DE60030749T2

DE60030749T2 - Prozessiertes menschliches chemokin phc-1

Info

Publication number: DE60030749T2
Application number: DE60030749T
Authority: DE
Inventors: Wolf-Georg Forssmann; Michel Detheux; Marc Parmentier; Ludger STÄNDKER
Original assignee: Pharis Biotec GmbH
Current assignee: Pharis Biotec GmbH
Priority date: 1999-10-25
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: ATE339504T1; WO2001031016A2; ES2272329T3; JP2003512843A; EP1224288A2; DE60030749D1; AU1259501A; EP1224288B1; CA2387378A1; WO2001031016A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neu identifizierte Verbindungen, auf Polynucleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenzen dieser Verbindungen codieren, sowie auf von diesen Verbindungen abgeleitete Antagonisten oder Inhibitoren für Chemokinrezeptoren und deren Verwendung auf dem Gebiet der Diagnostik und Therapeutik unter Beteiligung dieser Chemokinrezeptoren.
Stand der Technik
Chemokine sind kleine Sequenzen, die bekanntermaßen eine fundamentale Rolle in der Physiologie von akuten und chronischen Entzündungsprozessen sowie in der pathologischen Deregulation dieser Prozesse spielen.
Weiterhin sind bekanntermaßen mehrere Chemokinrezeptoren, insbesondere die als CCR5, CXCR4 und CCR3 identifizierten Chemokinrezeptoren, bei der Virusinfektion eines Patienten durch HIV beteiligt.
Die bekannten Chemokine MIP-1α, MIP-1β, RANTES MCP-2 und synthetische Verbindungen, die von diesen Chemokinen abgeleitet sind (AOP-RANTES), wurden als hauptsächliche HIV-hemmende Faktoren beschrieben.
Weiterhin wurden intensive Forschungen über die Suche nach neuen Verbindungen (im Allgemeinen synthetische Derivate von natürlichen Chemokinen und synthetische chemische Verbindungen, die mittels Durchmusterung von Bibliotheken erhalten werden) mit verbesserten Eigenschaften als Virusantagonisten oder -agonisten von Chemokinrezeptoren durchgeführt.
Ziele der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue natürliche Verbindungen sowie synthetische oder natürliche Derivate davon, die Antagonisten oder Inhibitoren verschiedener Chemokinrezeptoren und HIV-1- sowie HIV-2-Corezeptoren, insbesondere des CCR-1- und CCR-5-Rezeptors, sind und die Anwendung bei der Behandlung und/oder Prävention verschiedener Krankheiten finden, bereitzustellen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Verbindung, eine Chemokinverbindung, die mehr als 95% Homologie (oder Sequenzidentität) mit SEQ ID Nr. 1
(GPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN) aufweist, wobei diese Verbindung nicht den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 3
(MKISVAAIPFFLLITIALGTKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKI PRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN) oder SEQ ID Nr. 4
(TKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKI PRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN)(HCC-1-Peptid) entspricht, das ein ungekürztes PHC-1-Polypeptid ist, das bereits in den Dokumenten P4344397.4 und P4427395.9 sowie von P. Schulz-Knappe et al. (J. Exp. Med., Vol. 183, S. 295–299 (1999)) beschrieben ist.
Die neue Verbindung ist vorzugsweise ein Antagonist der HIV-Viren gegenüber Chemokinrezeptoren, insbesondere gegenüber den Chemokinrezeptoren CCR-1, CCR-3 und CCR-5.
Bei dem Polypeptid gemäß der Erfindung handelt es sich um das Chemokin PHC-1, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 hat, oder um biologisch aktive Fragmente oder Teile davon, wobei die Fragmente oder Teile den Chemokin- Rezeptor CCR3 und CCR5 gemäß einer Messung in einem Aequorin-Assay aktivieren.
Die aktiven Fragmente oder Teile davon sind vorteilhafterweise NH₂-terminale Aminosäuresequenzen von wenigstens 10, 15, 20, 25, 30 Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 40 Aminosäuren, besonders bevorzugt wenigstens 50 oder 55 Aminosäuren, der ursprünglichen oben beschriebenen vollständigen Sequenz SEQ ID Nr. 1, die die Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren beinhalten können, sowie ihre Derivate, insbesondere Verbindungen mit wenigstens 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 oder 55 Aminosäuren der vollständigen Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 mit einem oder mehreren zusätzlichen Aminosäureresten in der Sequenz, möglicherweise verknüpft mit oder modifiziert durch (Substitution an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen oder an einer oder mehreren Alkylgruppen) Amid-, Acetyl-, Phosphoryl- und/oder Glycosyl- oder andere Substitutionsgruppen.
Die Modifikation der ursprünglichen Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 wird vorzugsweise am C-terminalen Ende durch Fusion mit anderen Aminosäuresequenzen, Tags oder den Einbau der oben identifizierten Gruppen einschließlich fluoreszenter Gruppen an einem oder beiden Enden der ursprünglichen Sequenz SEQ ID Nr. 1 erhalten, um ein Substrat für die Durchmusterung nach proteolytischer Aktivität zu erhalten. Unter diesem Polypeptid und seinen Derivaten (Analoga) sind die Verbindungen mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 und ihre aktiven amidierten, acetylierten, phosphorylierten und/oder glycosylierten Derivate ausgeschlossen, d.h. die Verbindung, die nicht die Aktivität der Verbindung gemäß der Erfindung aufweist und die nicht an die folgenden Chemokinrezeptoren CCR-1, CCR-3, CXR-4 und/oder CCR-5 binden kann.
Vorzugsweise sind die zusätzlichen Aminosäurereste am N-terminalen oder C-terminalen Teil der Sequenz SEQ ID Nr. 1 Ketten von 2 bis 10 Aminosäuren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Derivaten oder Analoga der Verbindung gemäß der Erfindung um die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1, die eine Kopplung mit einer chemischen Gruppe am N-terminalen Ende umfasst.
In der folgenden Beschreibung werden die Peptide gemäß der Erfindung als PHC-Chemokine oder PHC-Derivate oder -Analoga identifiziert, die PHC-Peptiden entsprechen, bei denen ein Teil, vorzugsweise das N-terminale Ende, durch Kopplung oder Substitution mit einer chemischen Gruppe modifiziert ist, vorzugsweise nach einem von H. Gaertner et al. (J. Biol. Chem., Vol. 271, S. 2591–2603 (1996)) und G. Simmons et al. (Science, Vol. 276, 5. 276–279 (1997)) beschriebenen Verfahren.
Vorzugsweise haben die PHC-Derivate oder -Analoga die folgende Struktur:

– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-pentanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-caproyloxim;
– D-Met-[Gly¹]PHC;
– L-Pyrollidoncarboxoyl-[Gly¹]PHC;
– [Glyoxyloyl¹]PHC;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-acetyl-ethylamin-2-oxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-S-methyl-1-thiopropan-3-oxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-2-pentenoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-methanoxim;
– Hexanoyl-[Gly¹]PHC;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-phenylmethanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-propanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-butanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-2-butanoxim;
– Hexanyl-[Gly¹]PHC;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-2-propanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-pentanoxim;
– Nonanyl-PHC;
– [Glyoxyloyl¹]PHCPHC-2-heptanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-ethanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-heptanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-hexanoxim;
– [Glyoxyloyl¹]PHC-1-pentenoxim;
– Nonanoyl-PHC;

– CH₃-(CH₂)₄-CO-NH-CH₂-CO-PHC;
– CH₃-(CH₂)₅-H-CH₂-CO-PHC;
– CH₃-(CH₂)₇-CO-PHC;
– CH₃-(CH₂)₈-PHC;
– HOOC-(CH₂)₅-O-N=CH-CO-PHC.

