DE60011821T2 - Bindungsbeschleunigungsverfahren zum nachweis von analyten - Google Patents

Bindungsbeschleunigungsverfahren zum nachweis von analyten Download PDF

Info

Publication number
DE60011821T2
DE60011821T2 DE60011821T DE60011821T DE60011821T2 DE 60011821 T2 DE60011821 T2 DE 60011821T2 DE 60011821 T DE60011821 T DE 60011821T DE 60011821 T DE60011821 T DE 60011821T DE 60011821 T2 DE60011821 T2 DE 60011821T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
preferred
binding
electrode
nucleic acid
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE60011821T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60011821D1 (de
Inventor
Gary Blackburn
G. Jost VIELMETTER
Faiz Jon KAYYEM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clinical Micro Sensors Inc
Original Assignee
Clinical Micro Sensors Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clinical Micro Sensors Inc filed Critical Clinical Micro Sensors Inc
Publication of DE60011821D1 publication Critical patent/DE60011821D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60011821T2 publication Critical patent/DE60011821T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren, die nützlich sind, um das Binden von Zielanalyten an Einfangliganden auf Oberflächen zu beschleunigen. Die Detektion verläuft über die Verwendung einer Elektronenübertragungsgruppierung („electron transfer moiety", ETM), die mit dem Zielanalyt direkt oder indirekt verbunden ist, um die elektronische Detektion der ETM zu ermöglichen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es gibt eine Reihe von Tests und Sensoren zur Detektion der Gegenwart und/oder der Konzentration spezifischer Substanzen in Flüssigkeiten und Gasen. Viele von diesen sind auf spezifische Liganden/Antiliganden-Reaktionen als Detektionsmechanismus angewiesen. Das heißt, dass sich Substanzpaare (d.h. die bindenden Paare oder Liganden/Antiliganden) bekanntlicherweise aneinander binden, während sie an andere Substanzen kaum oder überhaupt nicht binden. Dies war das Herzstück zahlreicher Verfahren, die diese Bindungspaare zur Detektion von Komplexen einsetzen. Diese werden im Allgemeinen durch Kennzeichnen einer Komponente des Komplexes auf gewisse Weise durchgeführt, sodass der gesamte Komplex unter Einsatz von beispielsweise Radioisotopen, fluoreszierenden oder anders optisch aktiven Molekülen, Enzymen usw. nachweisbar ist.
  • Andere Tests basieren auf elektronischen Signalen für die Detektion. Besonders interessant sind Biosensoren. Zumindest zwei Arten von Biosensoren sind bekannt; enzymbasierte oder metabolische Biosensoren und Bindungs- oder Bioaffinitätssensoren. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.713.347, 5.192.507, 4.920.047, 3.873.267 und die darin aufgenommenen Verweise. Während manche dieser bekannten Sensoren Wechselstromverfahren einsetzen, sind diese Verfahren im Allgemeinen auf die Detektion von Unterschieden in der Massen- (oder dielektrischen) Impedanz eingeschränkt.
  • Der Einsatz von Elektrophorese in mikrofluiden Verfahren, um das Binden der biologischen Moleküle an ihre Bindungspartner zur darauffolgenden Detektion zu erleichtern, ist bekannt; siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 5.605.662 und 5.632.957 und die darin aufgenommenen Verweise.
  • Dem ähnlich ist auch die elektronische Detektion von Nucleinsäuren unter Einsatz von Elektroden bekannt; siehe beispielsweise die US-Patente 5.591.578, 5.824.473, 5.705.348, 5.780.234, 5.770.369, die U.S.S.N. 08/911.589 und die WO 98/20.162; PCT/US98/12.430, PCT/US98/12.082, PCT/US99/10.104, PCT/US99/01.705 und PCT/US99/01.703.
  • Eine der bedeutenden Hürden in Anwendungen von Biosensoren ist die Geschwindigkeit, mit der der Zielanalyt sich an die Oberfläche zur Detektion bindet, sowie die Affinität zur Oberfläche. Es gibt eine Reihe an Verfahren, die für Nucleinsäure-Anwendungen entwickelt wurden, um die Bindungsgeschwindigkeit zu beschleunigen oder um die Probe an der Detektionsoberfläche zu konzentrieren. Diese Verfahren umfassen das Ausfällen von Nucleinsäuren (siehe die EP 0.229.442 A1, umfassend die Zugabe von Detergenzien (siehe Pontius et al., PNAS USA 88, 8237 (1991)); Aufteilen der Nucleinsäuren in wässrige Zwei-Phasen-Systeme (siehe Albertsson et al., Biochimica et Biophysica Acta 103, 1–12 (1965), Kohne et al., Biochem. 16(24), 5329 (1977), und Müller, Partitioning of Nucleic Acids, Kap. 7, in: Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic Press (1985)); sowie das Aufteilen in Gegenwart von Markoliganden (siehe Müller et al., Anal. Biochem. 118, 269 (1981)); und die Zugabe von Nucleinsäure bindenden Proteinen (siehe Pontius et al., PNAS USA 87, 8403 (1990), und das US-Patent Nr. 5.015.569. Weiters wurden auch Trennsysteme für einige Proteine entwickelt, siehe Gineitis et al., Anal. Biochem. 139, 400 (1984).
  • Es gibt also Bedarf an einem System, das das Binden von Zielanalyten, einschließlich Nucleinsäuren, an eine Detektionselektrode zur darauf folgenden elektronischen Detektion beschleunigt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß den zuvor erläuterten Zielen stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die ein Substrat umfassen, das eine erste Oberfläche, umfassend eine Anordnung von Detektionselektroden, die jeweils einen kovalent gebundenen Einfangliganden umfassen, und zumindest eine erste Elektrophoreseelektrode, umfasst. Das Substrat umfasst auch eine zweite Oberfläche, umfassend zumindest eine zweite Elektrophoreseelektrode und zumindest einen Kanal, der die erste und die zweite Oberfläche verbindet. Die Kanäle können Permeationsschichtmaterialien oder Membranen, wie sie hierin erläutert sind, umfassen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend eine Detektionskammer, umfassend ein Substrat, umfassend eine erste Oberfläche, umfassend eine Anordnung von Detektionselektroden, wobei jede einen kovalent gebundenen Einfangliganden umfasst. Die Oberfläche umfasst auch eine zweite Oberfläche und zumindest einen Kanal, der die erste und die zweite Oberfläche verbindet. Die Detektionskammer umfasst außerdem ein absorbierendes Material, das die zweite Oberfläche kontaktiert. Die Kanäle wiederum können auch Permeationsschichtmaterialien oder Membranen, wie sie hierin erläutert sind, umfassen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion eines Zielanalyts in einer Probe bereit, umfassend das Konzentrieren des Zielanalyts in einer wie zuvor beschriebenen Detektionskammer und das Binden des Zielanalyts an den Einfangliganden, um einen Testkomplex zu bilden. Der Testkomplex umfasst weiters zumindest eine Elektronenübertragungsgruppierung (ETM). Das Verfahren umfasst das Detektieren der Gegenwart der ETM unter Einsatz der Detektionselektrode.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion eines Zielanalyts in einer Probe bereit. Das Verfahren umfasst das Konzentrieren des Zielanalyts in einer Detektionskammer, umfassend eine Detektionselektrode, umfassend einen kovalent gebundenen Einfangliganden. Der Zielanalyt ist an den Einfangliganden gebunden, um einen Testkomplex zu bilden, der zumindest eine Elektronenübertragungsgruppierung (ETM) umfasst. Die Gegenwart der ETM wird dann unter Einsatz der Detektionselektrode nachgewiesen.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst der Konzentrationsschritt das Anordnen der Probe in einem elektrischen Feld zwischen zumindest einer ersten Elektrode und zumindest einer zweiten Elektrode, was ausreichend ist, um den elektrophoretischen Transport der Probe zur Detektionselektrode auszulösen.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst der Konzentrationsschritt das Einbinden zumindest eines Volumenausschlussmittels in der Detektionskammer.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst der Konzentrationsschritt das Ausfällen des Zielanalyts.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst der Konzentrationsschritt das Einbinden von zumindest zwei Reagenzien, die zwei trennbare Lösungsphasen bilden, sodass der Zielanalyt in einer der Phasen konzentriert wird.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst der Konzentrationsschritt das Binden des Zielanalyts an ein Shuttleteilchen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Detektieren von Zielanalyten bereit, umfassend das Durchfließen der Probe durch eine Detektionselektrode, umfassend einen kovalent gebundenen Einfangliganden, unter Bedingungen, die zur Bildung eines Testkomplexes führen. Wie zuvor erwähnt umfasst der Testkomplex weiters zumindest eine Elektronenübertragungsgruppierung (ETM), und die Gegenwart der ETM wird unter Einsatz der Detektionselektrode nachgewiesen.
  • In einem weiteren Aspekt dienen die Verfahren zur Detektion von Zielnucleinsäuren und umfassen den Einsatz von Hybridisierungsbeschleunigern. Der Testkomplex wird in Gegenwart eines Hybridisierungsbeschleunigers gebildet, der ein Nucleinsäure bindendes Protein oder ein mehrwertiges Ion sein kann.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Detektion eines Zielanalyts in einer Probe bereit, umfassend das Zusetzen der Probe zu einer Detektionselektrode, umfassend einen kovalent gebundenen Einfangliganden, unter Bedingungen, die zur Bildung eines Testkomplexes führen. Die Bedingungen umfassen die Gegenwart von Mischteilchen.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Substrate bereit, die eine Vielzahl von Goldelektroden umfassen. Jede Goldelektrode umfasst eine sich selbst organisierende Monoschicht, einen Einfangliganden und eine Zwischenverbindung, sodass alle Elektroden unabhängig voneinander adressierbar sind. Bevorzugte Substrate umfassen Materialien für gedruckte Leiterplatten wie Fiberglas.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Substrats bereit, das eine Vielzahl von Goldelektroden umfasst. Die Verfahren umfassen das Beschichten eines Fiberglassubstrats mit einem Haftmetall und das Beschichten des Haftmetalls mit Gold. Anschließend wird unter Einsatz von Lithographie ein Muster gebildet, wobei dieses Muster zahlreiche Elektroden und verbundene Zwischenverbindungen umfasst. Die Verfahren schließen gegebenenfalls das Hinzufügen von sich selbst organisierenden Monoschichten („self assembling monolayers", SAM) zu jeder Elektrode ein.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Substrats bereit, das eine Vielzahl an Goldelektroden umfasst. Die Verfahren umfassen das Beschichten eines Substrats mit einem Haftmetall und das Beschichten des Haftmetalls mit Gold. Anschließend wird unter Einsatz von Lithographie ein Muster gebildet, wobei dieses Muster zahlreiche Elektroden und verbundene Zwischenver bindungen umfasst. Die Verfahren schließen das Hinzufügen von sich selbst organisierenden Monoschichten (SAM) zu jeder Elektrode ein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A, 1B, 1C, 1D, 1E und 1F stellen eine Reihe repräsentativer Anordnungen des Einsatzes von zwei Sätzen an Elektroden, eines Elektrophoresesets und eines Detektionssets dar. In den 1A und 1B weist ein Substrat 30 eine erste Elektrophoreseelektrode 10 mit Detektionselektroden 20 auf, die entweder auf den Elektrophoreseelektroden oder in die Elektrophoreseelektroden eingebettet, von diesen jedoch elektrisch isoliert sind. Ebenfalls vorhanden ist ein die Proben aufnehmender Abschnitt 40. Die Gegenelektrode für die Elektrophorese- und die Detektionselektroden sind nicht dargestellt. 1C zeigt eine Seitenansicht von 1A, wobei hierin die Gegenelektrophoreseelektrode 50 und gegebenenfalls die Gegendetektionselektrode 60 ebenfalls dargestellt sind. Eine Permeationsschicht 25 wird auch gezeigt. Es ist Fachleuten selbstverständlich bekannt, dass diese Gegenelektroden dieselbe Elektrode sein können, sofern sie nacheinander eingesetzt werden. Die 1D, 1E und 1F stellen den Einsatz einzelner Elektrophoreseelektroden dar. 1E ist eine Seitenansicht von 1D. 1F zeigt die Anordnung zum aufeinander folgenden Weiterführen einer Probe von einer Detektionselektrode zu einer anderen, wie es nachstehend im Detail beschrieben wird.
  • 2 zeigt die Verwendung mehrdimensionaler Anordnungen von Elektrophoreseelektroden sowohl zum räumlichen Targeting von Proben als auch zum „Vermischen", um die Bindungskinetik zu erhöhen. 2A zeigt Elektrophoreseelektroden 10 und Detektionselektroden 20. Elektrophoresespannung, die zwischen den Elektrophoreseelektroden 10 und 15 und zugleich zwischen den Elektrophoreseelektroden 12 und 17 angelegt wird, kann den Zielanalyt zur Detektionselektrode 20 führen.
  • Die 3A, 3B und 3C stellen drei bevorzugte Ausführungsformen des Bindens der Zielsequenz an die Elektrode dar. 3A stellt eine Zielsequenz 120, die an eine Einfangsonde 100, verbunden über einen Verbindungslinker 106, der wie hierin erläutert entweder ein leitfähiges Oligomer oder ein Isolator sein kann, hybridisiert ist. Die Elektrode 105 umfasst eine Monoschicht aus Passivierungsmittel 107, das leitfähige Oligomere (hierin als 108 dargestellt) und/oder Isolatoren (hierin als 109 dargestellt) umfassen kann. In allen in diesen Fig. dargestellten Ausführungsformen ist n eine ganze Zahl von zumindest 1, obwohl Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sein wird, dass es möglich ist, im System überhaupt keine Einfangsonde (d.h. n = 0) einzusetzen, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt wird. Die obere Grenze für n hängt von der Länge der Zielsequenz und der erforderlichen Empfindlichkeit ab. 3B stellt die Verwendung einer einzelnen Einfangverlängerungsssonde 110 mit einem ersten Abschnitt 111, der an einen ersten Abschnitt der Zielsequenz 120 hybridisiert, und einem zweiten Abschnitt 112, der an einen ersten Abschnitt 102 der Einfangsonde 100 hybridisiert, dar. Die zweite Einfangverlängerungssonde 130 weist einen ersten Abschnitt 132, der an einen zweiten Abschnitt der Zielsequenz 120 hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt 131 auf, der an einen zweiten Abschnitt 101 der Einfangsonde 100 hybridisiert. Fachleuten wird bekannt sein, dass jede dieser Anbindungsanordnungen in den Ausführungsformen der 4, 5 und 6 eingesetzt werden können.
  • Die 4A, 4B und 4C zeigen mehrere mögliche Mechanismus-1-Systeme. Die 4A, 4B und 4C zeigen mehrere mögliche Nucleinsäuresysteme. In 4A wird eine Detektionssonde 140 (die auch als eine Einfangsonde dient) über ein leitfähiges Oligomer 108 an eine Elektrode 105 gebunden. Die Elektrode 105 umfasst weiters eine Monoschicht aus Passivierungsmitteln 107. Die Zielsequenz 120 hybridisiert an die Detektionssonde 140, und eine ETM 135 wird (entweder kovalent an entweder die Zielsequenz oder die Detektionssonde oder nichtkovalent, d.h. als ein Hybridisierungsindikator) angebunden. In 4B wird eine Verbindung zur Elektrode aus 3A eingesetzt, wobei eine Einfangsonde 100 an die Elektrode 105 mittels eines Verbindungslinkers 106, der entweder ein Isolator oder ein leitfähiges Oligomer sein kann, gebunden wird. Die Zielsequenz 120 wird an die Einfangsonde hybridisiert, und eine Markierungssonde 145, umfassend einen ersten Abschnitt 141, der an einen Abschnitt der Zielsequenz 105 hybridisiert, und einen Verstärkungslinker 142, der an eine Detektionssonde 140 hybridisiert, die über ein leitfähiges Oligomer 108 an die Elektrode gebunden ist. 4C ist ähnlich, außer dass eine erste Einfangverlängerungssonde 110 dargestellt ist, und eine Verstärkersonde 150, umfassend einen ersten Abschnitt 152, der an einen zweiten Abschnitt der Zielsequenz 120 hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt (Amplifikationssequenz) 152, die an einen ersten Abschnitt 141 der Markierungssonde 145 hybridisiert. Ein zweiter Abschnitt 142 der Markierungssonde 145 hybridisiert an die Detektionssonde 140, wobei zumindest eine ETM 135 vorhanden ist. 3C setzt eine Verbindung zur Elektrode nach 3B ein. 4D stellt einen Zielanalyt, der keine Nucleinsäure ist, 165 dar, der an einen Einfangbindungsliganden 160 gebunden ist, der über einen Verbindungslinker 106 an die Elektrode 105 gebunden ist. Ein Lösungsbindungsligand 170 bindet auch an den Zielanalyt und umfasst einen Verstärkungslinker 171, umfassend Nucleinsäure, die an die Detektionssonde 140 mit zumindest einer ETM 135 hybridisiert.
  • Die 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 4F und 4G zeigen einige der Nucleinsäure-Mechanismus-2-Ausführungsformen der Erfindung. Alle darin dargestellten Monoschichten weisen die Gegenwart von leitfähigen Oligomeren 108 und Isolatoren 107 in etwa einem 1:1-Verhältnis auf, obwohl, wie hierin bereits erläutert, eine Vielzahl von unterschiedlichen Verhältnissen eingesetzt werden können oder der Isolator auch gänzlich fehlen kann. Weiters wird Fachleuten bekannt sein, dass jegliche dieser Strukturen für eine bestimmte Zielsequenz wiederholt werden kann; das bedeutet, dass in langen Zielsequenzen vielfache Testkomplexe gebildet werden können. Darüber hinaus können jegliche Ausführungsformen von Elektrodenbindungen aus 3 in jedem dieser System eingesetzt werden.
  • Die 5A, 5B und 5D zeigen die die ETMs 135 enthaltende Zielsequenz 120; wie hierin erläutert, können diese enzymatisch zugesetzt werden, beispielsweise während einer PCR-Reaktion unter Einsatz ETM-modifizierter Nucleotide, was in einer im Wesentlichen willkürlichen Inkorporation über die gesamte Zielsequenz hinweg oder in einem Zusatz am Zielsequenzterminus resultiert. 5C zeigt den Einsatz von zwei unterschiedlichen Einfangsonden 100 und 100', die an verschiedene Abschnitte der Zielsequenz 120 hybridisieren. Fachleuten wird bekannt sein, dass die 5'-3'-Ausrichtung der zwei Einfangsonden in dieser Ausführungsform eine andere ist.
  • 5C zeigt den Einsatz von Markierungssonden 145, die direkt an die Zielsequenz 120 hybridisieren. 5C zeigt den Einsatz einer Markierungssonde 145, umfassend einen ersten Abschnitt 141, der an einen Abschnitt der Zielsequenz 120 hybridisiert, und einen zweiten, ETM 135 umfassenden Abschnitt 142.
  • Die 5E, 5F und 5G zeigen Systeme unter Einsatz von Markierungssonden 145, die nicht direkt an die Zielsequenz hybridisieren, sondern eher an die Verstärkersonden, die direkt (5E) oder indirekt (die 5F und 5G) an die Zielsequenz hybridisiert sind. 5E setzt eine Verstärkersonde 150 ein, die einen ersten Abschnitt 151, der an die Zielsequenz 120 hybridisiert, und zumindest einen zweiten Abschnitt 152, d.h. die Verstärkersequenz, aufweist, die an den ersten Abschnitt 141 der Markierungssonde hybridisiert. 5F ist ähnlich, außer dass eine erste Markierungsverlängerungssonde 160 eingesetzt wird, umfassend einen ersten Abschnitt 161, der an die Zielsequenz 120 hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt 162, der an einen ersten Abschnitt 151 der Verstärkersonde 150 hybridisiert. Ein zweiter Abschnitt 152 der Verstärkersonde 150 hybridisiert an einen ersten Abschnitt 141 der Markierungssonde 140, die auch einen ETM 135 umfassenden Verstärkungslinker 142 umfasst. 5G fügt eine zweite Markierungsverlängerungssonde 170 mit einem ersten Abschnitt 171, der an einen Abschnitt der Zielsequenz 120 hybridisiert, und einem zweiten Abschnitt, der an einen Abschnitt der Verstärkersonde hybridisiert, hinzu.
