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Diese
Erfindung ist auf ein System zum Durchführen von Thermozyklen von Flüssigkeiten
in Kassetten gerichtet, um eine Amplifikation und Detektion von
Nukleinsäuresequenzen
zu erreichen. Es ist ein spezifischer Aspekt der Erfindung, dass
die Amplifikation und Überwachung
des Amplifikationsvorgangs gleichzeitig durchgeführt werden können, ohne
die Position der Kassette zu verändern.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die vollständige und blasenfreie
Befüllung
von Kassetten mit Flüssigkeiten
zum Durchführen
von Thermozyklen. Die Überwachung
des Amplifikationsvorgangs kann verwendet werden um die Anfangskonzentration
einer Zielnukleinsäure
mengenmäßig zu bestimmen.
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Eine
Vorrichtung zum Durchführen
von Nukleinsäureamplifikationen
in Reaktionskassetten ist aus
US
5 567 617 bekannt. Dieses US-Patent befasst sich mit einer
Erfindung zur Nukleinsäureamplifikation
in einer flexiblen Küvette.
Zur Amplifikation wird diese Küvette
in eine Heizvorrichtung mit einem dünnen Heizelement mit einem
zentralen Fenster, das einen optischen Durchgang bereitstellt, platziert. Eine
solche Ausführungsform
hat den Nachteil, dass das Heizen und die Detektion sich den freien
Platz in der seitlichen Richtung der Reaktionsküvette streitig machen. Ein
weiteres Problem des in
US 5
567 617 verwendeten Systems ist die flexible Art der Küvette mit
darin befindlichen Flüssigkeitskanälen. Es
müssen
Maßnahmen
ergriffen werden, um sicher zu stellen, dass die Flüssigkeitsverbindung
innerhalb der Küvette
nicht behindert wird, wenn die Küvette
in der Heizvorrichtung platziert wird.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf ein System zum Durchführen von
Thermozyklen gerichtet, das dem in
US
5 567 617 beschriebenen System ähnelt, aber das den Vorteil
hat, dass die Heizeffizienz nicht durch den für die Detektion benötigten freien
Raum beschränkt
wird. Es ist ein weiterer Vorteil verglichen mit
US 5 567 617 , dass eine Verengung
von Flüssigkeitsdurchgängen innerhalb
der Kassette unkritisch ist.
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Die
Druckschrift WO 98/38487 beschreibt einen Aufbau mit einer Thermomanschette
zur Steuerung der Temperatur innerhalb einer Flüssigkeitskammer. Der Aufbau
umfasst weiter eine Optik zum Abfragen des Kammerinhalts, während die
Kammer in der Thermomanschette platziert ist.
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Jedoch
ist die offenbarte Kammer ausgelegt, Flüssigkeit durch Bodenfüllung über eine
Flüssigkeitsöffnung am
oberen Ende der Kammer aufzunehmen. Das Füllen einer solchen Kammer ist
unkritisch, falls der innere Durchmesser groß genug ist, das Eintreten
von Flüssigkeit
ohne den Einschluss von Luftblasen zu erlauben. Jedoch ist die Verminderung
des Durchmessers wünschenswert,
um die innere Entfernung zwischen den temperaturgeregelten Wänden zu
reduzieren, um genügende
Aufheiz- und Abkühlungsgeschwindigkeiten
der Flüssigkeit
zu erlauben.
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Es
ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein System zur schnellen
Durchführung
von Thermozyklen von Flüssigkeiten
in Kassetten mit optischer online Überwachung. Es ist ein besonderes
Ziel, schnelle Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten
zu erreichen, während
die Störung
von optischen Messungen durch in der Flüssigkeit eingeschlossene Blasen
vermieden wird.
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Das
Ziel wird erreicht mit einer Thermozykler-Einheit, einer Lichtquelle,
einem Lichtdetektor, einer Flüssigkeitsbereitstellungseinheit
und einer Kassette, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, in der
Thermozyklen wie auch die Detektion durchgeführt werden kann, während die
Kassette in ihrer Position unverändert
bleibt. Ein solches System erlaubt die Durchführung von Thermozyklen mit
optischer online Überwachung.
Online Überwachung
bedeutet optische Überwachung
während
der Durchführung
von Temperaturzyklen. Des Weiteren weist die Kassette einen genügend kleinen
inneren Durchmesser zwischen den temperaturgeregelten Wänden auf,
um eine enge Temperatursteuerung von in der Kassette befindlicher
Flüssigkeit
zu erlauben. Die Befüllung der
Kassette wird vorteilhafterweise durch einen Durchflussprozess erreicht.
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Die
Kassette der vorliegenden Erfindung weist die Form einer dünnen Platte
auf. Die beiden gegenüberliegenden
Wände werden
für den
Wärmetransfer
verwendet, und eine oder mehrere Wände, die im wesentlichen vertikal
dazu sind, werden verwendet, um Licht in die Kassette hinein zu übertragen und
zu detektierendes Licht aus der Kassette heraus zu übertragen.
Dieser Kassettenaufbau stellt sicher, dass der optische Weg und
der Weg zum Wärmeaustausch
räumlich
getrennt sind, so dass die Detektion und die Wärmeübertragung sich den Platz nicht
streitig machen. Die Dicke der Kassette liegt bevorzugt im Bereich
von 2,5–5
mm, und die Fläche
jeder Wand für die
Wärmeübertragung
liegt bevorzugt im Bereich von 0,1–4 cm2.
