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Aufgrund
der stetig wachsenden Bedeutung von Mikrotechniken in einer großen Vielzahl
von wissenschaftlichen Anwendungen bleibt die Entwicklung von Systemen,
welche die Wechselwirkung von Molekülen mit Oberflächen ermöglichen,
ein entscheidendes Thema. Derartige Wechselwirkungen schließen die
Möglichkeit
des Entfernens von spezifischen Molekülen aus einer Probe, z. B.
um ihre Analyse/ihren Nachweis zu erleichtern, ein, jedoch auch
die Möglichkeit
des Präsentierens
von Molekülen
auf einer Oberfläche,
um auf diese Weise zu ermöglichen,
dass anschließende
Umsetzungen stattfinden können.
Diese Prinzipien zur Immobilisierung von Molekülen können in Sensor- oder chromatographischen
Systemen oder zur Bereitstellung von modifizierten Oberflächen im
Allgemeinen angewendet werden.
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In
den letzten Jahren hat es viele Ansätze gegeben, um Sensorchips
herzustellen, die auf selbstorganisierenden Monoschichten (SAMs)
oder bifunktionellen Molekülen
basieren, welche direkt oder indirekt Probenmoleküle an der
Sensoroberfläche
koppeln. Typischerweise tragen diese bifunktionellen Moleküle eine
Silan- oder Thiol-/Disulfideinheit, um eine Bindung mit der anorganischen
Oberfläche
zu erreichen, und eine zusätzliche
funktionelle Gruppe (z. B. Amino- oder
Epoxidgruppen), welche mit den Probenmolekülen interagiert, die häufig in
biologischen Proben in Form eines Oligonukleotids, eines Proteins
oder eines Polysaccharids etc. enthalten sind.
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Während die
Bildung einer direkten Bindung zwischen der bifunktionellen Verbindung
und dem Probenmolekül
möglich
ist, interagieren die Probenmoleküle nicht notwendigerweise direkt
mit den Kupplern, welche die Monoschicht bilden. In einer anderen
Ausführungsform
können
geeignete immobilisierte Biomoleküle an sich als Sonden zum Nachweis
von Probenmolekülen
wirken. Derartige Sondenmoleküle
können über eine Umsetzung
mit den freien funktionellen Gruppen der Monoschicht gleichermaßen immobilisiert
werden. Insbesondere kann, wenn Biomoleküle als Sondenmoleküle verwendet
werden, ihr Vorhandensein die Spezifität der Wechselwirkung der Probenmoleküle mit der
modifizierten Oberfläche
verstärken.
Zum Beispiel können
in den Fällen,
in denen die schnelle Analyse einer Probe aus DNA-Fragmenten oder
-Molekülen
erforderlich ist, die Monoschichten aus bifunktionellen Molekülen zuerst
mit synthetischen Oligonukleotiden in Kontakt gebracht werden, welche
auf diese Weise immobilisiert werden. Anschließend wird die Hybridisierung
von spezifischen Molekülen
wie kompatiblen Strängen
aus einer Probe nachgewiesen, z. B. über Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn
Farbstoff-markierte Probenmoleküle
verwendet werden.
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1 zeigt
eine schematische Beschreibung (nicht maßstabsgetreu) des Designs eines
herkömmlichen
DNA-Sensors. Die Monoschichten aus üblicherweise synthetischen
Oligonukleotid-Einzelsträngen
als Sonden werden an der Oberfläche
immobilisiert und dienen als Sondenmoleküle für komplementäre Proben-Oligonukleotide,
welche über
Hybridisierung gebunden werden. Die Hybridisierungsreaktion wird
zum Beispiel über
die Fluoreszenz, welche aus geeigneten Farbstoffmarkierungen, die
an die Probenmoleküle
gebunden sind, herrührt,
nachgewiesen.
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Obwohl
die Techniken für
diesen Zweck gut eingeführt
sind, ist die Anwendung von Standard-Nachweisverfahren problematisch, insbesondere
in Fällen,
in denen der Oberflächenbereich,
der für
den Nachweis eines spezifischen Typs von Probenmolekül verfügbar ist,
beschränkt
ist, z. B. wenn eine Vielzahl von Molekülen in einem parallelen Verfahren
analysiert werden soll, da die Monoschichten hinsichtlich ihrer
Pfropfdichte beschränkt
sind. Zum Beispiel müssen,
da die Anzahl der hybridisierten Doppelstränge pro Oberflächeneinheit eines
Sensors nicht einfach erhöht
werden kann, geeignete Detektoren sehr hohe Anforderungen hinsichtlich ihrer
Empfindlichkeit erfüllen.
Deshalb kann der minimale Oberflächenbereich
auf einem Sensor, der für
den Nachweis eines Oligonukleotidtyps notwendig ist, nicht einfach
verringert werden. Darüber
hinaus kann die maximale Dichte, d. h. ein Proben- oder Sondenmolekül pro funktionelle
Gruppe des Kupplers, kaum erreicht werden, da aufgrund der sterischen
Behinderung auf der sich zweidimensional erstreckenden Monoschicht
nur ein Bruchteil der funktionellen Gruppen fähig sein wird, mit Proben-
oder Sondenmolekülen
zu reagieren. Deshalb ist die Gesamtpfropfdichte gering und normalerweise
nicht gut definiert.
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Ähnliche
Probleme können
im Hinblick auf die begrenzte Anzahl von Reaktionsstellen pro Oberflächeneinheit
in anderen Anwendungen entstehen, in denen es erwünscht ist,
eine erhöhte
Anzahl von Molekülen
auf einer Oberfläche
zu immobilisieren.
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Es
sind verschiedene Versuche unternommen worden, um die vorstehend
umrissenen Probleme zu überwinden.
Im Hinblick auf die Analyse von Oligonukleotiden hat man versucht,
die Pfropfdichte auf der Oberfläche
durch das Verwenden von Oligomeren oder Polymeren zu erhöhen, welche
einen Oligonukleotidstrang (oder eine funktionelle Gruppe zu seiner
Befestigung) zusammen mit einer geeigneten Gruppe tragen, welche das
Binden dieser Oligomere oder Polymere an der Oberfläche des
Sensorchips ermöglicht.
Aufgrund der erhöhten
Flexibilität
der Oligomer- oder Polymerketten ist ein größerer Anteil der bifunktionellen
Oligomer- oder Polymermoleküle,
die an die Oberfläche
gekuppelt sind, in der Lage, Oligonukleotid-Sondenmoleküle zu immobilisieren.
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Jedoch
wird die gesamte Oligonukleotid-Pfropfdichte nicht signifikant erhöht, da die
Pfropfdichte der bifunktionellen Oligomer- oder Polymermoleküle auf der
Oberfläche
begrenzt ist. Dies ist eine Konsequenz aus der Tatsache, dass die
Selbstorganisation der Oligomere oder Polymere aus kinetischen Gründen behindert ist,
da, sobald die Sensoroberfläche
mit derartigen Molekülen
bedeckt ist, weitere Polymere gegen einen Konzentrationsgradienten
diffundieren müssen,
um die Oberfläche
zu erreichen.
