DE60028559T2

DE60028559T2 - Behandlung von multiplersklerose mit einer kombination von interferon und wachstumshormone

Info

Publication number: DE60028559T2
Application number: DE60028559T
Authority: DE
Inventors: Remy Sadoul; Sonia Pagliusi
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-03-20
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2020-03-21
Also published as: IL145722A0; EP1165118B1; CA2365070A1; DE60028559D1; EP1165118A2; AU776181B2; WO2000061176A2; ATE311897T1; AU3658400A; EP1043027A1; WO2000061176A3; JP2002541211A; US6869600B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Wachstumshormon (growth hormone, GH) zusammen mit einem Interferon (IFN) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von multipler Sklerose und/oder anderen Demyelinierungserkrankungen (Entmarkungserkrankungen).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Multiple Sklerose (MS) ist eine langsam fortschreitende Erkrankung des ZNS (Zentralnervensystems), die durch verteilte Stellen einer Demyelinierung (Entmarkung) im Gehirn und im Rückenmark gekennzeichnet ist, was zahlreiche und variierende neurologische Symptome und Anzeichen zur Folge hat, gewöhnlich mit Remissionen und einer Verschlimmerung (siehe das Handbuch von Merk, 16. Auflage).
Die Ursache ist unbekannt, jedoch wird eine immunologische Abnormalität angenommen, wobei wenige Anhaltspunkte gegenwärtig einen spezifischen Mechanismus anzeigen. Postulierte Ursachen schließen eine Infektion durch einen langsamen oder latenten Virus und eine Lyse von Myelin ("Myelinolyse") durch Enzyme ein. IgG liegt gewöhnlicherweise erhöht in der Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit (CSF) vor und erhöhte Titer sind mit einer Vielzahl von Viren, einschließlich Masernviren, in Verbindung gebracht worden. Die Bedeutung dieser Befunde und der berichteten Zusammenhänge mit HLA-Allotypen und einer veränderten Anzahl von T-Zellen ist unklar und die Beweislage ist etwas widersprüchlich.
Eine erhöhte familiäre Inzidenz weist auf eine genetische Anfälligkeit hin; Frauen sind etwas häufiger betroffen als Männer. Es scheinen Umweltfaktoren vorhanden zu sein. Obwohl das Alter beim Ausbruch im allgemeinen zwischen 20 und 40 Jahren liegt, ist MS mit dem geographischen Gebiet, in dem der Patient die ersten 15 Jahre verbracht hat, in Verbindung gebracht worden. Eine Ortsveränderung nach dem Alter von 15 Jahren verändert das Risiko nicht.
Stellen oder Inseln einer Demyelinierung (Entmarkung) mit einer Zerstörung der Oligodendroglia und einer perivaskulären Entzündung sind über das ZNS verteilt, in erster Linie in der weißen Substanz mit einer Bevorzugung der lateralen ad posterior Gebiete (Säulen) (insbesondere in den zervikalen und dorsalen Regionen), der optischen Nerven und der periventrikulären Areale. Abschnitte im Mittelhirn, dem Pons (Metencephalonboden) und dem Zerebellum (Kleinhirn) sind ebenfalls betroffen und die graue Substanz, sowohl im Zerebrum (Großhirn) als auch im Mark ("cord"), kann betroffen sein.
Zellkörper und Axone bleiben gewöhnlicherweise erhalten, insbesondere bei frühen Läsionen. Später können Axone zerstört werden, insbesondere in den langen Strängen, und eine fibröse Gliose gibt den Strängen ihr "sklerotisches" Erscheinungsbild. Beide, frühe und späte Läsionen, können gleichzeitig auftreten. Chemische Veränderungen in den Lipid- und Proteinbestandteilen von Myelin sind in den Plaques und um die Plaques herum nachgewiesen worden.
Die Erkrankung ist durch zahlreiche Beschwerden und Befunde einer Fehlfunktion des ZNS gekennzeichnet, mit Remissionen und beharrlich wiedereinsetzenden Verschlimmerungen.
Die magnetische Resonanzbildgebungsmethode (Magnetic Resonance Imaging, MRI) ist die sensitivste diagnostische bildgebende Technik; sie kann zahlreiche Plaques darstellen. Läsionen können ebenfalls über Kontrast-verstärkte CT-Scans sichtbar gemacht werden.
Therapeutische Fortschritte bei multipler Sklerose (MS) haben sich langsam abgezeichnet, teilweise aufgrund des lückenhaften Verständnisses der Pathogenese dieser Erkrankung. Für eine auf Erfahrungen basierende Behandlung schliessen die wesentlichen Hindernisse, um Fortschritte zu machen, den hochvariablen Verlauf von MS, den Langzeitcharakter der wichtigsten Ergebnismessungen und das Fehlen objektiver Kennzeichen einer Behandlungswirkung, insbesondere auf kurze Sicht, ein.
Obwohl die Pathogenese von MS unbestimmt bleibt, wird die Untersuchung des naturgemäßen Geschehens fortgesetzt. Objektive Ergebnismessungen, die auf magnetischer Resonanzbildgebung (MRI) basieren, sind entwickelt worden und viele der Fallen von klinischen Versuchen sind nun bekannt, was zu verbesserter klinischer Methodik und einer besseren Interpretation der Ergebnisse geführt hat.
Interferone sind eine Unterklasse von Zytokinen, die sowohl antivirale als auch antiproliferative Aktivität aufweisen. Auf der Basis von biochemischen und immunologischen Eigenschaften werden die natürlich auftretenden humanen Interferone in drei Klassen eingeteilt: Interferon-alpha (Leukozyt), Interferon-beta (Fibroblast) und Interferon-gamma (Immunsystem). Das alpha-Interferon ist gegenwärtig in den Vereinigten Staaten und anderen Ländern für die Behandlung von Haarzell-Leukämie, Geschlechtswarzen, Kaposi's Sarkom (ein Krebs, der üblicherweise Patienten betrifft, die an der erworbenen Immunabwehrschwäche (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) leiden) und chronischer non-A-, non-B- Hepatitis zugelassen.
Interferone (IFNs) sind weiterhin Glycoproteine, welche vom Körper als Antwort auf eine virale Infektion hergestellt werden. Sie inhibieren die Vermehrung der Viren in geschützten Zellen. Da sie aus einem Protein mit niedrigem Molekulargewicht bestehen, sind IFNs bemerkenswert unspezifisch in ihrer Wirkung, d.h. IFN, das durch ein Virus induziert wurde, ist wirksam gegen ein großes Spektrum von anderen Viren. Sie sind jedoch Speziesspezifisch, d.h. IFN, das von einer Spezies produziert wird, wird lediglich eine antivirale Aktivität in Zellen der gleichen oder einer nahe verwandten Spezies stimulieren. IFNs waren die erste Gruppe von Zytokinen, die aufgrund ihrer möglichen Antitumor- und antiviralen Aktivitäten genutzt wurden.