Analoga der Verbindung sind auch Moleküle wie Antikörper oder andere Produkte, die durch rekombinante Chemie oder Durchmusterung von Bibliotheken erhalten werden und die die Wechselwirkungen der Verbindungen mit ihren Rezeptoren nachbilden und vorzugsweise verstärken können.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise Lysin-, Histidin-, Glutamat-, Aspartat- oder Cysteinreste, der PHC-Peptide durch Kopplung mit einer chemischen Gruppe, die die Struktur eines Polyethylenglycols hat, modifiziert. Eine solche Modifikation erlaubt eine Erhöhung der Plasmahalbwertszeit des ursprünglichen PHC-Moleküls.
Weiterhin umfasst die Verbindung gemäß der Erfindung für diagnostische Zwecke einen Marker an einem oder mehreren ihrer Enden, vorzugsweise einen Marker, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus radioaktiven Markern, Biotin- oder Streptavidinmolekülen, Enzymen und/oder Fluoreszenzmarkern besteht.
Die bevorzugten PHC-Chemokinverbindungen gemäß der Erfindung sind menschlichen Ursprungs und können durch ein Isolierungsverfahren ausgehend von humanem Blut-Ultrafiltrat (Hämofiltrat) und unter Verwendung von biologischen Assaysystemen, die ihre biologische Aktivität bestimmen, erhalten werden.
Wie in 1 gezeigt ist werden Peptide, um die Reinigung der Verbindung gemäß der Erfindung zu erreichen, aus humanem Hämofiltrat hergestellt, wie es von Schulz-Knappe et al., J. Chrom. A., Vol. 776, S. 125–132 (1997), beschrieben wird. Danach wurden die erhaltenen Hämofiltratfraktionen auf ihre stimulierende Wirkung auf Chemokinrezeptoren durchmustert, und danach wurden die biologisch aktiven Fraktionen weiter durch Chromatographieverfahren unter Verwendung verschiedener Umkehrphasen-säulenchromatographischer Schritte gereinigt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die durch die chromatographische Reinigung erhaltenen biologisch aktiven Peptide wurden einer Strukturbestimmung einschließlich Massenspektrometrie und Peptidsequenzanalyse unterzogen.
Solche Verbindungen könnten jedoch auch durch Gen-Rekombinationstechniken oder durch Synthese erhalten werden, wobei diese Verfahren möglicherweise auch Reinigungsschritte umfassen, die vom Fachmann durchgeführt werden können.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Polynucleotid, das wenigstens eine Sequenz umfasst, die die Verbindung gemäß der Erfindung codiert, vorzugsweise eine Polynucleotidsequenz, die die Verbindung mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihre aktiven Teile codiert, oder biologisch aktive Fragmente oder Teile davon, die die Aktivität der vollen Sequenz aufweisen.
Wie oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf das Polynucleotid, das die Aminosäuresequenz der Verbindung gemäß der Erfindung codiert (wie ein cDNA-Molekül, genomisches DNA-Molekül oder RNA-Molekül).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Vektor, der das Polynucleotid umfasst, vorzugsweise einen Vektor, der für die Expression in einer Zelle angepasst ist, und der das regulatorische Element umfasst, das für die Expression des Polynucleotids in einer Zelle (vorzugsweise einer Zelle, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Bakterienzelle, einer Hefezelle, einer Insektenzelle oder einer Säugerzelle besteht) notwendig ist.
Der Vektor könnte ein Plasmid oder ein Virus, vorzugsweise ein Baculovirus, ein Adenovirus, ein Retrovirus oder ein Semliki-Forest-Virus, sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die mit dem Vektor gemäß der Erfindung transformierte (gemäß dem Fachmann bekannten Techniken) Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle (wie eine Zelle, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer COS-7-Zelle, CHO-K1-Zelle, LM(tk–)-Zelle, NIH-3T3-Zelle, HEK-293-Zelle oder K-562-Zelle besteht).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung (Impfstoff), die eine wirksame Menge einer oder mehrerer Verbindungen gemäß der Erfindung sowie die Polynucleotide, die diese Verbindungen codieren, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfasst, zur Verwendung als Medikament.
Vorteilhafterweise bezieht sich ein anderer Aspekt auf die Verwendung von einer oder mehreren der Verbindungen und Polynucleotide für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention verschiedener Krankheiten (an denen CCR-1, CCR-3 und CCR-5 beteiligt sind), insbesondere viraler Infektionen, insbesondere Krankheiten (AIDS), die durch ein humanes Immunschwächevirus 1 und/oder 2 (HIV-1 und/oder HIV-2) oder die anderen oben beschriebenen Viren induziert werden; sowie für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Störungen der Zellmigration, Krankheiten oder Störungen des Immunsystems einschließlich Krebserkrankungen, Entwicklung von Tumoren und Tumormetastase sowie Hodgkin-Lymphom, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, chronische Kontaktdermatitis, entzündliche Darmkrankheit, multiple Sklerose (MS), Schlaganfall, Sarcoidose, Abstoßung von Organtransplantaten, entzündliche und neoplastische Prozesse, virale, bakterielle und Pilzinfektionen, zur Wund- und Knochenheilung und für Fehlfunktionen von regulatorischen Wachstumsfunktionen, Schmerzen, Diabetes, Fettleibigkeit, Anorexie, Bulimie, Parkinsonsche Krankheit, akutes Herzversagen, Blutunterdruck, Bluthochdruck, Harnretention, Osteoporose, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Restenose, Atherosklerose, Krankheiten, die durch übermäßige Proliferation von Zellen der glatten Muskulatur gekennzeichnet sind, Aneurysmen, Wundheilung, Krankheiten, die durch Verlust von Zellen der glatten Muskulatur oder reduzierte Proliferation von Zellen der glatten Muskulatur gekennzeichnet sind, Schlaganfall, Ischämie, Geschwüre, Allergien (einschließlich Asthma), gutartige Prostatavergrößerung, Migräne, Brechreiz, psychotische und neurologische Störungen einschließlich Angst, Schizophrenie, manisch-depressivem Irresein, Depression, Delirium, Demenz und schwerer geistiger Retardierung, degenerative Krankheiten, neurodegenerative Krankheiten, wie Alzheimer-Krankheit, und Dyskinesien, wie Chorea Huntington oder Tourette-Syndrom, neben anderen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen diagnostischen Kit oder eine diagnostische Vorrichtung, die die (möglicherweise markierten) Verbindungen und Polynucleotide gemäß der Erfindung umfassen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des diagnostischen Kits oder der diagnostischen Vorrichtung ist ein Kit bzw. eine Vorrichtung zur Überwachung der Aktivität der Verbindungen auf verschiedene Chemokinrezeptoren, insbesondere die Überwachung ihrer Aktivität mit einer Korrelation mit ihrer therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung auf eine oder mehrere der oben genannten Krankheiten oder Symptome dieser Krankheiten.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der diagnostische Kit oder die diagnostische Vorrichtung eine Diagnose- und/oder Dosierungsvorrichtung für Hochdurchsatz-Screening, die für die mit hohem Durchsatz erfolgende Identifizierung, Gewinnung und/oder Dosierung solcher Verbindungen, Analoga, Antagonisten oder Inhibitoren, die die Identifizierung hoher Mengen an Verbindungen (bekannt oder unbekannt) ermöglichen, die als Antagonisten oder Inhibitoren der Verbindungen gemäß der Erfindung wirken.
