DE60031098T2 - Sich nicht verbreitendes pestivirus - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft Impfstoffe, die zur Vernichtung oder Kontrolle von pestiviralen Infektionen eingesetzt werden, insbesondere für solche in Schweinen oder Wiederkäuern.
  • Die Gattung Pestivirus der Familie Flaviviridae besteht herkömmlich aus dem klassischen Schweinepestvirus (conventional swine fever virus CSFV), dem Border Disease Virus (BDV) und dem rinderviralen Diarrhöevirus (bovine viral diarrhoea virus BVDV). Die Genome von verschiedenen BVDV, BDV und CSFV Stämmen wurden sequenziert, individuelle pestivirale Proteine wurden exprimiert und Viren wurden generiert, die sich von den DNA Kopien voller Länge des RNA Genoms aus BVDV und CSFV ableiten (Renard et al., 1987 EP Anmeldung 0208672; Collett et al., 1988, Virology 165, 191–199; Mendez et al., J. Virol. 72: 4737–4745, 1988; Deng und Brock, 1992, Virology, 1991, 865–679; Meyers et al., 1989, Virology 171, 555–567; Moormann et al., 1990, Virology 177, 184–188; Meyers et al., 1989, EP 89104921 ; Moormann und Wensvoort, 1989, PCT/NL90/00092; Moormann und Van Rijn; 1994, PCT/NL95/00214; Ridpath et al., 1997, Virus Res. 50: 237–243; Becker et al., 1998, J. Virol. 72: 5165–5173, Meyers et al., J. Virol. 70: 1588–1595, 1996).
  • Das pestivirale Genom ist ein Positivstrang RNA-Molekül einer Länge von 12,5 Kilobasen und umfasst einen großen offenen Leserahmen. Der offene Leserahmen wird zu einem hypothetischen Polyprotein von etwa 4000 Aminosäuren translatiert, das durch virus- und zellkodierte Proteasen weiter prozessiert wird. Der offene Leserahmen wird durch zwei konservierte nicht translatierte Regionen flankiert, die wahrscheinlich an der Replikation des Genoms beteiligt sind. Die 5' nicht kodierende Region spielt ebenfalls eine Rolle in der Translationsinitiierung.
  • Das Polyprotein, das co- und posttranslational, durch zellulare und virale Proteasen prozessiert wird, umfasst alle viralen strukturellen und nicht strukturellen Proteine (als Übersichtsartikel siehe C. M. Rice: In Fields Virology, Third Edition, 1996 Flaviviridae: The Viruses and their Replication: Kapitel 30: S. 931–959). Die viralen Strukturproteine, das Capsidprotein C und die Hüllproteine Erns, E1 und E2, sind im N-terminalen Teil des Polyproteins angeordnet. Die nicht strukturellen Proteine darunter, die Serinprotease NS3 und der RNA Replikasekomplexe NS5A und NS5B, sind im C-terminalen Teil des Polyproteins angeordnet.
  • Pestiviren sind strukturell und aufgrund ihrer Antigenizität eng miteinander verwandt. Bis heute wurden Pestiviren, beispielsweise BDV, BVDV und CSFV, aus verschiedenen Spezies isoliert, vor allem aus Wiederkäuern und Schweinen, aber auch über Infektionen von Menschen wurde berichtet. Alle Pestiviren haben im Allgemeinen die Fähigkeit, kongenitale Infektionen von Föten zu induzieren, wenn ein trächtiges Tier infiziert ist. Derartige fötale Infektionen erfolgen über transplazentale Infektionen, wenn das Muttertier einer akuten Infektion während der Trächtigkeit durchläuft oder wenn es persistent mit einem Pestivirus infiziert ist (Oirschot, J. T. van Vet. Microbiol. 4: 117–132, 1979; Baker J. C., JAVMA 190: 1449–1458, 1987; Nettleton P. F. et al., Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 15: 179–188, 1992, Wensvoort G. und Terpstra C. Res. Vet. Sci. 45: 143–148, 1988).
  • Zurzeit sind modifizierte Lebendimpfstoffe, Totimpfstoffe oder als Unterheiten vorliegende Pestivirusimpfstoffe erhältlich. Lebendvirusimpfstoffe haben den Vorteil gegenüber anderen Typen von Impfstoffen, dass sie höhere Niveaus einer Immunität erreichen ohne das Erfordernis einer Booster-Impfung. Jedoch umfassen die Nachteile die Fähigkeit der Impfstämme, die Plazenta zu passieren und alle bekannten Folgen einer fötalen Pestivirusinfektion zu induzieren (Liess B et al., Zentralblad Veterinarmed. (B) 31: 669–681, 1984). Des Weiteren wurde berichtet, dass modifizierte Lebendimpfstoffen des Pestivirus immunsuppresive Effekte verursachen, wahrscheinlich gemäß ihrer Fähigkeit, sich durch das geimpfte Tier auszubreiten und sich für mehrere Tage in Lymphozyten und Neutrophilen zu replizieren und dadurch Leukopenie und eine horizontale Ausbreitung zu verursachen (Roth J. A. und Kaeberle M. L., Am. J. Vet. Res. 44: 2366–2372, 1983). Darüber hinaus wurde von Tierseuchen bezüglich der „Mucosal Disease" (eine Folge einer persistenten BVDV Infektion) sowie akuter BVDV Infektion nach der Impfung mit lebenden Virusimpfstoffen berichtet (Lambert G., JAVMA 163: 874–876, 1973).
  • Somit sind trotz der Tatsache, dass bei Lebendimpfstoffen allgemein davon ausgegangen wird, dass sie die besten immunologischen Eigenschaften haben, deutliche Nachteile darin zu erkennen einen lebenden Pestivirusimpfstoff für die Kontrolle und Ausrottung von Pestivirusinfektionen zu verwenden.
  • Diese Nachteile beziehen sich auf die Tatsache, dass ein konventioneller lebender Pestivirusimpfstoff nach der Inokulation eines Tieres mit dem Impfstoff, mehrere Replikationszyklen durchläuft und sich in dem geimpften Tier ausbreitet. Einerseits kann dies in dem oben berichteten Absondern des Virus (horizontale Ausbreitung) resultieren, die alles in allem ein übliches Ergebnis jeder viralen Infektion ist, wodurch ein Tier mit dem Virus infiziert wird und wonach sich das Virus repliziert, und sich durch den Körper ausbreitet, sich wieder repliziert und gegebenenfalls von dem infizierten Tier weiter abgesondert wird, um sich auszubreiten und ein zweites kontaktiertes Tier zu infizieren.
  • Weitaus ernster sind jedoch kongenitale Infektionen mit Pestiviren, die die so genannte vertikale Ausbreitung verursachen. Föten werden infiziert, wenn das Virus sich durch den Körper eines trächtigen Tieres ausbreitet und das Virus die transplazentale Grenze überquert. Abhängig von dem Stadium der Trächtigkeit und der Virulenz des infizierenden Virus können verschiedene Effekte festgestellt werden. Schwerwiegende Effekte umfassen den Tod der Embryos oder der Föten, Missbildungen, Mumifizierung, Totgeburt, perinatale Sterblichkeit (Liess B, Vol 2 Disease Monographs (E. P. J. Gibss, Editor) Academic Press, London. S. 627–650, 1982). Weniger virulente Virusinfektionen oder Infektionen, die in einem späteren Stadium der Trächtigkeit auftreten, führen üblicherweise zu der Geburt einer kongenital infizierten Nachkommenschaft (van Oirschot J. T. in: Classical swine fever and related viral infections B. Liess (ed) Martinus Nijhoff Publishing Boston S. 1–25, 1988), beispielsweise von Kälbern, Lämmern oder Ferkeln, die im Allgemeinen persistent für ihr Leben infiziert sind, die nicht gut gedeihen, anfällig für Immunsuppression und (vor klinische Krankheiten sind (wie beispielsweise die „Mucosal Disease" mit BVDV) (Brownlie J Arch. Virol. [Suppl. 31: 73–96, 1991]), und die nicht zuletzt eine dauerhafte Quelle von Infektionen für den Rest der Population darstellen.
  • Die Erfindung stellt pestivirusartige Partikel bereit und einen modifizierten lebenden Pestivirusimpfstoff bereit, der eine Nukleinsäure oder die genannten Partikel umfasst, und der imstande ist, eine geeignete Immunantwort auszulösen ohne die Fähigkeit zu besitzen, sich durch das geimpfte Tier auszubreiten, wodurch die negativen Folgen der viralen Ausbreitung vermieden werden. Vorteilhafterweise erlaubt die Immunantwort eine serologische Unterscheidung zwischen geimpften Tieren und solchen Tieren, die mit dem wildtypischen Pestivirus infiziert sind.
  • Die virale Ausbreitung oder die Ausbreitung von viraler Nukleinsäure in einem inokulierten Tier könnte in der Theorie auch verhütet werden indem die Inokulation des Tieres mit defekten Pestiviruspartikeln, so genannten „defective interfering particle" (DI-Partikel) erfolgt, wie es beispielsweise von Meyers et al. bekannt ist (J. Virol. 70: 1588–1595, 1996) oder von Kupfermann et al. J. Virol. 70: 8175–8181, 1996), wenn man die DI-Partikel erhalten könnte, die frei von dem Helfer-Pestivirus sind, das für die Replikation erforderlich ist, was aber für alle praktischen Zwecke beinahe unmöglich ist. Die Inokulation eines Tieres mit einem DI Präparat, das das Helfervirus beinhaltet, würde alle Ziele zunichte machen, denn das Helfervirus würde sich durch das Tier ausbreiten, und es dadurch einer unerwünschten Pestivirusinfektion aussetzten sowie dabei eine horizontale und vertikale Transmission erlauben. Eine serologische Unterscheidung ist somit auch nicht möglich, da die Antikörper, die gegen das Helfervirus gerichtet sind, detektiert würden.
  • Selbst wenn man Erfolg haben würde, DI-Partikel frei von dem Helfervirus zu erhalten, würde dies nichts bringen, die pestiviralen DI-Partikel umfassen keine Nukleinsäure, welche es erlaubt, eine geeignete Immunantwort auszulösen, da die DI-Nukleinsäure im Wesentlichen keine Nukleinsäure zur Codierung der Strukturproteine oder immundominanter Teile dieser umfasst, welche für die genannte Immunantwort verantwortlich sind.
  • In einer ersten Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf eine rekombinante Nukleinsäure, die von einem Pestivirus abgeleitet ist, von dessen Nukleinsäure ein Fragment funktionell deletiert worden ist, das wenigstens für ein pestivirales Protein oder einen wesentlichen Teil von diesem codiert, das sich auf die virale Ausbreitung bezieht, sowie darauf, dass die genannte Nukleinsäure die RNA Replikation in einer geeigneten Zelle ermöglicht und wenigstens für ein funktionelles Strukturprotein oder zumindest einen immunodominanten Teil hiervon codiert.
  • Die funktionelle Deletion umfasst hierbei jede Insertion, jede Modifikation oder Deletion des viralen Genoms, das (über Transkription und Translation der Nukleinsäure in einer Zelle, bevorzugt in einer Zelle, die geeignet für die Transkription und Translation der genannten Nukleinsäure ist, bevorzugt eine Zelle in einem Tier, das geimpft wird) in der Produktion eines, zumindest funktionell, inaktivierten viralen Proteins oder eines Fragments hiervon resultiert, das in dessen wildtypischen Zustand an der virale Ausbreitung beteiligt ist oder zumindest an der Transmission zu oder der viralen Infektion von Zellen. Wegen dieses inaktivierten Proteins, selbst wenn es sogar in das virale Partikel, das die genannte Nukleinsäure umfasst, aufgenommen ist, hat die genannte funktionelle Deletion das genannte Partikel außer Stande gesetzt, in eine Zelle einzudringen oder eine Zelle zu infizieren, die normalerweise durch das Partikel infiziert würde, wäre das Protein oder das funktionelle Fragment in dem Partikel in korrekter Weise funktionsfähig gewesen. Obwohl das Partikel jetzt noch gebildet werden kann, ist das genannte Partikel auf diese Weise nicht mehr für andere Zellen infektiös und kann somit nicht länger über den Weg der Infektion zu einer Ausbreitung oder Transmission dieses Partikels zu einer anderen Zelle beitragen, ungeachtet der Tatsache, dass sich eine einmal infiziert Zelle verbinden und/oder teilen kann, und dadurch mehrere Zellen erzeugt, die die genannten Partikel beinhalten.
  • Die genannte Nukleinsäure ermöglicht die RNA Replikation in einer geeigneten Zelle und codiert wenigstens ein funktionelles Schutzprotein oder zumindest einen immunodominanten Teil hiervon. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung stellt das Schutzprotein ein Strukturprotein dar, im Allgemeinen bauen die immunodominanten Teile der strukturellen Hüllproteine die beste Immunantwort auf, allerdings sind einige nicht strukturellen Proteine, wie beispielsweise NS3, genauso fähig eine geeignete Immunantwort für einige Zwecke aufzubauen und können daher genauso umfasst sein. Obwohl die Ausbreitung durch die Infektion nun verhütet wurde, erlaubt somit die Tatsache, dass eine RNA Replikation möglich ist, in der genannten Zelle einen Zyklus oder mehrere Zyklen der Transkription und Translation der immunologisch dominanten Proteine, gegen die ein geimpftes Tier eine Immunantwort aufbaut, durch welche es zumindest teilweise gegen die Folgen der Infektion mit dem wildtypischen Pestivirus geschützt ist. Das bzw. die translatierte(n) Protein(e) oder Fragment(e) hiervon ist/sind an sich verantwortlich für die genannte Immunantwort und können auch Teil eines pestivirusartigen Partikels werden, sogar die replizierte RNA umfassen, aber das genannte Partikel ist nicht infektiös aufgrund der Tatsache, dass ein wesentliches funktionelles Merkmal des funktionell deletierten Proteins fehlt.
