DE60023862T2

DE60023862T2 - Mikromassstabgetreue vorrichtung für chemische analyse

Info

Publication number: DE60023862T2
Application number: DE60023862T
Authority: DE
Inventors: S. Joel ROSSIER; Frederic Reymond; H. Hubert GIRAULT
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2020-03-29
Also published as: WO2000058724A1; JP2002540425A; EP1166103A1; EP1166103B1; ATE309534T1; GB9907249D0; DE60023862D1; AU4292700A

Description

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Detektieren der Anwesenheit einer Zielspezies in einer wässrigen Probe und auch eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration und Reaktionskinetik von Zielspezies. Die Erfindung ist auf die Überwachung (das Monitoring) vieler verschiedener molekularer Wechselwirkungen anwendbar, insbesondere auf molekulare Erkennung zwischen einem immobilisierten Affinitätspartner und einer Spezies in Lösung, wie Immunoglobulin/Antigen-Wechselwirkung, DNA-Hybridisierung, Haptamer-Protein-Wechselwirkung, Arzneimittel- und Virusdetektion und Hochdurchsatz-Screening synthetischer Moleküle.
Da viele Affinitätskomplexbildungen zwischen zwei Reaktionspartnern diffusionskontrolliert sind, hängt die zum Erreichen des Reaktionsgleichgewichts erforderliche Zeit direkt von dem Massentransport des Moleküls ab. Die Diffusionszeit eines Moleküls in einer Lösung ist proportional zu dem Quadrat der Weglänge; in der Regel braucht ein kleines Molekül weniger als eine Sekunde, um durch 10 μm hindurch zu diffundieren, während es zwei Stunden benötigt, um einen Millimeter zurückzulegen. Um die Gleichgewichtszeit der Reaktion herabzusetzen, müssen die chemischen Partner daher so nahe wie möglich beieinander aufgebracht werden; die Gleichgewichtszeit kann dramatisch herabgesetzt werden, indem die Reaktorgröße auf Mikrodimensionen reduziert wird, ein Partner auf der Oberfläche des Reaktors immobilisiert wird und der Reaktor mit dem zweiten Partner gefüllt wird.
Die Verwendung von Mikroreaktoren erhöht nicht nur die Geschwindigkeit der Affinitätsassays, sondern erleichtert auch das Erhalten von Informationen, die Reaktionskinetiken betreffen, was zum Verständnis der thermodynamischen Stabilität von Komplexen wichtig ist. Die Affinitätskonstante K_d ist das Verhältnis zwischen den vorwärts und rückwärts gerichteten Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten k₊ und k_–, die für die Assoziationsbeziehungsweise Dissoziationskonstanten stehen. Eine starke Komplexbildung ist durch eine sehr rasche Assoziation und eine sehr langsame Dissoziation gekennzeichnet, die im speziellen Fall von Sorbensaffinitätsassays Adsorption und Desorption von der Oberfläche des Mikroreaktors sind. Das Verständnis dieser thermodynamischen Eigenschaften kann für die Studie der Kreuzreaktivität zwischen mehreren Antigenen oder der unspezifischen Adsorption eines Matrixelements während eines Affinitätsassays verwendet werden. Die Komplexbildung von Partnern mit höherer Affinität wird durch Modulieren der Inkubationszeit der Lösung begünstigt, und die unspezifische Adsorption wird dann auf ein Minimum reduziert. Diese Tatsache kann wegen der Minimierung des Hintergrundsignals bei der Abnahme der Detektionsgrenze in Immunosorbensassays ein wichtiger Faktor sein. Dieses Verfahren kann auch zur Überwachung der Adsorption von Antigenen mit unterschiedlichem Molekulargewicht verwendet werden.
Da der Diffusionskoeffizient eines Moleküls proportional zu seiner Masse ist, unterscheidet sich die Diffusionszeit des Moleküls durch die Reaktionskammer für kleine und große Moleküle. Im Fall von Molekülen mit unterschiedlichem Molekulargewicht und demselben Epitop (z. B. Fibrinabbauprodukten) kann die K_d für alle Moleküle die gleiche sein, während der Diffusionskoeffizient für jedes von ihnen verschieden ist. Wenn ein kinetisches Experiment durchgeführt wird, erreichen die kleineren Moleküle die Antikörper quantitativ vor den größeren. Das Überwachen des aus der Affinitätsreaktion resultierenden Signals als Funktion der Zeit kann somit nützliche Informationen über die Kinetik liefern, was zum Verständnis des Abbauprozesses beitragen kann. Diese kinetischen Ereignisse können durch Modulieren der Verweilzeit von Molekülen in Kontakt mit ihren Reaktionspartnern verfolgt werden, was sich am leichtesten erreichen lässt, indem ein Antikörper auf den Wänden einer Reihe von Mikroreaktoren immobilisiert wird und unterschiedliche Lösungen des interessierenden Analyten für unterschiedliche Zeiträume inkubiert werden.
In der Vergangenheit sind analytische Verfahren des oben beschriebenen Typs (wie enzymgebundene Immunosorbensassays – ELISAs) mit Mikrotiterplatten durchgeführt worden und waren relativ langsam. Es wurden in den vergangenen Jahren große Anstrengungen unternommen, die Größe von Analysevorrichtungen auf Mikrometermaßstab zu reduzieren, um die Reaktionszeiten zu verringern: Diese miniaturisierten Systeme sind als "Mikromaßstab-Vollanalysesysteme" (μ-TAS)¹ bezeichnet worden, und sie sind bereits als zweckmäßiges Mittel zum Manipulieren und Analysieren kleiner Probemengen bekannt^2–8. Die meisten μ-TAS-Vorrichtungen sind bislang durch Photolithographie, nasschemisches Ätzen oder Dünnfilmabscheidung auf Substraten wie Glas, Quarz und Silizium hergestellt worden^9,10. Um die Produktionskosten herabzusetzen, sind Kunststoffsubstrate auch maschinell mikrobearbeitet worden, wobei entweder Gießen von Silikonkautschuk^11–14, Spritzgießen¹⁵, Prägen^16,17 oder Laserphotoablation¹⁸ verwendet wurden. Diese Strukturen sind planare Vorrichtungen mit Kanälen von Mikrometergröße, die oft durch thermisches oder anodisches Binden an eine Glasabdeckung versiegelt sind. Miteinander verbundene Kanäle lassen sich leicht fertigen, wodurch die rasche Trennung und Reaktionen in Volumina von wenigen Picolitern möglich werden. Andere Vorteile von μ-TAS sind die Verringerung von Proben- und Reagenzverbrauch und die höhere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, verglichen mit Vorrichtungen im Labormaßstab^21,22.
