DE60030698T2

DE60030698T2 - Verfahren zur herstellung eines human-papillomavirus-vakzins mit disassemblierten und reassemblierten virus-aehnlichen partikeln

Info

Publication number: DE60030698T2
Application number: DE60030698T
Authority: DE
Inventors: B. David Rahway VOLKIN; Henryk Rahway MACH; Li Rahway SHI
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: DE60030698D1; PT1165126E; NL300268I1; CA2368391C; LU91328I9; EP1165126A1; CY2007010I1; NL300269I2; CA2368391A1; LTPA2007002I1; AU3909300A; LU91327I2; LTC1165126I2; US20010021385A1; FR07C0026I1; SI1165126T1; LU91327I9; DE122007000032I1; US6245568B1; DE122007000033I1

Description

Kurzbeschreibung der Erfindung
Diese Erfindung offenbart ein Human-Papillomavirus (HPV)-Vakzin, welches virusähnliche Partikel (VLPs) enthält, die in Capsomere disassembliert und dann zu VLPs reassembliert wurden. Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung dieses Vakzins, die zu homogeneren HPV-VLPs und stark verbesserter Lagerstabilität führen.
Hintergrund der Erfindung
Human-Papillomavirus (HPV) infiziert den Genitaltrakt und wurde mit verschiedenen Dysplasien, Tumoren und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Diese Erkrankungen sind gegenwärtig Ziele für eine Vakzin-Entwicklung und Vakzine, die virusähnliche Partikel (VLPs) enthalten, welche L1 oder die Kombination von L1-+L2-Proteinen enthalten, befinden sich gegenwärtig in klinischen Versuchen.
Es wurde jedoch festgestellt, dass rekombinante L1-Protein-HPV-VLPs, die aus Hefe gereinigt wurden, während einer Langzeitlagerung, entweder in Lösung oder adsorbiert auf Aluminium-Adjuvans-Partikel, nicht stabil sind.
In der Vergangenheit haben verschiedene Forscher die Bedingungen der HPV-VLP-Assemblierung und -Disassemblierung untersucht. Beispielsweise beschreiben McCarthy et al., 1998, "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro", J. Virology 72 (1): 32–41, die Disassemblierung und Reassemblierung von rekombinanten L1-HPV 11-VLPs, gereinigt aus Insektenzellen, um eine homogene Präparation von VLPs zu erhalten. Eine verlängerte Inkubation (etwa 16 h bei 4°C) mit einer relativ hohen Konzentration an Reduktionsmittel bei physiologischer Ionenstärke wurde zur Disassemblierung der VLPs verwendet und die Entfernung des Reduktionsmittels bei höherer Ionenstärke wurde zur Reassemblierung der VLPs verwendet. Dieses Verfahren ist jedoch ziemlich zeitaufwendig.
Zur Entwicklung eines kommerziell nützliches Vakzins ist eine lagerstabile Formulierung erforderlich. Es wäre wünschenswert, ein relativ einfaches, schnelles und quantitatives Behandlungsverfahren zur Herstellung einer lagerstabilen HPV-VLP-Formulierung zu haben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabiler virusähnlicher Partikel (VLPs) des Human-Papillomavirus (HPV).
In einigen Ausführungsformen sind die reassemblierten VLPs auf ein Aluminium-Adjuvans adsorbiert.
Diese Erfindung betrifft auch die Herstellung von VLPs durch ein Verfahren, welches die Schritte umfasst:

(a) Inkubieren von gereinigten VLPs in einer Hochsalz-Dissoziationsmischung, welche 2–20 mM Dithiothreit (DTT), ein Salz, das in einem zu 0,5 M bis 1,25 M NaCl äquivalenten Bereich vorliegt, ein nichtionisches Tensid, einen Metallchelatbildner und einen Puffer umfasst, bis disassemblierte VLPs gebildet werden;
(b) Entfernen des Reduktionsmittels aus der Dissoziationsmischung; und
(c) Reassemblieren der disassemblierten VLPs; und
(d) gegebenenfalls Adsorbieren der reassemblierten HPV-VLPs auf ein Aluminium-Adjuvans.

Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfasst VLPs, hergestellt durch ein Verfahren, welches die Schritte umfasst:

(a) Inkubieren gereinigter VLPs in einer Niedrigsalz-Dissoziationsmischung, welche 2–20 mM DTT, ein Salz, das in einem zu 0,10–0,2 M NaCl äquivalenten Bereich vorliegt, ein nichtionisches Tensid, einen Metallchelatbildner und einen Puffer umfasst, bis disassemblierte VLPs gebildet werden;
(b) Entfernen des Reduktionsmittels aus der Dissoziationsmischung; und
(c) Reassemblieren der disassemblierten VLPs; und
(d) gegebenenfalls Adsorbieren der reassemblierten HPV-VLPs auf ein Aluminium-Adjuvans.

Diese Erfindung betrifft auch Vakzinformulierungen, umfassend VLPs, die mit den obigen Verfahren hergestellt wurden, und welche in einem Formulierungspuffer gelagert werden. Der Formulierungspuffer umfasst ein Salz, einen Histidin-Puffer und ein nichtionisches Tensid.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm, das die Disassemblierung und Reassemblierung von HPV 16-VLPs, wie durch Analyse mittels analytischer Ultrazentrifugation bestimmt, zeigt.
2 ist ein Diagramm, welches Partikelgrößenverteilungen von dis/reassemblierten HPV 16-VLPs (gestrichelte Linie) und unbehandelten HPV 16-VLPs (durchgezogene Linie), wie durch Analyse mittels analytischer Ultrazentrifugation bestimmt, zeigt.
3 ist ein Diagramm, welches die beschleunigte Lagerstabilität (37°C) von HPV 16-Aluminium-Vakzinformulierungen zeigt, wie bestimmt durch in vitro-Antigenität mittels BIAcore-Analyse.
4 zeigt die beschleunigte Lagerstabilität von HPV 16-VLPs in physiologischer Salzlösung, wie bestimmt durch in vitro-Antigenität mittels BIAcore-Analyse.
5 zeigt die Wirkung der Dis/Reassemblierungsbehandlung auf die thermische Stabilität verschiedener Chargen von HPV 16-VLPs, wie bestimmt durch Überwachung einer thermisch induzierten Aggregation mittels UV-Trübung (Trübungspunkt-Analyse).
6A–D zeigen die beschleunigte Lagerstabilität (37°C) von vier verschiedenen Typen (HPV 16, 11, 6a, 18) von dis/reassemblierten HPV-VLPs sowie unbehandelten Kontroll-HPV-VLPs in Lösung, wie bestimmt durch in vitro-Antigenität mittels BIAcore-Analyse. 6A ist HPV 6A; 6B ist HPV 11; 6 ist HPV 16; und 6D ist HPV 18.
7A–D zeigen die beschleunigte Lagerstabilität von vier verschiedenen Typen (HPV 16, 11, 6a, 18) von dis/reassemblierten HPV-VLPs sowie unbehandelten Kontroll-HPV-VLPs, die auf Aluminium-Adjuvans absorbiert wurden. Die Proben wurden nach Behandlung in Citratlösung, um das Antigen von Aluminium-Adjuvans freizusetzen, hinsichtlich in vitro-Antigenität mittels einer BIAcore-Analyse untersucht. 7A und 7B sind HPV 6a; 7C und 7D sind HPV 11; 7E und 7F sind HPV 16; und 7G und 7H sind HPV 18-VLPs.