  • 5H zeigt ein System, das zahlreiche Markierungssonden einsetzt. Der erste Abschnitt 141 der Markierungssonde 140 kann an den gesamten Verstärkungslinker 142 oder an einen Teil davon hybridisieren.
  • Die 6A – 6H zeigen einige der möglichen Nicht-Nucleinsäure-Mechanismus-2-Ausführungsformen. 6A setzt einen Einfangbindungsliganden 200 ein, der über einen Verbindungslinker 106 an die Elektrode 105 gebunden ist. Der Zielanalyt 205 bindet sich an den Einfangbindungsliganden 200 und an einen Lösungsbindungsliganden 210 mit einem ETM 135 umfassenden Verstärkungslinker 220. 6B zeigt einen ähnlichen Fall, außer dass der Einfangbindungsligand 200 durch Wechselwirkung mit einem zweiten Bindungspartner, z.B. einer Nucleinsäure, an die Oberfläche gebunden ist; ein Abschnitt 201 des Einfangbindungsliganden bindet sich oder hybridisiert an eine Einfangsonde 100 an der Oberfläche. 6C setzt ebenfalls eine zweite Bindungswechselwirkung ein, z.B. eine Nucleinsäurewechselwirkung, um das Signal zu verstärken. In diesem Fall umfasst der Lösungsbindungsligand 210 einen ersten Abschnitt 220, der sich an einen ersten Abschnitt 231 einer Markierungssonde 230 bindet oder hybridisiert. Die Markierungssonde 230 umfasst auch einen zweiten Abschnitt 232, der ein Verstärkungslinker ist. 6D zeigt eine, der 6A ähnliche Ausführungsform, in der ein zweiter Lösungsbindungsligand 240 eingesetzt wird. 6E zeigt den Fall, in dem mehr als ein Einfangbindungsligand (200 und 200') eingesetzt wird. 6F zeigt eine Strukturanordnung, worin der Zusatz des Targets die Struktur der Bindungsliganden verändert und so dazu führt, dass der Verstärkungslinker 220 in der Nähe der Monoschichtoberfläche angeordnet wird. 6G zeigt den Einsatz der vorliegenden Erfindung beim Screening von möglichen bioaktiven Stoffen, worin der Zusatz eines Kandidat-Wirkstoffs zum Ziel dazu führt, dass der Lösungsbindungsligand dissoziiert und es so zu einem Signalverlust kommt. Weiters kann der Lösungsbindungsligand einer anderen Oberfläche zugesetzt und gebunden werden, wie es im Allgemeinen in 6H für Enzyme dargestellt ist. 6H zeigt den Einsatz eines Enzyms, um ein einen Verstärkungslinker umfassendes Substrat zu spalten, was wiederum zu einem Signalverlust führt. Das gespaltene Stück kann ebenfalls einer zusätzlichen Elektrode zugesetzt werden, was eine Signalsteigerung auslöst, wobei hierbei entweder ein Mechanismus-1- oder Mechanismus-2-System eingesetzt wird.
  • Die 7A, 7B, 7C, 7D und 7E zeigen unterschiedliche mögliche Anordnungen von Markierungssonden und Anbindungen von ETM. In den 7A–C ist der Verstärkungslinker eine Nucleinsäure; in den 7D und 7E ist er das nicht. A = Nucleosidersatz; B = Bindung an eine Base; C = Bindung an eine Ribose; D = Bindung an ein Phosphat; E = Metallocenpolymer (obwohl dies hierin als solches erläutert wird, kann es ebensogut ein Polymer anderer ETM sein), gebunden an eine Base, Ribose oder ein Phosphat (oder andere Hauptkettenanaloga); F = Dendrimer-Struktur, gebunden durch eine Base, Ribose oder ein Phosphat (oder andere Hauptkettenanaloga); G = Bindung über eine „verzweigende" Struktur, über eine Base, Ribose oder ein Phosphat (oder andere Hauptkettenanaloga); H = Bindung von Metallocen- (oder anderer ETM-) Polymere; I = Bindung über eine Dendrimerstruktur; J = Bindung unter Einsatz von Standardlinkern.
  • Die 8A und 8B sind eine schematische Darstellung eines alternativen Verfahrens zum gleichzeitigen Hinzufügen einer großen Anzahl an ETM zu einer Nucleinsäure unter Einsatz eines „Verzweigungspunkt"-Phosphoramidits, wie es auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Fachleuten wird bekannt sein, dass jeder Endpunkt eine beliebige Anzahl an ETM enthalten kann.
  • 9 ist eine schematische Ansicht der Synthese der gleichzeitigen Inkorporation zahlreicher ETM in eine Nucleinsäure unter Einsatz eines „Verzweigungspunkt"-Nucleosids.
  • 10 zeigt die Synthese eines „Verzweigungspunktes" (in diesem Fall ein Adenosin), um das Hinzufügen von ETM-Polymeren zu ermöglichen.
  • 11 stellt den Einsatz eines aktivierten Carboxylats zum Hinzufügen einer Nucleinsäure dar, die mit einem primären Amin zu einem vorgebildeten SAM funktionalisiert ist.
  • 12 zeigt eine repräsentative Haarnadelstruktur. 500 ist eine zielbindende Sequenz, 510 ist eine Schleifensequenz, 520 ist eine selbstkomplementäre Region, 530 ist im Wesentlichen komplementär zu einer Detektionssonde, und 530 ist das „klebrige Ende", d.h. ein Abschnitt, der an keinen anderen Abschnitt der ETM enthaltenden Sonde hybridisiert.
  • Die 13A, 13B, 13C und 13D zeigen einige Ausführungsformen der Erfindung.
  • 14 zeigt die Ergebnisse des experimentellen Beispiels.
  • Die 15A, 15B, 15C, 15D, 15E, 15F und 15G zeigen mehrere mögliche Anordnungen von zwei Elektroden-Systemen. In der Seitenansicht von 15A wird ein Substrat 30 auf die Detektionselektroden 20 enthaltende Elektrophoreseelektrode 10 gegeben. Das Substrat 30 weist Löcher oder Kanäle auf. Alle hierin abgebildeten Kanäle können gegebenenfalls mit Permeationsschichtmaterial 25 gefüllt sein; alternativ dazu kann eine Membran wie eine Dialysemembran an jedem Ende des Kanals eingesetzt werden. Das Permeationsschichtmaterial, wie z.B. Agarose, Acrylamid usw., ist durchlässig für Ionen zur Elektrophorese, hindert jedoch vorzugsweise Probenkomponenten wie Zielanalyte daran, in die Permeationsschicht einzutreten. Fachleuten wird jedoch bekannt sein, dass solche Kanäle offen und so mit einem Puffer gefüllt sein könnten. Die Gegenelektrode 50 kann überall angebracht werden. Durch Aufbauen eines elektrischen Feldes zwischen der Elektrophoreseelektrode 10 und der Gegenelektrode 50 gerät die Probe in die Nähe der Detektionselektrode. 15B zeigt eine ähnliche Anordnung, wobei die Elektrophoreseelektrode 10 jedoch nicht in direktem Kontakt mit der Permeationsschicht steht; hierin wird ein Ionenleitermaterial 27 eingesetzt; bevorzugte Ausführungsformen verwenden Puffer. 15C zeigt eine „asymmetrische" Anordnung, worin sich die Gegenelektrode 50 auf der einen Seite der Detektionselektrodenanordnung befindet und der Kanal auf der anderen. 15D ist 15C ähnlich, jedoch „symmetrisch". 15E setzt zwei Sets an Elektrophoreseelektroden ein; dies ermöglicht einen ersten Elektrophoreseschritt unter Einsatz der Elektroden 51 und 11, die eine bestimmte Zeit eingesetzt werden können, gefolgt von einem zweiten Elektrophoreseschritt unter Einsatz der Elektroden 52 und 12. Die 15F und 15G sind eine Draufsicht eines Substrats 30; die andere Elektrophoreseelektrode liegt auf der anderen Seite des Substrats und wird nicht gezeigt. In dieser Ausführungsform umgibt umgeben die Detektionselektrode(n) 20 einen Kanal, der gegebenenfalls mit einem Permeationsmaterial 25 gefüllt ist. So weist 15F einen Kanal auf, und die Detektionselektroden sind rund um den Kanal angeordnet. 15G weist in jeder Einlage einen Kanal auf.
  • Die 16A, 16B und 16C zeigen Systeme, die den Systemen aus 15 ähnlich sind, wobei jedoch nicht Elektrophorese zum Einsatz kommt, sondern die Hybridisierungsbeschleunigung durch Einsatz eines absorbierenden Materials, ähnlich einem Volumenausschlussmittel, oder durch Kombinationen aus Elektrophorese und einem absorbierenden Material erreicht wird. In 16A resultiert das Einführen der Probe in die Kammer 40 darin, dass die Flüssigkeit durch einen Kanal (gegebenenfalls mit einer Permeationsschicht gefüllt) in eine Kammer gezogen wird, die ein Adsorptionsmittel 500 umfasst. 16B zeigt eine abgeänderte Anordnung, worin die Größenausschluss-Trennwand (z.B. halbdurchlässige Membran) an der Oberfläche des Substrats (z.B. der Leiterplatte) liegt. Die 16C, 16D, 16E und 16F zeigen unterschiedliche Anordnungen, die den Einsatz eines absorbierenden Materials und Elektrophorese kombinieren. Fachleuten wird bekannt sein, dass dieses System auch in anderen Hybridisierungsbeschleunigungsverfahren eingesetzt werden kann.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die bei der Detektion von biologischen Zielanalytspezies wie Nucleinsäuren und Proteinen, die auf elektrochemischer Detektion an einer Elektrode basieren, zweckdienlich sind. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, ist eines der erheblichsten Hindernisse von Biosensoren, insbesondere von Biosensoren zur Detektion von Nucleinsäuren, die Bindungsgeschwindigkeit (d.h. der Hybridisierung bei Nucleinsäuren) des lösungsbasierten Targets an den oberflächengebundenen Einfangliganden. Siehe bei spielsweise Gingeras et al., Nucl. Acid Res. 13, 5373 (1987), hierin durch Verweis zur Gänze aufgenommen. Dies kann auf zahlreiche unterschiedliche Arten beeinflusst werden, umfassend (1) das Konzentrieren des Zielanalyts in der Nähe der Oberfläche, was dazu führt, dass sich eine größere Menge des Zielanalyts an den Einfangliganden bindet; (2) das Konfigurieren des Systems, um einen guten Fluss oder gutes „Vermischen" zu ermöglichen, was wiederum ermöglicht, eine größere Menge des Zielanalyts an den Einfangliganden zu binden; oder (3) im Falle von Nucleinsäuren den Einsatz von Hybridisierungsbeschleunigern, die tatsächlich die Hybridisierungsgeschwindigkeit in Testkomplexen, die die Zielsequenz und die Einfangsonden umfassen, beschleunigen. Auf alle drei Möglichkeiten wird hierin manchmal als Bindungs- oder Hybridisierungsbeschleunigung Bezug genommen, wobei erachtet werden muss, dass einige dieser Verfahren die Geschwindigkeitskonstante der Bindung nicht wirklich erhöhen, sondern dass sie die Menge des pro Zeiteinheit gebundenen Zielanalyts durch Konzentrationssteigerung oder durch Verbessern des Massentransports erhöhen. So zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, Zusammensetzungen und Verfahren einzusetzen, die die Anzahl der Zielmoleküle, die innerhalb einer bestimmten Zeiteinheit an die Oberfläche gebunden werden, erhöhen. Auch wenn zahlreiche hierin angeführte Verfahren im Allgemeinen unter Erwähnung von Nucleinsäuren beispielhaft dargestellt werden, ist Fachleuten selbstverständlich bekannt, dass all diese Verfahren auch auf andere Zielanalyte, umfassend Proteine, anwendbar sind.
  • So beschreibt die vorliegende Erfindung eine Reihe an Verfahren, die eingesetzt werden können, um die Geschwindigkeit der Testkomplexbildung zu beschleunigen oder um die Anzahl der Testkomplexe pro bestimmter Zeiteinheit zu erhöhen, worin der Zielanalyt mit einem Einfangliganden an der Elektrodenoberfläche verbunden wird. Diese Verfahren umfassen elektrophoretischen Transport; den Einsatz von Volumenausschlussmitteln; den Einsatz von Nucleinsäure-bindenden Proteinen (im Falle von Nucleinsäure-Zielanalyten); den Einsatz von mehrwertigen Ionen; Ausfällungsmittel; Abtrennung; Einstellen der Phasenkompatibilität; Strukturieren der Flussparameter; den Einsatz von Mikroteilchen (umfassend magnetische und nicht ma gnetische Teilchen) als „Transportmittel" oder „Mischer"; den Einsatz von Temperaturgradienten; den Einsatz von Filtern; und Kombination davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion eines Zielanalyts in Probelösungen bereit. Fachleuten wird bekannt sein, dass die Probenlösung eine beliebige Anzahl an Elementen enthalten kann, umfassend Körperflüssigkeiten (umfassend Blut, Urin, Serum, Lymphe, Speichel, Anal- und Vaginalsekrete, Schweiß und Spermien von praktisch jedem Organismus, jedoch nicht darauf beschränkt, wobei Proben von Säugetieren bevorzugt und menschliche Proben besonders bevorzugt sind); Proben aus der Umgebung (umfassend Luft-, Landwirtschafts-, Wasser- und Bodenproben, jedoch nicht darauf beschränkt); Proben aus biologischen Waffen; Forschungsproben (d.h. im Falle von Nucleinsäuren können Proben Produkte aus einer Amplifikationsreaktion sein, die sowohl Ziel- als auch Signalamplifikation umfasst, wie sie im Allgemeinen in der PCT/US99/01.705 beschrieben werden, wie z.B. PCR- oder SDA-Amplifikationsreaktionen); gereinigte Proben, wie gereinigte genomische DNA, RNA, Proteine usw.; unbehandelte Proben (Bakterien, Viren, genomische DNA usw.), jedoch nicht darauf beschränkt. Fachleuten wird bekannt sein, dass praktisch jede beliebige experimentelle Manipulation an solch einer Probe durchgeführt worden sein kann.
  • Die Verfahren beziehen sich auf die Detektion von Zielanalyten. Die Bezeichnung „Zielanalyte" oder hierin vorkommende grammatische Entsprechungen beschreiben jedes beliebige Molekül oder jede Verbindung, die nachzuweisen ist. Wie nachstehend erläutert wird, binden Zielanalyte vorzugsweise an Bindungsliganden, wie nachstehend genauer beschrieben wird. Fachleuten wird bekannt sein, dass zahlreiche Analyte unter Einsatz der vorliegenden Verfahren nachgewiesen werden können; grundsätzlich kann jeder Zielanalyt, für den ein nachstehend beschriebener Bindungsligand hergestellt werden kann, unter Einsatz der Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden.
  • Wird Elektrophorese eingesetzt, die nachstehend noch genauer beschrieben wird, so ist der Zielanalyt vorzugsweise geladen; d.h, dass er unter den Experimentbedingungen eine Nettoladung trägt, sodass er in der Lage ist, in einem elektrischen Feld elektrophoretisch transportiert zu werden. Dennoch können auch nicht geladene Zielanalyte eingesetzt werden, sofern ein geladener Bindungspartner oder Bindungsligand mit dem Zielanalyt verbunden ist. Wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, können beispielsweise im Falle von einigen Zielanalyten, z.B. Proteinen, die nur eine geringe oder überhaupt keine Nettoladung tragen, lösliche Bindungsliganden eingesetzt werden, um die Zielanalyte, die zusätzlich ETM und/oder geladene Spezies enthalten, zu binden; in einigen Ausführungsformen können die ETM geladen sein und so sowohl die Elektrophorese als auch die Detektion erleichtern.
  • Geeignete Analyte umfassen organische und anorganische Moleküle, einschließlich Biomoleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Analyt eine umweltverschmutzende Substanz (umfassend Pestizide, Insektizide, Toxine usw.); eine Chemikalie (umfassend Lösungsmittel, organische Materialien usw.); therapeutische Moleküle (umfassend therapeutische Arzneimittel und Drogen, Antibiotika usw.); Biomoleküle (umfassend Hormone, Zytokine, Proteine, Lipide, Kohlenwasserstoffe, Zellmembranantigene und Rezeptoren (Nerven-, Hormon-, Nährstoff- und Zelloberflächenrezeptoren) oder deren Liganden usw.; ganze Zellen (umfassend prokaryotische (wie pathogene Bakterien) und eukaryotische Zellen, umfassend Tumorzellen von Säugetieren); Viren (umfassend Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren usw.); und Sporen usw. sein. Besonders bevorzugte Analyte sind umweltverschmutzende Substanzen; Nucleinsäuren; Proteine (umfassend Enzyme, Antikörper, Antigene, Wachstumsfaktoren, Zytokine usw.); therapeutische Pharmaka und Suchtmittel; und Viren.
  • Besonders bevorzugte Zielanalyte umfassen Proteine und Nucieinsäuren. „Protein", wie es hierin verwendet wird, umfasst Proteine, Polypeptide und Peptide. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Peptidbindungen zusammengesetzt sein oder synthetische peptidomimetische Strukturen aufweisen. Die Seitenketten können entweder die (R)- oder die (S)-Konfiguration aufweisen. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder der L-Konfiguration vor. Werden nicht natürlich vorkommende Seitenketten eingesetzt, so können Substituenten, die keine Aminosäuren sind, eingesetzt werden, beispielsweise um In-vivo-Abbau zu vermeiden oder zu verzögern.
  • „Nucleinsäure" oder „Oligonucleotide" oder grammatische Entsprechungen davon bezeichnen hierin zumindest zwei Nucleotide, die kovalent aneinander gebunden sind. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen, obwohl in machen Fällen, wie nachstehend erläutert wird, Nucleinsäureanaloga eingebunden sind, die andere Hauptketten aufweisen können, umfassend beispielsweise Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10), 1925 (1993), und darin aufgenommene Verweise; Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14, 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Thiophosphat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und das US-Patent Nr. 5.644.048), Dithiophosphat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptid-Nucleinsäure-Hauptketten und -Verbindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996), die alle durch Verweis hierin aufgenommen sind). Andere analoge Nucleinsäuren umfassen jene mit bizyklischen Strukturen, umfassend eingeschlossene Nucleinsäuren, Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 13252-3 (1998); positive Hauptketten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995); nichtionische Hauptketten (US-Patente Nr. 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 und 4.469.863; Kiederowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y.S. Sanghui und P. Dan Cook (Hrsg.); Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Hauptketten, jene umfassend, die in den US-Patenten Nr. 5.235.033 und 5.034.506 und in den Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y.S. Sanghui und P. Dan Cook (Hrsg.), beschrieben werden. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbozyklische Zucker enthalten, fallen ebenfalls in den Rahmen der Definition von Nucleinsäuren (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., 169–176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga werden in Rawls, C & E News, 35 (2. Juni 1997), beschrieben.
  • Diese Modifikationen der Ribose-Phosphat-Hauptkette können vorgenommen werden, um die Zugabe von ETM zu erleichtern oder die Stabilität und die Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu steigern.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass alle dieser Nucleinsäureanaloga in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Darüber hinaus können Gemische aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und -analoga hergestellt werden; beispielsweise kann an der Anbindungsstelle des leitfähigen Oligomers oder der ETM eine analoge Struktur eingesetzt werden. Alternativ dazu können Gemische aus verschiedenen Nucleinsäureanaloga und Gemische aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und -analoga hergestellt werden.
  • Besonders bevorzugt sind Peptid-Nucleinsäuren (PNA), die Peptid-Nucleinsäureanaloga enthalten. Diese Hauptketten sind im Wesentlichen unter neutralen Bedingungen nichtionisch, im Gegensatz zur stark geladenen Phosphodiester-Hauptkette natürlich vorkommender Nucleinsäuren. Dies bringt zwei Vorteile hervor. Erstens weist die PNA-Hauptkette verbesserte Hybridisierungskinetik auf. PNA weisen größere Veränderungen der Schmelztemperatur (Tm) bei fehlgepaarten gegenüber richtig gepaarten Basenpaaren auf. DNA und RNA weisen typischerweise einen Rückgang der Schmelztemperatur bei einer internen Fehlpaarung von 2–4 °C auf. Bei den nichtionischen PNA-Hauptketten ist der Temperaturabfall näher bei 7–9 °C.