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Dementsprechend
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Oberfläche bereitzustellen,
welche mit einer Polymermonoschicht modifiziert ist, die funktionelle
Gruppen zur Interaktion mit Proben- oder Sondenmolekülen umfasst,
wobei die Anzahl der Moleküle,
welche pro Oberflächeneinheit
interagieren, deutlich erhöht
ist, verglichen mit herkömmlichen
(kurzkettigen) Monoschichten aus bifunktionellen Molekülen. Zudem sollte
die Dichte der vorhandenen Wechselwirkungsstellen höher sein
als die, welche aus der Umsetzung von bifunktionellen Polymeren
oder Oligomeren mit der Oberfläche
erhalten wird.
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In
dem besonderen Fall des Nachweises von DNA-Molekülen wie Oligonukleotiden kann
das Ziel ausgedrückt
werden als Bereitstellung einer Oberfläche mit einer Pfropfdichte
von synthetischen Oligonukleotidsträngen, welche höher ist
als die, welche durch Kuppeln der einzelnen Oligonukleotide an eine
funktionalisierte Monoschicht aus Kupplern mit niederem Molekulargewicht
erzeugt wird. Auch sollte die Pfropfdichte höher sein als die, welche aus
der Umsetzung von Polymeren oder Oligomeren, die mit einem synthetischen
Oligonukleotid-Einzelstrang
modifiziert wurden, mit der Oberfläche herrührt.
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Dieses
Ziel ist erreicht worden durch eine Oberfläche, an die eine Anordnung
von Polymerketten gebunden ist, die jeweils eine Vielzahl von funktionellen
Gruppen umfassen, welche die Wechselwirkung des Polymers mit Proben-
oder Sondenmolekülen
ermöglichen.
Wenn zum Beispiel eine derartige polyfunktionelle Polymerkette verwendet
wird, um eine oder mehrere synthetische Oligonukleotidsonden zu
immobilisieren, können
anschließend
komplementäre
Nukleinsäuren
aus einem Gemisch von Probenmolekülen nachgewiesen werden, nachdem
eine Hybridisierungsreaktion stattgefunden hat. Überraschenderweise ist festgestellt worden,
dass solch eine Anordnung von polyfunktionellen Polymerketten, auch
als Polymerbürste
bezeichnet, nicht unter den Problemen von herkömmlichen Nachweisverfahren
leidet, in denen eine hohe Pfropfdichte nicht erreicht werden konnte.
Darüber
hinaus können,
da die Flexibilität
der Polymerketten eine vollständige Bedeckung
der Sensoroberfläche
ermöglicht,
Oberflächeneffekte,
z. B. während
des Laser-Scannens, vermieden werden.
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Der
Begriff "Wechselwirkung" schließt wie in
dieser Beschreibung verwendet die Bildung von kovalenten Bindungen,
ebenso wie anziehende ionische und Van-der-Waals-Kräften und
Wasserstoffbrückenbindungen
ein. Die jeweilige funktionelle Einheit innerhalb der Polymerkette
oder der Sondenmoleküle,
welche den Typus der Wechselwirkung definiert, wird gemäß der gewünschten
Anwendung der erfindungsgemäßen Oberfläche ausgewählt werden.
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Der
Ausdruck "immobilisieren" wird hier nachstehend
für eine
Wechselwirkung von Molekülen
mit den Polymerbürsten
verwendet, die zur Bildung einer Bindung führt, welche unter den gewählten Bedingungen
permanent ist. Zum Beispiel werden Sondenmoleküle durch die Polymerbürsten während ihrer
Anwendung auf einer Sensoroberfläche
immobilisiert. Jedoch kann eine Immobilisierung durch Verändern der
Bedingungen (z. B. pH-Wert, Ionenstärke) manchmal aufgehoben werden.
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Der
Begriff "Probenmolekül" soll hier für Moleküle verwendet
werden, welche in einer Probe vorhanden sind und welche zeitweilig
oder permanent an die erfindungsgemäßen Polymerketten koppeln.
Die vorliegende Erfindung schließt zwei allgemeine Prinzipien
für eine
Wechselwirkung der beanspruchten Polymerbürsten mit den Probenmolekülen ein.
In einer ersten Ausführungsform
werden die funktionellen Gruppen, die innerhalb der Polymerketten
enthalten sind, ausgewählt,
um eine direkte Wechselwirkung der Ketten mit den Probenmolekülen zu ermöglichen.
In einer zweiten Ausführungsform
werden Sondenmoleküle an
den funktionellen Gruppen der Polymerbürste immobilisiert, und es
kann eine Wechselwirkung zwischen diesen Sondenmolekülen und
den Probenmolekülen
stattfinden.
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Geeignete
Sondenmoleküle
sind Moleküle,
die mindestens bifunktional sind, so dass nach ihrer Kupplung an
die multifunktionalen Polymerketten neue Wechselwirkungsstellen
in der erfindungsgemäßen Polymermonoschicht
vorhanden sind, welche eine Wechselwirkung mit Probenmolekülen ermöglichen.
Bevorzugt stellen diese Sondenmoleküle hoch spezifische Wechselwirkungsstellen
für die
Probenmoleküle
bereit. Sie können
aus natürlichen
oder nicht natürlichen
Quellen stammen. Besonders bevorzugte Sondenmoleküle sind Biomoleküle wie Nukleinsäuren einschließlich DNA,
RNA oder PNA (Peptidnukleinsäure),
am meisten bevorzugt Oligonukleotide oder Aptamere, Polysaccharide,
Proteine einschließlich
glykosidisch modifizierter Proteine oder Antikörper, Enzyme, Zytokine, Chemokine,
Peptidhormone oder Antibiotika und Peptide. Um ausreichende Stabilität sicher
zu stellen, z. B. während
einer Sensoranwendung, werden die Sondenmoleküle an die Polymerbürste bevorzugt
kovalent gebunden.
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In
Abhängigkeit
von der Verwendung kann eine Vielzahl von identischen Sondenmolekülen oder
ein Gemisch aus zwei oder mehr verschiedenen Sonden immobilisiert
werden. Zum Beispiel ist ein Satz von identischen Sondenmolekülen zur
Anwendung der Polymerbürsten
als Affinitätsmatrix
bevorzugt.
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Die
erfindungsgemäße Polymermonoschicht
umfasst eine Vielzahl von einzelnen Polymerketten, welche an eine
Oberfläche
gebunden sind. Bevorzugt ist die Bindung zwischen den Polymerketten
und der Oberfläche
kovalent. Es ist auch bevorzugt, dass die Polymerketten an einem
ihrer Enden an der Oberfläche
gebunden sind. Die Einführung
von verzweigten Polymeren ist möglich,
falls gewünscht.
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2 zeigt
eine schematische Darstellung (nicht maßstabsgetreu) des Designs eines
DNA-Sensors, der
auf funktionellen Polymerbürsten
basiert. Die einzelsträngigen
Oligonukleotide, welche als Sondenmoleküle dienen, werden an die auf
der Oberfläche
verankerten Polymerketten gebunden. Die Probenoligonukleotide werden über Hybridisierung
nachgewiesen. Diese Umsetzung kann durch Messen des signifikanten
Anstiegs der Schichtdicke nachgewiesen werden, der durch die Inkorporation
von zusätzlichem
Material in die Schicht verursacht wird.