8A–F sind Vergleiche der thermischen Stabilität und hydrodynamischen Größenverteilung von disassemblierten/reassemblierten HPV 6a-, HPV-11- und HPV 16-VLPs, hergestellt durch ein Disassemblierungsverfahren bei entweder annähernd physiologischen Bedingungen (Niedrigsalzverfahren) oder bei höheren Salzkonzentrationen (Hochsalzverfahren). Diese physiologischen Eigenschaften der HPV-VLPs wurden durch Trübungspunkt-Analyse und Analyse mittels analytischer Ultrazentrifugation bestimmt. Bei dem Niedrigsalzverfahren werden HPV-VLPs in 0,166 M NaCl, 10 mM TRIS-Lösung (pH 8,2) disassembliert, während bei dem Hochsalzverfahren HPV-VLPs in 0,63 M NaCl, 35 mM Phosphat und 100 mM TRIS-Lösung (pH 8,2) disassembliert werden. Beide Lösungen enthalten auch EDTA und Polysorbat 80. Die 8A und 8B zeigen die Trübungspunkt-Daten und Daten der analytischen Ultrazentrifugation von HPV 6a-VLPs; die 8C und 8D zeigen die gleiche Analyse mit HPV 11-VLPs; die 8E und 8F zeigen die gleiche Analyse mit HPV 16-VLPs.
9A–D sind die Partikelgrößenverteilung und Oberflächenaffinität von unbehandelten und dis/reassemblierten HPV-VLPs, wie mittels SEC-HPLC-Analyse gemessen. 9A ist HPV 6a; 9B ist HPV 1; 9C ist HPV 16; und 9D ist HPV 18.
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabilerer HPV-VLPs, welche befunden wurden, signifikant zur Gesamtstabilität einer HPV-Vakzinformulierung beizutragen. Die gereinigten HPV-VLPs werden hergestellt, zu mutmaßlichen Capsomeren disassembliert, in VLPs reassembliert und dann als aktiver Bestandteil in einer Vakzinformulierung verwendet.
Gemäß dieser Erfindung kann ein beliebiger Typ von HPV-VLPs als antigener Anteil der Vakzinformulierung verwendet werden. Die VLPs können nur L1-Protein oder sowohl L1- als auch L2-Protein enthalten. Die Proteine können eine Wildtyp-Aminosäurezusammensetzung aufweisen oder sie können Mutationen enthalten. VLPs, welche nur L1-Protein enthalten, das eine Wildtyp-Aminosäurezusammensetzung hat, sind bevorzugt.
Die bevorzugten HPVs sind diejenigen, welche mit einer Erkrankung assoziiert sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: HPV 1, HPV 2, HPV 3, HPV 4, HPV 6a, HPV 6b, HPV 7, HPV 10, HPV 11, HPV 16 und HPV 18, HPV 34, HPV 39, HPV 41–44 und HPV 51–55. Bevorzugte HPVs umfassen HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 und HPV 18. Darüber hinaus sind die Formulierungen dieser Erfindung für Kombinationen von HPV-Typen geeignet, einschließlich multivalenter Vakzine, die eine Mehrzahl von HPV-Antigenen enthalten, wie z.B. eine Kombination von HPV 6, 11, 16 und 18.
Es ist bevorzugt, dass die VLPs durch rekombinante Techniken hergestellt werden, wie im Stand der Technik bekannt. Es ist besonders bevorzugt, dass die zur Herstellung der VLPs verwendete Wirtszelle eine Hefezelle ist, obwohl andere Zelltypen, wie z.B. Bakterien-, Insekten- und Säugerzellen, bekannt sind und gegenwärtig als Wirte verwendet werden. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, scheint es, dass sich der Status von Disulfidbindungen in dem L1-Protein in einem VLP sich in Abhängigkeit von der Wirtszelle, die zur Expression des rekombinanten L1 verwendet wird, sowie von dem anschließenden Reinigungsverfahren unterscheiden kann. McCarthy et al., 1998, supra, beschreiben einige disulfid-vernetzte L1-Trimere in rekombinanten VLPs, die in Insektenzellen hergestellt wurden. Andererseits kann gemäß dieser Erfindung der Disulfidbindungsstatus in dem L1-Protein von VLPs, die in Hefe hergestellt wurden, differieren und somit unterschiedliche Bedingungen für eine optimale Disassemblierung und Reassemblierung erfordern.
Für einige Formulierungen ist ein an Aluminium absorbiertes Produkt wünschenswert. Im Allgemeinen beträgt in diesem Fall die Konzentration an HPV-VLPs, welche an Alumi nium adsorbiert werden, etwa 10–200 μg/ml für jeden HPV-VLP-Typ. Dies kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Antigenität des speziellen HPV-Typs und der Anwesenheit mehrerer Typen von HPVs in einem "Cocktail"-Typ von Vakzin eingestellt werden.
Disassemblierung
Nachdem die VLPs in der rekombinanten Wirtszelle hergestellt und gereinigt wurden, werden sie durch Inkubation in einer Dissoziationsmischung disassembliert. Die Disassemblierung wird hauptsächlich durch die Reduktion von Disulfidbindungen mit Dithiothreit (DTT) in einem relativ breiten Spektrum von Ionenstärkeumgebungen, variierend von physiologischen Bedingungen (auch bezeichnet als "Niedrigsalzverfahren") bis 1,25 M NaCl (auch als "Hochsalzverfahren" bezeichnet), vorangetrieben. Die Dissoziationsmischung umfasst ein Reduktionsmittel, ein Salz, ein nichtionisches Tensid, einen Metallchelatbildner und einen Puffer.
Das Reduktionsmittel ist Dithiothreit (DTT), obwohl andere Reduktionsmittel bekannt sind und verwendet werden können. In der Vergangenheit haben andere andere Reduktionsmittel (wie z.B. Beta-Mercaptoethanol; β-ME) zur Disassemblierung von HPV-Partikeln verwendet (siehe z.B. McCarthy et al., supra), sie haben jedoch eine relativ hohe Konzentration an Reduktionsmittel (5% oder 713 mM β-ME) eingesetzt. Im Gegensatz dazu ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer relativ niedrigen Konzentration des Reduktionsmittels.
Für die Zwecke der Patentbeschreibung und Ansprüche bedeutet der Begriff "relativ niedrige Konzentration eines Reduktionsmittels" etwa 2 mM bis 20 mM, falls DTT als Reduktionsmittel verwendet wird, oder, falls ein alternatives Reduktionsmittel verwendet wird, die Menge des alternativen Reduktionsmittels, welche etwa dieselbe Wirkung wie die Verwendung von 2–20 mM DTT haben würde. Eine bevorzugte Menge an Reduktionsmittel ist etwa 10 mM DTT.
Eine weitere wichtige Komponente der Dissoziationsmischung ist das Salz. Im Allgemeinen wird die Ionenstärke der Dissoziationsmischung durch die Anwesenheit von Salzen aufrecht erhalten. Fast jedes Salz, welches zur Kontrolle der Ionenstärke beitragen kann, kann verwendet werden. Bevorzugte Salze, welche zur Einstellung der Ionenstärke verwendet werden können, sind beliebige physiologisch annehmbare Salze, wie z.B. NaCl, KCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, Natriumphosphat, Natriumcitrat und Mischungen davon. Besonders bevorzugte Salze sind: NaCl, KCl und Na₂SO₄ und insbesondere NaCl.