  • Obwohl die Nukleinsäure, wie hier beschrieben, in einer Ausgestaltung DNA umfassen kann, um eine DNA Impfung zu ermöglichen, bezieht sich die Erfindung in einer anderen Ausgestaltung auf eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine RNA darstellt, um eine RNA Impfung zu ermöglichen. Eine solche RNA ist zum Beispiel in einem pestivirusartigen Partikel in einer komplementierenden Zelle verpackt, wie durch die Erfindung bereitgestellt, mit einem funktionellen Protein oder Fragment (abgeleitet von der komplementierenden Zelle) bereitgestellt und verantwortlich für die Wechselwirkung von Virus und Zelle, die es dem genannten Partikel erlauben, in eine geeignete Zelle einzudringen oder eine geeignete Zelle zu infizieren, oder sie kann in die Zellen eines Tieres anderweitig eingeführt werden, wie zum Beispiel auf intradermalem Weg.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf eine Nukleinsäure, wobei sich die genannte funktionelle Deletion in einem Fragment befindet, das für ein Hüllprotein codiert. Wesentlich für die Infektion mit Pestiviren ist die Interaktion von viralen Strukturproteinen mit der Oberfläche oder einem Rezeptor einer empfänglichen Zellen. Durch diese Interaktion findet die Infektion statt. Insbesondere Hüllproteine E2 und/oder Erns sorgen für diese Interaktion und die funktionelle Deletion zumindest eines dieser Hüllproteine oder funktioneller Fragmente hiervon (insbesondere solcher Fragmente, die an einer Wechselwirkung mit einem Rezeptor oder der Oberflächen beteiligt sind) führt zu einer Verhinderung einer Infektiosität.
  • Verschiedene Beispiele solcher funktioneller Deletionen in einer Nukleinsäure, die für ein Protein codiert, das auf eine virale Ausbreitung bezogen ist, werden in der detaillierten Beschreibung der Erfindung gegeben. Ein Beispiel umfasst eine Modifikation eines Cystein codierenden Nukleinsäure Kodons, wobei eine Konformationsverändeung in einem Fragment eines pestiviralen Proteins, bevorzugt eines Hüllproteins, derart induziert wird, dass das genannte funktionell deletierte Protein, wenn es in das genannte Partikel eingebracht ist, das genannte Partikel außer Stande bringt, in eine auf andere Weise zugängliche Zelle einzudringen. Ein Beispiel umfasst die Modifikation eines Kodons, das in einem Cysteinaustausch resultiert, zum Beispiel an der Aminosäureposition 422, oder zum selben Zweck an Position 381, an der Aminosäuresequenz des Erns Proteins von CSFV oder an funktionell korrespondierenden Orten in dem Erns Protein von CSFV oder anderen Pestiviren, die zum Beispiel durch den Sequenzvergleich erhalten werden, die ebenfalls gemäß der Erfindung vorgesehen sind. Ein weiteres Beispiel umfasst das Deletieren größerer Fragmente einer Nukleinsäure, die ein pestivirales Protein codiert, zum Beispiel durch das Entfernen wenigstens eines Fragments, das die annähernd korrespondierenden Positionen 170–268 oder andere funktionell verwandte Fragmente des Capsid Proteins C von CSFV oder anderer Pestiviren codiert, oder durch das Entfernen wenigstens eines Fragments, das die annähernd korrespondierenden Positionen 500–665 oder andere funktionell ähnlicher Fragmente des E1 Proteins von CSFV oder anderer Pestiviren codiert, oder es umfasst das Entfernen von codierenden Fragmenten etc. etc. Ein weiteres Beispiel umfasst das Entfernen größerer Fragmente einer Nukleinsäure, die ein pestivirales Protein codiert, zum Beispiel durch das Entfernen wenigstens eines Fragments, das die korrespondierenden Positionen 381, 422, 381–422, 405–436, 422–436, 422–488 oder 273–488 oder andere funktionell ähnlicher Fragmente des Erns Proteins von CSFV oder anderer Pestiviren codiert, oder es umfasst das Entfernen von Fragmenten, die die korrespondierenden Positionen 698–1008 oder 689–1062 in dem E2 Protein von CSFV oder anderer funktionell bezogener Fragmente des E2 Proteins von CSFV oder anderer Pestiviren codieren.
  • In einer sehr bevorzugten Ausgestaltungen bezieht sich die Erfindung auf eine Nukleinsäure, bei der die besagte funktionelle Deletion einen immunodominanten Teil des genannten Proteins umfasst. Zum Beispiel hat die Deletion eines Fragments, das zu Aminosäurepositionen 422–436 oder 422–488 des Erns Proteins korrespondiert oder das zu Aminosäurepositionen 693–746, 785–870, 689–870 oder 800–864 des E2 Proteins oder zu jedem anderen Fragment korrespondiert, das sich auf eine unterscheidbare Immunantwort gegen das genannte Protein bezieht, den zusätzlichen Vorteil, dass ein unterscheidbarer Impfstoff bereitgestellt wird.
  • Durch das Deletieren des genannten serologisch unterscheidbaren Fragments wird am Ende ein Markerimpfstoff erhalten, der eine serologische Unterscheidung zwischen geimpften Tieren und Tieren, die mit einem wildtypischen Pestivirus infiziert sind, erlaubt.
  • Bei der Konstruktion eines Impfstoffs hat man zu berücksichtigen, welche(r) (Art von) serologische(m) Test bevorzugt wird, sobald der Impfstoff im Feld zum Einsatz gelangt. Für CSFV sollte er bevorzugt spezifisch für den Genotyp sein, was die Verwendung von diagnostischen Tests, die auf NS3 basieren, blockiert. Allerdings behindert die die Auswahl von E2 oder Erns als diagnostische Antigene die Entwicklung eines Impfstoffs, die die schützenden Eigenschaften dieser Proteine nutzt. Die Erfindung stellt überraschenderweise einen Pestivirusimpfstoff bereit, in welchem ein Protein, bevorzugt ein Hüllprotein, das einen spezifischen immunodominanten Teil umfasst, der im Allgemeinen als verantwortlich für die Generierung des Schutzes angesehen wird, funktionell deletiert wurde, um eine serologische Unterscheidung zu erlauben, überraschenderweise ohne die schützenden Eigenschaften ernsthaft zu behindern.
  • Die genannten schützenden Eigenschaften werden in optimaler Weise durch eine Nukleinsäure bereitgestellt, die, wie hier beschrieben, ein Fragment beinhaltet, das ein schützendes Protein codiert, welches ein funktionelles Strukturprotein und besonders bevorzugt ein funktionelles Hüllprotein ist oder zumindest einen immunodominanten Teil hiervon darstellt. Am meisten bevorzugt gemäß der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die ein Fragment umfasst, das für eine funktionelle Deletion in einem pestiviralen Hüllprotein codiert, zum Beispiel E2 oder Erns, und die weiterhin eine Nukleinsäure umfasst, die für ein anderes schützendes Hüllprotein codiert oder einen immunodominanten Teil hiervon, zum Beispiel Erns oder E2 oder Teile hiervon.
  • In einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf eine Nukleinsäure, die zusätzlich ein nicht pestivirales Nukleinsäurefragment aufweist und sich dabei auf eine Nukleinsäure bezieht, die für ein heterologes Protein oder Fragmente hiervon codiert. Heterologe Proteine oder ihre Fragmente können als Marker eingesetzt werden oder, um eine (schützende) Immunantwort auszulösen. Markersequenzen weisen bevorzugt eine hohe Antigenizität auf und sind in einer Ausgestaltung der Erfindung bevorzugt abgeleitet aus einem (Mikro)Organismus, der in Tieren nicht repliziert wird. Sie können bekannte vollständige Genprodukte codieren (zum Beispiel Capsid oder Hüllproteine oder antigene Teile der Genprodukte, zum Beispiel Epitope). Markersequenzen können auch künstliche Antigene codieren, die normalerweise nicht in der Natur anzutreffen sind, oder histochemische Marker wie β-Galaktosidase aus Escherichia coli, Alkoholdehydrogenase aus Drosophila, humane plazentale alkalische Phosphatase, Luciferase und Chloramphenicol-Acetyltransferase aus Glühwürmchen. Zudem bezieht sich die Erfindung auf eine Nukleinsäure, worin das genannte nicht pestivirale Fragment aus einem Erreger abgeleitet wird, der ein oder mehrere Proteine oder Fragmente codiert, die eine schützende Immunität gegen Krankheiten, die durch den Erreger verursacht werden, induzieren, wie beispielsweise ein Fragment abgeleitet von einem Parvovirus, Coronavirus, porcines Atemwegs- und Reproduktionssyndrom Virus, Herpesvirus, Influenzavirus und zahlreichen anderen Erregern, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Ferner bezieht sich die Erfindung auch auf eine Nukleinsäure, worin das genannte nicht pestivirale Fragment aus einem Cytokin abgeleitet ist, das, wenn es exprimiert wird, immunoregulierende oder -stimulierende Signale induziert. Zahlreiche Cytokine sind in diesem Fachgebiet bekannt, wie beispielsweise Interleukine, Interferone und Tumornekrosefaktoren oder Kolonie-stimulierende Faktoren.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Nukleinsäure, wie hier beschrieben, wobei die genannte geeignete Zelle ein Nukleinsäurekonstrukt aufweist, das wenigstens ein pestivirales Protein oder einen wesentlichen, auf die virale Ausbreitung bezogenen Teil hiervon codiert. Eine derartig geeignete Zelle stellt eine Zelle dar, die eine rekombinante Nukleinsäure aufweist, die wenigstens für ein pestivirales Protein oder einen wesentlichen, auf die virale Ausbreitung bezogenen Teil hiervon codiert und das Verpacken des genannten pestiviralen Proteins oder eines wesentlichen Teils hiervon in einem pestivirusartigen Partikel erlaubt. Eine derartige verpackende oder komplementierende Zelle ermöglicht erfindungsgemäß einer Nukleinsäure oder einer replizierten Nukleinsäure, wie hier beschrieben, Teil eines pestivirusartigen Partikels zu sein, bei dem ein wesentlicher Teil der Protein(e) (Fragmente), die das genannte Partikel zusammensetzen, aus der Translation und Transkription einer hier beschriebenen Nukleinsäure in der genannten Zelle abgeleitet sind und durch ein auf die virale Ausbreitung bezogenes Protein (Fragment) komplementiert werden, das sich von Nukleinsäurekonstrukt ableitet, das auch in der genannten komplementierenden Zelle exprimiert wird. Ein derartiges Protein oder ein wesentlicher auf die virale Ausbreitung bezogener Teil hiervon wird stabil, entweder induzierbar oder konstitutiv von einer Nukleinsäure exprimiert, die in dem zellularen Genom integriert ist.
  • Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Erhalt eines pestivirusartigen Partikels bereit, welches das Transfizieren einer Zelle, gemäß der Erfindung, mit einer Nukleinsäure, gemäß der Erfindung, umfasst, welches weiter umfasst, es der genannten Nukleinsäure zu ermöglichen, sich in der genannten Zelle zu replizieren, welches weiter umfasst, es der Nukleinsäure zu ermöglichen, der Teil eines Partikels zu sein, der wenigstens das genannte pestivirale Protein oder einen von der Zelle abgeleiteten Teil hiervon beinhaltet, und welches weiter umfasst, den genannten Partikels abzuernten. Solch ein Einsatz einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung oder einer Zelle gemäß der Erfindung bei der Produktion eines pestivirusartigen Partikels wird durch die Erfindung bereitgestellt. Durch das Transfizieren der genannten Zelle mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und dadurch, dass es der Nukleinsäure ermöglicht wird, zu replizieren, wird eine Replikat RNA der genannten Nukleinsäure in dem genannten pestivirusartigen Partikel verpackt, wobei das genannte Partikel auch ein funktionelles Protein oder einen Satz von auf die virale Ausbreitung bezogenen Proteinen umfasst, die zumindest teilweise von dem Nukleinsäurekonstrukt abgeleitet sind, mit welchem die genannte komplementierende Zelle ebenfalls bereitgestellt wurde. Ebenso stellt die Erfindung ein pestivirusartiges Partikel bereit, das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich ist, zum Beispiel stellt die Erfindung ein pestivirusartiges Partikel (oder eine Vielzahl solcher Partikel) bereit, das eine von einem Pestivirus abgeleitete Nukleinsäure umfasst, aus welcher ein Fragment funktionell deletiert wird, wobei zumindest ein pestivirales Protein oder ein wesentlicher, auf eine virale Ausbreitung bezogener Teil hiervon codiert wird, wobei die genannte Nukleinsäure die RNA Replikation in einer geeigneten Zelle ermöglicht und zumindest ein funktionelles Strukturprotein oder zumindest einen immunodominanten Teil eines immunodominanten Strukturproteins codiert. Das genannte Partikel kann von einem Typ eines Pestivirus abgeleitet werden oder es kann ebenfalls ein sogenanntes Hybridpartikel darstellen, bei dem sich dessen Genom und Teile dessen konstituierender Proteine (Fragmente) von einem Typ Pestvirus, wie zum Beispiel BVDV oder BDV, ableiten, während sich die komplementierenden Proteine (Fragmente) von einem anderen Typ Pestvirus, wie beispielsweise CSFV, ableiten. Das genannte Partikel, das, wie bereitgestellt, in der besagten verpackenden oder komplementierenden Zelle, produziert worden ist, ist selbst infektiös und somit fähig, in eine geeignete zweite Zelle einzudringen, wie beispielsweise eine nicht komplementierenden Zelle, die in der Lage ist, mit einem Pestivirustyp im Allgemeinen infiziert zu werden, oder wie beispielsweise eine Zelle in einem Tier, die empfänglich ist, geimpft zu werden.