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Die
Polymerketten der vorliegenden Erfindung können Homo- oder Copolymere
sein, in Abhängigkeit von
der gewünschten
Anwendung. Ein Homopolymer würde
durch ein Polymer dargestellt werden, in dem jede der bei der Polymerisation
verwendeten monomeren Einheiten mindestens eine der funktionellen
Gruppen trägt,
die mit den Proben- oder Sondenmolekülen interagieren können. Jedoch
kann, um der Polymermonoschicht bestimmte vorteilhafte Eigenschaften
zu verleihen, ein Copolymer, das aus diesen Monomeren mit bestimmten
funktionellen Gruppen zur Wechselwirkung mit den Proben- oder Sondenmolekülen gebildet
wird (hierin nachstehend als "funktionalisierte
Monomere" bezeichnet),
zusammen mit anderen Comonomeren verwendet werden.
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Zum
Beispiel wird die Umsetzung der Proben- oder Sondenmoleküle mit dem
Polymer signifikant erleichtert, wenn das Polymer in dem Lösungsmittel,
welches diese Moleküle
enthält,
quellbar ist, so dass bevorzugt Comonomere verwendet werden sollten,
welche eine starke Wechselwirkung mit dem besagten Lösungsmittel
zeigen. Da in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung Biomoleküle, die
normalerweise in wässrigen
Lösungen
vorhanden sind, mit den Polymerketten interagieren, sind die Polymerketten
bevorzugt in Wasser quellbar.
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Deshalb
können
zum Beispiel ein oder mehrere Comonomere verwendet werden, die polar
oder sogar in Wasser löslich
sind, wenn ein Homopolymer aus funktionalisierten Monomeren keine
ausreichende Wechselwirkung mit Wasser zeigt, um eine schnelle Umsetzung
der Moleküle
mit den funktionellen Gruppen zu ermöglichen, die nachgewiesen werden
sollen. Beide Monomertypen, funktionalisierte ebenso wie Comonomere,
enthalten bevorzugt eine C-C-Doppelbindung, welche in einer radikalischen
Polymerisationsreaktion reagieren kann. Beispiele für geeignete
Comonomere, welche ein wasserquellfähiges Polymer ergeben, sind Acrylsäure, Methacrylsäure und
Derivate davon wie z. B. Ester und Amide dieser Säuren, wobei
die Alkohole oder Amine bevorzugt 1 bis 12 Kohlenstoffatome umfassen.
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Bekannte
Beispiele für
diese Gruppe von Monomeren sind Hydroxyethylmethacrylat, Acrylamid
und Dimethylacrylamid. Ein anderes geeignetes Monomer ist Vinylpyrrolidon.
Es ist auch möglich,
Monomere zu verwenden, die zuerst wasserunlösliche Polymere ergeben, welche
dann in wasserlösliche
Derivate überführt werden
können.
Ein geeignetes Beispiel für
diese Gruppe von Polymeren ist Polyvinylalkohol, der zum Beispiel durch
Verseifung von Polyvinylacetat erhalten werden kann.
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Wenn
ein Copolymer verwendet wird, wird das Verhältnis der Comonomere zu funktionalisierten
Monomeren vor dem Polymerisationsprozess bestimmt, um die Zusammensetzung
der so erhaltenen Polymerkette zu definieren. Bevorzugt liegt das
Verhältnis
der Comonomere zu den funktionalisierten Monomeren im Bereich von
50/1 bis 1/1, stärker
bevorzugt von 20/1 bis 2/1. Die funktionellen Gruppen, die notwendig
sind, um eine Wechselwirkung der Polymerschicht mit den Proben-
oder Sondenmolekülen
zu ermöglichen,
sind bevorzugt in den Seitenketten der Polymerketten vorhanden.
Eine "Vielzahl" von funktionellen
Gruppen, die in den Polymerketten der erfindungsgemäßen Monoschicht
enthalten sind, bedeutet mindestens zwei, bevorzugt jedoch mehr
als zwei Gruppen pro Polymerkette. Da die betreffenden funktionellen
Gruppen bevorzugt in den Monomeren enthalten sind, welche die Polymerbürsten bilden,
kann ihre Anzahl bis zu mehreren Tausend betragen, z. B. bis zu
10.000 dieser Gruppen, welche in einer einzelnen Kette vorhanden
sind, in Abhängigkeit von
der Größe des Sonden-
oder Probenmoleküls,
das immobilisiert werden soll. Bevorzugt umfasst jede Kette 20 bis
1000 dieser funktionellen Gruppen.
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Geeignete
funktionalisierte Monomere, welche in den Polymerbürsten vorhanden
sind, sind solche Monomere, die eine polymerisierbare C-C-Doppelbindung
umfassen, ebenso wie eine weitere funktionelle Einheit, die am Polymerisationsprozess
nicht beteiligt ist. Bevorzugt ist diese funktionelle Gruppe an
die Polymerhauptkette über
eine C2-C10-, stärker bevorzugt über eine
C3-C7-Alkylkette
als Spacer gebunden. Die Spacermoleküle können Teil des funktionalisierten
Monomers sein. Für
diese Herangehensweise geeignete Monomere schließen Acryl- und Methacrylester
oder Amide von C2-C10-Alkoholen
oder C2-C10-Aminen
ein. Um als Spacer zu dienen, tragen diese Alkohole oder Amine eine
zusätzliche
funktionelle Gruppe am Ende entgegengesetzt zu dem, welches die
Ester- oder Amidbindung bildet. Diese funktionelle Gruppe steht
entweder für
eine Gruppe, die für
die Wechselwirkung mit den Proben- oder Sondenmolekülen notwendig
ist, oder kann in einem weiteren Schritt zu einer derartigen funktionellen
Gruppe umgewandelt werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist es auch möglich,
diese Spacermoleküle
an geeignete reaktive Segmente innerhalb der Polymermonoschicht
nach ihrer Bildung zu binden. In diesem Fall müssen reaktive Monomere während der
Polymerisation vorhanden sein, wie Acryl- oder Methacrylsäurechloride
oder reaktive Ester davon wie N-Hydroxysuccinimide oder andere Monomere,
z. B. Maleinsäureanhydrid.
Diese bevorzugten reaktiven Monomere können kovalente Bindungen an
den bifunktionellen Alkoholen oder Aminen bilden, welche als Spacer
verwendet werden können.
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Die
Monomere, welche die Spacereinheit tragen, können leicht aus dem jeweiligen
Acryl- oder Methacrylsäurechlorid
oder -anhydrid und der ω-Amino-
oder Hydroxycarbonsäure
synthetisiert werden. Das so erhaltene Produkt kann in das aktive
Esterderivat unter Verwendung von z. B. N-Hydroxysuccinimid überführt werden.
Ein detailliertes Verfahren zur Synthese verschiedener Beispiele
für derartige
Monomere kann in der Literatur gefunden werden, z. B. in H.-G. Batz,
J. Koldehoff, Macromol. Chem. 177 (1976) 683.
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Wie
vorstehend umrissen ist es möglich,
reaktive Monomere zu verwenden, welche direkt eine erfindungsgemäße polyfunktionelle
Polymermonoschicht ergeben. In einer anderen Ausführungsform
können
Monomere ausgewählt
werden, welche einen Vorläufer
der funktionellen Gruppe, die auf der finalen Oberfläche verwendet
werden soll, tragen, z. B. ein Säurechlorid
oder ein Säureanhydrid.