  • Dies ermöglicht eine leichtere Detektion von Fehlpaarungen. Dem ähnlich ist aufgrund ihrer nichtionischen Beschaffenheit die Hybridisierung der an diese Hauptketten gebundenen Basen gegenüber Salzkonzentration relativ unempfindlich.
  • Die Nucleinsäuren können, wie spezifiziert wird, einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder Abschnitte von sowohl doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Sequenzen enthalten. Die Nucleinsäure kann DNA, sowohl genomische als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid sein, sofern die Nucleinsäure eine beliebige Kombination aus Desoxyribo- und Ribonucleotiden ist, sowie eine Kombination aus Basen, umfassend Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthin, Hypoxanthin, Isocytosin, Isoguanin usw. Eine bevorzugte Ausführungsform setzt Isocytosin und Isoguanin in Nucleinsäuren ein, die dafür bestimmt sind, komplementär zu anderen Sonden, und nicht zu Zielsequenzen, zu sein, da dies die nicht spezifische Hybridisierung reduziert, wie im Allgemeinen im US-Patent Nr. 5.681.702 beschrieben wird. Hierin verwendet umfasst die Bezeichnung „Nucleosid" Nucleotide sowie Nucleoside und Nucleotidanaloga und auch modifiziere Nucleoside wie Amino-modifizierte Nucleoside. Weiters umfasst „Nucleosid" nicht natürlich vorkommende analoge Strukturen. Die einzelnen Einheiten einer Peptid-Nucleinsäure beispielsweise, wovon jede eine Base enthält, werden hierin als Nucleosid bezeichnet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verfahren das Konzentrieren des Zielanalyts in der Nähe einer Detektionselektrode. Die Beschreibung der Detektionselektrodenzusammensetzungen werden nachstehend gegeben. Fachleuten wird bekannt sein, dass die anfängliche Konzentration des Zielanalyts in der Probe sehr stark variieren kann, da dies vom Typ der eingesetzten Probe abhängt. Im Allgemeinen ist die anfängliche Konzentration des Zielanalyts in der Probe relativ gering, und bevorzugte Techniken setzen Verfahren ein, die die Konzentration des Zielanalyts in der Nähe der Detektionselektrode ermöglichen.
  • Im Allgemeinen bedeutet „Konzentration", dass die effektive Diffusionsdistanz, die ein Zielanalyt zurücklegen muss, um an die Oberfläche zu binden, reduziert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Konzentration bei oder nahe bei der Detektionselektrode höher als die Konzentration in der anfänglichen Probe. Dies kann auf verschiedene Arten gemessen werden, umfassend direkte oder indirekte Messung als eine Funktion der Bindungsbeschleunigung. Das bedeutet, dass in einer bevorzugten Ausführungsform die Konzentration vorzugsweise um zumindest das Doppelte, noch bevorzugter um zumindest das Fünffache, und besonders bevorzugt um zumindest das Zehnfache, steigt. Fachleuten wird bekannt sein, dass der Anstieg der Konzentration auch von der anfänglichen Größe der Probe abhängt und dass so ein sehr starker Anstieg der Konzentration, z.B. ein Anstieg um das 100-, 1.000- und 10.000fache (oder mehr), wünschenswert ist. Wird die Hybridisierungsgeschwindigkeit als ein Indikator für die Konzentration verwendet, so ist ein Anstieg der Konzentration des Zielanalyts, der an die Detektionselektrode bindet, pro Zeiteinheit um zumindest das Doppelte wünschenswert, wobei ein Anstieg um zumindest das Fünffache noch bevorzugter, und um zumindest das Zehnfache besonders bevorzugt ist; ein noch höherer Anstieg kann in manchen Ausführungsformen wiederum bevorzugt sein:
  • Wie hierin erläutert wird, gibt es eine Vielzahl an geeigneten Konzentrationsverfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Konzentration mittels Elektrophorese. Im Allgemeinen funktioniert das System wie nachstehend beschrieben. Eine erste Elektrode und eine zweite Elektrode werden eingesetzt, um ein elektrisches Feld zum Transport, im Allgemeinen zum elektrophoretischen Transport, der Zielanalytspezien zu erzeugen, wobei der Zielanalyt seine Konzentration an der Detektionselektrode erhöht, die einen kovalent gebundenen Einfangliganden aufweist, der (direkt oder indirekt) den Zielanalyt bindet. Auf diese Weise wird die Kinetik des Zielanalyts, der an seinen Einfangliganden bindet, sowohl durch Erhöhen der Konzentration des Zielanalyts im den Einfangliganden umgebenden Medium als auch durch Reduzieren der Distanz, die das Zielanalytmolekül durchdringen muss, um einen Bindungsliganden zu finden, signifikant erhöht.
  • Die Detektionselektrode kann dieselbe wie die erste Elektrode sein oder nicht. Das bedeutet, dass sich in einer Ausführungsform die Elektroden, die zur Erzeugung von elektrischen Feldern eingesetzt werden, die zum Transport der Analyte an die Oberfläche dienen, von den Elektroden zur Detektion unterscheiden; d.h. dass es zwei Elektrodensets gibt, obwohl, wie Fachleuten bekannt sein wird, die zwei Sets Elektroden beiderseits verwenden können, beispielsweise die Gegenelektrode. In einer weiteren Ausführungsform sind die für den elektrophoretischen Transport und die zur Detektion eingesetzten Elektroden dieselben; d.h. dass es nur ein Elektrodenset gibt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Elektrophoreseelektrode, die den Zielanalyt anzieht, eine Permeationsschicht, die dazu dient, den Zugang der Zielanalyte zur Elektrodenoberfläche zu limitieren und so die Analyte vor elektrochemischer Zersetzung zu bewahren.
  • Dieser elektrophoretische Transport in die Nähe der Detektionssonde hin ermöglicht die Konzentration des Zielanalyts bei oder nahe bei der Detektionssondenoberfläche, die Einfangbindungsliganden enthält, welche die Zielanalyte bindet, um Testkomplexe zu bilden. In einigen Ausführungsformen ermöglicht der aufeinander folgende oder gleichzeitige Einsatz einer Vielzahl von Elektrophoreseelektroden mehrdimensionale Elektrophorese, d.h. dass auf die Lösung in der Nähe der Detektionselektrode abgezielt oder die Lösung in der Nähe der Detektionselektrode „vermischt" oder „gerührt" werden kann, um die Bindungskinetik weiter zu erhöhen. Wie nachstehend beschrieben wird, umfasst der Testkomplex eine ETM, die anschließend unter Einsatz einer Detektionselektrode detektiert wird.
  • Es gilt auch anzumerken, dass zahlreiche Elektrophoreseschritte eingesetzt werden können; die Komponenten des Systems können beispielsweise nacheinander zugesetzt werden, wobei nach jedem Zusatz ein Elektrophoreseschritt durchgeführt wird, um die Reagenzien hinunter zur Detektionselektrode zu transportieren. Dem ähnlich kann Elektrophorese eingesetzt werden, um „Waschschritte" durchzuführen, worin überschüssige Reagenzien (nicht gebundene Zielmoleküle oder nicht gebundene zusätzliche Bindungsligandenkomponenten usw.) oder andere Komponenten der Probe (z.B. nicht komplementäre Nucleinsäuren) von der Detektionselektrode entfernt werden. So kann jede beliebige Kombination von Elektrophoreseschritten eingesetzt werden. Weiters kann die Dauer der Elektrophoreseschritte geändert werden.
  • Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können entweder mit zwei Elektrodensets, worin ein Set zur Elektrophorese und das zweite Set zur Detektion eingesetzt wird, oder mit einem Elektrodenset arbeiten, das sowohl zur Elektrophorese als auch zur Detektion eingesetzt wird, wie nachstehend allgemein beschrieben wird.
  • Proben, die Zielanalyte enthalten, werden in ein elektrisches Feld zwischen zumindest einer ersten und zumindest einer zweiten Elektrophoreseelektrode platziert. Unter „Elektrode" wird hierin eine Zusammensetzung gemeint, die, wenn sie an eine elektronische Vorrichtung angeschlossen wird, in der Lage ist, Strom oder Spannung zu fühlen und in ein Signal umzuwandeln. Alternativ dazu kann eine Elektrode auch als eine Zusammensetzung definiert werden, die eine Spannung an Spezies anlegen kann und/oder Elektronen von Spezies in der Lösung weg oder zu Spezies in der Lösung hin leiten kann. So ist eine Elektrode eine nachstehend beschriebene ETM. Bevorzugte Elektroden sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen bestimmte Metalle und deren Oxide, umfassend Gold; Platin; Palladium; Silicium; Aluminium; Metalloxidelektroden, umfassend Platinoxid, Titanoxid, Zinnoxid, Indiumzinnoxid, Palladiumoxid, Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Molybdänoxid (Mo2O6), Wolframoxid (WO3) und Rutheniumoxide; und Kohlenstoff (umfassend Glaskohlenstoffelektroden, Graphit und Kohlenstoffpaste), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Elektroden umfassen Gold-, Silicium-, Platin-, Kohlenstoff- und Metalloxidelektroden, wobei Gold besonders bevorzugt ist.
  • Die hierin beschriebenen Elektroden sind mit einer flachen Oberfläche dargestellt, die jedoch nur eine der möglichen Strukturen der Elektrode ist und nur zum Zweck der schematischen Darstellung ausgewählt wurde. Die Struktur der Elektrode variiert je nach dem eingesetzten Detektionsverfahren. Flache, ebene Elektroden beispielsweise können für Verfahren der optischen Detektion bevorzugt sein, oder auch wenn Anordnungen von Nucieinsäuren erstellt werden, die adressierbare Stellen für die Synthese und die Detektion erfordern. Alternativ dazu kann für eine Einzelsondenanalyse die Elektrode in Form eines Röhrchens vorliegen, wobei die SAM leitfähige Oligomere und Nucleinsäuren, die an die innere Oberfläche gebunden sind, umfassen. Elektroden in Form von Spulen oder Netzen können in manchen Ausführungsformen ebenfalls bevorzugt werden. Dies ermöglicht, dass ein Maximum der die Nucleinsäuren enthaltenden Oberfläche einem geringen Volumen der Probe ausgesetzt ist.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die Elektroden auf zahlreiche verschiedene Arten angeordnet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Elektroden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, ineinandergreifen. Weiters können die unterschiedlichen Elektroden (z.B. die Detektionselektroden und die Elektrophoreseelektroden) aus denselben oder aus unterschiedlichen Metallen sein; die Elektrophoreseelektroden können beispielsweise aus Platin und die Detektionselektroden aus Gold sein.
  • Weiters kann, wie nachstehend noch ausführlicher erläutert wird, die Detektionselektrode so konfiguriert werden, dass die Kontaktfläche der gesamten Probe mit der Elektrode maximiert wird, oder so, dass ein Vermischen möglich ist, usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen eine (oder beide) der Elektrophoreseelektroden oder Kanäle im Substrat eine Permeationsschicht, wie sie im Allgemeinen in den US-Patenten Nr. 5.632.957 und 5.605.662 beschrieben wird, die beide ausdrücklich in ihrer Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen sind. Dies ist besonders nützlich, wenn das System mit hohen Spannungen betrieben wird, d.h. wo es zur Wasserhydrolyse kommt. Die Permeationsschicht dient als eine Zwischendiffusionsschicht und weist im Allgemeinen eine Porenbegrenzungseigenschaft auf, die Zielanalyte, Reaktanten usw. daran hindert bzw. davon abhält, mit der Elek trodenoberfläche in physischen Kontakt zu kommen und sie so vor negativen elektrochemischen Wirkungen schützt. Die Permeationsschicht kann aus einer Vielzahl von Materialien gebildet werden, umfassend Kohlenstoffketten-Polymere, Kohlenstoff-Siliciumketten-Polymere, Kohlenstoff-Phosphorketten-Polymere, Kohlenstoff-Stickstoffketten-Polymere, Siliciumketten-Polymere, Polymerlegierungen, geschichtete Polymerverbundstoffe, ineinandergreifende Polymermaterialien, Keramiken, Controlled Pore Glass, als Sol-Gele gebildete Materialien, als Aerogele gebildete Materialien, Agarose, Acrylamide, als Hydrogele gebildete Materialien, poröser Graphit, Tone oder Zeolithe, jedoch nicht darauf beschränkt. Besonders bevorzugt sind Polymere vom Netztyp, gebildet aus Acrylamid und Vernetzern, umfassend Triethylenglykoldiacrylat, Tetraethylenglykoldiacrylat und N,N'-Methylenbisacrylamid.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Elektrophoreseelektroden und/oder Kanäle Materialien, die keine herkömmlichen Permeationsschichtmaterialien, sondern eher Leitermaterialien sind, insbesondere elektropolymerisierbare Polymere. In dieser Ausführungsform werden die Elektrophoreseelektroden durch Polymerisieren eines Polymers auf die Oberfläche der Elektrophoreseelektrode hergestellt. Ein Vorteil dieser elektropolymerisierbaren Materialien ist, dass die Dicke des polymerisierten Materials gesteuert und geändert werden kann; es können beispielsweise eine einzelne Monoschicht eines Materials oder Schichten mit einer Dicke von mehreren Mikrometern hergestellt werden. Weiters ist es möglich, das Polymer äußerst exakt auf der Oberfläche der Elektrophoreseelektrode zu lokalisieren.
  • Geeignete elektropolymerisierbare Monomere umfassen Pyrrole (die in einer Polypyrrolschicht resultieren; siehe Brajter-Toth, Anal. Chem. 66, 2.458–2.464 (1994)), Anilin (das in einer Polyanilinschicht resultiert), Phenol (das in einer Polyphenolschicht resultiert), Azulene, Pyrene und Carbazole (siehe Hino et al., Synthetic Metals 64, 259 (1994)), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ein besonders bevorzugtes Material ist Polypyrrol, da es gewisse interessante Eigenschaften hinsichtlich seiner Leitfähigkeit aufweist. Übermäßige Oxidation des Pyrrols kann das leitfähige Polymer in einen Isolator umwandeln, der molekulare Erkennungseigenschaften aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können entweder Ionentrennungsmembrane oder Sol-Gel-Komponenten eingesetzt werden, um die Elektrophoreseelektroden abzuschirmen. Siehe Anal. Chem., 72, 1835 (2000). In dieser Ausführungsform können die Nucleinsäuren (oder andere Zielanalyte) tatsächlich in die Membran oder das Gel eindringen (z.B. werden sie gefangen oder gesammelt). Weiters kann darauf ein Pufferaustauschschritt erfolgen.
  • Das elektrische Feld wird zwischen der ersten und der zweiten Elektrophoreseelektrode erzeugt. Die Bezeichnungen „erste" und „zweite" sind im Wesentlichen austauschbar und erfüllen nicht den Zweck einer räumlichen Unterscheidung oder einer Unterscheidung hinsichtlich der Anordnung, obwohl im Allgemeinen, wie hierin verwendet, die erste Elektrode im Allgemeinen die räumlich der Detektionselektrode am nächsten liegende Elektrode ist (wenn zwei Elektrodensets eingesetzt werden) oder, alternativ dazu, die erste Elektrode im Allgemeinen als die Detektionselektrode abgebildet ist (wenn nur ein Elektrodenset eingesetzt wird). Fachleuten wird bekannt sein, dass beliebig viele mögliche Elektrophoreseelektroden-Anordnungen, wie aus den 1, 2 und 15 ersichtlich ist, eingesetzt werden können. Im Allgemeinen gibt es zwei Anordnungstypen: Massenelektrophorese und gerichtete Elektrophorese.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Massenelektrophorese-Anordnung eingesetzt. Das bedeutet, dass ein Set an Elektrophoreseelektroden, wie in den 1A, 1B und 1C im Allgemeinen dargestellt, eingesetzt wird. Die erste Elektrophoreseelektrode (10 in 1) ist im Allgemeinen größer als die Detektionselektroden und ist räumlich so angeordnet, dass die Detektionssonden innerhalb des durch die Elektrophoreseelektroden erzeugten elektrischen Feldes liegen. Durch Anlegen einer Gleichstromspannung zwischen den Elektroden wird ein elektrisches Feld erzeugt, sodass der elektrophonetische Transport der geladenen Zielanalyte in die Nähe der Detektionssonden hin durchgeführt wird. Während dies nicht unbedingt zur direkten Platzierung der Zielanalyte auf die Detektionssonden führt, erhöht das Herabsetzen der tatsächlichen Diffusionsdistanz und das Erhöhen der tatsächlichen Konzentration an der Detektionsoberfläche signifikant die Kinetik des Zielanalyts, der sich an den Einfangbindungsliganden an der Oberfläche der Detektionssonde bindet, da Diffusion im Wesentlichen auf einer zweidimensionalen Fläche stattfinden muss und nicht in einem dreidimensionalen Raum.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine gerichtete Elektrophoreseanordnung eingesetzt, wie sie im Allgemeinen in den 1D, 1E und 1F dargestellt wird. In dieser Ausführungsform gibt es eine Vielzahl an Elektrophoreseelektroden, die eingesetzt werden, um den Analyt spezifisch auf eine spezifische Detektionselektrode, sehr häufig, doch nicht immer, in Sets, auszurichten. Dies kann auf eine von zwei grundlegende Arten durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, wie sie im Allgemeinen in 1F dargestellt wird und deren Komponenten im US-Patent Nr. 5.605.662 beschrieben werden, hat jede Detektionselektrode eine mit ihr verbundene Elektrophoreseelektrode. So können durch jedes aufeinander folgendes oder gleichzeitiges Anlegen einer Spannung zwischen den Elektrophoreseelektrodensets die Zielanalyte von einer Detektionselektrode zu einer anderen bewegt werden. Unter der Annahme eines negativ geladenen Zielanalyts wie Nucleinsäure kann das System unter Einsatz des in 1F dargestellten Systems folgenden Ablauf aufweisen. In einer Ausführungsform wird ein elektrisches Feld zwischen Anode 50 und Elektrophoreseelektrode 10 erzeugt, die als Kathode dient, um das anionische Zielanalytgemisch hinunter zur Elektrophoreseelektrode 10 und so zur Detektionselektrode 20 zu bringen, wobei hierbei eine Spezies des Zielanalytgemischs gebunden werden kann. Das elektrische Feld wird dann ausgeschaltet, und ein neues elektrisches Feld wird zwischen der Elektrophoreseelektrode 10, die nun als eine Anode dient, und der Elektrophoreseelektrode 11, die als eine Kathode dient, angelegt. Dies führt die nicht gebundene, anionische Spezies von 10 nach 11, wobei eine zweite Spezies des Zielanalyts gebunden werden kann. Das elektrische Feld wird abgeschaltet, und ein neues Feld wird zwischen 11 (die als Anode dient) und 12 (die als Kathode dient) erzeugt, um nicht gebundene Zielanalyte zu einer neuen Detektionselektrode zu bewegen, usw. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Wesentlichen die gesamte Zielanalytpopulation zu jedem Einfangliganden transportiert wird und so die Anzahl der Zielanalyte, die eine Gelegenheit bekommen, sich an ihre Einfangliganden zu binden, maximiert wird.
  • Alternativ dazu kann die Elektrophorese an jeder Einlage gleichzeitig erfolgen, wobei ein elektrisches Feld zwischen der Anode 50 (unter Annahme einer negativ geladenen Zielanalytpopulation) und Kathoden 10, 11, 12 und 13 erzeugt wird. Dies beschleunigt das Verfahren, resultiert jedoch (bei beispielsweise vier Einlagen) darin, dass nur ein Viertel des Zielanalyts an jeder Detektionselektrode „vorhanden" ist. Dies kann in bestimmten Ausführungsformen erwünscht oder nicht erwünscht sein; beispielsweise wenn Geschwindigkeit eher als Empfindlichkeit von Bedeutung ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein ähnlicher, jedoch anderer Typ gerichteter Elektrophorese durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird eine Vielzahl an Sets von Elektrophoreseelektroden in einer dreidimensionalen Anordnung platziert, um das Bewegen der Zielanalyte zu den unterschiedlichen Stellen zu ermöglichen. Wie in 2 dargestellt ist, ermöglicht beispielsweise der Einsatz einer dreidimensionalen Anordnung von Elektrophoreseelektroden das Platzieren der Probelösung an bestimmten Stellen, d.h. an individuellen Detektionselektroden oder Detektionselektrodensets. So kann beispielsweise, wie aus 2 ersichtlich, elektrophoretische Spannung zwischen Elektrophoreseelektroden 10 und 15 angelegt werden, und Elektrophoreseelektroden 12 und 17 können zugleich den Zielanalyt zur Detektionselektrode 20 hinführen.
