DE60033945T2

DE60033945T2 - Alkalische amylase aus bacillus

Info

Publication number: DE60033945T2
Application number: DE60033945T
Authority: DE
Inventors: Helle Ottrup; Bjarne Ronfeldt Nielsen; Lisbeth Hedegaard Hoeck; Jens Toenne Andersen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-21
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2020-08-22
Also published as: EP1212409B1; CN1399676A; JP2003507059A; EP1212409A2; DK1212409T3; WO2001014532A2; WO2001014532A3; CN1240832C; DE60033945D1; JP4741128B2; AU6686200A; ATE356868T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Amylasen mit einer erhöhten Waschleistung in einer alkalischen Waschmittellösung bei niedriger Temperatur.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für etliche Jahre wurden die alpha-Amylaseenzyme für eine Vielzahl verschiedener Zwecke verwendet, wobei die Wichtigsten die Stärkeliquefaktion, das Textilentschlichten, die Stärkemodifikation in der Papier- und Pulpe-Industrie und für das Brauen und Backen waren. Eine weitere Verwendung von alpha-Amylasen, die zunehmend wichtig wird, ist die Entfernung von Stärkeflecken während des Waschens bei alkalischem pH.
Beispiele kommerzieller alpha-Amylaseprodukte sind Termamyl^®, BAN^®, und Fungamyl^®, die alle von Novo Nordisk A/S, Dänemark, erhältlich sind. Diese und ähnliche Produkte von anderen kommerziellen Quellen besitzen ein saures bis neutrales pH-Optimum, typischerweise im Bereich von pH 5 bis pH 7,5, und sie zeigen keine optimale Aktivität in Waschmittellösungen bei alkalischem pH.
WO 95/26397 offenbart eine alpha-Amylase aus einem Bacillus-Stammm, der eine optimale Aktivität bei pH 8 aufweist. WO 96/23873 beschreibt Varianten der Bacillus-Amylase mit einer erhöhten Leistung unter Waschbedingungen.
Die US 5,147,796 beschreibt eine alkalische Pullulanase mit alpha-Amylase-Aktivität. 2b dieses Dokuments zeigt eine optimale Amylase-Aktivität bei pH 8–8,5.
M. Takagi et al., J. Ferment. Bioeng., Bd. 81, Nr. 6, 557-559 (1996) beschreibt eine alkaliphile alpha-Amylase-Pullulanase aus Bacillus sp. Das Enzym besitzt eine optimale Amylase-Aktivität bei pH 9, aber die Aktivität fällt rapide bei höherem pH ab, und die Aktivität bei pH 10 ist niedriger als bei pH 7.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue alpha-Amylasen mit einer erhöhten Leistung in alkalischen Lösungen bereitzustellen, insbesondere in einer alkalischen Waschmittellösung bei einem pH von etwa 9–11.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine alpha-Amylase bereit, die ist:

a) ein Polypeptid, das durch den Bacillus sp NCIMB 40916 erzeugt wird, oder
b) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in den Positionen 1-556 der SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, oder
c) ein Polypeptid, das durch den alpha-Amylase kodierenden Teil der DNA-Sequenz kodiert wird, der in ein in Escherichia coli DSM 13001 vorliegendem Plasmid kloniert ist, oder
d) ein Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptides, das i) mindestens 60% homolog mit dem Polypeptid ist, oder ii) von dem Polypeptid durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einer abgeleitet

In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine alpha-Amylase bereit, die eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist:

– eine Aktivität bei einem pH von 10,5, die mindestens zwei mal höher ist als die Aktivität bei pH 7,3, wenn bei 37° gemessen wird,
– eine Aktivität bei pH 9,5, die mindestens viermal höher ist als die Aktivität bei pH 7,3, wenn bei 37°C gemessen wird,
– einen optimalen pH von etwa 9,5, wenn bei 37°C gemessen wird,
– eine Thermostabilität, so dass sie mehr als 90% ihrer Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 25°C in einer Lösung von 3 g/l Testwaschmittel beibehält, das 20% STPP, 25% Na₂SO₄, 15% Na₂CO₃, 20% LAS, 5% C12-C15-Alkoholethoxylat, 5% Na₂Si₂O₅, 0,3% NaCl bei pH 10,5 und 6 Deutsche Härtegrade aufweist, und weniger als 90% ihrer Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 30°C in der gleichen Lösung beibehält,
– ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa, wenn es mittels SDS-PAGE bestimmt wird,
– einen isoelektrischen Punkt von etwa 5, wenn er durch isoelektrisches Fokussieren bestimmt wird.

Die Erfindung stellt auch eine isolierte DNA-Sequenz bereit, die eine alpha-Amylase kodiert, wobei die apha-Amylase die vorstehend beschriebene ist, oder wobei die DNA-Sequenz umfasst:

a) die DNA-Sequenz, die in den Positionen 94-1764 der SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, oder
b) ein Analog der in a) definierten Sequenz, das i) zu mindestens 60% homolog mit der DNA-Sequenz ist, oder ii) mit der DNA-Sequenz bei mindestens 55°C hybridisiert,