Diese können
anschließend
in reaktive Gruppen umgewandelt werden, z. B. NHS-Ester- oder Glycidylesterreste,
welche eine Wechselwirkung des Polymers mit den Proben- oder Sondenmolekülen unter
den gewünschten
Bedingungen ermöglichen.
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Deshalb
sind alle polymerisierbaren Monomere für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung geeignet, solange sie mit funktionellen Gruppen vereinigt
werden oder diese enthalten können,
welche notwendig sind, um eine Wechselwirkung des Polymers mit den
Probenmolekülen
oder Sondenmolekülen
zu ermöglichen.
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Die
funktionellen Gruppen, welche für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden
bevorzugt den Molekülen
entsprechend ausgewählt,
mit denen eine Wechselwirkung erreicht werden soll. Die Wechselwirkung
kann auf einen einzigen Typ von Probenmolekül oder auf eine Vielzahl von Probenmolekülen gerichtet
sein. Da eine wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung im Nachweis
von spezifischen Molekülen
in biologischen Proben besteht, werden die innerhalb der Polymerbürste vorhandenen funktionellen
Gruppen bevorzugt mit natürlichen
oder synthetischen Biomolekülen
interagieren, welche dazu fähig
sind, mit den Molekülen
in biologischen Proben spezifisch zu interagieren, was zu ihrem
Nachweis führt. Geeignete
funktionelle Einheiten werden bevorzugt fähig sein, mit Nukleinsäuren und
Derivaten davon wie DNA, RNA oder PNA, z. B. Oligonukleotiden oder Aptameren,
Polysacchariden, Proteinen einschließlich glykosidisch modifizierten
Proteinen oder Antikörpern,
Enzymen, Zytokinen, Chemokinen, Peptidhormonen oder Antibiotika
oder Peptiden oder markierten Derivaten davon, zu reagieren.
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Darüber hinaus
wird es möglich
sein, die Kupplungsreaktion zwischen den nachzuweisenden Molekülen oder
den synthetischen Oligonukleotiden und den Polymerketten unter Bedingungen
durchzuführen,
welche für
die Proben- oder Sondenmoleküle
nicht schädlich
sind. Folglich sollte die Umsetzung in einer Nukleinsäuresensor-Anwendung
in einer wässrigen
Lösung
durchgeführt
werden und die Temperatur sollte nicht über 95°C erhöht werden.
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Auch
sollte die Kupplungsreaktion in einer angemessenen Geschwindigkeit
voranschreiten, so dass der Nachweis bevorzugt innerhalb von weniger
als 24 Stunden erbracht werden kann, ohne dass extreme pH-Werte
in der Lösung
erforderlich sind. Zur Immobilisierung von synthetischen Oligonukleotid-Einzelsträngen sollte
der pH-Wert im Bereich zwischen 7 und 11 liegen, bevorzugt 7 und
10. Während
der Hybridisierungsreaktion der Nukleinsäure-Probenmoleküle mit den
Sondenmolekülen
sollte die Bindung zwischen der funktionellen Gruppe und dem synthetischen
Oligonukleotid-Einzelstrang ebenso wie die Bindung der Polymerkette an
das Substrat fähig
sein, Temperaturen von mehr als 65°C und einem pH-Wert von 6 bis
9 zu widerstehen. In den Fällen,
in denen DNA als ein Probenmolekül
verwendet wird, können
die Temperaturen auf bis etwa 95°C
angehoben werden, um eine Trennung der DNA-Stränge zu bewirken, welche für die Hybridisierung
notwendig ist.
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Da
die meisten der Sondenmoleküle
insbesondere in biologischen oder medizinischen Anwendungen sterisch
ungehinderte nukleophile Einheiten umfassen, umfassen bevorzugte
Wechselwirkungen mit den Polymerbürsten nukleophile Substitutions-
oder Additionsreaktionen, welche zu einer kovalenten Bindung zwischen
den Polymerketten und den Proben- oder Sondenmolekülen führen. Zum
Beispiel werden synthetische Oligonukleotide üblicherweise mit einer freien
Aminogruppe an einem Ende (5' oder
3') bereitgestellt.
Deshalb stellen beispielhafte funktionelle Gruppen zum Beispiel
eine reaktive Doppelbindung, ein Äquivalent für eine Doppelbindung (wie z.
B. eine Epoxygruppe) oder eine reaktive Abgangsgruppe bereit. Jedoch
können
auch ionische oder Van-der-Waals-Kräfte ebenso wie Wasserstoffbrückenbindungen
verwendet werden, um Probenmoleküle
an die Polymerbürste
zu koppeln, wenn ihre funktionellen Gruppen dementsprechend ausgewählt sind.
Mit den entsprechenden funktionellen Gruppen, die in der Polymerbürste vorhanden
sind, können die erfindungsgemäßen Polymermonoschichten
auch in Trennverfahren, z. B. als eine stationäre Phase in Chromatographie-Anwendungen
verwendet werden.
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Bevorzugte
funktionelle Gruppen können
aus der Fachliteratur im Hinblick auf die Molekülklassen, welche immobilisiert
werden sollen, und gemäß den anderen
Anforderungen (Reaktionszeit, Temperatur, pH-Wert) wie vorstehend
beschrieben ausgewählt
werden. Eine allgemeine Liste kann zum Beispiel in dem Fachbuch "Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson,
Academic Press, 1996, gefunden werden. Im Falle des Bindens von
Amino-terminierten
Oligonukleotiden sind Beispiele für geeignete Gruppen sogenannte
aktive oder reaktive Ester wie N-Hydroxysuccinimide (NHS-Ester),
Epoxide, bevorzugt Glycidylderivate, Isothiocyanate, Isocyanate,
Azide, Carbonsäuregruppen
oder Maleinimide.
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Als
bevorzugte funktionelle Monomere, welche direkt eine polyfunktionelle
Polymermonoschicht ergeben, können
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung die folgenden Verbindungen verwendet
werden:
- – Acryl-
oder Methacrylsäure-N-hydroxysuccinimide
- – N-Methacryloyl-6-aminopropansäurehydroxysuccinimidester,
- – N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester
oder
- – Acryl-
oder Methacrylsäureglycidylester
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In
Abhängigkeit
von der Anwendung besteht die Möglichkeit
des Bereitstellens einer Polymerbürste mit einer Kombination
von zwei oder mehr unterschiedlichen funktionellen Gruppen, z. B.
indem die Polymerisation, welche zu den Polymerketten führt, in
Gegenwart unterschiedlicher Typen von funktionalisierten Monomeren
durchgeführt
wird. In einer anderen Ausführungsform
können
die funktionellen Gruppen identisch sein.
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Das
bevorzugte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen polyfunktionellen
Polymermonoschicht wird im Folgenden beschrieben:
In einem
ersten Schritt wird die Oberfläche
mit einer Monoschicht von Polymerisationsinitiatoren oder Startermolekülen bedeckt.