Es sind auch kompetitive Immunoassays auf Mikrochips^23–25 durchgeführt worden, die Mikrokanäle sind jedoch nur zum elektrophoretischen Trennen von freien und gebundenen Formen von Antigen oder Antikörper verwendet worden. In diesen Assays werden Antikörper und markiertes Antigen in spezifischen Mengen zu der zu analysierenden Probe gegeben. Die Probe wird dann mit einer Mischung der markierten und nativen Antigene inkubiert, die um eine begrenzte Anzahl von Antikörperbindungsstellen konkurrieren. Der Mikrokanal wird dann zum Trennen des freien markierten Antigens von dem Komplex durch Kapillarelektrophorese verwendet, und die Quantifizierung wird durch Lumineszenz (Fluoreszenz oder Chemilumineszenz) am Ende des Trennkanals durchgeführt. Die gemessene Menge an freiem markiertem Antigen wird dann unter Verwendung einer zuvor bestimmten Kalibrierungskurve mit der Analytkonzentration in der Probe in Beziehung gesetzt. Es ist bei diesem Assaytyp wesentlich, die Adsorption eines Reaktionspartners auf den Mikrokanalwänden zu vermeiden.
Für die Simultananalyse mehrerer Proben ist ein weiterer Typ von Immunoassayvorrichtung entwickelt worden²⁶. In diesem Fall wurden biotinmarkierte Antikörper im Muster auf einen avidinbeschichteten Wellenleiter aufgebracht, um so eine Gruppierung von sechs vertikal orientierten Streifen mit festgelegten Antikörpern zu bilden, die auf der Wellenleiteroberfläche durch Avitin-Biotin-Brücken immobilisiert waren. Die Proben wurden danach mit einem Sandwich-Immunoassayformat analysiert, indem eine weitere Gruppierung von sechs horizontal orientierten Linien, die das entsprechende fluoreszenzmarkierte Antigen in verschiedenen Konzentrationen enthielten, im Muster darüber gelegt wurde. Fluoreszenzkomplexe an der Oberfläche des Wellenleiters wurden danach durch einen Diodenlaser angeregt, und die Fluoreszenzintensitäten der 36 Quadratpunkte wurden durch eine CCD-Kamera erfasst. Dieser Immunosensor ermöglicht die Parallelanalyse mehrerer Proben und die simultane Detektion von mehr als einem Analyten pro Probe.
Zahlreiche Analysenverfahren verwenden Lumineszenz zum Detektieren eines interessierenden Analyten. Lumineszenz ist der Oberbegriff, der sich auf die Emission von elektromagnetischer Strahlung (UV, sichtbarem Licht oder IR) durch ein angeregtes Molekül bezieht, das in seinen Grundzustand relaxiert, und kann durch Photoanregung (Photolumineszenz) oder durch chemische Reaktion (Chemilumineszenz und Elektrochemilumineszenz) induziert werden. Chemifluoreszenz (CF) ist eine weitere Klasse von Lumineszenzreaktionen, die den Reaktionsmechanismus von sowohl PL als auch CL kombiniert. In diesem Fall wird ein fluorogenes Substrat A durch chemische Reaktion in ein Fluoreszenzprodukt C umgewandelt, und die Lumineszenz wird durch Anregung dieses Produkts erzeugt: A + B → C + D, hv1 + C → C* und C* → C + hv2
Zu analytischen Zwecken kann einer der Reaktanten des Assaysystems, der Lumineszenz erzeugen kann, an ein Molekül gebunden werden, um es spezifisch zu "markieren". Die Anwesenheit oder Abwesenheit einer beobachtbaren Markierung, die an ein oder mehrere der Bindungsmaterialien gebunden ist, wird dann als Indikator für die Existenz eines interessierenden Analyten verwendet. Es hat sich ein großer Bereich von Experimenten zum Detektieren und Quantifizieren von Spurenmengen von Pharmazeutika, Mikroorganismen, Hormonen, Viren, Antikörpern, Nukleinsäuren und anderen Proteinen gemäß derartigen Verfahren entwickelt. In klinischen Diagnostika werden mittlerweile beispielsweise kompetitive und Sandwich-Immunoassays, die Lumineszenzdetektion verwendet, auf Routinebasis^27,28 verwendet.
Bei enzymvermittelten Immunoassays wird ein Molekül mit einem Enzym markiert, das die Lumineszenzreaktion katalysiert. Typische Beispiele sind die Detektion von Immunoreagenzien, die mit Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase (ALP) markiert sind, die in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und Hydroxidionen die Oxidation von Luminol und Dioxetanen beziehungsweise die Hydrolyse von phosphathaltigen Reagenzien erleichtern. ALP ist in ähnlicher Weise in CF-Assays zur Abspaltung einer Phosphatgruppe von einem fluorogenen Substrat verwendet worden, um ein Produkt mit hoher Fluoreszenz zu erhalten²⁹.
Lumineszenzassayverfahren werden weitverbreitet zur Analyse von Peptiden, Proteinen und Nukleinsäuren verwendet. Es ist gezeigt worden, dass CL ein hochempfindliches Detektionsverfahren sowohl in Fließ-Injektions-Analyse (FIA) als auch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist^30–32, und sie ist auch in der Kapillarelektrophorese (CE)^33,34 zur Detektion von Aminosäuren, Neurotransmittern³⁵, Seltenerdmetallionen³⁶ oder markierten Proteinen³⁷ verwendet worden. In Immunoassays ist Lumineszenz jedoch das am häufigsten verwendete Detektionsverfahren^{27,34,38–43}.
Unter den Verfahren des Standes der Technik zur Messung der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit offenbart US-A-4,621,059 ein Verfahren, bei dem das Licht, das von einer lumineszierenden Substanz emittiert wird, die durch eine Kapillarsäule fließt und mit einem immobilisierten Enzym reagiert, durch mehrere optische Fasern aufgefangen wird, die um die Längsrichtung der Säule herum angeordnet sind, um die Enzymaktivität oder die Menge des interessierenden Analyten aus der Verteilung der Lumineszenzintensität zu ermitteln.
US-A-5,624,850 beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Immunoassays in Kapillaren, wobei Fluoreszenz zum Detektieren eines interessierenden Analyten in durchscheinenden Kapillaren mit einem Innendurchmesser von ~0,1 μm bis 1,0 mm verwendet wird. Homogene Chemilumineszenz-Immunoassays können in ähnlicher Weise wie beispielsweise in US-A-5,017,473 beschrieben durchgeführt werden, wobei ein Licht absorbierendes Material und ein lumineszent markierter Tracer mit dem Analyt/Antianalyt-Komplex inkubiert werden, so dass das gesamte emittierte Licht außer demjenigen, das zu dem gebundenen Tracer gehört, durch das Licht absorbierende Material absorbiert wird.
In US-A-5,585,069 ist ein Verfahren offenbart, bei dem zwei oder mehr Proben parallel in einem System verarbeitet werden, das mehrere Mulden aufweist, die durch einen oder mehrere Kanäle verbunden sind, um eine Probe mit mechanischem oder elektrokinetischem Pumpen von einer Mulde zur anderen zu bewegen. In dieser Vorrichtung werden die Kanäle einfach als Verbindungen zwischen zwei Mulden verwendet und werden nicht als Reaktions- oder Detektionskammern verwendet.