Andere Aspekte der Erfindung stellen einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der die DNA-Sequenz umfasst, und eine Zelle, die mit der DNA-Sequenz oder dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert ist.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer alpha-Amylase bereit, in dem die Zelle kultiviert wird, und eine Waschmittelzusammensetzung, die die alpha-Amylase enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahem auf die begleitenden Figuren veranschaulicht, wobei
1 ein pH-Aktivitätsprofil der Amylase aus NCIMB 40916 verglichen mit zwei Amylasen des Standes der Technik (SP722 und Termamyl) zeigt,
2 ein Temperaturaktivitätsprofil der Amylase aus NCIMB 40916 zeigt,
3 die Stabilität der Amylase aus NCIMB 40916 nach der Inkubation bei verschiedenen Temperaturen zeigt,
4 den in Beispiel 1 beschriebenen Klonierungsvektor pSJ1678 zeigt, und
5 und 6 die Ergebnisse von Waschtests in Beispiel 4 zeigen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Mikrobenquellen
Die alpha-Amylase der Erfindung kann aus einem Stamm des Bacillus stammen. Ein bevorzugter Stamm is Bacillus sp NCIMB 40916. Dieser Stamm wurde am 28. Januar 1998 von den Erfindern unter den Bedingungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahre beim National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, Vereinigtes Königreich hinterlegt. Ein mit NN049489 bezeichneter Escherichia coli-Stamm, der das alpha-Amylase-Gen enthielt, das in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, das in das Plasmid pJA386 kloniert ist, wurde am 7. August 1999 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DE ebenfalls hinterlegt und die Zugangsnummer DSM 13001 zugeteilt.
Produktion der alpha-Amylase
Die alpha-Amylase der Erfindung kann durch Kultivieren eines geeigneten alpha-Amylase produzierenden Stamms von Bacillus oder der transformierten Wirtszelle der Erfindung in einem geeigneten Nährmedium und Gewinnen der alpha-Amylase aus dem Kulturmedium hergestellt werden.
Das Medium, das verwendet wird, um die Zellen zu kultivieren, kann jedes konventionelle Medium sein, das für das Wachsen der in Rede stehenden Wirtszelle und dem Erreichen einer Expression der alpha-Amylase der Erfindung geeignet ist. Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich oder können nach veröffentlichten Rezepten (z.B. wie sie im Katalog der American Type Culture Collection veröffentlicht sind) hergestellt werden.
Die alpha-Amylase, die von den Wirtszellen sekretiert werden, kann üblicherweise aus dem Kulturmedium durch gut bekannte Verfahren gewonnen werden, einschließlich Trennen der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration und Präzipitieren proteinartiger Komponenten des Mediums mittels eines Salzes, wie z.B. Ammoniumsulfat, gefolgt von der Verwendung chromatographischer Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie,, Affinitätschromatographie oder dergleichen.
Eigenschaften der alpha-Amylase
Eine bevorzugte alpha-Amylase stammt vom Bacillus sp. NCIMB 40916. Sie kann wie in den Beispielen beschrieben hergestellt werden. Die Aminosäuresequenz in voller Länge der Amylase und die DNA, die sie kodieren, sind in den SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellt. Die folgenden Eigenschaften wurden für die Amylase der Erfindung gefunden (gereinigte alpha-Amylase aus NCIMB 40916):
Ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa, wenn sie mit SDS-PAGE unter Verwendung eines Novex 4–25% Gradientengels bestimmt wurde.
Ein pI von etwa 5 wurde durch isoelektrisches Fokussieren (Ampholine PAG, pH 3,5–9,5) bestimmt.
Eine pH-Aktivitätskurve ist in 1 gezeigt, wobei die Aktivität bei pH 7,3 als 100% genommen wurde. Sie wurde bestimmt unter Verwendung des Phadebas-Assays, wobei 50 mM Britten-Robinson-Puffer verwendet wurden, der auf verschiedene pH-Werte eingestellt wurde. Als Referenz wurden die pH-Profile von zwei Bacillus-Amylasen des Standes der Technik (Termamyl, die von B. licheniformis stammt, und SP722, die nach WO 95/26397 hergestellt wurde) unter den gleichen Bedingungen gemessen und sind auch in der 1 gezeigt. 1 zeigt, dass die Amylase der Erfindung die etwa 10 mal höhere Aktivität als die beiden Amylasen des Standes der Technik bei pH 9,5 besitzt. 1 zeigt auch, dass die optimale Aktivität bei etwa pH 9,5 liegt.
Eine Temperaturaktivitätskurve wurde unter Verwendung des Phadebas-Assays bei verschiedenen Temperaturen mit 50 mM Britten-Robinson-Puffer gemessen, der auf pH 9,5 eingestellt war. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Es kann von 2 gesehen werden, dass die Amylase der Erfindung eine optimale Aktivität bei etwa 55°C aufweist.
Die Stabilität der Amylase wurde bei pH 10,5 (50 mM CAPS) bei 22, 37, 45, 55 und 65°C nach 30 Minuten Inkubation gemessen. Das Enzym wurde auf 40 NU/ml im Puffer verdünnt, und Proben von 25 Mikrolitern wurden bei den entsprechenden Temperaturen inkubiert. Nach 30 Minuten wurden die Proben mit Eis abgeschreckt, und die verbleibende Aktivität wurde bestimmt. Ein Stabilitätsprofil der Amylase der Erfindung und einer Amylase des Standes der Technik (SP722) ist in 3 gezeigt.
Sie Stabilität wurde durch Inkubation von 40 NU/ml der Amylase in einer Lösung von 3 g/l des A/P-Modellwaschmittels, wie es vorstehend beschrieben wurde, bei pH 10,5 und 6°dH (Deutsche Härte, Ca:Mg 2:1) getestet. Nach der Inkubation wurde die verbleibende Aktivität durch Phadebas bei pH 7,3 gemessen. Die Ergebnisse waren 95% verbleibende Aktivität nach der Inkubation bei 25°C, und 87% bei 30°C.
