminosäurereste 1 bis 20 der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 umfasst.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch variante Zcytor14-Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurensequenz des varianten Polypeptids eine Identität mit der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 teilt, die aus der Gruppe mit mindestens 70 % Identität, mindestens 80 % Identität, mindestens 90 % Identität, mindestens 95 % Identität oder mehr als 95 % Identität ausgewählt wurde, wobei eine Differenz zwischen der Aminosäurensequenz des varianten Polypeptids und der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 auf eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitionen zurückzuführen ist.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch an solche Polypeptide binden. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale Antikörper, murine monoklonale Antikörper, aus murinen monoklonalen Antikörpern gewonnene humanisierte Antikörper und humane monoklonale Antikörper. Beispielhafte Antikörperfragmente umfassen F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv und minimale Erkennungseinheiten. Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren Zusammensetzungen, die einen Träger und ein Peptid, Polypeptid, Antikörper oder einen in diesem Patent beschriebenen antiidiotypischen Antikörper umfassen.
Die vorliegende Erfindung bietet auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, die ein Zcytor14-Polypeptid kodieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül aus der Gruppe gewählt wird, die Folgendes umfasst: (a) ein Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:3 umfasst, (b) ein Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäurensequenz kodiert, welche entweder die Aminosäurereste 21 bis 677 der SEQ ID-NR:2 oder die Aminosäurereste 21 bis 673 der SEQ ID-NR:10 umfasst und (c) ein Nukleinsäuremolekül, das im Anschluss an strenge Waschbedingungen hybridisiert bleibt an einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 214 bis 2184 der SEQ ID-NR:1 umfasst, oder das Komplement der Nukleotiden 214 bis 2184 der SEQ ID-NR:1. Beispielhafte Nukleinsäuremoleküle sind u. a. jene, bei denen jede Differenz zwischen der vom Nukleinsäuremolekül kodierten Aminosäurensequenz (c) und der entsprechenden Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 aufgrund einer konservativen Aminosäuresubstition auftritt. Die vorliegende Erfindung zieht des Weiteren isolierte Nukleinsäuremoleküle in Betracht, welche die Nukleotide 214 bis 2184 der SEQ ID-NR:1 oder Nukleotide 154 bis 2184 der SEQ ID-NR:1 umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Vektoren und Expressionsvektoren, die solche Nukleinsäuremoleküle enthalten. Solche Expressionsvektoren können einen Transkriptionspromoter und einen Transkriptionsterminator umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass der Promoter mit dem Nukleinsäuremolekül funktionell verknüpft ist und das Nukleinsäuremolekül mit dem Transkriptionsterminator funktionell verknüpft ist. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren rekombinante Wirtszellen und rekombinanten Viren, die diese Vektoren und Expressionsvektoren umfassen. Beispielhafte Wirtszellen sind u. a. Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insekten-, Säugetier- und Pflanzenzellen. Solche Expressionsvektoren umfassende rekombinante Wirtszellen können verwendet werden, um Zcytor14-Polypeptide zu produzieren, indem die rekombinanten Wirtszellen, die den Expressionsvektor umfassen und das Zcytor14-Protein produzieren, kultiviert werden, und optional durch Isolierung des Zcytor14-Proteins aus den kultivierten rekombinanten Wirtszellen.
Des Weiteren bietet die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und mindestens einem solchen Expressionsvektor oder einem solche Expressionsvektoren umfassenden rekombinanten Virus. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und einem in diesem Patent beschriebenen Polypeptid.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Methoden für die Erkennung der Gegenwart von Zcytor14-RNA in einer biologischen Probe in Betracht, welche folgende Schritte umfasst: (a) Kontaktierung einer Zcytor14-Nukleinsäureprobe unter hybridisierten Bedingungen mit entweder (i) aus der biologischen Probe isolierten Test-RNA-Molekülen oder (ii) aus den isolierten RNA-Molekülen synthetisierten Nukleinsäuremolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Nukleotidsequenz aufweist, welche einen Teil der Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1 oder deren Komplement umfasst, und (b) Erkennung der Bildung von Hybriden der Nukleinsäureprobe und entweder den Test-RNA-Molekülen oder den synthetisierten Nukleinsäuremolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass die Gegenwart der Hybride die Gegenwart von Zcytor14-RNA in der biologischen Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren Methoden für die Erkennung der Gegenwart des Zcytor14-Polypeptids in einer biologischen Probe, die folgende Schritte umfasst: (a) Kontaktierung der biologischen Probe mit einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, das spezifisch an ein Pollypeptid bindet, welches die Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktierung unter Bedingungen erfolgt, die das Binden des Antikörpers oder Antikörperfragments an die biologische Probe erlauben und (b) Erkennung jedes gebundenen Antikörpers oder gebundenen Antikörperfragments. Ein solcher Antikörper oder ein solches Antikörperfragment kann des Weiteren einen erkennbaren Label umfassen, welcher aus einer Gruppe gewählt wird, die Radioisotop, Fluoreszenzlabel, Chemilumineszenzlabel, Enzymlabel, Biolumineszenzlabel und kolloidales Gold umfasst.
Die vorliegende Erfindung bietet auch Kits für die Durchführung dieser Erkennungsmethoden. Ein Kit für die Erkennung der Zcytor14-Genexpression kann z. B. einen Behälter mit einem Nukleinsäuremolekül umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül aus der Gruppe gewählt wird, die Folgendes umfasst: (a) ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz der Nukleotide 214 bis 2184 der SEQ ID-NR:1, (b) ein Nukleinsäuremolekül mit dem Komplement der Nukleotide 214 bis 2184 der Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1, (c) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment von (a) ist und mindestens acht Nukleotide umfasst, und (d) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment von (b) ist und mindestens acht Nukleotide umfasst. Ein solches Kit kann auch einen zweiten Behälter umfassen, der eines oder mehrere Reagenzien enthält, welche die Gegenwart des Nukleinsäuremoleküls anzeigen können. Andererseits kann ein Kit für die Erkennung des Zcytor14-Proteins einen Behälter umfassen, welcher einen Antikörper oder ein Antikörperfragment enthält, das spezifisch an ein Polypeptid bindet, das die Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 umfasst.
Die vorliegende Erfindung zieht auch antiidiotypische Antikörper oder antiidiotypische Antikörperfragmente in Betracht, die spezifisch an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment binden, welcher/welches spezifisch an ein Polypeptid mit der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 oder SEQ ID-NR:10 bindet.
Die vorliegende Erfindung bietet auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine Zcytor14 sekretorische Signalsequenz kodieren, und eine Nukleotidsequenz, welche ein biologisch aktives Polypeptid kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Zcytor14 sekretorische Signalsequenz eine Aminosäurensequenz der Reste 1 bis 20 der SEQ ID-NR:2 umfasst. Beispielhafte biologisch aktive Polypeptide sind u. a. Faktor VIIa, Proinsulin, Insulin, Follicle-Stimulating-Hormon, Gewebe-Plasminogenaktivator, Tumornekrosefaktor, Interleukin, Colony-Stimulating-Faktor, Interferon, Erythropoietin und Thrombopoietin. Des Weiteren bietet die vorliegende Erfindung Fusionsproteine, welche eine Zcytor14 sekretorische Signalsequenz und ein Polypeptid umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zcytor14 sekretorische Signalsequenz eine Aminosäurensequenz der Reste 1 bis 20 der SEQ ID-NR:2 umfasst.
Die vorliegende Erfindung zieht des Weiteren isolierte Nukleinsäuremoleküle in Betracht, welche eine extrazelluläre Zcytor14-Domäne kodieren, dadurch gekennzeichnet, dass die extrazelluläre Domäne entweder die Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2 oder die Aminosäurereste 21 bis 435 der SEQ ID-NR:10 umfasst. Die vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte Polypeptide, die entweder Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2 oder Aminosäurereste 21 bis 435 der SEQ ID-NR:10, spezifisch an solche Polypeptide bindende Antikörper und antiidiotypische Antikörper, die spezifisch an solche Antikörper binden, umfassen.
Die vorliegende Erfindung bietet auch Fusionsproteine, welche eine Zcytor14 extrazelluläre Domäne und eine Immunglobulin-Untereinheit umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zcytor14 extrazelluläre Domäne entweder die Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2 oder die Aminosäurereste 21 bis 435 der SEQ ID-NR:10 umfasst. Bei solchen Fusionsproteinen kann die Immunglobulin-Untereinheit eine konstante Region schwerer Immunglobulinketten sein, wie z. B. ein humanes F_c-Fragment. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche die Fusionsproteine kodieren.
Diese und weitere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung verdeutlicht.
2. Definitionen
In der nachfolgenden Beschreibungen werden bestimmte Begriffe häufig verwendet. In den folgenden Definition werden diese Begriffe zum Zweck eines besseren Verständnisses der Erfindung erklärt.
Im Sinne dieser Schrift bezieht sich „Nukleinsäure" oder „Nukleinsäuremolekül" auf Polynukleotide, wie z. B. Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), Oligonukleotide, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) generierte Fragmente und durch Ligation, Spaltung, Endonuklease-Aktivität und Exonuklease-Aktivität generierte Fragmente. Nukleinsäuremoleküle können aus Monomeren bestehen, welche natürlich auftretende Nukleotide (z. B. DNA und RNA) oder Analoge der natürlich auftretenden Nukleotide (z. B. α-Enantiomerformen der natürlich auftretende Nukleotide) oder eine Kombination beider sind. Modifizierte Nukleotide können Änderungen in den Zuckeruntereinheiten und/oder in Pyrimidin- oder Purinbasis-Untereinheiten aufweisen. Zuckeränderungen sind z. B. der Austausch einer oder mehrerer Hydroxylgruppen gegen Halogene, Alkylgruppen, Amine und Azidogruppen, oder die Zucker-Untereinheiten können als Ether oder Ester funktionalisiert werden. Des Weiteren kann die gesamte Zuckeruntereinheit gegen sterisch und elektronisch ähnliche Strukturen ausgetauscht werden, wie z. B. Aza-Zucker und carbocyclische Zuckeranaloge. Beispiele für Modifizierungen in einer Basisuntereinheit sind u. a. alkylierte Purine und Pyrimidine, azylierte Purine oder Pyrimidine oder andere bekannte heterocyclische Substitutionen. Nukleinsäuremonomere können durch Phosphodiesterbindungen oder Analoge solcher Verbindungen verknüpft werden. Analoge der Phosphodiesterbindungen sind u. a. Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenoat, Phosphordiselenoat, Phosphoranilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat u. ä. Der Begriff „Nukleinsäuremolekül" umfasst auch die so genannten „Peptidnukleinsäuren", welche natürlich auftretende oder modifizierte an ein Polyamidrückgrat haftende Nukleinsäurebasen umfassen. Nukleinsäuren können entweder einsträngig oder zweisträngig sein.
Der Begriff „Komplemente eines Nukleinsäuremoleküls" bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül, das eine komplementäre Nukleotidsequenz und umgekehrte Ausrichtung im Vergleich zu einer Referenz-Nukleotidsequenz aufweist. Die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' ist beispielsweise komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Begriff „Contig" bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül, das eine durchgängige Strecke einer mit einem anderen Nukleinsäuremolekül identischen oder komplementären Sequenz aufweist. Man sagt, dass durchgängige Sequenzen eine gegeben Strecke eines Nukleinsäuremoleküls entweder in seiner Gesamtheit oder entlang eine Teilstrecke des Nukleinsäuremoleküls „überlappen".
Der Begriff „degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die eine oder mehrere degenerierte Codone umfasst im Vergleich zu einem Polypeptid-kodierenden Referenznukleinsäuremolekül. Degenerierte Codone enthalten verschiedene Nukleotiddrillinge, kodieren jedoch den gleichen Aminosäurerest (d. h. sowohl GAU- als auch GAC-Drillinge kodieren Asp).
Der Begriff „Strukturgen" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das in eine Boten-RNA (mRNA) transkribiert wird, welche dann in eine Sequenz von Aminosäurecharakteristiken eines spezifischen Polypeptids translatiert wird.
Ein „isoliertes Nukleinsäuremolekül" ist ein Nukleinsäuremolekül, das nicht in die Genom-DNA eines Organismus integriert ist. Ein DNA-Molekül, das einen Wachstumsfaktor kodiert, der von einer Genom-DNA einer Zelle getrennt wurde, ist z. B. ein isoliertes DNA-Molekül. Ein weiteres Beispiel für ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist ein chemisch synthetisiertes Nukleinsäuremolekül, das nicht in das Genom eines Organismus integriert ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das aus einer bestimmten Spezies isoliert wurde, ist kleiner als das komplette DNA-Molekül eines Chromosoms dieser Spezies.
Ein „Nukleinsäuremolekülkonstrukt" ist ein ein- oder zweisträngiges Nukleinsäuremolekül, das durch menschlichen Eingriff modifiziert wurde und Segmente von Nukleinsäure enthält, die in einer Kombination und Anreihung angeordnet sind, die in der Natur nicht existiert.
„Lineare DNA" bezeichnet nicht-kreisförmige DNA-Moleküle mit freien 5'- und 3'-Enden. Lineare DNA kann aus geschlossenen kreisförmigen DNA-Molekülen, z. B. Plasmiden, durch enzymatische Verdauung oder physische Störung präpariert werden.
„Komplementäre DNA (cDNA)" ist ein einsträngiges DNA-Molekül, das durch das Reverse Transkriptase-Enzym aus einer mRNA-Vorlage gebildet wird. Normalerweise wird für die Einleitung der Reverse-Transkription ein Primer eingesetzt, der komplementär zu Teilen der mRNA ist. Fachkundige Personen verwenden auch den Begriff „cDNA" zur Bezeichnung eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, bestehend aus einem einsträngigen DNA-Molekül und dessen komplementären DNA-Strang. Der Begriff „cDNA" bezieht sich auch auf einen, aus einer RNA-Vorlage synthetisierten Klon eines cDNA-Moleküls.
Ein „Promoter" ist eine Nukleotidsequenz, welche die Transkription eines Strukturgens steuert. Normalerweise befindet sich ein Promoter in der nicht-kodierenden 5'-Region eines Gens, proximal zum transkriptionellen Start eines Strukturgens.
Sequenzelemente innerhalb von Promotern, die in der Einleitung der Transkription aktiv sind, werden oft durch Consensus-Nukleotidsequenzen charakterisiert. Diese Promoterelemente umfassen RNA-Polymerase-bindende Stellen, TATA-Sequenzen, CAAT-Sequenzen, differenzierungsspezifische Elemente (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), zyklische AMP-Response-Elemente (CREs), Serum-Response-Elemente (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), Glucocorticoid-Response-Elemente (GREs) und bindende Stellen für andere Transkriptionsfaktoren, wie z. B. CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, cAMP-Response-Element-bindendes Protein (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) und Oktamer-Faktoren (siehe allgemein Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) und Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Wenn es sich bei dem Promoter um einen induzierbaren Promoter handelt, erhöht sich die Transkriptionsrate als Reaktion auf einen Induktor. Im Gegensatz dazu wird die Transkriptionsrate nicht durch einen Induktor reguliert, wenn es sich um einen konstitutiven Promoter handelt. Reprimierbare Promoter sind ebenfalls bekannt.
Ein „Kernpromoter" enthält die für die Promoter-Funktion notwendigen Nukleotidsequenzen, einschließlich TATA-Box und den Start der Transkription. Im Sinne dieser Definition kann ein Kernpromoter in Abwesenheit der spezifischen Sequenzen, welche die Aktivität verstärken oder gewebespezifische Aktivität vermitteln können, eine erkennbare Aktivität haben oder auch nicht.
Ein „regulatorisches Element" ist eine Nukleotidsequenz, welche die Aktivität eines Kernpromoters moduliert. Ein regulatorisches Element kann z. B. eine Nukleotidsequenz enthalten, die an zelluläre Faktoren bindet, welche die Transkription exklusiv oder präferenziell in bestimmten Zellen, Geweben oder Organellen aktiviert. Diese Arten von regulatorischen Elementen sind normalerweise mit Genen verbunden, die auf eine „zellspezifische", „gewebespezifische" oder „organellspezifische" Weise exprimiert werden. Ein Zcytor14-Promoter sollte z. B. die Expression eines funktionell verknüpften Gens in größerem Maße in Schilddrüsen-, Nebennieren-, Prostata- und Lebergewebe stimulieren als in Nieren-, Bauchspeicheldrüsen- oder Milzgewebe.
Ein „Verstärker" ist eine Art eines regulatorischen Elements, das die Effizienz der Transkription erhöhen kann, unabhängig von der Entfernung oder Ausrichtung des Verstärkers relativ zur Startstelle der Transkription.
„Heterologe DNA" bezieht sich auf ein DNA-Molekül oder eine Population von DNA-Molekülen, die innerhalb einer gegebenen Wirtszelle nicht natürlich auftreten. Einer bestimmten Wirtszelle gegenüber heterologe DNA-Moleküle können aus der Wirtszellenspezies abgeleitete DNA enthalten (d. h. endogene DNA), wenn die Wirts-DNA mit Nicht-Wirts-DNA (d. h. exogene DNA) kombiniert ist. Ein DNA-Molekül mit einem Nicht-Wirts-DNA-Segment, das ein funktionell mit einem Wirts-DNA-Segment verknüpftes Polypeptid kodiert, welches einen Transkriptionspromoter umfasst, wird z. B. als heterologes DNA-Molekül angesehen. Ein heterolages DNA-Molekül kann dagegen auch ein endogenes Gen umfassen, welches mit einem exogenen Promoter funktionell verknüpft ist. Als weiteres Beispiel wird ein DNA-Molekül mit einem Gen, welches von einer wildtypischen Zelle abgeleitet wurde, als heterologe DNA angesehen, wenn das DNA-Molekül in eine mutante Zelle eingeführt wird, in der das wildtypische Gen fehlt.
Ein „Polypeptid" ist ein Polymer der Aminosäurereste, das durch Peptidverbindungen angefügt wird, ob natürlich oder synthetisch produziert. Polypeptide mit weniger als 10 Aminosäureresten werden generell als „Peptide" bezeichnet.
Ein „Protein" ist ein Makromolekül, das eine oder mehrere Polypeptidketten umfasst. Ein Protein kann auch Nicht-Peptid-Komponenten umfassen, wie z. B. Kohlenhydratgruppen. Kohlenhydrate und andere Nicht-Peptid-Substituenten können einem Protein durch die Zelle, die das Protein produziert, zugefügt werden, und sie unterscheiden sich je nach Zelltyp. Proteine werden in dieser Schrift in Bezug auf ihre Aminosäuren-Backbone-Strukturen definiert; Substituenten wie Kohlenhydratgruppen werden generell nicht spezifiziert, können aber trotzdem vorhanden sein.
Ein Peptid oder Polypeptid, das von einem Nichtwirts-DNA-Molekül kodiert wird, ist ein „heterologes" Peptid oder Polypeptid.
Ein „integriertes genetisches Element" ist ein Segment der DNA, das in ein Chromosom einer Wirtszelle integriert wurde, nachdem das Element durch menschliche Manipulation in die Zelle eingeführt wurde. Die erfindungsgemäßen integrierten genetischen Elemente werden hauptsächlich aus linearisierten Plasmiden gewonnen, welche durch Elektroporation oder andere Methoden in die Zellen eingeführt werden. Integrierte genetische Elemente werden von der ursprünglichen Wirtszelle an deren Nachkommen weitergeleitet.
Ein „Klonierungsvektor" ist ein Nukleinsäuremolekül, wie z. B. ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in eine Wirtszelle. Klonierungsvektoren enthalten normalerweise eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, welche die Einfügung eines Nukleinsäuremoleküls auf bestimmbare Weise ohne Verlust einer notwendigen biologischen Funktion des Vektors erlauben, sowie Nukleotidsequenzen, die ein Markengen kodieren, das sich für die Verwendung zur Identifizierung und Auswahl der mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen eignet. Markergene umfassen normalerweise Gene, welche Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz bieten.
Ein „Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäuremolekül, das ein Gen kodiert, welches in eine Wirtszelle exprimiert wird. Normalerweise umfasst ein Expressionsvektor einen Transkriptionspromoter, ein Gen und einen Transkriptionsterminator. Die Genexpression wird meistens unter die Kontrolle eines Promoters gesetzt und ein solches Gen wird als „mit dem Promoter funktionell verknüpft" bezeichnet. Auf ähnliche Weise sind ein regulatorisches Element und ein Kernpromoter funktionell verknüpft, wenn das regulatorische Element die Aktivität des Kernpromoters moduliert.
Ein „rekombinanter Wirt" ist eine Zelle, die ein heterologes Nukleinsäuremolekül enthält, wie z. B. einen Klonierungsvektor oder Expressionsvektor. In dem vorliegenden Zusammenhang ist ein rekombinanter Wirt beispielsweise eine Zelle, die Zcytor14 zu einem Expressionsvektor produziert. Im Gegensatz dazu kann Zcytor14 durch eine Zelle produziert werden, welche eine natürliche Quelle für Zcytor14 ist und die keinen Expressionsvektor enthält.
„Integrative Transformanten" sind rekombinante Wirtszellen, in denen sich die heterologe DNA in die genomische DNA der Zellen integriert hat.
Ein „Fusionsprotein" ist ein von einem Nukleinsäuremolekül exprimiertes Hybridprotein, das Nukleotidsequenzen von mindestens zwei Genen umfasst. Ein Fusionsprotein kann z. B. mindestens einen Teil eines Zcytor14-Polypeptid umfassen, welches mit einem Polypeptid fusioniert ist, das an eine Affinitätsmatrix bindet. Ein solches Fusionsprotein liefert ein Mittel zur Isolierung großer Mengen von Zcytor14 unter Verwendung der Affinitätschromatographie.
Der Begriff „Rezeptor" bezeichnet ein zellverbundenes Protein, das an ein bioaktives Molekül, einen so genannten „Liganden", bindet. Diese Wechselwirkung überträgt die Wirkung des Liganden auf die Zelle. Rezeptoren können membrangebunden, zytosolisch oder nukleär, monomer (z. B. TSH-Rezeptor, betaadrenerger Rezeptor) oder multimer (z. B. PDGF-Rezeptor, Wachstumshormonrezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietinrezeptor und IL-6-Rezeptor) sein. Membrangebundene Rezeptoren sind durch eine Multidomänenstruktur gekennzeichnet, welche eine extrazelluläre ligandbindende Domäne und eine intrazelluläre Effektordomäne, die normalerweise an der Signaltransduktion beteiligt ist, umfasst. Bei bestimmten membrangebundenen Rezeptoren befinden sich die extrazelluläre ligandbindende Domäne und die intrazelluläre Effektordomäne in separaten Polypeptiden, welche den kompletten funktionellen Rezeptor umfassen.
Die Bindung des Liganden an den Rezeptor resultiert generell in einer Konformationsveränderung im Rezeptor, welche die Wechselwirkung zwischen der Effektordomäne und anderen Molekül(en) in der Zelle verursacht, was wiederum zu einer Veränderung des Stoffwechsels in der Zelle führt. Die oft mit Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Ligand verknüpften Stoffwechselereignisse sind u. a. Gentranskription, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Erhöhung der zyklischen AMP-Produktion, Mobilisierung von zellulärem Kalzium, Mobilisierung der Membranlipide, Zelladhäsion, Hydrolyse von Inositollipiden und Hydrolyse von Phospholipiden.
Der Begriff „sekretorische Signalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die ein Peptid (ein „sekretorisches Peptid") kodiert, das als Komponente eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Signalweg einer Zelle leitet, in dem es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird meistens gespalten, um das sekretorische Peptid während des Transportes durch den sekretorischen Signalweg zu entfernen.
Ein „isoliertes Polypeptid" ist essenziell frei von kontaminierenden zellulären Komponenten, wie Kohlenhydrat, Lipid oder andere proteinartige Unreinheiten des natürlichen Polypeptids. Eine Präparation des isolierten Polypeptids enthält normalerweise das Polypeptide in einer hochreinen form, d. h. mindestens ca. 80 % rein, mindestens ca. 90 % rein, mindestens ca. 95 % rein, mehr als 95 % rein oder mehr als 99 % rein. Eine Möglichkeit zum Aufzeigen, dass eine bestimmte Proteinpräparation ein isoliertes Polypeptid enthält, ist das Erscheinen eines einzelnen Bandes nach der Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Proteinpräparation und Coomassie Brilliant-Blaufärbung des Gels. Der Begriff „isoliert" schließt jedoch nicht die Gegenwart des gleichen Polypeptids in alternativen physischen Formen aus, wie z. B. Dimere oder alternativ glykosylierte oder derivatisierte Formen.
Die in dieser Schrift verwendeten Begriffe „aminoterminal" und „carboxylterminal" bezeichnen die Positionen innerhalb der Polypeptide. Wenn im Zusammenhang angebracht, werden diese Begriffe in Bezug auf eine bestimmte Sequenz oder einen Anteil eines Polypeptids verwendet, um die Nähe oder relative Position zu bezeichnen. Zum Beispiel eine bestimmte Sequenz carboxylterminal zu einer Referenzsequenz innerhalb eines Polypeptids, befindet sich proximal zum Carboxylterminus der Referenzsequenz, liegt aber nicht unbedingt am Carboxylterminus des kompletten Polypeptids.
Der Begriff „Expression" bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts. Im Fall eines Strukturgens betrifft die Expression z. B. die Transkription des Strukturgens in mRNA und die Translation von mRNA in eines oder mehrere Polypeptide.
Der Begriff „Spleißvariante" bezeichnet alternative Formen des von einem Gen transkribierten RNA. Spleißvarianten entstehen auf natürlichem Wege durch die Verwendung von alternativen Spleißstellen innerhalb eines transkribierten RNA-Moleküls, oder weniger häufig zwischen separat transkribierten RNA-Molekülen, und können dazu führen, dass mehrere mRNA von dem gleichen Gen transkribiert werden. Spleißvarianten können Polypeptide kodieren, die eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen. Der in dieser Schrift verwendete Begriff Spleißvariante wird auch zur Bezeichnung eines Polypeptids verwendet, das durch eine Spleißvariante eines von einem Gen transkribierten mRNA kodiert wird.
Im Sinne dieser Schrift beinhaltet der Begriff „Immunmodulator" Zytokine, Stammzellenwachstumsfaktoren, Lymphotoxine, costimulierende Moleküle, hämatopoetische Faktoren und synthetische Analoge dieser Moleküle.
Der Begriff „Komplement-/Antikomplement-Paar" bezeichnet nicht-identische Untereinheiten, die ein nicht-kovalent verbundenes, stabiles Paar unter den entsprechenden Bedingungen bilden. Biotin und Avidin (oder Streptavidin) sind z. b. prototypische Mitglieder eines Komplement-/Antikomplement-Paares. Weitere beispielhafte Komplement-/Antikomplement-Paare sind u. a. Rezeptor/Ligand-Paare, Antikörper/Antigen-(oder Hapten oder Epitop) Paare, Sense/Antisense-Polynukleotid-Paare u. ä. Wenn eine anschließende Dissoziation des Komplement-/Antikomplement-Paares wünschenswert ist, sollte das Komplement-/Antikomplement-Paar vorzugsweise eine Bindungsaffinität von weniger als 10⁹ M^–1 aufweisen.
Ein „antiidiotypischer Antikörper" ist ein Antikörper, der an die variable Regionsdomäne eines Immunglobulins bindet. In diesem Zusammenhang bindet ein antiidiotypischer Antikörper an die variable Region eines Anti-Zcytor14-Antikörpers und somit imitiert ein antiidiotypischer Antikörper ein Epitop von Zcytor14.
Ein „Antikörperfragment" ist ein Teil eines Antikörpers, wie z. B. F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab u. ä. Ein Antikörperfragment bindet unabhängig von der Struktur an das gleiche Antigen, das durch den intakten Antikörper erkannt wird. Ein monoklonales Anti-Zcytor14-Antikörperfragment bindet z. B. an ein Epitop von Zcytor14.
Der Begriff „Antikörperfragment" beinhaltet auch ein synthetisches oder ein gentechnisch verändertes Polypeptid, das an ein bestimmtes Antigen bindet, wie z. B. Polypeptide bestehend aus der variablen Region der leichten Kette, „Fv"-Fragmente bestehend aus variablen Regionen der schweren und leichten Kette, rekombinante Einzelkettenpolypeptidmoleküle, in denen leichte und schwere variable Regionen durch einen Peptid-Linker („scFv-Proteine") verbunden sind, und minimale Erkennungseinheiten bestehend aus den Aminosäureresten, welche die hypervariable Region imitieren.