  • Beim Replizieren in der genannten zweiten Zelle (die nicht komplementierend ist) wird ein neues Partikel produziert, dem jedoch die Fähigkeit fehlt, gegenwärtig eine andere Zelle zu infizieren, und das somit unfähig ist, durch eine Infektion ausgebreitet zu werden. Folglich werden die Partikel, wenn die in einer komplementierenden Zelle Partikel hergestellt werden, eingesetzt, um ein Tier zu infizieren, beispielsweise wenn sie in einem oder als ein Impfstoff bereitgestellt werden, um geeignete Zellen in dem geimpften Tier zu infizieren, von denen aus sich jedoch keine neuen Partikel durch Infektion zu anderen Zellen ausbreiten, wodurch die Anforderungen an einen nicht ausbreitenden Impfstoff gezeigt sind.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Erhalt eines nicht ausbreitenden Pestvirusimpfstoffs bereit, das den Erhalt einer Vielzahl von Partikeln durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und die Herstellung einer Suspension aus den genannten Partikeln in einem geeigneten Verdünnungsmittel umfasst. Geeignete Verdünnungsmittel sind auf diesem Fachgebiet bekannt und bevorzugt auf wässriger Basis, wie beispielsweise eine (gepufferte) Salzlösung oder ein (Wachstums-)Medium. Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Erhalt eines nicht ausbreitenden Pestvirusimpfstoffs bereit, das den Erhalt einer Vielzahl von Partikeln durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und die Herstellung einer Suspension aus den genannten Partikeln in Kombination der genannten Suspension mit einem Adjuvans umfasst. Geeignete Adjuvantien sind Wasser-Öl Emulsionen, Aluminiumsalze oder andere auf diesem Gebiet bekannte Adjuvantien, siehe zum Beispiel Vogel F. R. und Powell M. F. in „A compendium of adjuvants and excipients. In Vaccone desing. (eds) Powell and Newmann, Pharmaceutical Biotechnology Series, Plenum, New York, 1994". Die Erfindung stellt somit einen nicht ausbreitenden Pestvirusimpfstoff bereit, der durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhältlich ist. Die Erfindung stellt einen Impfstoff bereit, der eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung oder einen pestvirusartigen Partikel gemäß der Erfindung bereitstellt, der zum Beispiel ferner ein Adjuvans umfasst. Eine optimale Wirksamkeit des Impfstoffs wird erreicht, wenn durch dessen Nukleinsäure geeigneten Zellen getroffen werden, die Antigene präsentieren können. Die Replikation und Translation der viralen RNA in diesen Zellen wird in der Herstellung eines viralen Antigens für eine optimale Präsentation gegenüber dem Immunsystem resultieren.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung setzt sich der Impfstoff aus pestvirusartigen Partikeln zusammen, die in einer komplementierenden Verpackungszelle hergestellt sind und die, mit oder ohne ein Adjuvans, dem Tier auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, wie beispielsweise, über eine intranasale, intramuskuläre, intradermale oder intravenöse Impfung, oder eine Kombination dieser Wege, ohne darauf eingeschränkt zu sein. Gemäß einer anderen Ausgestaltung der Erfindung besteht der Impfstoff im wesentlichen aus bloßer DNA oder RNA, gemäß der Erfindung, und wird dem Tier mit oder ohne ein Adjuvans bevorzugt über den intradermalen Weg appliziert. Allerdings sind auch alternative Wege, wie beispielsweise der intramuskuläre Weg, geeignet, ohne darauf eingeschränkt zu sein.
  • Ein solcher Impfstoff wird bereitgestellt, wobei die genannte Nukleinsäure von irgendeinem Pestvirus(Impf)Stamm abgeleitet wird, von der cDNA (voller Länge) und infektiöse Kopien hiervon bereitgestellt sind oder bereitgestellt werden können, wie beispielsweise von einem C-Stamm Virus oder von einem anderen Pestvirus, wie beispielsweise einem anderer Impftyp- oder dem Wildtyp eines klassischen Schweinepestvirus, eines rinderviralen Diarrhöevirus oder eines Border-Disease-Virus oder eines chimären Virus. Der Einfachheit halber wird hier die Nummerierung der C-Stamm Sequenz für alle pestviralen Sequenzen verwendet. In Wirklichkeit kann sich in anderen pestviralen Sequenzen die Nummerierung der Erns und E2 Proteine in dem (Poly)Protein leicht infolge der Längenunterschiede in den (Poly)Proteinsequenzen der pestviralen Stämme unterscheiden. Basierend auf der Homologie, können die N- und C-Termini der E2 oder Erns Sequenz irgendeines pestviralen Stammes allerdings leicht bestimmt werden, wie beispielsweise gezeigt durch Rumenapf T. et al. J. Virol. 67: 3288–3294, 1993 oder Elbers K. et al. J. Virol. 70: 4131–4135, 1996.
  • Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Kontrolle und zum Auslöschen einer Pestvirus Infektion bereit, umfassend das Impfen zumindest eines Tieres mit einem Impfstoff gemäß der Erfindung. Das genannte Impfen dient dazu, eine Infektion mit dem wildtypischen Pestvirus zu verhindern oder abzuschwächen, die das genannte Tier haben kann oder mit der es konfrontiert ist infolge der Gegenwart des wildtypischen Virus in dessen Umgebung. Da kein Ausbreiten oder Absondern des Impfstoff stattfindet, kann das geimpfte Tier sicher geimpft werden, sogar wenn es trächtig ist; infolge der nicht ausbreitenden Natur des Impfstoff besteht keine Gefahr einer kongenitalen Infektion seines Fötus oder eine Absonderung des Impfstoffs von dem geimpften zu dem ungeimpften Tier.
  • Zudem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle und/oder zum Auslöschen einer Pestvirus Infektion bereit, umfassend das Testen eines mit einem Impfstoff, gemäß der Erfindung, geimpften Tieres auf die Gegenwart von Antikörper, die für einen wildtypischen Pestvirus spezifisch sind. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird in dem genannten Verfahren zum Zweck der Kontrolle ein solcher Impfstoff als Markerimpfstoffe eingesetzt. Die Verwendung eines solchen durch die Erfindung bereitgestellten Markerimpfstoffe erlaubt eine serologische Unterscheidung zwischen geimpften und durch den Feldvirus infizierten Tieren, und dadurch eine kontrollierte Eliminierung des Virus. Zur serologischen Unterscheidung der pestviralen Genotypen ist es nicht ausreichend, den Schutz mit einem Impfstoff, der die Schutzproteine E2 oder Erns umfasst, jedoch nicht das NS3 Protein, bereitzustellen und die Detektion von Infektionen mit Tests durchzuführen, die auf NS3 basieren. NS3 ist nicht Genotyp spezifisch, zumindest löst es keine Genotyp spezifischen Antikörper aus, um die Unterscheidung zwischen Genotypen zu ermöglichen. Obwohl kein Einwand gegen die Verwendung von Tests zur Diagnose von BVDV oder BDV Infektionen ersichtlich ist, können solche Diagnose Tests kaum in der Folgezeit von Impfkampagnen gegen zum Beispiel CSFV in Schweinen verwendet werden. Im Umlauf befindliche NS3-BDV oder NS3-BVDV Antikörper werden zu einer Fülle von falschen positiven Ergebnissen führen, was zu Verdächtsfällen von CSFV Infektionen führt, während in Wirklichkeit keine in der getestet Schweinepolulation präsent sind. Bevorzugt werden Tests eingesetzt, die Antikörper gegen E2 detektieren oder serologisch erkennbare Fragmente hiervon, wenn die funktionelle Deletion in dem Nukleinsäurefragment vorliegt, das das E2 Protein codiert, und das Schutzprotein hauptsächlich das Erns Schutzprotein oder Fragmente hiervon umfasst, die optional durch andere Schutzproteine (Fragmente) ergänzt werden; oder umgekehrt werden Tests eingesetzt, die Antikörper gegen Erns oder serologisch erkennbare Fragmente hiervon detektieren, wenn die funktionelle Deletion in dem Nukleinsäurefragment vorliegt, das das Erns Protein codiert und das Schutzprotein hauptsächlich das E2 Protein oder Fragmente hiervon umfasst, die optional durch andere Schutzprotein (Fragmente) ergänzt werden.
  • Die Erfindung beschäftigt sich ferner mit einem Tier, das mit einem sich nicht ausbreitenden Pestivirusimpfstoff gemäß der Erfindung geimpft ist. Da solch ein Tier kein Risiko birgt, den Virus auf Kontakttiere oder deren Fötus/Föten auszubreiten, hat ein solches Tier erhebliche Vorteile gegenüber Tieren, die mit konventionellen Pestivirusimpfstoffen geimpft wurden. Mit dem Tier kann zum Beispiel während der Periode kurz nach der Impfung gehandelt werden, während der Handel ansonsten infolge der Gefahr einer Ausreitung beschränkt werden müsste.
  • Die Erfindung wird weiter unten im Detail beschrieben, ohne die Erfindung einzuschränken.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion und Charakterisierung der rekombinanten CSFV Stämme Flc22, Flc23, Flc30, Flc31, Flc32 und Flc33
  • Materialien und Verfahren
  • Zellen und Viren
  • Schweinenierenzellen (SK6-M, EP 0351 901 B1 ), wurden in einem Eagle's Basalmedium vermehrt, das 5% fötales Rinderserum, Glutamin (0,3 mg/ml) und die Antibiotika Penicillin (200 U/ml), Streptomycin (0,2 mg/ml) sowie Myostatin (100 U/ml) enthält. Das fötale Rinderserum wurde auf die Abwesendheit von BVDV- und BDV-Antikörpern getestet, wie zuvor beschrieben (Moormann et al. 1990, Virology 177: 184–198.
  • Rekombinante CSFV-Stämme Flc22, Flc23 Flc30, Flc31, Flc32 und Flc33 wurden vermehrt und hergestellt wie zuvor beschrieben (Moormann et al. 1996, J. Virol. 70: 763–770) mit einer geringen Veränderung, dass das Kulturmedium der SK6-Zellen gegen supplementiertes Eagles Basalmedium ausgetauscht wurde. Virale Stammlösungen wurden hergestellt, indem der Virus acht bis zehnmal über SK6c26 Zellen passagiert wurde. Der erhaltene Virustiter lag in dem Bereich von 5,0–5,8 TCID50/ml.
  • Herstellen einer stabilen SK6-Zelllinie zur Expression von Erns
  • Plasmid pPRKc16 enthält das E2-Gen des CSFV-Stamm C unter Kontrolle des Transkriptions- und Translationssignals des Expressionsvektors pEVhisD12. Plasmid pEVhisD12 ist ein Vektor, der die Promotor/Verstärkersequenzen des Immediate-Early-Gens des humanen Cytomegalovirus enthält gefolgt von einem Codon der Translationsinitiation und dem Histidinoldehydrogenase-Gens (hisD) unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors, der als Selektionsmarker genutzt werden kann (Peeters et. al. 1992, J. Virol. 66: 894–905). Das Erns Gen des CSFV-Stamm C wurde durch PCR-Reaktion mit den folgenden Primern amplifiziert: p974 5' AAG AAA AGA TCT AAA GCC CTA TTG GCA TGG 3' und p976 5' TT GTT ACA GCT GCA TAT GTA CCC TAT TTT GCT TG 3'. Nach Verdau mit BglII wurde das PCR-Fragment in den Vektor pPRKc16 ligiert, der zuvor mit SalI verdaut, aufgefüllt und dann nachfolgend mit BglII verdaut wurde. Das resultierende Plasmid pPRKc26 enthält das Erns Gen des CSFV-Stamm C.
  • Zur Transfektion der SK6-Zellen mit pPRKc26 wurde Lipofectamin (20 μg) (Gibco-BRL) in 50 μl Optimem-I (Gibco-BRL) verdünnt und mit Plasmid-DNA (1 μg) gemischt, die zuvor in 50 μl Optimem-I (Gibco-BRL) verdünnt wurde. Diese Mischung wurde 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. SK6-Zellen, die in 10 cm2 Kulturplatten vermehrt wurden, wurden mit Optimem-I gewaschen. Frisches Optimem-I (0,5 ml) wurde zugegeben gefolgt von der DNA-Transfektionsmischung. Nach Inkubation für vier Stunden bei 37°C wurde die Transfektionsmischung wieder entfernt und die Zellbehältnisse mit Medium versorgt, das 5 mM Histidinol enthielt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen trypsiniert und auf einer 90 cm2 Platte ausgebracht. Das Medium wurde alle 3–4 Tage ausgetauscht. Nach 15 Tagen wurden Einzelkolonien gepickt und in 2 cm2 Platten ausgebracht. Die Expression von Erns wurde durch Immunfärbung der Zellen mit Mab C5 bestimmt (Wensvoort 1989, Thesis, University of Utrecht), der gegen Erns Gen des CSFV Stamm C gerichtet ist. Eine zweite Runde der Klonierung wurde durchgeführt, indem die Zellen trypsiniert und in einer zehnfachen Verdünnung mit Medium, das 5 mM Histidinol enthielt, in Mikrotiterplatten ausgebracht wurden. Kavitäten, die einzelne Kolonien enthielten, wurden trypsiniert und die Expression von Erns wurde durch Immunfärbung der Zellen mit Mab C5 bestimmt (Wensvoort et. al. 1988, Vet. Microbiol. 17, 129–140). Die etablierte SK6-Zelllinie mit konstitutiver Expression von Erns wurde SK6c26 genannt.
  • Charakterisierung der stabilen Zelllinie SK6c26
  • Die Expression von Erns in der Zelllinie SK6c26 wurde durch Immunperoxidasefärbung mit den Erns-spezifischen monoklonalen Antikörpern (Mabs) C5, spezifisch für Erns des Stammes C (Wensvoort 1989, Thesis, University of Utrecht), 140.1 und 137.5, die gegen Erns von CSFV Stamm C und Brescia gerichtet sind (de Smit et. al. unveröffentliche Daten), und ein polyklonales Kaninchenserum, R716 (Hulst et. al. J. Virol 1998, 72: 151–157) getestet. Die RNase-Aktivität von Erns, das in der SK6c26 Zellline exprimiert wurde, wurde durch eine modifizierte Methode von Brown und Ho gemessen (Plant Physiol. 1986, 82: 801–806), wie beschrieben von Hulst et. al. (J. Virol. 1998, 72: 151–157). Die Menge von Erns wurde durch einen indirekten ELISA bestimmt, der auf Mab C5 as Fängerantikörper basiert und Mab 140.1 als Detektionsantikörper, an dem Meerrettichperoxidase konjugiert wurde, verwendet, wie beschrieben in Hulst et. al. (J. Virol. 1998, 72: 151–157).