Bei einer Niedrigsalz-Ausführungsform dieser Erfindung sollte die Dissoziationsmischung eine Ionenstärke haben, welche annähernd physiologisch ist. Für die Zwecke dieser Patent beschreibung und der Ansprüche bedeutet der Begriff "annähernd physiologisch" unter Bezug auf ein Salz 0,10–0,20 M und vorzugsweise etwa 0,15–0,18 M und bevorzugter etwa 0,16 M, wenn NaCl als Salz verwendet wird. Für andere Salze, welche verwendet werden können, liegt es im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns, eine Molarität zu berechnen, welche das Äquivalent einer annähernd physiologischen NaCl-Lösung wäre.
Alternativ kann die Dissoziation in einer Hochsalz-Umgebung stattfinden. Wie hier verwendet, bedeutet "Hochsalz" mindestens 0,5 M Salz und mindestens 10 mM Pufferungsmittel. Ein bevorzugter Bereich für hohes Salz ist 0,5 bis 1,25 M, falls das verwendete Salz NaCl ist, und ein bevorzugterer Bereich ist 0,60 bis 1,0 M. Für andere Salze liegt es im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns, eine Molarität festzustellen, welche das Äquivalent einer 0,5 M und 1,25 M NaCl-Lösung wäre.
Die erfolgreiche Verwendung eines Hochsalz-Disassemblierungsverfahrens war recht unerwartet – Literaturberichte wie Brady et al., 1977, Virology 23: 717–724, Belnap et al., 1995, J. Mol. Biol. 259: 249–263, und die veröffentlichte Patentanmeldung WO 99/13056 beschränken die Salzkonzentration auf weniger als 0,5 M NaCl. Nichtsdestoweniger wurde gefunden, dass die Verwendung einer Hochsalz-Disassemblierung insofern vorteilhaft ist, als das hohe Salz eine mögliche Proteinaggregation beschränkt, zu einer erhöhten Rückgewinnung an Proteinmasse führt und auch die Initiierung der Dis/Reassemblierungsbehandlung beim letzten Reinigungschromatographieschritt ermöglicht und somit die Anzahl der Prozessierungsschritte, die während der Reinigung erforderlich sind, verringert.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine bevorzugte Hochsalz-Lösung (z.B. 1,0 M NaCl, 10 mM TRIS-Puffer, pH 8,2, 2 mM EDTA, 0,03% Polysorbat 80 und 2–20 mM DTT) zu einer etwa 100%igen HPV-Proteinmassenrückgewinnung in dem Verfahren führt. Eine andere Hochsalz-Lösung (0,63 M NaCl, 35 mM Phosphatpuffer, 100 mM TRIS-Puffer, pH 8,2, 2 mM EDTA, 0,03% Polysorbat 80 und 2–20 mM DTT) ist ebenfalls bevorzugt.
Zum besseren Verständnis und zur besseren Charakterisierung der Wirkung der Hochsalz-Konzentration auf die Wirksamkeit der HPV-VLP-Disassemblierung wurden Vergleichsstudien unter Disassemblierungsbedingungen von sowohl hohem Salz (0,5–1,0 M NaCl) als auch niedrigem Salz (physiologisch) durchgeführt. Änderungen der statischen Lichtstreuungsintensität wurden überwacht, um die VLP-Disassemblierung zu beurteilen. Es wurde beobachtet, dass die Ergebnisse für sowohl Hochsalzbedingungen als auch physiologische Salzbedingungen ziemlich ähnlich waren – eine vollständige VLP-Disassemblierung trat innerhalb von etwa zwei Minuten nach der (20 mM) DTT-Zugabe auf. Ferner scheint die Kinetik der Disassemblierung eher durch die Konzentration des Reduktionsmittels als durch die Salzkonzentration kontrolliert zu werden, wobei eine höhere Konzentration an Reduk tionsmittel mit einer schnelleren Disassemblierung bei einer gegebenen Temperatur und einem gegebenem pH-Wert korreliert.
Andere biophysikalische Eigenschaften von VLPs, die entweder in physiologischem oder hohem Salz disassembliert und reassembliert worden waren, wurden untersucht. Thermische Stabilität und hydrodynamische Größenverteilungen für disassemblierte/reassemblierte VLPs, hergestellt unter sowohl Hochsalz- als auch Niedrigsalzbedingungen, sind ähnlich. Jedoch war die Gesamtproteinmassenrückgewinnung relativ höher (nahe 100%) für die disassemblierten/reassemblierten HPV-VLPs, die mit einem Hochsalz-Disassemblierungsverfahren hergestellt wurden.
Eine weitere Komponente der Dissoziationsmischung ist ein nichtionisches Tensid. Das nichtionische Tensid kann ausgewählt werden aus der Gruppe, welche besteht aus: Polysorbat 80, Polysorbat 20, Polyoxyethylenalkylether, Triton X-100^®, Triton X-114^®, NP-40^®, Span 85 und ein Vertreter der Pluronic-Reihe nichtionischer Tenside. Polysorbat 80 ist besonders bevorzugt. Eine bevorzugte Konzentration von Polysorbat 80 ist 0,01–0,50% und vorzugsweise etwa 0,01–0,10% und insbesondere etwa 0,03%.
Die Dissoziationsmischung sollte durch die Gegenwart eines Puffers pH-kontrolliert werden. Die Disassemblierung von HPV-VLPs kann in einem breiten Spektrum von basischen pH-Werten, wie z.B. etwa 7,0 bis 10, stattfinden. Ein bevorzugter pH-Wert ist 8,0–8,5 und vorzugsweise etwa 8,2. Ein bevorzugter Puffer ist TRIS bei 5–100 mM, vorzugsweise 5–15 mM, obwohl andere Puffer wie Phosphat verwendet werden können. TRIS ist im Allgemeinen bevorzugt, da es eine gute Kontrolle von pH-Wert und Ionenstärke unter den Bedingungen der Dissoziationsmischung ermöglicht. Gegebenenfalls kann Phosphatpuffer mit 0–50 mM hinzugefügt werden.
Ein Metallchelatbildner ist ebenfalls in der Dissoziationsmischung anwesend, um eine vollständige Disassemblierung von VLPs sicherzustellen. Ein bevorzugter Metallchelatbildner ist EDTA mit 0,5 bis 5 mM und vorzugsweise etwa 2 mM, obwohl andere bekannte Chelatbildner verwendet werden können.
Eine besonders bevorzugte Dissoziationsmischung umfasst etwa 300 μg/ml HPV-VLP-Protein in einem 10 mM TRIS-Puffer, pH 8,2, zusätzlich 0,16 M–0,18 M NaCl, 10 oder 20 mM DTT, 2 mM EDTA und 0,03% Polysorbat 80 enthaltend. Alternativ enthält die Dissoziationsmischung dieselbe Menge an Protein in 0,63 M NaCl, 35 mM Phosphat, 100 mM TRIS-Puffer, pH 8,2, 10 oder 20 mM DTT, 2 mM EDTA und 0,03% Polysorbat 80.
Ein Vorteil des Verfahrens dieser Erfindung besteht darin, dass der Disassemblierungsschritt ziemlich schnell ist und nur die Inkubation der VLPs in der Dissoziationsmischung für weniger als etwa eine Stunde bei Raumtemperatur erfordert und so kurze Zeiten wie 30–40 Minuten verwendet werden können. Gewünschtenfalls kann der Dissoziationsschritt (sowie andere Schritte des Disassemblierungs/Reassemblierungsverfahrens) unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Beispielsweise können die Pufferkomponenten steril filtriert und mit sterilen Proteinlösungen verwendet werden. Darüber hinaus können die dis/reassemblierten HPV-VLPs in Lösung vor der Verwendung oder vor der Adsorption an Aluminium-Adjuvans steril filtriert werden.