Ein „chimärer Antikörper" ist ein rekombinantes Protein, das die variablen Domänen und komplementäritätsbestimmenden Regionen enthält, die aus einem Nagetierantikörper gewonnen wurden, während der Rest des Antikörpermoleküls aus einem humanen Antikörper gewonnen wurde.
„Humanisierte Antikörper sind rekombinante Proteine, in denen murine komplementäritätsbestimmende Regionen eines monoklonalen Antikörpers von schweren und leichten variablen Ketten des murinen Immunglobins in eine humane variable Domäne transferiert wurden.
Im Sinne dieser Schrift ist ein „therapeutischer Wirkstoff" ein Molekül oder Atom, das auf eine Antikörperuntereinheit konjugiert wird, um ein für die Therapie nutzbares Konjugat zu produzieren. Beispiele von therapeutischen Wirkstoffen sind u. a. Arzneimittel, Toxine, Immunmodulatoren, Chelatoren, Boronverbindungen, photoaktive Wirkstoffe oder Farbstoffe und Radioisotopen.
Im Sinne dieser Schrift ist ein „erkennbarer Label" ein Molekül oder Atom, das auf eine Antikörperuntereinheit konjugiert werden kann, um ein für die Diagnose nutzbares Molekül zu produzieren. Beispiele von erkennbaren Labeln sind u. a. Chelatoren, photoaktive Wirkstoffe, Radioisotopen, Fluoreszenzwirkstoffe, paramagnetische Ionen oder andere Markeruntereinheiten.
Der in dieser Schrift verwendete Begriff „Affinitäts-Tag" bezeichnet ein Polypeptidsegment, das an ein zweites Polypeptid angefügt werden kann, um die Reinigung oder Erkennung des zweiten Polypeptids zu bewirken oder Stellen für das Anfügen des zweiten Polypeptids an ein Substrat bereitzustellen. Grundsätzlich kann jedes Peptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderer spezifischer bindender Agenzien verfügbar ist, als Affinitäts-Tag verwendet werden. Affinitäts-Tags umfassen ein Polyhistidin-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), Glutathion-S-Transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)), Glu-Glu-Affinitäts-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), Substanz P, FLAG-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), streptavidinbindendes Peptid oder andere Antigenepitope oder bindende Domäne. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Affinitäts-Tag-kodierende DNA-Moleküle sind im Fachhandel erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Ein „nackter Antikörper" ist ein vollständiger Antikörper, im Gegensatz zu einem Antikörperfragment, der nicht mit einem therapeutischen Wirkstoff konjugiert ist. Nackte Antikörper umfassen sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sowie bestimmte rekombinante Antikörper, wie z. B. chimäre und humanisierte Antikörper.
Im Sinne dieser Schrift umfasst der Begriff „Antikörperkomponente" sowohl einen vollständigen Antikörper als auch ein Antikörperfragment.
Ein „Immunkonjugat" ist ein Konjugat einer Antikörperkomponente mit einem therapeutischen Wirkstoff oder erkennbaren Label.
Im Sinne dieser Schrift bezieht sich der Begriff „Antikörperfusionsprotein" auf ein rekombinantes Molekül, das eine Antikörperkomponente und eine Zcytor14-Polypeptidkomponente umfasst. Beispiele eines Antikörperfusionsproteins sind u. a. ein Protein, das eine extrazelluläre Zcytor14-Domäne und entweder eine Fc-Domäne oder eine antigenbindende Region umfasst.
Ein „Zielpolypeptid" oder ein „Zielpeptid" ist eine Aminosäurensequenz, die mindestens ein Epitop umfasst, und das auf eine Zielzelle exprimiert wird, wie z. B. eine Tumorzelle oder eine Zelle, die ein Antigen gegen ein infektiöses Agens trägt. T-Zellen erkennen Peptidepitopen, die von einem großen Histokompatibilitätskomplexmolekül an ein Zielpolypeptid oder Zielpeptid präsentiert werden und normalerweise die Zielzelle lysieren oder andere Immunzellen zur Stelle der Zielzelle rekrutieren und dadurch die Zielzelle abtöten.
Ein „antigenes Peptid" ist ein Peptid, das an ein großes Histokompatibilitätskomplexmolekül bindet, um einen MHC-Peptidkomplex zu bilden, welcher von einer T-Zelle erkannt wird, wodurch nach Präsentation an die T-Zelle eine zytotoxische Lymphozytenreaktion induziert wird. Antigene Peptide sind somit fähig, an ein entsprechendes großes Histokompatibilitätskomplexmolekül zu binden und eine zytotoxische T-Zellenreaktion zu induzieren, wie z. B. Zelllyse oder spezifische Zytokinfreisetzung gegen die Zielzelle, welche das Antigen bindet oder exprimiert. Das antigene Peptid kann im Zusammenhang mit einem großen Histokompatibilitätskomplexmolekül der Klasse I oder II an eine antigenpräsentierende Zelle oder eine Zielzelle gebunden werden.
In Eukaryoten katalysiert die RNA-Polymerase II die Transkription eines Strukturgens, um mRNA zu produzieren. Es kann ein Nukleinsäuremolekül konstruiert werden, das eine RNA-Polymerase-II-Vorlage enthält, in der das RNA-Trankcript eine Sequenz aufweist, die komplementär zur Sequenz eines spezifischen mRNA ist. Das RNA-Transkript wird als „Antisense-RNA" bezeichnet, und ein Nukleinsäuremolekül, das eine Antisense-RNA kodiert, wird als „Antisense-Gen" bezeichnet. Antisense-RNA-Moleküle können an mRNA-Moleküle binden, was eine Hemmung der mRNA-Translation zur Folge hat.
Ein „Antisense-Oligonukleotid spezifisch für Zcytor14" oder ein „Zcytor14-Antisense-Oligonukleotid" ist ein Oligonukleotid mit einer Sequenz, die fähig ist, (a) einen stabilen Triplex mit einem Teil des Zcytor14-Gens zu bilden, oder (b) einen stabilen Duplex mit einem Teil des mRNA-Transkripts des Zcytor14-Gens zu bilden.
Ein „Ribozym" ist ein Nukleinsäuremolekül, das ein katalytisches Zentrum enthält. Der Begriff umfasst RNA-Enzyme, selbstspleißende RNA, selbstspaltende RNA und Nukleinsäuremoleküle, welche diese katalytischen Funktionen ausführen. Ein Nukleinsäuremolekül, das ein Ribozym kodiert, wird als „Ribozym-Gen" bezeichnet.
Eine „externe Führungssequenz" ist ein Nukleinsäuremolekül, welches das endogene Ribozym, RNase P, an eine bestimmte Spezies der intrazellulären mRNA leitet, was die Spaltung der mRNA durch RNase P zur Folge hat. Ein Nukleinsäuremolekül, das eine externe Führungssequenz kodiert, wird als „externes Führungssequenz-Gen" bezeichnet.
Der Begriff „variantes Zcytor14-Gen" bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, welche ein Polypeptid kodieren, dessen Aminosäurensequenz eine Modifizierung der SEQ ID-NR:2 ist. Solche Varianten beinhalten natürlich auftretende Polymorphismen der Zcytor14-Gene sowie synthetische Gene, die konservative Aminosäurensubstitutionen der Aminosäurensequenz SEQ ID-NR:2 enthalten. Weitere variante Formen der Zcytor14-Gene sind Nukleinsäuremoleküle, die Insertionen oder Deletionen der hier beschriebenen Nukleotidsequenzen enthalten. Ein variantes Zcytor14-Gen kann z. B. die Bestimmung identifiziert werden, ob das Gen unter strengen Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1 oder deren Komplement enthält.
Alternativ können variante Zcytor14-Gene durch einen Sequenzvergleich identifiziert werden. Zwei Aminosäurensequenzen haben „100 % Aminosäurensequenz-Identität", wenn die Aminosäurereste der zwei Aminosäurensequenzen bei einem Alignment für maximale Übereinstimmung gleich sind. Auf ähnliche Weise haben zwei Nukleotidsequenzen „100 % Nukleotidsequenz-Identität", wenn die Nukleotidreste der zwei Nukleotidsequenzen bei einem Alignment für maximale Übereinstimmung gleich sind. Sequenzvergleiche können unter Verwendung standardmäßiger Softwareprogramme durchgeführt werden, z. B. mit den in der LASERGENE Bioinformatics Computing Suite enthaltenen Programmen. Diese Suite wird von DNASTAR (Madison, Wisconsin) hergestellt. Andere Methoden für den Vergleich von zwei Nukleotid- oder Aminosäurensequenzen durch die Bestimmung des optimalen Alignments sind fachkundigen Personen bekannt (siehe z. B. Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), „Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", in Methods in Gene Biotechnology, Seiten 123-151 (CRC Press, Inc. 1997) und Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2. Ausgabe (Academic Press, Inc. 1998)). Bestimmte Methoden für die Bestimmung der Sequenzidentität sind unten beschrieben.
Unabhängig von der jeweiligen Methode, die für die Identifizierung eines varianten Zcytor14-Gens oder varianten Zcytor14-Polypeptids verwendet wird, ist ein variantes Gen oder ein von einem varianten Gen kodiertes Polypeptid funktionell durch seine Fähigkeit zur spezifischen Bindung an einen Anti-Zcytor14-Antikörper gekennzeichnet.
Der in dieser Schrift verwendete Begriff „Allelvariante" bezeichnet jede der zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, das denselben chromosomalen Locus belegt. Allelvariationen entstehen auf natürliche Weise durch Mutation und können zu phänotypischen Polymorphismen innerhalb von Population führen. Genmutationen können stille Mutationen sein (keine Veränderung im kodierten Polypeptid) oder sie können Polypeptide mit veränderter Aminosäurensequenz kodieren. Der in dieser Schrift verwendete Begriff Allelvariante wird auch zur Bezeichnung eines von einer Allelvariante eines Gens kodierten Proteins verwendet.
Der Begriff „Ortholog" bezeichnet ein aus einer Spezies gewonnenes Polypeptid oder Protein, welches das funktionelle Gegenstück eines Polypeptids oder Proteins aus einer anderen Spezies ist. Sequenzunterschiede unter Orthologen sind das Resultat der Speziation.
„Paraloge" sind eindeutige aber strukturell verwandte Proteine, die aus Organismen erzeugt wurden. Man nimmt an, dass Paraloge durch Genduplizierung entstehen. So sind z. B. α-Globin, β-Globin und Myoglobin Paraloge von einander.
Die vorliegende Erfindung umfasst funktionelle Fragmente der Zcytor14-Gene. Im Sinne dieser Erfindung ist ein „funktionelles Fragment" eines Zcytor14-Gens ein Nukleinsäuremolekül, das einen Teil eines Zcytor14-Polypeptids kodiert, welches eine der hier beschriebenen Domänen ist oder mindestens spezifisch an einen Anti-Zcytor14-Antikörper bindet.
Aufgrund der Ungenauigkeit von standardmäßigen Analysemethoden sind Molekulargewichte und Polymerlängen als ungefähre Werte zu verstehen. Wenn ein solcher Wert als „ungefähr" X oder „ca." X angegeben wird, ist der genannte Wert X mit einer Genauigkeit von ± 10 % zu verstehen.
3. Produktion von Zcytor14-Genen
Nukleinsäuremoleküle, die ein humanes Zcytor14-Gen kodieren, können durch Screenen einer humanen cDNA- oder genomischen Bibliothek unter Verwendung von auf der SEQ ID-NR:1 oder SEQ ID-NR:4 basierenden Polynukleotidproben gewonnen werden. Dieses sind etablierte Standardmethoden.
So kann beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül, das ein humanes Zcytor14-Gen kodiert aus einer cDNA-Bibliothek isoliert werden. In diesem Fall ist der erste Schritt die Präparation der cDNA-Bibliothek durch die Isolierung der RNA aus einem Gewebe, wie z. B. Schilddrüsen-, Nebennieren-, Prostata- oder Lebergewebe, wozu die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden eingesetzt werden RNA-Isolierungsmethoden müssen generell eine Methode zum Brechen der Zellen, ein Mittel zur Hemmung der RNase-gesteuerten Degradierung der RNA und eine Methode zum Trennen der RNA von der DNA sowie von Protein und Polysaccharidverunreinigungen bereitstellen. Die Gesamt-RNA kann z. B. isoliert werden durch Einfrieren des Gewebes in Flüssigstickstoff, Mahlen des gefrorenen Gewebes mit einem Mörser und Stößel zur Lysierung der Zellen, Extraktion des gemahlenen Gewebes mit einer Lösung aus Phenl/Chloroform zum Entfernen der Proteine und Trennen der RNA von den restlichen Unreinheiten durch selektive Ausfällung mit Lithiumchlorid (siehe z. B. Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3. Ausgabe, S. 4-1 bis 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel (1995)"]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, S. 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ["Wu (1997)"]).
Alternativ kann die Gesamt-RNA isoliert werden durch Extraktion von gemahlenem Gewebe mit Guanidiniumisothiocyanat, Extraktion mit organischen Solvens und Trennen der RNA von Verunreinigungen mittels Differenzialzentrifugation (siehe z. B. Chirgwin et al., Biochemistry 18:52 (1979); Ausubel (1995) S. 4-1 to 4-6; Wu (1997) S. 33-41).
Für die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek muss Poly(A)⁺ RNA aus eine Gesamt-RNA-Präparation isoliert werden. Poly(A)⁺ RNA kann unter Verwendung der Standardtechnik von Oligo(dT)-Cellulosechromatographie aus der Gesamt-RNA isoliert werden (siehe z. B. Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Ausubel (1995),. S. 4-11 bis 4-12).
Doppelsträngige cDNA-Moleküle werden aus Poly(A)⁺ RNA synthetisiert, wozu die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden verwendet werden (siehe z. B. Wu (1997), S. 41-46). Des Weiteren können im Handel erhältliche Kits für die Synthetisierung von zweisträngigen cDNA-Molekülen verwendet werden. Solche Kits sind z. B. erhältlich von Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Promega Corporation (Madison, WI) und STRATAGENE (La Jolla, CA).
Für die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek eignen sich verschiedene Klonierungsvektoren. Eine cDNA-Bibliothek kann z. B. in einem aus einem Bakteriophagen abgeleiteten Vektor präpariert werden, z. B. ein λgt10-Vektor. Siehe z. B. Huynh et al., „Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11", in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), S. 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) S. 47-52.
Alternativ können doppelsträngige cDNA-Moleküle in einen Plasmidvektor eingefügt werden, z. B. in einen PBLUESCRIPT-Vektor (STRATAGENE; La Jolla, CA), einen LAMDAGEM-4 (Promega Corp.) oder andere im Handel erhältliche Vektoren. Geeignete Klonierungsvektoren sind auch von the American Type Culture Collection (Manassas, VA).
Zur Amplifikation der klonierten cDNA-Moleküle wird die cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Standardmethoden in einen prokaryotischen Wirt eingefügt. Eine cDNA-Bibliothek kann z. B. in kompetente E. coli DH5-Zellen eingefügt werden, die z. B. von Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) erhältlich sind.
Eine humane Genombibliothek kann durch die aus dem Stand der Technik bekannten Mittel präpariert werden (siehe z. B. Ausubel (1995), S. 5-1 bis 5-6; Wu (1997) S. 307-327). Genomische DNA kann isoliert werden durch Lysieren des Gewebes mit dem Detergens Sarkosyl, Verdauung des Lysats mit Proteinase K, Entfernung unlöslicher Verunreinigungen aus dem Lysat durch Zentrifugation, Ausfällung der Nukleinsäure aus dem Lysat unter Verwendung von Isopropanol und Aufreinigung der resuspendierten DNA auf einem Cesiumchlorid-Density-Gradienten.
DNA-Fragmente, die sich für die Produktion einer genomischen Bibliothek eignen, können durch zufälliges Abscheren der genomischen DNA oder partielle Verdauung der genomischen DNA mit Restriktionsendonukleasen gewonnen werden. Genomische DNA-Fragmente können in einen Vektor, wie z. B. einen Bakteriophagen- oder Cosmidvektor, eingefügt werden unter Verwendung konventioneller Methoden, wie z. B. die Verwendung von Restriktionsenzymverdauung, um geeignete Termini zu erhalten, sowie die Verwendung einer alkalinen Phosphatasebehandlung zur Vermeidung einer unerwünschten Verbindung der DNA- Moleküle und Ligation mit entsprechenden Ligasen. Methoden für diese Art der Manipulation sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Ausubel (1995), S. 5-1 bis 5-6; Wu (1997), S. 307-327).
Alternativ können humane genomische Bibliotheken aus Handelsquellen bezogen werden, z. B. von Research Genetics (Huntsville, AL) und American Type Culture Collection (Manassas, VA).
Ein Bibliothek, die cDNA oder genomische Klone enthält, kann mit einer oder mehreren Polynukleotidproben basierend auf SEQ ID-NR:1 oder SEQ ID-NR:4, gescreent werden, wozu Standardmethoden verwendet werden können (siehe z. B. Ausubel (1995), S. 6-1 bis 6-11).
Nukleinsäuremoleküle, die ein humanes Zcytor14-Gen kodieren, können auch unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Oligonukleotidprimern, die Nukleotidsequenzprimer enthalten, welche auf den hier beschriebenen Nukleotidsequenzen des Zcytor14-Gens basieren, gewonnen werden. Generelle Methoden für das Screenen von Bibliotheken mit PCR sind z. B. beschrieben in Yu et al., „Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), S. 211-215 (Humana Press, Inc. 1993). Methoden für die Verwendung der PCR zum Isolieren verwandter Gene sind z. B. beschrieben in Preston, „Use of Degenerate OligoNukleotid Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members" in Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), S. 317-337 (Humana Press, Inc. 1993).
Anti-Zcytor14-Antikörper, die wie unten beschrieben produziert werden, können auch zur Isolierung von DNA-Sequenzen verwendet werden, die humane Zcytor14-Gene aus den cDNA-Bibliotheken kodieren. Der Antikörper kann z. B. verwendet werden, um λgt11-Expressionsbibliotheken zu screenen, oder der Antikörper kann für das Immunscreening nach der Hybridauswahl und Translation verwendet werden (siehe z. B. Ausubel (1995), S. 6-12 bis 6-16; Margolis et al., „Screening λ expression libraries with antibody and protein probes" in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. Ausgabe, Glover et al. (eds.), S. 1-14 (Oxford University Press 1995)).
Alterativ kann ein Zcytor14-Gen durch die Synthetisierung von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung gegenseitig startender langer Oligonukleotide und der hier beschriebenen Nukleotidsequenzen gewonnen werden (siehe z. B. Ausubel (1995), S. 8-8 bis 8-9). Etablierte Methoden, bei denen die Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird, ermöglichen die Synthetisierung von DNA-Molekülen mit einer Mindestlänge von zwei Kilobasen (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., „Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), S. 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), und Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können auch mit „Genmaschinen" synthetisiert werden, unter Verwendung von Protokollen wie die Phosphoramiditmethode. Wenn für eine Anwendung chemisch synthetisierte doppelsträngige DNA erforderlich ist, wie z. B. für die Synthese eines Gens oder Genfragments, dann wird jeder komplementäre Strang separat hergestellt. Die Produktion von kurzen Genen (60 bis 80 Basenpaaren) ist ein technisch unkomplizierter Vorgang und kann durch die Synthetisierung der komplementären Stränge und deren anschließendes Alignment erreicht werden. Für die Produktion von längeren Genen (>300 Basenpaaren) müssen jedoch eventuell spezielle Strategien eingesetzt werden, da die Koppelungseffizienz jedes Zyklus während der chemischen DNA-Synthese nur selten 100 % beträgt. Zur Bewältigung dieses Problems werden synthetische Gene (doppelsträngig) in modularer Form aus einsträngigen Fragmenten mit einer Länge von 20 bis 100 Nukleotiden zusammengesetzt. Für Untersuchungen der Polynukleotidsynthese siehe z. B. Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), und Climie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990).
Die Sequenz eines Zcytor14 cDNA oder Zcytor14 genomischen Fragments kann unter Verwendung von Standardmethoden bestimmt werden. Die hier offen gelegten Zcytor14-Polynukleotidsequenzen können auch als Proben oder Primer für die Klonierung von 5' nicht-kodierenden Regionen eines Zcytor14-Gens verwendet werden. Promoterelemente aus einem Zcytor14-Gen könnten verwendet werden, um die Expression von heterologen Genen z. B. in Schilddrüsengewebe von transgenen Tiere oder mit Gentherapie behandelte Patienten zu steuern. Die Identifizierung der genomischen Fragmente, die einen Zcytor14-Promoter oder ein regulatorisches Element enthalten, kann mit etablierten Methoden erzielt werden, z. B. durch Deletionsanalyse (siehe allgemein Ausubel (1995)).
Die Klonierung von 5' Flankensequenzen ermöglicht auch die Produktion von Zcytor14-Proteinen durch „Genaktivierung", wie im US-Patent Nr. 5.641.670 offen gelegt. Kurz gefasst, die Expression eines endogenen Zcytor14-Gens in eine Zelle wird verändert, indem in den Zcytor14-Lokus ein DNA-Konstrukt eingeführt wird, das mindestens eine Zielsequenz, eine regulatorische Sequenz, ein Exon und eine ungepaarte Splice-Donor-Site umfasst. Die Zielsequenz ist eine nicht-kodierende Zcytor14 5' Sequenz, welche die homologe Rekombination des Konstrukts mit dem endogenen Zcytor14-Lokus erlaubt, wobei die Sequenzen innerhalb des Konstrukts mit der endogenen Zcytor14-kodierenden Sequenz funktionell verknüpft werden. Auf diese Weise kann ein endogener Zcytor14-Promoter durch andere regulatorische Sequenzen ersetzt oder ergänzt werden, um eine verbesserte, gewebespezifische oder anderweitig regulierte Expression zu bieten.
4. Produktion von Zcytor14-Genvarianten
Die vorliegende Erfindung bietet eine Vielfalt von Nukleinsäuremolekülen, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, welche die hier offen gelegten Zcytor14-Polypeptide kodieren. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass angesichts der Degeneration des genetischen Codes eine beachtliche Sequenzvariation unter den Polynukleotidmolekülen möglich ist. SEQ ID-NR:3 ist eine degenerierte Nukleotidsequenz, die alle Nukleinsäuremoleküle umfasst, die das Zcytor14-Polypeptid der SEQ ID-NR:2 kodieren. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die degenerierte Sequenz von SEQ ID-NR:3 auch alle RNA-Sequenzen liefert, die SEQ ID-NR:2 kodieren, indem U gegen T ausgetauscht wird. Die vorliegende Erfindung zieht somit Zcytor14-Polypeptid-kodierende Nukleinsäuremoleküle in Betracht, welche Nukleotid 154 bis Nukleotid 2229 der SEQ ID-NR:1 und deren RNA-Äquivalenzen umfassen. Auf ähnliche Weise liefert die degenerierte Zcytor14-1-Sequenz von SEQ ID-NR:6 auch alle RNA-Sequenzen, die SEQ ID-NR:5 kodieren, indem U gegen T ausgetauscht wird.
In Tabelle 1 sind die in SEQ ID-NR:3 and 6 verwendeten einstelligen Buchstabencodes zur Bezeichnung der degenerierten Nukleotid-Positionen aufgeführt. „Auflösungen" sind die mit einem Buchstabencode bezeichneten Nukleotide. „Komplement" ist der Code für das(die) Komplement-Nukleotid(e). Beispiel: Der Code Y bezeichnet entweder C oder T, und sein Komplement R bezeichnet A oder G, wobei A komplementär zu T und G komplementär zu C ist.
Tabelle 1
Die in SEQ ID-NR:3 und 6 verwendeten degenerierten Codone, die alle für eine gegebene Aminosäure möglichen Codone umfassen, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass bei der Bestimmung eines degenerativen Codons, das für die möglichen alle aminosäurekodierenden Codone repräsentativ ist, eine leichte Zweideutigkeit auftreten kann. Ein degeneratives Codon für Serin (WSN) kann z. B. unter bestimmten Umständen Arginin (AGR) kodieren, und das degenerative Codon für Arginin (MGN) kann unter bestimmten Umständen Serin (AGY) kodieren. Eine ähnliche Beziehung besteht zwischen Codonen, die Phenylalanin und Leucin kodieren. Bestimmte Polynukleotide, die zur degenerativen Sequenz gehören, können somit variante Aminosäurensequenzen kodieren, die fachkundige Person kann jedoch solche variante Sequenzen durch Bezugnahme auf die Aminosäurensequenzen der SEQ ID-NR:2, 5 und 10 bis 12 leicht erkennen. Variante Sequenzen lassen sich wie in dieser Schrift beschrieben leicht auf ihre Funktionalität prüfen.
Unterschiedliche Spezies können einen „präferenziellen Codongebrauch" aufzeigen. Siehe allgemein Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995) und Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). In Sinne diese Schrift bezieht sich der Begriff „präferenzieller Codongebrauch" auf einen Fachbegriff, der sich auf die Proteintranslationscodone bezieht, die am häufigsten in den Zellen einer bestimmten Spezies verwendet werden und somit eine Bevorzugung einer oder mehrere Code, die jede Aminosäure kodieren (siehe Tabelle 2) darstellen. Die Aminosäure Threonin (Thr) kann z. b. von ACA, ACC, ACG oder ACT kodiert werden, doch in Säugetierzellen ist ACC das am häufigsten verwendete Codon; in andern Spezies, z. B. in Insektenzellen, Hefe, Viren oder Bakterien, können andere Thr-Codone die präferenziellen Codone sein. Präferenzielle Codone für eine bestimmte Spezies können durch eine Vielfalt der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden in das erfindungsgemäße Polynukleotid eingefügt werden. Die Einführung von präferenziellen Codonsequenzen in rekombinante DNA kann beispielsweise die Produktion des Proteins verstärken, indem die Proteintranslation innerhalb eines bestimmten Zelltyps oder einer Spezies effizienter gemacht wird. Deshalb dienen die in SEQ ID-NR:5 und 6 offen gelegten Codonsequenzen als Vorlage für die Optimierung der Polynukleotidexpression in verschiedene Zelltypen und Spezies, die im Stand der Technik häufig verwendet werden und hier offen gelegt sind. Die Sequenzen, die bevorzugte Codone enthalten, können wie hier beschrieben für die Expression in verschiedene Spezies optimiert und auf ihre Funktionalität geprüft werden.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren variante Polypeptide und Nukleinsäuremoleküle, welche die Gegenstücke von anderen Spezies (Orthologe) repräsentieren. Diese Spezies umfassen ohne Eingrenzung Säugetiere, Vögel, Amphibien, Reptilien, Fische, Insekten und andere Wirbeltiere sowie wirbellose Tierarten. Von besonderem Interesse sind Zcytor14-Polypeptide aus anderen Säugetierspezies, einschließlich Maus, Schwein, Schaf, Rind, Hund, Katze, Pferd und anderen Primatenpolypeptiden. Orthologe der humanen Zcytor14 können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Informationen und Kompositionen in Kombination mit konventionellen Klonierungmethoden kloniert werden. Zcytor14-cDNA kann beispielsweise unter Verwendung der mRNA aus einem Gewebe- oder Zelltyp, der das hier offen gelegte Zcytor14 exprimiert, kloniert werden. Geeignete mRNA-Quellen können identifiziert werden, indem Northern Blots mit Sonden aus den hier offen gelegten Sequenzen beprobt werden. Anschließend wird aus der mRNA einer positiven Gewebe- oder Zelllinie eine Bibliothek erstellt.
Eine Zcytor14-kodierende cDNA kann dann unter Anwendung verschiedener Methoden isoliert werden, wie z. B. durch Probing mit einer kompletten oder partiellen humanen cDNA oder mit einem oder mehreren Sätzen von degenerierten Sonden basierend auf den offen gelegten Sequenzen. Eine cDNA kann auch unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion mit Primern, die aus den hier offen gelegten repräsentativen humanen Zcytor14-Sequenzen konstruiert wurden, kloniert werden. In einer weiteren Methode kann die cDNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder transfektieren, und die Expression der cDNA von Interesse kann dann mit einem Antikörper gegen das Zcytor14-Polypeptid erkannt werden.