Die drei bedeutenden IFNs werden als IFN-α, IFN-β und IFN-γ bezeichnet. Diese Hauptarten von IFNs wurden anfangs aufgrund ihrer Herkunftszellen (Leukozyten, Fibroblasten oder T-Zellen) klassifiziert. Es wurde jedoch offensichtlich, dass mehrere Typen von einer Zelle hergestellt werden können. Daher wird das Leukozyten-IFN nunmehr IFN-α, das Fibroblasten-IFN IFN-β und das T-ZeII-IFN IFN-γ genannt. Es gibt ebenfalls einen vierten IFN-Typ, das Lymphoblastoid-IFN, das von der "Namalwa" Zelllinie (abgeleitet vom Burkitt-Lymphom) produziert wird, welche anscheinend eine Mischung von sowohl Leukozyten- als auch Fibroblasten-IFN produziert.
Die Interferon-Einheit („unit") wird als Maß für die IFN-Aktivität bezeichnet, die (etwas willkürlich) als die Menge definiert wurde, die erforderlich ist, um 50 % der Zellen gegen einen viralen Schaden zu schützen.
Jede Klasse von IFN enthält mehrere unterschiedliche Typen. IFN-β und IFN-γ sind jeweils das Produkt eines einzigen Gens. Die Unterschiede zwischen den individuellen Typen scheinen hauptsächlich aufgrund von Variationen in der Glykosylierung zu bestehen.
IFNs-α stellen die verschiedenartigste Gruppe dar, die ungefähr 15 Typen enthält. Es existiert ein Cluster von IFN-α-Genen auf dem Chromosom 9, welches mindestens 23 Mitglieder enthält, von denen 15 aktiv sind und transkribiert werden. Reife IFNs-α sind nicht glykolysiert.
IFNs-α und IFN-β haben alle die gleiche Länge (165 oder 166 Aminosäuren) mit ähnlichen biologischen Aktivitäten. IFNs-γ haben eine Länge von 146 Aminosäuren und ähneln den α- und β-Klassen weniger stark. Lediglich IFNs-γ können Makrophagen aktivieren oder die Reifung von Killer-T-Zellen induzieren. Tatsächlich können diese neuen Typen therapeutischer Wirkstoffe als Modifizierer einer biologischen Antwort (biologic response modifiers, BRMs) bezeichnet werden, da sie eine Wirkung auf die Antwort des Organismus auf den Tumor besitzen, indem sie die Erkennung über eine Immunmodulation beeinflussen.
Insbesondere humanes Fibroblasten-Interferon (IFN-β) besitzt antivirale Aktivität und kann ebenfalls natürliche Killerzellen gegen neoplastische Zellen stimulieren. Es handelt sich um ein Polypeptid von ungefähr 20.000 Da, welches durch Viren und doppelsträngige RNAs induziert wird. Von der Nukleotidsequenz des Gens für Fibroblasten-Interferon, welches mittels rekombinanter DNA-Technologie kloniert wurde, leitete Derynk et al. (Derynk R. et al., Nature 285, 542–547, 1980) die vollständige Aminosäuresequenz des Proteins ab. Es ist 166 Aminosäuren lang.
Shepard et al. (Shepard H. M. et al., Nature, 294, 563–565, 1981) beschrieb eine Mutation an der Base 842 (Cys → Tyr an Position 141), welche seine antivirale Aktivität aufhob, und einen varianten Klon mit einer Deletion der Nukleotide 1119 bis 1121.
Mark et al. (Mark D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662–5666, 1984) fügte eine künstliche Mutation durch Ersetzen der Base 469 (T) durch (A) ein, welches einen Aminosäurewechsel von Cys → Ser an Position 17 bewirkte. Von dem resultierenden IFN-β wurde berichtet, dass es so aktiv ist, wie das "native" IFN-β und während einer Langzeitaufbewahrung (– 70°C) stabil bleibt.
Rebif^® (rekombinantes humanes Interferon-β) ist die neueste Entwicklung in der Interferon-Therapie für multiple Sklerose (MS) und stellt einen signifikanten Fortschritt in der Behandlung dar. Rebif^® ist Interferon (IFN)-beta 1a, welches von Säugetierzelllinien produziert wird und nahezu identisch mit dem natürlich auftretenden humanen Molekül ist.
Die Mechanismen, über welche die IFNs ihre Wirkungen ausüben, sind nicht vollständig verstanden. In den meisten Fällen wirken sie jedoch, indem sie die Induktion oder Transkription von bestimmten Genen beeinflussen, und so das Immunsystem beeinflussen. In vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass IFNs in der Lage sind, ungefähr 20 Genprodukte zu induzieren oder zu supprimieren.
IFN-β kann über drei wesentliche Signalwege bei MS wirken:

• Regulierung von T-Zell-Funktionen, wie Aktivierung, Proliferation und Suppressorzellfunktion;
• Modulation der Produktion von Zytokinen: Herunterregulierung von proinflammatorischen Zytokinen und Hochregulierung von inhibitorischen, antiinflammatorischen Zytokinen;
• Regulierung der Wanderung und Infiltration von T-Zellen in das ZNS über die Blut-Hirn-Schranke (BBB, blood brain barrier).

Die PRISMS-Untersuchung hat die Wirksamkeit von Interferon beta-1a ermittelt, wenn dieses dreimal pro Woche subkutan in der Behandlung von "Relapsing-Remitting-Multiple Sclerosis" (RR-MS) verabreicht wurde. Die Untersuchung zeigte, dass Interferon beta-1a eine positive Wirkung auf den Langzeitverlauf von MS durch Reduzieren der Anzahl und Schwere von Rückfällen und durch Reduzieren der Belastung dieser Krankheit und der Aktivität der Krankheit, wie durch MRI gemessen, besitzen kann (Randomised, Double-Blind, Placebo-Controlled Study of Interferon beta-1a in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis", The Lancet 1998; 352 (7 November, 1998): 1498–1504).
Humanes Wachstumshormon, ebenfalls als Somatotropin bekannt, ist ein Proteinhormon und wird durch die somatotrophen Zellen der Hypophysenvorderlappen produziert und sekretiert. Die Sekretion wird durch einen Freisetzungsfaktor, d.h. das Wachstumshormon-Freisetzungshormon (growth hormone-releasing hormone, GHRH), und durch einen inhibitorischen Faktor, das Somatostatin, reguliert. Das humane Wachstumshormon spielt durch seine Wirkungen auf den Metabolismus von Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden eine Schlüsselrolle in dem somatischen Wachstum.