Eine der Hauptschwierigkeiten, die mit der Verwendung von μ-TAS-Geräten verbunden ist, ist wegen der niedrigen Reynolds-Zahlen der Ströme das richtige Mischen der Reagenzien. Ein weiteres Problem liegt in der genauen Zeitgebung des Fluideintritts, was für kinetische Untersuchungen wesentlich ist. Die Anmelder haben, als sie sich dieser Probleme angenommen haben, gefunden, dass der Fluideintritt in eine Reaktionskammer (beispielsweise einen Mikrokanal) mittels einer hydrophoben Schranke genau kontrolliert werden kann.
Die vorliegende Anmeldung liefert daher in einem Aspekt eine Vorrichtung, umfassend: mindestens eine Reaktionskammer, mindestens einen Fluidzuflusskanal in Verbindung mit der oder jeder Reaktionskammer, und Schrankenmittel, die zur Verhinderung des Durchflusses von wässrigem Fluid durch den Fluidzuflusskanal/die Fluidzuflusskanäle in die Reaktionskammer(n) angepasst sind, bis eine Fluideintrittskraft auf das Fluid einwirkt, wobei das Schrankenmittel mindestens einen Teil des oder jedes Fluidzuflusskanals mit einer hydrophoben Innenfläche umfasst.
Die Vorrichtung hat vorzugsweise mehrere Reaktionskammern, die die Form von Mikrokanälen annehmen, wobei jeder einen dazugehörigen Fluidzuflusskanal aufweist. Alternativ können mehrere Mikrokanäle durch einen einzigen Zuflusskanal bedient werden, der in eine gemeinsame Rohrleitung einspeist, die mit den Mikrokanälen in Verbindung steht. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird die Fluideintrittskraft durch Aspirationsmittel geliefert, die mit einer gemeinsamen Rohrleitung verbunden sind, die an ihrem von dem Zuflusskanal entfernten Ende mit jedem Mikrokanal in Verbindung steht. In anderen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ein drehbares Trägerelement, die Fluideintrittskraft wird durch Zentrifugaldruck bereitgestellt, wenn das Substrat zum Rotieren gebracht wird. Das Trägerelement kann zweckmäßig das Substrat der Mikrokanalvorrichtung bilden, wobei die Mikrokanäle allgemein radial angeordnet sind. Das drehbare Trägerelement kann alternativ als Träger für eine oder mehrere Vorrichtungen mit parallelen Mikrokanälen dienen.
Der Vorteil einer gemeinsamen Quelle der Fluideintrittskraft für alle Mikrokanäle liegt darin, dass simultanes Füllen gewährleistet werden kann, wobei die Fluidproben durch die hydrophoben Schrankenmittel am Eintreten in die Mikrokanäle gehindert werden, bis die Fluideintrittskraft ausgeübt wird. Der Grad der Fluideintrittskraft kann zudem auch leicht kontrolliert werden, um rasches Füllen der Mikrokanäle und adäquates Mischen zu gewährleisten. Die Mikrokanäle können auch durch Ausübung einer verstärkten Kraft auf das Fluid in den Kanälen, beispielsweise durch Erhöhen des Aspirationsgrads oder durch Erhöhen der Rotationsgeschwindigkeit des Rotationsträgerelements, in effizienter und rascher Weise geleert werden. Daher lässt sich ein genauer Endpunkt eines Assays erreichen. Es ist in vielen Fällen vorteilhaft, die Probe vor dem Überwachen auf gebundene Zielspezies auszuwerfen.
Gewünschtenfalls kann ein flüssiges Reagenz oder ein Waschfluid in einem versiegelten Hohlraum bereitgestellt werden, der ein Reservoir bildet, wobei es vorzugsweise ein derartiges Reservoir pro Mikrokanal gibt. Die Reservoire können so angeordnet sein, dass sie über normalerweise geschlossene Ventile mit ihren jeweiligen Mikrokanälen in Verbindung stehen, und können zum Auswerfen ihres Inhalts durch solche Ventile gebracht werden, wenn jeweilige Kolben auf sie einwirken. Alternativ kann es ein einzelnes Reservoir geben, das über ein normalerweise geschlossenes Ventil mit einer gemeinsamen Rohrleitung in Verbindung steht, die in alle Mikrokanäle einspeist.
Detektion von Zielspezies mit den Mikrokanälen kann mit konventionellen Mitteln erreicht werden. Bevorzugte Ausführungsformen der Vorrichtung sind beispielsweise so aufgebaut, dass mindestens ein Teil der Oberfläche des Mikrokanals aus einem elektrisch leitenden Material gebildet ist, um elektrochemische Detektion zu ermöglichen. Dies kann beispielsweise ein leitendes Polymermaterial oder eine Elektrode sein. In einigen Ausführungsformen kann mindestens ein Teil der Mikrokanalwände aus einem Halbleitermaterial gebildet werden, wie Indiumoxid. Das Halbleitermaterial ist vorzugsweise transparent. Die Detektion kann alternativ durch Lumineszenz- oder Fluoreszenzmittel erreicht werden, wobei in diesem Fall ein elektromagnetischer Strahlungsdetektor wie eine Photodiode oder ein Sekundärelektronenvervielfältiger bereitgestellt wird.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass chemische Reagenzien auf den Innenseiten der Mikrokanäle immobilisiert werden können, wodurch die Möglichkeit von Assays vom ELISA-Typ in einem System vom μ-TAS-Typ geboten wird. An den Mikrokanalwänden können eine Anzahl verschiedener Reagenztypen befestigt werden, beispielsweise Oligonukleotide, Polypeptide, Proteine (wie Enzyme) oder andere natürliche oder synthetische Moleküle. Diese können zweckmäßig auf der Oberfläche der Mikrokanalwände adsorbiert sein oder kovalent daran gebunden sein (beispielsweise mittels Amidbindungsbildung mit Succinimid) oder elektrostatisch daran gebunden sein (beispielsweise mit einem Vernetzer wie Polylysin). Die Innenseite des Mikrokanals und/der des Fluidzuflusskanals kann auch mit chemisch-funktionalen Gruppen versehen sein, die durch chemische oder physikalische Behandlung gebildet worden sind.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung wie oben definiert, das die folgenden Stufen aufweist, die in beliebiger Reihenfolge oder simultan durchgeführt werden können: Bilden mindestens einer Reaktionskammer und Bilden mindestens eines Fluidzuflusskanals in Verbindung mit der Reaktionskammer bzw. den Reaktionskammern, wobei mindestens ein Teil des oder jedes Fluidzuflusskanals eine hydrophobe Innenfläche aufweist, die so angepasst ist, dass sie als Schrankenmittel wirkt, um den Durchgang von Fluid durch den Fluidzuflusskanal in die Reaktionskammer(n) solange zu verhindern, bis eine Fluideintrittskraft auf dieses Fluid wirkt.