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die in SEQ ID-NR:1 offen gelegte Sequenz ein Einzelallel des humanen Zcytor14 darstellt und dass Allelvarianten und alternative Spleißung auftreten können. Allelvarianten dieser Sequenz können durch cDNA-Probing oder Genombibliotheken von verschiedenen Personen gemäß den Standardverfahren kloniert werden. Allelvarianten der hier offen gelegten Nukleotidsequenzen, einschließlich derer mit stummen Mutationen und jener, bei denen Mutationen in Aminosäurensequenz-Veränderungen resultieren, liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung, ebenso wie Proteine, die Allelvarianten der hier offen gelegten Aminosäurensequenzen sind. cDNA-Moleküle, die aus alternativ gespleißten mRNA generiert werden, welche die Eigenschaften des Zcytor14-Polypeptids erhalten, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten, ebenso wie Polypeptide, die von solchen cDNA und mRNA kodiert werden. Allelvarianten und Spleißvarianten dieser Sequenzen können durch cDNA-Probing oder Genombibliotheken von verschiedenen Personen gemäß den Standardverfahren kloniert werden.
Innerhalb bestimmter Ausführungsbeispiele dieser Erfindung können die isolierten Nukleinsäuremoleküle unter strengen Bedingungen zu Nukleinsäuremolekülen hybridisiert, welche die hier offen gelegten Nukleotidsequenzen enthalten. Solche Nukleinsäuremoleküle können z. B. unter strengen Bedingungen zu Nukleinsäuremolekülen hybridisiert werden, die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1 enthalten, zu Nukleinsäuremolekülen, die die Nukleotidsequenz der Nukleotide 154 bis 2229 der SEQ ID-NR:1 enthalten, oder zu Nukleinsäuremolekülen, die eine zur SEQ ID-NR:1 komplementär Nukleotidsequenz enthalten, oder zu Nukleotiden 154 bis 2229 der SEQ ID-NR:1. Generell sind die gewählten strengen Bedingungen ungefähr 5 °C niedriger als der thermale Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einem festgelegten ionischen Stärkewert und pH-Wert. T_m ist die Temperatur (unter der festgelegten ionischen Stärke und dem pH-Wert), bei der 50 % der Zielsequenz auf eine perfekt übereinstimmende Probe hybridisiert werden.
Ein Paar Nukleinsäuremoleküle, wie z. B. DNA-DNA, RNA-RNA und DNA-RNA, können hybridisieren, wenn die Nukleotidsequenzen einen bestimmten Grad von Komplementarität aufweisen. Hybride können nicht übereinstimmende Paare im Doppelhelix tolerieren, aber die Stabilität des Hybrids wird durch den Grad der Nichtübereinstimmung beeinflusst. Die T_m des nicht-übereinstimmenden Hybrids nimmt für jede Basenpaar-Nichtübereinstimmung von 1-1,5 % um 1°C ab. Durch eine Variierung der Strenge der Hybridisierungsbedingungen kann der Grad der Nichtübereinstimmung im Hybrid kontrolliert werden. Der Grad der Strenge erhöht sich mit dem Anstieg der Hybridisierungstemperatur und die ionische Stärke des Hybridisierungspuffers verringert sich. Strenge Hybridisierungsbedingungen umfassen Temperaturen von ca. 5-25 °C unter der T_m des Hybrids und einen Hybridisierungspuffer mit bis zu 1 M Na⁺. Ein höherer Strengegrad bei niedrigeren Temperaturen kann durch Zugabe von Formamid erzielt werden, welches die T_m des Hybrids um ca. 1°C für jedes 1 % Formamid in der Pufferlösung reduziert. Generell umfassen solche strengen Bedingungen Temperaturen von 20-70 °C und einen Hybridisierungspuffer mit bis zu 6x SSC und 0-50 % Formamid. Ein höherer Strengegrad kann bei Temperaturen von 40-70 °C und einem Hybridisierungspuffer mit bis zu 4x SSC und 0-50 % Formamid erreicht werden. Hochstrenge Bedingungen umfassen normalerweise Temperaturen von 42-70 °C und einen Hybridisierungspuffer mit bis zu 1x SSC und 0-50 % Formamid. Verschiedene Strengegrade können während der Hybridisierung und Wäsche eingesetzt werden, um eine maximale spezifische Bindung an die Zielsequenz zu erzielen. Normalerweise werden die Wäschen nach der Hybridisierung mit zunehmenden Strengegraden durchgeführt, um nicht-hybridisierte Polynukleotidproben aus den hybridisierten Komplexen zu entfernen.
Die obigen Bedingungen sind als Richtlinie gedacht und fachkundige Personen haben die Fähigkeiten, diese Bedingungen für die Verwendung mit einem bestimmten Polypeptidhybrid anzupassen. Die T_m für eine spezifische Zielsequenz ist die Temperatur (unter der festgelegten Bedingungen), bei der 50 % der Zielsequenz auf eine perfekt übereinstimmende Probe hybridisiert werden. Diese Bedingungen, die sich auf die T_m auswirken, sind u. a. die Größe und der Basenpaarinhalt der Polynukleotidprobe, die ionische Stärke der Hybridisierungslösung und die Gegenwart von destabilisierenden Agenzien in der Hybridisierungslösung. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Gleichungen für die Berechnung der T_m bekannt und spezifisch für DNA, RNA und DNA-RNA-Hybride und Polynukleotidprobesequenzen verschiedener Längen (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Bergen and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); und Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Sequenzanalysensoftware wie z. B. OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) und Primery Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) sowie Internet-Sites sind für die Analyse einer gegebenen Sequenz und Berechnung der T_m basierend auf benutzerdefinierten Kriterien verfügbar. Solche Programme können auch eine gegeben Sequenz unter definierten Bedingungen und analysieren und geeignete Probesequenzen identifizieren. Normalerweise wird die Hybridisierung von längeren Polynukleotidsequenzen mit >50 Basenpaaren bei Temperaturen von etwa 20-25 °C unter der berechneten T_m.durchgeführt. Bei kleineren Proben mit <50 Basenpaaren wird die Hybridisierung meistens bei T_m oder 5-10 °C darunter durchgeführt. Dadurch wird die maximale Hybridisierungsrate für DNA-DNA und DNA-RNA Hybride ermöglicht.
Die Länge der Polynukleotidsequenz beeinflusst die Rate und Stabilität der Hybridbildung. Kleinere Probesequenzen mit <50 Basenpaaren erreichen sehr schnell das Gleichgewicht mit komplementären Sequenzen, bilden jedoch weniger stabile Hybride. Inkubationszeiten von Minuten bis Stunden können zum Erreichen der Hybridbildung verwendet werden. Längere Probesequenzen erreichen das Gleichgewicht langsamer, bilden aber auch bei niedrigen Temperaturen stabilere Komplexe. Inkubationen können über Nacht oder länger dauern. Generell werden Inkubationen für einen Zeitraum durchgeführt, der dem Dreifachen der berechneten Cot-Zeit entspricht. Die Cot-Zeit – die Zeit, die bis zur Reassoziation der
Polynukleotidsequenzen notwendig ist – kann mit den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden für eine bestimmte Sequenz berechnet werden.
Die Basenpaarzusammensetzung der Polynukleotidsequenz wirkt sich auf die thermische Stabilität des Hybridkomplexes aus und beeinflusst dadurch die Wahl der Hybridisierungstemperatur und der ionischen Stärke des Hybridisierungspuffers. A-T-Paare sind weniger stabil als G-C-Paare in natriumchloridhaltigen wässrigen Lösungen. Deshalb gilt: je höher der G-C-Gehalt, desto stabiler ist das Hybrid. Eine gleichmäßige Verteilung der G- und C-Rest innerhalb der Sequenz trägt ebenfalls positiv zur Hybridstabilität bei. Zusätzlich kann die Basenpaarzusammensetzung manipuliert werden, um die T_m einer gegebenen Sequenz zu verändern. So kann z. B. 5-Methyldeoxycytidin gegen Deoxycytidin und 5-Bromodeoxuridin gegen Thymidin ausgetauscht werden, um die T_m zu erhöhen, wogegen 7-deazz-2'-Deoxyguanosin gegen Guanosin ausgetauscht werden kann, um die Abhängigkeit von der T_m zu reduzieren.
Die ionische Konzentration des Hybridisierungspuffers wirkt sich ebenfalls auf die Stabilität des Hybrids aus. Hybridisierungspuffer enthalten generell Blockeragenzien, wie z. B. Denhardt's Solution (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), denaturierte Lachsspermien-DNA, tRNA, Milchpulver (BLOTTO), Heparin oder SDS und eine Na⁺-Quelle wie z. B. SSC (1x SSC: 0,15 M Natriumchlorid, 15 mM sNatriumcitrat) oder SSPE (1x SSPE: 1,8 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄, 1 mM EDTA, pH 7,7). Hybridisierungspuffer enthalten normalerweise 10 mM bis 1 M Na⁺. Die Zugabe von destabilisierenden oder denaturierenden Agenzien, wie z. B. Formamid, Tetralkylammoniumsalze, Guanidiniumkationen oder Thiocyanatkationen in der Hybridisierungslösung verändert die T_m eines Hybrids. Normalerweise wird Formamid mit einer Konzentration bis zu 50 % verendet, damit die Inkubationen bei praktischeren und niedrigeren Temperaturen durchgeführt werden können. Formamid reduziert auch nicht-spezifischen Hintergrund, wenn RNA-Proben verwendet werden.
So kann beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül, das ein variantes Zcytor14-Polypeptid kodiert, mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert werden, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, bei 42 °C über Nacht hybridisiert werden in einer Lösung mit 50 % Formamid, 5x SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5x Denhardt's Solution (100x Denhardt's Solution: 2 % (Gewicht/Volumen) Ficoll 400, 2 % (Gewicht/Volumen) Polyvinylpyrrolidon und 2 % (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin), 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte abgescherte Lachsspermien-DNA. Jede fachkundige Person kann Variationen dieser Hybridisierungsbedingungen entwickeln. Die Hybridisierungsmischung kann beispielsweise bei einer höheren Temperatur, wie z. B. bei ca. 65 °C, in einer formamidfreien Lösung inkubiert werden. Des Weiteren sind vorgemischte Hybridisierungslösungen im Handel erhältlich (z. B. EXPRESSHYB Hybridization Solution von CLONTECH Laboratories, Inc.), die gemäß den Herstelleranweisungen verwendet werden.
Nach der Hybridisierung können die Nukleinsäuremoleküle unter strengen oder hoch-strengen Bedingungen gewaschen werden, um nicht-hybridisierte Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Typische strenge Waschbedingungen umfassen das Waschen in einer Lösung aus 0,5x–2x SSC mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 55-65 °C. Das heißt, Nukleinsäuremoleküle, die ein variantes Zcytor14-Polypeptid kodieren, hybridisieren unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das Nukleotidsequenzen aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,5x–2x SSC mit 0,1 % SDS bei 55-65 °C, einschließlich 0,5x SSC mit 0,1 % SDS bei 55 °C oder 2xSSC mit 0,1 % SDS bei 65 °C entspricht. Die fachkundige Person kann leicht äquivalente Bedingungen entwickeln, z. B. durch Substitution von SSPE gegen SSC in der Waschlösung.
Typische hoch-strenge Waschbedingungen umfassen das Waschen in einer Lösung aus 0,1x-0,2x SSC mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 50-65 °C. Das heißt, Nukleinsäuremoleküle, die ein variantes Zcytor14-Polypeptid kodieren, hybridisieren unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,1x-0,2x SSC mit 0,1 % SDS bei 50-65 °C, einschließlich 0,1x SSC mit 0,1 % SDS bei 50°C oder 0,2x SSC mit 0,1 % SDS bei 65 °C entspricht.
Die vorliegende Erfindung bietet auch isolierte Zcytor14-Polypeptide, die eine im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität aufweisen wie die Polypeptide der SEQ ID-NR:2 oder deren Orthologen. Der hier verwendete Begriff „im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität" bedeutet, dass Polypeptide eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 % zu den Sequenzen in SEQ ID-NR:2 oder deren Orthologen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Zcytor14-variante Nukleinsäuremoleküle in Betracht, die unter Verwendung von zwei Kriterien identifiziert werden können: die Bestimmung der Ähnlichkeit zwischen den kodierten Polypeptiden und den Aminosäuresequenzen aus SEQ ID-NR:2 und einem Hybridisierungs-Assay (wie oben beschrieben). Solche Zcytor14-Varianten umfassen Nukleinsäuremoleküle, die (1) unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,5x-2x SSC mit 0,1 % SDS bei 55-65 °C entspricht, und (2) die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID-NR:2 aufweist. Solche Zcytor14-Varianten umfassen Nukleinsäuremoleküle, die (1) unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,1x-0,2x SSC mit 0,1 % SDS bei 50-65 °C entspricht, und (2) die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID-NR:2 aufweist.
Die prozentuale Sequenzidentität wird durch konventionelle Methoden bestimmt. Sie zum Beispiel Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, (1986) und Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, (1992). Kurz zusammengefasst, es werden zwei Aminosäuresequenzen aliniert, um die Alignment-Scores zu optimieren, wobei 10 Strafpunkte für das Einfügen einer Lücke (Gap Opening Penalty), 1 Strafpunkt für die Erweiterung einer Lücke (Gap Extension Penalty) und die „BLOSUM 62" Scoring-Matrix von Henikoff and Henikoff (ibid.) wie in Tabelle 3 gezeigt verwendet werden (Aminosäuren sind mit ihren standardmäßigen Buchstabencodes aufgeführt). Die prozentuale Identität wird dann wie folgt kalkuliert: ([Gesamtzahl identischer Übereinstimmungen]/[Länge der längeren Sequenz plus die Anzahl der in die längere Sequenz eingefügten Lücken für das Alignment der zwei Sequenzen])(100).
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass für das Alignment von zwei Aminosäuresequenzen viele etablierte Algorithmen zur Verfügung stehen. Der „FASTA" Ähnlichkeit-Suchalgorithmus von Pearson and Lipman ist eine geeignete Protein-Alignmentmethode für die Prüfung der Identitätsebene zwischen der hier offen gelegten Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz einer putativen Zcytor14-Variante. Der FASTA-Algorithmus wird beschrieben von Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) und Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Kurz zusammengefasst, FASTA charakterisiert zuerst die Sequenzähnlichkeit durch Identifizierung der Regionen, die von der Abfragesequenz (z. B. SEQ ID-NR:2) gemeinsam verwendet werden, und einer Testsequenz, welche entweder die höchste Dichte von Identitäten (wenn die ktup-Variable 1 ist) oder Identitätspaare (wenn ktup=2) aufweisen, ohne konservative Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zu berücksichtigen. Die zehn Regionen mit der höchsten Identitätsdichte werden dann durch einen Vergleich der Ähnlichkeit aller gepaarter Aminosäuren neu bewertet, wozu eine Aminosäuresubstitutionsmatrix verwendet wird, und die Enden der Regionen werden „zugeschnitten", so dass sie nur noch die Reste enthalten, die zum höchsten Score beitragen. Wenn mehrere Regionen mit Scores über dem „Abgrenzwert" auftreten (berechnet durch eine festgelegte Formel basierend auf der Länge der Sequenz und des ktup-Wertes), werden die ursprünglichen zugeschnittenen Regionen geprüft, um zu bestimmen, ob die Regionen zur Bildung eines angefähren Alignments mit Lücken verbunden werden können. Schließlich werden die Regionen der zwei Aminosäuresequenzen mit dem höchsten Score aliniert, wozu eine Modifizierung des Needleman-Wunsch-Sellers Algorithmus (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)) verwendet wird, welche Insertionen und Deletionen von Aminosäuren erlaubt. Illustrative Parameter für die FASTA-Analyse sind: ktup=1, Strafpunkte für das Einfügen einer Lücke=10, Strafpunkte für die Erweiterung einer Lücke=1 und Substitutionsmatrix=BLOSUM62. Diese Parameter können durch Modifizierung der Scoring-Matrix-Datei („SMATRIX"), wie in Anhang 2 von Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990) erklärt, in ein FASTA-Programm eingefügt werden.
FASTA kann auch zur Bestimmung der Sequenzidentität von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, wobei das oben offen gelegte Verhältnis Anwendung findet. Für Nukleotidsequenzvergleiche kann der ktup-Wert im Bereich von eins bis sechs, vorzugsweise im Bereich von drei bis sechs liegen und am besten drei betragen, mit anderen Parametern wie oben beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid kodieren, das im Vergleich zu einer hier offen gelegten Aminosäurensequenz eine konservative Aminosäurenveränderung aufweist. Es können z. B. Varianten erhalten werden, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitionen der SEQ ID-NR:2 enthalten, wobei eine alkyle Aminosäure gegen eine alkyle Aminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht wird, eine aromatische Aminosäure wird gegen eine aromatische Aminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht, eine schwefelhaltige Aminosäure wird gegen eine schwefelhaltige Aminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht, eine hydroxyhaltige Aminosäure wird gegen eine hydroxyhaltige Aminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht, eine saure Aminosäure wird gegen eine saure Aminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht, eine basische Aminosäure wird gegen eine basische Aminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht oder eine dibasische Monocarboxylaminosäure wird gegen eine dibasische Monocarboxylaminosäure in einer Zcytor14-Aminosäurensequenz ausgetauscht. Unter den allgemeinen Aminosäuren ist z. B. eine „konservative Aminosäuresubstition" eine Substitution unter Aminosäuren innerhalb jeder der folgenden Gruppen: (1) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, (2) Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, (3) Serin und Threonin, (4) Aspartat und Glutamat, (5) Glutamin und Asparagin und (6) Lysin, Arginin und Histidin.
Die BLOSUM62-Tabelle ist eine Aminosäuresubstitutionsmatrix, die aus ca. 2.000 lokalen multiplen Alignments von Proteinsequenzsegmenten abgeleitet ist und hoch-konservierte Regionen von mehr als 500 Gruppen verwandter Proteine darstellt (Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). Demgemäß können die BLOSUM62-Substitutionsfrequenzen verwendet werden, um die konservativen Aminosäuresubstitutionen zu definieren, die in die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen eingefügt werden können. Es ist zwar möglich, Aminosäuresubstitionen ausschließlich auf Basis der chemischen Eigenschaften zu konstruieren (wie oben erläutert), doch der Begriff „konservative Aminosäuresubstitution" bezieht sich vorzugsweise auf eine Substitution, die durch einen BLOSUM62-Wert größer als –1 dargestellt wird. Eine Aminosäuresubstitution ist beispielsweise konservativ, wenn die Substitution durch einen BLOSUM62-Wert von 0, 1, 2 oder 3 gekennzeichnet ist. Gemäß diesem System sind bevorzugte konservative Aminosäuresubstitionen durch einen BLOSUM62-Wert von mindestens 1 gekennzeichnet (z. B. 1, 2 oder 3), während bevorzugtere konservative Aminosäuresubstitionen durch einen BLOSUM62-Wert von mindestens 2 gekennzeichnet sind (z. B. 2 oder 3).
Bestimmte Varianten von Zcytor14 sind dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 % Sequenzidentität mit der entsprechenden Aminosäurensequenz (z. B. SEQ ID-NR:2) aufweisen, wobei die Variation in der Aminosäurensequenz aufgrund von einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitionen vorliegt.
Konservative Aminosäureveränderungen in einem Zcytor14-Gen können durch Substitution des Nukleotids gegen das in SEQ ID-NR:1 zitierte Nukleotid eingeführt werden. Solche „konservative Aminosäure"-Varianten können erhalten werden z. B. durch oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion u. ä. (siehe Ausubel (1995) auf den Seiten 8-10 bis 8-22; und McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). Ein variantes Zcytor14-Polypeptid kann durch die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an Anti-Zcytor14-Antikörpern identifiziert werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine können auch nicht natürlich auftretende Aminosäurereste enthalten. Nicht natürlich auftretende Aminosäuren sind u. a. ohne Eingrenzung trans-3-Methylprolin, 2,4-Methanoprolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, N-Methylglycin, allo-Threonin, Methylthreonin, Hydroxyethylcystein, Hydroxyethylhomocystein, Nitroglutamin, Homoglutamin, Pipecolinsäure, Thiazolidincarbonsäure, Dehydroprolin, 3- und 4-Methylprolin, 3,3-Dimethylprolin, tert-Leucin, Norvalin, 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin und 4-Fluorphenylalanin. Für die Einbindung nicht natürlich auftretender Aminosäurereste in Proteine sind mehrere Methoden aus dem Stand der Technik bekannt. Es kann z. B. ein in-vitro-System eingesetzt werden, wobei sinnentstellende (Nonsense) Mutationen mittels chemischen aminoazylierten Suppressor-tRNAs unterdrückt werden. Methoden für die Synthese von Aminosäuren und aminoacylierende tRNA sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Transkription und Translation von Nonsense-Mutationen enthaltenden Plasmiden wird in einem zellfreien System durchgeführt, das ein E. coli S30 Extrakt und im Fachhandel erhältliche Enzyme und andere Reagenzien enthält. Die Proteine werden durch Chromatographie gereinigt. Siehe z. B. Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al., Science 259:806 (1993) und Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993).
In einer zweiten Methode wird die Translation in Xenopus Oocyten durch Mikroinjektion der mutierten mRNA und chemisch aminoazylierte Suppressor-tRNAs durchgeführt (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). In einer dritten Methode werden E. coli-Zellen in Abwesenheit einer natürlichen Aminosäure, die zu ersetzen ist (z. B. Phenylalanin) und in Gegenwart der gewünschten nicht natürlich auftretenden Aminosäure(n) (z. B. 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4- Azaphenylalanin oder 4-Fluorphenylalanin) kultiviert. Die nicht natürlich auftretende Aminosäure wird anstelle ihres natürlichen Gegenstückes in das Protein eingebunden. Siehe Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994). Natürlich auftretende Aminosäurereste können durch chemische Modifizierung in-vitro in nicht natürlich auftretende Spezies konvertiert werden. Chemische Modifizierungen können mit stellenspezifischen Mutagenesen kombiniert werden, um den Bereich von Substitutionen zu erweitern (Wynn and Richards, Protein Sci. 1:395 (1993)).
Eine begrenzte Anzahl nicht-konservativer Aminosäuren, nicht durch den genetischen Code kodierter Aminosäuren, nicht natürlich auftretender Aminosäuren und unnatürlicher Aminosäuren kann für Zcytor14-Aminosäurereste substituiert werden.
Essenzielle Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Polypeptiden können unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden, wie z. B. ortsspezifische Mutagenese oder Alaninscanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, „Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), S. 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). Bei der letzteren Methode werden einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül eingefügt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf biologische Aktivität geprüft, um die für die Aktivität des Moleküls wichtigen Aminosäurereste zu identifizieren. Siehe auch Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
Obwohl die Sequenzanalyse zur weiteren Definition der Zcytor14-ligandbindenden Region verwendet werden kann, können die bei der Zcytor14-Bindungsaktivität maßgeblichen Aminosäuren auch durch eine physische Analyse der Struktur unter Verwendung von Methoden wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie, Elektronendiffraktion oder Fotoaffinitätsmarkierung in Verbindung mit der Mutation von putativen Kontaktstellen-Aminosäuren bestimmt werden. Siehe z. B. de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992) und Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992).
Multiple Aminosäuresubstitutionen können unter Verwendung bekannter Mutagenese- und Screening-Methoden durchgeführt und geprüft werden, wie z. B. durch die von Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53 (1988)) oder Bowie and Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989)) offen gelegten Methoden. Kurz gefasst, diese Autoren legen Methoden offen für die gleichzeitige Randomisierung von zwei oder mehreren Positionen in einem Polypeptid, Auswahl für das funktionelle Polypeptid und anschließende Sequenzierung der mutagenisierten Polypeptide zur Bestimmung des Spektrums zulässiger Substitutionen an jeder Position. Weitere anwendbare Methoden sind Phage-Display, (z. B. Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al., US-Patentnr. 5.223.409, Huse, Internationale Publikation Nr. WO 92/06204 und Region-Directed Mutagenesis (Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986) und Ner et al., DNA 7:127, (1988)). Des Weiteren kann mit Biotin oder FITC markiertes Zcytor14 für die Expressionsklonierung verwendet werden.
Varianten der offen gelegten Zcytor14-Nukleotid und Polypeptidsequenzen können durch DNA-Shuffling generiert werden, wie von Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994) und Internationale Publikation Nr. WO 97/20078. offen gelegt. Kurz gefasst, die Generierung der varianten DNA-Moleküle erfolgt durch homologe in-vitro Rekombination durch Zufallsfragmentierung einer Parental-DNA gefolgt von der Reassemblierung unter Verwendung der PCR und resultiert in zufällig eingeführte Punktmutationen. Diese Methode kann modifiziert werden durch die Verwendung einer Familie von Parental-DNA-Molekülen, wie z. B. Allelvarianten der DNA-Moleküle von verschiedenen Spezies, um weitere Variabilität in den Prozess einzuführen. Die Selektion oder das Screening für die gewünschte Aktivität, gefolgt von weiteren Iterationen der Mutagenese und ein Assay liefern eine rapide „Entwicklung" der Sequenzen, indem für die wünschenswerten Mutationen selektiert und gleichzeitig gegen unerwünschte Veränderungen selektiert wird.
Die hier offen gelegten Mutagenesemethoden können mit hochleistungsfähigen automatischen Screeningmethoden kombiniert werden, um die Aktivität von klonierten, mutagenisierten Polypeptiden in Wirtszellen zu finden. Mutagenisierte DNA-Moleküle, die biologisch aktive Polypeptide kodieren oder Polypeptide, die an den Anti-Zcytor14-Antikörper binden, können unter Verwendung moderner Geräte aus den Wirtszellen gewonnen und schnell sequenziert werden. Diese Methoden ermöglichen die schnelle Bestimmung der Bedeutung einzelner Aminosäurereste in einem Polypeptid von Interesse und können auf Polypeptide mit unbekannter Struktur angewandt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch „funktionelle Fragmente" der Zcytor14-Polypeptide und Nukleinsäuremoleküle, die solche funktionellen Fragmente kodieren. Routinemäßige Deletionsanalysen der Nukleinsäuremoleküle können durchgeführt werden, um funktionelle Fragmente eines Nukleinsäuremoleküls zu erhalten, welches ein Zcytor14-Polypeptid kodiert. Beispielsweise können DNA-Moleküle, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1 aufweisen, mittels Bal31-Nuklease verdaut werden, um eine Serie von verschachtelten (nested) Deletionen zu erhalten. Die Fragmente werden dann in dem entsprechenden Lese-Frame in Expressionsvektoren eingefügt und die exprimierten Polypeptide werden isoliert und auf ihre Fähigkeit zum Binden an Anti-Zcytor14-Antikörper geprüft. Eine Alternative zur Exonuklease-Verdauung ist die Verwendung der Oligonukleotid-gesteuerten Mutagenese zur Einführung von Deletionen oder Stopp-Codonen, um die Produktion eines gewünschten Fragments zu spezifizieren. Alternative können bestimmte Fragmente eines Zcytor14-Gens mittels Polymerase-Kettenreaktion synthetisiert werden.
Beispielsweise wurden Studien über die Kürzung an einem oder beiden Termini von Interferonen von Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995) zusammengefasst. Weitere Beispiele für Beschreibungen von Standardmethoden für die funktionelle Analyse sind Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content et al., „Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), Seiten 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) Seiten 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995) und Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).
Ein Beispiel eines funktionellen Fragments eines Zcytor14-Polypeptids ist eine lösliche Form des Zcytor14, in der eine transmembrane Domäne fehlt. Beispielhafte lösliche Zcytor14-Formen umfassen Polypeptide, welche die Aminosäurereste 1 bis 452 der SEQ ID-NR:2, Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2, Aminosäurereste 1 bis 435 der SEQ ID-NR:10 oder Aminosäurereste 21 bis 435 der SEQ ID-NR:10 enthalten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch funktionelle Fragmente eines Zcytor14-Gens, das im Vergleich zu einer hier offen gelegten Aminosäurensequenz Aminosäurenveränderungen aufweist. Ein variantes Zcytor14-Gen kann auf Basis der Struktur identifiziert werden, indem die Ebene der Identität mit den offen gelegten und oben erläuterten Nukleotid- und Aminosäurensequenzen bestimmt wird. Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung eines varianten Gens auf Basis der Struktur ist die Bestimmung, ob ein Nukleinsäuremolekül, das ein potenzielles variantes Zcytor14-Gen kodiert, an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert werden kann, das eine Nukleotidsequenz wie z. B. die SEQ ID-NR:1 oder 4 enthält.