  • Konstruktion von rekombinantem CSFV Erns
  • pPRKc5 (Hulst et. al., Virol. 1998, 72: 151–157) ist ein Derivat von pEVhisD12, das die Nukleotidsequenzen der Autoprotease und der Strukturgene des CSFV-Stamm C ohne Erns enthält (Npro-C und E1-E2, Aminosäuren (a.a.) 5–267 und 495–1063, der Aminosäuresequenz von CSFV-Stamm C) (Moormann et al. 1996. J. Virol. 70: 763–770)
  • Zwei komplementäre Oligomere das vorwärts gerichtete Oligomer p1135 (5' CCG AAA ATA TAA CTC AAT GGT TTG GCG CTT ATG 3') sowie das reverse Oligomer p1136 (5' CAT AAG CGC CAA ACC ATT GAG TTA TAT TTT CGG 3C) wurden mit T4-DNA-Kinase phosphoryliert, hybridisiert und durch Ligation in den Vektor pPRKc5 insertiert, der zuvor mit StuI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das Konstrukt wurde pPRKc48 genannt. Dieses Konstrukt beinhaltet die fünf äußerst N-terminalen und die sechs äußerst C-terminalen Aminosäuren von Erns (Deletion von Aminosäuren 273–488) (1 und 2A)
  • Eine Deletion der Aminosäuren 422–488 in Erns von Stamm C wurde erreicht, durch die PCR-Amplifikation des Erns-Gens mit dem vorwärts gerichteten Primer p974 und dem reversen Primer p1120 5' GAC GGA TTC GGC ATA GGC GCC AAA CCA TGG GCT CTC TAT AAC TGT AAC 3'. Das HA-Epitop, Aminosäuresequenz YPYDVPDYA (Wilson et. al., Cell 1984, 37, 767–778), wurde konstruiert, indem die 3' komplementären Nukleotide von P1124 '5 GAC AGA TCT ATC GAT TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT 3' und P1125 5' GAC GTC GAC GGA TCC AGC'GTA ATC TGG AAC ATC 3' (unterstrichen ist die HA-Sequenz) durch Annealing zusammengeführt wurden und die 5'-Einzelstrangnukleotide in einer PCR mittels Vent-Polymerase (New England Biolabs) aufgefüllt wurden. Das HA-Epitop PCR- Produkt wurde durch ClaI/SalI verdaut und das Erns PCR-Produkt wurde mit BglII/NarI verdaut. Die beiden verdauten PCR-Produkte wurden über eine Dreipunkt-Ligation in den Vektor pPRKc16 ligiert, der zuvor mit BglII und SalI geschnitten wurde. Dieses ergab das Plasmid pPRKc43, das rekombinantes Erns mit einer Deletion der Aminosäuren 422–488 und einem C-terminalen HA-Epitop enthält (1 und 2B). Nach PCR-Amplifikation von Plasmid pPRKc43 mit dem vorwärts gerichteten Primer p935 5' CCG AAA ATA TAA CTC AAT GG 3' und dem reversen Primer p925 5' CRT AAG CGC CAA ACC AGG TT 3' wurde das PCR-Produkt mit T4-DNA-Kinase phosphoryliert und nachfolgend in den mit StuI geschnittenen und durch alkalische Phosphatase behandelten Vektor pPRKc5 ligiert. Das resultierende Konstrukt beinhaltet die Nukleotidsequenz der Autoprotease, der Strukturproteine von Stamm C und das rekombinante Erns ohne Aminosäuren 422–488 und wird pPRKc50 genannt.
  • Eine Deletionsmutante ohne Aminosäuren 436–488 in Erns von Stamm C wurde durch die PCR-Amplifikation des Erns-Gens mit dem vorwärts gerichteten Primer p974 und dem reversen Primer p1121 5' GAC GGA TTC GGC ATA GGC GCC AAA CCA ATC CCC ATA CAA GGT ATC CTC 3' erzeugt. Nach Verdau mit BglII/NarI wurde das Fragment zusammen mit dem ClaI/SalI verdauten HA-Epitop PCR-Produkt über eine Dreipunkt-Ligation in den Vektor pPRKc16 ligiert, der zuvor mit BglII und SalI geschnitten wurde. Das resultierende Plasmid pPRKc42 wurde mit dem vorwärts gerichteten Primer p935 und dem reversen Primer p925 in einer PCR-Reaktion amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-DNA-Kinase phosphoryliert und nachfolgend in den mit StuI geschnittenen und durch alkalische Phosphatase behandelten Vektor pPRKc5 ligiert. Das resultierende Konstrukt beinhaltet die Nukleotidsequenz der Autoprotease, der Strukturproteine von Stamm C und das rekombinante Erns ohne Aminosäuren 436–488 und wird pPRKc49 genannt.
  • Eine Deletionsmutante ohne Aminosäuren 422–436 wurde erzeugt, durch die PCR-Amplifikation des Plasmids pPRKc129 mit Primern p1147 5' CAA ACT GCC GGA CTC ATG TGG GCT CTC TAT AAC TGT 3' und p925. Dann wurde das erhaltenen PCR Produkt über ein Agarosegel isoliert und als reverser Primer in einer zweiten PCR-Reaktion mit primer p935 als vorwärts gerichteten Primer zur Amplifikation von pPRKc129 benutzt. Das zweite PCR-Produkt mit T4-DNA-Kinase phosphoryliert und nachfolgend in den mit StuI geschnittenen und durch alkalische Phosphatase behandelten Vektor pPRKc5 ligiert, resultierend in Plasmid pPRKc51.
  • Ein Austausch von Cystein (Cys) zu Serin (Ser) an Aminosäureposition 422 wurde durch PCR-Amplifikation von pPRKc129 mit dem vorwärts gerichteten Primer p1140 5' GAG AGC CCT TCG AAT TTC AAT GT 3' und dem reversen Primer p925 erzeugt. Die weiteren Schritte waren identisch mit denen zur Erzeugung der Deletionsmutation, der die Aminosäuren 422–436 fehlt. Plasmid pPRKc52 beinhaltet die Autoprotease-Gene und die Strukturproteine von Stamm C mit einem mutierten Erns, das eine Cys-zu-Ser Substitution an Position 422 aufweist.
  • Ein Austausch von Cystein zu Serin an Aminosäureposition 405 wurde durch PCR-Amplifikation von pPRKc129 mit dem vorwärts gerichteten Primer p1148 5' CCT GAC CGG TTC GAA GAA AGG GAA 3' und dem reversen Primer p925 erzeugt. Die weiteren Schritte waren identisch mit denen zur Erzeugung der Deletionsmutation, der die Aminosäuren 422–436 fehlt. Plasmid pPRKc52 beinhaltet die Autoprotease-Gene und die Strukturproteine von Stamm C mit einem mutierten Erns, das eine Cys-zu-Ser Substitution an Position 405 aufweist.
  • Ein Austausch von Cystein zu Serin an Aminosäureposition 381 wurde durch PCR-Amplifikation von pPRKc129 mit dem vorwärts gerichteten Primer p1149 5' TGC GCT GTG ACT AGT AGG TAC GAT AAA 3' und dem reversen Primer p925 erzeugt. Die weiteren Schritte waren identisch mit denen zur Erzeugung der Deletionsmutation, der die Aminosäuren 422–436 fehlt. Plasmid pPRKc52 beinhaltet die Autoprotease-Gene und die Strukturproteine von Stamm C mit einem mutierten Erns, das eine Cys-zu-Ser Substitution an Position 381 aufweist.
  • Klonen, die die mutierten Erns in der richtigen Orientierung aufwiesen, wurden in SK6-Zellen transfiziert und auf Expression von Erns durch Immunfärbung mit den Antikörpern gegen Erns (c5, 140.1, 1337.5, R716) und E2-spezifischen Mabs b3 und b4 (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. 70: 2865–2876) getestet.
  • Herstellung der CSFV-Konstrukte voller Länge, die Erns-Deletionsmutanten beinhalten
  • Ein ClaI/NgoMI Fragment von pPRKc48 und pPRKc50 wurden isoliert und in den Vektor pPRKflc2, zuvor genannt pPRKflc133 (Moormann et al. 1996. J. Virol. 70: 763–770), ligiert, der mit ClaI/NgoMI verdaut wurde. Die resultierenden cDNA CSFV Stamm C Erns Mutanten voller Länge wurden pPRKflc23 und pPRKflc22 genannt. Das vollständige Konstruktionsschema der Konstrukte pPRKflc22 und pPRKflc23 voller Länge ist in 2A und 2B dargestellt und eine Übersicht der Erns-Plasmide ist in 1 angegeben.
  • In ähnlicher Weise werden die 422–436 Deletionsmutante von pPRKc51 und die Cys-Ser-Substitutionen von pPRKc52, pPRKc54, pPRKc56 in den Vektor pPRKflc2 über die Schnittstelle ClaI/NgoMI transferiert. Dieses resultiert in den rekombinanten voll-länge cDNA Klonen pPRKflc30, pPRKflc31, pPRKflc32 sowie pPRKflc33.
  • Isolierung der rekombinanten Viren
  • Plasmid-DNA von pPRKflc22, pPRKflc23, pPRKflc30, pPRKflc31 pPRKflc32, und pPRKflc33 wurde über Säulen (Qiagen) gereinigt und mit XbaI linearisiert. Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in Wasser aufgelöst. RNA wurde von den linearisierten Plasmiden (1 μg) in einem Reaktionsvolumen von 100 μl 40 mM TrisHCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM Dithiothreitol, 40 U rRNAsin (Promega), 0,5 mM jedes rNTP, and 35 U T7 RNA polymerase (Pharmacia) transkribiert. Nach 1 h Inkubation bei 37°C, wurden 10 U RNase-freie DNaseI (Pharmacia) zugegeben und die Mischung für weitere 15 Minuten inkubiert. RNA wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 10 μl Wasser aufgelöst.
  • Für RNA-Transfektionen, wurden 10 μg Lipofectin in 50 μl Optimem-I verdünnt. Nach 45 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur, werden 1 μg RNA verdünnt in 50 μl Optimem-I zugegeben und für weitere 15 Minuten inkubiert. SK6c26 Zellen, die 10 cm2 Gewebekulturplatten vermehrt wurden, wurden Optimem-I gewaschen und mit der RNA-Transfektionsmischung für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Dann werden die Zellen mit frischem Medium versorgt und für vier Tage bei, 37°C inkubiert. Die RNA-Transfektionen wurden in Duplikaten durchgeführt. Eine Probe wurde mit Mabs b3/b4 spezifisch für E2 immungefärbt. Wenn die Immunofärbung auf E2 einen negativen Nachweis zeigte, dann wurde die Duplikatprobe passagiert und in zwei Proben geteilt. Eine dieser Proben wurde zur Immunfärbung vier Tage nach der Passage verwendet. Von Ansätzen bei denen E2-Expression beobachtet wurde, wurde der Zellüberstand auf frische SK6c26 oder SK6 Zellen gegeben, um die Gegenwart von infektiösen Viruspartikeln nachzuweisen. Nach vier Tagen wurden die Monolayer fixiert und wie oben Beschrieben einer Immunfärbung unterzogen.
  • Wachstumskinetik von Flc22 und Flc23
  • Die Wachstumskinetik der Viren wurde in SK6c26 Zellen bestimmt. Subkonfluente Monolayer in M24 Kavitäten wurden mit einer Multiplizität der Infektion von 0,1 infiziert. Die Viren wurden für 1,5 Stunden adsorbiert. Bevor die Zellen mit frischem Medium versorgt wurden, wurde eine erste Probe als Zeitpunkt Null genommen. An dem 0., 1., 2., 3., 4., 5., 6. und 7. Tag nach Infektion wurden die M24-Platten zweimal gefroren und getaut und durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 5000 × g und 4°C geklärt. Virustiter (log TCID50 pro Milliliter) der Totallysate (Zell-Lysat plus Überstand) wurden an SK6c26 Zellen bestimmt.
  • Charakterisierung der rekombinanten Erns Viren
  • Die Erns Gene von Flc22, and Flc23 wurden sequenziert. Dazu wurde zytoplasmatische RNA mit dem RNeasy total-RNA Isolationskit (Qiagen) von SK6c26 Zellen isoliert, die mit den jeweiligen Viren infiziert waren. DNA-Fragmente, die die Erns Genes abdecken wurden durch RT-PCR analysiert. Mit Hilfe der Primer p1154 5' GTT ACC AGT TGT TCT GAT GAT 3' und p305 5' GGG GTG CAG TTG TTG TAT CCA 3' wurde die Nukleotidsequenz 865 bis 1920 amplifiziert, auf einem 1.5%igen Agarosegel in 1 × TAE analysiert und dann über Costar Spin-X Säulen gereinigt. Eine RT-PCR des E2-Gens wurde mit dem Primerpaar p307 TGG AAT GTT GGC AAA TAT GT und p304 CAC TTA CCT AT[A, G] GGG TAG TGT GG durchgeführt, die die Nukleotidsequenz 2200– 3174 amplifizieren.
  • Sequenzen der gereinigten PCR-Fragmente wurden durch PCR-Cycle-Sequenzierung mit Hilfe des „Big dye dRhodamine terminator ready reaction cycle sequencing kit" (Perkin Elmer) nach Angaben des Herstellers mit flankierenden Primern auf einem 310 ABI PRISM Genetic Analyser bestimmt.
  • Zusätzlich wurden die rekombinanten Viren durch einen Immunoperoxidase-Monolayerassay charakterisiert. Dazu wurden SK6 Zellen mit den rekombinanten Viren und Flc2 infiziert. Nach Inkubation für vier Tage bei 37°C, wurden die Monolayer mit Mabs spezifisch für CSFV E2 (Mabs b3/b4), CSFV Erns Mabs 140.1, C5, 137.5 und einem polyklonalen Kaninchenserum gegen Erns R716 immungefärbt.
  • Der Virus Neutralisierungsindex (log Abnahme des Virustiters [TCID50/ml] durch neutralisierendes Serum) wurde bei einer Verdünnung von 1:250 des Serum 716, spezifisch gerichtet gegen Erns von CSFV Stamm C, sowie bei einer Verdünnung von 1:1000 des Schweineserums 539, spezifisch gerichtet gegen E2 von CSFV Stamm Brescia (Hulst et al., Virol. 1998, 72: 151–157), bestimmt. Die Virenstocks von Flc2, Flc22 und Flc23 wurden durch Endpunktverdünnungen in Gegenwart oder Abwesenheit dieser CSFV neutralisierenden Antikörper titriert.