Die Vorrichtung wird zur leichteren Fertigung vorzugsweise in zwei Hauptteilen gebildet: einem Substrat, in dem die Mikrokanäle (und möglicherweise auch die Zuflusskanäle) als Vertiefungen gebildet sind (beispielsweise durch Spritzgießen, Heißprägen, Photoablation, Gießen oder Polymerisation auf einer Form) und einer Deckschicht, die über dem Substrat und über den Vertiefungen aufgebracht wird, um die Mikrokanäle (und gegebenenfalls auch die Zuflusskanäle) zu bilden. In Ausführungsformen, in denen die Zuflusskanäle nicht in dem Substrat hergestellt worden sind, können sie beispielsweise hergestellt werden, indem eine laminierte Deckschicht mit einem Laser durchbohrt wird, oder indem oberhalb des Einlasses der Reaktionskammer eine Verbindungsstelle aufgebracht wird, die aus einem hydrophoben Material wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt ist.
Die Vorrichtung kann aus jedem beliebigen geeigneten Material gebildet werden, beispielsweise Keramiken, Glas, Halbleitern, Polymeren oder Kombinationen davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden sowohl das Substrat als auch die Laminierungsschicht aus Polymermaterial gebildet, das nicht nur leichte Bildung der Mikrokanäle (beispielsweise durch Photoablation) zulässt, sondern auch das Verschmelzen der beiden Komponenten mittels einer thermischen Laminierungstechnik ermöglicht. Es ist zu diesem Zweck bevorzugt, dass mindestens eines der Polymere aus einem Material ist, das einen relativ niedrigen Schmelzpunkt hat, beispielsweise Polyethylen mit einem Schmelzpunkt unter 200°C. Die Laminierungsschicht kann vorteilhaft aus einem elastomeren Material sein, wie Polydimethylsiloxan (PDMS). Es ist in Vorrichtungen, die zusammen mit optischen Detektionsmitteln verwendet werden sollen, bevorzugt, dass die Laminierungsschicht aus einem im Wesentlichen transparenten Material gebildet wird und das Substrat aus einem im Wesentlichen opaken Material (wie einem Keramikmaterial oder kohlenstoffgefülltem Polymer) gebildet wird.
In einem Aspekt erstreckt sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Betreiben einer Vorrichtung wie definiert, umfassend die Stufen: Aufbringen von mindestens einer Probe einer zu testenden wässrigen Lösung am Ende mindestens eines Fluidzuflusskanals entfernt von mindestens einer Reaktionskammer, Herbeiführen des Eintretens der Probe in die Reaktionskammer(n) über den Fluidzuflusskanal bzw. die Fluidzuflusskanäle durch Ausüben einer Fluideintrittskraft und Überwachen der Probe in der Reaktionskammer bzw. den Reaktionskammern auf Anwesenheit oder Konzentration einer Zielsubstanz.
In Ausführungsformen der Vorrichtung mit Aspirationsmitteln wird die Fluideintrittskraft vorzugsweise durch Aktivieren des Aspirationsmittels ausgeübt, um für einen Zeitraum im Bereich von 0,1 bis 100 s verminderten Druck auf die Mikrokanäle auszuüben. Die Aspirationsmittel können danach aktiviert werden, um die Mikrokanäle zu evakuieren, um den Mikrokanälen noch niedrigeren Druck zur Verfügung zu stellen, gegebenenfalls in Kombination mit der Zufuhr von Waschfluid aus einem Reservoir.
In Ausführungsformen der Vorrichtung, die mit drehbaren Substraten oder Trägern aufgebaut sind, wird die Fluideintrittskraft vorzugsweise durch Drehen des Substrats oder des Trägers mit einer Winkelgeschwindigkeit im Bereich von 1 bis 1000 Umdrehungen pro Minute für einen Zeitraum im Bereich von 1 bis 100 s bereitgestellt. Die Mikrokanäle können dann durch Drehen des Substrats oder Trägers mit einer erhöhten Winkelgeschwindigkeit im Bereich von 10 bis 100.000 Umdrehungen pro Minute für einen Zeitraum im Bereich von 1 bis 100 Sekunden evakuiert werden.
Die Erfindung wird anschließend detaillierter in Bezug auf die angefügten Zeichnungen als Beispiele beschrieben, worin:
1 ein schematischer Querschnitt einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, die a) nach Absetzen eines wässrigen Probetropfens auf der hydrophoben Schranke und b) nach dem Laden der Probe dargestellt ist.
2 ist eine schematische Draufsicht einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die die Stufen des parallelen Probenehmens, -ladens, und -waschens zeigt, die durch Aspiration erreicht werden.
3 ist eine schematische Draufsicht einer alternativen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, in der parallele Füll- und Waschstufen durch Zentrifugalkraft erreicht werden.
4 ist eine schematische Draufsicht einer weiteren Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, in der die Lösung durch leichte Aspiration geladen und durch starke Aspiration gewaschen wird.
5a ist eine Partialdraufsicht einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die ein Fluidreservoir neben dem Fluidzuflusskanal beinhaltet.
5b besteht aus zwei vertikalen Querschnitten der Vorrichtung von 5a zusammen mit einem dazugehörigen Kolben, wodurch die Wirkung des Kolbens illustriert wird, der in das versiegelte Reservoir eindringt und dessen Inhalt über ein Ventil in die Reaktionskammer auswirft.
6 ist eine Draufsichtdarstellung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die durch UV-Laser-Photoablation einer Polycarbonat-CD hergestellt worden ist, wobei die Ausführungsform im Wesentlichen wie die Vorrichtung von 3 aufgebaut ist.
7 ist eine Eichkurve, die aus einem Fluoreszenz-Bildgebungsgerät unter Verwendung von ALP-DDi-Lösung in dem Mikrokanal einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten wurde.
8 ist eine graphische Darstellung, die Fluoreszenzergebnisse darstellt, die das Bindungsniveau zwischen DDi-ALP in einem Test zeigt, der die Verwendung zweier Mikrokanäle der erfindungsgemäßen Vorrichtung beinhaltet, wobei einer nur mit BSA und der andere mit BSA und Anti-DDi (in der Figur mit BSA + Ab angegeben) inkubiert wurde.
9 ist ein Fluoreszenzbild, das unter Verwendung einer Vorrichtung des in 6 dargestellten Typs erhalten wurde, wobei unterschiedliche Mikrokanäle mit unterschiedlichen Konzentration von DDi-ALP inkubiert wurden.
10 ist eine graphische Darstellung, die die Fluoreszenzintensität illustriert, die aus unterschiedlichen Konzentrationen von ALP-DDi in einer Vorrichtung des in 6 dargestellten Typs mit antikörperbeschichteten Mikrokanälen erhalten wurde.
11 ist eine graphische Darstellung, die die Variation der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf aus einer Inkubation von ALP-DDi in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mindestens einem antikörperbeschichteten Mikrokanal illustriert, und
12 ist eine graphische Darstellung, die die Fluoreszenzintensität (die gebundenes ALP-DDi zeigt) in einem kompetitiven Immunoassay mit D-Dimer unter Verwendung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit mindestens einem antikörperbeschichteten Mikrokanal illustriert.