Das humane Wachstumshormon liegt als Einzel-Polypeptidkette von 191 Aminosäuren vor (Bewly et al., 1972) und besitzt zwei Disulfidbindungen, eine zwischen Cys-53 und Cys-165, wodurch ein großer Loop (Schleife) in dem Molekül gebildet wird, und eine andere zwischen Cys-182 und Cys-189, wodurch ein kleiner Loop (Schleife) nahe des C-Terminus gebildet wird. Die DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz bestätigt, wurde von Martial et al. (1979) beschrieben. Aufgereinigtes hGH stellt ein weißes, amorphes Pulver in seiner lyophilisierten Form dar. Es ist leicht löslich (Konzentrationen > 10 mg/l) in verdünnten wässrigen Puffern bei einem pH, der größer als 7,2 ist.
In Lösung tritt hGH überwiegend als Monomer auf, mit einer kleinen Fraktion von Dimeren und Oligomeren mit höherem Molekulargewicht. Unter bestimmten Bedingungen kann hGH induziert werden, um größere Mengen von Dimeren, Trimeren und höheren Oligomeren zu bilden.
Mehrere Derivate von hGH sind bekannt, einschließlich natürlich auftretender Derivate, Varianten und Stoffwechselprodukten, Degradationsprodukten von in erster Linie biosynthetischem hGH und konstruierten Derivaten von hGH, die durch genetische Verfahren produziert werden. Ein Beispiel eines natürlich auftretenden Derivats von hGH ist GH-V, eine Variante des Wachstumshormons, das in der Plazenta gefunden wurde. Andere Mitglieder des Genlocus werden bei Chen et al. (1989) beschrieben. Jedes beliebige Derivat von hGH, einschließlich der Derivate, die konstruiert wurden, um langandauernd im Körper zu verbleiben, kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange es die biologische Aktivität von hGH beibehält.
Methionyl-hGH war die erste Form von hGH, welche durch rekombinante DNA-Technologie produziert wurde. Diese Verbindung ist tatsächlich ein Derivat von hGH, welches einen zusätzlichen Methioninrest an dessen N-Terminus besitzt (Goeddel et al., 1979).
Von einer natürlich auftretenden Variante von hGH, genannt 20-K-hGH, wurde berichtet, dass sie sowohl in der Hypophyse als auch im Blutkreislauf auftritt (Lewis et al., 1978; Lewis et al., 1980). Diese Verbindung, welcher die 15 Aminosäurereste von Glu-32 bis Gln-46 fehlen, ergibt sich aus einem alternativen Spleißen der messenger-Ribonukleinsäure (DeNoto et al., 1981). Diese Verbindung teilt zahlreiche, jedoch nicht alle der biologischen Eigenschaften von hGH.
20-K-hGH wird in der Hypophyse hergestellt und in das Blut sekretiert. Es stellt ungefähr 5 % der Wachstumshormonproduktion ("growth hormone outpout") bei Erwachsenen und ungefähr 20 % der Wachstumshormonproduktion bei Kindern dar. Es besitzt die gleiche Wachstum-fördernde Aktivität wie das 22 kD Wachstumshormon und es wurde berichtet, dass es ein gleiches oder größeres Ausmaß an lipolytischer Aktivität besitzt, wie die 22 kD Form. Es bindet an Wachstumshormon-Rezeptoren mit gleicher Affinität wie das 22 kD Wachstumshormon und besitzt ein Zehntel der lactogenen (Prolactin-ähnlichen) Bioaktivität wie das 22 kD Hormon. Im Gegensatz zur 22 kD-Form, besitzt 20-K-hGH eine schwache Anti-Insulin-Wirkung.
GH reguliert die Sekretion des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors (IGF-1), was den größten Teil von dessen biologischer Aktivität ausmacht. Die folgenden Wirkungen von IGF-1 auf die Myelinierung sind ebenfalls bekannt:

1) in vitro: IGF-1 fördert a) die Proliferation von Oligodendrozyten-Vorläufern b) das Überleben und die Differenzierung von reifen Oligodendrozyten
2) in vivo a) transgene Mäuse, die IGF-1 überexpremieren, besitzen mehr Oligodendrozyten (20 bis 30 %), mehr myelinierte Axone und dickeres Myelin als WT Tiere. b) IGF-1 Knock-Out (KO) Mäuse und IGF-BP1-Überexpressoren sind hypomyeliniert (dies gilt ebenfalls für GH KO).
3) Während der Remylenierung (die einer "Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis" (EAE) oder einer Verletzung des Rückenmarks folgt): a) die Expression des Rezeptors 1 für IGF-1 wird in Oligodendrozyten hochreguliert. b) die Expression von IGF-1 wird in Astrozyten hochreguliert.
4) IGF-1 iv reduziert a) die Demyelinierung bei einer "Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis" bei Ratten (die durch Homogenate aus dem Rückenmark von Meerschweinchen induziert wurde) b) den Eintritt von Immunzellen in das Parenchym in einem adoptiven Transfermodell von EAE.

Rekombinantes humanes Wachstumshormon, rhGH, wird von Serono Laboratories, Inc., als SEROSTIM^® hergestellt, wobei dem Produkt beschleunigt eine FDA-Zulassung zum Behandeln von Gewichtsverlust und Auszehrung (Schwäche) bei AIDS-Patienten erteilt wurde. PROTROPIN^®, welches von Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) hergestellt wird, unterscheidet sich in der Struktur geringfügig von der natürlichen Sequenz von hGH und besitzt einen zusätzlichen Methioninrest am N-Terminus.
WO 92/07578 beschreibt die Verwendung von protektiven Wirkstoffen, ausgewählt aus Wachstumshormon (GH), D-Faktor (DF) oder IL-1 und/oder einem Tumornekrosefaktor plus GH und/oder DF, für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Prophylaxe und/oder Behandlung von schädlichen Wirkungen von reaktiven Sauerstoffspezies bei einem Patienten.
US 4,898,856 offenbart die Verwendung von GH bei Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie beispielsweise multipler Sklerose.
Die Verwendung von Interferon-beta-1a alleine bei multipler Sklerose wird beispielsweise in der "Product approval information-Licensing Action" US Food and Drug Administration (US Nahrungs- und Arzneimittelbehörde) vom 13. November 1998 offenbart.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Patentanmeldung basiert auf der Annahme, dass die Co-Verabreichung von GH bei der Behandlung von MS oder anderen Demyelinierungserkrankungen (Entmarkungserkrankungen), wodurch eine Remyelinierung begünstigt wird, die Wirkung von einem Interferon, welches dazu gedacht ist, im wesentlichen als Entzündungshemmer zu wirken, verstärkt, und somit eine synergistische Wirkung erzielt. Diese Annahme basiert auf den neuesten Befunden des Anmelders, in denen die Verabreichung von GH in Kombination mit IFN-β eine vorteilhafte Wirkung auf die Remyelinierung hat und die klinischen Anzeichen der Erkrankung in einem experimentellen Tiermodell signifikant reduziert; eine synergistische Wirkung der zwei aktiven Bestandteile wird ebenfalls gezeigt.
Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von 1 mg/kg GH in Kombination mit 10.000 IU Interferon-beta, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von MS und/oder Demyelinierungserkrankungen (Entmarkungserkrankungen).
Im allgemeinen umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen, wie gemäß der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst, wirksame Mengen von Protein- oder Derivatprodukten der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittler, Emulgatoren, Hilfsstoffen und/oder Trägerstoffen; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), Seiten 1435–712. Eine wirksame Menge eines aktiven Bestandteils stellt eine therapeutisch, prophylaktisch oder diagnostisch wirksame Menge dar, die von einem Fachmann leicht bestimmt werden kann, indem Faktoren wie das Körpergewicht, das Alter, das therapeutische oder prophylaktische oder diagnostische Ziel und die gewünschte Freisetzungsrate in Betracht gezogen werden.
Im Fall der separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung der zwei aktiven Bestandteile bestehen die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung aus zwei verschiedenen Formulierungen, von denen jede einen der zwei aktiven Bestandteile zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Exzipient(en) umfasst.
"Pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet, dass jeder beliebige Trägerstoff umfasst ist, welcher die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Bestandteils nicht behindert, und welcher nicht toxisch in Bezug auf den Wirt, welchem er verabreicht wird, ist. Für eine parenterale Verabreichung können die oben genannten aktiven Bestandteile beispielsweise in Form einer Einheitsdosierung formuliert werden, für eine Injektion in Vehikeln, wie Salzlösung, Dextroselösung, Serum-Albumin- und Ringer-Lösung.
Neben dem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff können die Zusammensetzungen der Erfindung ebenfalls kleinere Mengen an Hilfsstoffen umfassen, wie Stabilisatoren, Exzipienten, Puffern und Konservierungsmitteln.
Die Verabreichung solcher aktiven Bestandteile kann auf intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Weg erfolgen. Andere Verabreichungswege, welche die gewünschten Blutkonzentrationen der jeweiligen Bestandteile herstellen können, sind durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Die kombinierte Therapie der vorliegenden Erfindung ist dazu geeignet, MS und/oder andere Demyelinierungserkrankungen (Entmarkungserkrankungen) zu behandeln.
Der Begriff "humanes Wachstumshormon", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, schließt die natürlich auftretenden Derivate, wie oben bezeichnet, einschließlich, ohne Beschränkung, sowohl das 20 kD und das 22 kD humane Wachstumshormon, GH-V und andere Mitglieder des Wachstumshormon-Genlocus, wie beschrieben von Chen et al. (1989), ein. Der Begriff schließt ebenfalls funktionelle Derivate, Fragmente, Varianten, Analoge oder Salze ein, welche die biologische Aktivität des Wachstumshormons beibehalten, d.h., welche als Agonisten des Wachstumshormon-Rezeptors wirken. Mit anderen Worten sind sie in der Lage, an den Wachstumshormon-Rezeptor zu binden, um die Signal-Aktivität des Rezeptors zu initiieren.
Eine Anzahl von Derivaten von hGH ergeben sich aus proteolytischen Modifikationen des Moleküls. Der wichtigste Weg für den Metabolismus von hGH betrifft die Proteolyse. Die Region von hGH um die Reste 130 bis 150 herum ist extrem anfällig für die Proteolyse und mehrere Derivate von hGH, die Nicks oder Deletionen in dieser Region aufweisen, sind beschrieben worden (Thorlacius-Ussing, 1987). Diese Region befindet sich in dem großen Loop (Schleife) von hGH und die Spaltung einer Peptidbindung dort resultiert in der Erzeugung von zwei Ketten, die über die Disulfidbindung bei Cys-53 und Cys-165 verbunden sind. Von zahlreichen dieser 2-kettigen Formen ist berichtet worden, dass sie eine erhöhte biologische Aktivität aufweisen (Singh et al., 1974). Zahlreiche Derivate von humanem Wachstumshormon sind durch die Verwendung von Enzymen künstlich erzeugt worden. Die Enzyme Trypsin und Subtilisin, ebenso wie andere, sind verwendet worden, um hGH an verschiedenen Punkten überall im Molekül zu modifizieren (Lewis et al., 1977; Graff et al., 1982). Eines dieser Derivate wird als 2-kettiges anaboles Protein (2-CAP) bezeichnet und wurde durch die kontrollierte Proteolyse von hGH unter Verwenden von Trypsin gebildet (Becker et al., 1989). Für 2-CAP wurde festgestellt, dass es biologische Eigenschaften aufweist, die sich von denen des intakten hGH-Moleküls dahingehend sehr unterscheiden, dass die Wachstum-fördernde Aktivität von hGH größtenteils beibehalten wurde und die meisten der Wirkungen auf den Kohlenhydrat-Metabolismus aufgehoben wurden.
Asparagin- und Glutaminreste in Proteinen sind unter geeigneten Bedingungen anfällig für Desamidierungsreaktionen. Für hGH aus der Hypophyse ist gezeigt worden, dass es diesem Reaktionstyp unterliegt, was zur Umwandlung von Asn-152 in Asparaginsäure (Aspartat) und ebenfalls, in einem geringeren Ausmaß, zur Umwandlung von Gln-137 in Glutaminsäure (Glutamat) führt (Lewis et al., 1981). Für desamidiertes hGH ist gezeigt worden, dass es eine veränderte Empfindlichkeit gegenüber der Proteolyse durch das Enzym Subtilisin aufweist, was nahelegt, dass die Desamidierung eine physiologische Bedeutung bei der Steuerung der proteolytischen Spaltung von hGH besitzt. Von biosynthetischem hGH ist bekannt, dass es unter bestimmten Lagerungsbedingungen degradiert, was zur Desamidierung an einem anderen Asparagin (Asn-149) führt. Dies ist die wichtigste Stelle für eine Desamidierung, jedoch wurde auch eine Desamidierung an Asn-152 beobachtet (Becker et al., 1988). Eine Desamidierung an Gln-137 ist für biosynthetisches hGH nicht berichtet worden.
Methioninreste in Proteinen sind für eine Oxidation anfällig, hauptsächlich für Sulfoxid. Sowohl aus der Hypophyse stammendes als auch biosynthetisches hGH unterliegen Sulfoxidationen an Met-14 und Met-125 (Becker et al., 1988). Eine Oxidation an Met-170 wurde ebenfalls für das Hypophysen-, nicht jedoch für biosynthetisches hGH berichtet. Sowohl für Desamid-hGH als auch für Met-14-Sulfoxid-hGH wurde festgestellt, dass sie die volle biologische Aktivität aufweisen (Becker et al., 1988).