Vorzugsweise beruht die diagnostische Vorrichtung und/oder Dosierungsvorrichtung für Hochdurchsatz-Screening auf dem Verfahren, das in der internationalen Patentanmeldung WO 00/02045 beschrieben ist.
Die Hochdurchsatz-Screening-Technologie könnte nach dem Fachmann bekannten Techniken auf verschiedenen festen Trägern, wie Mikrotiterplatten oder Biochips, durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung der rekombinanten Moleküle gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments, das für die Prävention und/oder Behandlung der oben genannten Krankheiten oder Symptome dieser Krankheiten vorgesehen ist, einschließlich der Verwendung einer Nucleotidsequenz, die die rekombinanten Moleküle codiert und die möglicherweise in einen Vektor aufgenommen oder in einer Zelle exprimiert wird und der durch dem Fachmann bekannten Techniken entweder in vivo oder ex vivo verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von Varianten der Moleküle, um die Prävention und/oder das therapeutische Verfahren gemäß der Erfindung zu verbessern oder um die möglichen Nebenwirkungen, die durch das Verfahren beim Patienten induziert werden, zu reduzieren. Eine solche Modifikation kann die Deletion oder die Addition eines oder mehrerer Nucleotide, Aminosäuren oder chemischen Gruppen an die Moleküle oder die Nucleotidsequenz, die die Moleküle codiert, umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Reinigung der Verbindung PHC-1 aus humanem Hämofiltrat.
2 zeigt die Bindung der funktionellen Aktivität der pH-Verbindung auf humane rekombinante Rezeptoren, die in CHO-K1-Zellen exprimiert werden.
3 zeigt die Calciummobilisierung und die Chemotaxis, die durch die PHC-1-Verbindung in primären Zellpopulationen induziert werden.
4 zeigt die Hemmung der HIV-1-Infektion.
5 zeigt die Durchmusterung von humanen Zelllinien nach PHC-1-proteolytischer Aktivierung.
6 zeigt die Hemmung der proteolytischen Erzeugung von PHC-1 durch verschiedene Serin-Protease-Inhibitoren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass spezifisch prozessierte Chemokine PHC-1 und PHC-2 aus humanem Hämofiltrat isoliert werden können und hochaktive Agonisten verschiedener Chemokinrezeptoren darstellen. Das prozessierte Chemokin PHC-2 ist eine N-terminal verkürzte Form von PHC-1, und beide Polypeptide kommen in humanem Hämofiltrat vor und könnten die natürlich prozessierten und biologisch hochaktiven Formen der bekannten Chemokinvorläufersequenz der Chemokine HCC-1 (Schulz-Knappe et al. 1996, Journ. Exp. Med. 183, S. 295–299; Zugangs-Nr. Q16627) oder HCC-3 (Zugangs-Nr. Q13954) darstellen.
Die neu identifizierten Chemokine PHC-1 und PHC-2 gehören zur Familie der β-Chemokine. Diese β-Chemokine haben zahlreiche Funktionen, die mit Entzündung oder Wundheilung, Immunregulation, Krebs, Infektionskrankheiten und mehreren weiteren Krankheitszuständen zusammenhängen.
Das Peptid PHC-1 gemäß der Erfindung zeigt eine sehr hohe Bindungsaffinität und eine sehr starke stimulierende Aktivität gegenüber den Chemokinrezeptoren CCR1, CCR3 und CCR5. Keine Wirkungen von PHC-1 auf die Chemokinrezeptoren CCR2, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CXCR1 und CXCR4 werden beobachtet. Das Peptid PHC-1 gemäß der Erfindung beeinflusst die Chemotaxis/Migration von Eosinophilen, T-Lymphocyten, Monocyten und dendritischen Zellen und kann daher an entzündlichen Zuständen beim Menschen beteiligt sein oder kann als therapeutisches und/oder diagnostisches Mittel bei entzündlichen, immunologischen, Krebserkrankungen und Infektionen, wie viralen, bakteriellen, Pilz- und Protozoeninfektionen, insbesondere durch HIV-1 oder HIV-2 verursachten Infektionen, verwendet werden.
Aufgrund der sehr hohen Bindungsaffinität zu Chemokinrezeptor CCR5, der den wichtigsten HIV-1-Corezeptor darstellt, bewirkt das PHC-1-Polypeptid eine sehr starke Inhibition der HIV-Infektion und HIV-Replikation in humanen Zellen.
Die prozessierten Chemokine PHC-1 und PHC-2 sind menschlichen Ursprungs und können durch ein Isolierungsverfahren ausgehend von humanem Blut-Ultrafiltrat (Hämofiltrat) und unter Verwendung von biologischen Assaysystemen, die ihre biologische Aktivität bestimmen, erhalten werden. Um die Reinigung von PHC-1 und PHC-2 zu erreichen, werden Peptide aus humanem Hämofiltrat hergestellt, wie es vor kurzem in der Literatur beschrieben wurde (Schulz-Knappe et al., 1997, J. Chrom. A., 776, 125–132). Die erhaltenen Hämofiltratfraktionen wurden auf ihre stimulierende Wirkung auf Chemokinrezeptoren durchmustert. Dann wurden die biologisch aktiven Fraktionen weiter durch Chromatographieverfahren unter Verwendung verschiedener Umkehrphasensäulenchromatographischer Schritte gereinigt.
Die durch chromatographische Reinigung erhaltenen biologisch aktiven Peptide wurden einer Strukturbestimmung einschließlich Massenspektrometrie und Peptidsequenzanalyse unterzogen.
Außer der rekombinanten Produktion von PHC-1 und PHC-2 ist auch eine schrittweise Totalsynthese auf gewöhnlichen festen Phasen im Sinne einer Merrifield-Synthese möglich.
Beispiele
Beispiel 1: Isolierung der humanen Chemokine PHC-1 und PHC-2 aus Hämofiltrat
Peptide von humanem Hämofiltrat wurden so hergestellt, wie es vor kurzem in der Literatur beschrieben wurde (Schulz-Knappe, P. et al., 1997, J. Chrom. A, 776, 125–132). Kurz gesagt, die Peptide wurden aus 10 000 l humanem Hämofiltrat extrahiert, das aus einem lokalen nephrologischen Zentrum erhalten wurde. Das gesammelte Hämofiltrat stammte von 40 erwachsenen Patienten mit chronischer Nierenerkrankung. Sofort nach der Blutfiltration unter Verwendung von Ultrafiltern mit einer angegebenen Schwelle von 20 kDa wurde das Filtrat routinemäßig auf 4°C gekühlt und auf pH 3 eingestellt, um bakterielles Wachstum und Proteolyse zu verhindern. Nach der Verdünnung mit entionisiertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von < 8 mS/cm wurden die Chargen von 800–1000 l Hämofiltrat unter Verwendung von Salzsäure genau auf pH 2,7 konditioniert. Diese Chargen wurden auf einen starken Kationenaustauscher (2 l Fractogel TSK SP 650(M), Merck) aufgetragen, und die Peptide wurden mit 10 l 0,5 M Ammoniumacetat, pH 7,0, diskontinuierlich eluiert. Diese Eluate wurden bei –20°C gelagert. Um Restmengen von Plasmaalbumin in dem konzentrierten Hämofiltrat zu beseitigen, wurde ein zusätzlicher Ultrafiltrationsschritt mit vereinigten Eluaten durchgeführt, die 10 000-l-Äquivalent Hämofiltrat entsprachen. Eine Ultrafiltration wurde mit einem Sartocon-Mini-Ultrafilter (0,1 m², ps-Membran) mit einer angegebenen Mr-Schwelle von 30 kDa durchgeführt. Die Filtration wurde durch einen Druckgradienten über die Membran von 1 bar bei einer Temperatur von 5°C und einer Fließgeschwindigkeit von 5–6 l/h angetrieben.