  • Ergebnisse
  • Transiente Expression von rekombinantem Erns in SK6-Zellen
  • Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen CSFV Erns erzeugt wurden, nicht die RNase Aktivität inhibieren (Hulst et. al. 1998, J. Virol. 72: 151–157). Die aktiven Domänen der Erns RNase befinden sich in der N-terminalen Hälfte des Proteins (Schneider et. al. 1993, Science 261: 1169–1711, Hulst et. al. 1994 Virol. 200: 558–565) (siehe 1 für eine schematische Darstellung von Erns). Analysen mit Pepscan ergaben keinen Hinweis auf lineare Epitope auf Erns für die Antikörper C5, 140.1 und 137.5 (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass konformationelle Epitope vorliegen. Daher wurden eine Reihe von rekombinanten Erns Konstrukten erzeugt, die Deletionen unterschiedlicher Länge im C-Terminus aufweisen (1). Diese Deletionsmutanten wurden in ein Expressionsplasmid pPRKcS transferiert, das die Nukleotidsequenz der Autoprotease und der Strukturgene (Npro-Capsid-E1-E2) umfasst ohne Erns. Die Expression dieser Konstrukte ermöglicht es uns, das E2 Gen als Kontrolle für einen korrekten offenen Leserahmen zu verwenden, da das E2 Gen C-terminal vom Erns Gen lokalisiert ist. SK6 Zellen wurden mit diesen Plasmiden transfiziert und eine Immunperoxidase-Färbung wurde 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt (Tabelle 1).
  • Zellen, die mit dem Plasmid pPRKc49, das eine Deletion an Aminosäureposition 436 bis 488 aufweist, transfiziert wurden, können spezifisch mit allen Antikörpern angefärbt werden, die CSFV Erns erkennen (Mab CS, 140.1, 137.5) sowie mit dem polyklonalen Serum R716, wie es auch für das wildtypische Plasmid pPRK83 zutrifft. Andererseits wird das Plasmid pPRKc50, das eine Deletion an Aminosäureposition 422 bis 436 aufweist, nicht mehr durch die Antikörper gegen Erns erkannt, ist aber positv nachweisbar mit den Mabs b3/b4 gegen E2. Diese Ergebnisse zeigen das Vorliegen einer definierten antigenen Domäne auf Erns und/oder eine wichtige Rolle der Aminosäuren 422 bis 436 für entweder die Bindung oder die Konformation der Epitope auf Erns. Diese Region umfasst ein Cystein 422 das möglicherweise in der konformationellen Struktur von Erns involviert ist.
  • Um die Rolle dieser Region weiter zu untersuchen wurde das Plasmid pPRKc51 erzeugt, das eine kleine Deletion von Aminosäuren 422–436 beinhaltet. Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, zeigt die Immunperoxidase-Färbung der transfizierten Zellen ausschließlich die Bindung von Mab an E2 aber nicht an Erns. Diese Resultate bestätigen die Bedeutung dieser Region für die Konformation dieser Erns-Epitope.
  • Etablierung einer Zelllinie, die CSFV Erns exprimiert
  • SK6-Zellen wurden mit dem Plasmid pPRKc26 transfiziert, das das CSFV Stamm C Erns Gen und das Histidinol Resistenzgen (hisD) umfasst. Nach drei Wochen wurden Kolonien, die die Selektion mit 5 mM Histidinol überlebt haben, auf Expression des Erns Gens untersucht durch Immunfärbung mit Mab C5 untersucht, der spezifisch für das CSFV Erns Gen ist. Positive Zellen wurden erneut kloniert um die Klonalität zu vergewissern.
  • Einer der gefundenen Klone zeigte die Expression von Erns in mehr als 95% der Zellen und dieser Klon wurde SK6c26 genannt. Diese Zelllinie produzierte substantiell höhere Mengen von Erns als die anderen fünf erhaltenen Klone, wie durch Immunfärbung bestimmt werden konnte. Kontinuierliche Passagierung dieser Zelllinie in Gegenwart von 5 mM Histidinol erhielt die persistente Expression in mehr als 95% der Zellen für mindestens 10 Monate (46 Passagen). Passagieren in der Abwesenheit von Histidinol für 10 Passagens resultierte in einer geringfügigen Abnahme der Erns exprimierenden Zellen auf ungefähr 80%.
  • Die stabile Zelllinie wurde weiterhin in Bezug auf die biochemischen Eigenschaften von Erns charakterisiert. Die SK6c26 Zelllinie reagiert in einem IPMA mit allen getesteten Erns Antikörpern (Tabelle 2A). Die Menge von Erns in den Zelllysaten von SK6c26 und SK6 Zellen, die mit Flc2 infiziert wurden, wurde über einen indirekten ELISA bestimmt und von einer Standardkurve extrapoliert. Diese wurde mit einem immunoaffinität gereinigten Präparat von Erns erstellt, das in Insektenzellen erzeugt wurde. Lysate von SK6c26 Zellen reagierten mit den Erns spezifischen Mabs und polyklonalen Antikörpern in einem indirekten ELISA wie das wildtypische Erns (Tabelle 2B). Die Mengen an Erns, die in den SK6c26 Zellen produziert wurde (10 ng per cm2) war dreimal geringer als in SK6 Zellen, die mit Flc2 infiziert waren (30 ng per cm2). Die SK6c26 Zellen und die mit Flc2 infizierten SK6 Zellen besitzen vergleichbare RNase Aktivität, wie durch die Messungen mit einem Antigen Capture RNase Assay gezeigt werden konnte (Tabelle 2B). Das Erns Protein aus der stabilen Zelllinie wies eine mit dem wildtypischen Erns vergleichbare Mobilität auf, wie in der SDS-PAGE gezeigt werden konnte, und war genauso effizient dimerisiert wie Erns, das in Virionen gefunden wird (Thiel et al. 1991, J. Virol. 65: 4705–4712) (Tabelle 2B).
  • Konstruktion und Wiedergewinnung von CSFV Stamm C Erns rekombinanten Viren Flc22 and Flc23.
  • Zwei Rekombinanten des Erns Gens wurden in pPRKflc2, der infektiösen Kopie voller Länge des CSFV Stamms C (Moormann et al. 1996. J. Virol. 70: 763–770), ersetzt. Der Klon pPRKflc22 voller Länge wurde aus dem pPRKc50 abgeleitet, der eine Deletion der Aminosäurepositionen 422 zu 488 in Erns aufweist (1). Der Klon pPRKflc23 voller Länge wurde aus dem pPRKc48 abgeleitet und umfasst die fünf äußersten N-terminalen Aminosäuren sowie die sechs äußersten C-terminalen Aminosäuren von Erns (Deletion von Aminosäuren 273–488) (1). 2 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion dieser rekombinanten Erns Klone voller Länge.
  • RNA, transkribiert von linearisierter cDNA voller Länge, wurde in die Erns exprimierende SK6 Zelllinie transfiziert. Vier Tage nach Transfektion zeigte die Immunperoxidase-Färbung des Monolayers mit Mab b3 keine Expression von E2, selbst nicht bei der RNA, die von pPRKflc2 transkribiert wurde.
  • Die E2-Proteinmenge des rekombinanten Virus könnte zu gering gewesen sein, um ihn in der Immunfärbung detektieren zu können. Daher wurden die Zellen passagiert, um einen höheren Titer der Viren zu erhalten. Eine Passage nach der Transfektion konnten die Expression von E2 bei den rekombinanten Klonen pPRKflc22 und pPRKflc23 nachgewiesen werden. Drei bis fünf zusätzlichen Passagen wurden benötigt, um einen Virustiter von ungefähr 5,5 TCID50/ml zu erhalten. Diese Stammlösung wurde für die weitere Charakterisierung der Viren, die Flc22 und Flc23 für Klone pPRKflc22 beziehungsweise pPRKflc23 genannt wurden, verwendet.
  • Überstände von SK6c26 Zellen, die mit Flc22 und Flc23 infiziert waren, wurden für die Infektion weiterer SK6c26 und SK6 Zellen verwendet. Vier Tage nach Infektion waren für beide Viren ungefähr 50–70% der SK6c26 Zellen positiv in der E2 Immunoperoxidase-Färbung, wohingegen die Infektion der SK6 Zellen nur in einzelnen Zellen oder Paaren von einzelnen Zellen zu einer Expression von E2 führte. Wenn man in Betracht zieht, dass sich Zellen, die mit CSFV infiziert sind, normal teilen (d.h. einmal in 24 Stunden), dann weist die Anzahl der positiven Zellen, die bei den SK6c26 Zellen beobachtet wurden, auf Replikation und eine sekundäre Verbreitung des mutierten Virus hin. Weil nur einzelne Zellen oder Paare einzelner Zellen in SK6 Zellen das E2 exprimierten, gibt dies einen Hinweis darauf, dass die Überstände, die von SK6c26 Zellen stammten, infektiösen Virus enthalten, der die SK6 Zellen infizieren und sich in diesen replizieren kann aber dass es dort keine Verbreitung von Zelle zu Zelle oder eine sekundäre Infektion des mutierten Virus in diesen Zellen gibt.
  • Überstände oder Lysate von SK6 Zellen, die mit Flc22 und Flc23 infiziert waren, wurden benutzt, um neue SK6 und SK6c26 Zellen zu infizieren aber dies führte ebenfalls nicht zu infizierten Zellen. Für die Infektion mit Pestviren wird die Interaktion von den viralen Hüllproteinen E2 and Erns mit der zellulären Oberfläche als essentiell betrachtet. Aufgrund der Abwesenheit von Erns in den SK6 Zellen können keine infektiösen Partikel aus den Viren Flc22 and Flc23 geformt werden.
  • Daher enthielten die Überstände der infizierten SK6 Zellen keinen infektiösen Virus (3), wohingegen der Überstand von SK6c26 Zellen, die mit Flc22 und Flc23 infiziert waren, SK6 und SK6c26 Zellen infizieren können und daher infektiösen Virus enthalten.
  • SK6 Zellen, die mit Flc22 und Flc23 aus den Überständen von SK6c26 Zellen infiziert wurden, konnten mit den Mabs, die gegen E2 gerichtet sind, immungefärbt werden, aber es konnten keine positive Zellen mit den Antikörpern gegen Erns (Mabs C5 und R716) gefunden werden. Als Kontrolle ergab die Infektion von SK6 Zellen mit Überständen von SK6c26 Zellen, die mit Flc2 infiziert waren, eine positive Immunoperoxidasefärbung für beide E2 und Erns sowie eine sekundäre Infektion (3).
  • Transfektion von linearisierter voll-länge cDNAs pPRKFlc22 und pPRKflc23 in eine SK6-Zelllinie, die eine RNA-Polymerase vom Bacteriophagen T7 konstitutiv in ihrem Zytoplasma exprimiert (Van Gennip 1999, J. Virol. Methods, akzeptiert zur Publikation), führte zur transienten Expression von E2 nach der Transfektion. Allerdings führte sechsmaliges Passagieren der transfizierten Zellen nicht zur Wiedergewinnung von infektiösen, rekombinanten Viren (Daten nicht gezeigt).
  • Zusammengenommen zeigen diese Resultate, dass die rekombinanten und Erns-mutanten Viren Flc22 und Flc23 eine Komplementierung von Erns durch eine komplementierende Zelllinie zur Verpackung des rekombinanten Virusgenoms benötigen, um einen infektiösen Virus zu erhalten.
  • Charakterisierung der rekombinanten CSFV Viren Flc22 und Flc23
  • Um die Gegenwart der Mutationen in den Genomen von Flc22 und Flc23 zu bestätigen, wurde die zelluläre RNA von infizierten SK6c26 Zellen mit RT-PCR über CSFV spezifische Primer analysiert. Die Fragmente, die nach RT-PCR mit Primern, die das Erns Gen flankieren, erhalten wurden, hatten die erwartete Größe von ungefähr 857, 401, und 1055 bp, mit Bezug auf Flc22, Flc23, beziehungsweise Flc2, wohingegen das RT-PCR Produkt des E2 Gens für alle Viren die erwartete Größe von 974 bp aufwies (4). Die Amplifikationsprodukte der Erns Gene wurden sequenziert und die erhaltenen Sequenzen waren so wie erwartet. Weder eine Reversion zum Wildtyp noch eine Rekombination mit dem Erns Gen, das durch die Zelllinie kodiert wird, wurde beobachtet.
  • Die Wachstumskinetik von Flc22 und Flc23 sowie dem wildtypischen Flc2 wurden in der komplementierenden Zelllinie SK6c26 bestimmt. Wie in 5 gezeigt, sind die mehrstufigen Wachstumskurven der rekombinanten Viren Flc22 und Flc23 sehr ähnlich, zeigen aber ein verlangsamtes Wachstum, wenn man sie mit dem ursprünglichen Virus Flc2 vergleicht. Titer zwischen 5,0–5,8 TCID50/ml wurden von den rekombinanten Viren nach sechs Tagen erhalten, während für den ursprünglichen Stamm Flc2 dieser Titer schon innerhalb von 3 Tagen erreicht wurde. Die beobachteten Titer, die für Flc2 4 Tage nach der Infektion in der komplementierenden Zelllinie erhalten werden, sind zehnmal niedriger als die, die in ursprünglichen Zelllinie SK6 (6,8 TCID50/ml) gefunden werden.
  • Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Erns in die virale Hülle inkorporiert wird. Dazu wurden Virenstocks von Flc2, Flc22 und Flc23 in Gegenwart von CSFV neutralisierenden Antikörpern titriert. Tabelle 3 zeigt die Reduktion des Virustiters durch Inkubation mit neutralisierenden Antikörpern. Alle rekombinanten Viren wurden in einem ähnlichen Umfang neutralisiert wie der ursprüngliche Virus Flc2 sowohl mit Erns spezifischen als auch mit E2 spezifischen neutralisierenden polyklonalen Antikörperen. Erns in der viralen Hülle von Flc22 konnte sowohl von der komplementierenden Zelllinie erhalten werden als auch vom rekombinanten Erns Protein, das durch das virale Genom kodiert wird. Allerdings wird das rekombinante Erns von Flc22 nicht durch das polyklonale Serum R716 erkannt (3), das für die Neutralisierung der Viren verwendet wurde. Daher zeigt der vergleichbare Neutralisationsindex, der für dieses polyklonale Serum erhalten wurde, dass die Menge von Erns, die in den viralen Hüllen von Flc22 von der komplementierende Zelllinie erhalten wurde, vergleichbar ist mit denen von Flc2 und Flc23.