  • Alternativ dazu wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Vielzahl an Elektrophoreseelektroden eingesetzt, nicht zur spezifischen Ausrichtung auf eine bestimmte Stelle, sondern eher, um die Bindungskinetik durch „Vermischen" oder „Rühren" der Probe in der Nähe der Detektionselektrode mit ihrem verbundenen Einfangliganden zu erhöhen. Wie in 2 dargestellt kann beispielsweise ein anfänglicher Elektrophoreseschritt zwischen Elektrophoreseelektrode 18 und einer nicht abgebildeten zweiten Elektrophoreseelektrode durchgeführt werden, um die Zielanalyte an die Detektionssondenoberfläche zu führen, d.h. es erfolgt „Massenelektrophorese" ge mäß der obigen Definition. Anschließend können Spannungen, entweder Gleichstrom- oder Wechselstromspannungen, Impulse von jedem umfassend, zwischen den zusätzlichen Sets von Elektrophoreseelektroden angelegt werden, um den Zielanalyt zu transportieren, um sowohl die Verfügbarkeit als auch die Bindungskinetik der Zielanalyte gegenüber den an den Detektionselektroden immobilisierten Einfangbindungsliganden zu steigern. Dem ähnlich können, wie in 15E dargestellt, unter Einsatz von zwei Elektrophoreseelektrodensets zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Zielanalyte zur Detektionssondenoberfläche geführt werden.
  • Die Stärke des angelegten elektrischen Feldes wird durch eine Anzahl an Faktoren bestimmt, umfassend die erwünschte Dauer für die Elektrophorese, die Größe der Probe (d.h. die Distanz, die der Zielanalyt durchlaufen muss), die Zusammensetzung der Lösung (d.h. die Gegenwart oder Abwesenheit von elektroaktiven Ladungsträgern und deren Redoxpotentiale), die Zusammensetzung der Komponenten (d.h. die Stabilität bestimmter Komponenten der Erfindung gegenüber elektrochemischem Potential), die Gegenwart oder Abwesenheit von elektroaktiven Ladungsträgern in Lösung, die Größe der Kammer, die Ladung des Zielanalyts, die Größe und Anordnung der Elektroden, das Elektrodenmaterial usw., jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Im Allgemeinen werden Gleichstromspannungen zur anfänglichen Elektrophorese angelegt, wobei Gleichstrom- oder Wechselstromimpulse oder -felder zum Vermischen angelegt werden, sofern zutreffend.
  • Die Stärke des angelegten Feldes hängt teilweise von den anderen Komponenten des Systems ab. Wird beispielsweise nur ein Elektrodenset eingesetzt und werden Thiolbindungen eingesetzt, um die Komponenten des Systems an die Detektionselektroden zu binden (d.h. die Anbindung von Passivierungsmitteln und leitfähigen Oligomeren an die Detektionselektrode, wie nachstehend im Detail beschrieben wird), so liegt die angelegte elektrophoretische Spannung unter dem Oxidationspotential der Thiolverbindungen, d.h. im Allgemeinen unter 1 V. Alternativ dazu können höhere Spannungen eingesetzt werden, wenn keine Thiolbindungen eingesetzt wer den. Dem ähnlich sind Thiolbindungen bei höheren Feldstärken annehmbar, sofern zwei Elektrodensets eingesetzt werden, d.h. sofern die empfindliche Chemikalien enthaltenden Detektionselektroden keiner hohen Spannung ausgesetzt werden.
  • So liegen im Allgemeinen die elektrophoretischen Spannungen im Bereich von 1 mV bis etwa 2 V, obwohl die erforderliche Spannung, wie Fachleuten sicherlich bekannt sein wird, von der erwünschten Ablaufzeit, der Nettoladung der Analyte, der Gegenwart oder Abwesenheit von Puffern, der Anordnung der Elektroden usw. abhängt. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, ist die elektrophoretische Geschwindigkeit μ(dΦ/dx), worin μ die Ionenbeweglichkeit ist. In Ausführungsformen mit einem Elektrodenset liegen die elektrophoretischen Spannungen im Bereich von etwa 50 mV bis etwa 900 mV, vorzugsweise von etwa 100 mV bis etwa 800 mV, besonders bevorzugt von etwa 250 mV bis etwa 700 mV. In Ausführungsformen mit zwei Elektrodensets liegen die elektrophoretischen Spannungen im Bereich von etwa 100 mV bis etwa 2 V oder höher, vorzugsweise von etwa 500 mV bis etwa 1,5 mV, und besonders bevorzugt von etwa 1 V bis etwa 1,5 V. Natürlich wird Fachleuten bekannt sein, dass diese Spannungen je nach Ladung des Analyts positiv oder negativ sein können.
  • Werden niedrige Spannungen eingesetzt, d.h. Spannungen unter 1,23 V (in Bezug auf eine Normalwasserstoffelektrode), der Spannung, bei der Wasserhydrolyse einsetzt, ist es notwendig, eine elektroaktive Spezies in die Lösung aufzunehmen, sodass der Strom von der Elektrode in die Lösung transportiert werden und durch die Lösung hindurch ein elektrisches Feld erzeugt werden kann. Typ und Konzentration der elektroaktiven Spezies variieren je nach Spannung, erforderlicher Dauer der Elektrophorese (die von der erforderlichen Distanz, d.h. dem Probenvolumen, abhängt), usw. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Redoxpotential der elektroaktiven Spezies höher als jenes der zur Detektion eingesetzten ETM. Wird beispielsweise ein elektroaktiver Ladungsträger mit einem Redoxpotential von 300 mV eingesetzt und hat die ETM ein Redoxpotential von 100 mV, so kann die Elektropho rese bei 300 mV mit anschließender Detektion bei 100 mV durchgeführt werden, ohne die elektroaktive Spezies entfernen zu müssen.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass eine große Vielzahl an geeigneten elektroaktiven Ladungsträgern eingesetzt werden kann, umfassend Eisenverbindungen, umfassend wässriges FeCl, Fe(CN)6 4–/3– und Ferrocen und seine Derivate; Rutheniumkomplexe, umfassend Ru(NH3)5pyr und Ru(NH3)5H2O; Cobaltkomplexe, umfassend Co(NH3)6 3+ Co(bpy)3 3+ und Co(tris)bpy3+; Osmiumkomplexe, umfassend Os(bpy)3 2+ und Os(tris)bpy und Derivate; Rheniumkomplexe, umfassend Rh(NH3)4Cl2; und Iod I3-, jedoch nicht darauf beschränkt. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, produzieren manche Redoxreaktionen Feststoffe (d.h. es gibt kein reversibles Paar). Im Allgemeinen sind diese Spezies nicht bevorzugt, obwohl sie in manchen Fällen eingesetzt werden können, wenn die Detektionselektrode die lösliche Reaktion ist. So kann beispielsweise eine Ag/AgCl-Reaktion mit Nucleinsäuren eingesetzt werden, da die AgCl-Reaktion an der Anode erfolgt. Die Konzentration der Redox-Moleküle variiert, wie Fachleuten bekannt sein wird, wobei Konzentrationen gleich oder unter der Sättigungskonzentration nützlich sind. Es gilt anzumerken, dass es in dieser Ausführungsform notwendig sein kann, das System während der Elektrophorese zu vermischen oder zu rühren, wenn ein elektroaktiver Ladungsträger eingesetzt wird.
  • Es gilt anzumerken, dass elektroaktive Ladungsträger in jedem System eingesetzt werden können, insbesondere in Matrixfeld-basierten Systemen, die Elektrophorese einsetzen. Elektroaktive Ladungsträger können beispielsweise in elektrophoretischen Anordnungssystemen, wie sie in den US-Patenten Nr. 5.532.129, 5.605.662, 5.565.322 und 5.632.957 beschrieben werden, und verwandten Anwendungen eingesetzt werden.
  • Die Probe wird in das elektrische Feld platziert, um elektrophoretischen Transport zu einer oder mehreren Detektionselektroden zu bewirken. Die Zusammensetzung der Detektionselektrode ist eine wie zuvor für die Elektrophoreseelektroden beschriebe ne, wobei Gold-, Silicium-, Kohlenstoff-, Platinelektroden und Metalloxidelektroden besonders bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Detektionselektroden auf einem Substrat gebildet. Weiters bezieht sich die hierin gegebene Erläuterung im Allgemeinen auf die Bildung von Goldelektroden, wobei jedoch Fachleuten bekannt sein wird, dass andere Elektroden ebenfalls eingesetzt werden können. Das Substrat kann eine Vielzahl an Materialien umfassen, wobei, wie Fachleuten bekannt sein wird, gedruckte Leiterplatten- (PCB-) Materialien besonders bevorzugt sind. So umfassen im Allgemeinen die geeigneten Substrate Fiberglas, Teflon, Keramiken, Glas, Silicium, Glimmer, Kunststoff (umfassend Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polycarbonat, Polyurethane, TeflonTM und Derivate davon usw.), GETEK (eine Mischung aus Polypropylenoxid und Fiberglas) usw., sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Im Allgemeinen umfassen bevorzugte Materialien gedruckte Leiterplattenmaterialien. Leiterplattenmaterialien sind jene, die ein isolierendes Substrat umfassen, das mit einer leitfähigen Schicht beschichtet und unter Einsatz von Litographieverfahren, besonders Photolithographieverfahren, verarbeitet wird, um die Muster von Elektroden und Verdrahtungen (auf dem Gebiet der Erfindung manchmal als Verbindungen oder Anschlussdrähte bezeichnet) zu bilden. Das isolierende Substrat ist im Allgemeinen, jedoch nicht immer, ein Polymer. Wie auf dem Gebiet der Technik bekannt kann eine oder eine Vielzahl an Schichten eingesetzt werden, um entweder „zweidimensionale" (d.h. alle Elektroden und Zwischenverbindungen in einer Ebene) oder „dreidimensionale" (worin sich die Elektroden an einer Oberfläche befinden und die Zwischenverbindungen durch die Platte auf die andere Seite hinauslaufen können) Platten herzustellen. Dreidimensionale Systeme werden oft unter Einsatz von Bohren oder Ätzen gebildet, gefolgt von Galvanisieren mit einem Metall wie Kupfer, sodass die durch die Platte verlaufenden Zwischenverbindungen hergestellt werden können. Leiterplattenmaterialien werden oft mit einer bereits am Substrat angebrachten Folie, z.B. einer Kupferfolie, versehen, wobei zusätzliches Kupfer, sofern erfor derlich, beispielsweise beim Galvanisieren, zugesetzt wird (beispielsweise als Zwischenverbindungen). Die Kupferoberfläche kann dann aufgeraut werden müssen, beispielsweise durch Ätzen, um das Haften der Klebeschicht zu ermöglichen.
  • In manchen Ausführungsformen ist Glas gegebenenfalls nicht als Substrat bevorzugt.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform Biochips (hierin manchmal als „Chips" bezeichnet) bereit, die Substrate umfassen, die eine Vielzahl an Elektroden, vorzugsweise Goldelektroden, umfassen. Die Anzahl der Elektroden ist wie in den verschiedenen Anordnungen dargelegt. Jede Elektrode umfasst vorzugsweise eine hierin erläuterte, sich selbst organisierende Monoschicht. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine der Monoschichten bildenden Spezies einen hierin beschriebenen Einfangliganden. Weiters hat jede Elektrode eine Zwischenverbindung, die an einem Ende an die Elektrode angebunden ist und schließlich an eine Vorrichtung angebracht wird, die die Elektrode steuern kann. Alle Elektroden sind somit unabhängig voneinander adressierbar.
  • Die Substrate können Teil einer größeren Vorrichtung sein, die eine Detektionskammer umfasst, die ein bestimmtes Volumen der Probe gegenüber der Detektionselektrode aussetzt. Im Allgemeinen liegt das Volumen der Detektionskammer im Bereich von etwa 1 nl bis 1 ml, vorzugsweise von etwa 10 μl bis 500 μl. Fachleuten wird bekannt sein, dass je nach Experimentbedingungen und Test kleinere oder größere Volumina eingesetzt werden können.
  • In manchen Ausführungsformen sind die Detektionskammer und die Elektrode Teil einer Kassette, die in eine elektronische Komponenten (Gleichstrom/Wechselstrom-Spannungsquelle, Amperemeter, Prozessor, Ableseanzeige, Temperatursteuerung, Lichtquelle usw.) umfassende Vorrichtung angebracht werden kann. In dieser Ausführungsform werden die Zwischenverbindungen von jeder Elektrode ausgehend so angebracht, dass beim Einfügen der Kassette in die Vorrichtung die Verbindungen zwischen den Elektroden und den elektronischen Komponenten hergestellt werden.
  • Detektionselektroden auf Leiterplattenmaterial (oder anderen Substraten) werden im Allgemeinen auf verschiedenste Arten hergestellt. Im Allgemeinen wird hochreines Gold eingesetzt, und dieses kann durch Vakuumabscheidungsverfahren (Sputtern oder Aufdampfen) oder Lösungsabscheidung (Galvanisierung oder stromlose Verfahren) auf einer Oberfläche abgeschieden werden. Ist das Galvanisieren abgeschlossen, so muss das Substrat anfänglich ein leitfähiges Material umfassen; Fiberglasleiterplatten werden oft mit einer Kupferfolie versehen. Häufig wird, je nach Art des Substrats, eine Kleberschicht zwischen dem Substrat und dem Gold eingesetzt, um gute mechanische Stabilität sicherzustellen. So verwenden bevorzugte Ausführungsformen eine Abscheidungsschicht eines Haftmetalls wie Chrom, Titan, Titan/Wolfram, Tantal, Nickel oder Palladium, die wie zuvor das Gold abgeschieden werden können. Wird galvanisiertes Metall (entweder das Haftmetall oder das Elektrodenmetall) eingesetzt, so können Kornverfeinerungszusätze, im Handel häufig als Aufheller bezeichnet, gegebenenfalls zugesetzt werden, um die Oberflächenabscheidungseigenschaften zu verändern. Bevorzugte Aufheller sind Gemische aus organischen und anorganischen Spezies, wobei Cobalt und Nickel bevorzugt sind.
  • Im Allgemeinen weist die Haftschicht eine Dicke von etwa 100 Å bis etwa 25 μm (1.000 Mikrozoll) auf. Ist das Haftmetall elektrochemisch aktiv, so muss das Elektrodenmetall mit solch einer Dicke beschichtet werden, dass dies „Durchbluten" vermeidet; ist das Haftmetall nicht elektrochemisch aktiv, dann kann das Elektrodenmetall dünner sein. Im Allgemeinen wird das Elektrodenmetall (vorzugsweise Gold) mit einer Dicke im Bereich von 5001 bis etwa 5 μm (200 Mikrozoll), vorzugsweise im Bereich von etwa 30 Mikrozoll bis etwa 50 Mikrozoll, abgeschieden. Im Allgemeinen wird das Gold abgeschieden, um die Elektroden in einen Durchmesserbereich von etwa 5 μm bis etwa 5 mm, vorzugsweise von etwa 100 bis 250 μm, zu bringen. Die so gebildeten Detektionselektroden werden dann vorzugsweise gereinigt, und SAM werden wie oben erläutert zugesetzt.
  • So stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Substraten bereit, die eine Vielzahl an Goldelektroden umfassen. Die Verfahren umfassen erstens das Beschichten eines Substrats mit einem Haftmetall wie Nickel oder Palladium (gegebenenfalls mit Aufheller). Galvanisieren ist bevorzugt. Das Elektrodenmetall, vorzugsweise Gold, wird dann auf das Haftmetall aufgeschichtet (wobei wiederum Galvanisieren als Verfahren bevorzugt ist). Dann werden die Muster der Vorrichtung, umfassend die Elektroden und die damit verbundenen Zwischenverbindungen, unter Einsatz von Litographieverfahren, insbesondere Photolithographieverfahren, wie sie auf dem Gebiet der Technik bekannt sind, und durch nasschemisches Ätzen hergestellt. Häufig wird ein nicht leitendes, chemisch resistentes, isolierendes Material wie Lötmaske oder Kunststoff unter Einsatz dieser Photolithographieverfahren abgelegt, wodurch nur die Elektroden und eine Verbindungsstelle zu den Zwischenverbindungen frei zugänglich bleiben; die Zwischenverbindungen selbst sind im Allgemeinen beschichtet.
  • Die Verfahren setzen mit der Zugabe von SAM fort. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Tropfablagerungsverfahren eingesetzt, um die erforderlichen Chemikalien zuzusetzen, d.h. die die Monoschicht bildenden Spezies, von denen eine vorzugsweise eine einen Einfangliganden umfassende Spezies ist. Tropfablagerungsverfahren werden bekanntlich eingesetzt, um „Fleck"-Anordnungen zu gestalten. Dies wird gemacht, um jeder Elektrode eine unterschiedliche Zusammensetzung zuzusetzen, d.h. um eine Anordnung zu errichten, die verschiedene Einfangliganden umfasst. Alternativ dazu können die SAM-Spezies für jede Elektrode dieselben sein, und dies kann durch Einsatz eines Tropfablagerungsverfahren oder durch Eintauchen des gesamten Substrats oder einer Oberfläche des Substrats in die Lösung erreicht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das System so angeordnet, dass der Fluss der Probe an den Detektionselektroden vorbei maximiert wird. Wie in 15 im Allgemeinen dargestellt, gibt es zahlreiche Möglichkeiten, dies zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Detektionselektroden auf einem Substrat verteilt, das in sich Kanäle oder Poren aufweist (diese können hierin auch als Löcher oder Durchgänge bezeichnet werden). Die Elektrophoreseelektroden werden an der gegenüberliegenden Seite dieses Substrats angebracht. Das Anlegen des elektrischen Feldes führt zur Bewegung der Probe durch die Detektionselektrode oder an ihr vorbei und führt somit zu besserer Hybridisierungskinetik.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die Anordnung der Elektrophoreseelektroden variieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Detektionselektroden und zumindest eine Elektrophoreseelektrode an der ersten Oberfläche des Substrats angebracht, und zumindest eine zweite Elektrophoreseelektrode ist an der zweiten Oberfläche des Substrats angebracht (wobei hierbei von einem im Allgemeinen ebenen Substrat ausgegangen wird; Fachleuten wird bekannt sein, dass andere Anordnungen auch möglich sind). Alternativ dazu können die Oberflächen der Detektionskammer die Elektrophoreseelektroden umfassen; das bedeutet, dass es möglich ist, diese Elektroden vom Substrat weg, aber auf anderen Seiten des Substrats anzubringen; Weiters kann eine Vielzahl an Elektrophoreseelektroden, wie sie hierin im Allgemeinen beschrieben sind, eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Kanäle mit einem Material gefüllt, das das Passieren von Ionen zur Durchführung der Elektrophorese zulässt, das jedoch nicht für den Zielanalyt permeabel ist. Die Kanäle können beispielsweise mit einem hierin definierten Permeationsschichtmaterial gefüllt sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Membran an ein Ende oder beide Enden des Kanals platziert, und nicht ein Gel-artiges Material verwendet. Diese Membran ermöglicht vorzugsweise die Bewegung der Ionen, um die Elektrophorese durchzuführen, lässt jedoch den Zielanalyt nicht durchdringen, wodurch die Zielanalyte in der Nähe der Detektionselektroden konzentriert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Hybridisierungsbeschleunigung durch eine Kombination der Anordnung des Systems und eines absorbierenden Materials erreicht. In dieser Ausführungsform, die im Allgemeinen in 16 dargestellt ist, weist die Detektionskammer zwei Unterkammern auf, die im Allgemeinen durch eine Größenausschluss-Trennwand wie eine Gelmatrix oder eine Membran getrennt sind. Eine Kammer umfasst den Einlasskanal zur Einführung der Probe und umfasst die Detektionselektrode. Die andere Kammer umfasst ein absorbierendes Material, üblicherweise im trockenen Zustand, das die wässrige Lösung der Probe absorbieren kann (obwohl in gewissen Fällen die Probe in einer organischen Phase vorliegen kann und das absorbierende Material so die Lösungen der organischen Phasen absorbiert).