Polypeptidfragmente oder Peptide, die einen Epitop-tragenden Anteil eines Zcytor14-Polypeptids, wie hier beschrieben, umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt. Solche Fragmente oder Peptide können ein „immunogenes Epitop" umfassen, welches Teil eines Proteins ist, das eine Antikörperreaktion auslöst, wenn das gesamte Protein als Immunogen verwendet wird. Immunogene Epitoptragende Peptide können mittels Standardmethoden identifiziert werden (siehe z. B. Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)).
Im Gegensatz dazu können Polypeptidfragmente oder Peptide ein „antigenes Epitop" umfassen, welches eine Region eines Proteinmoleküls ist, an das ein Antikörper spezifisch binden kann. Bestimmte Epitope bestehen aus einer linearen oder durchgehenden Strecke von Aminosäuren und die Antigenität solcher Epitope wird nicht durch denaturierende Agenzien unterbrochen. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass relativ kurze synthetische Peptide, welche Epitope eines Proteins imitieren, für die Stimulation der Produktion von Antikörpern gegen das Protein verwendet werden können (siehe z. B. Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)). Dementsprechend sind antigene Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung nützlich für die Aufzucht von Antikörpern, die mit den hier beschriebenen Polypeptiden binden.
Antigene Epitop-tragende Peptide und Polypeptide können mindestens vier bis zehn Aminosäuren, mindestens zehn bis fünfzehn Aminosäuren oder etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren einer hier offen gelegten Aminosäurensequenz enthalten. Solche Epitop-tragende Peptide und Polypeptide können durch Fragmentierung eines Zcytor14-Polypeptids oder durch chemische Peptidsynthese wie hier beschrieben produziert werden. Des Weiteren können Epitope mittels Phage-Display aus randomisierten Peptidbibliotheken selektiert werden (siehe z. B. Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993) und Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Standardmethoden für die Identifizierung von Epitopen und Produktion von Antikörpern aus kleinen Peptiden, die ein Epitop umfassen, sind z. B. beschrieben von Mole, „Epitope Mapping", in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), Seiten 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, „Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), Seiten 60-84 (Cambridge University Press 1995) und Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Seiten 9.3.1-9.3.5 und Seiten 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).
Für jedes Zcytor14-Polypeptid, einschließlich Varianten und Fusionsproteine, kann eine fachkundige Person unter Verwendung der Informationen aus den Tabellen 1 und 2 oben jederzeit eine diesen Varianten kodierende voll degenerierte Polynukleotidsequenz generieren. Fachkundige Personen können des Weiteren Standardsoftware verwenden, um Zcytor14-Varianten auf Basis der hier beschriebenen Nukleotid- und Aminosäurensequenzen zu entwickeln. Demgemäß kann ein computer-lesbarer, mit einer Datenstruktur kodierter Datenträger bereitgestellt werden, der mindestens eine der folgenden Sequenzen aufweist: SEQ ID-NR:1, SEQ ID-NR:2, SEQ ID-NR:3, SEQ ID-NR:4, SEQ ID-NR:5, SEQ-NR:6, SEQ ID-NR:8, SEQ ID-NR:9, SEQ ID-NR:10, SEQ ID-NR:11 und SEQ ID-NR:12. Geeignete Formen von computer-lesbaren Datenträgern sind Magnetträger und optisch-lesbare Datenträger. Beispiele für Magnetträger sind u. a. Festplatte bzw. Festplattenlaufwerk, RAM-Chip, Diskette, Digital Linear Tape (DLT-Laufwerk), Disk-Cache und ZIP-Diskette. Optisch lesbare Datenträger sind z. B. Compact Discs (z. B. CD-ROM-Laufwerk), CD-Rewritable (RW) und CD-Recordable (CD-R) sowie Digital-Versatile/Video-Discs (DVD) (z. B. DVD-ROM, DVD-RAM und DVD+RW).
6. Produktion von Zcytor14-Polypeptiden
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, einschließlich Gesamt-Polypeptide, funktionelle Fragmente und Fusionsproteine können in rekombinanten Wirtszellen mittels konventioneller Methoden produziert werden. Für die Expression eines Zcytor14-Gens muss ein das Polypeptid kodierendes Nukleinsäuremolekül funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft werden, welche die transkriptionelle Expression in einen Expressionsvektor steuern, und dann in eine Wirtszelle eingefügt werden. Zusätzlich zu transkriptionellen regulatorischen Sequenzen, wie z. B. Promoter und Enhancer, können Expressionsvektoren auch translatorische regulatorische Sequenzen und ein Markengen enthalten, welches für die Auswahl der Zellen, die den Expressionsvektor tragen, geeignet ist.
Expressionsvektoren, die sich für die Produktion eines fremden Proteins in eukaryotische Zellen eignen, enthalten normalerweise (1) prokaryotische DNA-Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsursprung und antibiotische Resistenzmarker kodieren, um das Wachstum und die Selektion des Expressionsvektors in einem bakteriellen Wirt zu liefern; (2) eukaryotische DNA-Elemente, welche die Initiierung der Transkription steuern, z. B. einen Promoter; und (3) DNA-Elemente, welche die Verarbeitung der Transkripte steuern, wie z. B. eine Transkriptionsterminierungs-/Polyadenylierungssequenz. Wie oben besprochen können Expressionsvektoren auch Nukleotidsequenzen enthalten, welche eine sekretorische Sequenz kodieren, die das heterologe Polypeptid in den sekretorischen Signalweg einer Wirtszelle leitet. Ein Zcytor14-Expressionsvektor kann z. B. ein Zcytor14-Gen und eine aus einem sekretierten Gen abgeleitete sekretorische Sequenz umfassen.
Erfindungsgemäße Zcytor14-Proteine können in Säugetierzellen exprimiert werden. Beispiele für geeignete Säugetierwirtszellen sind u. a. Nierenzellen von afrikanischen grünen Meerkatzen (Vero; ATCC CRL 1587), humane embryonische Nierenzellen (293-HEK; ATCC CRL 1573), Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), Nierenzellen vom Hund (MDCK; ATCC CCL 34), chinesische Hamstereierstockzellen (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), Rattennebennierenzellen (GHI; ATCC CCL82), HeLa S3-Zellen (ATCC CCL2.2), Rattenhäpatomzellen (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-transformierte Affennierenzellen (COS-1; ATCC CRL 1650) und Mausembryozellen (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Für einen Säugetierwirt können die transkriptionellen und translatorischen regulatorischen Signale aus viralen Quellen abgeleitet werden, z. B. Adenovirus, Bovine Papilloma Virus, Simian-Virus o. ä., in denen die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen verbunden sind, welches einen hohen Expressionsgrad aufweist. Geeignete transkriptionelle und translatorische Sequenzen können auch aus Säugetiergenen gewannen werden, wie z. B. Actin, Collagen, Myosin und Metallothionein.
Transkriptionelle regulatorische Sequenzen umfassen eine Promoterregion, die für die Initiierung der RNA-Synthese ausreicht. Geeignete eukaryotische Promoter sind u. a. die Promoter des Maus-Metallothionein-I-Gens (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), der TK-Promoter des Herpes-Virus (McKnight, Cell 31:355 (1982)), der frühe SV40-Promoter (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), der Rous Sarcoma Virus-Promoter (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), der Cytomegalovirus-Promoter (Foecking et al., Gene 45:101 (1980)) und der Mausbrustdrüsentumorvirus-Promoter (siehe allgemein Etcheverry, „Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), S. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Alternativ kann ein prokaryotischer Promoter, wie der Bakteriophage T3 RNA-Polymerasepromoter verwendet werden, um die Zcytor14-Genexpression in Säugetierzellen zu steuern, wenn der prokaryotische Promoter von einem eukaryotischen Promoter reguliert wird (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), and Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).
Ein Expressionsvektor kann mittels verschiedener Standardmethoden in Wirtszellen eingefügt werden, u. a. durch Kalziumphosphattransfektion, liposomvermittelte Transfektion, Mikroprojektil-vermittelte Abgabe, Elektroporation u. ä. Die transfektierten Zellen können selektiert und propagiert werden, um rekombinante Wirtszellen bereitzustellen, welche den stabil in das Wirtszellengenom integrierten Expressionsvektor umfassen. Methoden für das Einfügen von Vektoren in eukaryotische Zellen sowie Methoden für die Selektion solcher stabiler Transformanten mittels eines dominanten selektierbaren Markers werden u. a. von Ausubel (1995) und Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991) beschrieben.
Ein geeigneter selektierbarer Marker ist z. B. ein Gen mit Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin. Die Selektion wird in diesem Fall in Gegenwart eines Neomycin-Arzneimittels, wie z. B. G-418 o. ä., durchgeführt. Selektionssysteme können auch verwendet werden, um den Expressionsgrad des Gens von Interesse zu erhöhen; ein Prozess, der als „Amplifizierung" bezeichnet wird. Zur Amplifizierung werden Transfektanten in Gegenwart einer geringen Konzentration des selektiven Agens kultiviert und anschließend wird die Menge des selektiven Agens erhöht, um für die Zellen, die hohe Konzentrationen der in die Gene eingeführten Produkte erzeugen, zu selektieren. Ein geeigneter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist Dihydrofolatreduktase, welche Resistenz gegen Methotrexat überträgt. Andere Arzneimittelresistenz-Gene (z. B. Hygromycin-Resistenz, Multiple Arzneimittelresistenz, Puromycinacetyltransferase) können ebenfalls verwendet werden. Alternative Marker, die einen veränderten Phänotyp einführen, wie z. B. grün fluoreszierendes Protein oder Zelloberflächenproteine, wie CD4, CD8, I MHC Klasse I oder plazentale alkalische Phosphatase, können verwendet werden, um transfektierte Zellen von nicht-transfektierten Zellen mittels FACS-Sortierung oder Magnetic Bead Separation-Technologie auszusortieren.
Zcytor14-Polypeptide können auch durch kultivierte Säugetierzellen unter Verwendung eines viralen Abgabesystems produziert werden. Exemplarische Viren für diesen Zweck sind Adenovirus, Herpesvirus, Vacciniavirus und Adeno-Assoziierter Virus (AAV). Das Adenovirus, ein doppelsträngiges DNA-Virus, ist derzeit der am besten untersuchte Gentransfervektor für die Abgabe von heterologer Nukleinsäure (siehe Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), and Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Vorteile des Adenovirussystems sind u. a., dass dieses System relativ große DNA-Einsätze aufnehmen; in einem hohen Titer wachsen; einen weiten Bereich von Säugetierzelltypen infizieren kann und mit einer großen Anzahl erhältlicher Vektoren, die verschieden Promoter enthalten, verwendet werden kann.
Durch die Deletion von Teilen des Adenovirusgenoms können größere Einsätze (bis zu 7 kb) heterologer DNA aufgenommen werden. Diese Einsätze können durch direkte Ligation oder durch homologe Rekombination mit einem cotransfektierten Plasmid in die virale DNA eingebunden werden. Eine Option ist die Deletion des essenziellen E1-Gens aus dem viralen Vektor, was dazu führt, dass keine Replikation möglich ist, außer wenn das E1-Gen von der Wirtszelle bereitgestellt wird. Mit dem Adenovirusvektor infizierte humane 293-Zellen (ATCC-Nr. CRL-1573, 45504, 45505) können z. B. als adhärente Zellen oder in einer Suspensionskultur bei relativ hoher Zelldichte gezüchtet werden, um signifikante Mengen Protein zu erzeugen (siehe Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)).
Zcytor14 kann auch in andere höhere Eukaryonten exprimiert werden, wie z. B. Vogel-, Pilz, Insekten-, Hefe- oder Pflanzenzellen. Das Baculovirussystem bietet ein effizientes Mittel für die Einfügung klonierter Zcytor14-Gene in Insektenzellen. Geeignete Expressionsvektoren basieren auf dem Autographa californica multiplen nukleären Polyhedrosevirus (AcMNPV) und enthalten bekannte Promoter wie Drosophila Heat Shock Protein (hsp) 70 Promoter, Autographa californica Nuclear Polyhedrosevirus Sofortiger/Früher Gen-Promoter (ie-1) und Verzögerter/Früher 39K-Promoter, Baculovirus p10 Promoter und Drosophila Metallothionein Promoter. Eine zweite Methode zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus verwendet ein Transposon-Basis-System, das von Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993)) beschrieben wurde. Dieses System nutzt Transfervektoren und wird im BAC-to-BAC Kit (Life Technologies, Rockville, MD) verkauft. Dieses System nutzt einen Transfervektor, PFASTBAC (Life Technologies), der ein Tn7-Transposon enthält, um die Zcytor14-Polypeptid-kodierende DNA in ein Baculovirusgenom zu bewegen, das in E. coli als ein großes Plasmid namens „Bacmid" erhalten wird. Siehe Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) und Chazenbalk und Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Des Weiteren können Transfervektoren eine In-Frame-Fusion mit der DNA beinhalten, welche ein Epitop-Tag am C- oder N-Terminus des exprimierten Zcytor14-Polypeptids exprimiert, z. B. ein Glu-Glu-Epitop-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)). Mittels einer aus dem Stand der Technik bekannten Methode wird ein das Zcytor14-Gen enthaltender Transfervektor in E. coli transformiert und für Bacmide gescreent, welche ein unterbrochenes, für rekombinantes Baculovirus indikatives lacZ-Gen enthalten. Die Bacmid-DNA, die das rekombinante Baculovirusgenom enthält, wird dann mittels bekannter Methoden isoliert.
Der als Beispiel verwendete PFASTBAC-Vektor kann jedoch in einem wesentlichen Maß modifiziert werden. Der Polyhedrinpromoter kann entfernt und durch den Baculovirus-Basisproteinpromoter (auch als Pcor, p6.9 oder MP-Promoter bekannt) substituiert werden, welcher früher in der Baculovirusinfektion exprimiert wurde und sich als vorteilhaft für die Expression sekretierter Proteine erwiesen hat (siehe z. B. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) und Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). In solchen Transfervektorkonstruktionen kann eine kurze oder lange Version des Basisproteinpromoters verwendet werden. Des Weiteren können Transfervektoren konstruiert werden, welche die nativen sekretorischen Zcytor14-Signalsequenzen durch die aus Insektenproteinen gewonnenen sekretorischen Signalsequenzen ersetzen. So kann z. B. eine sekretorische Signalsequenz aus der Ecdysteroid-Glucosyltransferase (EGT), Honigbiene Melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) oder Baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) in Konstrukten verwendet werden, um die native sekretorische Zcytor14-Signalsequenz zu ersetzen.
Das rekombinante Virus oder Bacmid wird zur Transfektion der Wirtszellen verwendet. Geeignete Insektenwirtszellen sind u. a. Zelllinien, die aus IPLB-Sf-21, einer Spodoptera frugiperda Pupa-Eierstockzelllinie wie z. B. Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE und Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA) sowie Drosophila Schneider-2-Zellen und die HIGH FIVEO-Zelllinie (Invitrogen) aus Trichoplusia ni (US-Patentnr. 5.300.435) gewonnen werden. Im Handel erhältliche serumfreie Medien werden zum Züchten und Erhalten der Zellen verwendet. Geeignete Medien sind Sf900 II^TM (Life Technologies) oder ESF 921^TM (Expression Systems) für die Sf9-Zellen; und Ex-cellO405^TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder Express FiveO^TM (Life Technologies) für die T. ni-Zellen. Wenn ein rekombinantes Virus verwendet wird, werden die Zellen normalerweise von einer Inokulationsdichte von ca. 2-5 × 10⁵ Zellen auf eine Dichte von 1-2 × 10⁶ Zellen gezüchtet und zu diesem Zeitpunkt wird dann ein rekombinanter Virenbestand bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1 bis 10, am typischsten nahe 3, hinzugefügt.
Etablierte Methoden für die Produktion von rekombinanten Proteinen in Baculovirussystemen werden von Bailey et al., „Manipulation of Baculovirus Vectors" in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), S. 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991) von Patel et al., „The baculovirus expression system" in DNA Cloning 2 beschrieben: Expression Systems, 2. Ausgabe, Glover et al. (eds.), S. 205-244 (Oxford University Press 1995), von Ausubel (1995), S. 16-37 bis 16-57, von Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) und von Lucknow „Insect Cell Expression Technology" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), S. 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
Funguszellen, einschließlich Hefezellen, können ebenfalls für die Expression der hier beschriebenen Gene verwendet werden. Hefespezies von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang sind u. a. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Pichia methanolica. Geeignete Promoter für die Expression in Hefe umfassen Promoter von GAL1 (Galactose), PGK (Phosphoglyceratkinase), ADH (Alkoholdehydrogenase), AOX1 (Alkoholoxidase), HIS4 (Histidinoldehydrogenase) u. ä. Viele Hefeklonierungsvektoren wurden entwickelt und sind allgemein verfügbar. Zu diesen Vektoren gehören u. a. YIp-basische Vektoren wie YIp5, YRp-Vektoren wie YRp17, YEp-Vektoren wie YEp13 und YCp-Vektoren wie YCp19. Methoden für die Transformation von S. cerevisiae-Zellen mit exogener DNA und die Produktion rekombinanter Polypeptide daraus wurden offen gelegt z. B. von Kawasaki, US-Patentnr. 4.599.311; Kawasaki et al., US-Patenter. 4.931.373; Brake, US-Patentnr. 4.870.008; Welch et al., US-Patentnr. 5.037.743; und Murray et al., US-Patentnr. 4.845.075. Die transformierten Zellen werden nach Phänotyp ausgewählt, der durch den selektierbaren Marker, meistens Arzneimittelresistenz oder Fähigkeit zum Wachsen in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes (z. B. Leucin), bestimmt wird. Ein geeignetes Vektorsystem für die Verwendung in Saccharomyces cerevisiae ist das POT1-Vektorsystem, das von Kawasaki et al. (US-Patentnr. 4.931.373) offen gelegt wurde und das die Selektion von transformierten Zellen nach Wachstum in glukosehaltigem Medium ermöglicht. Weitere geeignete Promoter und Terminatoren für die Verwendung in Hefe sind u. a. jene aus glykolytischen Enzymgenen (siehe z. B. Kawasaki, US-Patentnr. 4.599.311; Kingsman et al., US-Patentnr. 4.615.974; und Bitter, US-Patentnr. 4.977.092) und Alkoholdehydrogenase-Gene. Siehe auch US-Patentnr. 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 und 4.661.454.
Transformationssysteme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) and Cregg, US-Patentnr. 4.882.279. Aspergilluszellen können gemäß den Methoden von McKnight et al., US-Patentnr. 4.935.349 verwendet werden. Methoden für die Transformation von Acremonium chrysogenum wurden von Sumino et al., US-Patentnr. 5.162.228 offen gelegt. Methoden für die Transformation von Neurospora wurden von Lambowitz, US-Patentnr. 4.486.533 offen gelegt.
Die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt für die Produktion von rekombinanten Proteinen wurde von Raymond, US-Patenten Nr. 5.716.808, Raymond, US-Patentnr. 5.736.383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998) und in den Internationalen Publikationen WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 und WO 98/02565 offen gelegt. DNA-Moleküle für die Verwendung in der Transformation von P. methanolica wird generell als doppelsträngige, kreisförmige Plasmide präpariert, die vorzugsweise vor der Transformation linearisiert werden. Für die Polypeptidproduktion in P. methanolica wird bevorzugt, dass Promoter und Terminator im Plasmid aus einem P. methanolica-Gen wie P. methanolica-Alkohol-Utilizing Gen (AUG1 oder AUG2) stammen. Andere nützliche Promoter sind Gene aus Dihydroxyacetonsynthase (DHAS), Formatdehydrogenase (FMD) und Catalase (CAT). Zur Ermöglichung der Integration der DNA in das Wirtschromosom wird bevorzugt, dass das gesamte Expressionssegment des Plasmids an beiden Enden von Wirts-DNA-Sequenzen umgeben ist. Ein geeigneter selektierbarer Marker für die Verwendung in Pichia methanolica ist ein P. methanolica ADE2 Gen, welches Phosphoribosyl-5-Aminoimidazolcarboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21) kodiert und welches das Wachstum von ade2-Wirtszellen in Abwesenheit von Adenin erlaubt. Für groß angelegte industrielle Prozesse, wo eine Minimierung der Methanolverwendung wünschenswert ist, können Wirtszellen verwendet werden, in denen beide Methanol-Utilization-Gene (AUG1 und AUG2) deletiert werden. Für die Produktion von sekretierten Proteinen werden Wirtszellen mit einem Mangel an Vacuolarprotease-Genen (PEP4 und PRB1) bevorzugt. Für die Einfügung von plasmidhaltiger DNA, die ein Polypeptid von Interesse kodiert, in P. methanolica-Zellen wird Elektroporation eingesetzt. P. methanolica-Zellen können durch Elektroporation transformiert werden, wozu ein exponenziell abbauendes, pulsiertes elektrisches Feld mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm, vorzugsweise etwa 3,75 kV/cm, und eine Zeitkonstante (t) von 1 bis 40 Millisekunden, vorzugsweise etwa 20 Millisekunden, verwendet werden.
Expressionsvektoren können auch in Pflanzenprotoplaste, intaktes Pflanzengewebe oder isolierte Pflanzenzellen eingefügt werden. Methoden für die Einführung von Expressionsvektoren in Pflanzengewebe sind u. a. direkte Infektion oder Co-Kultivierung des Pflanzengewebes mit Agrobacterium tumefaciens, Mikroprojektilvermittelter Abgabe, DNA-Injektion, Elektroporation u. ä. Siehe z. B. Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992) und Miki et al., „Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), S. 67-88 (CRC Press, 1993).
Alternativ können Zcytor14-Gene in prokaryotische Wirtszellen exprimiert werden. Geeignete Promoter für die Verwendung zur Expression der Zcytor14-Polypeptide in einen prokaryotischen Wirt sind fachkundigen Personen bekannt und sie umfassen Promoter mit der Fähigkeit zur Erkennung von T4-, T3-, Sp6- und T7-Polymerasen, die P_R- und P_L-Promoter aus dem Bakteriophagen Lambda, die Promoter trp, recA, Heat-Shock, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA und lacZ Promoter aus E. coli, Promoter aus B. subtilis, Promoter der Bakteriophagen aus Bacillus, Streptomyces-Promoter, int-Promoter aus dem Bakteriophagen Lambda, bla-Promoter aus pBR322 und CAT Promoter aus dem Chloramphenicolacetyltransferasegen. Prokaryotische Promoter wurden von Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe (Benjamin Cummins 1987) und von Ausubel et al. (1995) untersucht.
Beispielhafte prokaryotische Wirte umfassen E. coli und Bacillus subtilus. Geeignete Stränge von E. coli umfassen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 und ER1647 (siehe z. B. Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Geeignete Stränge von Bacillus subtilus umfassen BR151, YB886, MI119, MI120 und B170 (siehe z. B. Hardy, „Bacillus Cloning Methods" in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).
Bei der Expression eines Zcytor14-Polypeptids in Bakterien wie E. coli kann das Polypeptid im Zytoplasma erhalten werden, typisch als unlösliches Granulat oder es kann durch eine bakterielle Sekretionssequenz an den periplasmischen Raum geleitet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert und das Granular wird zurückgewonnen und z. B. mittels Guanidinisothiocyanat oder Harnstoff denaturiert. Das denaturierte Polypeptid kann dann erneut gefaltet und durch Verdünnung des Denaturierungsmittels dimerisiert werden, z. B. durch Dialyse gegen eine Lösung aus Harnstoff und einer Kombination aus reduziertem und oxidiertem Gluthation, gefolgt von eine Dialyse gegen eine gepufferte Kochsalzlösung. Im letzteren Fall kann das Polypeptid in einer löslichen und funktionellen Form aus dem periplasmischen Raum zurückgewonnen werden, indem die Zellen unterbrochen werden (z. B. durch Ultraschall oder osmotischen Schock), um den Inhalt des periplasmischen Raums freizusetzen und das Protein zurückzugewinnen, wobei der Bedarf für eine Denaturierung und erneute Faltung vermieden wird.
Methoden für die Expression von Proteinen in prokaryotische Wirte sind fachkundigen Personen bekannt (siehe z. B. Williams et al., „Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal Antikörper" in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. Ausgabe, Glover et al. (eds.), S. 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., „Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, S. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) und Georgiou, „Expression of Proteins in Bacteria" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), Seite 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Standardmethoden für das Einfügen von Expressionsvektoren in Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Pflanzenzellen werden beispielsweise von Ausubel (1995) bereitgestellt.
Allgemeine Methoden für die Expression und Wiedergewinnung von Fremdprotein, das durch ein Säugetierzellsystem produziert wurde, werden beispielsweise von Etcheverry, „Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), S. 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) bereitgestellt. Standardmethoden für die Rückgewinnung von Protein, das durch ein Bakteriensystem produziert wurde, wird z. B. von Grisshammer et al., „Purification of over-produced proteins from E. coli cells" in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. Ausgabe, Glover et al. (eds.), S. 59-92 (Oxford University Press 1995) bereitgestellt. Etablierte Methoden für die Isolierung rekombinanter Proteine aus einem Baculovirussystem wurden von Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) beschrieben.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch exklusive Festphasensynthese, partielle Festphasemethoden, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese synthetisiert werden. Diese Synthesemethoden sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (2. Ausgabe), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields and Colowick, „Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), und Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Variationen in gesamtchemischen Synthesestrategien, wie z. B. „native chemische Ligation" und „exprimierte Proteinligation" sind ebenfalls Standardmethoden (siehe z. B. Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998), und Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).
Erfindungsgemäße Peptide und Polypeptide umfassen mindestens sechs, mindestens neun oder mindestens 15 durchgängige Aminosäurereste der SEQ ID-NR:2, SEQ ID-NR:5, SEQ ID-NR:10, SEQ ID-NR:11 oder SEQ ID-NR:12. Die vorliegende Erfindung umfasst z. B. Polypeptide, die 15 durchgängige Aminosäuren aus folgenden Aminosäurensequenzen umfassen bzw. aus diesen bestehen: Aminosäurereste 21 bis 452 der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2, Aminosäurereste 21 bis 435 der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:10, Aminosäurereste 474 bis 677 der SEQ ID-NR:2 oder Aminosäurereste 457 bis 673 der SEQ ID-NR:10. In bestimmten Ausführungsbeispielen der Erfindung umfassen die Polypeptide 20, 30, 40, 50, 100 oder mehr durchgängige Reste dieser Aminosäurensequenzen. Als Beispiel umfasst die vorliegende Erfindung Polypeptide, welche 30 oder 40 durchgängige Aminosäuren der folgenden Aminosäurensequenzen umfassen bzw. aus diesen bestehen: Aminosäurereste 21 bis 452 der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2, Aminosäurereste 21 bis 435 der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:10, Aminosäurereste 474 bis 677 der SEQ ID-NR:2 oder Aminosäurereste 457 bis 673 der SEQ ID-NR:10. Nukleinsäuremoleküle, die solche Peptide und Polypeptide kodieren, sind als Primer und Proben der Polymerase-Kettenreaktion nützlich.
7. Produktion der Zcytor14-Fusionsproteine und Konjugate
Eine generelle Klasse der Zcytor14-Analoge sind Varianten mit einer Aminosäurensequenz, die eine Mutation der hier offen gelegten Aminosäurensequenz ist. Eine andere Klasse von Zcytor14-Analogen wird wie unten beschrieben durch antiidiotypische Antikörper und Fragmente davon bereitgestellt. Des Weiteren können rekombinante Antikörper, die antiidiotypische variable Domänen enthalten, als Analoge verwendet werden (siehe z. B. Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)). Da die variablen Domänen des antiidiotypischen Zcytor14-Antikörpers Zcytor14 imitieren, können diese Domänen eine Zcytor14-bindende Aktivität bereitstellen. Methoden für die Produktion von antiidiotypischen katalytischen Antikörpern sind fachkundigen Personen bekannt (siehe z. B. Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992), Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994) und Avalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)).
Ein weiterer Ansatz für die Identifizierung von Zcytor14-Analogen ist die Verwendung von kombinatorischen Bibliotheken. Methoden für die Konstruktion und das Screening von Phage-Display- und anderen kombinatorischen Bibliotheken werden z. B. von Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, US-Patentnr. 5.783.384, Kay, et. al., US-Patentnr. 5.747.334 und Kauffman et al., US-Patentnr. 5.723.323 beschrieben.