Nachdem die Disassemblierung der VLPs vollständig ist, sollte das Reduktionsmittel entfernt werden. Dies kann mittels eines Dialyseschrittes oder Diafiltrations/Ultrafiltrationsschritts erfolgen. Der Dialyseschritt umfasst eine Dialyse gegen eine Lösung von Salz (physiologische Stärke oder, falls das Hochsalz-Verfahren eingesetzt wurde, eine höhere Konzentration an Salz, wie z.B. 1 M), nichtionischem Tensid und einem ähnlichen Puffer wie dem in der Dissoziationsmischung vorhandenen, jedoch bei einem niedrigeren pH-Wert als er in der Dissoziationsmischung vorliegt. Empfohlene pH-Bereiche in diesem Dialyseschritt betragen etwa 6,5–7,5 und vorzugsweise etwa 7,0. Eine bevorzugte Dialyselösung umfasst 0,16–0,18 M NaCl, 0,01–0,03% Polysorbat 80, 10 mM Phosphat bei pH 7,0. Ein weiteres Beispiel einer empfohlenen Dialyse ist eine 1:100-Dialyse (drei Austausche, jeweils 30 Minuten) gegen eine Lösung von 0,166 M NaCl, 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0. Alternativ ist eine bevorzugte Lösung 1,0 M NaCl, 10 mM Phosphat und 0,03% Polysorbat 80, pH 7,0.
Erforderlichenfalls kann zusätzliches nichtionisches Detergens wie Polysorbat 80 dem Puffer zur Entfernung des DTT zugegeben werden, um ein ausreichendes Niveau an nichtionischem Detergens mit dem Protein während des Verfahrens aufrecht zu erhalten.
Alternativ könnte die im folgenden beschriebene Reassemblierungslösung zur Entfernung des DTT eingesetzt werden.
Bei größeren Volumina kann ein skalierbarer Diafiltrations- oder Ultrafiltrationsaufbau anstelle des Dialyseverfahrens eingesetzt werden.
Reassemblierung
Der nächste Schritt ist die Reassemblierung von VLPs. Dies kann während des oben beschriebenen Dialyseschritts, während des oben beschriebenen Diafiltrations/Ultrafiltrationsschritts oder während eines separaten oder zusätzlichen Dialyseschritts erfolgen und kann mehrere Stunden bis zu etwa 24 Stunden in Anspruch nehmen. Falls eine separate Dialyse eingesetzt wird, wird die Dialyse unter Verwendung eines Reassemblierungspuffers durchgeführt, welcher umfasst: Ionenstärkesalz im Bereich von 0,5–1,35 M NaCl, eine Metallionenquelle, einen Puffer bei pH 6,0–6,5.
Das Salz ist vorzugsweise das gleiche Salz, das in den vorherigen Schritten eingesetzt wurde, obwohl seine Konzentration vorzugsweise höher ist. Beispielsweise sollte, wenn NaCl verwendet wird, es in einer Konzentration von 0,5–1,35 M und vorzugsweise etwa 1,0 M vorliegen.
Die Quelle der Metallionen sollte eine Ca²⁺- oder Mg²⁺-Quelle sein, wie z.B. CaCl₂ oder MgCl₂, und ist mutmaßlich anwesend, um den reassemblierten VLPs Stabilität zu verleihen. Zink kann ebenfalls verwendet werden, ist jedoch typischerweise weniger vorteilhaft als die anderen Ionen. CaCl₂ ist bevorzugt. Die Menge an Metallionen sollte in einer Konzentration von etwa 1–10 mM, vorzugsweise etwa 2 mM, vorhanden sein.
Glycin oder Natriumcitrat werden als Reassemblierungspuffer-Komponente und/oder als pH-Regler zugegeben. Die Mengen liegen im Bereich von etwa 20–70 mM, vorzugsweise etwa 50 mM.
Der Puffer kann die Kombination von Glycin und Phosphat oder Citrat und Phosphat oder Citrat alleine sein. Die Verwendung von Phosphatpuffer alleine wird nicht empfohlen. Ein bevorzugter Reassemblierungspuffer ist 1 M NaCl, 2 mM Ca²⁺, 50 mM Citrat, pH 6,2, und 0,03% Polysorbat 80.
Erforderlichenfalls kann zusätzliches nichtionisches Tensid wie Polysorbat 80 dem Reassemblierungspuffer zugegeben werden, um ein ausreichendes Niveau an nichtionischem Tensid mit dem Protein während des Verfahrens aufrecht zu erhalten.
Bei größeren Volumina kann ein skalierbarer Diafiltrations- oder Ultrafiltrationsaufbau anstelle des Dialyseverfahrens eingesetzt werden.
Pufferaustausch
Schließlich können etwaige verbleibende Reagenzien mittels Dialyse unter Verwendung eines End-Dialysepuffers entfernt werden. Ein Beispiel enthält Salz (vorzugsweise NaCl) und nichtionisches Tensid und gegebenenfalls Histidin. Das Salz ist, falls es sich um NaCl handelt, vorzugsweise mit etwa 0,25 M–1 M, bevorzugter etwa 0,5 M vorhanden. Histidin kann mit 2–50 mM, vorzugsweise etwa 5–20 mM, mit einem pH-Wert von 6,0–6,5 und vorzugsweise etwa pH 6,2 vorhanden sein. Das nichtionische Tensid, wie z.B. Polysorbat 80 oder Polysorbat 20, kann mit 0,01–0,03% vorhanden sein. Ein alternativer bevorzugter Pufferaustausch ist 0,5 M NaCl und 0,03% Polysorbat 80.
Diese mehrfachen Dialyseschritte, welche zur Dis/Reassemblierung der HPV-VLPs verwendet werden, können auch mit einer Ausrüstung im größeren Maßstab wie Diafiltrations- und/oder Ultrafiltrationssystemen durchgeführt werden. Erforderlichenfalls kann zusätzliches nichtionisches Detergens wie Polysorbat 80 irgendeinem der Dis/Reassemblierungspuffer zugegeben werden, um ein ausreichendes Niveau an nichtionischem Tensid mit dem Protein während des Verfahrens aufrecht zu erhalten.
Gewünschtenfalls können die dis/reassemblierten HPV-VLPs auf ein Aluminium-Adjuvans unter Anwendung bekannter Techniken adsorbiert werden.
Gegebenenfalls kann die Stabilität der reassemblierten VLP-Formulierung durch die Zugabe von polyanionischen polymeren Exzipienten weiter erhöht werden. Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, soll der Begriff "polyanionisches Polymer" entweder Verbindungen bezeichnen, welche eine einzige lange Kette aufweisen, oder diejenigen mit mehreren vernetzten Ketten; jeder Typ besitzt mehrfache negative Ladungen entlang der Kette(n) in Lösung. Beispiele polyanionischer Polymere umfassen: Proteine, Polyanionen, Peptide und Polynukleinsäuren. Spezifische Stabilisatoren können aus der Gruppe, die aus Carboxymethylcellulose (insbesondere 10–800 cps), Heparin (6–30 kD), Polyaminosäuren (2–100 kD), wie z.B. Poly(Glu), Poly(Asp) und Poly(Glu, Phe), oxidiertes Glutathion [Glu-Cys-Gly]₂ (613 Da), Polynukleotide wie Polycytidylsäure (200–700 kD) und Polyadenylsäure (200–700 kD), RNA, DNA und Serumalbuminen besteht, ausgewählt sein.
Die Konzentration des polyanionischen polymeren Exzipienten, falls vorhanden, beträgt etwa 0,01% bis etwa 0,5%, insbesondere etwa 0,05–0,1% (Gewicht/Volumen), obwohl die Zugabe einer sogar 10fach geringeren Menge an polyanionischen Exzipienten (beispielsweise 0,01% Albumin, DNA oder Heparin) immer noch den unbehandelten HPV-VLP-Aluminiumformulierungen eine erhöhte Stabilität verleiht.