Es wurden verkürzte Formen von hGH produziert, entweder durch die Wirkungen von Enzymen oder durch genetische Verfahren. Bei 2-CAP, welches durch die kontrollierte Wirkung von Trypsin erzeugt wurde, sind die ersten acht Reste am N-Terminus von hGH entfernt worden. Andere verkürzte Versionen von hGH sind produziert worden, indem das Gen vor der Expression in einem geeigneten Wirt modifiziert wurde. Die ersten 13 Reste sind entfernt worden, um ein Derivat zu erhalten, das unterscheidbare biologische Eigenschaften aufweist (Gertler et al., 1986), wobei die Polypeptidkette nicht gespalten wurde.
Obwohl humanes Wachstumshormon ursprünglich aus den Hypophysendrüsen von Kadavern erhalten wurde, waren diese Präparationen elektrophoretisch nicht homogen und es erschienen Antikörper in dem Serum von Patienten, die mit Präparationen mit einem Reinheitsgrad von 50 % behandelt wurden, wobei die Immunogenität auf inaktive Komponenten zurückzuführen war. Die rekombinante DNA-Technologie erlaubte die Produktion einer unbegrenzten Menge an hGH in einer Anzahl verschiedener Systeme. Die Aufreinigung von hGh aus dem Kulturmedium wird durch die Gegenwart von lediglich geringen Mengen von kontaminierenden Proteinen vereinfacht. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass hGH in Labormaßstab durch einen einzigen Aufreinigungsschritt über eine Umkehrphasen-HPLC-Säule („reversed-phase HPLC column") aufgereinigt werden kann (Hsiung et al. (1989)).
Rekombinantes hGH wird im allgemeinen in Fläschchen vermarktet, die hGH sowie zusätzliche Exzipienten, z.B. Glycin und Manitol, in einer lyophilisierten Form enthalten. Ein be gleitendes Fläschchen mit Verdünnungsmittel wird bereitgestellt, was es dem Patienten erlaubt, das Produkt auf die gewünschte Konzentration vor der Verabreichung der Dosis einzustellen. Rekombinantes hGH kann ebenfalls auf andere gut bekannte Arten, wie beispielsweise als vorgefüllte Spritzen etc., vermarktet werden.
IFN-β stellt das IFN gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Der Begriff "Interferon-beta (IFN-β)", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schließt Interferon aus humanen Fibroblasten ein, wie es durch die Isolierung aus biologischen Flüssigkeiten erhalten wird, oder wie es durch rekombinante DNA-Techniken aus prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erhalten wird, ebenso wie seine Salze, funktionellen Derivate, Varianten, Analoge und Fragmente.
"Funktionelle Derivate", wie hierin verwendet, decken Derivate ab, welche mit Mitteln aus dem Stand der Technik auf der Basis der funktionellen Gruppen zubereitet werden können, die als Seitenketten an den Resten oder an den N- oder C-terminalen Gruppen auftreten und sind in die Erfindung eingeschlossen, solange sie pharmazeutisch akzeptabel bleiben, d.h. sie die biologische Aktivität der Proteine, wie oben beschrieben, nicht zerstören, d.h., die Fähigkeit, an den entsprechenden Rezeptor zu binden und die Rezeptorsignalgebung zu initiieren, und solange sie keine toxischen Eigenschaften auf die Zusammensetzungen, in denen sie enthalten sind, übertragen.
Derivative können chemische Gruppen, wie Kohlenhydrat- oder Phosphatreste, aufweisen, vorausgesetzt, dass ein Derivat die biologische Aktivität des Proteins beibehält und pharmazeutisch akzeptabel bleibt.
Derivate können zum Beispiel aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acyl-Derivate oder freie Aminogruppen der Aminosäurereste, gebildet mit Acylgruppen (z.B. Alkanoylgruppen oder carbozyklischen Aroylgruppen) oder O-Acyl-Derivate einer freien Hydroxylgruppe (z.B. der von Seryl- oder Threonylresten), gebildet mit Acylgruppen, einschließen. Solche Derivate können ebenfalls z.B. Seitenketten mit Polyethylenglycol einschließen, welche antigene Stelle maskieren können und die Aufenthaltsdauer des Moleküls in Körperflüssigkeiten ausdehnen können.
Von besonderer Bedeutung ist ein Protein, das mit einem komplexierenden Agens derivatisiert oder kombiniert worden ist, um langandauernd (dauerhaft) vorzuliegen. Z.B. können pegylierte Versionen oder gentechnisch konstruierte Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine langandauernde Aktivität im Körper aufzuweisen.
Der Begriff „Derivate" schließt lediglich solche Derivate ein, bei denen eine Aminosäure nicht in eine andere der zwanzig gewöhnlich auftretenden natürlichen Aminosäuren verändert ist.
Der Begriff „Salze" bezieht sich hierin sowohl auf Salze von Carboxylgruppen als auch auf Säureadditionssalze von Aminogruppen der oben beschriebenen Proteine oder der Analoge hiervon. Salze einer Carboxylgruppe können durch aus dem Stand der Technik bekannte Mittel gebildet werden und schließen anorganische Salze, wie z.B. Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- oder Zinksalze und dergleichen, und Salze mit organischen Basen, wie solche, die beispielsweise mit Aminen, wie Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen, gebildet werden, ein. Säureadditionssalze schließen zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, und Salze mit organischen Säuren, wie z.B. Essigsäure oder Oxalsäure, ein. Selbstverständlich muss jedes beliebige solcher Salze die biologische Aktivität der Proteine (hGH bzw. IFN-beta), die bzgl. der vorliegenden Erfindung relevant ist, d.h. die Fähigkeit, an den entsprechenden Rezeptor zu binden und die Rezeptor-Signalgebung zu initiieren, beibehalten.
Ein „Fragment" gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft jede beliebige Untergruppe der Moleküle, welche ein kürzeres Peptid darstellt, das die gewünschte biologische Aktivität beibehält. Fragmente können leicht zubereitet werden, indem Aminosäuren von einem der beiden oder beiden Enden des Moleküls entfernt werden und das resultierende Molekül auf seine Eigenschaften als Rezeptoragonist hin überprüft wird. Proteasen zum Entfernen jeweils einer Aminosäure von entweder dem N-Terminus oder dem C-Terminus eines Polypeptids sind bekannt, so dass die Bestimmung von Fragmenten, welche die gewünschte biologische Aktivität beibehalten, lediglich Standardexperimente mit sich bringt.