Zcytor14-Polypeptide können sowohl in-vivo als auch in-vitro verwendet werden. Es kann z. B. eine lösliche Form des Zcytor14 einem Zellkulturmedium zugegeben werden, um die Wirkungen des von den kultivierten Zellen produzierten Zcytor14-Liganden zu hemmen.
Fusionsproteine von Zcytor14 können verwendet werden, um Zcytor14 in einen rekombinanten Wirt zu exprimieren und das produzierte Zcytor14 zu isolieren. Bestimmte Zcytor14-Fusionsproteine finden wie unten beschrieben auch in der Diagnose und Therapie Anwendung. Ein Fusionsproteintyp umfasst ein Peptid, das ein Zcytor14-Polypeptid aus einer rekombinanten Wirtszelle leitet. Um ein Zcytor14-Polypeptid in den sekretorischen Signalweg einer eukaryotischen Wirtszelle zu leiten, ist im Zcytor14-Expressionsvektor eine sekretorische Signalsequenz (auch als Signalpeptid, Leitsequenz, Präpro-Sequenz oder Präsequenz bekannt) vorgesehen. Während die sekretorische Signalsequenz aus dem Zcytor14 abgeleitet werden kann, besteht auch die Möglichkeit, eine geeignete Signalsequenz aus einem anderen sekretierten Protein abzuleiten oder de novo zu synthetisieren. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der Zcytor14-kodierenden Sequenz funktionell verknüpft, d. h. die zwei Sequenzen sind im korrekten Lese-Frame verbunden und so positioniert, dass sie das neu synthetisierte Polypeptid in den sekretorischen Signalweg der Wirtszelle leiten. Sekretorische Signalsequenzen werden generell am 5'-Ende der Nukleotidsequenz positioniert, welche das Polypeptid von Interesse kodiert, obwohl bestimmte Signalsequenzen auch an anderer Stelle in der Nukleotidsequenz von Interesse positioniert sein können (siehe z. B. Welch et al., US-Patentnr. 5.037.743; Holland et al., US-Patentnr. 5.143.830).
Obwohl die sekretorische Signalsequenz von Zcytor14 oder ein anderes von Säugetierzellen produziertes Protein (z. B. Gewebeplasminogenaktivator-Signalsequenz wie z. B. in US-Patentnr. 5.641.655 beschrieben) für die Expression von Zcytor14 in rekombinante Säugetierwirte nützlich ist, wird eine Hefesignalsequenz für die Expression in Hefezellen bevorzugt. Beispiele für geeignete Hefesignalsequenzen sind die aus Hefe-Mating-Phermon-Alphafaktor (durch das MFα1-Gen kodiert), Invertase (durch das SUC2-Gen kodiert) oder Säurephosphatase (durch das PHO5-Gen kodiert) gewonnenen Sequenzen. Siehe z. B. Romanos et al., „Expression of Cloned Genes in Yeast" in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2. Ausgabe, Glover and Hames (eds.), S. 123-167 (Oxford University Press 1995).
In Bakterienzellen ist es oft wünschenswert, ein heterologes Protein als ein Fusionsprotein zu exprimieren, um die Toxizität zu verringern, die Stabilität zu erhöhen und die Rückgewinnung des exprimierten Proteins zu verbessern. Zcytor14 kann z. B. als ein Fusionsprotein exprimiert werden, das ein Glutathion-S-Transferasepolypeptid umfasst. Glutathion-S-Transfereasefusionsproteine sind normalerweise löslich und auf immobilisierten Gluthationsäulen leicht aus E. coli-Lysaten aufzureinigen. In ähnlichen Ansätzen kann ein Zcytor14-Fusionsprotein, das ein maltosebindendes Proteinpolypeptid umfasst, mit einer Amyloseharzsäule isoliert werden, während ein Fusionsprotein, welches das C-Terminusende eines gekürzten Protein-A-Gens umfasst, mit IgG-Sepharose aufgereinigt werden. Etablierte Methoden für die Expression eines heterologen Polypeptids als ein Fusionsprotein in eine Bakterienzelle werden z. B. von Williams et al., „Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies" in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2. Ausgabe, Glover and Hames (Eds.), S. 15-58 (Oxford University Press 1995) beschrieben. Des Weiteren sind Expressionssysteme im Handel erhältlich. Das PINPOINT Xa Proteinaufreinigungssystem (Promega Corporation; Madison, WI) bietet z. B. eine Methode für die Isolierung eines Fusionsproteins, das ein Polypeptid umfasst, welches während der Expression mit einem Avidin-haltigen Harz biotinyliert wird.
Für die Isolierung heterologer Polypeptide, die entweder von prokaryotischen oder von eukaryotischen Zellen exprimiert werden, nützliche Peptid-Tags sind u. a. Polyhistidin-Tags (welche eine Affinität für Nickelchelatharz aufweisen), c-myc-Tags, Calmodulin-bindendes Protein (isoliert mit Calmodulinaffinitätschromatographie), Substanz P, der RYIRS-Tag (welcher an den Anti-RYIRS-Antikörper bindet), der Glu-Glu-Tag und der FLAG-Tag (welcher an den Anti-FLAG Antikörper bindet). Siehe z. B. Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996) und Zheng et al., Gene 186:55 (1997). Nukleinsäuremoleküle, die solche Peptide-Tags kodieren, werden z. B. von Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO) angeboten.
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung der in den erfindungsgemäßen Zcytor14-Polypeptiden enthaltenen sekretorischen Signalsequenz für die Leitung anderer Polypeptide in den sekretorischen Signalweg in Betracht. Ein Signalfusionspolypeptid kann hergestellt werden, wobei eine von den Aminosäurereste 1 bis 20 der SEQ ID-NR:2 abgeleitete sekretorische Signalsequenz mittels der aus dem Stand der Technik bekannten sowie der hier offen gelegten Methoden mit einem anderen Polypeptid funktionell verknüpft wird. Die in den erfindungsgemäßen Fusionspolypeptiden enthaltene sekretorische Signalsequenz wird vorzugsweise aminoterminal an ein weiteres Peptid fusioniert, um weitere Peptide in den sekretorischen Signalweg zu leiten. Für solche Konstrukte gibt es zahlreiche aus dem Stand der Technik bekannte Anwendungen. Diese neuen sekretorischen Signalsequenzfusionskonstrukte können z. B. die Sekretion einer aktiven Komponente eines normalerweise nicht-sekretierten Proteins, wie z. B. einem Rezeptor, steuern. Solche Fusionen können transgenen Tieren oder in einem kultivierten rekombinanten Wirt verwendet werden, um Peptide durch den sekretorischen Signalweg zu leiten. In Bezug auf das Letztere umfassen beispielhafte Polypeptide pharmazeutisch aktive Moleküle wie Faktor VIIa, Proinsulin, Insulin, Follicle-Stimulating-Hormon, Gewebeplasminogenaktivator, Tumornekrosefaktor, Interleukine (z. B. Interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 und IL-18), Colony-Stimulating-Faktoren (z. B. Granulocyt-Colony-Stimulating-Faktor und Granulocytmakrophagen-Colony-Stimulating-Faktor), Interferone (z. B. Interferon-α, -β, -γ, -ω, -δ, -ε und -τ), den Stammzellwachstumsfaktor mit der Bezeichnung „S1-Faktor", Erythropoietin und Thrombopoietin. Die in den erfindungsgemäßen Fusionspolypeptiden enthaltene Zcytor14 sekretorische Signalsequenz wird vorzugsweise aminoterminal an ein weiteres Peptid fusioniert, um weitere Peptide in den sekretorischen Signalweg zu leiten. Fusionsproteine mit einer Zcytor14 sekretorischen Signalsequenz können unter Verwendung von Standardmethoden konstruiert werden.
Eine weitere Form des Fusionsproteins umfasst ein Zcytor14-Polypeptid und eine konstante Region schwerer Immunglobulinketten, typischerweise ein F_c-Fragment, welches zwei oder drei konstante Regionsdomänen und eine Hinge-Region, aber keine variable Region enthält. Chang et al., US-Patentnr. 5.723.125 beschreiben beispielsweise ein Fusionsprotein, das ein humanes Interferon und ein humanes Immunglobulin-Fc-Fragment umfasst. Der C-Terminus des Interferons ist durch eine Peptidlinker-Untereinheit mit dem N-Terminus des Fc-Fragments verknüpft. Ein Beispiel eines Peptidlinkers ist ein Peptid, das hauptsächlich eine gegen T-Zellen inerte Sequenz umfasst, die immunologisch inert ist. Ein beispielhafter Peptidlinker hat die Aminosäurensequenz: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID-NR:7). In diesem Fusionsprotein ist eine humane γ4-Kette, die in Lösung stabil ist und wenig oder keine komplementaktivierende Aktivität aufweist, eine bevorzugte Fc-Untereinheit. Demgemäß zieht die vorliegende Erfindung auch ein Zcytor14-Fusionsprotein in Betracht, das eine Zcytor14-Untereinheit und ein humanes Fc-Fragment umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der C-Terminus der Zcytor14-Untereinheit über einen Peptidlinker, wie z. B. ein Peptid mit der Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:7 mit dem N-Terminus des Fc-Fragments verbunden ist. Die Zcytor14-Untereinheit kann ein Zcytor14-Molekül oder ein Fragment davon sein. Ein Fusionsprotein kann z. B. ein Fragment des Zcytor14 umfassen, das die extrazelluläre Domäne (z. B. ein löslicher Zcytor14-Rezeptor) und ein Fc-Fragment (z. B. ein humanes Fc-Fragment) enthält.
In einer anderen Variation umfasst ein Zcytor14-Fusionsprotein eine IgG-Sequenz, eine kovalent mit dem Aminoterminusende der IgG-Sequenz verbundene Zcytor14-Untereinheit und ein Signalpeptid, das kovalent mit dem Aminoterminus der Zcytor14-Untereinheit verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die IgG-Sequenz die folgenden Elemente in der folgenden Reihenfolge enthält: eine Hinge-Region, eine CH₂-Domäne und eine CH₃-Domäne. Demgemäß fehlt in der IgG-Sequenz eine CH₁-Domäne. Die Zcytor14-Untereinheit zeigt wie hier beschrieben eine Zcytor14-Aktivität an, wie z. B. die Fähigkeit zum Binden an einen Zcytor14-Liganden. Dieser generelle Ansatz für die Produktion von Fusionsproteinen, die sowohl Antikörper- als auch Nicht-Antikörper-Anteile enthalten, wurde von LaRochelle et al., EP 742830 (WO 95/21258) beschrieben.
Fusionsproteine, welche eine Zcytor14-Untereinheit und eine Fc-Untereinheit umfassen, können z. B. als in-vitro-Assay-Tool verwendet werden. Die Gegenwart eines Zcytor14-Liganden in einer biologischen Probe kann z. B. unter Verwendung eines Zcytor14-Immunglobulinfusionsproteins erkannt werden, in dem die Zcytor14-Untereinheit zum Binden des Liganden und ein Makromolekül, wie z. B. ein Protein-A- oder Anti-Fc-Antikörper, zum Binden des Fusionsproteins an einen festen Träger verwendet wird. Solche Systeme können zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten eingesetzt werden, die eine Bindung des Zcytor14-Liganden an seinen Rezeptor hindern.
Weitere Beispiele von Antikörperfusionsproteinen sind u. a. Polypeptide mit einer Antigen-bindenden Domäne und einem Zcytor14-Fragment, das eine Zcytor14 extrazelluläre Domäne enthält. Solche Moleküle können für das Targeting bestimmter Gewebe für die Zcytor14-bindende Aktivität verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren eine Vielfalt anderer Polypeptidfusionen. So kann (können) z. B. eine biologische Funktion übertragende Domäne(n) ganz oder teilweise zwischen dem erfindungsgemäßen Zcytor14 gegen die funktionell gleichwertige(n) Domäne(n) eines anderen Mitglieds der Zytokinrezeptorfamilie ausgetauscht werden. Polypeptidfusionen können in rekombinante Wirtszellen exprimiert werden, um eine Vielfalt von Zcytor14-Fusionsanalogen zu produzieren. Ein Zcytor14-Polypeptid kann an zwei oder mehrere Untereinheiten oder Domänen, wie z. B. ein Affinitäts-Tag zur Aufreinigung und eine Targeting-Domäne, fusioniert werden. Polypeptidfusionen können auch eine oder mehrere Spaltstellen, insbesondere zwischen Domänen, umfassen. Siehe z. B. Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996).
Fusionsproteine können durch die den fachkundigen Personen bekannten Methoden präpariert werden, indem jede Komponente des Fusionsproteins präpariert und diese dann chemisch konjugiert werden. Alternativ kann ein Polynukleotid, das beide Komponenten des Fusionsproteins im richtigen Lese-Frame kodiert, unter Verwendung bekannter Methoden generiert und anhand der hier beschriebenen Methoden exprimiert werden. Generelle Methoden für enzymatische und chemische Spaltung der Fusionsproteine sind z. B. von Ausubel (1995) S. 16-19 bis 16-25 beschrieben.
Zcytor14-Polypeptide können zum Identifizieren und Isolierungen der Zcytor14-Liganden verwendet werden. Die Zcytor14 extrazelluläre Domäne (z. B. Aminosäurereste 1 bis 452, oder 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2) und andere Formen eines löslichen Zcytor14-Rezeptors sind für diese Methoden besonders nützlich. Die erfindungsgemäßen Proteine und Peptide können z. B. auf einer Säule immobilisiert und zum Binden der Liganden aus einer biologischen Probe verwendet werden, die die Säule gefahren wird (Hermanson et al. (eds.), Immobilized Affnity Ligand Techniques, S. 195-202 (Academic Press 1992)).
Die Aktivität eines Zcytor14-Polypeptids kann durch ein auf Silizium basierendes Biosensormikrophysiometer beobachtet werden, welches die extrazelluläre Azidifizierungsrate oder Protonexkretion in Verbindung mit der Rezeptorbindung und die anschließenden physiologischen zellulären Reaktionen misst. Ein exemplarisches Gerät ist das CYTOSENSOR Microphysiometer, das von Molecular Devices, Sunnyvale, CA, hergestellt wird. Eine Vielzahl von zellulären Reaktionen, wie Zellproliferation, Ionentransport, Energieproduktion, inflammatorische Reaktion, regulatorische und Rezeptoraktivierung u. ä. können durch diese Methode gemessen werden (siehe z. B. McConnell et al., Science 257:1906 (1992), Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84 (1997), Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212:49 (1998), Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87 (1998)). Das Mikrophysiometer kann für die Analyse eukaryotischer, prokaryotischer, adhärenter oder nicht-adhärenter Zellen verwendet werden. Durch die Messung extrazellulärer Azidifizierungsveränderungen über einen Zeitraum im Zellmedium misst das Mikrophysiometer direkt die zellulären Reaktionen auf verschiedene Stimuli, einschließlich Agonisten, Liganden oder Antagonisten von Zcytor14.
Das Mikrophysiometer kann für die Messung der Reaktionen einer Zcytor14-exprimierenden eukaryotischen Zelle im Vergleich zu einem Kontrolleukaryont, der das Zcytor14-Polypeptid nicht exprimiert, verwendet werden. Geeignete Zellen, die auf Zcytor14-modulierende Stimuli ansprechen sind u. a. rekombinante Wirtszellen, die einen Zcytor14-Expressionsvektor enthalten, und Zellen, die Zcytor14 auf natürliche Weise exprimieren. Die extrazelluläre Azidifizierung bietet einen Maßstab für eine Zcytor14-modulierte zelluläre Reaktion. Des Weiteren kann dieser Ansatz für die Identifizierung von Liganden, Agonisten und Antagonisten des Zcytor14-Liganden verwendet werden. Ein Molekül kann z. B. als ein Agonist des Zcytor14-Liganden identifiziert werden durch die Bereitstellung von Zellen, die ein Zcytor14-Polypeptid exprimieren, Kultivierung eines ersten Anteils der Zellen in Abwesenheit einer Testverbindung, Kultivierung eines zweiten Anteils der Zellen in Gegenwart einer Testverbindung und Bestimmung, ob der zweite Anteil im Vergleich zum ersten Anteil eine zelluläre Reaktion zeigt.
Alternativ kann ein Festphasensystem verwendet werden, um einen Zcytor14-Liganden oder Agonisten oder Antagonisten eines Zcytor14-Liganden zu identifizieren. Ein Zcytor14-Polypeptid- oder Zcytor14-Fusionsprotein kann z. B. auf die Oberfläche eines Rezeptorchips eines im Handel erhältlichen Biosensorinstruments (BIACORE, Biacore AB; Uppsala, Schweden) immobilisiert werden. Die Verwendung dieses Instruments wurde von Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229 (1991) und Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554 (1993) offen gelegt.
Kurz gefasst wird ein Zcytor14-Polypeptid oder Fusionsprotein unter Verwendung der Amin- oder Sulfhydrilchemie kovalent an Dextranfasern befestigt, die innerhalb einer Flusszelle an Goldfilm haften. Durch die Zelle wird dann eine Testprobe geführt. Wenn in der Probe ein Ligand vorhanden ist, bindet dieser an das immobilisierte Polypeptid oder Fusionsprotein und verursacht dadurch eine Veränderung des Refraktionsindex des Mediums, was als eine Veränderung der Oberflächen-Plasmonresonanz des Goldfilms registriert wird. Dieses System ermöglicht die Bestimmung von Ein- und Aus-Raten, aus denen die Bindungsaffinität berechnet und die Stoichiometrie der Bindung beurteilt werden kann. Dieses System kann auch für die Untersuchung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen und Wechselwirkungen anderer Komplement-/Antikomplement-Paare verwendet werden.
Die Zcytor14-bindende Domäne kann des Weiteren durch eine physische Analyse der Struktur unter Verwendung von Methoden wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie, Elektronendiffraktion oder Fotoaffinitätsmarkierung in Verbindung mit der Mutation von putativen Kontaktstellen-Aminosäuren der Zcytor14-Ligandagonisten bestimmt werden. Siehe z. B. de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992) und Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992).
Die vorliegende Erfindung zieht auch chemisch modifizierte Zcytor14-Zusammensetzungen in Betracht, in denen ein Zcytor14-Polypeptid mit einem Polymer verknüpft ist. Beispielhafte Zcytor14-Polypeptide sind lösliche Polypeptide, in denen eine funktionelle transmembrane Domäne fehlt. Das Polymer ist normalerweise wasserlöslich, so dass das Zcytor14-Konjugat nicht in einem wässrigen Umfeld ausgefällt wird, wie z. B. in einem physiologischen Umfeld. Ein geeignetes Polymer ist z. B. ein modifiziertes Polymer, das nur eine reaktive Gruppe enthält, wie z. B. einen aktiven Ester für die Azylierung oder ein Aldehyd für die Alkylierung. Auf diese Weise kann der Grad der Polymerisierung kontrolliert werden. Ein Beispiel eines reaktiven Aldehyds ist Polyethylenglycolpropionaldehyd oder Mono-(C1-C10)-Alkoxy oder Aryloxyderivative (siehe z. B. Harris, et al., US-Patentnr. 5.252.714). Das Polymer kann vernetzt oder unvernetzt sein. Des Weiteren kann eine Mischung aus Polymeren für die Produktion der Zcytor14-Konjugate verwendet werden.
Für Therapiezwecke verwendete Zcytor14-Konjugate können pharmazeutisch akzeptable wasserlösliche Polymeruntereinheiten enthalten. Geeignete wasserlösliche Polymere sind u. a. Polyethylenglycol (PEG), Monomethoxy-PEG, Mono-(C1-C10)-Alkoxy-PEG, Aryloxy-PEG, Poly-(N-Vinylpyrrolidon)-PEG, Tresylmonomethoxy-PEG, PEG-Propionaldehyd, bis-Succinimidylcarbonat-PEG, Propylenglycolhomopolymere, ein Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymer, polyoxyethylierte Polyole (z. B. Glycerol), Polyvinylalkohol, Dextran, Cellulose oder andere kohlehydratbasische Polymere. Geeignete PEG können ein Molekulargewicht von etwa 600 bis etwa 60.000, einschließlich z. B. 5.000, 12.000, 20.000 und 25.000 haben. Ein Zcytor14-Konjugat kann auch eine Mischung solcher wasserlöslicher Polymere umfassen.
Ein Beispiel eines Zcytor14-Konjugats umfasst eine Zcytor14-Untereinheit und eine Polyalkyloxiduntereinheit, die am N-Terminus der Zcytor14-Untereinheit haftet. PEG ist ein geeignetes Polyalkyloxid. Zcytor14 kann beispielsweise mit PEG, dem so genannten Pegylierungsprozess, modifiziert werden. Für die Pegylierung von Zcytor14 kann jede der aus dem Stand der Technik bekannten Pegylierungsreaktionen verwendet werden (siehe z. B. EP 0 154 316 , Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) und Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)). Die Pegylierung kann z. B. durch eine Azylierungsreaktion oder durch eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglycolmolekül durchgeführt werden. In einem alternativen Ansatz werden die Zcytor14-Konjugate durch Kondensation eines aktivierten PEG gebildet, wobei eine terminale Hydroxy- oder Aminogruppe des PEG gegen einen aktivierten Linker ausgetauscht wurde (siehe z. B. Karasiewicz et al., US-Patentnr. 5.382.657).
Die Pegylierung durch Azylierung erfordert normalerweise die Reaktion eines aktiven Esterderivats des PEG mit einem Zcytor14-Polypeptid. Ein Beispiel eines aktivierten PEG-Esters ist ein zu N-Hydroxysuccinimid esterifiziertes PEG. Im Sinne dieser Schrift umfasst der Begriff „Azylierung" die folgenden Arten von Verknüpfungen zwischen Zcytor14 und einem wasserlöslichen Polymer: Amid, Carbamat, Urethan u. ä. Methoden für die Präparation von Pegyliertem Zcytor14 durch Azylierung umfassen normalerweise die folgenden Schritte: (a) Reaktion eines Zcytor14-Polypeptid mit PEG (wie z. B. einem reaktiven Ester eines Aldehydderivats des PEG) unter Bedingungen, bei denen eine oder mehrere PEG-Gruppen an Zcytor14 haften, und (b) Gewinnung des/der Reaktionsprodukte/s. Die optimalen Reaktionsbedingungen für Azylierungsreaktionen werden generell basierend auf bekannten Parametern und den gewünschten Ergebnissen bestimmt. Je größer das PEG-zu-Zcytor14-Verhältnis, desto höher ist der prozentuale Anteil des polypegylierten Zcytor14-Produktes.
Das Produkt der Pegylierung durch Azylierung ist normalerweise ein polypegyliertes Zcytor14-Produkt, dadurch gekennzeichnet, dass die Lysin-ε-Aminogruppen über eine azylverknüpfende Gruppe pegyliert werden. Ein Beispiel einer verbindenden Verknüpfung ist ein Amid. Das resultiertende Zcytor14 ist normalerweise mindests 95 % mono-, di-, oder tri-pegyliert, obwohl je nach den vorliegenden Reaktionsbedingungen einige Spezien mit höheren Pegylierungsgraden gebildet werden können. Pegylierte Spezies können unter Verwendung standardmäßiger Aufreinigungsmethoden, wie z. B. Dyalise, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie u. ä., von nichtkonjugierten Zcytor14-Polypeptiden getrennt werden.
Die Pegylierung durch Alkylierung umfasst generell die Reaktion eines terminalen Aldehydderivats des PEG mit Zcytor14 in Gegenwart eines Reduktors. PEG-Gruppen werden vorzugsweise über eine -CH₂-NH-gruppe am Polypeptid befestigt.
Die Derivatisierung durch reduktive Alkylierung zur Erzeugung eines monopegylierten Produktes nutzt die differenzielle Reaktivität von verschiedenen Typen primärer Aminogruppen, die für die Derivatisierung zur Verfügung stehen. Die Reaktion wird normalerweise bei einem pH-Wert durchgeführt, der die Nutzung der pKa-Differenzen zwischen den ε-Aminogruppen der Lysinreste und der α-Aminogruppe des N-Terminusrestes des Proteins zulässt. Durch diese selektive Derivatisierung kann die Befestigung eines wasserlöslichen Polymers, das eine reaktive Gruppe wie Aldehyd enthält, an ein Protein kontrolliert werden. Die Konjugation mit dem Polymer erfolgt prädaminant am N-Terminus des Proteins und ohne wesentliche Modifizierung anderer reaktiver Gruppen, wie Aminogruppen der lysinseitigen Kette. Die vorliegende Erfindung liefert eine im Wesentlichen homogene Präparation der Zcytor14-Monopolymerkonjugate.
Die reduktive Alkylierung zur Erzeugung einer im Wesentlichen homogenen Population des monopolymeren Zcytor14-Konjugatmoleküls kann die folgenden Schritte umfassen: (a) Reaktion eines Zcytor14-Polypeptids mit einem reaktiven PEG unter reduktiven Alkylierungsbedingungen bei einem pH-Wert, der die selektive Modifizierung der α-Aminogruppe am Aminoterminus von Zcytor14 erlaubt, und (b) Gewinnung der/des Reaktionsprodukte/s. Der für die reduktive Alkylierung verwendete Reduktor sollte in wässriger Lösung stabil und vorzugsweise fähig sein, nur die im Anfangsprozess der reduktiven Alkylierung gebildete Schiffbase zu reduzieren. Bevorzugte Reduktoren sind u. a. Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran und Pyridinboran.
Für eine im Wesentlichen homogene Population der monopolymeren Zcytor14-Konjugate sind reduktive Alkylierungsreaktionsbedingungen notwendig, die eine selektive Befestigung der wasserlöslichen Polymeruntereinheit an den N-Terminus des Zcytor14 zulassen. Solche Reaktionsbedingungen umfassen generell pKa-Differenzen zwischen den Lysinaminogruppen und der α-Aminogruppe am N-Terminus. Der pH-Wert wirkt sich ebenfalls auf das zu verwendende Polymer-zu-Protein-Verhältnis aus. Bei einem niedrigeren pH-Wert wird generell eine größere Menge Polymer gegenüber dem Protein gewünscht, da bei einer weniger reaktiven N-Terminus-α-Gruppe mehr Polymer benötigt wird, um optimale Bedingungen zu erreichen. Ist der pH-Wert höher muss das Polymer-zu-Zcytor14-Verhältnis kleiner sein, da mehr reaktive Gruppen verfügbar sind. Der pH-Wert fällt normalerweise in den Bereich 3-9 oder 3-6.
Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist das Molekulargewicht des wasserlöslichen Polymers. Je höher das Molekulargewicht des Polymers, desto geringer ist die Anzahl der am Protein haftenden Polymermoleküle. Für Pegylierungsreaktionen ist das typische Molekulargewicht etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa, etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa oder etwa 12 kDa bis etwa 25 kDa. Das molare Verhältnis zwischen wasserlöslichem Polymer und Zcytor14 liegt generell im Bereich 1:1 bis 100:1. Das molare Verhältnis zwischen wasserlöslichen Polymers und Zcytor14 ist normalerweise 1:1 bis 20:1 für die Polypegylierung und 1:1 bis 5:1 für die Monopegylierung.
Allgemeine Methoden für die Produktion von Konjugaten, die ein Polypeptid und wasserlösliche Polymeruntereinheiten umfassen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Karasiewicz et al., US-Patentnr. 5.382.657, Greenwald et al., US-Patentnr. 5.738.846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).
Die vorliegende Erfindung zieht auch Zusammensetzungen in Betracht, die eines der hier beschriebenen Peptide oder Polypeptide enthalten. Solche Zusammensetzungen können des Weiteren einen Träger umfassen. Als Träger kann ein konventionelles organisches oder anorganisches Trägermaterial verwendet werden. Beispiele für Trägermaterial sind Wasser, Pufferlösung, Alkohol, Propylenglycol, Macrogol, Sesamöl, Maisöl u. ä.
8. Isolierung von Zcytor14-Polypeptiden
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auf eine Reinheit von mindestens ca. 80 %, mindestens ca. 90 %, mindestens ca. 95 % oder sogar auf eine Reinheit von mehr als 95 % in Bezug auf kontaminierende Makromoleküle, insbesondere andere Proteine und Nukleinsäuren, sowie völlige Freiheit von infektiösen und pyrogenen Stoffen aufgereinigt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch auf einen pharmazeutisch reinen Zustand von mehr als 99,9 % aufgereinigt werden. In bestimmten Präparationen ist ein aufgereinigtes Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere von anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs.