Homologie des Polypeptides und der DNA-Sequenz
Die Aminosäuresequenzhomologie kann als Grad der Identität zwischen den zwei Sequenzen bestimmt werden, die eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten zeigt. Die Homologie kann in geeigneter Weise mittels eines auf dem Gebiet bekannten Computerprogramms bestimmt werden. Somit kann FASTA, das in der GCG-Version 8 (Needleman S.B. und Wunsch, C.D., (1970), Juornal of Molecular Biology, 48, 443-453) verwendet werden, wobei die folgenden Einstellungen benutzt werden:Scoring-Matrix: GenRunData:blosum50.cmp, variabler Pamfaktor, der Gap-Creation-Penalty verwendet: 12, Gap-Extension-Penalty: 2.
Die Aminosäuresequenz zeigt einen Identitästgrad von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70% und bevorzugter mindestens 80%, und insbesondere mindestens 90%, oder mindestens 95%, noch spezieller mindestens 97% oder mindestens 99% mit der Aminosäuresequenz, die in den Positionen 1-556 der SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Die DNA-Sequenzhomologie kann als der Grad der Identität zwischen zwei Sequenzen bestimmt werden, die eine Abweichung der ersten Sequenz von der zweiten Sequenz zeigt. Die Homologie kann in geeigneter Weise mittels auf dem Gebiet bekannter Computerprogramme bestimmt werden, wie das GAP, das in dem GCG-Programmpacket (vorstehend beschrieben) bereitgestellt wird. Somit kann GAP GCGv8 mit den folgenden Defaultparametern verwendet werden: GAP-Creation-Penalty von 5,0 und GAP-Extension-Penalty von 0,3, Default-Scoring-Matrix. GAP verwendet die Methode von Needleman/Wunsch/Sellers, um Alignments zu erzeugen.
Das DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung umfasst eine DNA-Sequenz, die eine Identitätsgrad besitz von vorzugsweise mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80%, insbesondere mindestens 90% oder mindestens 95%, noch spezieller mindesten 97% oder mindestens 99% mit der Nucleinsäuresequenz, die in den Postitionen 94–1764 der SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Hybridisierung
Die Hybridisierung wird verwendet um anzuzeigen, dass eine gegebenen DNA-Sequenz analog zu einer Nucleionsäuresonde ist, die der SEQ ID NO: 1 entspricht. Die Hybridisierungsbedingungen sind im Detail nachfolgend beschrieben.
Geeignete Bedingungen zur Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nucleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz umfassen das Vor-Einweichen des Filters, der die DNA-Fragmente oder die RNA enthält, um zu hybridisieren, mit 5 × SSC (Standard Saline Citrat) währen mit Minuten, und Prähybridisieren des Filters in einer Lösung von 5 × SSC (Sambrook et al. 1989), 5 × Denhardt's Lösung (Sambrook et al. 1989), 0,5% SDS und 100 microgram/ml denaturierter beschallter Lachsspermien-DNA (Sambrook et al 1989), gefolgt von der Hybridiesierung in der gleichen Lösung mit zufällig geprimten (Feinberg, A.P. und Vogelstein, B: (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), ³²P-dCTP-markierter (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/microgram) Sonde für 12 Stunden bei etwa 45°C. Der Filter wird dann 2 mal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 55°C, bevorzugter mindestens 60°C, noch bevorzugter mindestens 65°C und sogar noch bevorzugter mindestens 70°C, speziell 75°C gewaschen.
Moleküle, an die die Oligonucleotidsonden unter diesen Bedingungen hybridisieren, werden unter Verwendung einer Röntgenfilms nachgewiesen.
Rekombinanter Expressionsvektor
Der Expressionsvektor der Erfindung umfasst typischerweise Kontrollsequenzen, die einen Promotor, einen Operator, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsinitiationssignal und ggf. ein Repressorgen oder verschiedene Aktivatorgene kodieren.
Der rekombinante Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz trägt, die die alpha-Amylase der Erfindung kodiert, kann jeder Vektor sein, der üblicherweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Entität existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z.B. ein Plasmid, ein Bakteriophage oder ein extrachromosomales Element, Minichromosom oder ein artifizielles Chromosom. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom der Wirtszelle integriert und zusammen mit dem/den Chromosomen, in das er integriert wurde, repliziert wird.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz operativ mit einer geeigneten Promotorsequenz verbunden sein. Der Promotor kann jede DAN-Sequenz sein, die eine transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl aufweist, und kann von Genen abgeleitet werden, die Proteine entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle kodieren. Beispiele geeigneter Promotoren zum Lenken der Transkription der DNA-Sequenz, die die alpha-Amylase der Erfindung kodiert, insbesondere in einem bakteriellen Wirt, sind die Promotoren des lac-Operon von E.coli, die Streptomyces coelicolor agarase-Gen dagA-Promotoren, die Promotoren des Bacillus licheniformis alpha-Amylase-Gens (amyL), die Promotoren des Bacillus stearothermophilus amltogenic-Amylase-Gens (amyM), die Promotoren der Bacillus amyloliquefaciens alpha-Amylase (amyQ), die Promotoren des Bacillus subtilis xylA- und xylB-Gens usw. Für die Transkription in einem Pilzwirt sind Beispiele geeigneter Promotoren die, die von dem Gen abgeleitet sind, die A.oryzae TAKA-Amylase, Rhizomucor miehei-Aspartinprotease, A. niger neutral-alpha-Amylase, A. niger-säurestabile alpha-Amylase, A. niger-Glucoamylase, Rhizomucor miehei-Lipase, A. oryzae-alklische Protease, A. oryzae-Triose-Phosphatisomerase oder A. nidulans-Acetamidase kodieren.