  • 6 zeigt die Aminosäuresequenz von Flc22 und Flc23 im Vergleich zu Flc2. Flc23 ist eine Erns Deletionsmutante, in der die Spaltstelle sowohl zwischen C-Erns als auch Erns-El intakt gelassen wurden. Die Präsenz diese Schnittstellen könnte die Viabilität diesen Virus beeinflussen.
  • Konstruktion von pPRKflc30, pPRKflc31, pPRKflc32, und pPRKflc33
  • Die Ergebnisse in Tabelle 1 weisen auf eine wichtige Rolle für die Aminosäureregion 422–436 für die Konformation der Epitope unserer Erns Antikörper hin. Diese Region beinhaltet an Position 422 ein Cystein, das für die Erkennung des Epitop verantwortlich sein könnte. Um die Rolle dieser Region weiter zu untersuchen, haben wir eine Gruppe von rekombinanten Erns Klonen voller Länge konstruiert: ein Klon, dem die Aminosäurepositionen 422–436 fehlen (pPRKflc30), eine Cystein zu Serin Mutante an Position 422 (pPRKflc31), und zwei zusätzliche Cystein zu Serin Mutanten an Positionen 405 und 381 (pPRKflc32 beziehungsweise pPRKflc33) (1).
  • RNAs, transkribiert von den linearisierten cDNAs voller Länge, wurden in die Zelllinie SK6c26 transfiziert. Nach dem Passagieren der transfizierten Zellen waren diese positiv in der Immunfärbung mit Mab b3. Dann wurden die Zellen weitere fünf Male passagiert, um höhere Titer der Viren zu erhalten.
  • Charakterisierung der rekombinanten CSFV Viren Flc30, Flc31, Flc32 und Flc33
  • Überstände von SK6c26 Zellen, die mit Flc30, Flc31, Flc32 und Flc33 infizierten waren, wurden für die Infektion von SK6c26 und SK6 Zellen verwendet. Für alle Viren waren ungefähr 30–50% der SK6c26 Zellen positiv in der E2 Immunoperoxidasefärbung vier Tage nach Infektion. Für Flc30, Flc31, und Flc33 resultierte die Infektion von SK6 Zellen nur in einzelne Zellen oder Paaren von einzelner Zellen, die E2 exprimieren und keine Expression von Erns zeigen (3). Dies weist darauf hin, dass sich die Infektion und Replikation in den SK6 Zellen vollzieht, aber dass keine Verbreitung von Zelle zu Zelle oder eine sekundäre Infektion mit den mutanten Viren stattfindet.
  • Überstände von SK6 Zellen, die mit Flc30, Flc31, oder Flc33 infizierten waren, wurden für die Infektion von neuen SK6 und SK6c26 Zellen verwendet, wobei dies aber nicht in infizierten Zellen resultierte. Daher enthielten die Überstände dieser infizierten SK6 Zellen kein infektiöses Virus (3). Für die Infektion mit Pestviren wird die Interaktion der viralen Hüllproteinen E2 und Erns mit der zellulären Oberfläche als essentiell betrachtet. Aufgrund des Fehlens von Erns in den SK6 Zellen können keine infektiösen Partikel von den Viren Flc30, Flc31, und Flc33 gebildet werden.
  • In Gegensatz dazu zeigte die Infektion mit Flc32 aus Überständen von infizierten SK6c26 Zellen, dass 30%–50% von den SK6 Zellen infiziert wurden. Beide, E2 und Erns konnten durch die E2 und Erns Antikörper detektiert werden (3). Überstände der SK6 Zellen, die mit Flc32 infiziert sind, können neue SK6 und SK6c26 Zellen infizieren und enthalten demnach infektiösen Virus (3).
  • Dieses weist darauf hin, dass Virus Flc32 in der Lage ist, in den SK6 Zellen zu replizieren und diese zu infizieren Daher erzeugt der rekombinante Virus mit der Substitution Cys405Ser (Flc32) infektiösen Virus, wohingegen die rekombinanten Viren mit Cys-Ser Substitutionen an Positionen 422 (Flc31) und 381 (Flc33) sowie einer Deletion der Aminosäuren 422–436 (Flc30) dieses nicht taten.
  • Diese Resultate zeigen eine wichtige Rolle der Cysteine an Positionen 422 und 381 für die funktionelle Aktivität von Erns zur Verbreitung von Zelle zu Zelle, die Infektiösität und die Erkennung von Epitopen.
  • pPRKflc23 zur Expression von heterologen Proteinen
  • pPRKflc23 kann als Vektor dazu verwendet werden, heterologe Proteine oder Fragmente von Proteinen zu inkorporieren, da die Schnittstellen zwischen C-Erns und auch zwischen Erns-E1 intakt gelassen geblieben sind. 7 zeigt eine schematische Darstellung von pPRKflc23, der das HA-Epitop, einer Sequenz nicht vom Pestvirus, umfasst. Das HA-Epitop wird von den fünf äußersten N-terminalen Aminosäuren und den sechs äußersten C-terminalen Aminosäuren von Erns flankiert.
  • Beispiel 2
  • Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten CSFV Stämmen Flc4 und Flc47
  • MATERIAL UND METHODEN
  • Zellen und Viren
  • Schweinenierenzellen (SK6-M, EP 0 351 901 B1 ) wurden in Eagle's Basalmedium kultiviert, das 5% fötales Rinderserum, Glutamin (0,3 mg/ml), und die Antibiotika Penicillin (200 U/ml), Streptomycin (0,2 mg/ml), und Mycostatin (100 U/ml) enthielt. Fötales Rinderserum wurde, wie zuvor beschrieben (Moormann et al. 1990. Virology 177: 184–198), auf die Abwesenheit von BVDV und BDV Antikörper getestet.
  • Rekombinante CSFV Stamm C Viren Flc4 und Flc47 wurden vermehrt und präpariert, wie zuvor beschrieben (Moormann et al. 1996. J. Virol. 70: 763–770), mit einer geringfügigen Modifikation, dass das Kulturmedium von SK6 Zellen gegen supplementiertes Eagle's Basalmedium ausgetauscht wurde. Virenstammlösungen wurden durch das fünf- bis zehnmalige Passagieren der Viren über SK6b2 Zellen hergestellt. Die erhaltenen Virustiter lagen im Bereich von 3,5–4,5 TCID50/ml.
  • Konstruktion einer stabilen SK6 Zelllinie, die E2 exprimiert.
  • Plasmid pPRb2 enthält das E2 Gen vom CSFV Stamm Brescia unter Kontrolle der transkriptionalen und translationalen Signalen des Expressionsvektors pEVhisD12 (van Rijn et al., 1992, Vet. Microbiol. 33: 221–230). Plasmid pEVhisD12 ist ein Vektor der die Promotor/Verstärker-Sequenzen des Immediate-Early-Gens des humanen Cytomegalovirus aufweist, gefolgt von einem Codon zur Translationsinitiation und dem Gen der Histidinoldehydrogenase (hisD) unter Kontrolle des frühen SV40 Promotors, der als Selektivitätsmarker verwendet werden kann (Peeters et. al. 1992, J. Virol. 66: 894–905).
  • Zur Transfektion der SK6-Zellen mit pPRb2 wurde Lipofectamin (20 μg) (Gibco-BRL) in 50 μl Optimem-I (Gibco-BRL) verdünnt und mit Plasmid-DNA (1 μg) gemischt, die zuvor in 50 μl Optimem-I (Gibco-BRL) verdünnt wurde. Diese Mischung wurde 15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. SK6-Zellen, die in 10 cm2 Gewebekulturplatten vermehrt wurden, wurden mit Optimem-I gewaschen. Frisches Optimem-I (0,5 ml) wurde zugegeben gefolgt von der DNA-Transfektionsmischung. Nach Inkubation für 20 Stunden bei 37°C wurde die Zellen trypsiniert und in einer zehnfachen Verdünnung mit Medium, das 10 mM Histidinol enthielt, in Microtiterplatten ausgebracht. Das Medium wurde alle drei bis vier Tage ausgetauscht bis einzelnen Kolonien sichtbar wurden. Kavitäten, die einzelne Kolonien enthielten, wurden durch begrenzte Verdünnung rekloniert. Die Expression von E2 wurde durch Immunfärbung der Zellen mit Mabs b3 und b4 bestimmt (Wensvoort et al., 1986, Vet. Microbial. 21: 9–20), die gegen die konservierten Epitope von CSFV gerichtet sind.
  • Charakterisierung der stabilen Zelllinie SK6b2
  • E2 Expression der Zelllinie SK6b2 wurde durch eine Immunoperoxidasefärbung mit E2 spezifischen monoklonalen Antikörpern (Mabs) b3 und b4 getestet (Wensvoort et al., 1986, Vet. Microbiol. 21: 9–20), die gegen die konservierte Domäne A von CSFV E2 gerichtet sind, sowie mit den Mabs b6 und b8 (Wensvoort et al., 1986, Vet. Microbiol. 21: 9–20), die gegen die Domänen B und C von Brescia E2 gerichtet sind.
  • Die Menge von E2 wurde durch einen Ceditest ELISA bestimmt, der auf Mab b3 als Fängerantikörper und mit Meerrettichperoxidase gekoppeltem Mab b8 als Detektionsantikörper basiert, wie beschrieben von Colijn et. al. (Vet. Microbial. 59: 15–25, 1997).
  • Herstellung von CSFV Konstrukten voller Länge, die E2 Deletionsmutanten beinhalten
  • Plasmid pPRKflc4 ist ein Plasmid voller Länge, das eine Deletion der Domänen B/C in CSFV-E2 von Aminosäuren 693–746 (8A) beinhalten. Dafür wurde das E2 Gen, das die Deletion von Plasmid pPAb16 beinhaltet (van Rijn et al., 1996, J. Gen. Virol. 77: 2737–2745) in pPRc129 durch NgoMI/BglII Ligation insertiert (Moormann et al. 1996. J. Virol. 70: 763–770), was in Plasmid pPRc144 resultierte. Das ClaI/NcoI Fragment von pPRc144 wurde isoliert und in den mit ClaI/NcoI geschnittenen Vektor pPRKflc2 ligiert, der formal pPRKflc133 genannt wurde, (Moormann et al. 1996. J. Virol. 70: 763–770), was den voll-länge Klon pPRKflc4 ergab. Plasmid pPRKflc47 ist ein Plasmid voller Länge, das die Deletion des kompletten CSFV-E2 Gens von Aminosäure 689–1062 (8B) beinhaltet. Dazu wurde ein PCR Fragment, das die Deletion beinhaltet, von dem Plasmid pPRKflc2 amplifiziert und zwar mit dem vorwärts gerichteten Primer p1195 (5' GGC TGT TAC TAG TAA CTG GGG CAC AAG GCT TAC CAT TGG GCC AGG GTG 3') an Position 2412 der Nukleotidsequenz vom Stamm C und dem reversen Primer p403 (5' CCC GGG ATC CTC CTC CAG TTT TTT GTA AGT.GGA 3') an der Nukleotidposition 5560. Das SpeI/AflII Fragment wurde isoliert und in dem mit SpeI/AflII geschnittenen pPRc144, legiert und ergab das Plasmid pPRKc58. Das ClaI/NcoI Fragment von pPRKc58 wurde isoliert und in den mit ClaI/NcoI geschnittenen Vektor pPRKflc2 ligiert was den Klon voller Länge namens pPRKflc47 ergab.
  • Isolierung der rekombinanten Viren Flc4 und Flc47
  • Plasmid DNA von pPRKflc4 und pPRKflc47 wurde über Säulen gereinigt (Qiagen) und mit XbaI linearisiert. Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in Wasser aufgelöst. RNA wurde von den linearisierten Plasmiden (1 μg) in einem Reaktionsvolumen von 100 μl 40 mM TrisHCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM Dithiothreitol, 40 U rRNAsin (Promega), 0,5 mM jedes rNTP, and 35 U T7 RNA-Polymerase (Pharmacia) transkribiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C, wurden 10 U RNase-freie DNaseI (Pharmacia) zugegeben und die Mischung für weitere 15 Minuten inkubiert. RNA wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 10 μl Wasser aufgelöst.
  • Für RNA-Transfektionen, wurden 10 μg Lipofectin in 50 μl Optimem-I verdünnt. Nach 45 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur, werden 1 μg RNA, verdünnt in 50 μl Optimem-I, zugegeben und für weitere 15 Minuten inkubiert. SK6b2 Zellen, die 10 cm2 Gewebekulturplatten vermehrt wurden, wurden Optimem-I gewaschen und mit der RNA- Transfektionsmischung für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Dann werden die Zellen mit frischem Medium versorgt und für vier Tage bei 37°C inkubiert. Die RNA-Transfektionen wurden in Duplikaten durchgeführt. Eine Probe wurde mit Mab C5 (Wensvoort 1998, Thesis, University of Utrecht), spezifisch für C Stamm Erns, immungefärbt. Wenn die Immunofärbung auf Erns einen positiven Nachweis zeigte, dann wurde die Duplikatprobe passagiert und in zwei Proben geteilt. Eine dieser Proben wurde zur Immunfärbung vier Tage nach der Passage verwendet. Von Ansätzen bei denen Erns Expression beobachtet wurde, wurde der Zellüberstand auf frische SK6 Zellen gegeben, um die Gegenwart von infektiösen Viruspartikeln nachzuweisen. Nach vier Tagen wurden die Monolayer fixiert und wie oben Beschrieben einer Immunfärbung unterzogen
  • Charakterisierung der Flc4 und Flc47
  • Die Viren wurden durch einen Immunoperoxidase-Monolayerassay charakterisiert. Dazu wurden SK6 Zellen mit den Viren Flc2, Flc4 und Flc47 infizierten. Nach Inkubation für 4 Tage bei 37°C, wurden die Monolayer mit Mabs spezifisch für CSFV E2 (Mabs b3/b4) und CSFV Erns (Mab C5) immungefärbt.