Für den ersten Reinigungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurde das Ultrafiltrat mit entionisiertem Wasser auf eine Leitfähigkeit von 6,7 mS/cm verdünnt, mit HCl auf pH 2,7 eingestellt und auf eine zweite 10-l-Fractogel-Kationenaustauschersäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 0,01 M HCl gewaschen, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm lag. Die schrittweise diskontinuierliche Elution der gebundenen Peptide erfolgte unter Verwendung der folgenden acht Puffer: I: 0,1 M Zitronensäure, pH 3,5; II: 0,1 M Essigsäure + 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5; III: 0,1 M Äpfelsäure, pH 5,0; IV: 0,1 M Bernsteinsäure, pH 5,6; V: 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat, pH 6,6; VI: 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,4; VII: 0,1 M Ammoniumcarbonat, pH 9,0; VIII: Wasser, pH 7,0 (Entsalzungsschritt). Die resultierenden pH-Pool-Fraktionen (15 bis 25 l) wurden aufgefangen, auf pH 2–3 angesäuert und sofort einem zweiten Trennungsschritt unterzogen.
Für den zweiten Trennungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurde das Eluat der pH-Pool-Fraktion Nr. 5 auf eine Source-RPC-Säule (15 μm, 10 × 12,5 cm, Pharmacia) geladen, mit zwei Säulenvolumina Lösungsmittel A (10 mM HCl) gewaschen, und eine Trennung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min mit einem 8-l-Gradienten von 100% A (Wasser, 10 mM HCl) auf 60% B (80 Vol.-% Acetonitril, 10 mM HCl) durchgeführt. Fraktionen von 200 ml wurden aufgefangen, und die Extinktion bei 280 nm wurde überwacht. Aliquote dieser Peptidfraktionen wurden lyophilisiert und auf Bioaktivität getestet, wie es unten beschrieben ist.
Fraktion 21 enthielt die biologisch aktiven Peptide gemäß dieser Erfindung (1A).
Für den dritten Reinigungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurde die bioaktive Fraktion 21 auf eine RP-C18-Säule (15–20 μm, 300 Å, 47 × 300 mm; Vydac, Hesperia, USA) geladen, und eine Trennung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/min unter Verwendung des folgenden Gradienten und der folgenden Puffer durchgeführt: von 90% A (Wasser, 10 mM HCl) auf 50% B (80% Acetonitril, 10 mM HCl) in 48 min. Einzelne Fraktionen von 1 min wurden aufgefangen, wobei die Extinktion bei 214 nm überwacht wurde, und auf Bioaktivität getestet, wie es unten beschrieben ist. Fraktion 12 enthielt die biologisch aktiven Peptide gemäß dieser Erfindung.
Für den vierten Reinigungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurde die bioaktive Fraktion 12 auf eine RP-C4-Säule (5 μm, 100 Å, 20 × 250 mm; Biotek Silica, Östringen, Deutschland) geladen, und eine Trennung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 7 ml/min unter Verwendung des folgenden Gradienten und der folgenden Puffer durchgeführt: von 67% A (Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure) auf 58% B (80% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) in 60 min. Einzelne Fraktionen von 1 min wurden aufgefangen, wobei die Extinktion bei 214 nm überwacht wurde, und auf Bioaktivität getestet, wie es unten beschrieben ist. Die Fraktionen 13 und 14 enthielten die biologisch aktiven Peptide gemäß dieser Erfindung.
Für den fünften Reinigungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurden die erhaltenen bioaktiven Fraktionen 13 und 14 weiter auf einer analytischen RP-C18-Säule (5 μm, 30 nm, 1,0 × 25 cm; Vydac; Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min), wobei der folgende Gradient und die folgenden Puffer verwendet wurden: von 70% A (Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure) auf 45% B (80% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) in 45 min. Einzelne Fraktionen von 1 min wurden aufgefangen, wobei die Extinktion bei 214 nm überwacht wurde, und auf Bioaktivität getestet, wie es unten beschrieben ist. Die Fraktionen 19 und 20 enthielten die biologisch aktiven Peptide gemäß dieser Erfindung.
Für den sechsten Reinigungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurde die erhaltenen bioaktiven Fraktionen 19 und 20 auf eine analytische RP-C18-Säule (5 μm, 30 nm, 0,46 × 25 cm; YMC, Schernbeck, Deutschland; Fließgeschwindigkeit: 0,6 ml/min) geladen, wobei der folgende Gradient und die folgenden Puffer verwendet wurden: von 77% A (Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure) auf 38% B (80% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) in 45 min. Einzelne Fraktionen von 1 min wurden aufgefangen, wobei die Extinktion bei 214 nm überwacht wurde, und auf Bioaktivität getestet, wie es unten beschrieben ist. Fraktion 20 enthielt die biologisch aktiven Peptide gemäß dieser Erfindung.
Für den siebten Reinigungsschritt von PHC-1 und PHC-2 wurde die erhaltene bioaktive Fraktion 20 auf eine analytische RP-C18AQ-Säule (3 μm, 0,1 × 25 cm; Reprosil-pur, Fa. Maisch, Ammerbuch 3, Deutschland; Fließgeschwindigkeit: 0,02 ml/min) geladen, wobei der folgende Gradient und die folgenden Puffer verwendet wurden: von 77% A (Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure) auf 38% B (80% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) in 45 min. Einzelne Fraktionen von 0,5 min wurden aufgefangen, wobei die Extinktion bei 214 nm überwacht wurde, und auf Bioaktivität getestet, wie es unten beschrieben ist. Die gereinigten biologisch aktiven Peptide PHC-1 und PHC-2 wurden in den bioaktiven Fraktionen 45 und 46 gefunden (1B).
Eine Fraktion, die aus der Kationenaustauschchromatographie stammt, wurde auf Umkehrphasen-HPLC (C18-Säule) aufgetragen, und die biologische Aktivität der Fraktionen auf humanes CCR5 wurde bestimmt (gestrichelte Linie). Der fünfte und letzte Reinigungsschritt des aktiven Materials erfolgte durch Umkehrphasen-HPLC (C4-Säule). Der aktive Peak (gestrichelte Linie) wurde durch Massenspektrometrie und Edman-Abbau analysiert, wobei PHC-1 (Mr 7795) und HCC-1 in voller Größe (Mr 8673) als Hauptverbindungen in dieser Fraktion identifiziert wurden. Der zeitliche Verlauf der CCR5-stimulierenden Aktivität wurde durch Trypsin-Verdau von HCC-1 erhalten. Das RP-HPLC-Chromatogramm von Trypsin-verdautem HCC-1 (1 h Inkubation) zeigt die Bildung von bioaktivem (schraffiert) PHC-1 (Mr 7795) als einem der Hauptabbauprodukte. Gezeigt ist die Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils von HCC-1 voller Größe, PHC-1, HCC-3 und anderer Chemokine, die auf CCR1, CCR3 oder CCR5 wirken. Die Sternchen markieren die ersten beiden konservierten Cysteine.