Eine solche Kassette kann aus einem Körper gemacht sein, der eine
untere Wand und aufrechtstehende Seitenwände aufweist, wobei der Körper durch
eine obere Wand geschlossen wird, um eine geschlossene Kassette
mit einer Reaktionskammer darin zu bilden. Eine bevorzugte Ausführungsform
der Kassette ist jedoch aus einem Rahmen gemacht, der die Seitenwände der
Kassette bereitstellt, und der durch eine untere und eine obere
Wand geschlossen wird. Es wird besonders bevorzugt, wenn die oberen
und unteren Wände
Folien mit einer Dicke von weniger als 200 μm sind. Eine Kassette gemäß der vorliegenden
Erfindung kann eine einheitliche Dicke haben, jedoch wird es bevorzugt,
wenn die Wärme
leitenden oberen und unteren Wände
einen Winkel von 3 bis 8 Grad relativ zueinander bilden. Eine solche
keilförmige
Kassette weist den Vorteil auf, dass sie eine effiziente Wärmeübertragung
und einfache Handhabung bereitstellt, wenn sie in Verbindung mit
einer Thermozykler-Einheit verwendet wird, die einen Aufnahmebereich
einer jeweiligen Keilform hat.
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Kassetten
der vorliegenden Erfindung können
aus transparentem Plastik gemacht werden. Bevorzugt wird ein ringförmiger Rahmen
mit einer Wanddicke von 0,3–4
mm bereitgestellt, um die Seitenwände der Kassette zu bilden.
Der Rahmen kann z.B. durch Spritzguss aus Polymeren, wie z.B. Polyethylen
oder Polypropylen hergestellt werden. Der Rahmen wird durch Folien,
die die oberen und unteren Wände
bilden, durch Heißsiegeln
verschlossen. Prozesse zum Versiegeln einer Polymerfolie auf einem
solchen Rahmen sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden
daher hier nicht im Detail besprochen. Heißsiegelprozesse werden z.B.
beschrieben in: Polymere Werkstoffe: 3. Band, Herausgeber: Hans
Batzer. Stuttgart; New York: Thieme. Bd. 2. Technologie 1,1984,
Seiten 206–212;
Kunststoffverarbeitung; Herausgeber: Otto Schwarz u. a.; 4. überarbeitete
Ausgabe Würzburg:
Vogel, 1988, Seiten 193–206
und Kunststoff-Folien: Herstellung, Eigenschaften, Anwendung; Herausgeber:
Joachim Nentwig. München,
Wien: Hanser, 1994, Seiten 88–93.
Metallisierte Mehrschichtfolien können ebenfalls zur Versiegelung
auf dem Rahmen eingesetzt werden.
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Wie
unten in Verbindung mit dem Befüllungsprozess
deutlicher werden wird, wird die Kassette aus Materialien gemacht,
die eine hohe Oberflächenspannung
aufweisen, oder die Oberflächenspannung der
inneren Wände
kann gesteigert werden. Eine solche Steigerung der Oberflächenspannung
kann durch geeignete Oxidbeschichtung oder Plasmabehandlung der
Oberfläche
erreicht werden. Der beschränkende
Oberflächenspannungswert,
der die blasenfreie Befüllung
ermöglicht,
hängt jedoch
von der Oberflächenspannung
der Flüssigkeit
ab.
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Wie
erwähnt,
ist es vorteilhaft, Kassetten mit einem kleinen inneren Durchmesser
zwischen den wärmegeregelten
Wänden
der Kassette einzusetzen. Es hat sich gezeigt, dass ein Durchmesser
unterhalb von ungefähr
5 mm eine enge Temperatursteuerung und somit hohe Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten
erlaubt.
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Es
sollte beachtet werden, dass das innere der Kassette Flüssigkeitskanäle haben
kann, ebenso wie Vorsprünge
und Aussparungen. Des weiteren schließt die verwendete Formulierung „verschlossene
Kassette" nicht
aus, dass Flüssigkeitskanäle, die benutzt
werden, um Flüssigkeiten
in die oder aus der Kassette zu bringen, die Wände der Kassette durchdringen.
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Die
Thermozykier-Einheit der vorliegenden Erfindung umfasst einen Heizabschnitt,
um einen thermischen Kontakt mit den Wärme leitenden Wänden der
Kassette herzustellen. Der Heizabschnitt umfasst bevorzugt mindestens
eine Platte, die in mechanischen Kontakt mit der Wärme leitenden
Wand der Kassette gebracht wird und wobei die Platte selbst aufgeheizt
und abgekühlt
wird, wie für
den Thermozyklenprozess notwendig. Dieses Aufheizen und Kühlen kann
z.B. durch ein Peltier-Element erfolgen, dadurch, dass die Platte
in Kontakt mit heißen und
kalten Flüssigkeiten
gebracht wird, oder durch Erhitzen mit einem Widerstandheizer und
Kühlen durch
das Blasen von Luft auf die Platte. Verfahren und Vorrichtungen
zur Durchführung
von Thermozyklen durch thermischen Kontakt mit Platten sind im Stand
der Technik wohlbekannt.