  • So wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Größenausschlusstrennwand eingesetzt. Unter „Größenausschlusstrennwand" wird hierin ein Material bezeichnet, das Komponenten aufgrund ihres Molekulargewichts ausschließt. So werden beispielsweise auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Gelmatrizes (so wie hierin im Zusammenhang mit Permeationsschichten erläutert, wie z.B. Acrylamid, Agarose usw.) oder Größenausschluss-Cutoff-Membrane eingesetzt. In manchen Ausführungsformen, insbesondere, wenn der Zielanalyt ein großes Molekulargewicht im Vergleich zu anderen kontaminierenden Komponenten des Systems aufweist, kann der Molekulargewichts-Cutoff der Membran oder des Gels so gewählt werden, dass er auch einen Komplexitätsreduktionsschritt durchführt. Das bedeutet, dass Größenausschusstrennwände eingesetzt werden können, die das Durchdringen von durchschnittlicher mRNA zulässt, wenn beispielsweise ribosomale RNA der Zielanalyt ist. Dem ähnlich können Molekulargewichts-Cutoffs eingesetzt werden, die das Durchdringen von mRNA und fragmentierter DNA zulassen, wenn das Ziel große genomische DNA umfasst.
  • In dieser Ausführungsform wird beim Einführen der Probe die den Zielanalyt enthaltende wässrige Lösung von der Detektionskammer, die die Detektionselektrode umfasst, in die Absorptionskammer gezogen, wobei der Zielanalyt in der Detektions kammer konzentriert wird. So konzentriert eine Injektion von 1 ml Probe in eine Kassette, die eine 0,95-ml-Absorpitionskammer umfasst, den Zielanalyt in der Detektionskammer 20:1.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Detektionskammer und die Absorptionskammer durch Löcher oder Durchgänge im die Elektroden umfassenden Substrat getrennt, obwohl es in manchen Ausführungsformen möglich ist, die Detektionselektroden „auf" der Größenausschlusstrennwand anzubringen.
  • In dieser Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die Volumina jeder Kammer in der Kassette so einzustellen, dass Absorption leicht möglich ist. Das bedeutet, dass, wenn das Volumen der Detektionskammer dasselbe oder ein geringeres ist als das Probenvolumen, die Injektion der Probe in die Kammer nicht zur Absorption führen kann, wenn das absorbierende Material in getrocknetem, gelagerten Zustand vorliegt. Ist das Probenvolumen jedoch geringfügig größer als das der Detektionskammer, so kann das Injizieren der Probe in die getrennte Kammer zu erzwungenem „Benetzen" des absorbierenden Materials führen und somit die Reaktion durch Kapillarwirkung auslösen. So ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Volumen der Detektionskammer geringfügig kleiner als das Volumen der Probe, sodass das Fluid in die Absorptionskammer „gezwungen" wird.
  • Weiters ermöglicht der Einsatz einer Größenausschlusstrennwand eine Hybridisierungsbeschleunigung, die auf dem Volumen der Probe basiert. Das bedeutet, dass durch Einsatz einer Größenausschlusstrennwand wie einer Membran oder Gelmatrix ein großes Probenvolumen in die Detektionskammer eingeführt werden kann, wobei die wässrige Lösung durch die Größenausschlusstrennwand in die Absorptionskammer gezwungen wird. So wird beispielsweise eine fünffache Konzentration des Zielanalyts innerhalb des Probenvolumens erlangt, wenn das Probenvolumen 5 ml, das Detektionskammervolumen 1 ml und das Absorptionskammervolumen 4 ml ausmacht. Fachleuten wird bekannt sein, dass dies mit oder ohne Absorptionsmaterial in der Absorptionskammer durchgeführt werden kann. Wichtig in dieser Ausfüh rungsform ist, dass die Größenausschlusstrennwand den Zielanalyt daran hindert, aus der nahen Umgebung um die Detektionselektrode herum auszutreten. Weiters kann in manchen Ausführungsformen das Volumen der Probenkammer einzustellen sein; das bedeutet, dass beim Einführen der Probe die Probenkammer groß genug ist, um die gesamte Probe aufzunehmen. Da also die Probenlösung in die Absorptionskammer „hineingezogen" wird, nimmt das Volumen der Probenkammer beispielsweise durch Einsatz einer Membran oder einer flexiblen Dichtung ab. Auf diese Weise kann der konzentrierte Zielanalyt in der Nähe der Detektionselektrode gehalten werden.
  • Fachleuten ist bekannt, dass das System verschiedene Anordnungen aufweisen kann, was im Allgemeinen in 16 dargestellt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann das absorbierende Material in Verbindung mit Elektrophorese eingesetzt werden. Das bedeutet, dass, wie im Allgemeinen in 16 dargestellt ist, es eine Anzahl an Anordnungen gibt, die eingesetzt werden können, umfassend hierin erläuterte „vermischende" Anordnungen.
  • Weiters kann, wie in 13B dargestellt, das System so angeordnet werden, um zu ermöglichen, dass die Probe an einer Anzahl von Detektionselektroden, die entlang dem Elektrophoresekanal angeordnet sind, vorbeifließen kann. Das bedeutet, wie hierin erläutert, dass die die Probe aufnehmende Kammer so angeordnet werden kann, dass ein so großer Anteil der Probe wie möglich die Detektionselektroden kontaktiert.
  • Dem ähnlich verwendet eine bevorzugte Ausführungsform, wenn ein Zwei-Elektroden-System eingesetzt wird, eine poröse Detektionselektrode, die zwischen der ersten und der zweiten Elektrophoreseelektrode angeordnet ist, sodass das Ziel durch die Detektionselektrode „durchgehen" muss und dadurch der Kontakt des Zielanalyts und der Detektionselektrode maximiert wird. Mikroporöse Polycarbonatmembrane werden beispielsweise zur Elektronenmikroskopanalyse mittels Goldzer stäubung beschichtet. Alternativ dazu kann goldbeschichtetes Polyanilin eingesetzt werden. So können Goldelektroden mit sehr gleichförmiger Porengröße im Bereich von 0,01 bis 20 μm hergestellt werden. Dem ähnlich wurden Siliciumwafer mit 10-μm-Poren entwickelt, um als Gensensor eingesetzt zu werden, der das Einfangen der Zielsequenz um das 700fache verbessert. Durch Einstellen der Fließgeschwindigkeit, der Einlagenfläche, des Porendurchmessers, der Tiefe und der elektrophoretischen Parameter können praktisch 100 % des Zielanalyts in der Probe an die Detektionselektrode gebunden werden.
  • Es gilt ebenfalls anzumerken, dass zahlreiche elektrophoretische Schritte eingesetzt werden können; beispielsweise können die Komponenten des Systems nacheinander zugesetzt werden, wobei nach jedem Zusatz ein Elektrophoreseschritt durchgeführt wird, um die Reagenzien hinunter zur Detektionselektrode zu transportieren. Dem ähnlich kann Elektrophorese eingesetzt werden, um einen „Waschschritt" durchzuführen, worin überschüssige Reagenzien (nicht gebundene Zielmoleküle oder nicht gebundene zusätzliche Bindungsligandenkomponenten usw.) von der Detektionselektrode entfernt werden. So kann jede beliebige Kombination an Elektrophoreseschritten eingesetzt werden. Weiters kann die Dauer der Elektrophoreseschritte geändert werden.
  • Weiters können hierin erläuterte Elektrophoreseschritte mit anderen Verfahren zum Konzentrieren von Analyten an der Detektionselektrodenoberfläche kombiniert werden. Wie in 13 beispielsweise kann das System so angeordnet sein, dass die Probe vorbei an der Detektionselektrode in eine Richtung fließen kann, während der elektrophoretische Fluss in die andere Richtung ausgerichtet ist und so der Zielanalyt wirksam konzentriert wird, während andere Probenkomponenten (besonders ungeladene Komponenten oder Komponenten mit einer dem Analyt entgegengesetzten Ladung) „fortgewaschen" werden können. In dieser Ausführungsform wird die Stärke des elektrophoretischen Feldes auf Grundlage von Größe und Ladung des Targets eingestellt, sodass das Target relativ immobilisiert an der Detektionselektrode bleibt.
  • Weiters, wie Fachleuten sicherlich bekannt ist, ist es auch möglich, die die Probe aufnehmende Kammer so anzuordnen, dass die Hybridisierungsbeschleunigung maximiert wird. Beispielsweise kann die Kammer so angeordnet sein, dass die gesamte Probe dem Elektrophoresefeld ausgesetzt ist; dies kann auf verschiedene Arten geschehen; beispielsweise durch Einsatz unterschiedlicher Geometrien (dreieckig usw.), durch Überziehen einer oder mehrerer interner Oberflächen der Kammer mit Elektroden usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration des Zielanalyts durch zumindest ein Volumenausschlussmittel im Testreagenzgemisch erlangt. In dieser Ausführungsform konzentriert die Einbindung eines Volumenausschlussmittels, das Lösungsmittel und kleine Moleküle wie Ionen absorbieren kann, jedoch größere Moleküle wie Zielanalyte ausschließt, den Zielanalyt zu kleiner erscheinenden Volumina und senkt dadurch das wirksame Diffusionsvolumen, das der Zielanalyt erfährt, wodurch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass das Target einen Einfangliganden findet. Fachleuten wird bekannt sein, dass die Volumenausschlussmittel nicht unbedingt die Probe in der Nähe der Detektionselektrode konzentrieren muss; sie senken eher das wirksame Diffusionsvolumen, das der Zielanalyt erfährt oder in dem er liegt.
  • So umfassen die Verfahren der Erfindung die Zugabe von zumindest einem Volumenausschlussmittel zum Testgemisch. Fachleuten wird bekannt sein, dass dies zu jedem möglichen Zeitpunkt des Tests durchgeführt werden kann, auch im Rahmen eines Vorgemischs des Ausschlussmittels mit der Probe, vor der Zugabe der zusätzlichen Reagenzien (wie Markierungssonden usw.), vor der Zugabe des Ausschlussmittels mit einem oder mehreren Testreagenzien oder nach der Zugabe der Testreagenzien. Alternativ dazu kann die Detektionskammer im Vorhinein mit einem Volumenausschlussmittel ausgekleidet werden (z.B. mit Agarose, Sephadex, Sepharose, Polyacrylamid usw.), das in Gegenwart der Probe aufquillt. In manchen Ausführungsformen kann eine für den Zielanalyt undurchlässige Membran eingesetzt werden, um das Volumenausschlussmittel von der Detektionselektrode zu trennen. Dem ähnlich können andere Komponenten des Systems mit quellbaren Volumenaus schlussmittel beschichtet werden, wie beispielsweise die hierin beschriebenen magnetischen Teilchen. Im Allgemeinen ist die Zugabe des Mittels zu den anderen Reagenzien vorzuziehen. Wurde es zugegeben, so wird im Allgemeinen ein Inkubationsschritt, wie er Fachleuten bekannt ist, durchgeführt.
  • Geeignete Volumenausschlussmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Dextran, Dextransulfat, Chonchritinsulfat, Polyethylenglykol, Polysulfonat, Heparinsulfat, Hespan, hochmolekulare Nucleinsäure usw., sind jedoch nicht darauf beschränkt. Siehe beispielsweise Amasino, Anal. Chem. 152, 304 (1986); Wetmur, Biopolymers 14, 2517 (1975); Renz et al., Nucl. Acid Res. 12, 3435 (1984); Wahl et al., PNAS USA 75, 3683 (1979); und Gingeras et al., Nucl. Acid Res. 15, 5373 (1987). Darüber hinaus, wie Fachleuten bekannt ist, können auch Gemische dieser Mittel eingesetzt werden. Es gilt anzumerken, dass, während der Volumenausschluss ein Konzentrationsschritt ist, das Volumenausschlussmittel jedoch ebenfalls als ein Hybridisierungsbeschleuniger, wie unten beschrieben, betrachtet werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration des Zielanalyts durch Ausfällen des Zielanalyts erreicht. Dies ist bei Nucleinsäuren besonders wirksam. Wie bereits gezeigt wurde, kann das Ausfällen von Nucleinsäuren die Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 50- bis 100fache erhöhen; siehe dazu as EP 0.229.442 A1 . Wie zuvor gezeigt ist das Ausfällen ein Konzentrationsschritt, wobei das Fällungsmittel wie unten erläutert als ein Hybridisierungsbeschleuniger betrachtet werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bedingungen ausgewählt, die doppelsträngige Nucleinsäure ausfällen, einzelsträngige Nucleinsäure jedoch nicht, da dies zu einer starken Antriebskraft führt und nicht spezifische Verluste auf ein niedriges Niveau reduziert.
  • Geeignete Fällungsmittel für Nucleinsäure umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Salze, die zumindest eine der stärker aussalzenden Kation- oder Aniongruppen enthalten (umfassend die Alkalimetallsalze und Ammoniumsalze von SO4, PO4, Li und COOH); organische Verbindungen, die mit der Reaktionslösung mischbar sind und Ausfäll- oder Aussalzeigenschaften aufweisen, umfassend Detergens (siehe Pontius et al., PNAS USA 88, 8237 (1991), Dihydroxybenzol, Sarkosyl (N-Laurosarcosinnatriumsalz), Natriumdodecylsulfat, Natriumdiisobutylsulfosuccinat und Natriumtetradecylsulfat. Geeignete Konzentrationen von jedem Mittel werden in den aufgenommenen Verweisen beschrieben. Es gilt anzumerken, dass bei manchen Ausführungsformen, wie unten erwähnt, Detergenzien nicht wirklich die Nucleinsäure ausfällen müssen, sondern eher als Hybridisierungsbeschleuniger zugesetzt werden.
  • Weiters, wie in der Elektrophorese 0.229.442 A1 beschrieben wird, können zusätzliche Reagenzien zugesetzt werden, umfassend EGTA, EDTA, SDS, SK, PK, EtOH, Harnstoff, Guanidin HCl, Glykogen und verdünntes Amphyl, jedoch nicht darauf beschränkt. Weiters können bekannte Konzentrationen von Mitteln, die zumindest eine Nucleinsäure denaturieren, wie Alkohol zugesetzt werden.
  • Wie zuvor erläutert kann der Zusatz des Nucleinsäure ausfällenden Mittels zu jedem möglichen Zeitpunkt des Tests durchgeführt werden, einschließlich beim Vorgemisch des Mittels mit der Probe, vor der Zugabe der zusätzlichen Reagenzien (wie Markierungssonden usw.), der Zugabe des Mittels zu einem oder mehreren Testreagenzien oder nach der Zugabe der Testreagenzien. Im Allgemeinen wird der Zusatz des Mittels mit den anderen Testreagenzien bevorzugt. Ist das Mittel einmal zugesetzt, wird wiederum ein Inkubationsschritt, wie er Fachleuten bekannt ist, durchgeführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration durch Einbinden von zumindest zwei Reagenzien, die zwei trennbare Lösungsphasen bilden, erreicht, sodass der Zielanalyt in einer der Phasen oder an der Grenzfläche konzentriert wird. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann ein Analyt aus einer Phase in eine andere geführt und dadurch in einer Phase konzentriert werden, wenn eine Probe zwei trennbaren Lösungsphasen ausgesetzt wird, oder unter gewissen Umständen kann die Konzentration auch an der Grenzfläche zwischen den zwei Phasen auftreten. Siehe beispielsweise Albertsson et al., Biochimica et Biophysica Acta 103, 1–12 (1965), Kohne et al., Biochem. 16(24), 5329 (1977), Müller, Partitioning of Nucleic Acids, Kap. 7, in: Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic Press (1985), und Müller et al., Anal. Biochem. 118, 269 (1981). Durch Konfigurieren des Probenvolumens, des Volumens jeder Phase, der Detektionselektrodenkammer und der Position der Detektionselektrode kann eine gute Konzentration an der Elektrode erlangt werden. Wie in Müller, Partitioning of Nucleic Acids, Kap. 7, in: Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic Press (1985), und Albertsson (s.o.) gezeigt wird, wird das Trennen durch die Elektrolytzusammensetzung durchgeführt, umfassend die Ionenstärke und die Arten der Ionen, Polymerkonzentration, Größe der Nucleinsäuren, die Struktur und/oder Komplexität der Nucleinsäuren und die Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter Liganden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Liganden in die Trenngemische eingeschlossen werden, um das Trennen durchzuführen. Wie in beiden Literaturverweisen von Müller et al. gezeigt wird, kann die Einbindung von Liganden, die sich an Nucleinsäuren binden, zur Trennung führen. So kann beispielsweise der Einsatz von Nucleinsäure bindenden Farbstoffen, die kovalent an Heteroalkyketten wie PEG gebunden sind, die Trennungskoeffizienten stark ansteigen lassen. Siehe Müller et al., Anal. Biochem. 118, 269 (1981), Müller et al., Anal. Biochem. 118, 267 (1981); und Müller et al., Eur. J. Biochem. 128, 231 (1982).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Phenolemulsionsreassozüerungsverfahren (phenol emulsion reassociation technique, PERT) wie in Kohne et al. (s.o.) beschrieben, durchgeführt. In dieser Ausführungsform werden Phenol und Wasser (oder andere wässrige Lösungen) in richtigen Verhältnissen zugesetzt und geschüttelt oder gerührt, wodurch sich eine Emulsion bildet. Wird das Schütteln abgebrochen, so bricht die Emulsion, und es bilden sich zwei Phasen. Der Zusatz von einzelsträngiger Nucleinsäure und Salz zur wässrigen Phase führt zu äußerst schneller Bildung von Hybriden. Wie in Kohne (s.o.) erläutert, hängt die Geschwindigkeit der Nucleinsäurehybridisierung von (a) der Gegenwart der Emulsion; (b) dem Typ und der Konzentration der Ionen; (c) einer geeigneten Inkubationstemperatur; (d) dem geeigneten pH; (e) der Geschwindigkeit und Art des Schüttelns der Emulsion; (f) der Menge des vorhandenen Phenols; (g) der Fragmentgröße der Nucleinsäure; (h) der Komplexität der Nucleinsäure; und (i) der Konzentration der Nucleinsäure ab.
  • Weiters ist das Trennverfahren auch für Proteine bekannt; siehe Gineitis et al., Anal. Biochem. 139, 400 (1984).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahrensschritte des Volumenausschlusses und des Trennens gleichzeitig durchgeführt werden. Dextran (3–8 %) und PEG (3,5–6 %) können beispielsweise vermischt werden und getrennte Phasen bilden. Veränderungen im Verhältnis von Kationen oder Anionen können hochmolekulare Nucleinsäuren von einer Phase in eine andere übertragen und die Bildung von Doppelsträngen induzieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Konzentrationsschritt unter Einsatz von Shuttleteilchen durchgeführt. Im Allgemeinen kann dieses Verfahren wie folgt beschrieben werden. Shuttleteilchen, die sich entweder durch Schwerkraft auf der Detektionselektrode absetzen (beispielsweise, wenn sich die Detektionselektrode am „Boden" der Kammer befindet) oder die induziert werden können, um sich mit der Detektionselektrode zu verbinden (beispielsweise durch Einsatz von magnetischen Teilchen), werden eingesetzt. Diese Shuttleteilchen umfassen Bindungsliganden, die sich an den Zielanalyt/die Zielanalyte in der Testlösung binden, die im Allgemeinen, jedoch nicht immer, nicht spezifisch sind, und führen dann die Zielanalyte zur Detektionselektrode, wo sie freigesetzt werden können, um sich an den Einfangbindungsliganden (direkt oder indirekt, wie unten erläutert) zu binden. Fachleuten ist bekannt, dass die Shuttlebindungsliganden vorzugsweise weniger stark mit dem Zielanalyt Wechselwirken als die Komponenten des Testkomplexes, d.h. als der Einfangbindungsligand. Das bedeutet, dass die Wechselwirkung mit den Shuttleteilchen schwach genug sein muss, um die Freisetzung der Zielanalyte zur Bindung an die Detektionselektrode zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure, und die Shuttleteilchen können auf verschiedene Arten angeordnet sein. In einem System umfassen die Shuttleteilchen im Allgemeinen kurze (d.h. 4 bis 10, obwohl sie je nach eingesetzter Temperatur auch länger sein können) Nucleinsäuresonden, die die Zielanalyte binden können. Diese können entweder spezifisch sein, d.h. kurze Sequenzen beinhalten, die für den betreffenden Zielanalyt/die Zielanalyte spezifisch sind, oder nicht spezifisch, d.h. zufällige Sonden sein, die die gesamte Nucleinsäure in der Probe an die Oberfläche bringen. Die Anbindung der Nucleinsäuren an die Teilchen ist bekannt; siehe beispielsweise U.S.S.N. 60/105.875 und Materialien von Chad Mirkin. Dem ähnlich können für Targets, die nicht Nucleinsäuren sind, Liganden mit variierenden Bindungsaffinitäten eingesetzt werden; ein schwach an ein Proteintarget bindender Antikörper beispielsweise kann an des Kügelchen gebunden sein, und ein Antikörper mit stärkerer Affinität kann als Einfangligand auf der Oberfläche dienen. Alternativ dazu können Lösungsänderungen eingesetzt werden, um die Übertragung vom Kügelchen zur Oberfläche anzutreiben.