  • ERGEBNISSE
  • Etablierung einer Zelllinie, die CSFV E2 exprimiert
  • SK6-Zellen wurden mit dem Plasmid pPRb2 transfiziert, das das CSFV Stamm Brescia E2 Gen und das Gen der Histidinolresistenz (hisD) umfasst. Nach drei Wochen wurden Kolonien, die die Selektion mit 10 mM Histidinol überlebt haben, durch limitierte Verdünnung rekloniert und auf Expression des E2 Gens durch Immunfärbung mit Mab b3, der spezifisch für das CSFV Erns Gen ist, untersucht. Dieser Klon wurde SK6b2 genannt. Die biochemischen Eigenschaften des produzierten E2 sowie der SK6b2 Zelllinie wurden charakterisiert. SK6b2 Zellen reagierten mit den E2 spezifisch Mabs in einem Immunoperoxidaseassay (Tabelle 4A) und in einem indirekten ELISA wie wildtypisches E2 (Tabelle 4B). Die Menge von E2 in den Zelllysaten von SK6b2 und SK6 Zellen, die mit Flc2 infiziert wurden, wurde über einen indirekten ELISA bestimmt und von einer Standardkurve extrapoliert. Diese wurde mit einem immunoaffinität gereinigten Präparat von E2 erstellt, das in Insektenzellen erzeugt wurde. Die Menge von E2, die in der SK6b2 Zelllinie (115 ng pro cm2) bestimmt wurde, war dreimal höher als die in den SK6 Zellen (30 ng pro cm2), die mit Flc2 infiziert waren. Das E2 Protein aus der stabilen Zelllinie zeigte eine ähnliche Mobilität wie das wildtypische E2, wie in der SDS-PAGE gezeigt werden konnte, und wurde ebenso effizient dimerisiert, wie E2, dass in Virionen gefunden wird (Thiel et al. 1991, J. Virol. 65: 4705–4712) (Tabelle 4B).
  • Herstellung und Wiedergewinnung von Stamm C CSFV E2 rekombinanten Viren.
  • Vorangegangene Studien haben gezeigt, das E2 aus zwei antigenen Untereinheiten A und B/C besteht und dass die separaten antigenen Untereinheiten von E2 Schweine gegen das klassische Schweinefieber schützen kann (van Rijn et al., 1996, J. Gen. Virol. 77: 2737–2745).
  • Daher wurden zwei Deletionsmutanten hergestellt: Plasmid pPRKflc4, dass eine Deletion in E2 von Domäne B/C zwischen Aminosäuren 693–746 aufweist, und Plasmid pPRKflc47, in dem das gesamte E2 Gen zwischen Aminosäure 689–1062 deletiert wurde. 8 zeigt eine schematische Darstellung von der Konstruktion dieser rekombinanten E2 Klone voller Länge.
  • RNA, die von der linearisierten cDNA voller Länge transkribiert wurde, wurde in die E2 exprimierende SK6b2 Zelllinie transfiziert. Die Zellen waren positiv nach Immunfärbung mit Mab C5. Dann wurden die transfizierten Zellen passagiert, um höhere Titer der Viren zu erhalten. Die Überstande, die von seriellen Passagen isoliert wurden, enthielten infektiöse Viren. Zwischen fünf und zehn Passagen waren notwendig, um einen Virustiter von ungefähr 3,5–4,5 TCID50/ml zu erhalten. Dieser Stammlösung wurde für die weitere Charakterisierung der Vieren verwendet.
  • Charakterisierung von rekombinanten E2 CSFV Viren
  • Überstände von SK6b2 Zellen wurden für die Infektion von SK6 und SK6b2 Zellen genutzt, um Flc4 und Flc47 zu charakterisieren. Vier Tage nach Infektion, waren ungefähr 30–50% der SK6b2 Zellen in der Immunoperoxidasefärbung von Erns positiv.
  • Infektion von SK6 Zellen ergab nur einzelne Zellen oder Paare einzelner Zellen, die Erns vier Tage nach der Infektion exprimerten. Dies weist darauf hin, dass die Infektion und Replikation in de SK6 Zellen stattgefunden hat aber dass dort keine Verbreitung von Zelle zu Zelle oder eine sekundäre Infektion mit den rekombinanten Viren stattgefunden hat.
  • Überstände der mit Flc4 und Flc47 infizierten SK6 Zellen wurden für die Infektion von frischen SK6 und SK6b2 Zellen verwendet, was allerdings nicht zu infizierten Zellen führte. Daher beinhalten die Überstände dieser infizierten SK6 Zellen keine infektiösen Viren (Tabelle 5). Für die Infektion mit Pestviren werden die Wechselwirkungen der viralen Hüllprotein E2 und Erns mit der Zelloberfläche als essentiell betrachtet. Aufgrund des Fehlens von E2 in den SK6 Zellen, können keine infektiösen Partikel gebildet werden. Die Infektion von SK6 Zellen mit Flc2 von infizierten SK6b2 Zellen führte zu einer positiven Immunoperoxidasefärbung von E2 und Erns sowie bei sekundären Infektion mit diesem Virus.
  • SK6 Zellen, die mit den Viren Flc4 und Flc47 infiziert waren, konnten mit Mab C5, der gegen Erns gerichtet ist, immungefärbt werden, wohingegen nur Flc4 und Flc2 mit Mab b3 reagierten, der gegen die A-Domäne von CSFV E2 gerichtet ist (Tabelle 5). Wie erwartet war Flc47 vollständig negativ bei den Mabs gegen die A-, B- und C-Domäne (Tabelle 5).
  • Transfektion von der SK6-Zelllinie mit in vitro RNA, abgeleitet von pPRKflc4 und pPRKflc47, führte zur transienten Expression von Erns, allerdings konnte durch das sechsmalige Passagieren der transfizierten Zellen keine Wiedergewinnung der rekombinanten Viren erreicht werden. Dieses weist darauf hin, dass die rekombinanten E2 Viren Flc4 und Flc47 eine Komplementierung von E2 benötigen, um einen infektiösen Virus zu erhalten.
  • Beispiel 3 (Tierexperiment: 298-47042-00/98-06)
  • Schweine, die mit Flc22 und Flc23 geimft wurden, waren gegen eine letale Belastungsinfektion mit dem virulenten CSFV Stamm Brescia geschützt.
  • Material und Methoden
  • Tiere
  • Schweine, die sechs bis sieben Wochen alt waren, wurden von gewöhnlichen Säuen erhalten. Die Schweine wurden zufällig in Gruppen unterteilt und in separaten Ställen der Hochsicherheitsanlagen von ID-DLO untergebracht. Die Tiere wurden einmal am Tag in einem Trog mit Komplettfutter-Pellets gefüttert und konnten ad libitum Wasser aus einem Nippel trinken.
  • Impfung und Belastungsinfektion
  • Die Schweine wurden in zwei Gruppen von je zwei Schweinen aufgeteilt. Die Schweine in Gruppe A wurden mit Stamm Flc23 geimpft; die Schweine in Gruppe B wurden mit Stamm Flc22 geimpft. Die Schweine wurden durch Inokulation über verschiedene Routen geimpft. Die Schweine wurden betäubt und auf ihren Rücken gelegt, bevor die Inokulation mit einer Virussuspension erfolgte (2 ml mit 105 TCID50/ml), die tropfenweise in die Nüstern eingeflößt wurde. Zusätzlich wurden zwei Milliliter der Virussuspension intravenös inokuliert und zwei weitere Milliliter wurden intradermal inokuliert. Die Impfstoffe wurden in einem Wasser-Öl-Wasser Adjuvans emulsifiziert (Hulst et al., 1993. J. Virol. 67: 5435–5442), und 2 Milliliter dieses Impfstoffes wurden intramuskulär im Nacken zwischen den Ohren inokuliert. Insgesamt erhielt jedes Schwein acht Milliliter des Impfstoffs, entsprechend 8 × 105 TCID50/ml.
  • Die Schweine wurden intranasal mit dem hundertfachen der 50%igen letalen Dosis (= 100 LD50) von CSFV Stamm Brescia 456610 (Terpstra und Wensvoort, 1988. Vet. Microbiol. 16: 123–128) vier Wochen nach der Vakzinierung belastungsinfiziert. Der virale Gehalt des Impfinokulums wurde durch Titration von Proben bestimmt, die nach Rückkehr von den Ställen genommen wurden. Die Schweine wurden sieben Wochen nach der Belastungsinfektion geopfert.
  • Klinische Beobachtungen
  • Die Schweine wurden täglich durch Tiertechniker geprüft, abnormale Befunde wurden aufgezeichnet und, wenn notwendig, wurde der leitender Veterinär gerufen. Jede Gruppe wurde mindestens für fünfzehn Minuten pro Tag bevor und während der Fütterung sowie während der Reinigung der Ställe beobachtet. Eine Abnahme der Futteraufnahme einer Gruppe oder individueller Tiere wurde aufgezeichnet. Die Körpertemperaturen wurden während einiger Tage vor der Belastungsinfektion gemessen sowie bis zu zwanzig Tage danach.
  • Blutanalyse nach der Belastungsinfektion
  • EDTA-Blutproben wurden an den Tagen 1, 2, 6, 9, 12 und 15 nach Belastungsinfektion genommen, um die Veränderungen in den Leukozytenzahlen und den Thrombozytenzahlen im Blut zu verfolgen. Eine Abnahme der Leukozytenzahl (Leukopenie) und Thrombozytenzahlen (Thrombozytopenie) ist eines der typischen Anzeichen für CSF. Normale Zellzahlen für weiße Blutzellen und Thrombozyten bewegen sich bei gewöhnlichen Schweinen in Bereichen von 11–23 109/l beziehungsweise 320–720 109/l. Beide genannten Bereiche variieren in jedem Schwein. Die Analyse der Blutzellen wurde mit einem Medonic CA 570 coulter Zähler durchgeführt. Leukopenie und Thrombozytopenie wurden als Zell- bzw. Plättchenzahl definiert, die, vorzugsweise mehr als einen Tag, beträchtlich geringer ist als die oben genannte Minimumsanzahl.
  • Virusisolierung und Detektion viraler Antigene
  • Virusisolierung: Peripherblut Leukozyten wurden von EDTA-Blutproben extrahiert, die an den Tagen 1, 2, 6, 9, 12 und 15 nach der Belastungsinfektion genommen wurden, um die Virämie zu verfolgen. Die Proben wurden bei –70°C gelagert. Die Gegenwart von CSFV in den Leukozyten wurde wie folgt ermittelt. In einer M24-Platte (Greiner) wurden 300 μl (mit ungefähr 5 × 106 Zellen) einer Suspension von Schweinenierenzellen (SK6) zu jeder Kavität gegeben und bei 37°C und 5% CO2 in einem Inkubator mit Luftbefeuchtung für 24 Stunden kultiviert. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt und 300 μl einer unverdünnten gefroren/getauten Leukozytenprobe wurden zu jeder Kavität zu geben. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde die Probe entfernt. Der Monolayer wurde dann durch Zugabe und Entfernen von 400 μl des Kulturmedium (Eagle Basalmedium) gewaschen. Daraufhin wurden 800 μl Kulturmedium (Eagle Basalmedium mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), das frei von Antikörpern gegen Pestvirus war, und 1% einer Antibiotika-Stammlösung (beinhaltend: 0,3 mg/ml Glutamine, 200 Einheiten/ml Penicillin, 0,2 mg/ml Streptomycin und 100 U/ml Mycostatin)) zu jeder Kavität zugegeben. Nach vier Tagen, wurde der Monolayer mit einer Lösung von 10% NaCl gewaschen, für eine Stunde bei 80°C getrocknet, mit einer gepufferten Lösung inkubiert, die CSFV spezifische konjugierte Antikörper enthielt, gewaschen und gefärbt. Die Monolayer wurden mikroskopisch bezüglich gefärbter Zellen ausgelesen. Die Ergebnisse wurden als „positiv" oder „negativ" für Virus ausgedrückt.
  • IFT: Post-mortem wurden Gewebeproben von Mandel, Milz, Nieren, und Ileum gesammelt und wurden durch direkte Immunofluorezenztechnik (Ressang und De Boer, 1967. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 92: 567–586) auf Gegenwart von viralem Antigen getestet. Cryostatschnitte (4 μm dick, zwei pro Organ) dieser Gewebeproben wurden fixiert und mit einem polyklonalen anti-Pestvirus Schweineserum, das mit FITC konjugiert war, inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop ausgelesen. Die Ergebnisse wurden als positiv (= Fluoreszenz) oder negativ (= keine Fluoreszenz) ausgedrückt.
  • Serologische Antwort
  • Serumblutproben aller Schweine bis auf die Kontrollen wurden für sechs Wochen in einem Wochenintervall nach der Belastungsinfektion gesammelt. Die Proben wurden bei –20°C gelagert und in einem CSFV spezifischen (Terpstra und Wensvoort. 1984 Vet. Microbiol. 33: 113–120) Virus-Neutralisationstest (NPLA) analysiert, in dem Ceditest ELISA zur Detektion von CSFV spezifischen Antikörpern gegen E2 (Colijn et al., 1997 Vet. Microbiol. 59: 15–25), sowie in einem Ceditest ELISA zur Detektion von Antikörpern gegen Erns (de Smit et al., in Vorbereitung) gestestet.
  • Titer der CSFV spezifischen neutralisierenden Antikörper im Serum wurden in einem Mikrotitersystem bestimmt. Serielle Zweifachverdünnungen von dem Serum wurden mit gleichen Volumina einer CSFV (Stamm Brescia) Suspension gemischt, die 30–300 TCID50 enthielt. Nach Inkubation für eine Stunde bei 37°C in einem CO2-Inkubator wurden ungefähr 25.000 PK-15 Zellen in jede Kavität gegeben. Nach vier Tagen wurden die Mikrotiterplatten wie zuvor beschrieben behandelt und mikroskopisch ausgelesen. Der CSFV neutralisierende Titer wurde als Reziprokwert der höchsten Verdünnung angegeben, bei der alle Vieren neutralisiert wurden.