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Es
sollte jedoch verstanden werden, dass andere Geräte zum Aufheizen und Abkühlen der Kassetten
verwendet werden können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Es ist nur nötig dass,
welches Gerät
auch immer zum Aufheizen und Abkühlen
der Kassetten verwendet wird, es in der Lage ist, die erforderlichen
Temperaturen zu erreichen und aufrecht zu erhalten, und das gewünschte Temperatur-Zeit-Profil
zu erreichen. Somit sollte zum Zwecke der Amplifikation von Nukleinsäuren ein
solches Gerät
in der Lage sein, einen Zyklus der Temperatur der Amplifikationsreaktionsmischung
durchzuführen
zwischen einer denaturierenden Temperatur T1 (die
in dem Bereich von ungefähr
80–105°C und bevorzugt
90–100°C liegen
kann) und einer Annealing/Extensions-Temperatur T2,
die in dem Bereich von ungefähr
30–90°C und bevorzugt
50–70°C liegen kann),
wobei T1 > T2 wie den Fachleuten bekannt ist.
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Um
einen genügenden
thermischen Kontakt zwischen der Kassette und dem Heizabschnitt
zu erreichen, können
Mittel bereitgestellt werden, die eine oder zwei Platten gegen die
Kassette pressen. Solche Mittel werden z.B. in
US 5 567 617 beschrieben. Im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung wird es jedoch bevorzugt, eine Heizeinheit
einzusetzen, die einen Aufnahmebereich einer keilförmigen Ausnehmung
aufweist. Der Aufnahmebereich kann durch zwei Wände gebildet werden, die zueinander geneigt
sind. Eine keilförmige
Kassette kann in einem solchen keilförmigen Aufnahmebereich einfach
platziert werden, und genügender
thermischer Kontakt zwischen den Wänden des Aufnahmebereichs und den
Wärme leitenden
Wänden
der Kassette wird automatisch durch mechanischen Kontakt erreicht,
in den die jeweiligen Wände
kommen, wenn die Kassette in den Aufnahmebereich hinunterläuft.
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Die
Thermozykler-Einheit umfasst des Weiteren eine Steuereinheit, die
die rechtzeitige Aufheizung und Abkühlung des Heizabschnittes steuert. Eine
solche Steuereinheit wird zum Beispiel in EP B 0 236 069 beschrieben,
die hiermit durch Bezugnahme umfasst wird. Die vorliegende Erfindung
benötigt keine
andere Steuereinheit als die, die in EP B 0 236 069 beschrieben
wird, jedoch müssen
das Timing, die Temperaturprofile und die Wärmemenge, die mit der Kassette
ausgetauscht werden, auf die speziellen Bedürfnisse angepasst werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst die Amplifikation von Nukleinsäure und
die Detektierung, Überwachung
und Quantifizierung von Amplifikationsprodukten. Um das Verständnis des
Amplifikationsdatenerfassungs- und -verarbeitungssystem der vorliegenden
Erfindung zu erleichtern, wird zunächst eine Zusammenfassung von
Amplifikationsprozessen von Nukleinsäuren, die besonders geeignet
sind für
die Verwendung in Verbindung mit der Erfindung erörtert.
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Fachleute
werden erkennen, dass die vorliegende Erfindung die Amplifikation
der Duplexform der Nukleinsäure
benötigt.
Es gibt wohlbekannte Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren. Die
Mittel zur Amplifikation sind nicht kritisch, und diese Erfindung
wird mit jedem Verfahren funktionieren, in dem Nukleinsäure-Duplexe
erzeugt werden. Die verschiedenen Verfahren werden besprochen in: Bio/Technology8:
290–293,
April 1990. Sie umfassen PCR, LCR, Qß und 3SR, sind aber nicht
darauf beschränkt.
Obschon 3SR und Qß nicht
die Durchführung
von thermischen Zyklen umfassen, können die Ergebnisse ihrer Amplifikationen
mit der unten erörterten
Fluoreszenzdetektionsanordnung überwacht und
gemäß den Prinzipien
der vorliegenden Erfindung analysiert werden. Jedes Verfahren wird
unten kurz beschrieben.
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PCR-Amplifikation
von DNA umfasst wiederholte Zyklen der Hitzedenaturierung der DNA,
Anlagern von zwei Oligonukleotid-Primern an Sequenzen, die das zu
amplifizierende DNA-Fragment
flankieren, und das Verlängern
der angelagerten Primer mit DNA-Polymerase. Die Primer hybridisieren
zu eingegengesetzten Strängen
der Zielsequenz und sind so orientiert, dass die DNA- Synthese durch
die Polymerase über
die Bereiche zwischen den Primern verläuft, wobei jeder aufeinanderfolgende
Zyklus die Menge an DNA, die in dem vorhergehenden Zyklus synthetisiert
wurde, im wesentlichen verdoppelt. Dieses resultiert in der exponentiellen
Akkumulation des spezifischen Zielfragments mit einer Rate von ungefähr 2n pro Zyklus, wobei n die Anzahl der Zyklen
ist. Eine vollständige
Besprechung dieser Technologie kann man in PCR Technology – Principles
and Applications, Hrsg. Erlich H. A., Stockton Press, New York 1989
finden, Taq-DNA-Polymerase wird bevorzugt, wenn PCR in Verbindung
mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, obschon dies nicht
ein wesentlicher Aspekt der Erfindung ist.
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Die
Ligase-Kettenreaktion wird in der internationalen Patentanmeldung
WO 89/09835 beschrieben. Der Vorgang umfasst die Verwendung von Ligase
zur Verbindung von Oligonukleotid-Segmenten, die sich an die Zielnukleinsäure anlagern.