Zusätzlich kann das Polypeptid, welches solche hGH-Rezeptoragonist-Aktivität aufweist, sei es hGH, ein Analog oder eine Variante, ein Salz, ein funktionelles Derivat oder Fragment hiervon, ebenfalls zusätzliche Aminosäurereste enthalten, welche das hGH-Polypeptid flankieren. Solange das resultierende Molekül die hGH-Rezeptoragonist-Fähigkeit des Kernpolypeptids beibehält, kann man durch Standardexperimente bestimmen, ob irgendwelche solcher flankierenden Reste die grundlegenden und neuen Eigenschaften des Kernpeptids, d.h. seine Rezeptoragonist-Eigenschaften, beeinflussen. Der Begriff „im wesentlichen bestehend aus", wenn er auf eine spezifizierte Sequenz bezogen ist, bedeutet, dass zusätzlich flankierende Reste vorhanden sein können, welche die grundlegenden und neuen Eigenschaften der spezifizierten Sequenz nicht beeinflussen. Dieser Begriff umfasst keine Substitutionen, Deletionen oder Additionen innerhalb der spezifizierten Sequenz.
Eine „Variante" gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Molekül, welches im wesentlichen ähnlich zu entweder den vollständigen, oben definierten Proteinen oder einem Fragment hiervon ist. Peptidvarianten können herkömmlich zubereitet werden durch eine direkte chemische Synthese der Peptidvariante unter Verwenden von Verfahren, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind. Selbstverständlich würden solche Varianten eine ähnliche Rezeptorbindungs- und Signalinitüerungsaktivität aufweisen wie das entsprechende natürlich auftretende Protein.
Aminosäuresequenzvarianten der oben definierten Proteine (GH und/oder ein Interferon) können durch Mutationen in den DNAs, welche die synthetisierten Derivate kodieren, zubereitet werden. Solche Varianten schließen z.B. Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz ein. Jede beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann ebenfalls durchgeführt werden, um das Endkonstrukt zu erreichen, vorausgesetzt, dass das Endkonstrukt die gewünschte Aktivität besitzt. Naheliegenderweise dürfen die Mutationen, welche in der DNA, die die Peptidvariante kodiert, durchgeführt werden, den Leserahmen nicht verändern und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, die eine Sekundärstruktur der mRNA hervorbringen könnten.
Auf der genetischen Ebene werden diese Varianten gewöhnlicherweise durch ortsspezifische Mutagenese von Nukleotiden in der DNA, welche das Peptidmolekül kodiert, zubereitet, wodurch eine DNA produziert wird, welche die Variante kodiert, und danach wird die DNA in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert. Die Varianten weisen typischerweise die qualitativ gleiche biologische Aktivität wie die nicht-varianten Peptide auf.
Ein „Analog" der oben definierten Proteine (GH und/oder ein Interferon) gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein nicht natürliches Molekül, welches im wesentlichen ähnlich zu entweder den vollständigen Molekülen oder zu einem aktiven Fragment hiervon ist. Ein solches Analog würde die gleiche Aktivität wie das entsprechende natürlich auftretende Protein aufweisen.
Die Arten der Substitutionen, welche beim humanen Wachstumshormon und/oder bei einem Interferon gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, können auf der Analyse der Häufigkeit von Aminosäurenveränderungen zwischen einem homologen Protein aus verschiedenen Spezies basieren. Auf einer solchen Analyse basierend, können konservative Substitutionen hierin als Austausche innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen definiert werden:

Kleine, alphatische, nicht-polare oder geringfügig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
II. Polare, negativ geladene Reste und ihre Amide: Asp, Asn, Glu, Gln
III. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
IV. Große, aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val, Cys
V. Große, aromatische Reste Phe, Tyr, Trp

Innerhalb der vorangehenden Gruppen werden folgende Substitutionen als „hoch konservativ" betrachtet:
Asp/Glu
His/Arg/Lys
Phe/TyrΠrp
Met/Leu/Ile/Val
Semi-konservative Substitutionen werden als Austausche zwischen zwei der obigen Gruppen (I) bis (IV) definiert, welche auf die Übergruppe (A), welche die obigen (I), (II) und (III) umfasst, beschränkt sind, oder auf die Übergruppe (B), welche die obigen (IV) und (V) umfasst. Die Substitutionen sind nicht auf die genetisch kodierten oder sogar auf die natürlich auftretenden Aminosäuren beschränkt. Wenn das Epitop mittels Peptidsynthese zubereitet wird, kann die gewünschte Aminosäure direkt verwendet werden. Alternativ kann eine genetisch kodierte Aminosäure modifiziert werden, indem sie mit einem organischen, derivatisierenden Agens zur Reaktion gebracht wird, der in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren.
Cysteinreste („cysteinyl residues") werden am häufigsten mit alpha-Haloacetaten (und den entsprechenden Aminen), wie z. B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, zur Reaktion gebracht, um Carboxylmethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinreste werden ebenfalls derivatisiert durch eine Reaktion mit Bromtrifluoraceton, alpha-Brombeta-(5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Histidinreste („histidyl residues") werden derivatisiert durch eine Reaktion mit Diethylprocarbonat bei pH 5,5 bis 7,0, da dieses Agens relativ spezifisch für die Histidinseitenkette ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls verwendbar; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysin- und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Eine Derivatisierung mit diesen Agentien hat die Wirkung, die Ladung der Lysinreste („lysinyl residues") umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von alpha-Aminosäure-enthaltenden Resten schließen Imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und eine Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat ein.
Argininreste („arginyl residues") werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien) modifiziert, unter denen sich Phenylglyoxalat; 2,3-Butandion; und Ninhydrin befinden. Eine Derivatisierung von Argininresten erfordert es, dass die Reaktion aufgrund des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Diese Reagenzien können weiterhin ebenso mit den Gruppen von Lysin als auch mit der Arginin-Epsilon-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosinresten („tyrosyl residues") per se ist ausführlich untersucht worden, mit besonderem Interesse an dem Einführen von spektralen Markierungen in Tyrosinreste durch eine Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am häufigsten werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. ε-Nitro-Derivate zu bilden.
Carboxylseitengruppen (Aspartat oder Glutamat) ("aspartyl or glutamyl") werden selektiv modifiziert, indem sie mit Carbodiimiden (R'N-C-N-R'), wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-[2-morpholinyl-(4-ethyl)]carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid zur Reaktion gebracht werden. Weiterhin werden Aspartat- und Glutamatreste in Asparagin(„asparaginyl") und Glutamin- („glutaminyl") Reste durch eine Reaktion mit Ammonium-Ionen umgewandelt.
Glutamin- und Asparaginreste werden oft in die entsprechenden Glutamat- und Aspartatreste desamidiert. Alternativ werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Gegenstand dieser Erfindung.
Beispiele zur Herstellung von Aminosäuresubstitutionen in Proteinen, die verwendet werden können, um Analoge für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erhalten, schließen jede beliebigen bekannten Verfahrensschritte ein, wie solche, dargestellt in den US-Patenten RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585 und 4,737,462, von Mark et al; 5,116,943 von Koths et al; 4,965,195 von Namen et al; und 5,017,691 von Lee et al, und Lysinsubstituierte Proteine, wie in dem US Patent 4,904,584 (Shaw et al) dargestellt.