Fraktionierung und/oder konventionelle Aufreinigungsmethoden können verwendet werden, um Zcytor14-Präparationen, die frei von natürlichen Quellen sind (z. B. Prostata- oder Schilddrüsengewebe), synthetische Zcytor14-Polypeptide und rekombinante Zcytor14-Polypeptide und Fusions-Zcytor14-Polypeptide, die von rekombinanten Wirtszellen gereinigt sind, zu erhalten. Generell kann eine Ammoniumsulfat-Ausfällung und Säure- oder chaotrope Extraktion für die Fraktionierung der Proben verwendet werden. Beispielhafte Aufreinigungsschritte umfassen u. a. Hydroxyapatit, Größenausschluss, FPLC- und Reverse-Phase-High-Performance-Flüssigchromatographie. Geeignete Chromatographiemedien sind u. a. derivatisiertes Dextrans, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, Spezialsiliziumdioxid u. ä. PEI-, DEAE-, QAE- und Q-Derivate werden bevorzugt. Beispielhafte Chromatographiemedien sind u. a. mit Phenyl-, Butyl- oder Octylgruppen derivatisierte Medien, wie z. B. Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) u. ä.; oder Polyacrylharze, wie z. B. Amberchrom CG 71 (Toso Haas) u. ä. Geeignete feste Träger sind u. a. Glasperlen, siliziumdioxidbasische Harze, Celluloseharze, Agaroseperlen, vernetzte Agaroseperlen, Polystyrolperlen, vernetzte Polyacrylamidharze u. ä., die unter den vorgesehenen Einsatzbedingungen nicht löslich sind. Diese Träger können mit reaktiven Gruppen modifiziert werden, die eine Anhaftung der Proteine durch Aminogruppen, Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen, Hydroxylgruppen und/oder Kohlenhydratuntereinheiten erlauben.
Beispiele für diese koppelnde Chemie sind u. a. Cyanogenbromid-Aktivierung, N-hydroxysuccinimid-Aktivierung, Epoxid-Aktivierung, Sulfhydryl-Aktivierung, Hydrazid-Aktivierung und Carboxyl- und Aminoderivate für Carbodiimidkopplungschemie. Diese und andere feste Medien sind aus dem Stand der Technik bekannt und weit verbreitet im Einsatz und im Fachhandel erhältlich. Die Wahl einer bestimmten Methode für die Polypeptidisolierung und -aufreinigung ist eine Sache des routinemäßigen Designs und wird zum Teil durch die Eigenschaften des gewählten Trägers bestimmt. Siehe z. B. Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) und Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).
Weitere Variationen in der Zcytor14-Isolierung und Aufreinigung können von fachkundigen Personen erstellt werden. Ein Anti-Zcytor14-Antikörper, der wie unten beschrieben gewonnen wird, kann z. B. für die Isolierung großer Mengen Protein durch Immunaffinitätsaufreinigung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können ebenfalls durch Ausnutzung bestimmter Eigenschaften isoliert werden. Immobilisierte Metallionenadsorptions-(IMAC)-Chromatographie kann beispielsweise für die Aufreinigung histidinreicher Proteine, einschließlich der Proteine mit Polystidin-Tags, verwendet werden. Kurz gefasst, es wird ein Gel mit divalenten Metallionen aufgeladen, um ein Chelat zu bilden (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Histidinreiche Proteine werden auf dieser Matrix mit je nach dem verwendeten Metallion unterschiedlichen Affinitäten adsorbiert und durch kompetitive Elution, Senkung des pH-Wertes oder Verwendung starker chelatbildender Stoffe eluiert. Andere Methoden der Aufreinigung umfassen Aufreinigung der glycosylierten Proteine durch Lectinaffinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). Innerhalb von weiteren Ausführungsbeispielen der Erfindung können eine Fusion des Polypeptids von Interesse und ein Affinitäts-Tag (z. B. maltosebindendes Protein, eine Immunglobulindomäne) konstruiert werden, um die Aufreinigung zu ermöglichen.
Zcytor14-Polypeptide oder Fragmente davon können auch durch chemische Synthese, wie oben beschrieben, präpariert werden. Zcytor14-Polypeptide können Monomere oder Multimere sein; glycosyliert oder nicht-glycosyliert; pegyliert oder nicht-pegyliert; und können einen ersten Methioninaminosäurerest enthalten oder nicht enthalten.
9. Produktion von Antikörpern gegen Zcytor14-Proteine
Antikörper gegen Zcytor14 können z. B. unter Verwendung des Produktes eines Zcytor14-Expressionsvektors oder Zcytor14-Isolierung aus einer natürlichen Quelle als ein Antigen gewonnen werden. Besonders nützliche Anti-Zcytor14-Antikörper „binden spezifisch" an Zcytor14. Antikörper werden als spezifisch bindend angesehen, wenn der Antikörper mindestens eine der zwei folgenden Eigenschaften aufweist: (1) der Antikörper bindet an Zcytor14 mit einem Grenzwert der Bindungsaktivität, und (2) der Antikörper weist keine signifikante Kreuzreaktion mit den mit Zcytor14 verwandten Polypeptiden auf.
In Bezug auf die erste Eigenschaft sind Antikörper spezifisch bindend, wenn sie mit einer Bindungsaffinität (K_a) von 10⁶ M^–1 oder höher, vorzugsweise 10⁷ M^–1 oder höher, noch besser 10⁸ M^–1 oder höher und am besten 10⁹ M^–1 oder höher an ein Zcytor14-Polypeptid, -Peptid oder -Epitop binden. Die Bindungsaffinität eines Antikörpers lässt sich von der fachkundigen Person leicht bestimmen, z. B. durch eine Scatchard-Analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)). In Bezug auf die zweite Eigenschaft weisen Antikörper keine signifikante Kreuzreaktion mit verwandten Polypeptidmolekülen auf, wenn sie z. B. unter Verwendung einer standardmäßigen Western-Blot-Analyse Zcytor14 erkennen, aber keine der derzeit bekannten Polypeptide. Beispiele von bekannten verwandten Polypeptiden sind u. a. Zytokinrezeptoren.
Anti-Zcytor14-Antikörper können unter Verwendung von antigenen epitoptragenden Zcytor14-Peptiden und -Polypeptiden produziert werden. Erfindungsgemäße antigene epitoptragende Peptide und Polypeptide enthalten eine Sequenz von mindestens neun oder zwischen 15 und etwa 30 Aminosäuren aus der SEQ ID-NR:2 oder einer anderen hier offen gelegten Aminosäurensequenz. Jedoch Peptide oder Polypeptide, die einen größeren Anteil einer erfindungsgemäßen Aminosäurensequenz umfassen, von 30 bis 50 Aminosäuren oder jede beliebige Länge bis zur gesamten inklusiven Aminosäurensequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids sind ebenfalls nützlich für die Induktion von Antikörpern, die an Zcytor14 binden. Es ist wünschenswert, dass die Aminosäurensequenz des epitoptragenden Peptids so ausgewählt wird, dass eine substanzielle Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln ermöglicht wird (d. h. die Sequenz umfasst relativ hydrophile Reste, während hydrophobe Reste vorzugsweise vermieden werden). Des Weiteren können auch Aminosäurensequenzen, die Prolinreste enthalten, für die Antikörperproduktion wünschenswert sein.
Zur Darstellung wird die Identifizierung potenzieller antigener Stellen im Zcytor14 unter Verwendung der Jameson-Wolf-Methode angeführt (Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988)), die durch das PROTEAN-Programm (Version 3.14) von LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI) implementiert wurde. Bei dieser Analyse wurden Standardparameter verwendet.
Die Jameson-Wolf-Methode wird zur Vorhersage potenzieller antigener Bestimmungsfaktoren verwendet, wozu sechs Hauptsubroutinen für die Vorhersage der Proteinstruktur kombiniert werden. Kurz gefasst: Die Hopp-Woods-Methode, Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981) wurde anfangs verwendet, um Aminosäurensequenzen zu identifizieren, die Bereiche der größten lokalen Hydrophilizität darstellen (Parameter: sieben Reste gemittelt). Im zweiten Schritt wurde die Emini-Methode, Emini et al., J. Virology 55:836 (1985), verwendet, um die Oberflächenwahrscheinlichkeiten zu berechnen (Parameter: Oberflächenentscheidungsgrenze (0,6) = 1). Als Drittes wurde die Karplus-Schultz- Methode, Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985), verwendet, um die Rückgradketten-Flexibilität vorherzusagen (Parameter: Flexibilitätsgrenze (0,2) = 1). Im vierten und fünften Schritt der Analyse wurden sekundäre Strukturvorhersagen auf die Daten angewandt unter Einsatz der Methoden von Chou-Fasman, Chou, „Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), S. 549-586 (Plenum Press 1990) und Garnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (Chou-Fasman Parameter: Anordnungstabelle = 64 Proteine; α-Regionsgrenze = 103; β-Regionsgrenze = 105; Garnier-Robson Parameter: α und β Entscheidungskonstanten = 0). In der sechsten Subroutine wurden Flexibilitätsparameter und Hydropathie/Solvens-Accessibility-Faktoren kombiniert, um einen Oberflächenkonturwert zu bestimmen, der als „Antigener Index" bezeichnet wird. Schließlich wurde eine Spitzenverbreiterungsfunktion auf den antigenen Index angewandt, wodurch die Hauptoberflächenspitzen durch Hinzufügung von 20, 40, 60 oder 80 % des jeweiligen Spitzenwertes verbreitert wurden, um der zusätzlichen freien Energie, die aus der Mobilität der Oberflächenregionen relative zu den internen Regionen abgeleitet wird, Rechnung zu tragen. Diese Kalkulation wurde jedoch nicht auf Hauptspitzen angewandt, die in einer Helixregion sitzen, da Helixregionen zu einer geringeren Flexibilität neigen.
Die Ergebnisse dieser Analyse weisen darauf hin, dass die folgenden Aminosäurensequenzen der SEQ ID-NR:2 geeignete antigene Peptide liefern würden: Aminosäuren 26 bis 33 („antigenes Peptid 1"), Aminosäuren 41 bis 46 („antigenes Peptid 2"), 74 bis 81 („antigenes Peptid 3"), Aminosäuren 95 bis 105 („antigenes Peptid 4"), Aminosäuren 109 bis 119 („antigenes Peptid 5"), Aminosäuren 95 bis 119 („antigenes Peptid 6"), Aminosäuren 178 bis 185 („antigenes Peptid 7"), Aminosäuren 200 bis 206 („antigenes Peptid 8"), Aminosäuren 231 bis 238 („antigenes Peptid 9"), Aminosäuren 231 bis 241 („antigenes Peptid 10"), Aminosäuren 264 bis 270 („antigenes Peptid 11"), Aminosäuren 274 bis 281 („antigenes Peptid 12"), Aminosäuren 317 bis 324 („antigenes Peptid 13"), Aminosäuren 357 bis 363 („antigenes Peptid 14"), Aminosäuren 384 bis 392 („antigenes Peptid 15"), Aminosäuren 398 bis 411 („antigenes Peptid 16"), Aminosäuren 405 bis 411 („antigenes Peptid 17"), Aminosäuren 423 bis 429 („antigenes Peptid 18"), und Aminosäuren 434 bis 439 („antigenes Peptid 19"). Die vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung eines der antigenen Peptide 1 bis 19 für die Generierung von Antikörper gegen Zcytor14 in Betracht. Die vorliegende Erfindung zieht des Weiteren Polypeptide in Betracht, die mindestens eines der antigenen Peptide 1 bis 19 enthalten.
Polyklonale Antikörper gegen das rekombinante Zcytor14-Protein oder gegen aus natürlichen Quellen isoliertes Zcytor14 kann unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden präpariert werden. Siehe z. B. Green et al., „Production of Polyclonal Antisera", in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), S. 1-5 (Humana Press 1992) und Williams et al., „Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal Antikörper" in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. Ausgabe, Glover et al. (eds.), S. 15 (Oxford University Press 1995). Die Immunogenität eines Zcytor14-Polypeptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Alum (Aluminiumhydroxid) oder ein komplettes oder nicht-komplettes Freund-Adjuvans erhöht werden. Für die Impfung nützliche Polypeptide sind u. a. auch Fusionspolypeptide, wie z. B. Fusionen von Zcytor14 oder einem Teil davon mit einem Immunglobulinpolypeptid oder mit einem maltosebindenden Protein. Das Polypeptid-Immunogen kann ein Gesamtmolekül oder ein Teil davon sein. Wenn der Polypeptidteil „Hapten-ähnlich" ist, kann dieser Teil vorteilhaft für die Impfung mit einem makromolekulären Träger (z. B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Bovine Serum Albumin (BSA) oder Tetanustoxoid) verbunden oder verknüpft werden.
Obwohl polyklonale Antikörper normalerweise in Tieren gezüchtet werden, wie z. B. in Pferden, Rindern, Hunden, Hühnern, Ratten, Mäusen, Kaninchen, Meerschweinchen, Ziegen oder Schafen, kann ein erfindungsgemäßer Anti-Zcytor14-Antikörper auch aus einem subhumanen Primaten-Antikörper gewonnen werden. Generelle Methoden für die Züchtung diagnostisch und therapeutisch nützlicher Antikörper in Pavianen sind z. B. in Goldenberg et al., Internationale Patentpublikation Nr. WO 91/11465 und in Losman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990) beschrieben.
Alternativ kann ein monoklonaler Anti-Zcytor14-Antikörper generiert werden. Monoklonale Nagetierantikörper gegen spezifische Antigene können mit den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden gewonnen werden (siehe z. B. Kohler et al., Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, S. 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [„Coligan"), Picksley et al., „Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. Ausgabe, Glover et al. (eds.), S. 93 (Oxford University Press 1995)).
Kurz gefasst: Monoklonale Antikörper können gewonnen werden durch die Injektion von Mäusen mit einer Zusammensetzung, die ein Zcytor14-Genprodukt umfasst, Verifizierung der Gegenwart der Antikörperproduktion durch Entfernen einer Serumprobe, Entfernen der Milz zur Gewinnung der B-Lymphozyten, Fusionierung der B-Lymphozyten mit Myelomzellen für die Erzeugung von Hybridomen, Klonierung der Hybridome, Auswahl positiver Klone, die den Antikörper gegen das Antigen produzieren, Kultivierung der Klone, die den Antikörper gegen das Antigen produzieren, und Isolierung der Antikörper aus den Hybridomkulturen.
Des Weiteren kann ein erfindungsgemäßer Anti-Zcytor14-Antikörper aus einem humanen monoklonalen Antikörper gewonnen werden. Humane monoklonale Antikörper werden aus transgenen Mäusen gewonnen, die gentechnisch verändert wurden, um spezifische humane Antikörper als Reaktion auf einen Antigen-Challenge zu produzieren. Bei dieser Methode werden Elemente des humanen schweren und leichten Kettenlokus in die aus embryonischen Stammzelllinien gewonnenen Mausstränge eingefügt, die gezielte Unterbrechungen der endogenen schweren und leichten Kettenloki enthalten. Die transgenen Mäuse können für humane Antigene spezifischen humanen Antikörper synthetisieren und die Mäuse können für die Produktion von humanen Antikörper-sekretierenden Hybridomen verwendet werden. Methoden für die Gewinnung von humanen Antikörpern aus transgenen Mäusen sind z. B. beschrieben in Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994) und Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994).
Monoklonale Antikörper können unter Einsatz verschiedener etablierter Methoden aus Hybridomkulturen isoliert und aufgereinigt werden. Solche Isolierungsmethoden umfassen Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose, Größenausschluss-Chromatographie und Ionenaustauschchromatographie (siehe z. B. Coligan, S. 2.7.1-2.7.12 und S. 2.9.1-2.9.3; Baines et al., „Purification of Immunoglobulin G (IgG)" in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, S. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
Für bestimmte Verwendungszwecke kann es wünschenswert sein, Anti-Zcytor14-Antikörperfragmente zu präparieren. Solche Antikörperfragmente können z. B. durch proteolytische Hydrolyse des Antikörpers gewonnen werden. Antikörperfragmente können durch Pepsin- oder Papainverdauung des gesamten Antikörper unter Verwendung konventioneller Methoden gewonnen werden. Antikörperfragmente können beispielsweise durch enzymatische Spaltung des Antikörpers mit Pepsin produziert werden, um ein 5S-Fragment mit der Bezeichnung F(ab')₂ zu gewinnen. Dieses Fragment kann unter Verwendung eines Thiolreduzierenden Agens erneut gespalten werden, um monovalente 3.5S-Fab'-Fragmente zu produzieren. Optional kann die Spaltreaktion unter Verwendung einer Blockierungsgruppe für die aus der Spaltung von Disulfidverknüpfungen resultierenden Sulfhydrylgruppen durchgeführt werden. Alternativ erzeugt eine enzymatische Spaltung unter Verwendung von Pepsin direkt zwei monovalente Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment. Diese Methoden sind z. B. beschrieben in Goldenberg, US-Patentnr. 4.331.647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, S. 422 (Academic Press 1967) und Coligan, S. 2.8.1-2.8.10 und 2.10.-2.10.4.
Andere Methoden zum Spalten von Antikörpern, wie z. B. die Trennung der schweren Ketten, um monovalente Leichtkettenfragmente zu bilden, die weitere Spaltung der Fragmente, oder andere enzymatische, chemische oder genetische Methoden können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die Fragmente binden an das Antigen, das von dem intakten Antikörper erkannt wird.
Fv-Fragmente können z. B. ein Assoziation der V_H- und V_L-Ketten umfassen. Diese Assoziation kann nicht-kovalent sein, wie von Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972) beschrieben. Alternativ können die variablen Ketten durch eine intermolekulare Disulfidbindung oder Vernetzung durch Chemikalien wie Glutaraldehyd verknüpft werden (siehe z. B. Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)).
Die Fv-Fragmente können V_H- und V_L-Ketten umfassen, welche durch einen Peptidlinker verbunden sind. Diese einkettigen antigenbindenden Proteine (scFv) werden durch die Konstruktion eines Strukturgens präpariert, das DNA-Sequenzen umfasst, die V_H- und V_L-Domänen kodieren, welche durch ein Oligonukleotid verbunden sind. Das Strukturgen wird in einen Expressionsvektor eingefügt, welcher anschließend in eine Wirtszelle wie z. B. E. coli eingefügt wird. Die rekombinanten Wirtszellen synthetisieren eine einzelne Polypeptidkette, wobei ein Linkerpeptid die zwei V-Domänen überbrückt. Methoden für die Produktion der scFvs sind z. B. beschrieben in Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (siehe auch Bird et al., Science 242:423 (1988), Ladner et al., US-Patentnr. 4.946.778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993) und Sandhu, supra).
So können beispielsweise zur Gewinnung eines scFV Lymphozyten in vitro an das Zcytor14-Polypeptid ausgesetzt und Antikörper-Displaybibliotheken in Phage oder ähnlichen Vektoren ausgewählt werden (z. B. durch die Verwendung eines immobilisierten oder markierten Zcytor14-Proteins oder -Peptids). Polypeptidekodierende Gene, die potenzielle Zcytor14-Polypeptid-bindende Domänen aufweisen, können durch Screening von randomisierten auf Phage angezeigten (Phage-Display) Peptidbibliotheken oder auf Bakterien, wie E. coli, erhalten werden. Polypeptidekodierende Nukleotidsequenzen können auf verschiedene Weisen erhalten werden, z. B. durch randomisierte Mutagenierung und randomisierte Polynukleotidsynthese. Die randomisierten Peptid-Display-Bibliotheken können verwendet werden, um für Peptide zu screenen, welche mit einem bekannten Ziel interagieren, das ein Protein oder Polypeptid sein kann, wie z. B. ein Ligand oder Rezeptor, ein biologisches oder synthetisches Makromolekül oder organische oder anorganische Substanzen. Methoden für die Erzeugung und das Screening solcher randomisierter Peptid-Display-Bibliotheken sind aus dem Stand der Technik bekannt (Ladner et al., US-Patentnr. 5.223.409; Ladner et al., US-Patentnr. 4.946.778; Ladner et al., US-Patentnr. 5.403.484 und Ladner et al., US-Patentnr. 5.571.698 und Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996))) und randomisierte Peptid-Display-Bibliotheken und Kits zum Screening solcher Bibliotheken sind im Handel erhältlich, z. B. von CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), and Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Randomisierte Peptid-Display-Bibliotheken können mittels der hier offen gelegten Zcytor14-Sequenzen gescreent werden, um Proteine zu identifizieren, die an Zcytor14 binden.
Eine weitere Form eines Antikörperfragments ist ein Peptid, das für eine einzelne komplementäritätsbestimmende Region (CDR) kodiert. CDR-Peptide („minimale Erkennungseinheiten") können durch die Konstruktion von Genen gewonnen werden, die CDR eines Antikörpers von Interesse kodieren. Solche Gene werden z. B. präpariert durch die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion für die Synthetisierung der variablen Region der RNA von Antikörper produzierenden Zellen (siehe z. B. Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, „Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), S. 166 (Cambndge University Press 1995) und Ward et al., „Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), S. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Des Weiteren kann ein erfindungsgemäßer Anti-Zcytor14-Antikörper aus einem „humanisierten" monoklonalen Antikörper gewonnen werden. Humanisierte monoklonale Antikörper werden durch die Übertragung muriner komplementäritätsbestimmender Regionen von schweren und leichten variablen Ketten des murinen Immunglobins in eine humane variable Domäne produziert. Typische Reste des humanen Antikörpers werden dann in Framework-Regionen der murinen Gegenstücke substituiert. Durch die Verwendung von aus humanisierten monoklonalen Antikörpern abgeleiteten Antikörperkomponenten werden die mit der Immunogenizität von murinen konstanten Regionen verbundenen potenziellen Probleme vermieden. Generelle Methoden für die Klonierung von murinen Immunglobulin-variablen Domänen sind z. B. beschrieben in Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Methoden für die Produktion von humanisierten monoklonalen Antikörpern sind z. B. beschrieben in Jones et al., Nature 321:522 (1986), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, „Engineering Therapeutic Antibodies" in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), S. 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) und Queen et al., US-Patentnr. 5.693.762 (1997).
Polyklonale antiidiotypische Antikörper können präpariert werden, indem Tiere unter Verwendung standardmäßiger Verfahren mit Anti-Zcytor14-Antikörper oder Antikörperfragmenten geimpft werden. Siehe z. B. Green et al., „Production of Polyclonal Antisera" in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), S. 1-12 (Humana Press 1992). Siehe auch Coligan, S. 2.4.1-2.4.7. Alternativ können monoklonale antiidiotypische Antikörper unter Verwendung von anti-Zcytor14-Antikörper oder Antikörperfragmenten als Immungene mit den oben beschriebenen Methoden präpariert werden. Als weitere Alternative können humanisierte antiidiotypische Antikörper oder subhumane antiidiotypischee Primatenantikörper mit den oben beschriebenen Methoden präpariert werden. Methoden für die Produktion von antiidiotypischen Antikörpern sind z. B. beschrieben in Irie, US-Patentnr. 5.208.146, Greene, et. al., US-Patentnr. 5.637.677 und Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996).
10. Verwendung von Zcytor14-Nukleotidsequenzen zur Erkennung der Genexpression und Genstruktur
Nukleinsäuremoleküle können für die Erkennung der Expression eines Zcytor14-Gens in eine biologische Probe verwendet werden. Bestimmte Probenmoleküle sind u. a. doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1, SEQ ID-NR:4 oder einen Teil davon umfassen, sowie einsträngige Nukleinsäuremoleküle mit dem Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1, SEQ ID-NR:4 oder eines Teils davon. Probenmoleküle können DNA, RNA, Oligonukleotide u. ä. sein. Der hier verwendete Begriff „Teil" oder „Anteil" bezieht sich auf mindestens acht Nukleotide bis zu mindestens 20 oder mehr Nukleotide. Bestimmte Proben binden an Regionen des Zcytor14-Gens, die eine geringe Sequenzähnlichkeit mit den vergleichbaren Regionen in anderen Zytokinrezeptorgenen haben.
In einem Basisassay wird ein einsträngiges Probenmolekül mit RNA inkubiert, welche aus einer biologischen Probe isoliert wurde, wobei die Bedingungen für Temperatur und ionische Stärke so ausgewählt werden, dass die Basenpaarung zwischen den Proben- und Ziel-Zcytor14-RNA-Spezies gefördert wird. Nach der Trennung der ungebundenen Probe aus den hybridisierten Molekülen wird die Hybridenmenge erkannt.
Etablierte Hybridisierungsmethoden der RNA-Erkennung sind u. a. Northern-Analyse und Dot/Slot-Blot-Hybridisierung (siehe z. B. Ausubel (1995), S. 4-1 bis 4-27 und Wu et al. (eds.), „Analysis of Gene Expression at the RNA Level" in Methods in Gene Biotechnology, S. 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). Nukleinsäureproben können mit Radioisotopen wie ³²P oder ³⁵S erkennbar markiert werden. Alternativ kann Zcytor14-RNA durch eine nicht-radioaktive Hybridisierungsmethode erkannt werden (siehe z. B. Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes (Humana Press, Inc. 1993)). Die nichtradioaktive Erkennung wird normalerweise durch eine enzymatische Konvertierung von chromogenen oder chemilumineszenten Substraten erzielt. Beispielhafte nicht-radioaktive Untereinheiten sind u. a. Biotin, Fluoreszein und Digoxigenin.
Zcytor14-Oligonukleotidproben sind auch für die in vivo-Diagnose nützlich. Mit ¹⁸F-Label markierte Oligonukleotide können beispielsweise einem Probanden verabreicht und durch Positronemissionstomographie visualisiert werden (Tavitian et al., Nature Medicine 4:467 (1998)).
Zahlreiche Diagnoseverfahren nutzen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die Ansprechempfindlichkeit der Erkennungsmethoden zu erhöhen. Standardmethodene für die Durchführung der PCR sind aus dem stand der Technik bekannt (siehe generell Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998) und Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).
PCR-Primer können so konzipiert werden, dass der Teil des Zcytor14-Gens amplifiziert wird, der eine geringe Sequenzähnlichkeit mit den vergleichbaren Regionen in anderen Proteinen, wie z. B. anderen Zytokinrezeptorproteinen, hat.
Eine Variation der PCR für diagnostische Assays ist die Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR). Bei der RT-PCR-Methode wird RNA aus einer biologischen Probe isoliert, durch reversierte Transkription in cDNA umgeschrieben und die cDNA wird mit Zcytor14-Primern inkubiert (siehe z. B. Wu et al. (eds.), „Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR" in Methods in Gene Biotechnology, S. 15-28 (CRC Press, Inc. 1997)). Anschließend wird die PCR durchgeführt und die Produkte werden unter Verwendung der Standardmethoden analysiert.
RNA wird beispielsweise unter Verwendung des oben beschriebenen Guanidiniumthiocyanat-Zelllyseverfahren aus der biologischen Probe isoliert. Alternativ kann eine Festphasenmethode verwendet werden, um mRNA aus dem Zelllysat zu isolieren. Das Priming einer reversierte Transkriptionsreaktion kann mit der isolierten RNA erfolgen, wozu zufällige Oligonukleotide, kurze Homopolymere der dT, oder Zcytor14-Antisenseoligomere verwendet werden. Oligo-dT-Primer bieten den Vorteil, dass verschiedene mRNA-Nukleotidsequenzen amplifiziert werden, die Kontrollzielsequenzen liefern können. Zcytor14-Sequenzen werden unter Verwendung von zwei Oligonukleotid-Flankenprimern, die normalerweise 20 Basen lang sind, durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert.
Für die Erkennung der Produkte der PCR-Amplifizierung stehen verschiedene Ansätze zur Verfügung. Die PCR-Produkte können z. B. durch Elektrophorese fraktioniert und durch Ethidiumbromidfärbung visualisiert werden. Alternativ können die fraktionierten PCR-Produkte auf eine Membran transferiert, mit einer erkennbar markierten Zcytor14-Probe hybridisiert und durch Autoradiographie untersucht werden. Weitere alternative Ansätze umfassen die Verwendung von mit Digoxigenin-Label markierten Deoxyribonukleinsäuretriphosphaten zur Bereitstellung der Chemilumineszenzerkennung und der C-TRAK kolorimetrische Assay.