Ligase-Kettenreaktion (LCR) resultiert in der Amplifikation eines
ursprünglichen
Zielmoleküls
und kann Millionen von Kopien von produzierter DNA bereitstellen. Demzufolge
resultiert die LCR in einem Nettozuwachs an Doppelstrang-DNA. Die
vorliegenden Detektionsmethoden können auf LCR ebenso wie auf PCR
angewendet werden, LCR benötigt
typischerweise irgendein Mittel zum Detektieren der produzierten
DNA, wie etwa eine Oligonukleotid-Sonde. Solche Mittel sind unnötig, wenn
Sie in Verbindung mit den offenbarten Verfahren zur Detektion von
Amplifikationsprodukten verwendet werden, und das LCR-Resultat ist
direkt detektierbar.
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Ein
weiteres Amplifikationsschema, Q-beta Replicase, nutzt die Verwendung
der Replicase der RNA Bakteriophage Qß. Bei diesem Amplifikationsschema
wird ein modifiziertes rekombinantes Bakteriophagen-Genom mit einer
Sequenz, die spezifisch für
die zu erzielende Sequenz ist, anfangs an die zu testende Nukleinsäure ligiert.
Nach der Anreicherung der zwischen der Bakteriophagensonde und der
Nukleinsäure
in einer Probe gebildeten Duplexe wird Qß-Replicase beigemengt, die,
nachdem sie das zurückgehaltene
rekombinante Genom erkannt hat, beginnt, eine große Anzahl
von Kopien anzufertigen. Das Qß-System
erfordert keine Primersequenzen, und es gibt keinen Hitzedenaturierungsschritt,
wie bei den PCR- und LCR-Amplifikationssystemen. Die Reaktion findet
bei einer Temperatur statt, typischerweise 37°C. Die bevorzugte Vorlage ist
ein Substrat für
die Qß-Replicase, midvariant-1
RNA. Eine sehr große
Zunahme an Vorlagen wird durch die Verwendung dieses Systems erreicht.
Eine Besprechung dieses Amplifikationssystems kann man in der internationalen
Patenanmeldung WO 87/06270 und in Lizardi u. a., 1988, Bio/Technology
6: 1197–1202
finden.
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Das
3SR System ist eine Variante eines auf In-Vitro-Transkription basierenden
Amplifikationsystems, Ein auf Transkription basierendes Amplifikationssystem
(TAS) umfasst die Verwendung von Primern, die eine Promotorsequenz
codieren, wie auch eine zu dem Zielstrang komplementäre Sequenz,
um DNA-Kopien eines Zielstranges und die Produktion von RNA-Kopien
aus den DNA -Kopien mit einer RNA-Polymerase zu erzeugen.
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Siehe
z.B. Beispiel 9B des U. S. Patentes Nr. 4,683,202 und die Europäische Patent
Anmeldung EP-A-0 310 229. Das 3SR System ist ein System, das drei
Enzyme verwendet, um eine isotherme Replikation von Zielnukleinsäuren durchzuführen.
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Das
System beginnt mit einem Ziel von einzelsträngiger RNA, an die ein T7 RNA-DNA-Primer gebunden wird.
Durch die Verlängerung
des Primers mit reverser Transkriptase wird eine cDNA gebildet, und
eine RNAseH-Behandlung befreit die cDNA aus der Heteroduplex. Ein
zweiter Primer wird an die cDNA gebunden und eine doppelsträngige cDNA wird
durch eine Behandlung mit reverser Transkriptase gebildet. Einer
(oder beide) der Primer codiert einen Promotor, z.B. den Promotor
für T7
RNA-Polymerase, so dass die doppelsträngige cDNA eine Transkriptionsvorlage
für RNA-Polymerase
ist.
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Transkriptionsfähige cDNAs
ergeben antisense-RNA-Kopien des ursprünglichen Ziels. Die Transkripte
werden dann durch die reverse Transkriptase in doppelsträngige cDNA
umgewandelt, die doppelsträngige
Promotoren enthält,
wahlweise auf beiden Enden in einer invertierten Wiederholungsorientierung.
Diese DNAs können
RNAs ergeben, die wieder in den Zyklus eintreten können. Eine
vollständigere
Beschreibung des 3SR-Systems kann in Guatell u. a., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87: 1874–1878, und
der europäischen
Patentanmeldung EP-A-0 329 822 gefunden werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung, wird die Nukleinsäureamplifikation
durch das Detektieren von Fluoreszenz überwacht, die emittiert wird,
wenn ein fluoreszierender Farbstoff, wie etwa ein interkalierender
fluoreszierender Farbstoff, der in der Reaktionsmischung bereitgestellt
wird, sich mit der doppelsträngigen
Nukleinsäure
während
jeder Annealing/Extension-Phase verbindet, während die Mischung einem Zyklus
zwischen zwei Temperaturen unterzogen wird. Ein Anstieg der Fluoreszenz
weist auf eine positive Amplifikation der Zielnukleinsäure hin.
Geeignete interkalierende Mittel oder Farbstoffe umfassen Ethidiumbromid,
Propidiumbromid, Proflavin, Acridinorange, Acriflavine. Fluorcoumarin,
Ellipticine, Daunomycin, Chloroquin, Distamycin D, Chromomycin,
Homidium, Mithramycin, Rutheniumpolypyridyle, Anthramycin, Methidiumbromid,2-[2-(4-hydroxyphenyl)-6-benzimidazol-6-(1-methyl4-piperazye)benzimidazoltrihydrochlorid
und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Fluorophore
und DNA-bindende Chromophore, die im Stand der Technik beschrieben
werden, sind geeignet zum Gebrauch in dem im US-Patent 5,210,015
offenbarten 5' bis
3' Nuklease-Assay,
und sind ebenso nützlich
bei der vorliegenden Erfindung. Geeignete Spenderfluorophoren und
Quencher werden so ausgewählt,
dass das Emissionsspektrum des Spenderfluorophors mit dem Absorptionsspektrum
des Quenchers überlappt.