Eine typische Vakzinformulierung umfasst:
1) Aluminium-absorbiertes Produkt, enthaltend 10–200 μg/ml eines jeden HPV-VLP-Typs und 0,15–0,32 M Salzlösung; 2) 5–10 mM Histidin, pH 6,2 und 3) 0,005–0,03% nichtionisches Tensid.
Die resultierenden HPV-Vakzinformulierungen dieses Verfahrens sind bei 2–8°C bis Raumtemperatur für mindestens 6 Monate (Studie wird fortgesetzt) stabil, wie in 7 illustriert.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Verwendung eines Formulierungspuffers zur Bereitstellung einer stabilen Langzeitlagerung von Vakzinen, die mit den disassemblierten/reassemblierten VLPs hergestellt wurden. Der Formulierungspuffer umfasst 0,15–0,32 M NaCl, 5–10 mM Histidin, pH 6,2 und 0,005–0,015% Polysorbat 80. Diese Vakzinformulierungen sind bei verschiedenen Temperaturbereichen (von 4–30°C) für bis zu mindestens sechs Monate stabil. Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele dienen zur besseren Erläuterung der Erfindung.
BEISPIEL 1
Eine eingefrorene Lösung von aus Hefe erhaltenen rekombinanten L1-Protein-HPV 16-VLP (mehr als 95%ige Proteinreinheit) in 0,5 M NaCl, 0,003% Polysorbat 80, pH auf etwa 6,2 eingestellt, wurde für die meisten dieser Experimente eingesetzt. HPV 6a-VLPs und HPV 11-VLPs lagen in 0,5 M NaCl, 0,03% Polysorbat 80 vor. Die HPV 18-VLPs lagen in 0,5 M NaCl, 0,01% Polysorbat 80 vor. Einige der Studien verwendeten HPV 6a-, 11- und 16-VLPs in 75 mM Phosphatpuffer bei pH 7, enthaltend 1,25 M NaCl.
Freisetzung von HPV-VLPs von Aluminium-Adjuvans für eine anschließende in vitro-Analyse.
Zur Freisetzung von HPV-VLPs von dem Aluminium-Adjuvans wurde ein Aluminium-Lösungsverfahren entwickelt, welches die Verdünnung einer HPV-Aluminium-Formulierung in eine Hochsalz-Lösung, enthaltend Citrat und Polysorbat 80, einschloss. Die HPV-VLP-Proben aus dem Aluminium-Lösungsverfahren werden direkt einem in vitro-Antigenitätsassay unter Anwendung von BIAcore-Analyse unterworfen.
In vitro-Antigenitätsassay.
Die HPV-VLP-Proben aus dem Aluminium-Lösungsverfahren befanden sich in einer stabilisierenden Lösung von pH 6–6,5 und hoher Ionenstärke (etwa 0,5 M–1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat, enthaltend 0,02% Polysorbat 80. Die Proben wurden direkt einer BIAcore-Analyse ohne weitere Verdünnung unterworfen (unter Verwendung von HPV-VLP-Typ-spezifischem neutralisierenden Antikörper). Lösungsproben (kein Aluminium-Adjuvans) wurden auf eine Zielkonzentration in etwa 0,5–1 M NaCl vor der BIAcore-Analyse verdünnt. Alle in vitro-Antigenitätsdaten beziehen sich auf eine eingefrorene HPV-VLP-Kontrollprobe (nicht aluminium-adsorbiert).
Proteinkonzentrationsanalyse.
Die Proteinkonzentration von HPV-VLPs in sowohl Gesamtlösungen als auch formulierten Proben (nach Aluminiumlösung) wurden durch UV-Extinktionsspektren-Messung bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines HP 8452A-Dioden-Array-Spektrophotometers und einer Küvette mit einer Weglänge von 1 cm bestimmt. Die verwendeten Probenvolumina waren 100–250 μl. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung einer Multikomponenten-zweite Ableitung-Analysetechnik berechnet. Für einige Experimente wurde die Proteinkonzentration auch durch kolorimetrische BCA-Analyse bestimmt.
Hydrodynamische Größenanalyse.
Die hydrodynamische Größe von unbehandelten und dis/reassemblierten HPV-VLPs wurde durch dynamische Lichtstreuung, analytische Ultrazentrifugation und SEC-HPLC bestimmt.
Dynamische Lichtstreuungsmessungen wurden bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines Malvern 4700 Light Scattering-Systems bei 90° durchgeführt. Die scheinbare hydrodynamische Größe von HPV-VLPs wurde als Z-Mittel des hydrodynamischen Durch messers bestimmt. Jeder der Werte repräsentiert den Mittelwert von fünf Messungen derselben Probe.
Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente wurden unter Verwendung einer Beckman XL1-Analyse-Ultrazentrifuge mit UV-Nachweis bei 280 nm durchgeführt. Zwei verschiedene Verfahren wurden angewandt, um den Sedimentationskoeffizienten zu bestimmen, einschließlich Modi mit fixierter und variabler Geschwindigkeit.
SEC-HPLC-Messungen wurden bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines Waters/Millennium 2690-Systems mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren durchgeführt. Eine PL-GFC-Säule von 4000 Å (vorkonditioniert mit HPV-VLPs) wurde bei einer Flussrate von 0,4 ml/Minute unter Verwendung von 750 mM NaCl, 25 mM Phosphat-Puffer (pH 7) als mobiler Phase durchgeführt.
Elektronenmikroskopische Analyse.
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde unter Anwendung von Negativfärbung durchgeführt. Proben wurden fixiert und mit Phosphorwolframsäure angefärbt und in einem JEOL 1200 EX-Transmissionselektronenmikroskop untersucht. Mikroskopische Aufnahmen wurden von zufälligen Gebieten mit Proben, die zu verschiedenen Zeiten präpariert worden waren, bei einer Vergrößerung zwischen 30.000× und 40.000× gemacht. Eine zusätzliche dreifache Vergrößerung wurde beim Entwickeln der Drucke von den Negativen eingeführt.
Realzeit- und beschleunigte Lagerstabilitätsstudien.
HPV-Aluminium-Formulierungs-Lagerstabilitätsstudien wurden durchgeführt. Die Temperatur der Stabilitätsstudien betrug im Allgemeinen 2–8, 15, 25, 30 und 37°C. Frühere Konformationsintegritätsdaten (nicht gezeigt) mit Zirkulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Temperatur über 40–45°C signifikante Konformationsänderungen in dem L1-Protein von HPV-VLP verursacht, ein Zustand, der bei beschleunigten Lagerstabilitätsstudien definitiv zu vermeiden ist.
Die HPV-VLP-Wärmestabilität wurde auch mit Trübungsassays ermittelt, welche unter Verwendung eines HP 8452A-Dioden-Array-Spektrophotometers, der mit einer HP 845X UV-Visible System-Software und einem Temperaturkontrollsystem ausgerüstet war, durchgeführt wurden. Die Lichtstreuung der Lösungen (aufgrund von Proteinaggregation) wurde bei 350 nm in dem kinetischen Modus des Programms durch Erhöhung der Temperatur von 24°C auf 74°C mit einer kontrollierten Geschwindigkeit verfolgt.
Maus-Wirksamkeitstests.