Ein weiterer Ansatz für die Erkennung der Zcytor14-Expression ist die Cycling Probe Technologie (CPT), bei der ein einsträngiges DNA-Ziel an einen Überschuss der chimären DNA-RNA-DNA-Probe bindet, um einen Komplex zu bilden, der RNA-Teil mit RNAase H gespalten und die Gegenwart der gespaltenen chimären Probe erkannt wird (siehe z. B. Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34:2985 (1996), Bekkaoui et al., Biotechniques 20:240 (1996)). Alternative methoden für die Erkennung von Zcytor14-Sequenzen umfassen die Verwendung von Methoden wie auf Nukleinsäuresequenz basierende Amplifizierung, kooperative Amplifizierung der Vorlagen durch Kreuzhybridisierung und die Ligasekettenreaktion (siehe z. B. Marshall et al., US-Patentnr. 5.686.272 (1997), Dyer et al., J. Virol. Methods 60:161 (1996), Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358 (1997) und Chadwick et al., J. Virol. Methods 70:59 (1998)). Fachkundigen Personen sind weitere Standardmethoden bekannt.
Zcytor14-Proben und Primer können auch für die Erkennung und Lokalisierung der Zcytor14-Genexpression in Gewebeproben verwendet werden. Methoden für eine solche in-situ Hybridisierung sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Choo (ed.), In Situ Hybridization Protocols (Humana Press, Inc. 1994), Wu et al. (eds.), „Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)", in Methods in Gene Biotechnology, S. 259-278 (CRC Press, Inc. 1997) und Wu et al. (eds.), „Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)" in Methods in Gene Biotechnology, S. 279-289 (CRC Press, Inc. 1997)). Verschiedene weitere diagnostische Ansätze sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996) und Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc., 1996)). Geeignete Testproben umfassen Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsien und Autopsiematerial.
Das Zcytor14-Gen befindet sich im humanen Chromosom 3p25-3p24. Diese Region steht mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung, u. a. Xeroderma pigmentosum, Marfan-ähnliche Bindegewebeerkrankung, Kardiomyopathie, Diabetes mellitus, Fanconi-Anämie, Nierenzellkarzinom, Marfan-Syndrom, Von-Hippel-Lindau-Syndrom und Blepharophimose. Des Weiteren sind Mutationen der Zytokinrezeptoren mit bestimmten Krankheiten verbunden. Polymorphismen der Zytokinrezeptoren sind z. B. mit pulmonaler Alveolarproteinose, familiärem periodischen Fieber und Erythroleukämie verbunden. Die Zcytor14-Nukleotidsequenzen können somit in auf Verknüpfungen basierenden Tests für verschiedene Krankheiten und für die Bestimmung, ob die Chromosomen eines Probanden eine Mutation im Zcytor14-Gen aufweisen, verwendet werden. Erkennbare chromosomale Aberrationen des Zcytor14-Gen-Lokus umfassen ohne Eingrenzung Aneuploidie, Veränderungen der Genkopieanzahl, Insertionen, Deletionen, Veränderungen und Neuanordnungen der Restriktionsstelle. Von besonderem Interesse sind genetische Veränderungen, die ein Zcytor14-Gen deaktivieren.
Mit dem Zcytor14-Lokus in Verbindung stehende Abenationen können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle erkannt werden, indem molekulare Gentechniken eingesetzt werden, wie z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-(RFLP)-Analyse, Short Tandem Repeat (STR) Analyse unter Einsatz von PCR-Techniken, Amplification-Refractory Mutation System-Analyse, einsträngige Anordnungspolymorphismuserkennung, RNase-Spaltungsmethoden, Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese, Fluoreszenzgestützte Mismatch-Analyse und andere genetische Analysetechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (siehe z. B. Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), und Richards and Ward, „Molecular Diagnostic Testing" in Principles of Molecular Medicine, S. 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)).
Der Protein-Truncation-Test eignet sich ebenfalls für die Erkennung der Deaktivierung eines Gens, wobei translationsterminierende Mutationen nur Teile des kodierten Proteins produzieren (siehe z. B. Stoppa-Lyonnet et al., Blood 91:3920 (1998)). Bei diesem Ansatz wird die RNA aus einer biologischen Probe isoliert und zu cDNA synthetisiert. Durch PCR wird dann die Zcytor14-Zielsequenz amplifiziert und ein RNA-Polymerasepromoter, eine Translationsstartsequenz und ein In-Frame-ATG-Drilling eingefügt. Die PCR-Produkte werden unter Verwendung einer RNA-Polymerase transkribiert und die Transkriptionen werden mit einem T7-gekoppelten Retikulozytenlysatsystem in vitro translatiert. Die Translationsprodukte werden dann durch SDS-PAGE fraktioniert, um die Länger der Translationsprodukte zu bestimmen. Der Protein-Truncation-Test ist z. B. beschrieben in Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, S. 9.11.1-9.11.18 (John Wiley & Sons 1998).
Die vorliegende Erfindung zieht auch Kits für die Durchführung diagnostischer Assays für die Zcytor14-Genexpression oder die Erkennung von Mutationen im Zcytor14-Gen in Betracht. Solche Kits umfassen Nukleinsäureproben wie z. B. doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1, SEQ ID-NR:4 oder einen Teil davon umfassen, sowie einsträngige Nukleinsäuremoleküle mit dem Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1, SEQ ID-NR:4 oder eines Teils davon. Probenmoleküle können DNA, RNA, Oligonukleotide u. ä. sein. Die Kits können auch Nukleinsäureprimer für die Durchführung der PCR umfassen.
Ein solches Kit kann alle notwendigen Elemente für die Durchführung eines der oben beschriebenen diagnostischen Nukleinsäure-Assays umfassen. Ein Kit umfasst mindestens einen Behälter einer Zcytor14-Probe oder Primers. Das Kit kann auch einen zweiten Behälter umfassen, der eines oder mehrere Reagenzien enthält, welche die Gegenwart der Zcytor14-Sequenzen anzeigen können. Beispiele für solche Indikatorreagenzien sind u. a. erkennbare Labels wie radioaktive Labels, Fluorchrome, Chemilumineszenzagenzien u. ä. Ein Kit kann auch Mittel umfassen, die dem Benutzer vermittelen, dass die Zcytor14-Proben und Primer für die Erkennung der Zcytor14-Genexpression verwendet werden. Schriftliche Anweisungen können z. B. aussagen, dass die beiliegenden Nukleinsäuremoleküle für die Erkennung eines Nukleinsäuremoleküls, das Zcytor14 kodiert, oder eines Nukleinsäuremoleküls mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Zcytor14-kodierenden Nukleotidsequenz ist, verwendet werden können. Das schriftliche Material kann entweder direkt auf einem Behälter angebracht oder in Form einer Packungsbeilage bereitgestellt werden.
11. Verwendung von Anti-Zcytor14-Antikörper zur Erkennung von Zcytor14
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung der Zcytor14-Antikörper für das in vitro Screenen biologischer Proben auf die Gegenwart des Zcytor14 in Betracht. In einer Art des in vitro Assays werden Anti-Zcytor14-Antikörper in einer Flüssigphase verwendet. Die Gegenwart von Zcytor14 in einer biologischen Probe kann z. B. durch Mischen der biologischen Probe mit einer Spurenmenge von markiertem Zcytor14 und einem Anti-Zcytor14-Antikörper unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen Zcytor14 und seinen Antikörpern fördert, geprüft werden. Komplexe von Zcytor14 und Anti-Zcytor14 in der Probe können aus der Reaktionsmischung getrennt werden, indem der Komplex mit einem immobilisierten Protein kontaktiert wird, das an den Antikörper bindet, wie z. B. ein Fc-Antikörper oder Staphylococcus Protein A. Die Konzentration von Zcytor14 in der biologischen Probe ist invers proportional zur Menge des markierten an den Antikörper gebundenen Zcytor14 und in direkter Beziehung zur Menge des freien markierten Zcytor14. Geeignete biologische Proben umfassen Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsien und Autopsiematerial.
Alternativ können in vitro Assays durchgeführt werden, bei denen Anti-Zcytor14-Antikörper an einen Festphasenträger gebunden wird. Antikörper können z. B. an ein Polymer wie Aminodextran befestigt werden, um den Antikörper mit einem unlöslichen Träger, wie z. B. eine polymerbeschichtete Perle, eine Platte oder einen Tubus, zu verknüpfen. Andere geeignete in vitro Assays sind fachkundigen Personen bekannt.
In einem weiteren Ansatz können Anti-Zcytor14-Antikörper verwendet werden, um Zcytor14 in Gewebeschnitten zu erkennen, die aus einer Biopsieprobe präpariert wurden. Eine solche immunchemische Erkennung kann verwendet werden, um die relative Reichlichkeit von Zcytor14 und die Verteilung von Zcytor14 in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Allgemeine Immunchemiemethoden sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Ponder, „Cell Marking Techniques and Their Application" in Mammalian Development: A Practical Approach, Monk (ed.), S. 115-38 (IRL Press 198, Coligan S. 5.8.1-5.8.8, Ausubel (1995) S. 14.6.1 bis 14.6.13 (Wiley Interscience 1990) und Manson (ed.), Methods In Molecular Biology, Vol. 10: Immunochemical Protocols (The Humana Press, Inc. 1992)).
Die immunchemische Erkennung kann durchgeführt werden, indem eine biologische Probe mit einem Anti-Zcytor14-Antikörper und anschließend mit einem erkennbar markierten, an den Antikörper bindenden Molekül kontaktiert wird. Ein erkennbar markiertes Molekül kann z. B. eine Antikörperuntereinheit umfassen, die an Anti-Zcytor14-Antikörper bindet. Alternativ kann der Anti-Zcytor14-Antikörper mit Avidin/Streptavidin (oder Biotin) konjugiert werden und das erkennbare mit Label markierte Molekül kann Biotin (oder Avidin/Streptavidin) umfassen. Fachkundigen Personen sind zahlreiche weitere Standardmethoden bekannt.
Alternativ kann ein Anti-Zcytor14-Antikörper mit einem erkennbaren Label konjugiert werden, um ein Anti-Zcytor14-Immunkonjugat zu bilden. Geeignete erkennbare Label sind u. a. ein Radioisotop, ein Fluoreszenz-Label, ein Chemilumineszenz-Label, ein Enzym-Label, ein Biolumineszenz-Label oder kolloidales Gold. Methoden zur Herstellung und Erkennung solcher erkennbar markierter Immunkonjugate sind aus dem Stand der Technik bekannt und unten genauer beschrieben.
Das erkennbare Label kann ein Radioisotop sein, das durch Autoradiographie erkannt wird. Besonders gut geeignete Isotopen für den Zweck der vorliegenden Erfindung sind ³H, ¹²⁵I ¹³¹I, ³⁵S und ¹⁴C.
Anti-Zcytor14-Immunkonjugate können auch mit einer Fluoreszenzverbindung markiert werden. Die Gegenwart eines mit einem Fluoreszenz-Label markierten Antikörpers wird bestimmt, indem das Immunkonjugat an Licht mit der entsprechenden Wellenlänge ausgesetzt und die resultierende Fluoreszenz erkannt wird. Fluoreszenz-Label-Verbindungen umfassen Fluoreszenzeinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerytherin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
Alternativ kann ein Anti-Zcytor14-Immunkonjugat durch Koppelung eines Antikörpers an eine Chemilumineszenzverbindung erkennbar markiert werden. Die Gegenwart des mit dem Chemilumineszenz-Label markierten Immunkonjugate wird durch Erkennung der Gegenwart der im Verlauf der chemischen Reaktion entstehenden Lumineszenz bestimmt. Beispiele für Chemilumineszenz-Label-Verbindungen sind u. a. Luminol, Isoluminol, ein aromatischer Acridiniumester, ein Imidazol, ein Acridiniumsalz und ein Oxalatester.
Auf ähnliche Weise kann eine Bioluminiszenzverbindung für die Markierung der erfindungsgemäßen Anti-Zcytor14-Immunkonjugate verwendet werden. Biolumineszenz ist eine Art der Chemilumineszenz, die in biologischen System auftritt, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemiluminiszenzreaktion erhöht. Die Gegenwart eines Biolumineszenzproteins wird durch die Erkennung der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Für die Markierung geeignete Biolumineszenzverbindungen sind u. a. Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Alternativ können Anti-Zcytor14-Immunkonjugate durch Verknüpfung eines Zcytor14-Antikörpers mit einem Enzym erkennbar markiert werden. Wird das Anti-Zcytor14-Enzymkonjugar in Gegenwart des entsprechenden Substrats inkubiert, reagiert die Enzymuntereinheit mit dem Substrat, um eine chemische Untereinheit zu produzieren, die z. B. durch spektrophotometrische, fluorometrische oder visuelle Mittel erkannt werden kann. Beispiele für Enzyme, die sich für die erkennbare Markierung von polyspezifischen Immunkonjugaten eignen, sind u. a. β-Galactosidase, Glucoseoxidase, Peroxidase und alkaline Phosphatase.
Der fachkundigen Person sind weitere geeignete Labels bekannt, die zum Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Bindung der Markeruntereinheiten an Anti-Zcytor14-Antikörper kann unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Standardmethoden erreicht werden. Typische Methoden in dieser Hinsicht sind beschrieben in Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990), Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990) und Coligan, supra.
Die Praktikalität und Vielseitigkeit der immunchemischen Erkennung kann des Weiteren durch Anti-Zcytor14-Antikörper verbessert werden, die mit Avidin, Streptavidin und Biotin konjugiert wurden (siehe z. B. Wilchek et al. (eds.), „Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990) und Bayer et al., „Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), S. 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992).
Methoden für die Durchführung von Immunoassays sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Cook and Self, „Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), S. 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, „The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox, (eds.), S. 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995) und Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).
Die vorliegende Erfindung zieht auch Kits für die Durchführung eines immunologischen diagnostischen Assays für die Zcytor14-Genexpression in Betracht. Ein solches Kit umfasst mindestens einen Behälter eines Zcytor14-Antikörpers oder Antikörperfragments. Das Kit kann auch einen zweiten Behälter umfassen, der eines oder mehrere Reagenzien enthält, welche die Gegenwart der Zcytor14-Antikörper oder Antikörperfragmente anzeigen können. Beispiele für solche Indikatorreagenzien sind u. a. erkennbare Label wie ein radioaktives Label, ein Fluoreszenz-Label, ein Chemilumineszenz-Label, ein Enzym-Label, ein Biolumineszenz-Label, kolloidales Gold u. ä. Ein Kit kann auch Mittel umfassen, die dem Benutzer vermittelen, dass die Zcytor14-Antikörper oder Antikörperfragmente für die Erkennung des Zcytor14-Proteins verwendet werden. Schriftliche Anweisungen können z. B. darauf hinweisen, dass der beiliegende Antikörper or das beiliegende Antikörperfragment für die Erkennung von Zcytor14 verwendet werden kann. Das schriftliche Material kann entweder direkt auf einem Behälter angebracht oder in Form einer Packungsbeilage bereitgestellt werden.
12. Therapeutische Verwendungen der Polypeptide mit Zcytor14-Aktivität
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Proteinen, Polypeptiden und Peptiden, die Zcytor14-Aktivität aufweisen (z. B. Zcytor14-Polypeptiden (z. B. lösliche Formen von Zcytor14), Zcytor14-Analogen (z. B. antiidiotypische Anti-Zcytor14-Antikörper) und Zcytor14-Fusionsproteinen) an einem Probanden, bei dem ein Mangel an diesem Polypeptid vorliegt. Im Gegensatz dazu können Zcytor14-Antagonisten (z. B. Anti-Zcytor-14-Antikörper) verwendet werden, um einen Probanden mit einem Zcytor14-Überschuss zu behandeln.
Zcytor14 hat beispielsweise eine Aminosäurensequenz, die Ähnlichkeiten mit dem humanen Interleukin-17-Rezeptor aufweist. In Studien wurde nachgewiesen, dass Interleukin-17 eine sehr wichtige Rolle bei der Einleitung und Erhaltung einer inflammatorischen Reaktion spielt (siehe z. B. Jovanovic et al., J. Immunol. 160:3513 (1998)). Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass Interleukin-17 die Produktion von inflammatorischen Mediation durch Synoviozyten aktiviert, und dass Interleukin-17 zum proinflammatorischen Muster, das für rheumatoide Arthritis charakteristisch ist, beiträgt (Chabaud et al., J. Immunol. 161:409 (1998); Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42:963 (1999)). Demgemäß können Polypeptide mit Zcytor14-Aktivität (z. B. Zcytor14-Polypeptide, funktionelle Fragmente von Zcytor14 inklusive ein löslicher Zcytor14-Rezeptor, antiidiotypische Anti-Zcytor14-Antikörper etc.) für die Behandlung von Entzündungen sowie mit Entzündungen verbundenen Krankheiten wie z. B. rheumatoide Arthritis, verwendet werden.
Die Dosis des verabreichten Zcytor14 (oder Zcytor14-Analogs oder Fusionsproteins) hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. dem Alter, Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, Allgemeinzustand und Anamnese des Patienten. Normalerweise ist es wünschenswert, dem Empfänger eine Dosis des Zcytor14- Polypeptids zu verabreichen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge des Wirkstoffes/Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl durch die vorliegenden Umstände bedingt auch niedrigere oder höhere Dosen gegeben werden können.
Die Verabreichung eines Zcytor14-Polypeptids an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathekal, durch Perfusion über einen regionalen Katheter oder durch direkte intraläsional Injektion erfolgen. Bei der Gabe von therapeutischen Proteinen per Injektion kann die Verabreichung durch eine Dauerinfusion oder durch einen Bolus oder mehrere Bolen erfolgen.
Weitere Verabreichungswege sind u. a. oral, Schleimhaut, pulmonal und transkutan. Die orale Gabe eignet sich für Polyestermikrosphären, Zeinmikrosphären, Proteinoidmikrosphären, Polycyanoacrylatmikrosphären und Lipidbasische Systeme (siehe z. B. DiBase and Morrel, „Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanden and Hendren (eds.), S. 255-288 (Plenum Press 1997)). Die Machbarkeit einer intranasalen Gabe ist durch einen solchen Insulinverabreichungsweg exemplifiziert (siehe z. B. Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Trockene oder flüssige Zcytor14-haltige Partikel können präpariert und mithilfe von Trockenpulverdispergierern, Flüssigaerosolgeneratoren oder Zerstäubern inhaliert werden (z. B. Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Dieser Ansatz ist im AERX Diabetes Management System dargestellt, wobei ein handgehaltenes elektronisches Inhalationsgerät, das aerosolisiertes Insulin in die Lungen abgibt, verwendet wird. In Studien wurde nachgewiesen, dass Proteine mit einer Größe bis zu 48.000 kDa mithilfe von niederfrequentem Ultraschall in therapeutischen Konzentrationen über die Haut abgegeben wurden, was die Machbarkeit der transkutanen Gabe zeigt (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). Die transdermale Gabe unter Verwendung von Elektroporation bietet ein weiteres Mittel für die Verabreichung eines Moleküls mit Zcytor14-bindender Aktivität (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
Eine pharmazeutische Verbindung, die ein Protein, Polypeptid oder Peptid mit Zcytor14-bindender Aktivität umfasst, kann gemäß den bekannten Methoden für die Präparation pharmazeutisch geeigneter Verbindungen formuliert werden, wobei die therapeutischen Proteine in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger kombiniert werden. Eine Verbindung hat einen „pharmazeutisch akzeptierbaren Träger", wenn die Verabreichung von einem empfangenden Patienten vertragen werden kann. Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist z. B. ein pharmazeutisch akzeptierbarer Träger. Andere geeignete Träger sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgabe (Mack Publishing Company 1995).
Zum Zweck der Therapie werden Moleküle mit Zcytor14-bindender Aktivität und ein pharmazeutisch akzeptierbarer Träger einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine Kombination aus einem Protein, Polypeptid oder Peptide mit Zcytor14-bindender Aktivität und einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger wird als in einer „therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht angesehen, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Wirkstoff ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart eine erkennbare Veränderung in der Physiologie des empfangenden Patienten bewirkt. Ein Wirkstoff, der für die Behandlung von Entzündungen verwendet wird, ist z. B. physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart die inflammatorische Reaktion lindert.
Eine pharmazeutische Verbindung, die Zcytor14 (oder einen Zcytor14-Analog oder ein Fusionsprotein) umfasst, kann in flüssiger Form, in einem Aerosol oder in fester Form bereitgestellt werden. Füllige Formen sind beispielweise injizierbare Lösungen und orale Suspensionen. Beispiele für feste Formen sind Kapseln, Tabletten und kontrollierte Freisetzungsformen (Controlled-Release). Beispiele für die letztere Form sind miniosmotische Pumpen und Implantate (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, „Implants in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), S. 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., „Protein Delivery with Infusion Pumps", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), S. 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., „Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), S. 93-117 (Plenum Press 1997)).
Liposome bieten ein Mittel für die intravenöse, intraperitoneale, intrathekale, intramuskuläre, subkutane Verabreichung oder orale Gabe, Inhalation oder intranasale Gabe von therapeutischen Polypeptiden an einen Patienten. Liposome sind mikroskopische Vesikel mit einer oder mehreren Lipid-Bilayer-Membranen, die wässrige Kompartemente umgeben (siehe generell Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) und Ranade, „Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), S. 3-24 (CRC Press 1995)). Die Zusammensetzung der Liposome ist der von zellulären Membranen ähnlich und folglich können Liposome sicher und biologisch abbaubar verabreicht werden. Je nach der verwendeten Präparationsmethode können Liposome unilamellar oder multilamellar sein und können verschiedene Durchmesser von 0,02 μm bis über 10 μm aufweisen. In Liposome können viele verschiedene Agenzien eingekapselt werden: hydrophobe Agenzienpartition in den Bilayers und hydrophile Agenzienpartition innerhalb des/der wässrigen Innenraums/Innenräume (siehe z. B. Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) und Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Des Weiteren ist es möglich, die therapeutische Verfügbarkeit des eingekapselten Wirkstoffes durch variierende Limpsomgröße, Anzahl von Bilayers, Lipidzusammensetzung sowie Ladungs- und Oberflächencharakteristik der Liposome zu kontrollieren.
Liposome adsorbieren praktisch auf jeden Zelltyp und setzen den eingekapselten Wirkstoff langsam frei. Alternativ kann absorbiertes Liposom von den Zellen, die phagozytisch sind, endozytosiert werden. Der Endozytose folgt ein intralysosomaler Abbau der liposomalen Lipide und die Freisetzung der eingekapselten Wirkstoffe (Scherphof et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Nach der intravenösen Verabreichung werden kleine Liposome (0,1 bis 1,0 μm) normalerweise von den Zellen des Retikuloendothelialsystems aufgenommen, die sich prinzipiell in der Lever und Milz befinden, wogegen die Liposome mit einer Größe über 3,0 μm in der Lunge abgesetzt werden. Diese präferenzielle Aufnahme von kleineren Liposomen durch das Retikuloendothelialsystem wurde für die Abgabe von chemotherapeutischen Wirkstoffen an Makrophagen und Tumoren der Leber verwendet.
Das Retikuloendothelialsystem kann durch mehrere Methoden umgangen werden, u. a. durch Sättigung mit großen Dosen von Liposompartikeln oder selektive Makrophagendeaktivierung durch pharmakologische Mittel (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Des Weiteren zeigte die Integration von Glycolipid- oder Polyethelenglycol-derivatisierten Phospholipiden in Liposommembrane eine signifikant reduzierte Aufnahme in das Retikuloendothelialsystem (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Liposome können auch präpariert werden, um auf bestimmte Zellen oder Organe abzuzielen, indem die Phospholipidzusammensetzung variiert wird oder Rezeptoren oder Liganden in die Liposome eingefügt werden. Liposome, die mit einem hohen Gehalt eines nicht-ionischen Tensids präpariert werden, wurden z. B. für die Abzielung auf die Leber verwendet (Hayakawa et al., Japanese Patent 04-244,018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Für die Präparation dieser Formulierungen wurden Sojabohnen-Phospatidylcholin, α-Tocopherol und ethoxyliertes hydrogeniertes Rizinusöl (HCO-60) in Methanol gemischt, die Mischung bei Unterdruck konzentriert und dann mit Wasser rekonstituiert. Eine liposomals Formulierung von Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) mit einer aus Sojabohnen gewonnenen Sterylglucosidmischung (SG) und Cholesterin (Ch) zielt nachweisbar ebenfalls auf die Leber ab (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
Alternativ können verschiedene Targeting-Liganden an die Liposomoberfläche gebunden werden, wie z. B. Antikörper, Antikörperfragmente, Kohlenhydrate, Vitamine und Transportproteine. Liposome können z. B. mit vernetzten Galactosyl-Lipidderivaten modifiziert werden, um auf Asialoglycoproteinrezeptoren (Galactose) abzuzielen, welche exklusiv auf die Oberfläche von Leberzellen exprimiert werden (Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). Auf ähnliche Weise haben Wu et al., Hepatology 27:772 (1998) nachgewiesen, dass die Markierung der Liposome mit Asialofetuin eine verkürzte Liposomplasma-Halbwertszeit zur Folge hatte und die Aufnahme von mit Asialofetuin markierten Liposomen durch Hepatozyten wesentlich verbesserte. Andererseits kann die hepatische Ansammlung von Lipasomen, die vernetzte Galactosyl-Lipidderivate umfassen, durch eine Präinjektion von Asialofetuin gehemmt werden (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). Polyaconitylierte Humanserumalbumin-Liposome bieten einen weiteren Ansatz für das Targeting der Liposome auf die Leberzellen (Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Des Weiteren beschreiben Geho, et al. US-Patentnr. 4.603.044, ein hepatocytgesteuertes Liposomvesikel-Abgabesystem, das Spezifität für die mit spezialisierten metabolischen Zellen der Leber verbundenen hepatobiliären Rezeptoren aufweist.
In einem allgemeineren Ansatz für das Gewebe-Targeting werden Target-Zellen im Voraus mit biotinyliertem Antikörper markiert, der für einen von der Target-Zelle exprimierten Liganden spezifisch ist (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1448)). Nach der Plasmaelimination der freien Antikörper werden mit Streptavidin konjugierte Liposome verabreicht. In ein weiteren Ansatz werden die Targeting-Antikörper direkt an den Liposomen befestigt (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
Polypeptide mit Zcytor14-bindender Aktivität können unter Verwendung der Standardmethoden für die Mikroeinkapselung von Protein innerhalb der Liposome eingekapselt werden (siehe z. B. Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990) und Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. „Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", in Liposome Technology, 2. Ausgabe, Vol. III, Gregoriadis (ed.), S. 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Wie oben erwähnt, können therapeutisch nützliche Liposome eine Vielfalt von Komponenten enthalten. Liposome können z. B. Lipidderivate von Poly(ethylenglycol) umfassen (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Abbaubare Polymermikrosphären wurden entwickelt, um die hohen systemischen Konzentration von therapeutischen Proteinen aufrechtzuerhalten. Mikrosphären werden aus abbaubaren Polymeren präpariert, wie z. B. Poly(lactid-coglycolid) (PLG), Polyanhydride, Poly(orthoester), nicht biologisch abbaubare Ethylvinylacetatpolymere, in denen die Proteine in den Polymeren eingefangen sind (Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, „Role of Polymers in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), S. 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, „Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), S. 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Mit Polyethylenglycol (PEG) beschichtete Nanosphären können ebenfalls Träger für die intravenöse Verabreichung von therapeutischen Proteinen bieten (siehe z. B. Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).
Die vorliegende Erfindung zieht auch chemisch modifizierte Polpeptide mit Zcytor14-bindender Aktivität und Zcytor14-Antagonisten in Betracht, in denen, wie oben erläutert, ein Polypeptid mit einem Polymer verknüpft ist.
Andere Dosierungsformen können von fachkundigen Personen konzipiert werden, wie z. B. von Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5. Ausgabe (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Ausgaben (Mack Publishing Company 1995) und Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) gezeigt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. als Kit bereitgestellt werden, das einen Behälter umfasst, welcher ein Polypeptid mit einer Zcytor14 extrazellulären Domäne oder einen Zcytor14-Antagonisten enthält (z. B. einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, das an ein Zcytor14-Polypeptid bindet). Therapeutische Polypeptide können in Form einer injizierbaren Lösung für Einzel- oder Mehrfachdosen oder als steriles Pulver, das vor der Injektion rekonstituiert wird, bereitbestellt werden. Alternativ kann ein solches Kit einen Trockenpulverdispergierer, einen Flüssigaerosolgenerator oder Zerstäuber für die Verabreichung eines therapeutischen Polypeptids enthalten. Ein solches Kit kann auch schriftliche Informationen zu den Indikationen und zum Gebrauch der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten. Des Weiteren können solche Informationen eine Aussage beinhalten, dass die Zcytor14-Zusammensetzung bei Patienten mit bekannter Überempfindlichkeit auf Zcytor14 kontraindiziert ist.