Der Expressionsvektor der Erfindung kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator und in Eukaryoten eine Polyadenylationssequenz aufweisen, die operativ mit der DNA- Sequenz verbunden sind, die die alpha-Amylase der Erfindung kodiert. Die Terminations- und Polyadenylations-Sequenz kann geeigneterweise von der gleichen Quelle wie der Promotor stammen.
Der Vektor kann weiterhin eine DNA-Sequennz umfassen, die den Vektor befähigt, in der in Rede stehenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele solcher Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z.B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, wie das dal-Gen aus B. subtilis oder B. licheniformis oder eines, das eine Antibiotikaresistenz verleiht, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz. Weiterhin kann der Vektor einen Aspergillus-Selektionsmarker umfassen, wie amdS, argB, niaD und sC, einen Marker zur Bildung einer Hygromycin-Resistenz, oder die Selektion kann durch die Co-Transformation bewerkstelligt werden, wie z.B. in der WO 91/17243 beschrieben.
Während die intrazelluläre Expression in mancher Hinsicht vorteilhaft sein kann, z.B. wenn bestimmte Bakterien als Wirtszellen verwendet werden, ist es allgemein bevorzugt, dass der Expressionsvektor extrazellulär vorliegt.
Verfahren, die zur Konstruktion von Vektoren der Erfindung geeignet sind, die eine alpha-Amylase kodieren, und die Promotor, Terminator bzw. andere Elemente enthalten, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al. (1989)).
Wirtszellen
Die Zelle der Erfindung, die entweder ein DNA-Konstrukt oder einen Expressionsvektor der Erfindung enthält, wie sie vorstehend definiert sind, wird vorteilhafterweise als Wirtszelle in der rekombinanten Herstellung der alpha-Amylase der Erfindung verwendet. Die Zelle kann mit dem DNA-Konstrukt der Erfindung transformiert sein, die die Amylase kodiert, üblicherweise durch Integrieren des DNA-Konstukts (in einer oder mehreren Kopien) in das Wirtschromosom. Diese Integration wird im Allgemeinen als Vorteil angesehen, da die DNA-Sequenz eher stabil in der Zelle bleibt. Die Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden, z.B. durch homologe oder heterologe Rekombination. Alternativ kann die Zelle mit einem Expressionsvektor wie er vorstehend in Verbindung mit verschiedenen Typen von Wirtszellen beschrieben ist.
Die Zelle der Erfindung kann eine Zelle eines höheren Organismus sein, wie ein Säuger oder ein Insekt, aber sie ist vorzugsweise eine mikrobielle Zelle, z.B. eine Bakterien- oder ein Pilz-(einschließlich eine Hefe-)Zelle.
Beispiele der bakteriellen Wirtszelle, die nach Kultivierung in der Lage sind, das Enzym der Erfindung zu produzieren, sind gram-positive Bakterien, wie Stämme von Bacillus, wie Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. clausii, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces, wie S. lividans oder S. murinus, oder gram-negative Bakterien, wie Escherichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation, Elektroporation, Konjugation oder durch Verwendung kompetenter Zellen in einer an sich bekannten Art (vgl. Sambrool et al., supra) bewirkt werden.
Die Hefeorganismen können günstigerweise ausgewählt werden von einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z.B. Saccharomyces cervesiae. Der filamentöse Pilz kann vorteilhafterweise zu einer Spezies von Aspergillus gehören, z.B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Pilzzellen können durch Verfahren transformiert werden, die die Protoplastbildung und die Transformation des Protoplasten gefolgt von der Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Art umfassen. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen ist in EP 238 023 beschrieben.
Industrielle Anwendung
Wegen ihrer Aktivität bei alkalischen pH-Werten sind die alpha-Amylasen der Erfindung gut geeignet für die Verwendung in einer Vielzahl industrieller Prozesse, insbesondere findet das Enzym potentielle Verwendung als Komponente in Waschmitteln, z.B. Haushaltswaschmitteln und Waschmittelzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen, aber es kann auch zur Herstellung von Süßungsmitteln und von Ethanol aus Stärke eingesetzt werden. Somit kann es in konventionellen Stärkeumwandlungsprozessen, wie die Liquefactions- und Saccharifications-Prozesse, die in dem US-Patent 3,912,590 und den EP-Patentveröffentlichungen Nrs. 252,730 und 63,909 beschrieben sind, verwendet werden.
Die alkalische alpha-Amylase der Erfindung kann auch bei der Herstellung von Lignocellulosematerial, wie Pulpe, Papier und Karton, aus mit Stärke verstärktem Abfallpapier und -Karton verwendet werden, insbesondere wenn das Aufschließen bei einem pH von über 7 auftritt und wo Amylasen den Abbau des Abfallmaterials durch den Abbau der verstärkenden Stärke erleichtern kann. Die alpha-Amylase der Erfindung ist insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung einer Pulpe zur Papierherstellung aus Stärke-beschichtetem Papier geeignet. Der Prozess kann wie in der WO 95/14807 beschrieben durchgeführt werden, der folgende Schritte umfasst:

a) Abbau des Papiers, um Pulpe herzustellen,
b) Behandeln mit einem Stärke-abbauenden Enzym vor, während oder nach dem Schritt a), und
c) Trennen von Druckfarbepartikeln aus der Pulpe nach den Schritten a) oder b).

Die alpha-Amylasen der Erfindung können auch beim Modifizieren von Stärke sehr nützlich sein, wo enzymatisch modifizierte Stärke bei der Papierherstellung zusammen mit einem alkalischen Füllstoff, wie Calciumcarbonat, Kaolin und Ton, verwendet wird. Mit der alkalischen alpha-Amylase der Erfindung wird es möglich, die Stärke in Gegenwart des Füllstoffs zu modifizieren, was einen einfacheren integrierten Prozess erlaubt.
Die alpha-Amylase der Erfindung kann auch beim Entschlichten von Textilien sehr nützlich sein. In der textilverarbeitenden Industrie werden alpha-Amylasen traditionell als Hilfsstoffe beim Entschlichten eingesetzt, um die Entfernung der Stärke-haltigen Schlichte zu erleichtern, die als Schutzüberzug auf Schußgarnen während des Webens dienen. Die vollständige Entfernung des Schlichteüberzugs nach dem Weben ist wichtig, um optimale Ergebnisse in den nachfolgenden Prozessen zu erhalten, in denen das Gewebe gewaschen, gebleicht und gefärbt wird. Der enzymatische Stärkeabbau ist bevorzugt, da er keinen schädlichen Effekt auf das Fasermaterial ausübt. Um die Verarbeitungskosten zu vermindern und den Walkdurchsatz zu erhöhen wird der Entschlichtungsprozess manchmal mit den Wasch- und Bleichschritten kombiniert. In einem solchen Fall werden nicht enzymatische Hilfsmittel, wie Alkali oder Oxidationsmittel, typischerweise verwendet, um die Stärke abzubauen, da traditionelle alpha-Amylasen nicht sehr verträglich mit hohen pH-Werten und Bleichmitteln sind. Der nicht enzymatische Abbau der Stärkeschlichte führt zu einigen Faserschäden, da ziemlich aggressive Chemikalien verwendet werden. Dementsprechend wäre es wünschenswert, die alpha-Amylase der Erfindung zu benutzen, da sie eine erhöhte Leistung in alkalischen Lösungen aufweist. Die alpha-Amylasen können alleine oder in Kombination mit einer Cellulase verwendet werden, wenn Cellulose-haltiges Gewebe oder Textilien entschlichtet werden.
Die alpha-Amylasen der Erfindung könne auch bei Bierproduktionsverfahren sehr nützlich sein; die alpha-Amylase wird typischerweise während des Maischverfahrens zugegeben.
Waschmittelzusammensetzung
Gemäß der Erfindung kann die alpha-Amylase typischerweise der Bestandteil einer Waschmittelzusammensetzung sein, z.B. eine Haushaltswaschmittelzusammensetzung. Als solche kann sie in einer Waschmittelzusammensetzung in Form eines nicht staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder einer geschützten Enzyms enthalten sein. Nicht staubende Granulate können z.B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide für Novo Industries A/S) beschrieben hergestellt werden, und sie können optional mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren überzogen sein. Beispiele der Wachsüberzugsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 1 000 bis 20 000; ethoxylierte Nonylphenole mit von 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorliegen; Fettalkohole; Fettsäuren, und Mono-, Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele der filmbildenden Beschichtungsmaterialien, die für die Anwendung in Wirbelschichttechniken geeignet sind, sind in dem Patent GB 14 835 91 angegeben. Flüssigenzympräparationen können z.B. durch Zugabe eines Polyols, wie Propylenglycol, Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure oder Borsäure gemäß eingeführten Verfahren stabilisiert werden. Andere Enzymstabilisierer sind auf dem Gebiet gut bekannt. Geschützte Enzyme können nach dem in der EP 238 216 offenbaren Verfahren hergestellt werden.
Die Eigenschaften der alpha-Amylase der Erfindung macht sie insbesondere geeignet zur Verwendung in alkalischen Detergenzien, z.B. bei pH 9,5–10,5 und für das Waschen bei niedrigen Temperaturen, z.B. 20 bis 40°C.
Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann in jeder herkömmlichen Form, z.B. als Pulver, Granulate, Pasten oder Flüssigkeiten vorliegen. Ein Flüssigwaschmittel kann wässrig, typischerweise mit bis zu 70% Wasser und 0–30% organischem Lösungsmittel, oder nicht wässrig sein.
Die Waschmittelzusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, wobei jedes davon anionisch, nicht ionisch, kationisch oder amphoterisch (zwitterionisch) sein kann. Das Waschmittel wird üblicherweise bis zu 0–50% anionisches Tensid enthalten, wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), alpha-Olefinsulfonat (AOS), Alkylsulfat (Fettalkoholsulfat) (AS), Alkoholethoxysulfat (AEOS oder AES), sekundäres Alkansulfonat (SAS), alspha-Sulfofettsäuremethylester, Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure oder Seife. Es kann auch 0–40% nicht ionisches Tensid enthalten, wie Alkoholethoxylat (AEO oder AE), Alkoholpropoxylat, carboxyliertes Alkoholethoxylat, Nonylphenolethoxylat, Alkylpolyglykosid, Alkyldimethylaminoxid, ethoxyliertes Fettsäuremonoethynolamid, Fettsäuremonoethanolamid oder Polyhydroxyalkylfettsäureamid (z.B. wie in der WO 92/06154 beschrieben).
Die Waschmittelzusammensetzung kann zusätzlich ein oder mehrere andere Enzyme umfassen, wie Pullulanase, Esterase, Lipase, Cutinase, Protease, Cellulase, Peroxidase oder Oxidase, z.B. Laccase.
Normalerweise enthält das Waschmittel 1–65% eines Gerüststoffs oder eines Komplexierungsmittels, wie einen Zeolit, ein Diphosphat, ein Triphosphat, ein Phosphonat, ein Citrat, eine Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Diethylentriaminpentaessigsäure (DTMPA), eine Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure, lösliche Silikate oder Schichtsilikate (z.B. SKS-6 von Hoechst).
Der Gerüststoff kann in Phosphor-haltige und nicht Phosphor-haltige Arten unterteilt werden. Beispiele Phosphor-haltiger anorganischer alkalischer Gerüststoffe umfassen wasserlösliche Salze, insbesondere Alkalimetallpyrophosphate, Orthophosphate, Polyphosphate und Phosphonate. Beispiele nicht Phosphor-haltiger anorganischer Gerüststoffe umfassen wasserlösliche Alkalimetallcarbonate, Borate und Silikate sowie Schichtdisilikate und die verschiedenen wasserunlöslichen kristallinen oder amorphen Alumosilikate, von denen die Zeolite die am besten bekannten Vertreter sind.
Beispiele der geeigneten organischen Gerüststoffe umfassen Alkalimetalle, Ammoniumsalze oder substituierte Ammoniumsalze von Succinaten, Malonaten, Fettsäuremalonaten, Fettsäuresulfonaten, Carboxymethoxysuccinaten, Polyacetaten, Carboxylaten, Polycarboxylaten, Aminopolycarboxylaten und Polyacetylcarboxylaten. Das Waschmittel kann auch unaufgebaut („unbuilt") sein, d.h. um wesentlichen frei an einem Gerüststoff, sein.