In vivo-Immunogenität von HPV-VLPs wurde in BALB c-Mäusen beurteilt. HPV-VLPs-Proben wurden auf Aluminium-Adjuvans adsorbiert, auf mehrere Zielkonzentrationen mit Aluminium-Adjuvans verdünnt und in Mäuse injiziert. Seren wurden gewonnen und hinsichtlich Antikörperniveaus mit einem ELISA-Assay analysiert.
BEISPIEL 2
Disassemblierung und Reassemblierung von HPV-16-VLPs, wie durch Analyse mittels analytischer Ultrazentrifugation bestimmt
Wie in 1 ersichtlich, werden HPV 16-VLPs nach Inkubation in einen Puffer von pH 8,2, der 10 mM TRIS oder Phosphat, 0,166 M NaCl, 2 mM EDTA und 2 mM DTT enthält, bei Raumtemperatur für 20 Minuten disassembliert (mittlere Kurve). Die disassemblierte HPV-16-Probe zeigt einen Peak bei einem kleineren S-Wert als für L1-Capsomere erwartet, was eine Größe von HPV-L1-Protein-Pentameren nahe legt. Die obere Kurve zeigt, dass die disassemblierten HPV 16 (Capsomere) dann durch Dialyse in einen Puffer von pH 6,2, der 10 mM Natriumphosphat, 0,5 bis 1 M NaCl, 2 mM Calciumchlorid enthält, in Gegenwart von entweder Glycin oder Citrat reassembliert wurden. Die untere Kurve zeigt die unbehandelten HPV 16-VLPs.
BEISPIEL 3
Partikelgrößenverteilungen von dis/reassemblierten HPV 16-VLPs
2 zeigt Partikelgrößenverteilungen von HPV 16-VLPs, welche wie im Beispiel 2 beschrieben disassembliert und reassembliert worden waren, (gestrichelte Linie) und unbehandelte HPV 16-VLPs (ausgezogene Linie), wie durch Analyse mittels analytischer Ultrazentrifugation bestimmt. Die Daten offenbaren, dass dis/reassemblierte HPV 16-VLPs größer sind und eine homogenere Verteilung haben, wie anhand der Positionen bzw. Breite der Peaks beurteilt. Eine Elektronenmikroskopie (EM)-Analyse bestätigt die Analyse mit analytischer Ultrazentrifugation; sie zeigt, dass die dis/reassemblierten VLPs homogener sind und als rundere Partikel gleichförmiger Größe mit einem mittleren Durchmesser von etwa 80–85 nm vorliegen (EM-Daten nicht gezeigt). Unbehandelte Proben erscheinen kleiner und mit einer heterogeneren Gestalt und Größenverteilung mit einer mittleren Größe um 50–68 nm. Gleichermaßen zeigt ein späterer Datensatz, dass unbehandelte HPV 16-VLPs eine mittlere Größe von etwa 40 nm haben, während die reassemblierten HPV 16-VLPs eine mittlere Größe von etwa 60 nm aufweisen.
BEISPIEL 4
Beschleunigte Stabilität (37°C) von HPV 16-VLP-Aluminium-Vakzinformulierungen, wie mittels BIAcore-Analyse bestimmt
Die dis/reassemblierten HPV 16-VLPs sowie unbehandelte HPV 16-VLPs wurden auf Aluminium-Adjuvans (mit 160 μg/ml Protein und 450 μg/ml Al) adsorbiert und in 0,32 M NaCl, 10 mM Histidin, 0,015% Polysorbat 80, pH 6,2, formuliert. Die in vitro-Antigenität der Proben wurde zu identifizierten Zeitpunkten mittels BIAcore-Analyse einem Assay unterworfen.
In 3 sind disassemblierte und reassemblierte HPV 16-VLPs mit ausgefüllten Kreisen und offenen Kästchen dargestellt und unbehandelte VLPs sind ausgefüllte Rauten. Der Lauf 1 enthielt Citrat und Lauf 2 wies Glycin im Reassemblierungspuffer auf. Die Daten demonstrieren, dass das Dis/Reassemblierungsverfahren zu einer signifikanten und dramatischen Erhöhung der beschleunigten Lagerstabilität von an Aluminium-Adjuvans adsorbierten HPV 16-VLPs im Vergleich zu unbehandelten HPV-VLPs führt. Kein Verlust der in vitro-Antigenität von aluminium-adsorbierten dis/reassemblierten HPV-VLPs wurde in ähnlichen Experimenten beobachtet, die bei 25°C und 4°C nach drei Monaten durchgeführt wurden.
BEISPIEL 5
Beschleunigte Stabilität (37°C) von HPV 16-VLPs in Lösung mit physiologischer Salzlösung, wie mittels BIAcore-Analyse bestimmt
80 μg/ml von dis/reassemblierten HPV 16-VLPs sowie unbehandelten HPV 16-VLPs wurden in 0,15 M NaCl, 10 mM Histidin, 0,015% Polysorbat 80, pH 6,2 bei 37°C inkubiert. Die in vitro-Antigenität der Proben wurde zu identifizierten Zeitpunkten mittels BIAcore-Analyse untersucht. Die Daten demonstrieren, dass das Dis/Reassemblierungsverfahren zu einer signifikanten Erhöhung der beschleunigten Lagerstabilität von HPV 16-VLPs im Vergleich zu unbehandelten HPV-VLPs führt. Dies ist in 4 gezeigt, worin disassemblierte und reassemblierte VLPs als offene Kreise und offene Kästchen dargestellt sind; unbehandelte VLPs sind als ausgefüllte Rauten gezeigt. Der Lauf 1 enthält Citrat und der Lauf 2 weist Glycin im Reassemblierungspuffer auf.
BEISPIEL 6
Wirkung einer Dis/Reassemblierungsverfahrensbehandlung auf die thermische Stabilität verschiedener Chargen von HPV 16-VLPs wie bestimmt durch die Überprüfung von thermisch induzierter Trübungsbildung (Aggregation) mittels UV-Spektroskopie (Trübungspunkt-Analyse)
Ein Standard-Trübungspunktprotokoll wurde bei den Proben angewandt: Erwärmung von 24°C auf 74°C mit einer kontrollierten Geschwindigkeit, wobei die optische Dichte der Lösung bei 350 nm überwacht wurde. Wie in 5 gezeigt, wurden drei verschiedene Chargen von HPV 16-VLPs (Chargen 1, 2, 3) vor (gestrichelte Linien und offene Symbole) und nach (durchgezogene Linien und ausgefüllte Symbole) der Dis/Reassemblierungsbehandlung analysiert. Von diesen Proben wurden HPV 16-VLPs (Charge 1) dreimal getestet. Diese Daten demonstrieren, dass eine Dis/Reassemblierungsverfahrensbehandlung zu einer signifikanten Erhöhung der inhärenten Stabilität von HPV 16-VLPs gegenüber einer wärme-induzierten Aggregation führt. Neben der Erhöhung der thermischen Stabilität führt die Dis/Reassemblierungsverfahrensbehandlung auch zu einem einheitlicheren und homogeneren Stabilitätsprofil.
BEISPIEL 7
Die in vitro-Antigenität von unbehandelten und dis/reassemblierten VLPs wurde weiter untersucht mit einer Charge von HPV 16-VLPs, wobei sowohl unbehandelte als auch dis/reassemblierte VLPs vor und nach Adsorption an Aluminium-Adjuvans untersucht wurden. Die in vitro-Antigenität wurde mittels BIAcore-Analyse gemessen und die Proteinkonzentration durch UV-Spektroskopie und einen kolorimetrischen BCA-Assay. Das Verhältnis von Antigen zu Protein wurde dann für sowohl unbehandelte als auch dis/reassemblierte HPV 16-VLPs bestimmt. Die in vitro-Antigenität der dis/reassemblierten HPV 16-VLPs war um etwa 50% erhöht. Beispielsweise betrug das Verhältnis von Antigen zu Protein für dis/reassemblierte HPV 16-VLPs gegenüber unbehandelten 1,7 mit einem Bereich von 1,5–1,9. Diese Beobachtung wurde mittels EIA-Analyse (Mittelwert von 1,6 und Bereich von 1,4–1,8) und IVRP-Analyse (Mittelwert 1,4 und Bereich von 1,3–1,5) bestätigt.