  • Alternativ dazu können bei Nucleinsäuren und anderen Analyttypen, umfassend Proteine, die Teilchen modifiziert werden (beispielsweise durch Derivatisierung mit Amingruppierungen (wie Lysingruppierungen) oder Carboxygruppen), sodass sie eine Ladung zur elektrostatischen Wechselwirkung zwischen Target und Teilchen enthalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Shuttleteilchen, wiederum wenn die Zielanalyte Nucleinsäuren sind, Nucleinsäure bindende Komponenten enthalten, die entweder einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäuren binden. Beispielsweise sind Teilchen bekannt, die Interkalatoren enthalten; siehe das US-Patent 5.582.984, das hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen ist. Dem ähnlich können Teilchen, die einzelsträngige oder doppelsträngige Bindungsproteine enthalten, erzeugt werden. Befinden sich die Zielanalyte erst einmal an der Detektionsoberfläche, so können sie unter Einsatz bekannter Verfahren, umfassend Hitze, pH-Änderung, Salzänderungen usw., freigesetzt werden. Es gilt anzumerken, dass diese Teilchen Einsatz in Probenpräparaten finden können, da diese Teilchen den gesamten Zielanalyt binden können und so ermöglichen, dass die verbleibende Probe ausgewaschen oder entfernt wird oder dass die den Zielanalyt umfassenden Teilchen aus der Probe entfernt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Oberfläche der Elektrode oder des hierin beschriebenen Substrats verändert werden, um die Bindungsstärke zu erhöhen und/oder den wirksamen Diffusionsraum für den Zielanalyt zu reduzieren. Das bedeutet, dass das Reduzieren des Diffusionsraums von der Dreidimensionalität (Detektionskammer) zur Zweidimensionalität (Detektionsoberfläche) die Bindungskinetik signifikant erhöht. Diese Reduktion kann auf verschiedene Arten erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beispielsweise können die Endgruppen des SAM modifiziert werden, sodass sie elektrostatische Gruppen mit der dem Zielanalyt entgegengerichteten Ladung umfassen. So wird die Dauer, die ein spezifisches Zielmolekül braucht, um sich an die Oberfläche zu binden, erhöht, und Diffusion tritt vorzugsweise im zweidimensionalen und nicht im dreidimensionalen Bereich auf. So werden die Zielanalyte wirksam von der Diffusionsschicht über der Detektionsoberfläche entfernt, wodurch ein Gradient gebildet wird, der neue Zielanalyte hinunter in die Diffusionsschicht bringt. So können beispielsweise Passivierungsmittel mit kationischen Enden wie HS-CH2-NR3 + eingesetzt werden. Alternativ dazu kann das gesamte Substrat der Detektionskammer (d.h. der Bereiche um die individuellen Elektroden) mit schwach bindenden Liganden, die den hierin beschriebenen Shuttleteilchen ähnlich sind, beschichtet werden, wodurch ein Bindungsliganden-„Rasen" gebildet wird. Oligonucleotidsonden beispielsweise, die entweder spezifisch bindende Zielsequenzen oder relativ kurze, nicht spezifische Sequenzen sind, können an der Oberfläche eingesetzt werden. Bei der Bindung einer Zielsequenz an diese Oberflächensonden ermöglichen Diffusion über Gleichgewichtsbindung und Freisetzen zweidimensionale und nicht dreidimensionale Diffusion. In dieser Ausführungsform ist wichtig, dass die Wechselwirkung zwischen den Oberflächenliganden und den Zielanalyten schwächer ist als die der Einfangliganden, sodass die Zielanalyte vorzugsweise an die Einfangliganden binden. Dies kann im Fall von Nucleinsäu ren durch die Sondenlänge gesteuert werden; Einfangsonden sind im Allgemeinen länger als Oberflächensonden. Fachleuten wird bekannt sein, dass diese Verfahren alleine oder zusätzlich zu einem belibigen der anderen Beschleunigungsverfahren, die hierin erläutert sind, durchgeführt werden können.
  • Weiters, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, können Teilchen auch als „Mischteilchen" eingesetzt werden, die dazu dienen, die Lösung in der Nähe der Detektionselektrode zu rühren und so Hybridisierung zu erhöhen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindungsbeschleunigung durch gezieltes Anordnen des Systems, um die Menge des Zielanalyts zu maximieren, die sich in einer bestimmten Zeitspanne an die Detektionselektrode binden kann. Dies kann beispielsweise durch Vorbeifließen eines großen Volumens der Probe, die den Zielanalyt enthält, an der Detektionselektrode oder Aussetzen gegenüber dieser Detektionselektrode erfolgen, sodass sich die Zielanalyte mit hoher Wahrscheinlichkeit an die Detektionselektrode binden.
  • Demgemäß umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform die Verfahren das Vorbeifließenlassen der den/die Zielanalyt(e) enthaltenden Probe an einer Detektionselektrode, um Testkomplexe zu bilden. In dieser Ausführungsform entsteht die Konzentration des Zielanalyts durch ein großes Volumen der Probe, das mit der Detektionselektrode pro Zeiteinheit kontaktiert wird, wodurch auch die Bindungsdauer im Vergleich mit einer stillstehenden Probe gesenkt wird. So kann in einer bevorzugten Ausführungsform, wie zuvor im Zusammenhang mit Elektrophorese erläutert, die die Detektionselektrode umfassende Vorrichtung so angeordnet werden, dass die Probe an der Detektionselektrode vorbei- oder durch die Detektionselektrode durchfließt. So wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine poröse Elektrode wie eine Goldelektrode, wie zuvor erläutert, eingesetzt, die in einem Probenfließkanal angeordnet ist. Siehe beispielsweise die WO 95/11.755, die hierin durch Verweis aufgenommen ist. Die Probe kann, sofern erforderlich, darüber hinaus rezirkuliert werden. Rotierende Scheibenelektroden sind auch bevorzugt.
  • So sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Detektionselektrode und der umgebende Bereich so angeordnet, dass es zu einem Vermischen der Probe kommt, was dazu dienen kann, diese Diffusionsschicht zu stören und besseren Zugang zur Oberfläche zu schaffen. In einer Ausführungsform beispielsweise wird die Detektionselektrode in einem engen Probenkanal angeordnet: So ist die Detektionselektrode im Wesentlichen ein Band oder eine Zone rund um den Umfang des Kanals. Wiederum kann es, wie zuvor erwähnt, zur Rezirkulation kommen.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird die Detektionselektrode in Verbindung mit der Kammer so angeordnet, dass der Fluss der Probe an der Elektrode vorbei Vermischen oder Wirbelströmung der Probe verursacht. In einer Ausführungsform wird die Detektionselektrode im Verhältnis zur Kammer beispielsweise „abgesenkt" oder „vertieft", sodass der Fluss der Probe an der Elektrode vorbei Vermischen auslöst; siehe 13. Diese Wirkung kann durch Einbinden angehobener Oberflächen, die hierin manchmal als „Wehre" bezeichnet werden, an den Kanten der Elektroden (umfassend abgesenkte Elektroden) verstärkt werden, die zum Vermischen führen.
  • Zusätzlich zu oder anstelle von den hierin offenbarten Verfahren setzt eine bevorzugte Ausführungsform Teilchen als „Mischbällchen" ein. Als „Teilchen" oder „Mikroteilchen" oder „Nanoteilchen" oder „Kügelchen" oder „Mikrokügelchen" werden hierin mikropartikuläre Substanzen bezeichnet. Fachleuten wird bekannt sein, dass Teilchen je nach ihrem Einsatzbereich eine große Vielfalt an Materialien umfassen können, jedoch nicht darauf beschränkt sind: vernetzte Stärke, Dextrane, Cellulose, Proteine, organische Polymere, umfassend Styrolpolymere, umfassend Polystryrol und Methylstyrol sowie andere Styrol-Copolymere, Kunststoffe, Glas, Keramiken, Acrylpolymere, magnetisch ansprechende Materialien, Kolloide, Thoriumoxid-Sol, Kohlenstoffgraphit, Titandioxid, Nylon, Latex und Teflon können alle eingesetzt werden. „Microsphere Detection Guide" von Bangs Laboratories, Fishers, IN, ist ein hilfreicher Leitfaden. Bevorzugte Ausführungsformen setzen magnetische Teilchen, die nachstehend erläutert werden, ein. Darüber hinaus müssen in bestimmten Fällen die Mischteilchen nicht notwendigerweise mikropartikuläre Substanzen umfassen; bei spielsweise kann zum Schwerkraftmischen (d.h. zum Vermischen durch Schütteln der Vorrichtung) jede beliebige Komponente mit einer Dichte, die sich von jener der Probe unterscheidet, eingesetzt werden; Luftbläschen beispielsweise können als Mischteilchen eingesetzt werden.
  • In anderen Ausführungsformen können die Mischteilchen so ausgewählt werden, dass sie eine hohe Dielektrizitätskonstante aufweisen, sodass die Teilchen durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldgradienten, wie er unter Einsatz fokussierten Lichts oder eines divergierenden Hochfrequenzfeldes produziert werden könnte, bewegt werden können. Die Teilchen könnten in manchen Fällen auch diamagnetische Materialien enthalten. Solche Teilchen würden durch das Anlegen eines linearen magnetischen Feldes im Wesentlichen nicht beeinflusst werden, könnten jedoch durch Anlegen eines nichtlinearen magnetischen Feldes, wie es unter Verwendung eines nichtlinearen Magneten oder durch Einsatz eines großen linearen Magneten in Kombination mit kleinen ferromagnetischen oder paramagnetischen Einschlüssen in der Kammer angelegt werden kann, bewegt werden.
  • Die Größe der Teilchen hängt von ihrer Zusammensetzung ab. Die Teilchen müssen nicht kugelförmig sein; unregelmäßige Teilchen können eingesetzt werden. Weiters können die Teilchen porös sein, wodurch die Oberfläche der Teilchen, die zur Anbindung der Gruppierungen freisteht, vergrößert wird. Im Allgemeinen variiert die Größe der Teilchen je nach ihrer Zusammensetzung; magnetische Teilchen beispielsweise sind im Allgemeinen größer als Kolloidteilchen. So weisen die Teilchen einen Durchmesser im Bereich von 1–5 nm (Kolloide) bis 200 μm (magnetische Teilchen) auf.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die Teilchen zu jedem Zeitpunkt des Tests zugesetzt werden können, sowohl vor, während oder nach der Zugabe der Probe.
  • Die Teilchen helfen, die Probe zu rühren, um höhere Targetbindung zu bewirken. Dies kann auf zahlreiche Arten erreicht werden. Teilchen können beispielsweise in der Detektionskammer zugesetzt werden, und die gesamte Kammer oder Vorrichtung wird geschüttelt. In einer bevorzugten Ausführungsform können auf dem Gebiet der Erfindung bekannte, magnetische Mikroteilchen eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Teilchen ein magnetisches Teilchen oder ein Teilchen, das induziert werden kann, um magnetische Eigenschaften aufzuweisen. Unter „magnetisch" wird hierin verstanden, dass das Teilchen in einem magnetischen Feld, umfassend ferromagnetische, paramagnetische und diamagnetische Felder, angezogen wird. In dieser Ausführungsform weisen die Teilchen vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 0,001 bis etwa 200 μm, noch bevorzugter von etwa 0,05 bis etwa 200 μm, besonders bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 100 μm, und am meisten bevorzugt von etwa 0,5 bis 10 μm, auf.
  • In dieser Ausführungsform kann es bevorzugt werden, die Richtung und/oder Stärke des magnetischen Feldes zu variieren, beispielsweise mittels Elektromagneten, die um die Detektionskammer angeordnet werden, um die Kügelchen in zahlreiche verschiedene Richtungen zu bewegen. So kann der Einsatz von magnetischen Shuttleteilchen als Shuttle- und als Mischteilchen durch multiple Magnetfelder erreicht werden; hierbei bringt eines die Teilchen hinunter zur Detektionselektrode, und eines versetzt die Kügelchen an der Oberfläche der Detektionselektrode in Bewegung. Alternativ dazu können nicht magnetische Teilchen zugesetzt werden, um das zuvor erläuterte Vermischen durch Fließen zu steigern.
  • Die Größe der Mikroteilchen variiert, wie hierin bereits erwähnt. Bei Mikroteilchen mit 4,5 μm Durchmesser wurde beobachtet, dass sie in Lösung auf einem festen Träger relativ unberührt durch Diffusion bleiben, wobei in derselben Probe Teilchen mit 1,0 μm Durchmesser entfernt von der festen Oberfläche suspendiert bleiben und den Zwängen der Diffusion zu folgen scheinen. So können sich die großen Teilchen innerhalb der Diffusionsschicht freier bewegen, wenn diese mit einer Strömung kombiniert ist, um die Laminarströmung in eine turbulente Strömung umzuwandeln.
  • Weiters können die Teilchen chemisch verändert werden, beispielsweise mit Volumenausschlussmittel oder Hybridisierungsbeschleunigern, die hierin erläutert sind, um die Beschleunigungswirkungen zu kombinieren.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die zuvor erläuterten Shuttleteilchen auch in einer zweiten Funktion als Mischteilchen dienen können.
  • So stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die Detektionselektroden und Mischteilchen enthalten, sowie Verfahren zum Detektieren von Zielanalyten unter Einsatz dieser Zusammensetzungen bereit.
  • Weiters wird, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, als einer der geschwindigkeitsbestimmenden Schritte für das Einfangen des Targets an einer Oberfläche die Diffusion von Molekülen über die Grenzschicht in der Nähe der festen Schicht erwogen. Diese Grenzschicht scheint sich auch während des Flusses der Probe nicht gut zu vermischen. Diese Grenzschicht und ihre statistische Tiefe sind eine Funktion der Eigenschaften des Lösungsmittels, des Feststoffes und der gelösten Substanz. So kann ein Verändern dieser Parameter dazu dienen, die Grenzschicht „schrumpfen" zu lassen, die der Zielanalyt passieren muss, um die Oberfläche zu erreichen. Das Einstellen des organischen Gehalts der gelösten Substanz beispielsweise kann dem Analyt den Zugang zur Oberfläche leichter machen. Andere Parameter, die solch eine Wirkung hervorbringen können, sind Viskosität, Oberflächenladung, Sekundär- und Tertiärstruktur des Targets und Temperatur.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, sofern der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist, erfolgt die Bindungsbeschleunigung unter Einsatz eines Hybridisierungsbeschleunigers. In dieser Ausführungsform erfolgt das Binden des Zielanalyts an die Detektionselektrode in Gegenwart eines Hybridisierungsbeschleunigers. Wie hierin erläutert wird, gibt es zahlreiche Hybridisierungsbeschleuniger, die tatsächlich die Geschwindigkeit der Nucleinsäurehybridisierung steigern, umfassend Nucleinsäure bindende Proteine, Salze, mehrwertige Ionen und Detergenzien, jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hybridisierungsbeschleuniger ein Nucleinsäure bindendes Protein. Wie auf dem Gebiet der Erfindung gezeigt wurde, erhöhen bestimmte Proteine die Hybridisierungsgeschwindigkeit einzelsträngiger Nucleinsäuren; siehe Pontius et al., PNAS USA 87, 8403 (1990), und das US-Patent 5.015.569. hnRNP (A1 hnRNP) und recA sind beispielsweise dafür bekannt, die Annealing-Geschwindigkeit doppelsträngiger Nucleinsäuren zu erhöhen. Andere einzelsträngige Nucleinsäure bindende Proteine und große und kleine Furchen bindende Proteine können auch eingesetzt werden. Geeignete Bedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden darin erläutert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hybridisierungsbeschleuniger ein Salz. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt kann die Einbindungen hoher Konzentrationen an Salz die Hybridisierungsgeschwindigkeit erhöhen; siehe die EP 0.229.442 A1. Im Allgemeinen können Salzkonzentration bis hin zu etwa 2 M die Hybridisierungsgeschwindigkeit steigern. Geeignete Salze umfassen Natriumchlorid, Cäsiumchlorid, Natriumphosphat, Natriumperchlorat, Litiumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumbromid, Natriumsulfat und Ammoniumchlorid, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hybridisierungsbeschleuniger ein mehrwertiges Ion. Ionen höherer Wertigkeit wie Mg++ können die Affinität der Nucleinsäurestränge über elektrostatische Wechselwirkung verbessern und so die Hybridisierung beschleunigen. Weiters können diese mehrwertigen Ionen die Packung an der Oberfläche wirksam beeinflussen; das bedeutet, dass sich bei Steigerung der Nucleinsäuredichte an der Oberfläche eine negative Ladung sammelt, die folgendes Binden von mehr Nucleinsäure hemmt. So kann das Einbinden eines mehrwertigen Ions, das als eine „Salzbrücke" dient, auch zur Steigerung der Hybridisierung dienen. Mn++ kann eine ähnliche Wirkung erzielen.
  • Weiters wurde gezeigt, dass bestimmte Ionen wie Mg++ die Bindung in RNA durch ein anderes Verfahren verbessern können. RNA bildet Schleifen um Mg++-Ionen und findet eine stabile Sekundärstruktur, die mit Mg++ zusammenwirkt. Wird Mg++ entfernt, ändert die RNA ihre Struktur zu einer anderen, die ebenfalls stabil ist. Die Übergangsphase kann jedoch eine Phase gesteigerter Zugänglichkeit für ankommende Sonden sein. So können aufeinander folgende Zusatzdurchgänge von Mg++, gefolgt von EDTA oder ähnlichen Chelatoren, einen Kreislauf durch diese Übergangsphase bilden und so das Binden fördern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hybridisierungsbeschleuniger ein Detergens; siehe Pontius et al., PNAS USA 88, 8237 (1991). In diesem Fall können bestimmte Detergenzien die Hybridisierungsgeschwindigkeit um das 104-fache steigern. Geeignete Detergenzien umfassen kationische Detergenzien, umfassend Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und andere Varianten des quaternären Amins Tetramethylammoniumbromid (TMAB), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Alle der obigen Verfahren zielen darauf ab, die Menge an Zielanalyt, die zum Binden und zur Detektion an der Detektionselektrode innerhalb einer bestimmten Zeitspanne zugänglich ist, zu steigern. Die Detektionssysteme der vorliegenden Erfindung begründen sich auf der Einbindung einer Elektronenübertragungsgruppierung (ETM) in einen Testkomplex als Ergebnis des Bindens von Zielanalyten.