Idealerweise sollten die Fluorophoren eine hohe Stokes-Verschiebung aufweisen
(einen großen
Unterschied zwischen der Wellenlänge
für die
maximale Absorption und der Wellenlänge für die maximale Emission), um
die Interferenz durch gestreutes Anregungslicht zu minimieren.
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Geeignete
Marker, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, umfassen Fluoroscein
und Derivate wie etwa FAM, HEX, TET, und JOE; Rhodamin und Derivate
wie etwa Texas Red, ROX, und TAMRA; Lucifer Yellow, und Cumarinderivate
wie etwa 7-Me2N-cumarin-4-acetat, 7OH-4-CH3-cumarin-3-acetat, und
7-NH2-4-CH3cumarin3-acetat (AMCA), sind aber nicht darauf beschränkt. FAM,
HEX, TET, JOE, ROX, und TAMRA werden durch PerkinElmer, Applied
Biosystems Division (Foster City, CA) vertrieben. TEX-as Red und
viele andere geeignete Verbindungen werden durch Molecular Probes
(Eugene, OR) vertrieben. Beispiele von chemolumineszierenden und
biolumineszierenden Verbindungen, die für die Verwendung als Energiespender
geeignet sein können,
umfassen Luminol (Aminophthalhydrazid) und Derivate, und Luziferasen.
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Die
Optik eines Systems gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst eine Lichtquelle und einen Lichtdetektor. Mit
dem System können
Absorptions- oder Streuungsmessungen mit der Flüssigkeit innerhalb der Kassette
durchgeführt
werden. Es wird jedoch bevorzugt, dieses System für Fluoreszenzmessungen
zu verwenden, wobei Licht in das Innere der Kassette gesendet wird,
um Fluoreszenzemission zu initiieren, die durch den Lichtdetektor
detektiert wird. Die Lichtquelle kann Halbleiterlichtquellen, wie
etwa Halogenleuchten oder andere Ausführungsformen umfassen. Im Geiste
der Erfindung wird das Licht in die Kassette durch eine zweite,
für Licht
transparent Wand der Kassette, die im Wesentlichen senkrecht zu
der Wand für
die Wärmeübertragung
ist, übertragen.
Wegen der flachen Form der Kassette hat die zweite, für Licht
transparente Wand eine Breite von nur 0,5 bis 5 mm in einer Dimension.
Es wird daher bevorzugt, mit der Lichtquelle kooperierende Strahlformungsoptiken
einzusetzen, um Licht durch dieses begrenzte Fenster zu führen. Solche
Strahlformungsoptiken können
Blenden, Linsen und Faseroptiken umfassen. Für Fluoreszenzmessungen ist
es notwendig, fluoreszierende Farbstoffe mit Licht einer Wellenlänge innerhalb
des Absorptionsspektrums des Farbstoffs zu stimulieren. Es wird
normalerweise gewünscht,
Hintergrundstrahlung zu unterdrücken, die
durch Lichtemission anderer Quellen als dem fluoreszierenden Farbstoff
verursacht wird. In vielen Ausführungsformen
ist es des Weiteren erwünscht, Fluoreszenzmessungen
mit zwei oder mehr Farbstoffen innerhalb desselben Reaktionsvolumens durchzuführen. In
diesen Fällen
ist es notwendig, die Bandbreite des Lichts für die Beleuchtung zu begrenzen.
Dies kann geschehen, indem man Lichtquellen verwendet, die eine
niedrige Bandbreite aufweisen, wie z.B. LEDs, oder, indem man Lichtquellen mit
einer hohen Bandbreite in Verbindung mit geeigneten Filtern verwendet.
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Ein
System der vorliegenden Erfindung umfasst ferner einen oder mehrere
Lichtdetektoren zum Detektieren von Licht, das aus dem Inneren der
Kassette durch die zweite, für
Licht transparente Wand heraustritt. Geeignete Lichtdetektoren sind
Halbleiterdetektoren wie etwa Photodioden oder Photomultiplier.
Hie bereits erwähnt,
ist es erwünscht,
Hintergrundsignale zu unterdrücken,
und daher sollte das Detektieren auf das Emissionsband des zu detektierenden
fluoreszierenden Farbstoffs begrenzt sein. Dies kann durch Wellenlängenfilter
oder spektrale Trennung des Lichts mit einem Spektrometer erreicht werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, zwei oder mehr
fluoreszierende Farbstoffe innerhalb derselben Kassette durch separates
Detektieren der emittierten Fluoreszenzstrahlung von den Farbstoffen
zu detektieren. Vorteilhaft werden die Farbstoffe auch separat mit
geeigneten Lichtquellen stimuliert.
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Der
Lichtdetektor der vorliegenden Erfindung kann mit Licht richtenden
Mitteln wie etwa Faseroptiken, Linsensystemen und so weiter zusammenarbeiten.
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Die
Kassette der vorliegenden Erfindung wird als ein Hohlraum zur Durchführung von
Thermozyklen für
Flüssigkeiten
verwendet und weist daher einen Einlass auf, um die Kassette mit
Flüssigkeit
zu versorgen. Die Kassette weist einen Auslass auf, um Flüssigkeit
aus der Kassette abzulassen. Es wird jedoch bei manchen Verwendungsarten
bevorzugt, eine Wegwerfkassette zu haben. Eine solche Kassette kann
zusammen mit ihrem Inhalt nach der Verwendung weggeworfen werden.