Beispiel 2: Peptidanalytik
Die durch den siebten chromatographischen Schritt erhaltenen biologisch aktiven Peptide (Beispiel 1) wurden einer Strukturbestimmung unterzogen. Die Bestimmung der Masse der gereinigten Peptide wurde auf einem Sciex-API-III-Quadrupol-Massenspektrometer (Sciex, Perkin-Elmer) mit einem Elektrospray-Interface durchgeführt (ESI-MS). Die Molekülmasse des neu identifizierten Peptids PHC-1 wurde zu 7795 ± 0,9 Da bestimmt. Die Molekülmasse des neu identifizierten Peptids PHC-2 wurde zu 7479 ± 1 Da bestimmt (1E).
Die neu identifizierten biologisch aktiven Peptide wurden mit einem 473-A-Gasphasensequenzer (Applied Biosystems) durch Edman-Abbau mit mitlaufendem Nachweis von Phenylthiohydantoin-Aminosäuren unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Standardvorschrift sequenziert.
Die folgende N-terminale Sequenz wurde für PHC-1 erhalten:

X:: kein Aminosäuresignal nachweisbar

Die folgende N-terminale Sequenz wurde für PHC-2 erhalten:

X:: kein Aminosäuresignal nachweisbar

Ein Datenbankvergleich wurde mit den Datenbanken Swiss-Prot und EMBL durchgeführt. Eine Sequenzhomologie wurde etabliert und zeigte sowohl für PHC-1 als auch für PHC-2 Sequenzidentität mit der Vorläufersequenz des humanen Chemokins HCC-1 (Zugangs-Nr. Q16627) oder des humanen Chemokins HCC-3 (Zugangs-Nr. Q13954). PHC-1 und PHC-2 könnten die natürlich prozessierten, biologisch aktiven Formen des humanen Chemokins HCC-1 und/oder des humanen Chemokins HCC-3 darstellen.
Die Molekülmasse von PHC-1 (7795 Da) war genau im Einklang mit der theoretischen Masse eines Peptids, das die C-terminalen Aminosäurereste 9–74 der Vorläufersequenz des humanen Chemokins HCC-1 umfasst, welche zu 7795 Da berechnet wird. Die Molekülmasse von PHC-2 (7479 Da) war genau im Einklang mit der theoretischen Masse eines Peptids, das die C-terminalen Aminosäureres te 12–74 der Vorläufersequenz des humanen Chemokins HCC-1 umfasst, welche zu 7479 Da berechnet wird.
Das prozessierte Chemokin PHC-1 war ein starker Konkurrent der ¹²⁵I-Rantes-Bindung an CCR1 mit einem Ki von 0,023 ± 0,007 nM (Ki ± SEM). PHC-1 war ein starker Konkurrent der ¹²⁵I-Eotaxin-Bindung an CCR3 mit einem Ki von 2,7 ± 0,8 nM (Ki ± SEM). PHC-1 war ein starker Konkurrent der ¹²⁵I-MIP-1-α-Bindung an CCR5 mit einem Ki von 0,04 ± 0,01 nM (Ki ± SEM).
Beispiel 3: Biologischer Assay, der für die Reinigung von PHC-1 und PHC-2 verwendet wurde (Aequorin-Assay)
Um die Reinigung von PHC-1 und PHC-2 zu erreichen, wurde ein biologischer Assay verwendet, mit dem die Aktivierung des Chemokin-Rezeptors CCR5 gemessen wurde. Daher wurde jede der Fraktionen, die während des oben beschriebenen chromatographischen Reinigungsverfahrens getestet wurden, an CHO-K1-Zellen getestet, die stabil mit dem Chemokinrezeptor 5 (CCR5; AC P51681) transfiziert wurden. Die Aktivierung der Zellen über den CCR5-Rezeptor wurde mit dem folgenden Aequorin-Assay gemessen: Die Messung der Zunahme der intrazellulären Calciumkonzentration wurde so durchgeführt, wie es beschrieben ist (Stables J. et al. 1997, Anal. Biochem. 252, 115–126). Die verschiedenen CHO-K1-Zellen, die CCR5, Mitochondrien-Apoaequorin und Gα16 stabil exprimieren, wurden mit Ca²⁺/Mg²⁺-freier phosphatgepufferter Salzlösung (Life Technologies, Gaithersburg, MD), die mit 5 mM EDTA ergänzt war, von Platten abgesammelt, 2 min lang mit 1000 × g sedimentiert und in einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml in D-MEM-F12 (Life Technologies, Bethesda) resuspendiert. Das aktive Aequorin wurde durch Inkubation von Zellen während 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 5 μM Coelenterazin h (Molecular Probes, Eugene, OR) in D-MEM-F12-Medium, das 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt, rekonstituiert. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen in demselben Puffer zehnfach verdünnt und vor der Messung 30 Minuten lang gerührt. Dann wurden 50 μl Zellsuspension in 96-Napf-Platten, die die zu testenden Proben enthielten, injiziert. Die integrierte Lichtemission wurde mit einem Microbeta Jet (Wallac) oder einem Microlumat-Luminometer (EG&G Berthold) über 30 s aufgezeichnet. Die endgültigen Ergebnisse wurden als Prozentsatz der mit 1 μM ATP erhaltenen Reaktion aufgetragen. Das gereinigte Peptid PHC-1 (das der Sequenz des Peptids HCC-1, Reste 9–74 entsprach) zeigte eine starke Aktivierung der CCR5-transfizierten Zellen (EC₅₀ ± SDEM: 4,8 ± 1,2 nM). Im Vergleich wurden die bekannten β-Chemokine Rantes und MIP-1-α als positive Kontrollen verwendet (EC₅₀ ± SEM von 2,4 ± 0,5 nM bzw. 3,3 ± 0,8 nM). Zum Vergleich zeigten die Peptide HCC-1, Reste 1–74, und HCC-1, Reste 6–74, keine Wirkung auf die CCR5-transfizierten Zellen.
Die Ergebnisse werden als relative Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt. Die Symbole stehen für dieselben Chemokine wie bei den Bindungsgraphiken. Die Ergebnisse von Bindungs- und funktionellen Assays sind repräsentative für wenigstens 3 unabhängige Experimente.
Beispiel 4: Bindung von PHC-1 an verschiedene Chemokinrezeptoren (Bindungs- und Aequorin-Assay)
Das prozessierte Chemokin PHC-1 band mit Affinitätsbindung an verschiedene Chemokinrezeptoren.
Für die Bestimmung seiner Bindungseigenschaften wurden CHO-K1-Zellen verwendet, die stabil mit den Chemokinrezeptoren CCR1, CCR3, CCR5 transfiziert waren. Daher wurden Rohmembranextrakte, die aus den CHO-K1-Zelllinien, die die verschiedenen GPCR exprimieren, hergestellt wurden, in Radioligand-Bindungsassays verwendet. Kompetitive Bindungsassays wurden in Minisorp-Röhrchen (Nunc, Roskilde, Dänemark) in einem Gesamtvolumen von 100 μl, das 0,1 nM iodierten Liganden als Tracer, variable Konzentrationen an Konkurrenten und eine definierte Menge an Membranen enthielt, durchgeführt. Die Gesamtbindung wurde in Abwesenheit von Konkurrent gemessen, und unspezifische Bindung wurde mit einem 100fachen Überschuss an unmarkiertem Liganden gemessen. Die Proben wurden 90 Minuten lang bei 25°C inkubiert, dann über GF/B-Filter, die in 0,3% Polyethylenimin getränkt wurden, filtriert. Die Filter wurden mit einem Gamma-Szintillationszähler (Packard) vermessen. Die Bindungsparameter wurden mit der PRISM-Software (Graphpad-Software, San Diego, CA) bestimmt, wobei man eine nichtlineare Regression verwendete, die auf ein Ein-Zentrum-Konkurrenzmodell angewendet wurde.