13. Therapeutische Verwendungen der Zcytor14-Nukleotidsequenzen
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Zcytor14-Nukleotidsequenzen für die Bereitstellung von Zcytor14 an Patienten, die eine solche Behandlung benötigen. Des Weiteren kann ein therapeutischer Expressionsvektor bereitbestellt werden, der die Zcytor14-Genexpression hemmt, wie z. B. ein Antisense-Molekül, ein Ribozym oder ein externes Führungssequenzmolekül.
Es gibt zahlreiche Ansätze für die Einfügung eines Zcytor14-Gens in einen Probanden, u. a. die Verwendung von rekombinanten Wirtszellen, welche Zcytor14 exprimieren, Abgabe einer nackten Nukleinsäure, welche Zcytor14 kodiert, Verwendung eines kationischen Lipidträgers mit einem Nukleinsäuremolekül, das Zcytor14 kodiert und die Verwendung von Viren, die Zcytor14 exprimieren, wie z. B. rekombinante Retroviren, rekombinante Adeno-Assoziierte Viren, rekombinante Adenoviren und rekombinante Herpes-Simplex-Viren (siehe z. B. Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). In einem ex vivo Ansatz werden die Zellen z. B. von einem Probanden isoliert, mit einem Vektor transfektiert, der ein Zcytor14-Gen exprimiert, und dann in den Probanden transplantiert.
Um die Expression eines Zcytor14-Gens zu bewirken, wird ein Expressionsvektor konstruiert, in dem eine das Zcytor14-Gen kodierende Nukleotidsequenz mit einem Kernpromoter funktionell verknüpft ist und optional ein regulatorisches Element enthalten ist, das die Gentranskription kontrolliert. Die allgemeinen Voraussetzungen eines Expressionsvektors sind oben beschrieben.
Alternativ kann ein Zcytor14-Gen unter Verwendung rekombinanter Virusvektoren gewonnen werden, z. B. Adenovirusvektoren (z. B. Kass-Eisler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993), Kolls et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:215 (1994), Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993) und Zabner et al., Cell 75:207 (1993)), Adenovirus-Assoziierte Virusvektoren (Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10613 (1993)), Alphaviren wie Semliki Forest Virus und Sindbis Virus (Hertz and Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju and Huang, J. Vir. 65:2501 (1991), and Xiong et al., Science 243:1188 (1989)), Herpesvirusvektoren (z. B. US-Patentnr. 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 und 5.328.688), Parvovirusvektoren (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)), Pockenvirusvektoren (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali and Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4927 (1982)), Pockenviren wie Canarypox-Virus oder Vaccinia-Virus (Fisher-Hoch et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317 (1989) und Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)) und Retroviren (z. B. Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993) und Anderson et al., US-Patentnr. 5.399.346). In verschiedenen Ausführungsbeispielen können entweder die Virusvektoren selbst oder ein Viruspartikel, der den Virusvektor enthält, in den unten beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen verwendet werden.
Als Beispiel eines Systems ist z. B. das Adenovirus, ein doppelsträngiges DNA-Virus ein gut charakterisierter Gentransfervektor für die Abgabe eines heterologen Nukleinsäuremoleküls (siehe Untersuchung von Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Das Adenovirussystem bietet mehrere Vorteile, u. a.: (i) die Fähigkeit zur Aufnahme relativ große DNA-Einsätze, (ii) die Fähigkeit zur Züchtung in einem hohen Titer, (iii) die Fähigkeit zur Infektion eines weiten Bereichs von Säugetierzelltypen und (iv) die Fähigkeit zur Verwendung mit einer großen Anzahl erhältlicher Vektoren, die ubiquitäre, gewebespezifische und regulierbare Promoter enthalten. Da Adenoviren im Blutstrom stabil sind, können sie außerdem durch intravenöse Injektion verabreicht werden.
Unter Verwendung von Adenovirusvektoren, bei denen Teile des Adenvirusgenoms deletiert wurden, können diese Einsätze durch direkte Ligation oder durch homologe Rekombination mit einem cotransfektierten Plasmid in die virale DNA eingebunden werden. In einem exemplarischen System wird das essenzielle E1-Gen aus dem viralen Vektor deletiert und das Virus wird nicht replizieren, außer das E1-Gen wird von der Wirtszelle geliefert. Wenn intakten Tieren intravenös verabreicht, zielt das Adenovirus primär auf die Leber ab. Obwohl ein adenovirales Abgabesystem mit einer E1-Gendeletion in den Wirtszellen nicht repliziert werden kann, exprimiert und verarbeitet das Gewebe der Wirtszelle ein kodiertes heterologes Protein. Wirtszellen sekretieren auch das heterologe Protein, wenn das entsprechende Gen eine sekretorische Signalsequenz umfasst. Sekretierte Proteine treten von dem Gewebe, das das heterologe Gen exprimiert (z. B. die stark vaskularisierte Leber), in den Kreislauf ein.
Des Weiteren können adenovirale Vektoren, die verschiedene Deletionen von viralen Genen enthalten, für den Versuch verwendet werden, die Immunantworten auf den Vektor zu reduzieren oder zu eliminieren. Solche Adenoviren weisen E1-Deletion auf und enthalten außerdem Deletionen von E2A oder E4 (Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). Des Weiteren führt die Deletion von E2b Berichten nach zur Reduzierung der Immunantworten (Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)). Durch die Deletion des gesamten Adenovirusgenoms können sehr große Einsätze heterologer DNA aufgenommen werden. Die Generierung so genannter „gutless" Adenoviren, bei denen alle viralen Gene entfernt wurden, sind besonders vorteilhaft für das Einfügen großer Einsätze heterologer DNA (siehe Yeh. and Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).
Hochtiterbestände von rekombinanten Viren, die zur Expression eines therapeutischen Gens fähig sind, können unter Verwendung der Standardmethoden aus infizierten Säugetierzellen gewonnen werden. Rekombinantes Herpes-Simplex-Virus kann in Vero-Zellen präpariert werden gemäß der Beschreibung von Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989), Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992) und Brown and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997).
Alternativ kann ein Expressionsvektor, der ein Zcytor14-Gen umfasst, durch Lipofektion unter Verwendung von Liposomen in vivo in die Zellen eines Probanden eingefügt werden. Synthetische kationische Lipide können verwendet werden, um Liposome für die in vivo Transfektion eine Marker-kodierenden Gens zu präparieren (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)). Die Verwendung der Lipofektion für die Einführung exogener Gene in spezifische Organe in-vivo hat bestimmte praktische Vorteile. Liposome können verwendet werden, um die Transfektion an bestimmte Zelltypen zu leiten, was beispielsweise besonders vorteilhaft in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität, wie z. B. Pankreas, Leber, Niere und Gehirn, wäre. Lipide können zum Zweck des Targeting chemisch an andere Moleküle gekoppelt werden. Target-Peptide (z. B. Hormone oder Neurotransmitter), Proteine wie z. B. Antikörper oder Nicht-Peptid-Moleküle können chemisch an Liposome gekoppelt werden.
Elektroporation ist eine weitere Alternative für einen Verabreichungsweg. Aihara and Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867 (1998) haben z. B. die Verwendung von in vivo Elektroporation für einen Gentransfer in einen Muskel nachgewiesen.
In einem alternativen Ansatz zur Gentherapie kann ein therapeutisches Gen eine Zcytor14-Antisense-RNA kodieren, welche die Expression von Zcytor14 hemmt. Geeignete Sequenzen für Antisensemoleküle können aus den hier offen gelegten Nukleotidsequenzen des Zcytor14 gewonnen werden.
Alternativ kann ein Expressionsvektor konstruiert werden, in dem ein regulatorisches Element mit einer ein Ribozym kodierenden Nukleotidsequenz funktionell verknüpft ist. Ribozyme können für die Expression von Endonukleaseaktivität konzipiert werden, die auf eine bestimmte Zielsequenz in einem mRNA-Molekül gerichtet ist (siehe z. B. Draper and Macejak, US-Patentnr. 5.496.698, McSwiggen, US-Patentnr. 5.525.468, Chowrira and McSwiggen, US-Patentnr. 5.631.359 und Robertson and Goldberg, US-Patentnr. 5.225.337). In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung umfassen Ribozyme Nukleotidsequenzen, die an Zcytor14-mRNA binden.
In einem weiteren Ansatz können Expressionsvektoren konstruiert werden, in denen ein regulatorisches Element die Produktion von RNA-Transkripten leitet, die zur Förderung von RNase P-vermittelter Spaltung der Zcytor14-Genkodierenden mRNA-Moleküle leitet. Bei diesem Ansatz kann eine externe Führungssequenz konstruiert werden für die Leitung des endogenen Ribozym, RNase P, an eine bestimmte Spezies von intrazellulärer mRNA, welche anschließend von dem zellulären Ribozym gespalten wird (siehe z. B. Altman et al., US-Patentnr. 5.168.053, Yuan et al., Science 263:1269 (1994), Pace et al., Internationale Publikation Nr. WO 96/18733, George et al., Internationale Publikation Nr. WO 96/21731, und Werner et al., Internationale Publikation Nr. WO 97/33991). Eine externe Führungssequenz umfasst vorzugsweise eine zehn bis fünfzehn Nukleotidsequenz komplementär zur Zcytor14-mRNA und eine 3'-NCCA Nukleotidsequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die externen Führungssequenztrariskripte binden an die Ziel-mRNA-Spezies durch Bildung eines Basenpaares zwischen der mRNA und den komplementären externen Führungssequenzen, wodurch die Spaltung der mRNA durch RNase P an dem Nukleotid, das sich am 5'-Ende der Basenpaarregion befindet, gefördert wird.
Die Dosis einer Zusammensetzung aus einem therapeutischen Vektor mit einer Zcytor14-Nukleotidsequenz, wie z. B. ein rekombinantes Virus, hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. dem Alter, Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, Allgemeinzustand und Anamnese des Patienten. Geeignete Verabreichungswege für therapeutische Vektoren sind u. a. intravenöse Injektion, intraarterielle Injektion, intraperitoneale Injektion, intramuskuläre Injektion, intratumorale Injektion und Injektion in eine Kavität, die einen Tumor enthält. Wie von Horton et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:1553 (1999) dargestellt, wurde nachgewiesen, dass die intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA-kodierendem Interferon-α potente Antitumorwirkungen auf primären und metastasierenden Tumoren in einem Mausmodell produziert wurden.
Eine Verbindung, die Virusvektoren, nicht-virale Vektoren oder eine Kombination aus viralen und nicht-viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung umfasst, kann gemäß den bekannten Methoden für die Präparation pharmazeutisch geeigneter Verbindungen formuliert werden, wobei die Vektoren oder Viren in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger kombiniert werden. Wie oben erwähnt, wird eine Verbindung wie eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung als „pharmazeutisch akzeptierbarer Träger" anerkannt, wenn die Verabreichung von einem empfangenden Patienten vertragen werden kann. Andere geeignete Träger sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), und Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)).
Zum Zweck der Therapie werden ein therapeutischer Genexpressionsvektor oder ein rekombinantes Virus, das einen solchen Vektor umfasst, und ein pharmazeutisch akzeptierbarer Träger einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine Kombination aus einem Expressionsvektor (oder Virus) und einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger wird als in einer „therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht angesehen, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Wirkstoff ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart eine erkennbare Veränderung in der Physiologie des empfangenden Patienten bewirkt. Ein Wirkstoff, der für die Behandlung von Entzündungen verwendet wird, ist z. B. physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart die inflammatorische Reaktion lindert.
Wenn der mit einem therapeutischen Genexpressionsvektor oder einem rekombinanten Virus behandelte Proband ein Mensch ist, ist die Therapie vorzugsweise eine somatische Zellgentherapie. Das bedeutet, dass die bevorzugte Behandlung eines Menschen mit einem therapeutischen Genexpressionsvektor oder einem rekombinanten Virus keine Einfügung eines Nukleinsäuremoleküls in die Zellen beinhaltet, die Teil einer humanen Keimbahn bilden können, die auf nachfolgende Generation übertragen werden kann (d. h. humane Keimbahngentherapie).
14. Produktion von transgenen Mäusen
Transgene Mäuse können entwickelt werden, um das Zcytor14-Gen in alle Gewebe oder unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder gewebepräferenziellen regulatorischen Elements zu überexprimieren. Diese Überproduktion von Zcytor14 kann verwendet werden, um den aus der Überexpression resultierenden Phänotyp zu charakterisieren, und die transgenen Mäuse können als Modell für menschliche Krankheiten, die durch einen Überschuss an Zcytor14 verursacht werden, dienen. Transgene Mäuse, die Zcytor14 überexprimieren, können auch Bioreaktoren für die Produktion von Zcytor14, wie lösliches Zcytor14, in der Milch oder im Blut von größeren Tieren modellieren. Methoden für die Produktion von transgenen Mäusen sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Jacob, „Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), S. 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995) und Abbud and Nilson, „Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", in Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), S. 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)).
Eine Methode für die Produktion einer transgenen Maus, die ein Zcytor14-Gen exprimiert, beginnt z. B. mit erwachsenen, fruchtbaren männlichen Mäusen (Studs) (B6C3f1, 2-8 Monate alt (Taconic Farms, Germantown, NY), vasektomisierten männlichen Mäusen (Duds) (B6D2f1, 2-8Monate alt, (Taconic Farms)), präpubeszenten fruchtbaren weiblichen Mäusen (Donors) (B6C3f1, 4-5 Wochen, (Taconic Farms)) und erwachsenen fruchtbaren weiblichen Mäusen (Recipients) (B6D2f1, 2-4 Monate, (Taconic Farms)). Die Donors werden eine Woche akklimatisiert und erhalten dann eine Injektion von ca. 8 IE/Maus Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P. und 46-47 Stunden später 8 IU/Maus Human Chorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)) I.P., um eine Superovulation einzuleiten. Donors werden anschließen an Hormoninjektionen mit den Studs gepaart. Die Ovulation tritt generell innerhalb von 13 Stunden nach der hCG-Injektion ein. Die Kopulation wird durch die Gegenwart eines Vaginalplugs am Morgen nach der Paarung bestätigt.
Die befruchteten Eier werden unter einem chirurgischen Mikroskop gewonnen. Die Oviducts werden gewonnen und die Eier werden in Urinanalyse-Objektträger, die Hyaluronidase (Sigma) enthalten, freigesetzt. Die Eier werden einmal in der Hyalwonidase und zweimal in Whitten W640 Medium gewaschen (siehe Beschreibungen z. B. von Menino and O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986) und Dienhart and Downs, Zygote 4:129 (1996)), das mit 5 % CO₂, 5 % O₂ und 90 % N₂ bei 37 °C inkubiert wurde. Anschließend werden die Eier bis zur Mikroinjektion bei 37 °C/5 % CO₂ in einem Inkubator aufbewahrt.
Zehn bis zwanzig Mikrogramm Plasmid-DNA, welches eine Zcytor14-kodierende Sequenz umfasst, werden linearisiert, gel-aufgereinigt und in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.25 mM EDTA (pH 8.0) mit einer Endkonzentration von 5-10 Nanogramm pro Mikroliter für die Mikroinjektion resuspendiert. Die Zcytor14-kodierenden Sequenzen können z. B. ein Polypeptid kodieren, das die Aminosäurereste 21 bis 452 der SEQ ID-NR:2 umfasst.
Plasmid-DNA wird in die geernteten Eier mikroinjiziert, welche in einem Tropfen W640-Medium, das von warmem CO₂-equilibriertem Mineralöl überlagert ist, enthalten sind. Die DNA wird in eine Injektionsnadel aufgezogen (aus einem ID von 0,75 mm und AD von 1 mm Borsilikatglaskapillar) und in die einzelnen Eier injiziert. Jedes Ei wird mit der Injektinsnadel in einen oder beide Haploid pronuclei durchstochen.
Picoliter der DNA werden in die Pronuclei injiziert und die Injektionsnadel wird zurückgezogen, ohne mit den Nucleoli in Kontakt zu kommen. Das Verfahren wird wiederholt, bis alle Eier injiziert wurden. Die erfolgreich mikroinjizierten Eier werden in eine Organgewebekulturplatte mit vorbelüftetem W640-Medium übertragen und bei 37 °C/5 % CO₂ im Inkubator aufbewahrt.
Am nächsten Tag werden zweizellige Embryos in die pseudoschwangeren Recipients transferiert. Die Recipients werden durch die Gegenwart von Kopulationsplugs nach der Kopulation mit vasektomisierten Duds identifiziert. Die Recipients werden anästhetisiert und auf der dorsalen linken Seite rasiert und unter ein chirurgisches Mikroskop transferiert. Es wird eine kleine Inzision in die Haut und durch die Muskelwand in der Mitte des Abdomenbereichs, der vom Brustkorb, Sattel und Hinterbein umgeben ist, halbwegs zwischen Knie und Milz hergestellt. Die Reproduktionsorgane werden auf ein kleines chirurgisches Abdecktuch exteriorisiert. Das Fettpolster wird auf dem chirurgischen Abdecktuch ausgestreckt und ein Baby-Serrefine (Roboz, Rockville, MD) wird am Fettpolster befestigt und über den Rücken der Maus gehängt, um ein Zurückrutschen der Organe zu verhindern.
Mit einer feinen Transferpipette, die Mineralöl enthält, gefolgt von abwechselnd W640 und Luftblasen, werden 12-17 gesunde zweizellige Embryos von der Injektion des Vortages in den Recipient transferiert. Die geschwollene Ampulla wird lokalisiert und der Oviduct wird zwischen Ampulla und Bursa gehalten, und mit einer 28 g-Nadel wird nahe an der Bursa der Oviduct angeritzt, wobei darauf zu achten ist, dass Ampulla oder Bursa nicht eingerissen werden.
Die Pipette wird in die eingeritzte Kerbe im Oviduct transferiert und die Embryos werden hinein geblasen, wobei die erste Luftblase aus der Pipette entweichen muss. Das Fettpolster wird sanft in das Peritoneum geschoben, sodass die Reproduktionsorgane hineingleiten können. Die Peritonealwand wird mit einer Naht geschlossen und die Wunde wird mit einer Wundklammer verschlossen. Die Mäuse erholen sich mindestens vier Stunden lang bei 37 °C in einem Objekmäger-Wärmegerät.
Die Recipients werden in Paaren in Käfige zurück gebracht für eine Gestationszeit von 19-21 Tagen. Nach der Geburt werden 19-21 Tage postpartum vor der Entwöhnung erlaubt. Die frisch entwöhnten Mäuse werden nach Geschlecht sortiert, in separate geschlechtsspezifische Käfige gesetzt, und es wird eine 0,5 cm Biopsie (für die Genotypisierung) mit einer sauberen Schere vom Schwanz abgeschnitten.
Die genomische DNA wird unter Verwendung z. B. eines QIAGEN DNEASY Kits, das nach Herstelleranweisung verwendet wird, aus den Schwanzschnitten präpariert. Die genomische DNA wird durch PCR unter Verwendung von Primern, die für die Amplifizierung eines Zcytor14-Gens oder eines selektierbaren Marker-Gens, das in das gleiche Plasmid eingefügt wurde, analysiert. Nachdem die Transgenität der Tiere bestätigt wurde, werden sie durch Platzierung eines transgenen Weibchens mit einem wildtypischen Männchen, oder eines transgenen Männchens mit einem wildtypischen Weibchen in einen Inzuchtstrang zurückversetzt. Nach der Geburt und Entwöhnung der Jungen (Pups) werden die Geschlechter getrennt und ihre Schwänze werden für die Genotypisierung beschnitten.
Zur Prüfung auf eine Expression eines Transgens in einem lebenden Tier wird eine partielle Hepatektomie durchgeführt. Es wird eine chirurgische Präparation des oberen Abdomenbereichs, direkt unter dem Zyphoidfortsatz durchgeführt. Unter Verwendung steriler Methoden wird unter dem Sternum eine 1,5-2 cm große Inzision hergestellt und der links-laterale Leberlappen wird exteriorisiert. Mit 4-0-Seide wird der untere Lappen abgebunden und außerhalb der Körperhöhle befestigt. Die Abbindung wird durch eine atraumatische Klammer gehalten, während eine zweite Schlaufe von resorbierbarem Dexon (American Cyanamid; Wayne, N.J.) priximal zur ersten Anbindung gelegt wird. Es wird ein distaler Schnitt zur Dexon-Anbindung hergestellt und etwa 100 mg des exzidierten Lebergewebes wird in eine sterile Petrischale gelegt. Der exzidierte Leberschnitt wird in ein 14 ml Polypropylenröhrchen mit rundem Boden transferiert und in Flüssigstickstoff schockgefroren und dann auf Trockeneis gelagert. Die Operationsstelle wird durch Naht und Wundklammern verschlossen und der Tierkäfig wird 24 Stunden postoperativ auf eine 37 °C warme Wärmedecke gestellt. Das Tier wird täglich postoperativ überprüft und die Wundklammer werden 7-10 Tage nach der Operation entfernt. Die Expressionskonzentration der Zcytor14 mRNA wird bei jeder transgenen Maus unter Verwendung eines RNA-Lösungshybridisierungs-Assay oder Polymerase-Kettenreaktion untersucht.
Neben der Produktion von transgenen Mäusen, die Zcytor14 überexprimieren, ist auch die Entwicklung von transgenen Mäusen mit abnormal niedriger oder keiner Expression des Gens nützlich. Solche transgenen Mäuse sind nützliche Modelle für Krankheiten, die mit einem Zcytor14-Mangel verbunden sind. Wie oben besprochen, kann die Zcytor14-Genexpression durch Verwendung von Antisensegenen, Ribozymgenen oder externen Führungssequenzgenen gehemmt werden. Zur Produktion von transgenen Mäusen, die das Zcytor14-Gen unterexprimieren werden solche hemmenden Sequenzen auf die Zcytor14-mRNA gerichtet. Methoden für die Produktion transgener Mäuse, die eine abnormal niedrige Expression eines bestimmten Gens aufweisen, sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Wu et al., „Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies", in Methods in Gene Biotechnology, S. 205-224 (CRC Press 1997)).
Ein alternativer Ansatz für die Produktion von transgenen Mäusen mit wenig oder keiner Zcytor14-Genexpression ist die Generierung von Mäusen, bei denen mindestens ein normales Zcytor14-Allel gegen ein funktionsunfähiges Zcytor14-Gen ausgetauscht wird. Eine Methode zur Konzipierung eines funktionsunfähigen Zcytor14-Gens ist die Einfügung eines anderen Gens, wie z. B. eines selektierbaren Markergens, in ein Nukleinsäuremolekül, das Zcytor14 kodiert. Standardmethoden für die Produktion dieser so genannten „Knockout"-Mäuse sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Jacob, „Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), S. 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994) und Wu et al., „New Strategies for Gene Knockout", in Methods in Gene Biotechnology, S. 339-365 (CRC Press 1997)).
Die vorliegende Erfindung, die hier nur generell beschrieben ist, wird durch Bezugnahme auf das folgende Beispiel verständlicher gemacht, wobei dieses Beispiel lediglich zur besseren Darstellung dient und die Erfindung in keiner Weise einschränken soll.
BEISPIEL 1
Expression des Zcytor14-Gens
Northern-Analysen wurden unter Verwendung von Human Multiple Tissue Blots (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) durchgeführt. Es wurden zwei Proben aus gelaufgereinigten PCR-Produkten generiert. Die erste Probe wurde unter Verwendung von ZC21798 (5' CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3'; SEQ ID-NR:8) and ZC21808 (5' TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3'; SEQ ID-NR:9) als Primer hergestellt. Die Probe wurde unter Verwendung des Multiprime Labeling Kits von Amersham (Arlington Heights, IL) gemäß Herstelleranweisungen durch ein radioaktives Label markiert. Die Probe wurde mit einer NUCTRAP Push Column (STRATAGENE, La Jolla, CA) aufgereinigt. EXPRESSHYB (CLONTECH) Lösung wurde für die Prähybridisierung und Hybridisierungslösungen für die Northern Blots verwendet. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 65 °C. Nach der Hybridisierung wurden die Blots jeweils 30 Minuten wie folgt in Lösungen gewaschen, die 0,1 % SDS und SSC enthielten: zweimal in 2xSSC bei Raumtemperatur, dreimal in 0,1x SSC bei 50 °C, einmal in 0,1x SSC bei 55 °C und einmal in 0,1x SSC bei 65°C. Die Ergebnisse zeigten, dass das Zcytor14-Gen stark in Schilddrüsen-, Nebennieren-, Prostata- und Lebergewebe und in einem geringeren Maß in Herz-, Dünndarm-, Magen- und Tracheagewebe exprimiert wird. Im Gegensatz dazu besteht nur wenig oder gar keine Expression in Gehirn, Plazenta, Lunge, Skelettmuskulatur, Nieren, Speicheldrüse, Milz, Thymus, Hoden, Eierstock, Kolon, periphere Leukozyten, Wirbelsäule, Lymphknoten und Knochenmark. SEQUENZAUFFÜHRUNG

Claims

Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäure Sequenz, die zu mindestens 90% mit einer Referenz-Aminosäure-Sequenz identisch ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Aminosäure-Resten 21 bis 452 von SEQ ID NO: 2, (b) Aminosäure-Resten 21 bis 435 von SEQ ID NO: 10, (c) Aminosäure-Resten 21 bis 677 von SEQ ID NO: 2 und (d) Aminosäure-Resten 1 bis 692 von SEQ ID NO: 2.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das isolierte Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die zu 100% mit der Referenz-Aminosäure-Sequenz identisch ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ IO NO: 11 und SEQ ID NO: 12.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend eine extrazelluläre Domäne, wobei die extrazelluläre Domäne entweder die Aminosäure-Reste 21 bis 452 der Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäure-Reste 21 bis 435 der Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 10 umfasst.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid weiterhin eine Transmembran-Domäne umfasst, die sich in einer Carboxyl-terminalen Position relativ zu der extrazellulären Domäne befindet, wobei die Transmembran-Domäne die Aminosäure-Reste 453 bis 473 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid weiterhin eine intrazelluläre Domäne umfasst, die sich in einer Carboxyl-terminalen Position relativ zu der Transmembran-Domäne befindet, wobei die intrazelluläre Domäne entweder die Aminosäure-Reste 474 bis 677 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäure-Reste 457 von 673of SEQ ID NO: 10 umfasst.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid weiterhin eine sekretorische Signalsequenz umfasst, die sich in einer Amino-terminalen Position relativ zu der extrazellulären Domäne befindet, wobei die sekretorische Signalsequenz die Aminosäure-Reste 1 bis 20 der Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das für ein Polypeptid gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1-6 kodiert.
Vektor, umfassend das isolierte Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 8.
Expressionsvektor, umfassend das isolierte Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 8, einen Transkriptionspromotor und einen Transkriptionsterminator, wobei der Promotor mit dem Nukleinsäure-Molekül operabel verknüpft ist, und wobei das Nukleinsäure-Molekül mit dem Transkriptionsterminator operabel verknüpft ist.
Rekombinantes Virus, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 10.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 10, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bakterium, Hefezelle, Pilzzelle, Insektenzelle, Säugetierzelle und Pflanzenzelle.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 1-6, umfassend Kultivieren von rekombinanten Wirtszellen, die einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 10 umfassen, wobei dadurch das Polypeptid hergestellt wird.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäure-Sequenz eine lösliche Aminosäure-Sequenz ist, umfassend entweder die Aminosäure-Reste 21 bis 452 von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäure-Reste 21 bis 435 von SEQ ID NO: 10.
Antikörper oder Antikörper-Fragment, der/das an ein Polypeptid gemäß Anspnruch 1 oder 14 spezifisch bindet.
Anti-idiotypischer Antikörper oder anti-idiotypisches Antikörper-Fragment, der/das an den Antikörper oder das Antikörper-Fragment gemäß Anspruch 15 spezifisch bindet.
Fusionsprotein, umfassend ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 14 und einen Immunoglobulin-Rest.