Die Mikrokanalvorrichtungen der 1 bis 6 werden durch LTV-Laser-Photoablation von im Handel erhältlichen Polymeren produziert, wie PET oder Polycarbonat. Das Photoablationsverfahren wird in bekannter Weise durchgeführt, wie beispielsweise zuvor von den Anmeldern der vorliegenden Erfindung beschrieben wurde. Kurz gesagt wurde eine Polymerfolie mit destilliertem Wasser und Ethanol gespült und danach auf einer X,Y-Arbeitsplattform (Microcontrol, Frankreich) befestigt. Danach wurden UV-Laserpulse (193 nm) (Lambda Physik LPX 205 i, Deutschland) durch eine Photomaske und eine 10:1 Linse mit einer Frequenz von 50 Hz mit 200 mJ/Puls auf das Polymersubstratziel geschossen, was pro Puls einer Fluoreszenz von 1 J/cm² auf der Oberfläche entspricht. Während des Photoablationsverfahrens wurde das Polymersubstrat mit einem X,Y-Schrittmotor (Microcontrol, Frankreich) mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mm/s horizontal bewegt, was zu 22 mm langen linearen Kanälen führte. Diese Mikrokanäle sind in der Regel zwischen 1 und 1000 μm breit, und in diesem Beispiel waren sie ungefähr 100 μm breit. Die Tiefe der Kanäle war durch Kontrolle der Anzahl der verwendeten Laserpulse auf 40 μm festgelegt (jeder Puls trug durch Photoablation ungefähr 150 nm ab). Die Kanäle wurden danach durch thermische Laminierung einer Polyethylenschicht über der Basispolymerfolie versiegelt, die Kanäle zeigten dann eine trapezoide Form, wobei drei Wände aus dem Substratpolymer (PET oder Polycarbonat) bestanden und die Decke aus der Laminierung (Polyethylen) bestand. Fluidzuflusskanäle (oder "Schranken") (1) werden entweder durch Beschießen mit ausreichenden Laserpulsen geöffnet, oder werden mechanisch durch die hydrophobe Laminierungsschicht gebohrt. Die Schranken, die einen Durchmesser zwischen 10 μm und 10 mm haben können, haben infolge der Beschaffenheit des Polymers hydrophobe Innenseiten und inhibieren daher den Durchgang wässriger Fluida.
Die genaue Anordnung der Mikrokanäle ist für den Betrieb der Erfindung nicht entscheidend, obwohl zwei allgemeine Geometrien von den Anmeldern entwickelt und getestet worden sind und sich als vorteilhaft erwiesen haben. In der ersten sind mehrere Mikrokanäle parallel zueinander angeordnet, zweckmäßig auf einem allgemein rechteckigen Substrat. Die Zuflusskanal-"Schranken" der verschiedenen Mikrokanäle sind miteinander ausgerichtet, um rasches und effizientes Beladen mit Testlösungen aus einer linearen Mehrfachpipettiervorrichtung (siehe 2) zu ermöglichen. In der zweiten Konfiguration sind die Mikrokanäle radial auf einem allgemein kreisförmigen Substrat angeordnet, wobei die Zuflusskanalschranken entweder in Richtung der Mitte des Kreises und die entgegengesetzten (Ausfluss)-Enden der Mikrokanäle in Richtung des Umkreises (3 und 6) weisen, oder anders herum (4).
Es können viele verschiedene Mittel zur Bereitstellung der Fluideintrittskraft verwendet werden, wobei die bevorzugten Mittel Aspiration und Zentrifugalkraft sind. In der Vorrichtung von 2 wird eine gemeinsame Rohrleitung (3) an den Ausflussenden der Mikrokanäle (2) bereitgestellt, an die während des Betriebs der Vorrichtung ein verminderter Druck angelegt wird, um Fluid durch die Fluidzuflussschranken in die Mikrokanäle zu ziehen. Wie in der letzten Darstellung in 2 zu sehen ist, kann das Aspirationsmittel auch verwendet werden, um eine stärkere Aspirationskraft auszuüben, um den Inhalt der Mikrokanäle in einen Abfluss auszuwerfen, gegebenenfalls zusammen mit der Zufuhr eines Waschfluida. Die in 4 dargestellte Vorrichtung arbeitet in ähnlicher Weise, wobei die Aspiration an den gemeinsamen Ausflussabfluss (6) angelegt wird. In der in den 3 und 6 dargestellten Vorrichtung wird Fluid dazu gebracht, die Fluidzuflussschranken zu passieren und in die Mikrokanäle zu gelangen, indem das Substrat zur Erzeugung von Zentrifugalkraft gedreht wird. In der dargestellten Anordnung hat jeder Mikrokanal seinen eigenen Abfluss (7).
In einer aspirationsgetriebenen Vorrichtung (wie in den 2 und 4) wird in der Regel eine 2 μl Probe mittels Pipette auf jeder Schranke (1) aufgebracht. Die Lösung wird danach mittels einer kurzen Aspiration aus der gemeinsamen Rohrleitung (3; 6) in den Mikrokanal geladen. Die Technik gewährleistet Homogenität der Lösung über den gesamten Mikrokanal. Der Mikrokanal wird nach der Inkubation aspiriert und drei Mal mit 2 μl gespült. Es ist erwähnenswert, dass das Waschlösungsvolumen viel größer als das Volumen des Mikrokanals (etwa 100 nl) ist, um effizientes Waschen zu gewährleisten. Die Füll- und Waschverfahren können unter Verwendung von durch Zentrifugaldruck getriebenen Vorrichtungen erreicht werden, indem über jeder Schranke (1) 2 μl Lösung aufgebracht werden. Langsames Drehen führt zum Laden der Probe in den Mikrokanal bzw. die Mikrokanäle, und schnelleres Drehen wird anschließend zum Auswerfen der Probe aus dem Mikrokanal bzw. den Mikrokanälen verwendet.
5 illustriert eine optionale Modifikation der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei jeder Mikrokanal ein dazugehöriges Fluidreservoir (10) aufweist, das durch einen versiegelten Hohlraum gebildet ist, der sich neben der Fluidzuflussschranke (1) befindet. Das Reservoir steht mittels eines normalerweise geschlossenen Ventils (12), das Ventilelement (13) umfasst, das unter Druck in Vertiefung (14) verformt werden kann, mit Mikrokanälen (2) in Verbindung. Reservoir (10) ist durch Siegelung (15) bedeckt, die durch abwärtsgerichteten Druck gebrochen werden kann, der von Kolben (11) ausgeübt wird, der in enger Passung in Reservoir (10) geformt ist. Die abwärtsgerichtete Bewegung von Kolben (11) in Reservoir (10) erhöht den Fluiddruck in dem Reservoir, wodurch Ventil (12) geöffnet wird und Fluid aus dem Reservoir in den Mikrokanal eintreten kann. In Abhängigkeit von den Anforderungen eines beliebigen speziellen Assays kann das Reservoir entweder mit einem Reagenz oder mit Waschfluid gefüllt werden.