Das prozessierte Chemokin PHC-1 war ein starker Konkurrent der ¹²⁵I-Rantes-Bindung an CCR1 mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration von 2,3 ± 0,7 nM (Ki ± SEM). PHC-1 war ein starker Konkurrent der ¹²⁵I-Eotaxin-Bindung an CCR3 mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration von 78 ± 14 nM (Ki ± SEM). PHC-1 war ein starker Konkurrent der ¹²⁵I-MIP-1-α-Bindung an CCR5 mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration von 0,04 ± 0,01 nM (Ki ± SEM).
Die Aktivität von PHC-1 wurde an CCR1 und CCR3 getestet. PHC-1 war gegenüber CCR1 aktiver als RANTES (EC₅₀ ± SEM: 2,8 ± 0,8 nM im Vergleich zu 6,3 ± 1,1 nM) und ein einigermaßen guter Agonist gegenüber CCR3 (EC₅₀ 78 ± 14 nM), während es inaktiv gegenüber CCR2, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CXCR1 und CX3CR1 war.
2 zeigt die Verbindung PHC-1, HCC-1 voller Größe und die Referenzchemokine, die an CCR1, CCR3 und CCR5 getestet wurden. Kompetitive Bindungsassays wurden mit [¹²⁵I]-RANTES bei CCR1, [¹²⁵I]-Eotaxin bei CCR3 und [¹²⁵I]-MIP-1 bei CCR5 durchgeführt. PHC-1, HCC1, MIP-1, RANTES, Eotaxin und MCP-4 wurden als Konkurrenten verwendet.
Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die Bindung in Abwesenheit von Konkurrent (100%) und unspezifische Bindung (0%) normiert. Funktionelle Assays auf Aequorin-Basis (rechte Bilder) wurden unter Verwendung von CHO-K1-Zellen durchgeführt, die den Chemokinrezeptor, Apoaequorin und G exprimierten.
Beispiel 5: Biologische Aktivität von PHC-1 auf natürliche Zellpopulationen in Bezug auf ihre Calciummobilisierung und chemotaktischen Eigenschaften
Die Migration von Zellen wurde mit einer 48-Napf-Mikrochemotaxis-Kammer-Technik (Neuroprobe, Gaithersburg, MD) bewertet. Das untere Kompartiment der Kammer wurde mit Aliquoten von 0,1% BSA-Medium oder mit Konzentrationen von jedem der verschiedenen Chemokine (verdünnt in 0,1% BSA-Medium) beladen. Das obere Kompartiment der Kammer wurde mit einer 55-μl-Zellsuspension (5·10⁵ Zellen/ml in BSA-Medium) von Zellen beladen, die zuvor isoliert und dreimal in BSA-Medium gewaschen wurden. Die beiden Kompartimente waren durch ein Polycarbonat-PVPF-Filter mit einer Porengröße von 5 μm oder 8 μm gemäß der Art der getesteten Zelle, das 2 h lang bei 37°C mit 20 μg/ml Humancollagen Typ IV beschichtet war, voneinander getrennt. Die Kammer wurde 30 bis 180 Minuten lang bei 37°C in angefeuchteter Luft mit 5% CO₂ inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde der Filter entfernt, fixiert und mit einem Diff-Quik-Kit angefärbt.
Für jede getestete Chemokinkonzentration wurden Zellen, die zur Unterseite des Filters durchwanderten, in drei stark vergrößerten Gesichtsfeldern (× 500) durch Lichtmikroskopie (nach Codieren der Proben) in dreifachen Parallelansätzen gezählt. Da die Ergebnisse von mehreren Experimenten miteinander kombiniert wurden, um die Migrationsreaktion zu bewerten, und da eine Variation der Migrationsfähigkeit zwischen verschiedenen Experimenten beobachtet wurde, ist die Reaktion auf jede der Chemokinkonzentrationen als Chemotaxisindex gezeigt. Der Chemotaxisindex in jedem Experiment wurde bewertet, indem man das folgende Verhältnis berechnete: Chemotaxisindex = Mittelwert der Anzahl von Zellen, die zu einer spezifischen Chemokinkonzentration wandern/Mittelwert der Anzahl von Zellen, die zu BSA-Medium (= 0 ng/ml Chemokin) wandern.
Die Daten sind als Mittelwert und Standardfehler (S.E.) der Chemotaxis-Indices von 3–4 Experimenten angegeben. Das Grundniveau der Zahl der transfizierten Zellen, die wandern, lag für alle getesteten Zellen (1–5) in einem ähnlichen Bereich mit einem Mittelwert von 6,7, der von 2 bis 18 Zellen pro stark vergrö ßertes Gesichtsfeld reichte. Aufgrund der großen Größe der Zellen und aufgrund von Beschränkungen durch die Größe des stark vergrößerten Gesichtsfeldes war die maximale Reaktion auf 70–80 Zellen pro stark vergrößertes Gesichtsfeld beschränkt. Die p-Werte der Migration als Reaktion auf jede der Chemokinkonzentrationen im Vergleich zur Migration als Reaktion auf BSA-Medium wurden auf der Basis der tatsächlichen Zahlen der wandernden Zellen unter Verwendung eines Student-Tests berechnet.
Für intrazelluläre Calciummessungen wurden die Zellen 30 min lang bei Raumtemperatur mit Fura-2AM beladen. Änderungen der Calciumkonzentration wurden durch ein LS-50B-Spektrofluorimeter (Perkin Elmer) überwacht, wie es in C. Grynkiewicz, N. Poenie, R. Y. Tsien, J. Biol. Chem. 260, 3440 (1985), beschrieben ist.
In Monocyten induzierte PHC-1 robuste Calciumflüsse, die mit den durch RANTES hervorgerufenen vergleichbar waren (3A). Durch 50 nM PHC-1 wurden diese Zellen gegenüber einer weiteren Stimulierung durch denselben Liganden völlig desensibilisiert (Daten nicht gezeigt), und eine weitere Reaktion auf 50 nM RANTES wurde ebenfalls beseitigt, während PHC-1 nach einer ersten Stimulierung durch RANTES weiterhin Calcium auf reduziertem Niveau mobilisieren konnte (3A). Durch die vorherige Stimulierung durch HCC-1 voller Größe, MIP-1β oder höhere RANTES-Konzentrationen konnte die Reaktion auf PHC-1 nicht völlig beseitigt werden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der monocytischen Zelllinie THP-1 erhalten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass CCR1 und CCR5 einen Teil der funktionellen Antwort von Monocyten auf PHC-1 vermitteln. In Chemotaxis-Assays mit Monocyten war PHC-1 genauso stark (maximale Migration bei 10 nM beobachtet) und effizient wie RANTES. Es war 100mal wirksamer als HCC-1 voller Größe, das als schwacher, aber effizienter Chemoattraktor erschien (C. L. Tsou et al. (1998), J. Exp. Med. 188, 603). PHC-1 mobilisierte bei Eosinophilen Calcium weniger effizient als Eotaxin (3B). Die Eotaxin-Reaktion war nach vorheriger Einwirkung von PHC-1 leicht reduziert, während die Aktivität von PHC-1 nach Stimulierung mit Eotaxin unverändert war (3B) und nach Stimulierung mit MIP-1α stark gehemmt war. Diese Ergeb nisse unterstreichen die Rolle von PHC-1 als schwacher Agonist von CCR3 und stützen die Beteiligung von CCR1 an der funktionellen Reaktion von Eosinophilen auf PHC-1. Bei Chemotaxis-Assays war PHC-1 gegenüber Eosinophilen von den meisten Spender weniger stark, aber fast so wirksam wie Eotaxin. Bei einem der Spender war HCC-1 jedoch nur bei hohen Konzentrationen schwach chemotaktisch, was der geringen CCR1-Expression zugeschrieben wurde, die bei Eosinophilen von einigen Individuen beobachtet wurde (I. Sabroe et al. (1999), J. Immunol. 162, 2946). PHC-1, aber nicht HCC-1 voller Größe, mobilisierte Calcium in Interleukin-2-konditionierten Lymphoblasten. Eine vollständige Kreuzdesensibilisierung wurde zwischen den Reaktionen auf PHC-1 und MIP-1β beobachtet, was darauf hinweist, dass CCR5 der hauptsächliche Rezeptor ist, der von PHC-1 in diesen Zellen genutzt wird. Die Migration von Lymphoblasten wurde durch PHC-1 und MIP-1α, aber nicht durch HCC-1 voller Größe stimuliert (3C). PHC-1 induzierte auch einen kleinen Calciumfluss bei Neutrophilen, und an der Desensibilisierung dieser Reaktion durch RANTES, aber nicht durch MIP-1β, war CCR1 beteiligt. Bei HCC-1 voller Länge oder PHC-1 wurde keine Chemotaxis von Neutrophilen beobachtet.