Vorzugsweise weist die Variante oder das Analog, wie oben definiert, eine Kernsequenz auf, die die gleiche ist, wie die der „nativen" Sequenz oder einem biologisch aktiven Fragment hiervon, wobei sie/es eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70 % Identität zu der nativen Aminosäuresequenz aufweist und die biologische Aktivität hiervon beibehält. Stärker bevorzugt weist eine solche Sequenz mindestens 80 % Identität, mindestens 90 % Identität oder am stärksten bevorzugt mindestens 95 % Identität zur nativen Sequenz auf.
Der Begriff „Sequenzidentität", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass die Sequenzen, wie folgt, verglichen werden. Die Sequenzen werden unter Verwenden von Version 9 „of the Genetic Computing Group's GAP" (global alignment program); unter Verwenden der Standardeinstellungs- (BLOSUM62) Matrix (Werte –4 bis +11) mit einer „gap open penalty" von –12 (für die erste Null eines „gap") und einer „gap extension penalty" von –4 (pro jeder zusätzlichen aufeinanderfolgenden Null in dem „gap") abgeglichen. Nach dem Abgleich wird die Prozentidentität berechnet, indem die Anzahl der Übereinstimmungen („matches") als Prozentsatz der Anzahl der Aminosäuren in der beanspruchten Sequenz ausgedrückt wird.
Analoge oder Varianten entsprechend der vorliegenden Erfindung können ebenfalls entsprechend der folgenden Vorgehensweise bestimmt werden. Die DNA der nativen Sequenz ist im Stand der Technik bekannt und ist in der Literatur zu finden (Martial et al, 1979). Polypeptide, welche durch irgendeine Nukleinsäure, wie z. B. DNA oder RNA, kodiert werden, die mit dem komplementären Gegenstück der nativen DNA oder RNA unter hoch stringenten oder moderat stringenten Bedingungen hybridisieren, fallen ebenfalls unter den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange das Polypeptid die biologische Aktivität der nativen Sequenz behält.
Stringenzbedingungen sind eine Funktion der im Hybridisierungsexperiment verwendeten Temperatur, der Molarität der monovalenten Kationen und des Prozentsatzes an Formamid in der Hybridisierungslösung. Um den Grad der Stringenz, der an jedem beliebigen gegebenen Satz von Bedingungen beteiligt ist, zu bestimmen, verwendet man zuerst die Gleichung von Meinkoth et al. (1984), um die Stabilität der Hybride mit 100 % Identität zu bestimmen, ausgedrückt als Schmelztemperatur Tm des DNA-DNA-Hybrids: Tm = 81,5 °C + 16,6 (_LogM) + 0,41 (% GC) – 0,61 (% Form) – 500/L, wobei M die Molarität der monova lenten Kationen ist, % GC der Prozentsatz an G- und C-Nukleotiden in der DNA ist, Form der Prozentsatz an Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Für jeden 1 °C-Schritt, um den die Tm gegenüber der für ein Hybrid mit 100 % Identität berechneten reduziert wird, wird die Anzahl der erlaubten Fehlpaarungen um ungefähr 1 % erhöht. Wenn daher die verwendete Tm für jedes beliebige gegebene Hybridisierungsexperiment bei den spezifischen Salz- und Formamidkonzentrationen 10 °C unterhalb der Tm, die für ein 100 % Hybrid gemäß der Gleichung von Meinkoth berechnet wurde, liegt, tritt die Hybridisierung sogar dann auf, wenn es dort bis zu ungefähr 10 % Fehlpaarung gibt.
Wie hierin verwendet, sind hoch stringente Bedingungen solche, die bis zu ungefähr 15 Sequenzabweichung tolerant sind, während moderat stringente Bedingungen solche sind, die bis zu ungefähr 20 % Sequenzabweichung tolerant sind. Ohne Einschränkung wird bei hoch stringenten (12 bis 15 °C unterhalb der berechneten Tm des Hybrids) und moderat (15 bis 20 °C unterhalb der berechneten Tm des Hybrids) Bedingungen eine Waschlösung von 2 × SSC (standard saline citrate) und 0,5 % SDS bei geeigneter Temperatur unterhalb der berechneten Tm des Hybrids verwendet. Die endgültige Stringenz der Bedingungen ist in erster Linie auf die Waschbedingungen zurückzuführen, insbesondere wenn die verwendeten Hybridisierungsbedingungen solche sind, welche es weniger stabilen Hybriden erlauben, neben den stabilen Hybriden gebildet zu werden. Die Waschbedingungen bei höherer Stringenz entfernen sodann die weniger stabilen Hybride. Eine übliche Hybridierungsbedingung, die mit den oben beschriebenen, hoch stringenten bis moderat stringenten Waschbedingungen verwendet werden kann, ist Hybridisierung in einer Lösung aus 6 × SSC (oder 6 × SSPE), 5 × Denhardt's Reagenz, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierter Lachssperma-DNA bei einer Temperatur von ungefähr 20 °C bis 25 °C unterhalb der Tm. Sofern gemischte Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) anstelle von SSC zu verwenden (Ausubel, 1987–1998).
Während die vorliegende Erfindung rekombinante Verfahren zur Herstellung der oben definierten Derivate bereitstellt, können diese Derivate ebenfalls durch herkömmliche Proteinsyntheseverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung ist mit Bezugnahme auf die spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden, der Inhalt der Beschreibung umfasst jedoch sämtliche Modifikationen und Substitutionen, welche durch einen Fachmann vorgenommen werden können, ohne über die Bedeutung und den Zweck der Ansprüche hinauszugehen.
Die Erfindung wird nunmehr mittels der folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht dahingehend auszulegen sind, in irgendeiner Weise die vorliegende Erfindung zu beschränken. Die Beispiele nehmen auf die nachfolgend spezifizierten Figuren Bezug.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1
Wirkung der GH-Behandlung auf den zeitlichen Verlauf eines klinischen Mittelwertes ("mean clinical") von MOG-induziertem EAE in Mäusen. Die Mäuse wurden mit 200 μg MOG35-55 Peptid in CFA immunisiert und es wurde ihnen 500 ng Pertussistoxin unmittelbar und zwei Tage später ip verabreicht. Die Tiere erhielten eine Woche später eine Wiederholungsinjektion ("boost"), die aus einer identischen Menge an Peptid in CFA bestand. Klinische Mittelwerte ("mean clinical scores") (± SEM) von Gruppen, die täglich mit entweder Salzlösung oder mit rekombinantem humanen Wachstumshormon, 2 mg/kg s.c., von Beginn der Erkrankung bis Tag 31 der Behandlung injiziert wurden, sind gezeigt. Statistische Analysen der Fläche unterhalb der Kurve haben unter Verwenden von entweder dem unverbundenen t-Test ("unpaired t-test") als auch dem Mann-Whitney-Test den einseitigen P-Wert ("one-tailed P value") von 0,02 gezeigt, der als signifikant betrachtet wurde.