Es wurden beispielhaft verschiedene Tests durchgeführt, um die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bei der Durchführung eines Immunoassays auf D-Dimer festzustellen. D-Dimer wird als diagnostischer Indikator bei thromboembolischen Ereignissen verwendet: Thrombosen der tiefen Venen und Lungenembolie können durch Überwachen der D-Dimerkonzentration im Blut diagnostiziert werden. In der Vergangenheit wurde der zuverlässigste Assay auf D-Dimer durch ELISA-Techniken durchgeführt, beispielsweise der "Asserachrom D-Di" von Diagnostica Stago. Die Standard-ELISA-Techniken sind für Notfallsituationen jedoch ungeeignet, und es sind alternative Techniken auf Membranbasis entwickelt worden, die Detektionssysteme auf Farbbasis verwenden⁴⁸. Diese leiden jedoch unter dem Nachteil, dass der Detektionsmechanismus zu subjektiv ist.
In den vorliegenden Tests wurde die Detektion des Enzyms durch eine Chemifluoreszenzsubstratlösung (VCR, Amersham) bewirkt. Dieses System basiert auf der Fluoreszenzdetektion des AttoPhos-Substrats, das von ALP hydrolysiert wird. Die Mikrokanäle wurden danach einem Fluoreszenzbildgebungsschirm (MP840, Molecular Dynamics) ausgesetzt, und jeder Kanal wurde 1 Minute abgelesen. Das Bild wurde danach mit Image Quant-Software (Molecular Dynamics) quantifiziert. Die Kalibrierung des Enzyms in dem Mikrokanal wurde erreicht, indem die Substratlösung mit unterschiedlichen Enzymkonzentrationen gemischt und 5 Minuten inkubiert wurde. Die Mikrokanäle wurden danach mit den Mischungen gefüllt und mit dem Fluoreszenzbildgebungsgerät analysiert. In den eigentlichen Tests wurde das Enzym auf der Oberfläche der Mikrokanäle immobilisiert, und die VCR-Lösung wurde zu den Kanälen gegeben, wobei die Fluoreszenz 5 Minuten später gemessen wurde.
Immobilisierung der Proteine wurde durch einstündige Physisorption bei Raumtemperatur erreicht. Der IgG-Antikörper der Maus (Serbio, Frankreich) wurde immobilisiert, indem entweder 10 oder 100 μg/ml in dem Mikrokanal aufgebracht und eine Stunde in einer feuchten Kammer inkubiert wurden. Die Oberfläche wurde dann mit PBS und 20% Tween (Tween/Wasser: 0,2 ml/L, Fischer, Deutschland) gewaschen und eine Stunde mit einer Lösung von 50 μg/ml wärmegeschocktem BSA (Sigma, USA) in der Waschpufferlösung blockiert. Nach einer weiteren Waschstufe wurden die Kanäle individuell mit der Antigenlösung gefüllt. Nach fünf Minuten (außer bei dem kinetischen Experiment, wobei andere Zeiträume unten spezifiziert sind) wurden die Mikrokanäle gespült, und eine Lösung von 10 μg/ml mit alkalischer Phosphatase markiertem Antigen (ALD-DDi) wurde eingebracht und nach fünf Minuten erneut gespült.
Die Fluoreszenzabhängigkeit von der Enzymkonzentration nach 5 Minuten Inkubation ist graphisch in 7 dargestellt. Die Nachweisgrenze wird im Bereich von 1 ng·ml^–1 erreicht. Der nicht-lineare Detektionsbereich ergibt sich aus der Tatsache, dass das Hydrolyseprodukt nicht sehr gut löslich ist und in höheren Konzentrationen an der Oberfläche ausfallen kann. Dieses System kann dennoch zur Quantifizierung der Enzymkonzentration in dem Mikrokanal verwendet werden.
Zur Untersuchung der Aktivität der adsorbierten Antikörper in dem Mikrokanal wurden zwei unterschiedliche Inkubationsverfahren eingesetzt. Erstens wurden einige Kanäle nur mit BSA inkubiert. Zweitens wurden einige weitere Kanäle mit Ab und danach mit BSA inkubiert. Danach wurde jeder Kanal mit dem DDi-ALP gefüllt, eine Stunde inkubiert und nach dem bereits beschriebenen Verfahren durch Aspiration gewaschen. Die Fluoreszenzintensität jedes Kanals wurde dann gemessen, und die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Die nur mit BSA inkubierten Kanäle zeigten eine geringe Fluoreszenz, die sich von derjenigen des Polymersubstrats selbst nicht signifikant unterschied. Im Unterschied dazu zeigten die mit den Antikörpern inkubierten Kanäle viel mehr Fluoreszenz, wodurch gezeigt wird, dass DDi-ALP auf den Antikörpern adsorbiert wurde. Dies Experiment zeigt, dass einige der adsorbierten Antikörper auf der Oberfläche noch aktiv sind, und dass BSA ein wirksames Blockierungsmittel für die unspezifische Adsorption des DDi-ALP-Komplexes ist.
9 zeigt die Fluoreszenz des Substrats in den Kanälen nach Adsorption verschiedener Konzentrationen von ALP-DDi auf den aus 10 μg·ml^–1 adsorbierten Antikörpern. Die Fluoreszenzintensität der Mikrokanallinien zeigt eindeutig den Konzentrationsgradienten in den verschiedenen Mikrokanälen. Die relative Intensität jedes Mikrokanals ist in 10 graphisch dargestellt. Die Sättigung der Kanäle wird bei etwa 30 μg/ml erreicht.
11 zeigt die Fluoreszenzintensität von Mikrokanälen, die für verschiedene Zeiträume inkubiert worden sind. Bei kurzen Inkubationszeiten (< 5 Minuten) nimmt die Intensität linear zu, wodurch gezeigt wird, dass die Antigene durch die Antikörper sehr rasch eingefangen werden. Es wird angenommen, dass noch nicht alle Antigene die Oberfläche durch Diffusion erreicht haben. Diese erste Neigung folgt ungefähr der Diffusion der Moleküle zu den Wänden. Die Moleküle reagieren dann rasch, und die Reaktion wird quasi diffusionskontrolliert. Nach 5 Minuten der Inkubation wird die Reaktion durch langsamere Kinetiken kontrolliert, die durch zwei verschiedene Phänomene angetrieben werden. Erstens diffundieren große Moleküle langsamer und erreichen daher die Oberfläche nach einer langen Zeit. In diesem Fall können die Moleküle teilweise abgebaute Fibrinprodukte sein, deren Molekulargewicht größer als 1000 kD sein kann. Zweitens gibt es eine Neigung zu unspezifischer Adsorption, solche Reaktionen sind viel langsamer als immunologische Erkennung und werden durch elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen angetrieben, die Reorganisation auf Molekularebene erfordern. Dieser Typ von unspezifischer Adsorption kann daher durch kurze Inkubationszeiten ausgeschlossen werden.