Der Einlass und der Auslass sind bevorzugt Kanäle durch den Körper oder durch
den Rahmen der Kassette. Wie bereits erwähnt, sind Körper und Rahmen zumeist inkompressibel
gemacht, so dass die Kanäle
nicht blockiert werden, wenn auf die Kassette Druck ausgeübt wird,
um einen thermischen Kontakt mit der Erhitzungseinheit zu erreichen.
Ein System gemäß der vorliegenden Erfindung
umfasst eine Flüssigkeitsbereitstellungseinheit,
die an den Einlass der Kassette gekoppelt ist. Eine solche Flüssigkeitsbereitstellungseinheit
kann eine Pipettiereinheit oder ein interner Flüssigkeitskanal sein, von dem
Flüssigkeit
in die Kassette gepresst wird. Das System umfasst optional eine
Flüssigkeitsaufnahmeeinheit,
die an einen Auslass der Kassette gekoppelt ist, um Flüssigkeit
aus der Kassette aufzunehmen. Eine solche Flüssigkeitsaufnahmeeinheit ist notwendig,
wenn die Kassette geleert werden muss, oder falls verschiedene Flüssigkeiten
innerhalb der Kassette verarbeitet werden müssen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird jedoch die Kassette zusammen mit der darin befindlichen Flüssigkeit
nach einer einzigen Benutzung weggeworfen. Solche Ausführungsformen
benötigen
keine Flüssigkeitsaufnahmeeinheit,
sondern nur einen Auslass, um Gas abzulassen, wenn die Kassette
mit Flüssigkeit
gefüllt
wird.
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Kassetten
gemäß der vorliegenden
Erfindung werden bevorzugt mit der sogenannten Durchflussbefüllung gefüllt. Durchflussbefüllung bedeutet, dass
die Flüssigkeit
durch einen Einfluss eingeführt wird
und den Innenraum der Kassette, der unmittelbar zum Einlass benachbart
ist, füllt.
Das Einführen von
weiterer Flüssigkeit
vergrößert kontinuierlich
den gefüllten
Raum, bis ein erwünschter
Befüllungsgrad erreicht
ist. Bei diesem Prozess wird der Flüssigkeitsbolus nie während der
Befüllung
von dem Einlass gelöst,
wie es der Fall bei der Befüllung
vom Boden nach oben, wie in WO 98/38487 beschrieben, ist. Um einen
Durchflussbefüllungsprozess
zu erlauben, ist die innere Geometrie beziehungsweise der Kanalverbindungseinlass
und -auslass wichtig. Für
Kassetten zur Durchführung
von Thermozyklen ist es wünschenswert,
eine große
Kontaktfläche
der Flüssigkeit mit
den thermisch geregelten Wänden
zu haben. Die Dimension des Kanals, der die Kontaktfläche regelt, wird
mit DL (lateraler Durchmesser) bezeichnet,
und die interne Entfernung zwischen den thermisch geregelten Wänden wird
mit DV (vertikaler Durchmesser) bezeichnet.
Je größer der
Quotient DL/DV ist,
desto effizienter ist die Wärmesteuerung
ebenso, wie die Gefahr, dass während
der Befüllung
Blasen eingeschlossen werden. Es hat sich gezeigt, dass optimale Quotienten
DL/DV im Bereich
von 1 bis 10 liegen.
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Unter
Berücksichtigung
dessen, dass die Gefahr von Blasenbildung mit zunehmendem lateralem
Durchmesser zunimmt, sollte der Quotient berechnet werden, indem
der größte vertikale
Durchmesser (DV, max) des Kanals verwendet
wird, wobei der Durchmesser vertikal zur Flussrichtung gemessen
wird.
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Andere
Faktoren, wie etwa Oberflächenspannung
(von Wand und Flüssigkeit),
Viskosität
der Flüssigkeit,
Kapillarkräfte
und Befüllungsgeschwindigkeit
werden den Befüllungsprozess
ebenfalls beeinflussen. Der genannte Flüssigkeitskanal weist jedoch
nicht notwendigerweise eine einzigartige Form an jedem Abschnitt
auf. Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, einen kurvenförmigen Kanal
einzusetzen, so dass die Länge
L des Kanals größer ist
als die geometrische Distanz D zwischen dem Einlass und dem Auslass.
Ein solcher Aufbau kann effizient durch einen Vorsprung, der, wie
in 1 gezeigt, in das Innere der Kassette vorragt,
erzeugt werden.
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Die
Kassette kann ebenso einen Raum zur Aufnahme von Gasen, die bei
der Erwärmung
der Flüssigkeit
freigesetzt werden, aufweisen. Dieser Raum ist in einem Abschnitt
der Kassette angeordnet, der die optische Messung nicht behindert.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden
Figuren detaillierter beschrieben.
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1:
Kassette in einer Draufsicht, teilweise mit Flüssigkeit gefüllt
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2:
Kassette in einer Draufsicht mit Lichtquellen und Detektor
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3:
Lichtquellenmodul
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4:
Raytracediagramm mit Kassette, die ein schäges Fenster aufweist
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5:
Fluoreszenzsignal während
der Durchführung
eines Thermozyklus
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6:
System zur Durchführung
von Thermozyklen in einer Kassette innerhalb eines Blockthermozyklers
aus Metall, wobei man Lichtquellen und Lichtdetektor integriert.
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7:
System zur Durchführung
von Thermozyklen mit einer keilförmigen
Kassette
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8:
Befüllungsprozess
der in 1 gezeigten Kassette.