Die Gruppen in diesen Initiatoren, welche die Initiierung der Polymerisation
ermöglichen, werden üblicherweise
z. B. aus Peroxogruppen oder Azogruppen ausgewählt, wenn ein thermisch initiierter radikalischer Mechanismus
verwendet werden soll. Aromatische Ketone wie Benzoin-, Benzil-
oder Benzophenonderivate werden bevorzugt verwendet, wenn die Polymere
durch photochemische Initiierung erzeugt werden. Aromatische Ketone,
welche Schwefel beinhalten, können
gleichermaßen
verwendet werden, um, falls gewünscht,
die zur Photoinitiierung geeignete Wellenlänge in einen längeren Wellenlängenbereich
zu verschieben. Zusätzlich
zu diesen labilen Gruppen tragen die geeigneten Initiatoren für das bevorzugte
erfindungsgemäßen Verfahren
eine oder mehrere Gruppen, die für
ihre Bindung an der Oberfläche,
welche mit den Polymerketten bedeckt werden soll, geeignet sind.
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Man
lässt die
erfindungsgemäßen Polymerketten üblicherweise
von der Oberfläche
aus über
eine Kettenreaktion wachsen. Während
radikalische Mechanismen aus praktischen Gründen bevorzugt sind, ist die Anwendung
von ionischen Polymerisationstechniken ebenfalls möglich.
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Die
funktionellen Gruppen zur Bindung an der Oberfläche, welche in den Initiatormolekülen enthalten sind,
müssen
an die verwendete Sensoroberfläche
angepasst sein. Zur Herstellung der Initiator-Monoschicht auf Metalloxiden,
insbesondere Siliciumoxid-Oberflächen
(aufgedampfte oder gesputterte SiOx-Schichten, SiO2-Oberflächen
von Siliciumwafern, Glas, Quarz) werden Chlorsilaneinheiten oder
Alkoxysilane verwendet. Thiol- oder Disulfidgruppen können zur
Modifikation von Goldoberflächen
verwendet werden. Jedoch werden Silane üblicherweise aufgrund ihrer
erhöhten
Stabilität
auf Oberflächen
bevorzugt. Darüber
hinaus ist die vorliegende Erfindung nicht auf anorganische Oberflächen beschränkt. Organische
Polymeroberflächen
können ebenfalls
als Substrate, um die Polymermonoschichten zu tragen, verwendet
werden, und es besteht auch die Möglichkeit, die Starter für die Polymerisationsreaktion
direkt in ein derartiges, eine Oberfläche bildendes Polymer einzuschließen.
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Bevorzugte
Beispiele für
Initiatoren, welche für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind
nachstehend aufgelistet, zusammen mit ihren Strukturformeln:
- – 4,4'-Azobis-(4-cyanopentansäure-(3'-chlordimethylsilyl)propylester),
Verbindung 1, oder die jeweiligen Di- und Trichlor- oder Mono-,
Di- und Trialkoxysilananaloga;
- – 2,4'-Azo-(4-cyanopentansäure-(3''-chlordimethylsilyl)propylester), Verbindung
2, oder die jeweiligen Di- und Trichlor- oder Mono-, Di- und Trialkoxysilananaloga;
oder die jeweiligen Verbindungen mit einem Undecyl-Spacer, statt
eines Propyl-Spacers; oder Disulfid- oder Thiolderivate dieses allgemeinen
Typs von Azoverbindungen;
- – 4-(3'-Chlordimethylsilyl)propyloxy)benzophenon,
3, oder die jeweiligen Di- und Trichlor- oder Mono-, Di- und Trialkoxysilananaloga;
- – Silan-
und Disulfid-/Thiolderivate von Arylazomalodinitrilen, wie Verbindung
4.
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Nach
der Initiierung der Polymerisationsreaktion, bevorzugt durch einen
Erwärmungsschritt
(thermische Initiierung) oder dem Aussetzen an Strahlung (Photoinitiierung)
in Gegenwart von polymerisierbaren Monomeren, kann man Polymerketten
von der Oberfläche
aus wachsen lassen. Die Polymerisation kann unter Standardreaktionsbedingungen,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Wenn diese Technik
angewendet wird, können
die Pfropfdichten der so erhaltenen Polymermonoschicht über einen
breiten Bereich gesteuert werden, zum Beispiel durch Variation der
Polymerisationszeit. Darüber
hinaus können Pfropfdichten
erreicht werden, die durch andere Verfahren unerreichbar sind. So
können
Polymere derart befestigt werden, dass der durchschnittliche Abstand
zwischen den Verankerungsorten auf der Oberfläche 5 nm oder weniger beträgt, z. B.
2 bis 5 nm.
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Vorteilhafterweise
können
derartige Pfropfdichten unabhängig
vom Molekulargewicht der befestigten Ketten erreicht werden, z.
B. sogar für
Molekulargewichte von 100.000 g/mol oder mehr.
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Darüber hinaus
ermöglicht
die bevorzugte in-situ-Bildung von Polymerketten auf einer Oberfläche gemäß der vorliegenden
Erfindung die Steuerung des mittleren Molekulargewichts der befestigten
Polymerketten, insbesondere ihrer Länge, unabhängig von der Pfropfdichte.
Wenn z. B. die Polymerisation in einem Lösungsmittel durchgeführt wird,
in dem die Monomerkonzentration gesteuert werden kann, wird eine
höhere Monomerkonzentration
direkt zu einem höheren
Molekulargewicht der so erhaltenen Polymere führen.
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Entsprechend
dieser präzisen
Steuerung der Parameter Pfropfdichte und Molekulargewicht ist es möglich, die
Eigenschaften der jeweiligen Polymerschichten einer Vielzahl von
Anwendungen anzupassen. Zum Beispiel können Schichten unterschiedlicher
Dicke über
einen breiten Bereich von einigen Nanometern bis zu einigen Mikrometern
erzeugt werden. Es ist auch möglich,
die Eigenschaften der so erhaltenen Schicht fein abzustimmen, z.
B. im Hinblick auf die Erreichbarkeit der funktionellen Gruppen
für die
anschließend
gekoppelten Sonden- und Probenmoleküle, die sich in ihrer Größe und Struktur
beträchtlich
unterscheiden können.
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Die
Polymerketten, die über
das vorstehende, bevorzugte Verfahren erhalten wurden, behalten
ein Fragment des Initiators in ihrer Struktur zurück, welche
diese an der Oberfläche
immobilisiert, nämlich
den Abschnitt, der mit dem Verankerungsort beginnt und zu dem vorbestimmten
Initiierungspunkt führt,
wie er auf dem Fachgebiet für
alle Initiatortypen, insbesondere solche, die in dieser Anmeldung
erwähnt
werden, bekannt ist.
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Detaillierte
Informationen über
die Synthese von Initiatormolekülen,
ihre Reaktion mit der Oberfläche und
die bevorzugten Polymerisationsbedingungen sind beschrieben in:
- – O.
Prucker, J. Rühe,
Macromolecules, 1998, 31, 592;
- – O.
Prucker, J. Rühe,
Macromolecules, 1998, 31, 602 und
- – O.
Prucker, J. Rühe,
Langmuir, 1998, 24 (14), 6893.