  • Der CSFV E2-ELISA wurde anhand der Angaben des Herstellers durchgeführt (Colijn et al., 1997 ibid.). Der CSFV Erns-ELISA wurde wie folgt durchgeführt. Testsera (30 μl) werden mit dem CSFV Erns-Antigen (70 μl einer Arbeitsverdünnung von Erns des CSFV Stamm Brescia, dass in Baculoviren exprimiert wurde) in einer unbeschichteten 96-well Mikrotiterplatte, die 45 μl ELISA Puffer enthält, für 30 min bei 37°C vorinkubiert. Danach werden 50 μl of dieser Inkubationvormischung in eine Mikrotiterplatte gegeben, die mit dem Erns-spezifischen monoklonalen Antikörper 137.5 beschichtet ist und 50 μl einer Arbeitsverdünnung des mit Meerrettichperoxidase konjugierten ERNS-spezifischen monoklonalen Antikörpers 140.1.1 enthält. Die Platten werden für eine Stunde bei 37°C inkubiert, sechsmal mit 200 μl der Waschlösung gewaschen und dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 μl einer gebrauchsfertigen Lösung des chromogenen Substrates (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) inkubiert. Die Farbreaktion wird durch die Zugabe von 100 μl einer Lösung von 0,5 M H2SO4 gestoppt und die optische Dichte wurde bei 450 nm an einem Easy Reader Spektrophotometer (SLT Vienna) gemessen.
  • Ergebnisse
  • Klinische Beobachtungen, Detektion viraler Antigene, Leukozyten/Thrombozytenzahlen
  • Nach Vakzinierung entwickelte keines der Tiere klinische Symptome oder Fieber (Tabelle 6). Schweine beider Gruppen A und B entwickelten ein leichtes Fieber (40°C < T < 41°C) für drei Tage, beginnend drei Tage nach der Belastungsinfektion. Keines der vakzinierten Schweine, weder in Gruppe A (Flc23) oder B (Flc22) entwickelten eine Leukopenie oder eine Thrombozytopenie (Tabelle 6), obschon sechs Tage nach der Belastungsinfektion ein leichter Rückgang der Thrombozytenzahlen und der Leukozytenzahlen für die meisten der Schweine beobachtet wurde. In beiden Gruppen A und B, wurde kein Virus in den Leukozyten gefunden. Mehr noch waren die Organe aller Schweine IFT-negativ zum Ende des Experimentes, was auf das Fehlen einer persistenten Infektion hinweist.
  • Serologische Antwort
  • Nach Vakzinierung der Schweine in Gruppe A (Flc23) und Gruppe B (Flc22), wurden keine CSFV-spezifischen Antikörper mit dem E2-ELISA (Tabelle 7) und dem Erns-ELISA (Tabelle 8) detektiert. Dieser Befund war konsistent mit den NPLA Ergebnissen: alle vakzinierten Schweine blieben negativ auf neutralisierende Antikörper gegen CSFV (Tabelle 9). Nach der Inokulation zur Belastungsinfektion, wurden in allen inokulierten Schweinen durch den E2-ELISA maximale prozentuale Inhibierungen festgestellt. Ebenso zeigten alle vier Schweine Serokonversion in dem Erns ELISA. In dem Assay der neutralisierenden Antikörper zeigten alle inokulierten Schweine hohe Titer gegen CSFV. Diese Resultate zeigen eindeutig, dass beide Vakzine, Flc22 und Flc23, gegen eine letale Belastungsinfektion mit dem virulenten Brescia schützen, und dabei von infizierten Tieren durch den CSFV spezifisch Erns-ELISA abgegrenzt werden können. Tabelle 1) IPMA mit SK6 Monolayern transfiziert mit Erns Expressionsplasmiden, die die Nukleotidsequenzen der Autoprotease und der Strukturgene (Npro-C-rekombinantes Erns-E1-E2) enthalten
    Figure 00510001
    • * Aminosäurenummerierung von CSFV Stamm C (Moormann et. al. 1996, J. Virol. 70: 763–770)
  • Tabelle 2A) IPMA Reaktivität der SK6c26 und SK6 Zellen mit CSFV Erns Antikörpern
    Figure 00520001
  • Tabelle 2B) Vergleich von Erns aus SK6c26 Zellen und SK6 Zellen infiziert mit Flc2
    Figure 00520002
  • Tabelle 3) Neutralisierung von CSF Viren durch Antikörper
    Figure 00530001
  • Tabelle 4A) Reaktivität von SK6b2 und SK6 Zellen mit CSFV E2 Mabs
    Figure 00530002
  • Tabelle 4B) Charakterisierung der SK6b2 Zelllinie
    Figure 00530003
  • Tabelle 5) Charakterisierung von rekombinanten E2 Viren an SK6 Zellen
    Figure 00540001
  • Tabelle 6) Ergebnisse der Virusisolation, Zytopenie und Fieber nach Behandlung mit CSFV
    Figure 00540002
  • Tabelle 7) Ergebnisse des Ceditest® ELISA zur Detektion der CSFV-E2 Antikörpera
    Figure 00550001
  • Tabelle 8) Ergebnisse des Ceditest® ELISA zur Detektion der CSFV-Erns Antikörpera
    Figure 00550002
  • Tabelle 9) Ergebnisse der NPLA zur Detektion von CSFV Brescia-spezifischen neutralisierenden Antikörpern
    Figure 00560001
  • Legenden
  • 1: Schematische Darstellung von Erns von CSFV Stamm C (oben) und Übersicht der Erns Plasmide (unten). Domänen mit RNase-Aktivität sind durch ausgefüllte Balken angezeigt. Positionen der Cysteine sind durch schwarze Punkte indiziert
    • a Positionen der Deletions- und Punktmutationen mit Bezug zu Aminosäuresequenzen des offenen Leserahmens (ORF) von CSFV Stamm C (Moormann et. al., J. Virol. 1996, 70: 763–770).
    • b Cystein-zu-Serin Mutationen wurden mit weißen Punkten gekennzeichnet
    • c Das rekombinante Erns in diesen Plasmiden beinhaltet keinen C-terminalen HA tag.
    • NA: not available.
  • 2: Schematische Darstellung der Konstruktion der voll-länge DNA Kopien pPRKflc23 (A) und pPRKflc22 (B) mit Erns-Deletionen: Die Numerierung der Aminosäuresequenz entspricht dem offenen Leserahmen von CSFV Stamm C (Moormann et. al. 1996, J. Viral., 70: 763–770). PCR Primer sind mit durchgezogenen Linien indiziert und wie folgt bezeichnet: p(Nummer). Npro, Autoprotease; C, Kernprotein; Erns, E1 und E2 Hüllproteine; 5', 5' nicht kodierende Region; 3', 3' nicht kodierende Region; Amp, Gen der Ampicillinresistenz; CIP, Phosphatase aus Kälberdarm; Kan, Gen der Kanamycinresistenz; ORF: offener Leserahmen; PNK, Polynukleotidkinase; PhCMV, Promotor-/Verstärkersequenz des Immediate-Early-Gens des humanen Cytomegalovirus; T7, Promotor des Bacteriophagen T7. pPRKflc2 ist die wildtypische cDNA Kopie voller Länge des CSFV Stamm C. (B) Plasmid pPRKc129 war das Templat für die erste PCR von Erns. Die NarI Schnittstelle dieses PCR-Produktes und die ClaI Schnittstelle des Hämagglutinin-Epitops (HA) weisen kompatible Enden auf. Diese beiden PCR-Fragmente wurden in den mit BglII/SalI geschnittenen Vektor pPRKc16 durch eine Dreipunktligation insertiert. Siehe Text für detaillierte Informationen zur Konstruktion der DNA Kopien voller Länge und zu den Primersequenzen.
  • 3: Charakterisierung von rekombinanten Viren.
    • a Positionen der Cysteine sind durch schwarze Punkte gekennzeichnet, Mutationen von Cystein zu Serin sind durch weiße Punkte dargestellt.
    • b Positionen der Deletionsmutanten mit Bezug zu den Aminosäuresequenzen des CSFV Stamm C (Moormann et. al., J. Virol. 1996, 70: 763–770).
    • c Überstände von infizierten SK6c26 Zellen wurden für die Infektion von SK6 und SK6c26 Zellen verwendet. Die Zellen wurden mit Erne spezifisch Antikörper (R716 und C5) oder einem E2 spezifisch Mab (b3) immungefärbt und wurden als positiv (+) oder negativ (–) eingestuft.
    • d Viren werden als infektiöse Virus eingeschätzt, wenn Überstände der infizierten Zellen andere SK6 oder SK6b26 Zellen infizieren können. Die Verbreitung von Viren durch Ausbreitung von Zelle zu Zelle oder durch Ausbreitung über Zellteilung wird nicht als die durch einen infektiösen Virus betrachtet.
  • 4: RT-PCR von SK6c26 Zellen, die mit Flc22, Flc23 und Flc2 infizierten wurden, mit Primern, die Erns und E2 flankieren (–) negativ Kontrolle: mock-infizierte SK6c26 Zellen; M: 200 bp-Marker.
  • 5 Wachstumskinetik der rekombinanten CSFV Viren Flc22, Flc23 und des wildtypischen Virus Flc2. Subkonfluente Monolayer von SK6c26 Zellen wurden mit einer Multiplizität von 0,1 Viren infiziert und wurden für 1,5 Stunden adsorbiert. Virustiter der Zelllysate und Überstände wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durch Endpunktverdünnung auf SK6c26 Zellen bestimmt.
  • 6: Erns Aminosäuresequenzen der rekombinanten Flc22, Flc23 und des wildtypischen Stamm Flc2, ¦: indiziert die Position von Deletionen
  • 7: Schematische Darstellung von pPRKflc23, das das HA-Epitop, eine nicht pestvirale Sequenz, beinhaltet. Das HA-Epitop wird von den fünf äußersten N-terminalen Aminosäuren und den sechs äußersten C-terminalen Aminosäuren von Erns flankiert.
  • 8: Schematische Darstellung der Konstruktion von volllänge DNA Kopien pPRKflc4 (a) und pPRKflc47 (b). Die Nummerierung der Aminosäuresequenz entspricht dem offenen Leserahmen des CSFV Stamm C (Moormann et. al. 1996, J. Virol.). PCR Primer werden mit durchgezogenen Linien gekennzeichnet und bezeichnet: p(Nummer). Npro, Autoprotease; C, Kernprotein; Erns, E1 und E2 Hüllproteine; p7: p7-Protein, NS: nicht strukturelles Protein, 5', 5' nicht kodierende Region; 3', 3' nicht kodierende Region; Amp, Ampicillinresistenz; Kan: Kanamycinresistenz. pPRKflc2 ist die wildtypische DNA Kopie voller Länge von CSFV Stamm C.
    • (a) Das E2 Gen von Plasmid pPAB16 wurde in das Plasmid pPRKc129, das mit NgoMI/BglII geschnitten wurde, insertiert.
    • (b) pPRKflc2 war das Templat für die PCR-Amplifikation mit den Primern p1195 und p403. Siehe Text für detaillierte Informationen zur Konstruktion der DNA Kopien voller Länge und zu den Primersequenzen.

Claims (19)

  1. Verfahren zum Erhalt eines pestivirusartigen Partikels, umfassend: Bereitstellen einer Zelle gemäß Anspruch 9, die ein Nukleinsäure-Konstrukt aufweist, das für wenigstens ein pestivirales Protein oder einen wesentlichen, auf die virale Ausbreitung bezogenen Teil hiervon codiert, Transfitieren der Zelle mit einer rekombinanten Nukleinsäure, die von einem Pestivirus abgeleitet ist, und von welcher ein Fragment funktionell deletiert worden ist, das für das zumindest eine pestivirale, auf die virale Ausbreitung bezogene Protein codiert; es der rekombinanten Nukleinsäure, die von einem Pestivirus abgeleitet ist, zu ermöglichen, sich in der Zelle zu replizieren; es der replizierten Nukleinsäure zu ermöglichen, Teil eines Partikels zu sein, das mindestens das pestivirale Protein oder einen wesentlichen Teil hiervon umfasst, der von der Zelle stammt, und das Ermten des Partikels.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Nukleinsäurekonstrukt stabil exprimiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die von dem Pestivirus abgeleitete, rekombinante Nukleinsäure zusätzlich ein nicht pestivirales Nukleinsäurefragment umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das nicht pestivirale Fragment von einem Pathogen oder einem Cytokin abgeleitet ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin die Nukleinsäure RNA darstellt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem sich die funktionelle Deletion in einem Fragment befindet, das für ein Hüllprotein codiert.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei dem die funktionelle Deletion einen immundominanten Teil des Proteins umfasst.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, worin das strukturelle Protein ein funktionelles Hüllprotein darstellt oder mindestens einen immundominanten Teil hiervon bildet.
  9. Eine Verpackungszelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt, das für mindestens ein pestivirales Protein oder einen wesentlichen, auf die virale Ausbreitung bezogenes Teil hiervon codiert, worin das pestivirale Protein oder der wesentliche, auf die virale Ausbreitung bezogene Teil hiervon stabil von einer Nukleinsäure exprimiert wird, die in dem zellularen Genom integriert ist und das Verpacken des pestiviralen Proteins oder eines wesentlichen Teils hiervon in einem pestivirusartigen Partikel ermöglicht, und zwar nach Transfektion der Zelle mit einer rekombinanten Nukleinsäure, die sich von einem Pestivirus ableitet, bei dem das besagte pestivirale Protein funktionell deletiert worden ist.
  10. Pestivirusartiges Partikel, erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2.
  11. Verfahren zum Erhalten einer sich nicht ausbreitenden Pestivirusimpfstoffes, umfassend das Erhalten einer Vielzahl von Partikeln durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, und das Zubereiten einer Suspension der Partikel in einem geeigneten Verdünnungsmittel.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend das Kombinieren der Suspension mit einem Adjuvans.
  13. Ein sich nicht ausbreitender Pestivirusimpfstoff, erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12.
  14. Impfstoff, umfassend ein Partikel gemäß Anspruch 10 und ein Verdünnungsmittel.
  15. Impfstoff gemäß Anspruch 14, der ferner ein Adjuvans aufweist.
  16. Impfstoff gemäß Anspruch 14 oder 15, worin die Nukleinsäure von einem Pestivirusimpfstamm, beispielsweise dem C-Stamm-Virus, abgeleitet ist.
  17. Impfstoff gemäß Anspruch 14 oder 15, worin die Nukleinsäure von einem klassischen Schweinepestvirus abgeleitet ist.
  18. Impfstoff gemäß Anspruch 14 oder 15, worin die Nukleinsäure von einem rinderviralen Diarrhöevirus abgeleitet ist.
  19. Impfstoff nach Anspruch 14 oder 15, worin die Nukleinsäure von einem Borderkrankheitvirus abgeleitet ist.
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