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1 zeigt
eine Kassette (1) zur Durchführung von Thermozyklen von
Flüssigkeiten
in einer Draufsicht. Die Kassette weist einen Körper (3) mit einem
Hohlraum (2) darin auf. Der Kassettenkörper wurde aus einem festen
Polypropylenblock geschmolzen. Im Bereich des Hohlraums wurde Material
entfernt, bis ein Zellenboden mit einer Dicke von 200 μm erreicht
wurde. (In der Serienproduktion kann die Kassette durch Spritzguss
effizienter produziert werden). In den Propylenblock wurden ebenso
ein Einlass (10) zur Flüssigkeitsaufnahmen
und ein Auslass (11) zum Abzug von Luft aus dem Hohlraum während der
Befüllung
geschmolzen. Der Körper
der in 1 gezeigten Kassette wurde geschlossen, indem
eine Versiegelungsfolie von 40 μm
Dicke auf den Kassettenkörper
geschweißt
wurde. 1 zeigt eine bevorzugte Form des Hohlraums (2)
mit einem Vorsprung (5) in Form einer Nase, die in den
Hohlraum hineinreicht. Der Vorsprung (5) stellt sicher, dass
der Hohlraum vollständig
mit Flüssigkeit
ohne den Einschluss von Blasen gefüllt werden kann.
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Der
Vorsprung modifiziert die Geometrie der Kassette so, dass der größte laterale
Durchmesser DL,max ebenso wie der Quotient
DL,max/DV verringert wird
(DV ist die Entfernung zwischen den wärmeregulierten
Wänden,
d.h. die Dicke der Flüssigkeit
in der Kassette). In dem gezeigten Versuchsaufbau betrug DL,max 4,0 mm und DV 1,5
mm, was einen Quotienten von 2,7 ergab.
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Die
Größe des Vorsprungs
(5) muss an diese spezifische Situation angepasst werden
und hängt von
der Dicke des Hohlraums, der Viskosität der Flüssigkeit, der Oberflächenspannung
der oberen und unteren Wand der Kassette, sowie der Größe und Form
des Hohlraums ab. Es wurde herausgefunden, dass es die Wirkung des
Vorsprungs ist, eine Flüssigkeitsabkürzung zwischen
Einlass und Auslass zu vermeiden, in diesem Sinne leitet der Vorsprung die
Flüssigkeit
auf einen Pfad (L), der länger
ist als die kürzeste
Distanz (D) zwischen dem Einlass und dem Auslass. In 1 wurden
mehrere Flüssigkeitspfade
durch punktierte Linien gezeigt. Es wurde herausgefunden, dass es
vorteilhaft ist, wenn der Quotient des kürzesten L dividiert durch D
zwei oder mehr beträgt. 1 zeigt
weiterhin eine bevorzugte Ausführungsform
hinsichtlich des Ortes des Einlasses und des Auslasses auf derselben
Seite der Kassette. Mit dieser Anordnung ist es möglich, Flüssigkeitsverbindungen
auf derselben Seite anzuordnen und die Verbindung zu einem Gerät einfacher
zu machen. Eine Anordnung von Einlass und Auslass auf derselben
Seite ist ebenso vorteilhaft dadurch, dass diese Seite innerhalb
des Systems während
des Befüllens, des
Zyklus und der Messung nach oben gerichtet befindet. Durch diese
Anordnung können
Luftblasen, die gelegentlich in dem Hohlraum verbleiben, oder die
während
der Erwärmung
der Kassette erzeugt werden, durch die Einlass- oder die Auslassöffnung entfernt
werden. 1 zeigt ebenfalls eine vorteilhafte
Form des Hohlraums neben dem Einlass und dem Auslass. Wie ersichtlich,
bilden die Wände
(7, 7', 7'', 7''') einen Winkel
mit dem Einlass und dem Auslass von ungefähr 130°. Ein bevorzugter Bereich dieses Winkels
ist 100°–150°, der gezeigt
hat, dass er leere Stellen verhindert, wenn der Hohlraum mit Flüssigkeit
gefüllt
wird. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die in 1 gesehen
werden kann, sind die schrägen
Fenster (4, 4').
Licht wird in den Hohlraum senkrecht zu den Oberflächen (8, 8') des Hohlraums
eingestrahlt, und wird durch den schematisch gezeigten Detektor
(20) detektiert. Das einstrahlende Licht wird durch die
schrägen
Oberflächen
(4, 4')
in einer Richtung zum Detektor hin gebrochen. Aufgrund dieser Anordnung
kann die Erzeugung des fluoreszierenden Lichtes auf einen zentralen
Teil dieses Hohlraums gelenkt werden, der näher am Detektor ist, um die
Messempfindlichkeit zu steigern.
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Die 2 zeigt
eine schematische Zeichnung einer Kassette in Kombination mit Lichtquellen (30, 30', 30'', 30''') und einem
Detektor (20). Wie ersichtlich ist der Brennpunkt der Lichtquellen
in dem Zentrum des Hohlraums angeordnet, und die Brennpunkte sind
zum größten Teil
zusammenfallend. Der Detektor (20) ist unterhalb des Detektionsfensters der
Kassette angeordnet, um fluoreszierendes Licht aus dem Zentrum des
Hohlraums zu detektieren. Im Aufbau von 2 ist es
möglich,
die Fluoreszenz von vier verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen
zu überwachen.