Die in vivo-Immunogenität von unbehandelten und dis/reassemblierten, an Aluminium adsorbierten HPV 16-VLPs wurde mit einem Maus-Wirksamkeitstest ermittelt. Dieser Test ergab einen ED₅₀-Wert, welcher die Dosis (μg) von HPV-VLPs, bei der mehr als 50% der Mäuse Serokonvertierer sind, repräsentiert. Die in vivo-Immunogenität der dis/reassemblierten HPV 16-VLPs war äquivalent zu derjenigen oder besser als diejenige der unbehandelten HPV 16-VLPs. Ein Experiment zeigte einen ED₅₀-Wert von 0,034–0,062 für zwei dis/reassemblierte Proben gegenüber einem ED₅₀-Wert von 0,146 für die unbehandelte Probe. In einem zweiten Mausversuch wurde ein ED₅₀-Wert von < 0,0125 für drei dis/reassemblierte HPV-VLP-Proben gegenüber einem ED₅₀-Wert von 0,074 für die unbehandelte Probe erhalten.
BEISPIEL 8
Beschleunigte Stabilität (37°C) von unbehandelten und dis/reassemblierten HPV-VLPs in Lösung und auf Aluminium-Adjuvans, wie mittels BIAcore-Analyse bestimmt
80 μg/ml HPV-VLPs wurden in Lösung, die 0,32 M NaCl, 10 mM Histidin, 0,015% Polysorbat 80, pH 6,2, enthielt, bei 37°C inkubiert. Proben wurden hinsichtlich in vitro-Antigenität mittels BIAcore zu den in 6 angegebenen Zeiten untersucht. Die Daten zeigen an, dass die Dis/Reassemblierungsbehandlung zu einer dramatischen Erhöhung der Stabilität für die HPV-VLP-Typen 6a, 11 und 16 in Lösung bei Tests zur beschleunigten Lagerstabilität führt. Die unbehandelten HPV 18-VLPs zeigen ein Stabilitätsprofil ähnlich dem für die dis/reassemblierten VLPs für die anderen drei Typen. Keine signifikante Stabilitätserhöhung wird mit einer Behandlung der HPV 18-VLPs beobachtet, mutmaßlich aufgrund eines Unvermögens der Dis/Reassemblierungsbehandlung, HPV 18-VLPs zu beeinflussen (Daten nicht gezeigt). Die für diese Studie verwendeten Proben wurden mit dem Niedersalz-Disassemblierungsverfahren hergestellt. Der Proteinmassenrückgewinn für die vier Typen bei der Dis/Reassemblierungsbehandlung betrug etwa 85–95% für HPV 11-, 16- und 18-VLPs und etwa 60–70% für HPV 6a-VLPs. Die Ausbeute bei der Dis/Reassemblierungsbehandlung scheint von der Qualität der spezifischen Charge an HPV-VLP bezüglich der VLP-Aggregation beeinflusst zu werden. Die Proteinmassenausbeute bei der Dis/Reassemblierungsbehandlung nimmt auf fast 100% zu, wenn das Disassemblierungsverfahren unter Hochsalzbedingungen stattfindet. Eine Analyse der dis/reassemblierten HPV-VLPs durch analytische Ultrazentrifugation legt nahe, dass die Dis/Reassemblierungsbehandlung zu einer nahezu quantitativen Reassemblierung von Capsomeren in VLPs führt.
7 zeigt die Lagerstabilität und beschleunigte Stabilität von HPV-VLPs, absorbiert auf Aluminium-Adjuvans, wobei 400 μg/ml HPV-VLPs auf 450 μg/ml Aluminium-Adjuvans adsorbiert und in einer Lösung, die 0,32 M NaCl, 10 mM Histidin, 0,015% Polysorbat 80, pH 6,2 enthielt, bei 4°C, 15°C, 25°C, 30°C und 37°C inkubiert wurden. Proben wurden hinsichtlich in vitro-Antigenität durch BIAcore zu den in der Figur angegebenen Zeiten untersucht nach einer Behandlung in Citratlösung, um das Antigen von dem Aluminium-Adjuvans freizusetzen. Die Daten zeigen an, dass die Dis/Reassemblierungsbehandlung zu einer dramatischen Stabilitätserhöhung für an Aluminium adsorbierte HPV-VLP-Typen 6a, 11 und 16 bei den Tests zur beschleunigten Lagerstabilität führt. Die unbehandelten HPV 18-VLPs zeigen ein Stabilitätsprofil ähnlich dem der dis/reassemblierten VLPs für die anderen drei Typen. Keine signifikante Stabilitätserhöhung wird mit einer Disassemblierungs/Reassemblierungsbehandlung der HPV 18-VLPs beobachtet.
BEISPIEL 9
Thermische Stabilität und hydrodynamische Größenverteilung von reassemblierten HPV 6a-, HPV 11- und HPV 16-VLPs, hergestellt nach sowohl dem Niedersalz-Disassemblierungsverfahren als auch dem Hochsalz-Disassemblierungsverfahren
Proben wurden mittels Trübungspunkt-Analyse und Analyse durch analytische Ultrazentrifugation beurteilt. Bei dem Niedrigsalzverfahren werden HPV-VLPs in 0,166 M NaCl, 10 mM TRIS-Lösung (pH 8,2) disassembliert, wohingegen bei dem Hochsalzverfahren die HPV-VLPs in 0,63 M NaCl, 35 mM Phosphat und 100 mM TRIS-Lösung disassembliert werden (pH 8,2). Beide Lösungen enthalten auch EDTA und Polysorbat 80. Die Daten, wie in 8 ersichtlich, zeigen, dass die disassemblierten/reassemblierten HPV-VLPs, welche mit den Niedrigsalz- und Hochsalzverfahren hergestellt wurden, hinsichtlich ihrer thermischen Stabilität und hydrodynamischen Größenverteilung für die HPV-VLP-Typen 11, 6a und 16 ähnlich sind.
BEISPIEL 10
Partikelgrößenverteilung und Oberflächenaffinität von HPV-VLPs, wie mittels SEC-HPLC-Analyse gemessen
Dis/reassemblierte (9, durchgezogene Linie) und unbehandelte (gestrichelte Linie) HPV-VLPs (Typen 11, 16 und 6a) wurden auf einer 4000A-GPC-Größenausschlusssäule analysiert. Ein einzelner Peak wurde von dis/reassemblierten HPV-VLPs im Vergleich zu einer stärker heterogenen Verteilung unbehandelter HPV-VLPs erhalten. Die Monomer-Peaks von dis/reassemblierten HPV-VLPs haben ein kleineres Elutionsvolumen als die Monomer-Peaks von unbehandelten HPV-VLPs, was eine relativ größere Partikelgröße für die dis/reassemblierten VLPs nahe legt. Die relativ größeren Gesamtpeakflächen von dis/reassemblierten HPV-VLPs zeigen eine höhere Rückgewinnungsrate von dis/reassemblierten VLPs an, was nahe legt, dass dis/reassemblierte VLPs eine niedrigere Affinität für die Säule als unbehandelte VLPs aufweisen. Unbehandelte HPV 18-VLPs zeigen ein SEC-HPLC-Profil ähnlich dem der dis/reassemblierten VLPs für die anderen drei Typen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Human-Papillomavirus (HPV)-Vakzins, umfassend HPV-Virus-ähnliche Partikel (VLPs), wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Inkubieren von VLPs in einer Dissoziationsmischung, welche 2–20 mM Dithiothreit (DTT), ein Salz, das in einem zu 0,10–0,2 M NaCl äquivalenten Bereich vorliegt, ein nichtionisches Tensid, einen Metallchelatbildner und einen Puffer umfasst, bis disassemblierte VLPs gebildet werden; (b) Entfernen des Reduktionsmittels aus der Dissoziationsmischung; und (c) Reassemblieren der disassemblierten VLPs.