  • Im Allgemeinen gibt es zwei grundlegende Detektionsmechanismen. In einer bevorzugten Ausführungsform begründet sich die Detektion einer ETM auf Elektronentransfer durch übereinander angeordnete π-Orbitale doppelsträngiger Nucleinsäure. Dieser Grundmechanismus wird in den US-Patenten Nr. 5.591.578, 5.770.369, 5.705.348 und PCT US97/20.014 beschrieben und wird hierin als „Mechanismus-1" bezeichnet. Kurz zusammengefasst haben bisherige Forschungsarbeiten gezeigt, dass Elektronentransfer rasch über die übereinander angeordneten π-Orbitale doppelsträngiger Nucleinsäure und signifikant langsamer über einzelsträngige Nuclein säure erfolgt. Demgemäß kann dies als Grundlage für einen Test dienen. So kann durch Zugabe von ETM (entweder kovalent an einen der Stränge oder nicht kovalent an den Hybridisierungskomplex durch die Verwendung von nachstehend beschriebenen Hybridisierungsindikatoren) zu einer Nucleinsäure, die über ein leitfähiges Oligomer an eine Detektionselektrode gebunden ist, Elektronentransfer zwischen der ETM und der Elektrode durch die Nucleinsäure und das leitfähige Oligomer nachgewiesen werden. Diese allgemeine Idee ist in 3 dargestellt.
  • Dies kann umgesetzt werden, wenn der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist; alternativ dazu wird ein Zielanalyt eingesetzt, der keine Nucleinsäure ist, mit einem optionalen Einfangbindungsliganden (um den Zielanalyt an die Detektionselektrode zu binden) und einem Lösungsbindungsliganden, der einen Nucleinsäure-„Schwanz" trägt, der sich entweder direkt oder indirekt an eine Detektionssonde an der Oberfläche bindet, um die Detektion zu bewirken. Diese allgemeine Idee ist in 3C dargestellt.
  • Alternativ dazu kann die ETM nicht notwendigerweise mittels Elektronentransfer durch Nucleinsäure nachgewiesen werden, sondern eher direkt mittels leitfähiger Oligomere; dies bedeutet, dass sich die Elektronen der ETM nicht durch die übereinander angeordneten π-Orbitale fortbewegen müssen, um ein Signal zu erzeugen. Stattdessen kann die Gegenwart von ETM an der Oberfläche einer SAM, die leitfähige Oligomere umfasst, direkt nachgewiesen werden. Diese grundlegende Idee wird hierin als „Mechanismus-2" bezeichnet. So wird durch Binden eines Zielanalyts ein löslicher, bindender Ligand, der eine ETM umfasst, an die Oberfläche gebracht, und die Detektion der ETM kann fortschreiten. Die Rolle der SAM, die die leitfähigen Oligomere umfasst, ist es, die Elektrode von Lösungskomponenten abzuschirmen und die Menge nicht spezifischer Bindungen an die Elektroden zu reduzieren. Anders gesehen ist die Rolle des Bindungsliganden, Spezialität für den Zuwachs der ETM an die Oberfläche zu verleihen, wo sie mittels leitfähiger Oligomere mit elektronisch ausgesetzten Enden nachgewiesen werden können. Diese allgemeine Idee ist in den 4, 5 und 6 veranschaulicht.
  • So wird in jeder Ausführungsform, wie nachstehend noch weiter beschrieben wird, ein Testkomplex gebildet, der eine ETM enthält, die dann mittels der Detektionselektrode nachgewiesen wird.
  • Das vorliegende System findet einen besonderen Einsatzbereich in Anordnungsformaten, d.h. worin eine Matrix adressierbarer Detektionselektroden (hierin im Allgemeinen als „Einlagen", „Adressen" oder „Mikro-Stelle" bezeichnet) vorliegt. Unter „Anordnung" wird hierin eine Vielzahl von Einfangliganden in einem Anordnungsformat verstanden; die Größe der Anordnung hängt von der Zusammensetzung und dem letztlichen Einsatzgebiet der Anordnung ab. Anordnungen mit etwa 2 bis mehreren Tausend verschiedenen Einfangliganden können hergestellt werden. Im Allgemeinen umfasst die Anordnung, je nach der Größe der Elektroden und dem letztendlichen Einsatzgebiet der Anordnung, von zwei bis 100.000 oder sogar mehr. Bevorzugte Bereiche gehen von etwa 2 bis etwa 10.000, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 1.000, besonders bevorzugt von etwa 10 bis etwa 100. In manchen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung der Erfindung auch nicht in Anordnungsformat vorliegen; das heißt, dass in manchen Ausführungsformen auch einen einzelnen Einfangliganden umfassende Zusammensetzungen hergestellt werden können. Weiters können in manchen Anordnungen multiple Substrate eingesetzt werden, entweder aus unterschiedlichen oder gleichen Zusammensetzungen. So können beispielsweise große Anordnungen eine Vielzahl an kleineren Substraten umfassen.
  • Die Detektionselektrode umfasst eine sich selbst organisierende Monoschicht (SAM). Unter „Monoschicht" oder „sich selbst organisierende Monoschicht" oder „SAM" wird hierin eine relativ geordnete Anordnung von Molekülen verstanden, die spontan an einer Oberfläche chemisorbiert werden, worin die Moleküle eine bevorzugte Ausrichtung in Bezug aufeinander (z.B. Moleküle, die etwa parallel zueinander ausgerichtet sind) und eine bevorzugte Ausrichtung in Bezug auf die Oberfläche (z.B. etwa senkrecht darauf) aufweisen. Jedes der Moleküle umfasst eine funktionelle Gruppe, die an der Oberfläche anhaftet, und einen Abschnitt, der mit den benachbarten Molekülen in der Monoschicht wechselwirkt, um die relativ geordnete Anord nung zu bilden. Eine „gemischte" Monoschicht umfasst eine heterogene Monoschicht, d.h. eine Monoschicht, in der zumindest zwei verschiedene Moleküle die Monoschicht bilden. Die SAM kann leitfähige Oligomere alleine oder ein Gemisch von leitfähigen Oligomeren und Isolatoren umfassen. Wie hierin erläutert kann die Wirksamkeit der Zielanalytbindung (beispielsweise Oligonucleotidhybridisierung) gesteigert werden, wenn der Analyt in einer bestimmten Distanz zur Elektrode angeordnet ist. Dem ähnlich wird das nicht spezifische Binden von Biomolekülen, umfassend die Zielanalyte, an eine Elektrode im Allgemeinen reduziert, wenn eine Monoschicht vorhanden ist. So erleichtert eine Monoschicht das Halten des Analyts in gewisser Distanz zur Elektrodenoberfläche. Weiters dient eine Monoschicht dazu, fremde elektroaktive Spezies von der Oberfläche der Elektrode fernzuhalten. So hilft diese Schicht, elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden und den ETM oder zwischen der Elektrode und fremden elektroaktiven Spezien innerhalb eines Lösungsmittels zu unterbinden. Solch ein Kontakt kann zu einem direkten „Kurzschluss" oder einem indirekten Kurzschluss über geladene Spezies, die in der Probe vorhanden sein können, führen. Demgemäß ist die Monoschicht in einer Ausführungsform vorzugsweise dicht in einer gleichförmigen Schicht an der Elektrodenoberfläche gepackt, sodass ein Minimum an „Löchern" vorhanden ist. In dieser Ausführungsform dient die Monoschicht also als eine physische Barriere, um die Lösungsmittelzugänglichkeit zur Elektrode zu blockieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Monoschicht leitfähige Oligomere. Die Bezeichnung „leitfähige Oligomere" beschreibt hierin ein im Wesentlichen leitfähiges, vorzugsweise lineares Oligomer, von dem manche Ausführungsformen in der Literatur als „molekulare Drähte" bezeichnet werden. Unter „im Wesentlichen leitfähig" wird hierin verstanden, dass das Oligomer fähig ist, Elektronen bei 100 Hz zu übertragen. Im Allgemeinen weist das leitfähige Oligomer sich wesentlich überlappende π-Orbitale auf, d.h. konjugierte π-Orbitale wie zwischen den monomeren Einheiten des leitfähigen Oligomers, obwohl das leitfähige Oligomer auch eine oder mehrere Sigma- (σ-) Bindungen enthalten kann. Weiters kann ein leitfähiges Oligomer durch seine Fähigkeit, Elektronen in eine verbundene ETM zu injizieren oder aus einer verbundenen ETM aufzunehmen, definiert werden. Darüber hinaus ist das leitfähige Oligomer besser leitfähig als die hierin definierten Isolatoren. Weiters sind die leitfähigen Oligomere der Erfindung von elektroaktiven Polymeren zu unterscheiden, die selbst Elektronen abgeben oder aufnehmen können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die leitfähigen Oligomere eine Leitfähigkeit S von zwischen etwa 10–6 bis etwa 104 Ω–1cm–1 auf, vorzugsweise von etwa 10–5 bis etwa 103 Ω–1cm–1, wobei diese S-Werte für Moleküle im Bereich von etwa 20 Å bis etwa 200 Å berechnet werden. Wie nachstehend beschrieben weisen Isolatoren eine Leitfähigkeit S von etwa 10–7 Ω–1cm–1 oder weniger auf, wobei weniger als 10–8 Ω–1cm–1 bevorzugt sind. Siehe im Allgemeinen Gardner et al., Sensors and Actuators A 51, 57–66 (1995).
  • Erwünschte Eigenschaften eines leitfähigen Oligomers umfassen hohe Leitfähigkeit, ausreichende Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und/oder Wasser zur Synthese und Einsatz der Zusammensetzungen der Erfindung und vorzugsweise chemische Beständigkeit gegenüber Reaktionen, die i) während der Bindungsligandensynthese (d.h. Nucleinsäuresynthese, in der die die leitfähigen Oligomere enthaltenden Nucleoside während der Synthese der Zusammensetzung der Erfindung einem Nucleinsäuresynthesegenerator zugesetzt werden können), ii) während des Bindens des leitfähigen Oligomers an eine Elektrode oder iii) während der Bindungstests auftreten. Weiters sind leitfähige Oligomere, die die Bildung sich selbst organisierender Monoschichten fördert, bevorzugt.
  • Die Oligomere der Erfindung umfassen zumindest zwei monomere Untereinheiten, die hierin beschrieben werden. Wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, umfassen Oligomere Homo- und Hetero-Oligomere, einschließlich Polymere.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist das leitfähige Oligomer die in Struktur 1 abgebildete Struktur auf:
  • Struktur 1
    Figure 00580001
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass alle hierin abgebildeten Strukturen zusätzliche Atome oder Strukturen aufweisen können; d.h. dass das leitfähige Oligomer der Struktur 1 an ETM, wie z.B. Elektroden, Übergangsmetallkomplexe, organische ETM und Metallocene, und an Bindungsliganden, wie z.B. Nucleinsäuren, oder an einige von diesen gebunden sein kann. Sofern nicht anders angemerkt werden die hierin abgebildeten, leitfähigen Oligomere an der linken Seite an eine Elektrode gebunden; wie in Struktur 1 dargestellt ist das linke „Y" mit der hierin beschriebenen Elektrode verbunden. Ist das leitfähige Oligomer an einen Bindungsliganden anzubinden, so wird das rechte „Y", sofern vorhanden, an den Bindungsliganden wie eine Nucleinsäure entweder direkt oder über einen Linker, wie er hierin beschrieben wird, gebunden.
  • In dieser Ausführungsform ist Y eine aromatische Gruppe, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 50, g ist entweder 1 oder null, e ist eine ganze Zahl von Null bis 10, und m ist null oder 1. Ist g = 1, so ist B-D eine Bindung, die in der Lage ist, mit benachbarten Bindungen zu konjugieren (hierin als eine „konjugierte Bindung" bezeichnet), die vorzugsweise aus Acetylen, Alken, substituiertem Alken, Amid, Azo, -C=N- (umfassend -N=C-, -CR=N- und -N=CR-), -Si=Si- und -Si-C- (umfassend -C=Si-, -Si=CR- und – CR=Si-) ausgewählt sind. Ist g gleich null, so ist e vorzugsweise 1, D ist vorzugsweise Carbonyl oder eine Heteroatom-Gruppierung, worin das Heteroatom aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Silicium oder Phosphor ausgewählt ist. So umfassen geeignete Heteroatomgruppierungen -NH und -NR, sind jedoch nicht darauf beschränkt, worin R wie hierin definiert ist; substituierten Schwefel; Sulfonyl (-SO2-); Sulfoxid (-SO-); Phosphinoxid (-PO- und -RPO-); und Thiophosphin (-PS- und -RPS-). Ist jedoch das leitfähige Oligomer wie unten erläutert an eine Goldelektrode anzubinden, so werden Schwefelderivate nicht bevorzugt.
  • Unter „aromatischer Gruppe" oder hierin verwendeten grammatikalischen Entsprechungen wird eine aromatische monozyklische oder polyzyklische Kohlenwasserstoffgruppierung verstanden, die im Allgemeinen 5 bis 14 Kohlenstoffatome enthält (obwohl auch größere polyzyklische Ringstrukturen hergestellt werden können), sowie jedes beliebige carbozyklische Keton- oder Thioketonderivat davon, worin das Kohlenstoffatom mit der freien Valenz ein Glied eines aromatischen Rings darstellt. Aromatische Gruppen umfassen Arylengruppen und aromatische Gruppen mit mehr als zwei entfernten Atomen. Zum Zwecke dieser Anwendung umfasst aromatisch auch heterozyklische Verbindungen. „Heterozyklus" oder „Heteroaryl" bezeichnet eine aromatische Gruppe, worin 1 bis 5 der angegebenen Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom, ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Bor und Silicium, ersetzt sind, worin das Atom mit der freien Valenz ein Glied eines aromatischen Rings ist, und jegliches heterozyklische Keton- und Thioketonderivat davon. So umfasst Heterozyklus Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Pyrimidinyl, Oxalyl, Indolyl, Purinyl, Chinolyl, Isochinolyl, Thiazolyl, Imidozyl usw.
  • Es ist wichtig anzumerken, dass die aromatischen Gruppen Y des leitfähigen Oligomers unterschiedlich sein können, d.h. dass das leitfähige Oligomer ein Heterooligomer sein kann. Das bedeutet, dass ein leitfähiges Oligomer ein Oligomer eines einzigen Typs an Y-Gruppen oder zahlreicher Typen an Y-Gruppen umfassen kann.
  • Die aromatische Gruppe kann mit einer Substitutionsgruppe substituiert werden, die hierin im Allgemeinen als R dargestellt wird. R-Gruppen können, sofern erforderlich, zugesetzt werden, um die Packung der leitfähigen Oligomere zu beeinflussen, d.h. die R-Gruppen können eingesetzt werden, um die Verbindung der Oligomere in der Monoschicht zu verändern. R-Gruppen können auch zugesetzt werden, um 1) die Löslichkeit des Oligomers oder der Oligomer-hältigen Zusammensetzungen zu verändern; 2) die Konjugation oder das elektrochemische Potential des Systems zu verändern; und 3) die Ladung oder die Eigenschaften an der Oberfläche der Monoschicht zu verändern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, sofern das leitfähige Oligomer größer als drei Untereinheiten ist, werden R-Gruppen bevorzugt, um die Löslichkeit zu erhöhen, wenn Lösungssynthese durchgeführt wird. Die R-Gruppen und ihre Anordnung werden jedoch so gewählt, dass die Packung der leitfähigen Oligomere an der Oberfläche, insbesondere in einer Monoschicht, wie unten beschrieben, so geringfügig wie möglich beeinflusst wird. Im Allgemeinen werden nur kleine R-Gruppen innerhalb der Monoschicht eingesetzt, wobei größere R-Gruppen im Allgemeinen über der Oberfläche der Monoschicht angeordnet werden. So ist beispielsweise die Anbindung von Methylgruppen an den Abschnitt des leitfähigen Oligomers innerhalb der Monoschicht bevorzugt, um die Löslichkeit zu erhöhen, wobei längere Alkoxygruppen, beispielsweise C3 bis C10, vorzugsweise über der Monoschichtoberfläche angebunden werden. Im Allgemeinen bedeutet dies für die hierin beschriebene Systeme, dass die Anbindung von sterisch signifikanten R-Gruppen nicht an einer der ersten zwei oder drei Oligomer-Untereinheiten erfolgt, wobei dies wiederum von der mittleren Länge der die Monoschicht bildenden Moleküle abhängt.
  • Geeignete R-Gruppen umfassen Wasserstoff, Alkyl, Alkohol, aromatische Gruppen, Amino-, Amido-, Nitrogruppen, Ether, Ester, Aldehyde, Sulfonyl, Siliciumgruppierungen, Halogene, Schwefel-hältige Gruppierungen, Phosphor-hältige Gruppierungen und Ethylenglykole. In den hierin dargestellten Strukturen ist R Wasserstoff, wenn die Position nicht substituiert ist. Es gilbt anzumerken, dass manche Positionen auch zwei Substitutionsgruppen, R- und R', zulassen können, wobei die R- und R'-Gruppen entweder dieselben oder unterschiedliche sein können.
  • Unter „Alkylgruppe" oder hierin verwendeten grammatikalischen Entsprechungen wird eine unverzweigte oder verzweigte Alkylgruppe verstanden, wobei unverzweigte Alkylgruppen bevorzugt sind. Sind sie verzweigt, so können sie an einer oder mehreren Positionen, und sofern nicht anders festgelegt, auch an jeder beliebigen Position verzweigt sein. Die Alkylgruppe kann im Bereich von etwa 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen (C1–C30) liegen, wobei eine bevorzugte Ausführungsform etwa 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatome verwendet, wobei der Bereich von etwa C1 bis etwa C12 bis etwa C15 bevorzugt und der Bereich von C1 bis C5 besonders bevorzugt ist, obwohl in manchen Ausführungsformen die Alkylgruppe sehr viel größer sein kann. Die Definition einer Alkylgruppe umfasst auch Cycloalkylgruppen wie C5- und C6-Ringe und heterozyklische Ringe mit Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel oder Phosphor. Alkyl umfasst auch Heteroalkyl, wobei Heteroatome von Schwefel, Sauerstoff, Stickstoff und Silicium bevorzugt sind. Alkyl umfasst substituierte Alkylgruppen. Als „substituierte Alkygruppen" wird hierin eine Alkylgruppe bezeichnet, die weiters eine oder mehrere Substitutionsgruppierungen „R", wie zuvor definiert, umfasst.
  • Als „Aminogruppen" oder grammatikalischen Entsprechungen werden hierin -NH2-, -NHR- und -NR2-Gruppen bezeichnet, wobei R wie hierin definiert ist.
  • Als „Nitrogruppe" wird hierin eine -NO2-Gruppe bezeichnet.
  • Als „Schwefel-hältige Gruppierungen" werden hierin Verbindungen bezeichnet, die Schwefelatome enthalten, umfassend Thia-, Thio- und Sulfoverbindungen, Thiole (-SH und -SR) und Sulfide (-RSR-), jedoch nicht darauf beschränkt. Als „Phosphor-hältige Gruppierungen" werden hierin Verbindungen bezeichnet, die Phosphor enthalten, umfassend Phosphine und Phosphate, jedoch nicht darauf beschränkt. Als „Silicium-hältige Gruppierungen" sind hierin Verbindungen bezeichnet, die Silicium enthalten.
  • Unter „Ether" wird hierin eine -O-R-Gruppe verstanden. Bevorzugte Ether umfassen Alkoxygruppen, wobei -O-(CH2)2CH3 und -O-(CH2)4CH3 bevorzugt sind.
  • Unter „Ester" wird hierin eine -COOR-Gruppe verstanden.
  • Unter „Halogen" wird hierin Brom, Iod, Chlor oder Fluor verstanden. Bevorzugte substituierte Alkyle sind teilweise oder vollständig halogenierte Alkyle wie CF3 usw.
  • Unter „Aldehyd" wird hierin eine -RCHO-Gruppe verstanden.
  • Unter „Alkohol" werden hierin -OH-Gruppen und Alkylalkohole -ROH verstanden.
  • Unter „Amido" werden hierin -RCONH- oder RCONR-Gruppen verstanden.
  • Unter „Ethylenglykol" oder „(Poly)ethylenglykol" wird hierin eine -(O-CH2-CH2)n-Gruppe verstanden, obwohl jedes Kohlenstoffatom der Ethylengruppe auch einfach oder doppelt substituiert sein kann, d.h. -(O-CR2-CR2)n-, wobei R wie zuvor beschrieben ist. Ethylenglykolderivate mit anderen Heteroatomen anstelle von Sauerstoff (d.h. -(N-CH2-CH2)n- oder -(S-CH2-CH2)- oder mit Substitutionsgruppen) sind auch bevorzugt.