12 zeigt die Fluoreszenzabhängigkeit der D-Dimerkonzentration nach einem kompetitiven Immunoassay. In dem unteren Konzentrationsbereich sind die meisten der immobilisierten Antikörperstellen nicht durch das DDi besetzt; wodurch das DDi-ALP in einer großen Menge vorhanden sein kann und daher mehr Fluoreszenzsubstrate hydrolysieren kann. Bei Konzentrationen über 1000 ng·ml^–1 sind D-Dimermoleküle an den meisten der Antikörperstellen vorhanden, und daher sind für DDi-ALP nur wenige Stellen verfügbar. Der mittlere Teil des Konzentrationsbereichs (100 bis 1000 ng·ml^–1) zeigt die starke Konzentrationsabhängigkeit des Systems, wobei die beiden Größenordnungen des Nachweisbereichs in dem interessierenden Bereich für diagnostische Anwendungen liegen⁴⁹.
Diese Experimente zeigen die Umsetzbarkeit von ELISA-Techniken in Mikrokanälen. Die zur Vollendung eines Assays (einschließlich Kalibrierung) erforderliche Zeit kann auf weniger als 10 Minuten reduziert werden, verglichen mit einer typischen Zeit von 3 Stunden für einen ELISA in einer Mikrotiterplatte, weil rasche Gleichgewichtszeiten und rasche Füll- und Spülverfahren genutzt werden können. Es können gewünschtenfalls Hunderte von Mikrokanälen auf einem Substrat bereitgestellt werden, und die Fähigkeit, simultanes Füllen zu gewährleisten, bietet die Möglichkeit für hocheffiziente parallele Assays.
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Claims

Vorrichtung zur Durchführung chemischer Assays, die wässrige Fluida beinhalten, wobei die Vorrichtung umfasst: mindestens eine Reaktionskammer, mindestens einen Fluidzuflusskanal in Verbindung mit der oder jeder Reaktionskammer, und Schrankenmittel, die zur Verhinderung des Durchflusses von wässrigem Fluid durch den Fluidzuflusskanal/die Fluidzuflusskanäle in die Reaktionskammer(n) angepasst sind, bis eine Fluideintrittskraft auf das Fluid einwirkt, wobei die Reaktionskammer eine hydrophile Innenfläche hat und das Schrankenmittel mindestens einen Teil des oder jedes Fluidzuflusskanals mit einer hydrophoben Innenfläche umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Reaktionskammer einen Mikrokanal mit mindestens einer Dimension im Bereich von 1 bis 1000 μm umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Fluidzuflusskanal in einem Substrat gebildet ist, von dem mindestens ein Teil aus einem hydrophoben Material besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Fluidzuflusskanal in einem Substrat gebildet ist, von dem mindestens ein Teil physikalisch oder chemisch behandelt worden ist, um es hydrophob zu machen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluidzuflusskanal eine Querschnittfläche im Bereich von 10 μm² bis 1000 mm² hat.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluidzuflusskanal als Komplementärform zu einer Standardpipette (beispielsweise vom Eppendorf^(RTM)-Typ) geformt ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluideintrittskraft durch Kolbendruck bereitgestellt wird.,
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend mehrere separate Reaktionskammern, die jeweils mit einem Zuflusskanal und zugehörigem Schrankenmittel in Verbindung stehen.
Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei jede Reaktionskammer mit einem separaten Zuflusskanal ausgestattet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei ein Zuflusskanal vorliegt, der eine gemeinsame Rohrleitung für alle Reaktionskammern liefert.
Vorrichtung nach den Ansprüchen 8, 9 oder 10, soweit abhängig von Anspruch 2, wobei jeder Mikrokanal an seinem von dem Zuflusskanal entfernten Ende mit einer gemeinsamen Rohrleitung in Verbindung steht, wobei die gemeinsame Rohrleitung an ein Aspirationsmittel angeschlossen ist, das angepasst ist, um selektiv verminderten Druck an die Rohrleitung anzulegen und so im Betrieb Fluid durch den Mikrokanal zu ziehen.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei die gemeinsame Rohrleitung eine Querschnittfläche im Bereich von 0,01 mm² bis 25 cm² hat.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikrokanäle allgemein parallel zueinander angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 13, soweit abhängig von einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Mikrokanäle allgemein senkrecht zu der gemeinsamen Rohrleitung angeordnet sind.
Vorrichtung, die mehrere Vorrichtungen nach Anspruch 14 gemeinsam auf einem Band angebracht umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 11, die ein im Wesentlichen kreisförmiges Substrat umfasst, wobei die Mikrokanäle im Wesentlichen radial angeordnet sind, wobei ihr jeweiliger Zuflusskanal in Richtung der Peripherie des Kreises weist und ihr entgegengesetztes Ende mit einer mittigen Kammer in Verbindung steht, die an das Aspirationsmittel angeschlossen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, die ein im Wesentlichen kreisförmiges Substrat umfasst, wobei die Mikrokanäle im Wesentlichen radial angeordnet sind, der Zuflusskanal bzw. die Zuflusskanäle in Richtung der Mitte des Kreises angeordnet sind und jeder Mikrokanal eine Abfallkammer am entgegengesetzten Ende in Richtung der Peripherie des Kreises aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, wobei die Dicke des im Wesentlichen kreisförmigen Substrats im Bereich von 50 bis 5000 μm liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei das kreisförmige Substrat drehbar ist und die Fluideintrittskraft durch Zentrifugaldruck bereitgestellt wird, wenn das Substrat zum Rotieren gebracht wird.
Vorrichtung, die mehrere Vorrichtungen nach Anspruch 13 oder Anspruch 14 auf einem drehbaren Trägerelement angeordnet umfasst, und wobei die Fluideintrittskraft durch Zentrifugaldruck bereitgestellt wird, wenn das Trägerelement zum Rotieren gebracht wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die oder jede Reaktionskammer daran anschließend mit einem versiegelten Hohlraum ausgestattet ist, der ein mit einem wässrigen Fluid gefülltes Reservoir bildet.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Reservoir über ein normalerweise geschlossenes Ventil mit der Reaktionskammer in Verbindung steht, das durch Ausübung von erhöhtem Druck auf das wässrige Fluid in dem Hohlraum zum Öffnen gebracht werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 22, die ferner ein Kolbenelement mit einem Außenprofil umfasst, das so geformt ist, dass es in den Hohlraum passt, wobei der Hohlraum durch eine zerreißbare Siegelung verschlossen ist, die im Betrieb durch den Kolben zerrissen wird, wobei die Bewegung des Kolbens in den Hohlraum den erforderlichen erhöhten Druck liefert, um das wässrige Fluid aus dem Hohlraum über das Ventil in die Reaktionskammer zu drücken.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Teil der Oberfläche der Reaktionskammer aus einem elektrisch leitenden Material gebildet ist, und die Vorrichtung ferner elektrische Detektierungsschaltkreise aufweist, die mit dem leitenden Teil verbunden sind, um die Detektion einer Zielspezies in der Reaktionskammer durch elektrochemische Mittel zu ermöglichen.
Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei der leitende Teil aus einem leitenden Polymermaterial gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei der leitende Teil durch eine Elektrode gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 26, wobei die Elektrode aus einem Halbleitermaterial ist.
Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei das Halbleitermaterial im Wesentlichen transparent ist.
Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei das Halbleitermaterial Indiumoxid ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, die ferner elektromagnetische Strahlungsdetektionsmittel umfasst, die angepasst sind, um von einer Zielspezies in der Reaktionskammer emittierte Strahlung zu detektieren.
Vorrichtung nach Anspruch 30, wobei das Detektierungsmittel mindestens eine Photodiode oder mindestens eine Sekundärelektronenvervielfältigergruppierung umfasst, die über mindestens einen Teil der Reaktionskammer angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein chemisches Reagenz auf mindestens einem Teil der Innenfläche der Reaktionskammer immobilisiert ist, wobei das Reagenz zur Wechselwirkung mit einer Zielspezies angepasst ist, deren Anwesenheit oder Konzentration bestimmt werden soll.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei das Reagenz ein Oligonukleotid, ein Polypeptid, ein Protein oder anderes natürliches oder synthetisches Molekül umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei das Reagenz auf der Innenfläche der Reaktionskammer adsorbiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei das Reagenz kovalent an die Innenfläche der Reaktionskammer gebunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 35, wobei die kovalente Bindung über ein Succinimid-Bindungsmittel erreicht ist.
Vorrichtung nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei das Reagenz elektrostatisch über einen Vernetzer an die Innenfläche der Reaktionskammer gebunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 37, wobei der Vernetzer Polylysin ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Teil der Innenfläche der Reaktionskammer und/oder des Fluidzuflusskanals mit chemisch funktionellen Gruppen ausgestattet ist, die durch chemische oder physikalische Behandlung der Oberfläche gebildet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die ein Substrat umfasst, in dem die Reaktionskammer und/oder die Fluidzuflusskanäle als Vertiefung(en) gebildet sind, wobei die Reaktionskammer und/oder der Fluidzuflusskanal durch eine Deckschicht versiegelt sind, die über dem Substrat aufgebracht ist.
Vorrichtung nach Anspruch 40, wobei das Substrat und die Deckschicht aus Polymermaterialien gebildet sind, wobei der Schmelzpunkt von mindestens einem der Materialien ausreichend niedrig ist, um zu ermöglichen, dass das Substrat und die Deckschicht durch thermische Laminierung miteinander versiegelt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 41, wobei das mindestens eine Material Polyethylen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 40 oder Anspruch 41, wobei die Deckschicht aus einem elastomeren Material gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 43, wobei das elastomere Material Polydimethylsiloxan (PDMS) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 40, soweit abhängig von Anspruch 30 oder 31, wobei mindestens ein Teil des Substrats aus einem im Wesentlichen opaken Material gebildet ist und die Deckschicht aus einem im Wesentlichen transparenten Material gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 45, wobei das im Wesentlichen opake Material ein kohlenstoffgefülltes Polymer oder ein Keramikmaterial umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 46, umfassend die folgenden Stufen, die in beliebiger Reihenfolge oder simultan durchgeführt werden können: Bilden mindestens einer Reaktionskammer mit einer hydrophilen Innenfläche und Bilden mindestens eines Fluidzuflusskanals in Verbindung mit der Reaktionskammer bzw. den Reaktionskammern, wobei mindestens ein Teil des oder jedes Fluidzuflusskanals eine hydrophobe Innenfläche aufweist, die so angepasst ist, dass sie als Schrankenmittel wirkt, um den Durchgang von Fluid durch den Fluidzuflusskanal in die Reaktionskammer solange zu verhindern, bis eine Fluideintrittskraft auf dieses Fluid wirkt.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei die Vorrichtung aus polymerem Material gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Vorrichtung durch Spritzgießen, Heißprägen, Photoablation, Gießen oder Polymerisation auf einer Form gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 48 oder Anspruch 49, umfassend die Stufen: Bilden eines Substrats mit mindestens einer Vertiefung darin und Aufbringen einer Deckschicht über dem Substrat, um die oder jede Vertiefung zu versiegeln, um so mindestens einen Fluidzuflusskanal und/oder mindestens eine Reaktionskammer zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 50, wobei die Deckschicht durch thermische Laminierung mit dem Substrat versiegelt wird.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei mindestens ein Teil der Vorrichtung aus einem Keramikmaterial, Glas, einem Leiter- oder einem Halbleitermaterial gebildet ist.
Verfahren zum Betreiben einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 46, umfassend die Stufen: Aufbringen von mindestens einer Probe einer zu testenden wässrigen Lösung am Ende mindestens eines Fluidzuflusskanals entfernt von mindestens einer Reaktionskammer, wobei mindestens ein Teil des oder jedes Fluidzuflusskanals eine hydrophobe Innenfläche aufweist; Herbeiführen des Eintretens der Probe in die Reaktionskammer(n) über den Fluidzuflusskanal bzw. die Fluidzuflusskanäle durch Ausüben einer Fluideintrittskraft und Überwachen der Probe in der Reaktionskammer bzw. den Reaktionskammern auf Anwesenheit oder Konzentration einer Zielsubstanz.
Verfahren nach Anspruch 53, wobei die Probe(n) zum Verlassen der Reaktionskammer(n) gebracht wird bzw. werden, bevor die Reaktionskammer(n) oder die ausgeworfene Probe auf Anwesenheit oder Konzentration einer Zielsubstanz überwacht wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 53 oder 54, wobei die oder jede Probe mittels einer Pipette, einer Spritze oder einer elektrisch betriebenen Einspritzvorrichtung aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 53 bis 55 zum Betreiben einer Vorrichtung nach Anspruch 11 oder irgendeinem davon abhängigen Anspruch, wobei die Fluideintrittskraft durch Aspirationsmittel bereitgestellt wird, wobei die Aspirationsmittel zum Anlegen von vermindertem Druck an die oder jede Reaktionskammer für einen Zeitraum im Bereich von 0,1 bis 100 s aktiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 53 bis 55 zum Betreiben einer Vorrichtung nach Anspruch 19 oder Anspruch 20 oder irgendeinem davon abhängigen Anspruch, wobei die Fluideintrittskraft durch Drehen des Substrats oder des Trägerelements mit einer Winkelgeschwindigkeit im Bereich von 1 bis 1000 Umdrehungen pro Minute für einen Zeitraum im Bereich von 1 bis 100 s bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Probe aus der Reaktionskammer ausgeworfen wird, indem das Substrat mit einer höheren Winkelgeschwindigkeit im Bereich von 10 bis 100.000 Umdrehungen pro Minute für einen Zeitraum im Bereich von 1 bis 100 s gedreht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 53 bis 55 zum Betreiben einer Vorrichtung nach Anspruch 7 oder irgendeinem davon abhängigen Anspruch, wobei die Fluideintrittskraft durch Kolbendruck geliefert wird.