Wie in 3 gezeigt ist, wurden Monocyten, Eosinophile und IL-2-stimulierte Lymphoblasten auf ihre funktionelle Reaktion auf PHC-1, HCC-1 voller Größe und Referenzchemokine getestet. Die Stimulierung der Calciummobilisierung und die Kreuzdesensibilisierungsexperimente von 3 wurden mit Chemokinkonzentrationen von 50 nM durchgeführt. Die Zellen wurden mit Fura-2AM beladen, und die intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca²⁺]_i) wurde durch radiometrische Fluoreszenzmessung überwacht (R_340/380). Chemotaxis-Assays wurden in 48-Napf-Kammern unter Verwendung von Polycarbonatfiltermembranen durchgeführt. Die Zellmigration als Reaktion auf PHC-1, HCC-1, RANTES, Eotaxin oder MIP-1 wird als Migrationsindex angegeben.
Beispiel 6: Hemmung von Eintritt/Replikation von HIV-1 bei menschlichen Zellen durch PHC-1
Das prozessierte Chemokin PHC-1 ist ein starker Inhibitor der HIV-Replikation. Das Peptid band an Cofaktoren des HIV-1-Eintritts und blockierte in Zellkultur effizient die virale Replikation. Die antivirale Aktivität von PHC-1 wurde in einem Infektionsinhibitionsassay untersucht. P4-CCR5-Zellen (NIH AIDS Research and Reference Reagent program) (P. Charneau et al. (1994), J. Mol. Biol. 241, 651) wurden in DMEM gezüchtet, das mit 10% FCS und 1 μg/ml Puromycin ergänzt war. Die Zellen wurden in 96-Napf-Schalen mit flachem Boden ausgesät, über Nacht kultiviert und 2 Stunden lang mit den Chemokinen inkubiert, bevor sie mit Virus infiziert wurden, das 20 ng p24-Antigen in einem Gesamtvolumen von 50 μl Medium enthielt. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen zweimal gewaschen und in frischem DMEM ohne Chemokine kultiviert. Drei Tage nach der Infektion wurden die Zellen lysiert, und die β-Galactosidase-Aktivität wurde gemessen. PBMC wurden mit Hilfe von Lymphocyten-Trennmedium (Organon Teknika Corporation) isoliert. Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 20% FCS und 50 E/ml IL-2 kultiviert, und die Virusproduktion wurde durch einen Reverse-Transcriptase-Assay gemessen, wie es beschrieben ist (B. J. Potts in Techniques in HIV Research, A. Aldovini, B. D. Walker (hrsg.) (Stockton, N. Y., 1990), S. 103–106). Sowohl HCC-1 [9–74] als auch RANTES hemmten die Infektion durch den makrophagotropen Stamm YU2 (4a). RANTES reduzierte die YU2-Infektion von P4-CCR5-Zellen um mehr als 95% bei 3,2 μM und um 50% bei 1,3 μM. HCC-1 [9–74] war etwas effizienter und blockierte bei 0,5 μM die YU2-Infektion um 50%. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung des makrophagotropen Stamms JR-CSF erhalten. Mit HCC-1 der vollen Länge wurde keine inhibitorische Wirkung auf die YU2-Infektion beobachtet. Keines der drei Chemokine hemmte den T-tropen Stamm NL4-3 (4b). Im Einklang mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen⁸ verstärkte RANTES die Infektiosität von NL4-3 bei Konzentrationen von über 0,6 μM um etwa 50%. Dagegen wurde mit HCC-1 [9–74] keine verstärkende Wirkung auf die Infektiosität beobachtet (4b). Wir testeten auch, ob HCC-1 [9–74] die HIV-1-Replikation bei humanen mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) hemmen konnte. Wie in 4c und d gezeigt ist, wurde die Replikation des makrophagotropen Stamms JR-CSF durch HCC-1 [9–74] und RANTES bei Konzentrationen von 125 nM erheblich blockiert, während für den YU2-Stamm Konzentrationen von 625 nM notwendig waren. Es wurde keine Hemmung der NL4-3-Replikation beobachtet, und HCC-1 war bei allen Stämmen unwirksam.
Wie in 4 gezeigt ist, wurden Zellen, die sowohl den Corezeptor CCR5 als auch den Corezeptor CXCR4 exprimierten, in Gegenwart von HCC-1, PHC-1 oder RANTES mit dem YU2-Stamm, der CCR5 nutzt, und dem NL4-3-Stamm, der CXCR4 nutzt, infiziert. Die Daten stellen den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (s.e.m.) für in dreifachen Parallelansätzen durchgeführte Punkte dar. C, D. Humane PBMC wurden in Gegenwart von HCC-1, PHC-1 oder RANTES mit YU2 und JR-CSF infiziert. Die Daten stellen die Aktivität der Reversen Transcriptase dar, die in Zellkulturüberständen gemessen wurde, die 14 tage nach der Infektion geerntet wurden. Die Ergebnisse sind als Einheiten der photostimulierten Lumineszenz (PSL) ausgedrückt.