Jede der Lichtquellen ist ausgewählt, um spezifische
einen der fluoreszierenden Farbstoffe zu stimulieren. Durch die
nachfolgende Aktivierung der Lichtquellen kann die Menge von jedem
fluoreszierenden Farbstoff durch Detektieren der Fluoreszenzstrahlung
mit dem Detektor überwacht
werden.
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3 zeigt
ein Lichtquellenmodul, das vorteilhafterweise in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann. Das Lichtquellenmodul umfasst eine
Halbleiterlichtquelle (31), ein Wellenlängenselektionsfilter (32)
und ein Überwachungsgerät (33)
für die
optische Ausgangsleistung. Das Überwachungsgerät für die optische
Ausgangsleistung umfasst einen Strahlenteiler (33a), um
einen Teil des Lichts aus dem Lichtweg zu extrahieren, und einen
Detektor (33b), um das extrahierte Licht zu detektieren.
Die Menge des detektierten Lichtes wird zur Steuerung des an die
Halbleiterlichtquelle angelegten Stroms verwendet, um eine konstante
und spezifische Ausgabe zu erzeugen. Das Lichtquellenmodul aus 3 umfasst
weiterhin einen Strahlformer (34) in Form einer Linse.
Vorteühafterweise
wird die Licht emittierende Oberfläche der Halbleiterlichtquelle
durch die Linse in das Zentrum der Kassette abgebildet.
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4 zeigt
ein Raytrace eines Systems, das eine Kassette mit einem schrägen Fenster
einsetzt. Wie ersichtlich, wird das von der Lichtquelle (30)
erzeugte Licht durch eine kugelförmige
Linse (35) auf ein schräges
Fenster (4) der Kassette abgebildet. Aufgrund dieser Anordnung
wird das licht in Richtung des Detektors (20) gebrochen.
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5 zeigt
ein Fluoreszenz-Zeit-Diagramm, das mit dem System gemäß der vorliegenden
Erfindung gemessen wurde. Die Abszisse zeigt die Anzahl der Messung
und die Ordinate zeigt die Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten.
Messungen wurden nach jedem Denaturierungs-Elongationszyklus der
Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Eine wie in 1 und 6 gezeigte
Kassette (1) wurde eingeführt und in einem Halter fixiert,
wie in 6 gezeigt. Der Halter mit der Kassette war in
einer Thermozykler-Einheit integriert worden. Beleuchtungsoptiken
mit einfachen Strahlformungsoptiken wurden für quantitative Fluoreszenzmessung
verwendet. PCR-Läufe
(HCV-Kontrolle mit Mastermix, 5 × 103 Anfangskopien)
mit dem folgenden Protokoll wurden dann durchgeführt. 120 Zyklen, Denaturierungstemperatur
Tdenat = 94°C, Annealingtemperatur Tanneal = 60°C, Temperaturrampenzeit tramp ca. 20 s, Temperatur Plateau tplateau ca. 26 s, Gesamtprozessdauer ttot ca. 3 h. Das experimentell gemessene
Fluoreszenzsignal über
die Anzahl der Messungen ist in 5 aufgetragen
(durchgängige
Linie). Zum Vergleich wurde das Fluoreszenzsignal einer Amplifikation
in einem Gefäß mit demselben
PCR-Protokoll gemessen.
Das Ergebnis wird ebenfalls in 5 gezeigt (gepunktete
Linie). Das verminderte Fluoreszenzsignal der Kassette (ungefähr Faktor
2) ist ein Ergebnis der Strahl formenden Optik, die für die Messung
verwendet wurden. Diese Optik führt
einen Beleuchtungsleistungsverlust von ungefähr 30% ein.
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6 zeigt
eine Kassette der vorliegenden Erfindung in dem Hohlraum eines Metallblocks
zum Durchführen
von Thermozyklen. Innerhalb des Metallblocks gibt es integrierte
Lichtquellen und einen Lichtdetektor. Zum Durchführen von Thermozyklen kann
der Verschluss (41) auf den Metallblock (40) geschraubt
werden, um so einen optimalen thermischen Kontakt zwischen der Kassette
und dem Metallblock zu erreichen. Der Metallblock selbst ist mit Pettier-Elementen
zum Erhitzen und Abkühlen
versehen.
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7 zeigt
ein vorteilhaftes System gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die gezeigte Kassette ist eine keilförmige Ausführungsform, die eine größere Dicke
auf der Seite des Einlasses und Auslasses aufweist. Das System ist
mit einer keilförmigen
Aufnahmeeinheit versehen, die Pettier-Elemente (40') umfasst, die
einen Winkel zueinander bilden, um die keilförmige Kassette aufzunehmen.
Mit dieser Ausführungsform
ist es möglich,
einen intensiven thermischen Kontakt zwischen den Kassetten und
der Heizeinheit zu erreichen, indem einfach die Kassette zwischen
die Pettier-Elemente (40')
eingesetzt wird. Dieser Kassettenaufbau zeigt dass der optische
Weg und der Weg zum Wärmeaustausch
räumlich
getrennt sind, so dass die Detektion und die Wärmeübertragung sich den Platz nicht
streitig machen.
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8 zeigt
die Befüllung
der Kassette aus 1 mit Flüssigkeit. Flüssigkeit
wird durch den Einlass (10) eingefüllt und füllt den Kassettenbereich, der
direkt neben dem Einlass liegt (Bild a). Die weitere Einführung von
Flüssigkeit
vergrößert den
gefüllten
Bereich, wie in den 8b) und c) zu
sehen ist. Dieser Durchflussbefüllungsprozess
stellt eine blasenfreie Befüllung
der Kassette bereit.