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Es
sollte darauf geachtet werden, nicht umgesetzte Monomere ebenso
wie nicht gebundene Polymerketten mit geeigneten Lösungsmitteln
nach der Polymerisation zu entfernen.
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Die
nach diesem Verfahren hergestellten Polymerschichten können auf
einer breiten Vielzahl von Oberflächen angewendet werden, unabhängig von
ihrer Form. Sogar Oberflächen,
die für übliche Oberflächen-Modifikationsverfahren
unzugänglich
sind (z. B. innere Oberflächen)
können
mit den erfindungsgemäßen Polymermonoschichten
bereitgestellt werden, da keine sperrigen Polymermoleküle zur Oberfläche diffundieren
müssen.
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Es
ist auch möglich,
Anordnungen der Polymermonoschichten in Form von Mustern durch verschiedene
Mittel zu erzeugen. Ein Weg sind photolithographische Standardverfahren,
die entweder nach der Polymerisation (Photoablation der Polymere
durch Masken), vor diesem Schritt (Photoabbau oder Photoablation der
Initiator-Monoschichtmasken) oder während der Polymerisation mittels
Photopolymerisation durch Masken angewendet werden können. Andere
mögliche
Verfahren zur Erzeugung von Polymermonoschichten in Form von Mustern
sind das Mikrokontakt-Drucken oder verwandte Verfahren, welche während der
Bildung der Initiatorschicht oder während der Polymerisation angewendet
werden können.
Schließlich
können
Tintenstrahl-Techniken oder andere Mikroplotting-Verfahren verwendet
werden, um Initiator-Monoschichten in Form von Mustern zu erzeugen,
welche anschließend
in Polymermonoschichten in Form von Mustern überführt werden. Unter Verwendung
von einer dieser Techniken können
Oberflächenstrukturen
in Größenordnungen
im Mikrometerbereich erzeugt werden. Der hoch parallele Modus der
Signalerzeugung und eine signifikante Verbesserung bei der Integration
von analytischen Daten ist das vielversprechendste Merkmal derartiger
Techniken, welche dementsprechend die Optimierung von automatischen
analytischen Verfahren ermöglichen.
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Zum
Nachweis einer erfolgreichen Immobilisierung von Proben- oder Sondenmolekülen auf
einer Polymermonoschicht kann eine Vielzahl von Techniken angewendet
werden. Insbesondere wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Polymerschichten
einen signifikanten Zuwachs in ihrer Dicke durchlaufen, der mit
geeigneten Verfahren, z. B. Ellipsometrie, nachgewiesen werden kann.
Massensensitive Verfahren können ebenfalls
angewendet werden.
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Wenn
Nukleinsäuren,
zum Beispiel Oligonukleotide mit einer gewünschten Nukleotidsequenz oder DNA-Moleküle in einer
biologischen Probe, analysiert werden sollen, können synthetische Oligonukleotid-Einzelstränge mit
der Polymermonoschicht umgesetzt werden. Die Reaktion wird unter
hoher Luftfeuchte durchgeführt,
bevorzugt in einer gepufferten wässrigen
Lösung.
Die Umsetzungstemperatur kann über
Raumtemperatur erhöht
werden, solange sie für
die Oligonukleotide nicht schädlich
ist. Bevorzugte Temperaturen liegen im Bereich von 40–60°C. In dieser
Anwendung kann eine Vielzahl von identischen synthetischen Oligonukleotidsträngen oder
ein Gemisch aus verschiedenen Strängen verwendet werden. Wenn
verschiedene Stränge verwendet
werden, sollten ihre Sequenzen bevorzugt bekannt sein.
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Bevor
die so hergestellte Oberfläche
in einer Hybridisierungsreaktion verwendet wird, werden die nicht umgesetzten
funktionellen Gruppen über
die Zugabe von geeigneten Nukleophilen, bevorzugt C1-C4-Amine wie einfache primäre Alkylamine (z. B. Propyl-
oder Butylamin), sekundäre
Amine (Diethylamin) oder Aminosäuren
(Glycin), deaktiviert.
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Wenn
sie einem Gemisch aus Oligonukleotid-Einzelsträngen, z. B. wie durch PCR erhalten,
welche markiert sind, ausgesetzt werden, werden nur die Oberflächenbereiche,
welche synthetische Stränge
als Sonden bereitstellen, die zu dem PCR-Produkt komplementär sind,
aufgrund der Hybridisierung ein nachweisbares Signal beim Scannen
zeigen. Um den parallelen Nachweis von unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen
zu erleichtern, können
Druck-Techniken
verwendet werden, welche die Trennung der Sensoroberfläche in Bereiche
ermöglichen,
in denen unterschiedliche Typen von synthetischen Oligonukleotidsonden
der Testlösung
präsentiert
werden.
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Der
Begriff "Hybridisierung" kann sich, wie gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet, auf stringente oder nicht-stringente Bedingungen
beziehen. Wenn nicht näher
ausgeführt,
sind die Bedingungen bevorzugt nicht-stringent. Die Hybridisierungsbedingungen
können
gemäß üblicher
Protokolle eingerichtet werden, welche zum Beispiel in Sambrook, "Molecular Cloning,
A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989), Ausubel, "Current Protocols
in Molecular Biology",
Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989)
oder Higgins und Hames (Hrsg.), "Nucleic
acid hybridization, a practical approach", IRL Press Oxford, Washington DC (1985)
beschrieben sind. Das Einstellen der Bedingungen liegt im Umfang
des Wissens des Fachmannes und soll gemäß den auf dem Fachgebiet beschriebenen
Protokollen bestimmt werden. So wird der Nachweis von nur spezifisch
hybridisierenden Sequenzen üblicherweise
stringente Hybridisierungs- und Waschungs-Bedingungen wie zum Beispiel
0,1 × SSC,
0,1% SDS bei 65°C
erfordern. Beispielhafte nicht-stringente Hybridisierungsbedingungen
für den
Nachweis von homologen oder nicht exakt komplementären Sequenzen
können
auf 6 × SSC,
1% SDS bei 65°C
eingestellt sein. Wie bekannt ist, stellen die Länge der Sonde und die Zusammensetzung
der Nukleinsäure,
die bestimmt werden soll, weitere Parameter der Hybridisierungsbedingungen
dar.
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Die
Nukleinsäuren,
die analysiert werden sollen, können
aus einer DNA-Bibliothek oder einer Genombank, einschließlich synthetischen
und semisynthetischen Nukleinsäurebibliotheken,
stammen. Bevorzugt umfasst die Nukleinsäurebibliothek Oligonukleotide.
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Um
ihren Nachweis in einem immobilisierten Zustand zu erleichtern,
sollten die Nukleinsäuremoleküle bevorzugt
markiert sein. Geeignete Marker schließen radioaktive, fluoreszierende,
phosphorisierende, biolumineszente oder chemolumineszente Marker,
ein Enzym, einen Antikörper
oder ein funktionelles Fragment oder funktionelle Derivate davon,
Biotin, Avidin oder Streptavidin ein.
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Antikörper können polyklonale,
monoklonale, chimäre
oder einzelkettige Antikörper
oder funktionelle Fragmente oder Derivate von derartigen Antikörpern einschließen, sind
jedoch nicht auf diese beschränkt.