Das Waschmittel kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose (CMC), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalcohol) (PVA), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Polymaleate, Malein/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat/Acrylsäure-Copolymere.
Die Waschmittelzusammensetzung kann Bleichmittel des Chlor/Brom-Typs oder des Sauerstoff-Typs enthalten. Das Bleichmittel kann beschichtet oder verkapselt sein.
Beispiele des anorganischen Bleichmittels vom Chlor/Brom-Typ sind Lithium-, Natrium- oder Calciumhypochlorit oder -hypobromit sowie chlorinierte Trinatriumphosphate. Beispiele des organischen Bleichmittels vom Chlor/Brom-Typ sind heterocyclische N-Brom- und N-Chlorimide, wie Trichlorisocyanursäure, Tribromisocyanursäure, Dibromisocyanursäure und Dichlorisocyanursäure und Salze davon mit wasserlöslichen Kationen, wie Kalium und Natrium. Hydantoin-Verbindungen sind auch geeignet. Das Bleichsystem kann auch Peroxysäuren vom z.B. Amid-, Imid- oder Sulfon-Typ umfassen.
Das Bleichmittel vom Sauerstoff-Typ kann ein anorganisches Persalz sein, vorzugsweise mit einem Bleichaktivator, oder eine Peroxysäure-Verbindung. Beispiele der organischen Persalze sind Alkalimetallperborate, sowohl Tetrahydrate als auch Monohydrate, Alkalimetallpercarbonate, Persilicate und Perphosphate. Der Aktivator kann Tetraacetylethylendiamin (TAED) oder Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS) sein.
Die Enzyme der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung können unter Verwendung herkömmlicher Stabilisierungsmittel, z.B. einem Polyol, wie Propylenglycol oder Glycerol, Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure oder einem Borsäurederivat, wie z.B. einen aromatischen Boratester, stabilisiert werden, und die Zusammensetzung kann wie in der WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben formuliert werden. Die Enzyme der Erfindung können auch durch Zugabe reversibler Enzyminhibitoren, z.B. eines Proteintyps wie in der EP 0 544 777 B1 beschrieben stabilisiert werden.
Das Waschmittel kann auch einen anderen konventionellen Waschmittelbestandteil enthalten, wie z.B. einen Gewebezusatzstoff („fabric conditioner"), einschließlich Ton, Entflockungsmaterial, Schaumbooster, schaumunterdrückenden Zusatz, seifenschaumunterdrückenden Zusatz, Antikorrosionsmittel, Flecken-suspendierende Mittel, Anti-Flecken-Redispositionsmittel, Farbstoffe, dehydratisierende Mittel, Baktericide, optische Aufheller oder Parfüme.
Der pH (gemessen in wässriger Lösung bei Anwendungskonzentrationen) wird üblicherweise neutral oder alkalisch sein, z.B. im Bereich von 7–11.
Insbesondere kann die alpha-Amylase der Erfindung in irgendeiner der in der WO 96/23873 beschriebenen Waschmittelformulierungen vorliegen.
Die alpha-Amylase der Erfindung kann in Konzentrationen vorliegen, die üblicherweise in Waschmitteln eingesetzt werden. Es wird gegenwärtig ins Auge gefasst, dass in der Waschmittelzusammensetzung der Erfindung die alpha-Amylase in einer Menge zugegeben werden kann, die 0,00001–1 mg (berechnet als reines Enzymprotein) der alpha-Amylase pro Liter Waschflüssigkeit entspricht.
Die vorliegende Erfindung wir weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die nicht dazu gedacht sind, in irgendeiner Weise den Umfang der Erfindung, wie sie beansprucht wird, einzuschränken.
BEISPIELE
Wirtsorganismus:
Escherichia coli SJ2 wird in Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (1990) Journal of Bacteriology, Bd. 172, Nr. 8, Seiten 4315-4321 beschrieben.
Plasmide:
Der Genbankvektor war pSJ1678, der weiter in der WO 04/19454 offenbart ist, die durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
Der Genbankvektor pSJ1678 wird weiter in der WO 94/19454 offenbart, die durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
Modellwaschmittel:
Das A/P (Asien/Pazifik)-Modellwaschmittel hat die folgende Zusammensetzung: 20% STPP (Natriumtripolyphosphat), 25% Na₂SO₄, 15% Na₂CO₃, 20% LAS (lineares Alkylbenzolsulfonat, Nanso 80S), 5% C₁₂-C₁₅-Alkoholethoxylat (Dobanol 25-7), 5% Na₂Si₂O₅, 0,3% NaCl.
Beispiel 1
Klonieren der alpha-Amylase in E.coli
DNA wurde vom Bacillus sp. NCIMB 40916 mittels des Verfahrens von Pitcher, D.G., Saunders, N.A. und Owen, R.J. (1989) Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156 isoliert. Chromosomale DNA wurde partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3AI verdaut. Fragmente wurden in die BamHI-Stelle des Klonierungsvektors pSJ1678 kloniert, wie in 4 dargestellt, und in Escherichia coli SJ2 transformier, wodurch eine Genbibliothek von Bacillus sp. NCIMB 40916 kreiert wurde.
Diese Genbibliothek wurde hinsichtlich der alpha-Amylase-Aktivität gescreent, und der Stamm, der eine alpha-Amylase-Aktivität zeigt, wurden als Escherichia coli Stamm NN049489 bezeichnet, der die alpha-Amylase der Erfindung umfasst. Dieser Stamm wurde hinterlegt und hat die Zugangsnummer DSM13001 erhalten. Der Escherichia coli-Stamm NN049489, der das Plasmid enthielt, das als pJA386 bezeichnet wird, das die alpha-Amylase kodiert, wurde für die DNA-Sequenzierung verwendet.
Beispiel 2
Sequenzieren der DNA und der alpha-Amylase
Das alpha-Amylase-Gen, das in das Plasmid pJA386 kloniert war, wurde durch DNA-Sequenzierung durch Primerwalking („primer walking") charakterisiert, wobei das Taq-Deoxyterminal-Zyklus-Sequenzierungs-Kit (Perkin Elmer, USA), fluoreszenzmarkierte Terminatoren und geeignete Oligonucleotide als Primer verwendet wurden.
Die Analyse der Sequenzdaten erfolgte gemäß Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387–395. Die Sequenz entspricht der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz. Die vorhergesagte Proteinsequenz der alpha-Amylase einschließlich dem Signalpeptid und der reifen Amylase sind in der SEQ ID NO: 2 dargestellt, Die abgeleitete N-terminale Sequenz wurde durch Sequenzieren der 34 Aminosäuren am N-Terminus des Proteins verifiziert.
Beispiel 3
Herstellung von alpha-Amylase
E. coli NN049489 (DSM 13001), der das Plasmid pJA386 aufweist, wurde über Nacht in einer LB-Brühe mit Chloramphenicol 10 μg/ml, 37°C, 250 U/min. kultiviert. Zellen wurden aus 2,7 l Kulturbrühe durch Zentrifugation bei 6 000 U/min während 15 Minuten geerntet. Die intrazellulär lokalisierte Amylase wurde aus den Zellen freigesetzt, in dem das folgende Osmose-Schock-Verfahren angewendet wurde:

1) Zellen wurden resuspendiert und gewaschen in 500 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 (EKV-Puffer), gefolgt von einer Zentrifugation.
2) Zellen wurden in 75 ml 20% Sucrose, 30 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA resuspendiet und Lysozym auf eine Konzentration von 5 mg/ml zugegeben.
3) Die Lösung wurde während 15 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation. Der Hauptteil der Amylase war nun im Überstand enthalten.

Der Überstand wurde über Nacht gegen 10 l in EKV-Puffer mit 1 Pufferwechsel dialysiert, um die hohe Succrosekonzentration zu vermindern. Die Lösung wurde durch einen 0,45 micro m Membranvakuumfilter filtriert.
Die Enzymlösung wurde auf eine Pharmacia Q Sepharose-Säule FF aufgetragen, die vorher mit EKV-Puffer, pH 7 äqulibriert wurde, und die Säule wurde mit EKV-Puffer gewaschen. Gebundenes Protein wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0–500 mM über 10 Säulenvolumen eluiert. Amylase-haltige Fraktionen wurden vereinigt und über Nacht gegen EKV-Puffer dialysiert.
Die Lösung wurde dann auf eine Q Sepharose-Säule FF aufgebracht, die vorher mit EKV-Puffer, pH 8 äqulibiriert wurde, die Säule wurde mit EKV-Puffer gewaschen, und die Amylase wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0–500 mM über 10 Säulenvolumen eluiert. Amylase-haltige Fraktionen wurden vereinigt.
Eine Phenyl-Superose-Säule, die vorher mit EKV-Puffer, pH 8, der 1 M Ammoniumsulfat enthielt, äquilibiriert wurde, wurde mit der Enzymlösung beladen, zu der Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 1 M gegeben wurde. Ungebundenes Material wurde mit den Ammoniumsulfatpuffer ausgewaschen, und die Säule wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 1–0 M Ammoniumsulfat über 20 Säulenvolumen eluiert. Amylase-haltige Fraktionen wurden vereinigt.
Die gereinigte Amylase wurde mittels SDS-PAGE analysiert, und nur eine Bande wurde nach dem Färben mit Coomasie-Blau erhalten.
Beispiel 4
Waschtest
Die Waschleistung wurde durch Waschen verschmutzter Teststoffproben während 15 Minuten bei 25°C in einer Waschmittellösung mit der alpha-Amylase der Erfindung beurteilt.
Das verwendete Waschmittel war das A/P-Modellwaschmittel, das vorstehend beschrieben wurde, mit 3 g/l mit einem pH von 10,5 oder ein kommerzielles Waschmittel aus Malasien (FAB Total von Colgate) mit 3 g/l mit einem pH von etwa 9,7. Die gereinigte Amylase aus Beispiel 3 wurde zu der Waschmittellösung in der oben angegebenen Konzentration zugegeben. Die Stoffproben waren mit Orangen-Reisstärke („orange rice starch") (CS-28-Stoffprobe, erhältlich von CFT, Center for Test Material, Holland) verschmutzt.
Nach dem Waschen wurden die Stoffproben beurteilt, in dem die Remission bei 460 nm gemessen wurde. Die Ergebnisse sind als ΔR = Remission der Stoffprobe, gewaschen mit der alpha-Amylase, minus der Remission der Stoffprobe, die unter den gleichen Bedingungen ohne alpha-Amylase gewaschen wurde, ausgedrückt.
Die Ergebnisse sind in den 5 und 6 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die alpha-Amylase der Erfindung in beiden Waschmitteln bei hoch alkalischem pH wirksam ist.
SEQENZPROTOKOLL