Verfahren zur Herstellung eines Human-Papillomavirus (HPV)-Vakzins, umfassend HPV-Virus-ähnliche Partikel (VLPs), wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Inkubieren von VLPs in einer Dissoziationsmischung, welche 2–20 mM Dithiothreit (DTT), ein Salz, das in einem zu 0,50–1,25 M NaCl äquivalenten Bereich vorliegt, ein nichtionisches Tensid, einen Metallchelatbildner und einen Puffer umfasst, bis disassemblierte VLPs gebildet werden; (b) Entfernen des Reduktionsmittels aus der Dissoziationsmischung; und (c) Reassemblieren der disassemblierten VLPs.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Salz in der Dissoziationsmischung aus NaCl, KCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, Natriumphosphat, Natriumcitrat und Mischungen davon ausgewählt ist und vorzugsweise NaCl ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Salz in der Dissoziationsmischung NaCl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei das nichtionische Tensid in der Dissoziationsmischung aus Polysorbat 80, Polysorbat 20, Polyoxyethylenalkylethern, Triton X-100^®, Triton X-114^®, NP-40^®, Span 85 und einem nichtionischen Pluronic-Tensid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das nichtionische Tensid 0,01–0,5% Polysorbat 80 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Puffer in der Dissoziationsmischung TRIS oder Phosphatpuffer bei pH 7–10 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Metallchelatbildner in der Dissoziationsmischung EDTA bei 0,5–5 mM ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt (a) für weniger als eine Stunde bei Raumtemperatur stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Schritt (a) für 30–40 Minuten bei Raumtemperatur stattfindet.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt (b) einen Dialyse- oder Diafiltrations/Ultrafiltrations-Schritt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Dialyseschritt eine Dialyse oder Diafiltration/Ultrafiltration gegen eine Lösung mit einer physiologischen Salzkonzentration oder einer höheren Salzkonzentration, einem nichtionischen Tensid und Puffer bei einem niedrigeren pH-Wert als in der Dissoziationsmischung vorliegt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Dialyseschritt eine Dialyse oder Diafiltration/Ultrafiltration in einem Reassemblierungspuffer umfasst, wobei der Reassemblierungspuffer Ionenstärken-Salz im Bereich von 0,5–1,35 M NaCl, eine Metallionenquelle und einen Puffer bei pH 6,0–6,5 umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt (c) einen Dialyse- oder Diafiltrations/Ultrafiltrations-Schritt mit einem Reassemblierungspuffer umfasst, wobei der Reassemblierungspuffer Ionenstärken-Salz im Bereich von 0,5–1,35 M NaCl, eine Metallionenquelle und einen Puffer bei pH 6,0–6,5 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Metallionenquelle eine Ca²⁺- oder eine Mg²⁺-Quelle ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Metallionenquelle CaCl₂ oder MgCl₂ bei 0,5–5,0 mM ist.
Verfahren nach Anspruch 13, 14 oder 15, wobei der Puffer a) Glycin und Phosphat, b) Citrat und Phosphat, oder c) Citrat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Reassemblierungspuffer 1 M NaCl, 2 mM Ca²⁺, 50 mM Citrat, pH 6,2, und 0,03% Polysorbat 80 umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend: d) Weiteres Reinigen mit einem Dialyseschritt, umfassend einen Endpuffer, der 0,25–1,25 M NaCl und ein nichtionisches Detergens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Endpuffer ferner einen Histidinpuffer bei pH 6,0–6,5 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das nichtionische Detergens Polysorbat 80 oder Polysorbat 20 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend das Adsorbieren der dis/reasssemblierten VLPs auf ein Aluminium-Adjuvans.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die VLPs aus HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, HPV 18 und Kombinationen davon ausgewählt sind.
Verfahren zur Herstellung von Human-Papillomavirus (HPV)-Vakzin, umfassend HPV-Virus-ähnliche Partikel (VLPs), wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Inkubieren von VLPs in einer Niedrigsalz-Dissoziationsmischung für 30–40 Minuten, wobei die Dissoziationsmischung umfasst: 0,16–0,18 M NaCl, 2–20 mM DTT, 0,01–0,03% Polysorbat 80, 0,5–5 mM EDTA und 5–15 mM TRIS-Puffer bei pH 8,2, um disassemblierte VLPs zu bilden; (c) Reassemblieren der disassemblierten VLPs mittels Dialyse gegen einen Reassemblierungspuffer, wobei der Reassemblierungspuffer 1,0 M NaCl, 2 mM CaCl₂ und einen Puffer von pH 6,2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 50 mM Natriumcitrat, 50 mM Glycin und Phosphat, und 50 mM Citrat, umfasst; und (d) Weiteres Reinigen der reassemblierten VLPs mittels Dialyse gegen einen Endpuffer, der 0,5 M NaCl und 10 mM Histidin, pH 6,2, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, welches ferner als Schritt (b) umfasst das Entfernen des DTT aus der Dissoziationsmischung mittels Dialyse gegen einen Puffer, der 0,16–0,18 M NaCl, 0,01–0,03% Polysorbat 80 und 10 mM Phosphat bei pH 7,0 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, ferner umfassend (e) Adsorbieren der reassemblierten VLPs aus Schritt (d) auf ein Aluminium-Adjuvans.
Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen Human-Papillomavirus (HPV)-Vakzins, umfassend HPV-Virus-ähnliche Partikel (VLPs), wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Inkubieren von VLPs in einer Hochsalz-Dissoziationsmischung für 30–40 Minuten, wobei die Dissoziationsmischung umfasst: 0,5–1,25 M NaCl, 2–20 mM DTT, 0,01–0,03% Polysorbat 80, 0,5–5 mM EDTA und 5–100 mM TRIS-Puffer und 0–50 mM Phosphat bei pH 8,2, um disassemblierte VLPs zu bilden; (c) Reassemblieren der disassemblierten VLPs mittels Dialyse gegen einen Reassemblierungspuffer, wobei der Reassemblierungspuffer 1,0–1,35 M NaCl, 2 mM CaCl₂ und einen Puffer von pH 6,2, der aus der Gruppe bestehend aus 50 mM Natriumcitrat, 50 mM Glycin und Phosphat, und 50 mM Citrat ausgewählt ist, umfasst; und (d) Weiteres Reinigen der reassemblierten VLPs mittels Dialyse gegen einen Endpuffer, wobei der Endpuffer 0,5 M NaCl und 10 mM Histidin, pH 6,2, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, welches ferner als Schritt (b) umfasst das Entfernen des DTT aus der Dissoziationsmischung mittels Dialyse gegen einen Puffer, der mindestens 1 M NaCl, 0,01–0,03% Polysorbat 80 und 10 mM Phosphat bei pH 7,0 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, ferner umfassend (e) Adsorbieren der reassemblierten VLPs aus Schritt (d) auf ein Aluminium-Adjuvans.