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Die
allgemeine Methodologie zur Herstellung von Antikörpern ist
bekannt und ist zum Beispiel in Köhler und Milstein, Nature 256
(1975), 494, beschrieben worden und in J. G. R. Hurrel, Hrsg., "Monoclonal Hybridoma
Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982),
rezensiert worden, und wurde auch von L. T. Mimms et al., Virology
176 (1990), 604–619,
gelehrt. Wie vorstehend angegeben, bezieht sich der Begriff "Antikörper" in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung auf monoklonale oder polyklonale
Antikörper.
Funktionelle Antikörperfragmente
oder -derivate stellen die gleiche Spezifität bereit wie die ursprünglichen
Antikörper
und umfassen F(ab')2-, Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente; siehe
zum Beispiel Harlow und Lane, "Antibodies,
A Laboratory Manual",
CSH-Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Antikörper ein
monoklonaler Antikörper.
Darüber
hinaus können
die Derivate in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung durch Peptidomimetika hergestellt
werden. Derartige Herstellungsverfahren sind auf dem Fachgebiet
bekannt und können
von einem Fachmann ohne weiteres angewendet werden.
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In
Abhängigkeit
von dem verwendeten Markierungsverfahren kann der Nachweis durch
auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden, z. B. über Laser-Scannen
oder die Verwendung von CCD-Kameras. Die vorliegende Erfindung umfasst
auch Verfahren, in denen der Nachweis indirekt bewirkt wird. Ein Beispiel
für einen
derartigen indirekten Nachweis ist die Verwendung eines sekundären markierten
Antikörpers,
der auf eine erste Verbindung wie einen Antikörper gerichtet ist, welcher
an das biologische Molekül
(Probenmolekül)
von Interesse bindet.
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Eine
weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Polymermonoschichten liegt
auf dem Feld der Affinitätschromatographie,
z. B. zur Reinigung von Stoffen. Zu diesem Zweck werden Polymerbürsten mit
identischen funktionellen Gruppen oder Sondenmolekülen bevorzugt
verwendet, welche mit einer Probe in Kontakt gebracht werden. Nachdem
der gewünschte
Stoff durch die Polymerbürste
immobilisiert wurde, kann das nicht gebundene Material entfernt
werden, z. B. in einem Waschschritt. Mit geeigneten Elutionsmitteln
kann der gereinigte Stoff dann von der Affinitätsmatrix getrennt werden.
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Bevorzugte
Stoffe, welche auf einer derartigen Matrix immobilisiert werden
können,
sind Nukleinsäuremoleküle, Peptide
oder Polypeptide (oder Komplexe davon, wie Antikörper, funktionelle Fragmente
oder Derivate davon), Saccharide oder Polysaccharide.
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Eine
Regeneration der Oberflächen,
nachdem die Immobilisierung stattgefunden hat, ist möglich, jedoch
sind einmalige Anwendungen bevorzugt, um die Qualität der Ergebnisse
sicherzustellen.
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Mit
der vorliegenden Erfindung können
verschiedene Typen von Proben mit erhöhter Präzision und/oder verringertem
Raumbedarf in seriellen ebenso wie in parallelen Nachweisverfahren
analysiert werden. Die erfindungsgemäßen Sensoroberflächen können deshalb
in diagnostischen Instrumenten oder anderen medizinischen Anwendungen,
z. B. zum Nachweis von Komponenten in physiologischen Flüssigkeiten
wie Blut, Serum, Sputum etc., dienen.
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Die
erfindungsgemäßen Oberflächen können auch
Startermoleküle
für synthetische
Anwendungen, insbesondere in der Festphasensynthese, z. B. während der
in-situ-Bildung von Oligo- oder Polymeren immobilisieren. Bevorzugt
sind die Oligo- oder Polymere Biomoleküle und umfassen Peptide, Proteine,
Oligo- oder Polysaccharide oder Oligo- oder Polynukleinsäuren. Als
immobilisierte Initiatoren kann ein Monomer dieser Makromoleküle verwendet
werden.
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Darüber hinaus
können
die erfindungsgemäßen Polymerschichten
als Gele bei der Trennung von Molekülen, bevorzugt von Biomolekülen in einem
elektrischen Feld verwendet werden.
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Im
Allgemeinen ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von homogen modifizierten Oberflächen mit überlegener
Pfropfdichte. Indem die passenden Polymerisationsbedingungen ausgewählt werden,
können
die Pfropfdichte und die Kettenlänge
und so die Dicke der Polymerschicht gesteuert werden. Darüber hinaus
können
strukturierte Oberflächen
bereitgestellt werden, z. B. durch Starten der Polymerisation von
Anordnungen von Initiatormolekülen
in Form von Mustern. Als Konsequenz können die Polymermonoschichten
auf die jeweiligen Anwendungen optimal eingestellt werden.
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Die
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Punkten weiter
veranschaulicht:
Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis der
Probennukleinsäuremoleküle, bevorzugt
der einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, unter
Verwendung einer erfindungsgemäßen Polymerschicht
umfasst die Schritte:
- a) Bereitstellen einer
Oberfläche,
welche mit einer erfindungsgemäßen polyfunktionellen
Polymermonoschicht bedeckt ist
- b) Immobilisieren geeigneter Sondenmoleküle, bevorzugt Oligonukleotid-Einzelsträngen, auf
der Polymermonoschicht über
eine Umsetzung mit den funktionellen Gruppen, welche in den Polymerketten
vorhanden sind
- c) Ermöglichen,
dass eine Hybridisierungsreaktion zwischen den Oligonukleotid-Einzelsträngen und
den Probennukleinsäuremolekülen stattfindet,
- d) Entfernen der nicht-hybridisierten Nukleinsäuremoleküle in einem
Waschschritt und
- e) Nachweis der hybridisierten Nukleinsäuremoleküle, bevorzugt fluorometrisch.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Reinigung einer Verbindung aus einer Probe
unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Polymerschicht umfasst
die Schritte:
- a) Bereitstellen einer Oberfläche, welche
mit einer erfindungsgemäßen Polymermonoschicht
modifiziert wurde
- b) Immobilisieren einer Vielzahl von identischen Sondenmolekülen auf
der Polymerschicht
- c) In-Kontakt-Bringen der Probe mit der so erhaltenen Polymerschicht
unter Bedingungen, welche ein Binden der Verbindung an das Sondenmolekül ermöglichen;
- d) und Entfernen des Materials, welches nicht an das Sondenmolekül gebunden
hat, aus der Probe.
-
Dieses
Verfahren kann ferner den Schritte einschließen:
- e)
Trennen der Verbindung von dem Sondenmolekül durch Verwendung eines geeigneten
Elutionsmittels.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
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(1) Synthese des Initiators
-
Als
ein Beispiel wird die Herstellung der Verbindung 1 beschrieben.
Der Reaktionsweg wird nachstehend veranschaulicht. Die Indices i–iii in
der Figur beziehen sich auf die Beschreibung der verschiedenen Schritte
im Text.