Claims

Alpha-Amylase mit erhöhter Leistung in alkalischen Lösungen, die a) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz wie in den Positionen 1-556 von SEQ ID Nr. 2 gezeigt, oder b) ein Polypeptid, das durch den alpha-Amylase kodierenden Teil der DNA-Sequenz kodiert ist, die in ein in Escherichia coli DSM 13001 (NN049489) vorliegendes Plasmid geklont ist, oder c) ein Polypeptid, das einen Identitätsgrad von mindestens 60% mit dem in (a) oder (b) definierten Polypeptid aufweist; ist mit der Maßgabe, dass das Polypeptid nicht eine Aminosäuresequenz, wie in den Positionen 32-532 von SEQ ID Nr. 2 gezeigt, die in WO 99/42567 offenbart ist, oder ein Analog davon, das mindestens 60% homolog zu dem Polypeptid ist, besitzt.
Alpha-Amylase nach Anspruch 1, die eine Aktivität bei pH 10,5 aufweist, die mindestens zweimal höher ist als die Aktivität bei pH 7,3, wenn bei 37°C gemessen wird.
Alpha-Amylase nach Anspruch 1 oder 2, die eine Aktivität bei pH 9,5 aufweist, die mindestens viermal höher ist als die Aktivität bei pH 7,3, wenn bei 37°C gemessen wird.
Alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch, die ein pH Optimum von etwa 9,5 aufweist, wenn bei 37°C gemessen wird.
Alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch, die aus einem Stamm von Bacillus, vorzugsweise Bacillus sp. NCIMB 40916, ist.
Alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch, die mehr als 90% ihrer Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 25°C in einer Lösung von 3 g/l eines Test-Waschmittels beibehält, enthaltend 20% STPP, 25% Na₂SO₄, 15% Na₂CO₃, 20% LAS, 5% C12-C15 Alkoholethoxylat, 5% Na₂Si₂O₅, 0,3% NaCl bei pH 10,5 und Deutscher Härtegrad 6 und weniger als 90% ihrer Aktivität nach 20 Minuten Inkubation bei 30°C in der gleichen Lösung beibehält.
Alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch, die ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa aufweist, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
Alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch, die einen isoelektrischen Punkt von etwa 5 aufweist, wie durch Isoelektrische Fokussierung bestimmt.
Alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch, in der Form eines Waschmittelzusatzes, dass ein nicht staubendes Granulat oder eine stabilisierte Flüssigkeit ist.
Isolierte DNA-Sequenz, die die alpha-Amylase nach einem vorangehenden Anspruch kodiert.
DNA-Sequenz nach Anspruch 10, die: a) eine DNA-Sequenz in den Positionen 94-1764 von SEQ ID Nr. 1 gezeigt, oder b) eine alpha-Amylase, die einen kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die in ein in Escherichia coli DSM 13001 (NN049489) vorliegendes Plasmid geklont ist, oder c) eine DNA-Sequenz, die einen Identitätsgrad von mindestens 60% mit der in (a) oder (b) bestimmten DNA-Sequenz aufweist; umfasst mit der Maßgabe, dass die DNA-Sequenz nicht eine DNA-Sequenz, in den Positionen 94-1596 von SEQ ID Nr. 1 gezeigt, die in WO 99/42567 offenbart ist, oder ein Analog davon, das mindestens 60% homolog zu der DNA-Sequenz ist, besitzt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11, die von einem Bakterium, vorzugsweise von Bacillus, besonders bevorzugt aus dem Stamm NCIMB 40916 ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 10–12.
Zelle, die mit der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 10–12 oder dem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 13 transformiert ist.
Zelle nach Anspruch 14, die eine prokaryontische Zelle ist, insbesondere eine Bakterienzelle oder eine endogene Zelle, von der die DNA-Sequenz stammt.
Zelle nach Anspruch 15, wobei die Zelle zu Bacillus oder Escherichia, vorzugsweise E. coli, gehört.
Verfahren zur Herstellung einer alpha-Amylase, umfassend das Kultivieren einer Zelle nach einem der Ansprüche 14–16, unter Bedingungen, die die Herstellung der alpha-Amylase erlauben, und Gewinnen der alpha-Amylase aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung einer alpha-Amylase nach einem der Ansprüche 1–9, umfassend das Kultivieren eines amylaseherstellenden Stamms von Bacillus in einem geeigneten Nährstoffmedium und Gewinnen der alpha-Amylase aus der Kultur.
Waschmittelzusammensetzung, umfassend eine alpha-Amylase nach einem der Ansprüche 1–9 und ein Tensid.
Waschmittelzusammensetzung nach dem vorangehenden Anspruch, die einen pH von 8,5–11 in wässriger Lösung aufweist, vorzugsweise pH 9–10,5.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, die ein Haushaltswaschmittel ist.