2
Synergistische Wirkung von GH-Behandlung und IFN-beta auf den zeitlichen Verlauf von MOG-induziertem EAE in Mäusen. Die Tiere wurden immunisiert, wie es in der Beschreibung von 1 beschrieben wird. Die klinischen Mittelwerte (± SEM) von Mäusen, die mit rekombinantem humanen Wachstumshormon bei 1 mg/kg von Beginn bis Tag 33 der Erkrankung injiziert wurden, sind statistisch nicht verschieden von den Kontrollen, denen Salzlösung injiziert wurde, während rekombinantes murines IFN-beta die klinischen Mittel werte signifikant herabsetzt, wie anhand der Fläche unterhalb der Kurve analysiert wurde (der einseitige P-Wert beträgt 0,0076). Jedoch konnte rhGH bei einer Dosis, die für sich genommen keine Wirkung aufgewiesen hat, wenn es mit IFNb kombiniert wurde, die neurologische Erkrankung bei Mäusen signifikant herabsetzen, wie es durch die klinischen Mittelwerte unter Verwenden von Analysen der Fläche unterhalb der Kurve durch den unverbundenen T-Test reflektiert wird (der einseitige P-Wert beträgt 0,02, was als signifikant für IFN × GH + IFN betrachtet wird).
Beispiele
Wir haben die hypothetische, vorteilhafte Wirkung von GH auf die Remyelinierung getestet unter Verwenden des "Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis" Modells, welches ein Modell für chronische Demyelinierung (Entmarkung) ist.
EAE-Induktionsprotokoll
"Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis" (EAE) ist bei Gruppen von Mäusen, wie nachfolgend beschrieben, induziert worden. Gruppen von C57black6/J weiblichen Mäusen werden subkutan in die rechte Flanke bei Tag 0 mit 200 μl Emulsion, die 200 μg eines synthetischen Peptids enthält, welches dem Myelin-Oligodendrozyten-Glycoprotein (MOG 35-55, Neosystem) entspricht, in kompletten Freund's Adjuvanz, welches 5 mg/ml H37RA Mycobakterium tubercolosis enthält, immunisiert.
Unmittelbar und an Tag 2 erhalten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion von 500 ng Pertussistoxin, welches in 400 μl Pertussispuffer (0,5 M NaCl, 0,015 M Tris pH 7,5, 0,017 Triton X-100) aufgelöst ist. An Tag 7 erhalten die Mäuse eine Wiederholungsinjektion („boost") mit der identischen Menge (200 μl) der Emulsion, welche 200 μg MOG35-55 Peptid in kompletten Freund's Adjuvanz enthält, diesmal in die linke Flanke.
Die Tiere, die ein deutliches Anzeichen neurologischer Beeinträchtigung zeigen, welches durch eine Lähmung des Schwanzes reflektiert wird, werden täglich mit 200 μl behandelt von entweder:

1) Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (n = 9/8),
2) humanem rekombinanten Wachstumshormon bei 1 oder 2 mg/kg (lediglich, wenn es alleine verabreicht wird) (n = 9),
3) rekombinantem murinen Interferon-beta bei 10.000 IU (n = 0/9) oder dem
4) kombinierten rhGH und rmIFNbeta.

PBS wurde als Vehikel verwendet und alle Substanzen wurden subkutan in den Nacken injiziert, wobei die Gruppe, die mit zwei Substanzen behandelt wurde, zweimal in verschiedene Stellen injiziert wurde.
Die Tiere wurden täglich auf neurologische Anzeichen hin bewertet ("scored") gemäß der vorher beschriebenen Skala.
Der zeitliche Verlauf der klinischen Mittelwerte +/– SEM von jeder Gruppe wird unten dargestellt und P < 0,05 für alle Behandlungen, ausgenommen für GH × PBS, unter Verwenden der Mann-Whitney-Test-Analyse.
Eine Kontrollgruppe erhielt lediglich das Vehikel (CFA). Gewichtsverlust und eine klinische Bewertung ("clinical score") von einzelnen Tieren ist täglich bis zu Tag 43 nach der Immunisierung aufgezeichnet worden, unter Verwenden des internationalen Bewertungsstandards („international standard of scoring") durch die folgenden Kriterien:

0 = keine Anzeichen einer Erkrankung
1 = Schwäche oder Lähmung des Schwanzes
2 = Lähmung des Schwanzes + Schwächung oder teilweise Lähmung einer/der hinteren Gliedmaße(n)
3 = Lähmung des Schwanzes + komplette Lähmung der hinteren Gliedmaßen
3.5 = Lähmung des Schwanzes + Lähmung der hinteren Gliedmaßen + Inkontinenz
4 = Lähmung des Schwanzes + Lähmung der hinteren Gliedmaßen + Schwäche oder Lähmung der vorderen Gliedmaßen
5 = sterbend P < 0,05: Der einseitige P-Wert wird als signifikant betrachtet. T-Test.

Ergebnisse
Wir haben die Wirkungen von rekombinantem humanen Wachstumshormon (rhGH) in dem früher beschriebenen EAE-Modell getestet. RhGH, wenn es täglich an erkrankte Tiere verabreicht wurde, ist bei einer Behandlungsdauer von mehr als 30 Tagen, bei Dosierungen von 2 mg/kg für subkutane Verabreichungen, wirksam im Herabsetzen der neurologischen Anzeichen der Erkrankung gewesen. Die Ergebnisse werden in i berichtet.
Die Ergebnisse, die mit der kombinierten Therapie (rhGH plus rmIFN-β) erzielt wurden, sind in 2 dargestellt.
Schlussfolgerungen
Unsere Ergebnisse zeigen eine eindeutige vorteilhafte Wirkung der GH-Behandlung, welche die klinischen Anzeichen von chronischer EAE bei Mäusen nach der Immunisierung mit MOG reduziert. Daher weist GH eine vorteilhafte therapeutische Wirkung auf und kann zur Behandlung von chronischen Demyelinierungserkrankungen (Entmarkungserkrankungen), wie MS verwendet werden; insbesondere wird eine synergistische Wirkung mit IFN-β gezeigt.
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Claims

Verwendung von 1 mg/kg Wachstumshormon (growth hormone, GH) in Kombination mit 10.000 IU Interferon beta (IFN-beta) in der Gegenwart von einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Exzipient(en) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von multipler Sklerose und/oder anderen Demyelinierungserkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das IFN-beta humanes rekombinantes IFN-beta ist.
Verwendung nach einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei das GH humanes rekombinantes Wachstumshormon ist.