- i) Zu einer Suspension aus 40 g Phosphorpentachlorid
(PCl5) in 50 ml Methylenchlorid, welche
mit einem Eisbad gekühlt
wurde, wurde eine Suspension aus 10 g 4,4'-Azobis-(4-cyanopentansäure) in 50 ml Methylenchlorid
tropfenweise zugegeben. Man ließ das
Gemisch auf Raumtemperatur aufwärmen
und rührte über Nacht.
Das überschüssige PCl5 wurde abgefiltert und die verbleibende
Lösung
wurde eingeengt, bis sich kein weiteres PCl5 abtrennte.
Das Gemisch wurde nochmals filtriert und das Filtrat wurde zu 300
ml kaltem Hexan zugegeben, was die Abtrennung des Säurechlorids
als einen weißen
Feststoff (Ausbeute: 90%) verursachte.
- ii) Zu einer Lösung
aus 2,7 ml Allylalkohol und 6,5 ml Pyridin in 50 ml Methylenchlorid
bei 0°C
wurde eine Lösung
aus 10 g des Säurechlorids
in 50 ml Methylenchlorid tropfenweise zugegeben. Man ließ das Gemisch
auf Raumtemperatur aufwärmen
und rührte über Nacht.
Dann wurde die Lösung
zweimal mit 2 N H2SO4,
wässrigem
NaHCO3 und Wasser gewaschen. Die organische
Schicht wurde über
Na2SO4 getrocknet
und das Lösungsmittel
wurde verdampft. Der so erhaltene Bis-allylester wurde aus Methanol
umkristallisiert (Ausbeute: 90%).
- iii) Zu einer Suspension aus 3 g des Bis-allylesters in 30 ml
Dimethylchlorsilan wurde eine Lösung
aus 30 mg Hexachlorplatinsäure
in 0,5 ml Dimethylether/Ethanol (1/1, Vol./Vol.) zugegeben und das
Gemisch wurde für
3 h unter Rückfluss
erhitzt. Der Silanüberschuss
wurde verdampft, wobei sich die Verbindung 1 als fahlgrünes Öl in quantitativen
Ausbeuten ergab. Der restliche Platinkatalysator wurde durch Filtration
einer Methylenchloridlösung
des Produkts über
wasserfreiem Na2SO4 entfernt.
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(2) Bilden einer Initiator-Monoschicht
-
Der
unter (1) synthetisierte Initiator wird bei Raumtemperatur auf einer
Glasoberfläche
unter inerten Bedingungen (Atmosphäre aus trockenem Stickstoff)
immobilisiert unter Verwendung von wasserfreiem Toluol als Lösungsmittel
und trockenem Triethylamin als Katalysator. Die Toluollösung zeigt
eine Konzentration des Initiators von etwa 50 mmol/l, es wird Triethylamin
bis zu einer Konzentration von etwa 10 mmol/l zugegeben. Die Proben
werden in der Lösung über Nacht
belassen und dann durch extensives Spülen mit Methanol und Chloroform
gereinigt.
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(3) Synthese des funktionalisierten
Monomers
-
Als
ein Beispiel wird die Synthese von N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester beschrieben.
Der Reaktionsweg wird nachstehend gezeigt. Die Indices i–iii in
dieser Figur beziehen sich auf die Beschreibung der verschiedenen
Schritte im Text.
- i) Eine
Lösung
aus 13,2 g 6-Aminocapronsäure
und 20 g NaHCO3 in 100 ml Wasser und 50
ml 1,4-Dioxan wurde langsam zu einer Lösung aus 10,3 ml Methacrylsäurechlorid
in 50 ml 1,4-Dioxan zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Dann
wurden 50 ml Wasser zugegeben und das Gemisch wurde dreimal mit
100-ml-Portionen Ethylacetat gewaschen. Die Wasserschicht wurde
mit verdünnter
Salzsäure
angesäuert
(pH-Wert 2) und dann mit drei 100 ml-Portionen Ethylacetat extrahiert.
Die vereinigten organischen Schichten wurden über Na2SO4 getrocknet, auf ein Volumen von etwa 50
ml eingeengt und zu 350 ml kaltem Hexan zugegeben. Dieses Gemisch
wurde auf –20°C gekühlt und
das Produkt trennte sich langsam über Nacht als weiße Kristalle
ab (Ausbeute: ca. 14 g).
- ii) Eine Lösung
aus 14 g der Säure
in 300 ml Methylenchlorid wurde auf 5°C gekühlt und 8,2 g N-Hydroxysuccinimid
(NHS) und 14,6 g N,N-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das
Gemisch wurde über Nacht
bei 5°C
gehalten. Das Präzipitat
(Dicyclohexylharnstoff) wurde abgefiltert und das Lösungsmittel
wurde verdampft. Während
dieses Schrittes trennte sich in einigen Fällen zusätzlicher Harnstoff ab und wurde ebenfalls
abgefiltert. Das rohe Produkt wurde aus Isopropanol umkristallisiert,
um etwa 15 g des NHS-Ester-Monomers zu ergeben.
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(4) Bildung einer polyfunktionellen
Polymermonoschicht
-
Ein
Comonomergemisch aus N,N-Dimethylacrylamid (DMAA) und dem aus (3)
erhaltenen N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester
(C6AE) wird in Dimethylformamid (DMF) als
Lösungsmittel
polymerisiert. Die Monomerkonzentration beträgt 4 mmol/l in einem molaren
Verhältnis
der Comonomere DMAA/C6AE = 5/1. Die Polymerisation
wird bei 60°C
durchgeführt.
Vor der Polymerisation werden die Lösungen alle vorsichtig entgast
durch mindestens 3 Gefrier-Tau-Zyklen, um alle Sauerstoffspuren
zu entfernen. Nach der Polymerisation wird jede Probe mit DMF für mindestens
10 Stunden extrahiert.
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(5) Nachweis von Oligonukleotidsträngen
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Die
so erhaltene Oberfläche
wurde 1 nl einer 10 μM
Oligonukleotidlösung
ausgesetzt und man lässt die
Kupplungsreaktion bei etwa 40–50°C für zwei Stunden
in einer wässrigen
Lösung
voranschreiten.
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Das
synthetische Oligonukleotid ist 5-amino-modifiziert, und die Lösung ist
mit einem 100 mM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,0
gepuffert. Nach der Kupplungsreaktion wird die Sensoroberfläche mit
Natriumphosphatpuffer gespült.
Um die räumliche
Ausdehnung der spezifischen Oligonukleotidtypen auf der Sensoroberfläche für den parallelen
Nachweis zu definieren, wurde der Reaktant auf die Polymerschicht
aufgedruckt.
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Man
ließ die
so hergestellte Oberfläche
mit einem Cy5-markierten PCR-Produkt in einem Puffer aus 2 × SSC, 10%
Dextransulfat und 50% Formamid für
12 h bei 28°C
reagieren. Der DNA-Gehalt
betrug 100 ng DNA/80 μl
Probe. Nachdem die Hybridisierungsreaktion stattgefunden hatte,
wurde die Oberfläche
in SSC-Puffer gewaschen und das Ergebnis wurde fluorometrisch über Laseraktivierung
mit einer CCD-Kamera nachgewiesen. Ein Fluoreszenzsignal konnte
nur für
solche Bereiche nachgewiesen werden, welche synthetische Oligonukleotide
trugen, die zu dem PCR-Produkt komplementär waren.