Beispiel 7: Erzeugung von biologisch aktivem PHC-1 durch Trypsin-Verdau von humanem Chemokin HCC-1, Aminosäurereste 1–74
Die Aminosäuresequenz beider neu identifizierter biologisch aktiver Peptide entspricht der C-terminalen Sequenz des humanen Chemokins HCC-1, das ursprünglich 74 Aminosäurereste umfasst und von dem früher geschrieben wurde, dass es in Humanplasma in nanomolaren Mengen vorkomme (Schulz-Knappe et al., 1996, Journ. Exp. Med. 183, 295–299). Da das 74 Aminosäurereste umfassende Chemokin HCC-1 mit der Molekülmasse 8673 Da bezüglich der CCR5-Rezeptor-Aktivierung und -Bindung vollständig inaktiv war und nur eine marginale Bindung an den CCR1-Rezeptor zeigte (Ki 100 nM), verwendeten wir das 74 Aminosäurereste umfassende humane Chemokin HCC-1 als Edukt in einem Verdau mit dem Enzym Trypsin, wobei man ausreichende Mengen des aus 65 Resten bestehenden Peptids PHC-1 für biologische Tests erhielt. Nach einer Stunde Inkubation (Enzym/Substrat-Verhältnis (w/w) 1/100) war das aus 74 Resten bestehende Peptid zum Teil in kleinere Fragmente gespalten. Als eines der Spaltprodukte wurde auch das neu identifizierte biologisch aktive Peptid PHC-1, das die Reste 9–74 der HCC-1-Vorläufersequenz umfasst, mit der Molmasse 7795 Da erhalten. Das Peptid dieser Erfindung wurde weiter durch zwei Schritte analytische Umkehrphasen-Chromatographie bis zur Homogenität gereinigt (Reinheit > 99%). Das durch Trypsin-Verdau von biologisch inaktivem HCC-1, 1–74 erhaltene Peptid PHC-1 wurde in den oben beschriebenen biologischen Assays getestet und zeigte die volle biologische Aktivität (2). Dagegen zeigten die Peptide HCC-1, Reste 1–74, und HCC-1, Reste 6–74, in den oben beschriebenen Assays keine Wirkung.
Beispiel 8: Identifizierung der Protease die HCC-1 der vollen Größe zu PHC-1 spaltet
Mehrere humane Zelllinien wurden durchmustert, um eine natürliche Quelle für die Protease, die PHC-1 erzeugt, zu identifizieren. 1 μM HCC-1 der vollen Größe wurde zu dem Kulturmedium von 8 tumoralen Zelllinien gegeben: PC-3 (Prostatakarzinomzelllinie, ATCC-Nr. CRL-1435, gezüchtet in Nährmedium Ham's F12 mit 10% fetalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Glutamat, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), Du-146 oder 52 (Adenokarzinomzelllinie, ATCC-Nr. HTB-81, gezüchtet in DMEM-Medium mit 10% fetalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Glutamat, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), 143-B (Osteosarkomzelllinie, ATCC-Nr. CRL-8303, gezüchtet in DMEM-Medium mit 10% fetalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Glutamat, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), Mel-22 und MeWo (Melanomzelllinien, gezüchtet in DMEM-Medium mit 10% fetalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Glutamat, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), MCF-7 (Adenokarzinomzelllinie, ATCC-Nr. HTB-22, gezüchtet in RPMI1640-Medium mit 10% fetalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Glutamat, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) und CRL-1555 (Epidermoidkarzinomzelllinie, ATCC-Nr. A431, gezüchtet in RPMI1640-Medium mit 10% fetalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Glutamat, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Nach 48 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Kulturmedium zentrifugiert und in einem Aequorinassay unter Verwendung von CCR5-exprimierenden Zellen getestet, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. 5 zeigt, dass PC-3, DU-146 und 143-B das HCC-1 der vollen Größe aktivierten. Eine unspezifische Reaktion wurde nur mit dem CRL-1555-Kulturmedium ohne Zugabe des HCC-1 der vollen Größe erhalten. Serumfreie konditionierte Medien, die von diesen verschiedenen Zelllinien erhalten wurden, waren ebenfalls in der Lage, HCC-1 der vollen Größe zu aktivieren, was darauf hinweist, dass die PHC-1-erzeugende Protease löslich ist. Da PC-3 eine große Menge an Urokinase, einer Serin-Protease, sezerniert, wurden mehrere Serin-Protease-Inhibitoren 6 Stunden lang bei 37°C in PC-3-konditioniertem Medium getestet, das mit 500 nM HCC-1 der vollen Größe inkubiert wurde. Wie in 6 gezeigt ist, senkten alle Protease-Inhibitoren die Aktivierung des HCC-1 der vollen Größe. 3 μg/ml PAI-1, ein spezifischer Urokinase-Inhibitor, war effizienter als 4 mM Pefabloc; 2 μg/ml Aprotinin war inaktiv. Weiterhin hemmte ein spezifisch blockierender Urokinase-Antikörper (monoklonaler neutralisierender Antikörper 394 gegen humane uPA-B-Kette, American Diagnostica, USA) ebenfalls die Aktivierung von HCC-1 der vollen Größe. Dann wurde gereinigte CHOAY-Urokinase (Sanofi Wintrop) 40 min lang bei 37°C mit 500 nM HCC-1 der vollen Größe inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde auf Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und die Fraktionen wurden im Aequorin-Assay mit CCR5-exprimierenden Zellen getestet. Dann wurden die aktiven Fraktionen durch Massenspektrometrie und Edman-Abbau analysiert, wobei PHC-1 und HCC-1 der vollen Größe als Hauptverbindungen in diesen Fraktionen identifiziert wurden. Wie oben angegeben, erzeugt Trypsin PHC-1 und baut PHC-1 dann zu inaktiven Fragmenten ab, wenn die Inkubationszeit erhöht wird. 50 nM PHC-1 wurde mit 10 oder 100 IE gereinigter Urokinase inkubiert. Nach 90 min Inkubation bei 37°C wurde keine Änderung der Aktivität beobachtet, was darauf hinweist, dass Urokinase PHC-1 nicht abbaut.
Sequenzprotokoll

Claims

Verbindung, die mehr als 95% Sequenzidentität mit SEQ ID Nr. 1 aufweist, oder ihre amidierten, acetylierten, phosphorylierten und/oder glycosylierten Derivate oder Fragmente oder Teile davon, wobei die Verbindung, die Derivate, Fragmente oder Teile den Chemokin-Rezeptor CCR3 und CCR5 gemäß einer Messung in einem Aequorin-Assay aktivieren.
Chemokinverbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 hat.
Chemokinverbindung gemäß Anspruch 2, modifiziert durch oder verknüpft mit einer oder mehreren Amid-, Acetyl-, Phosphoryl- und/oder Glycosylgruppen.
Chemokinverbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 3, die an den Chemokinrezeptor CCR-1 bindet.
Polynucleotid, das die Aminosäuresequenz der Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche codiert.
Vektor, der das Polynucleotid gemäß Anspruch 5 umfasst.
Zelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen geeigneten pharmazeutischen Träger und die Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 oder das Polynucleotid gemäß Anspruch 5 umfasst.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, die durch virale Infektionen induziert wird, insbesondere Krankheiten, die durch die Immunschwächeviren 1 und/oder 2 (HIV-1 und/oder HIV-2) oder Viren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Herpes-simplex-Virus, Varicella-zoster-Virus, Hepatitis-A-Viren, Hepatitis-B-Viren, Cytomegalie-Virus, Influenzavirus, Poliovirus, Rhinovirus, Masernvirus, Rötelnvirus, Tollwutvirus, Rous-Sarkom-Virus, Epstein-Barr-Virus und Pockenvirus besteht, einem bakteriellen Erreger oder einem Protisten induziert werden.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 9 für die Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Entzündung (einschließlich rheumatoider Arthritis), Krebserkrankungen (einschließlich Hodgkin-Lymphomen), Restenose, Atherosklerose, Allergien (einschließlich Asthma), Psoriasis, chronischer Kontaktdermatitis, entzündlicher Darmkrankheit, multipler Sklerose, Schlaganfall, Sarcoidose, Abstoßung von Organtransplantaten und einer Infektion, die durch einen Erreger einschließlich HIV-1 und/oder HIV-2 induziert ist (AIDS), besteht.
Diagnostischer Kit oder diagnostische Vorrichtung, umfassend die Verbindung gemäß Anspruch 1 bis 4 und/oder das Polynucleotid gemäß Anspruch 5.