  • Bevorzugte Substitutionsgruppen umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Alkoxygruppen wie -O-(CH2)2CH3 und -O-(CH2)4CH3 und Ethylenglykol und Derivate davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Bevorzugte aromatische Gruppen umfassen Phenyl, Naphthyl, Naphthalen, Anthracen, Phenanthrolin, Pyrrol, Pyridin, Thiophen, Porphyrine und substituierte Derivate von all den eben genannten, umfassend kondensierte Ringderivate, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In den hierin veranschaulichten, leitfähigen Oligomeren ist B-D eine Bindung, die zwei Atome oder chemische Gruppierungen verbindet, sofern g = 1 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist B-D eine konjugierte Bindung, die sich überlappende oder konjugierte π-Orbitale enthält.
  • Bevorzugte B-D-Bindungen werden aus Acetylen (-C≡C-, auch Alkin oder Ethin genannt), Alken (-CH=CH-, auch Ethylen genannt), substituiertem Alken (-CR=CR-, -CH=CR- und -CR=CH-), Amid (-NH-CO- und -NR-CO- oder -CO-NH- und -CO-NR-), Azo (-N=N-), Estern und Thioestern (-CO-O-, -O-CO-, -CS-O- und -O-CS-) und ande ren konjugierten Bindungen wie (-CH=N-, -CR=N-, -N=CH- und -N=CR-), (-SiH=SiH-, -SiR=SiH-, -SiR=SiH- und -SiR=SiR-), (-SiH=CH-, -SiR=CH-, -SiH=CR-, -SiR=CR-, -CH=SiH-, -CR=SiH-, -CH=SiR- und -CR=SiR-) ausgewählt. Besonders bevorzugte B-D-Bindungen sind Acetylen, Alken, Amid und substituierte Derivate von diesen drei und Azo. Besonders bevorzugte B-D-Bindungen sind Acetylen, Alken und Amid. Die an Doppelbindungen gebundenen Oligomerkomponenten können in der trans- oder cis-Konfiguration oder als Gemische vorkommen. So kann B oder D Kohlenstoff, Stickstoff oder Silicium enthalten. Die Substitutionsgruppen sind wie zuvor für R definiert.
  • Ist g = 0 im leitfähigen Oligomer der Struktur 1, so ist e vorzugsweise 1, und die D-Gruppierung kann Carbonyl oder eine wie zuvor definierte Heteroatomgruppierung sein.
  • Wie zuvor auch für die Y-Ringe beschrieben wurde, können die B-D-Bindungen (oder D-Gruppierungen, wenn g = 0) innerhalb eines einzelnen leitfähigen Oligomers alle dieselben sein, oder eine ist zumindest eine andere. Ist m beispielsweise gleich null, so kann die End-B-D-Bindung eine Amidbindung sein, und die übrigen B-D-Bindungen können Acetylenbindungen sein. Sind Amidbindungen vorhanden, sind im Allgemeinen so wenig wie möglich Amidbindungen vorzuziehen, doch in manchen Ausführungsformen sind alle B-D-Bindungen Amidbindungen. So kann ein Typ der B-D-Bindungen, wie zuvor für die Y-Ringe erläutert wurde, im leitfähigen Oligomer innerhalb einer nachstehend noch beschriebenen Monoschicht und ein anderer Typ über dem Monoschichtniveau vorhanden sein, um beispielsweise für die Nucleinsäurehybridisierung größere Flexibilität zu verleihen, wenn die Nucleinsäure über ein leitfähiges Oligomer gebunden wird.
  • In den hierin dargestellten Strukturen ist n eine ganze Zahl von 1 bis 50, obwohl längere Oligomere auch eingesetzt werden können (siehe beispielsweise Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33(13), 1360 (1994)). Ohne theoretisch gebunden zu sein, scheint es, dass für wirksame Hybridisierung von Nucleinsäuren an einer Oberfläche die Hybridisierung in einer Distanz zur Oberfläche eintreten sollte, d.h. dass die Hybridisierungskinetik als Funktion der Distanz zur Oberfläche steigt, insbesondere bei langen Oligonucleotiden von 200 bis 300 Basenpaaren. Demgemäß hat die Länge des leitfähigen Oligomers so zu sein, dass das nächste Nucleotid der Nucleinsäure in einer Distanz von etwa 6 Å bis etwa 100 Å (obwohl Distanzen von bis zu 500 Å eingesetzt werden können) von der Elektrodenoberfläche angeordnet ist, vorzugsweise in einer Distanz von etwa 15 Å bis etwa 60 Å und auch bevorzugt von etwa 25 Å bis etwa 60 Å, wenn eine Nucleinsäure über ein leitfähiges Oligomer, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, gebunden ist. Demgemäß hängt n von der Größe der aromatischen Gruppe ab, liegt im Allgemeinen jedoch im Bereich von etwa 1 bis etwa 20, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 15, und besonders bevorzugt von etwa 3 bis etwa 10.
  • In den hierin dargestellten Strukturen ist m entweder 0 oder 1. Das bedeutet, dass, wenn m = 0 ist, das leitfähige Oligomer mit einer B-D-Bindung oder einer D-Gruppierung abgeschlossen sein kann, d.h. dass das D-Atom entweder direkt oder über einen Linker an die Nucleinsäure gebunden ist. In manchen Ausführungsformen, beispielsweise wenn das leitfähige Oligomer an ein Phosphat der Ribose-Phosphat-Hauptkette einer Nucleinsäure gebunden ist, können zusätzliche Atome wie Linker vorhanden sein, die zwischen dem leitfähigen Oligomer und der Nucleinsäure gebunden sind. Weiters, wie nachstehend noch erläutert wird, kann das D-Atom das Stickstoffatom der Amino-modifizierten Ribose sein. Alternativ dazu kann, sofern m = 1 ist, das leitfähige Oligomer mit Y, mit einer aromatischen Gruppe, abschließen, d.h. dass die aromatische Gruppe an die Nucleinsäure oder den Linker gebunden ist.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass eine Vielzahl an möglichen leitfähigen Oligomeren eingesetzt werden kann. Diese umfassen leitfähige Oligomere, die in den Bereich der Formeln für Struktur 1 und Struktur 8 fallen, sowie andere leitfähige Oligomere, wie sie im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfasend beispielsweise Verbindungen, die kondensierte aromatische Ringe oder Te flon®-artige Oligomere umfassen, z.B. -(CF2)n-, -(CHF)n- und -(CFR)n-. Siehe beispielsweise Schumm et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 33, 1361 (1994); Grosshenny et al., Platinum Metals Rev. 40(1), 26–35 (1996); Tour, Chem. Rev. 96, 537-553 (1996); Hsung et al., Organometallics 14, 4808–4815 (1995); und darin zitierte Verweise.
  • Besonders bevorzugte, leitfähige Oligomere dieser Ausführungsform sind nachstehend dargestellt:
  • Struktur 2
    Figure 00650001
  • Struktur 2 ist Struktur 1, wenn g = 1 ist. Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 2 umfassen: e ist null, Y ist Pyrrol oder substituiertes Pyrol; e ist null, Y ist Thiophen oder substituiertes Thiophen; e ist null, Y ist Furan oder substituiertes Furan; e ist null, Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl; e ist null, Y ist Pyridin oder substituiertes Pyridin; e ist 1, B-D ist Acetylen und Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl (siehe nachstehende Struktur 4). Eine bevorzugte Ausführungsform von Struktur 2 ist auch, wenn e = 1 ist, dargestellt in der nachstehenden Struktur 3.
  • Struktur 3
    Figure 00650002
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 3 sind: Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl und B-D ist Azo; Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl und B-D ist Acetylen; Y ist Phenyl oder substituiertes Phenyl und B-D ist Alken; Y ist Pyridin oder substituiertes Pyridin und B-D ist Acetylen; Y ist Thiophen oder substituiertes Thiophen und B-D ist Acetylen; Y ist Furan oder substituiertes Furan und B-D ist Acetylen; Y ist Thiophen oder Furan (oder substituiertes Thiophen oder Furan) und B-D sind abwechselnd Alken- und Acetylenbindungen.
  • Die meisten der hierin dargestellten Strukturen setzen ein leitfähiges Oligomer der Struktur 3 ein. Jedes Oligomer der Struktur 3 kann jedoch durch jede beliebige der anderen, hierin dargestellten Strukturen ersetzt werden, d.h. durch Oligomere der Strukturen 1 oder 8 oder durch andere leitfähige Oligomere, und die Verwendung dieser Darstellungen der Struktur 3 beabsichtigt keineswegs, den Schutzumfang der Erfindung einzuschränken.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 3 umfassen die Strukturen 4, 5, 6 und 7, die nachstehend dargestellt sind.
  • Struktur 4
    Figure 00660001
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 4 umfassen: n = 2, m = 1 und R ist Wasserstoff; n = 3, m = null und R ist Wasserstoff; und den Einsatz von R-Gruppen, um die Löslichkeit zu steigern.
  • Struktur 5
    Figure 00660002
  • Ist die B-D-Bindung eine Amidbindung wie in Struktur 5, so sind die leitfähigen Oligomere Pseudopeptidoligomere. Obwohl die Amidbindung in Struktur 5 mit dem Carbonyl an der linken Seite, d.h. -CONH-, dargestellt ist, kann auch die umgekehrte Abfolge eingesetzt werden, d.h. -NHCO-. Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 5 umfassen: n = 2, m = 1 und R ist Wasserstoff; n = 3, m = null und R ist Wasserstoff (in dieser Ausführungsform kann der endständige Stickstoff (das D-Atom) Stickstoff oder Amino-modifizierte Ribose sein); und den Einsatz von R-Gruppen zur Erhöhung der Löslichkeit.
  • Struktur 6
    Figure 00670001
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 6 umfassen: das erste n = 2, das zweite n = 1, m = null und alle R-Gruppen sind Wasserstoff oder den Einsatz von R-Gruppen, um die Löslichkeit zu erhöhen.
  • Struktur 7
    Figure 00670002
  • Bevorzugte Ausführungsformen von Struktur 7 umfassen: das erste n = 3, das zweite n ist von 1–3, m ist entweder 0 oder 1 und den Einsatz von R-Gruppen, um die Löslichkeit zu erhöhen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist das leitfähige Oligomer die in Struktur 8 dargestellte Struktur auf:
  • Struktur 8
    Figure 00670003
  • In dieser Ausführungsform sind C Kohlenstoffatome, n ist eine ganze Zahl von 1 bis 50, m = 0 oder 1, J ist ein Heteroatom, ausgewählt aus der aus Sauerstoff, Stickstoff, Silicium, Phosphor, Schwefel, Carbonyl oder Sulfoxid bestehenden Gruppe, und G ist eine aus Alken, Alken oder Acetylen ausgewählte Bindung, sodass zusammen mit den zwei Kohlenstoffatomen die C-G-C-Gruppe ein Alken (-CH=CH-), substituiertes Alken (-CR=CR-) oder Gemische davon (-CH=CR- oder -CR=CH-), Acetylen (-C≡C-) oder Alken (-CR2-CR2-, wobei R entweder Wasserstoff oder eine hierin beschriebene Substitutionsgruppe ist) ist. Die G-Bindung jeder Untereinheit kann dieselbe oder eine andere als die G-Bindungen anderer Untereinheiten sein; das bedeutet, dass abwechselnde Oligomere von Alken- und Acetylenbindungen eingesetzt werden könnten, usw. Ist G jedoch eine Alkanbindung, so sollte die Anzahl der Alkanbindungen im Oligomer auf einem Minimum gehalten werden, wobei etwa sechs oder weniger Sigmabindungen pro leitfähiges Oligomer bevorzugt sind. Alkenbindungen sind bevorzugt und sind im Allgemeinen hierin dargestellt, obwohl Alken- und Acetylenbindungen in jeder der hierin beschriebenen Strukturen oder Ausführungsformen substituiert werden können, wie Fachleuten bekannt sein wird.
  • In manchen Ausführungsformen, beispielsweise wenn keine ETM vorhanden sind und m=0 ist, ist zumindest eine der G-Bindungen keine Alkanbindung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das m der Struktur 8 gleich null. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist m = null und G eine Alkenbindung, wie in Struktur 9 dargestellt ist:
  • Struktur 9
    Figure 00680001
  • Das Alkenoligomer von Struktur 9 und andere, die hierin dargestellt sind, werden im Allgemeinen in der bevorzugten trans-Konfiguration dargestellt, obwohl cis- Oligomere oder Gemische von trans- und cis-Oligomeren auch eingesetzt werden können. Wie zuvor erläutert können R-Gruppen zugesetzt werden, um die Packung der Zusammensetzung an einer Elektrode, die Hydrophilie oder Hydrophobie des Oligomers und die Flexibilität, d.h. die Rotations-, Torsions- und Längsflexibilität des Oligomers, zu verändern. n ist wie zuvor definiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist R Wasserstoff, obwohl R auch Alkylgruppen und Polyethylenglykole oder Derivate sein kann.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das leitfähige Oligomer ein Gemisch aus unterschiedlichen Oligomertypen, beispielsweise der Strukturen 1 und 8, sein.
  • Die leitfähigen Oligomere können Endgruppen aufweisen oder nicht. So gibt es in einer bevorzugten Ausführungsform keine zusätzliche Endgruppe, und das leitfähige Oligomer endet mit einer der in den Strukturen 1 bis 9 dargestellten Gruppe; beispielsweise mit einer B-D-Bindung wie einer Acetylenbindung. Alternativ dazu wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Endgruppe zugesetzt, die hierin manchmal als „Q" bezeichnet wird. Eine Endgruppe kann aus verschiedenen Gründen eingesetzt werden; beispielsweise als Ergänzung zur elektronischen Verfügbarkeit des leitfähigen Oligomers zur Detektion von ETM oder zur Veränderung der Oberfläche der SAM aus anderen Gründen, beispielsweise, um nicht spezifische Bindungen zu vermeiden. Ist der Zielanalyt beispielsweise eine Nucleinsäure, so können negativ geladene Gruppen am Ende vorhanden sein, um eine negativ geladene Oberfläche zu bilden, sodass, wenn die Nucleinsäure DNA oder RNA ist, die Nucleinsäure abgestoßen wird oder daran gehindert wird, sich an der Oberfläche abzulagern, um Hybridisierung zu erleichtern. Bevorzugte Endgruppen umfassen -NH2, -ON, -COOH und Alkylgruppen wie z.B. -CH3 und (Poly)alkyloxide wie z.B. (Poly)ethylenglykol, wobei -OCH2CH2OH, -(OCH2CH2O)2H, -(OCH2CH2O)3H und -(OCH2CH2O)4H bevorzugt sind.
  • In einer Ausführungsform ist es möglich, Gemische von leitfähigen Oligomeren mit unterschiedlichen Typen an Endgruppen einzusetzen. So können beispielsweise manche der Endgruppen die Detektion erleichtern, und manche können nicht spezifisches Binden vermeiden.
  • Es ist bekannt, dass die Monoschicht verschiedene leitfähige Oligomerspezies umfassen kann, obwohl verschiedene Spezies vorzugsweise so gewählt werden, dass eine ziemlich gleichförmige SAM gebildet werden kann. So ist es beispielsweise möglich, wenn Einfangbindungsliganden wie Nucleinsäuren kovalent mittels leitfähiger Oligomere an die Elektrode gebunden sind, einen Typ an leitfähigem Oligomer, der zur Anbindung der Nucleinsäure eingesetzt wird, und einen anderen Typ in der SAM zu haben. Dem ähnlich kann es wünschenswert sein, Gemische aus verschiedenen Längen von leitfähigen Oligomeren in der Monoschicht zu haben, um zur Reduktion der nicht spezifischen Signale beizutragen. So setzen beispielsweise bevorzugte Ausführungsformen leitfähige Oligomere ein, die unter der Oberfläche des Rests der Monoschicht enden, d.h. unter der Isolationsschicht, sofern eine eingesetzt wird, oder unter einer bestimmten Fraktion der anderen leitfähigen Oligomere. Dem ähnlich können auch unterschiedliche leitfähige Oligomere eingesetzt werden, um die Bildung von Monoschichten zu erleichtern oder um Monoschichten mit veränderten Eigenschaften zu bilden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Monoschicht weiters Isolatorgruppierungen umfassen. Unter „Isolator" wird hierin ein im Wesentlichen nicht leitfähiges, vorzugsweise lineares, Oligomer verstanden. Unter „im Wesentlichen nicht leitfähig" wird hierin verstanden, dass der Isolator keine Elektronen bei 100 Hz überträgt. Die Geschwindigkeit der Elektronenübertragung durch den Isolator ist vorzugsweise geringer als die Geschwindigkeit durch die hierin beschriebenen, leitfähigen Oligomere.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Isolatoren eine Leitfähigkeit S von etwa 10–7 Ω–1cm–1 oder darunter auf, wobei weniger als 10–8 Ω–1cm–1 bevorzugt sind. Siehe im Allgemeinen Gardner et al. (s.o.).
  • Im Allgemeinen sind Isolatoren Alkyl- oder Heteroalkyloligomere oder -gruppierungen mit Sigmabindungen, obwohl jedes einzelne Isolatormolekül aromatische Gruppen oder eine oder mehrere konjugierte Bindungen enthalten kann. Unter „Heteroalkyl" wird hierin eine Alkylgruppe verstanden, die zumindest ein Heteroatom, d.h. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Silicium oder Bor, in der Kette eingebunden hat. Alternativ dazu kann der Isolator einem leitfähigen Oligomer sehr ähnlich sein, unter Zusatz von einem oder mehreren Heteroatomen oder Bindungen, die dazu dienen, Elektronentransfer zu vermeiden oder, vorzugsweise wesentlich, zu verlangsamen.
  • Geeignete Isolatoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen -(CH2)n-, -(CRH)n- und -(CR2)n-, Ethylenglykol oder Derivate, die andere Heteroatome anstelle von Sauerstoff, d.h. Stickstoff oder Schwefel (Schwefelderivate sind nicht bevorzugt, wenn die Elektrode aus Gold ist), einsetzen.
  • Bei den leitfähigen Oligomeren können die Isolatoren mit hierin definierten R-Gruppen substituiert sein, um die Packung der Gruppierungen oder leitfähigen Oligomere an einer Elektrode, die Hydrophilie oder Hydrophobie des Isolators und die Flexibilität, d.h. die Rotations-, Torsions- oder Längsflexibilität, des Isolators zu verändern. Verzweigte Alkylgruppen können beispielsweise eingesetzt werden. Dem ähnlich können die Isolatoren zuvor erläuterte Endgruppen enthalten, insbesondere um die Oberfläche der Monoschicht zu beeinflussen.
  • Die Länge der Spezies, die die Monoschicht bilden, kann je nach Bedarf variieren. Wie zuvor erläutert ist das Binden der Zielanalyte (beispielsweise Hybridisierung von Nucleinsäuren) in einer Distanz zur Oberfläche scheinbar wirksamer. Die Spezies, an die die Einfangbindungsliganden gebunden sind (wie nachstehend noch erläutert wird, können diese entweder Isolatoren oder leitfähige Oligomere sein), können im Grunde dieselbe Länge wie die die Monoschicht bildenden Spezies aufweisen oder länger als sie sein, was dazu führt, dass die Einfangbindungsliganden für das Lö sungsmittel zur Hybridisierung besser zugänglich sind. In manchen Ausführungsformen können die leitfähigen Oligomere, an die die Einfangbindungsliganden gebunden sind, kürzer als die Monoschicht sein.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die tatsächlichen Kombinationen und Verhältnisse zwischen den verschiedenen Spezies, die die Monoschicht bilden, stark variieren können und davon abhängen, ob Mechanismus-1 oder -2 eingesetzt wird und, im Falle von Elektrophorese, ob ein Ein-Elektroden-System oder ein Zwei-Elektroden-System eingesetzt wird, wie nachstehend noch genauer erläutert wird. Im Allgemeinen werden Drei-Komponenten-Systeme für Mechanismus-2-Systeme bevorzugt, worin die erste Spezies eine einen Einfangbindungsliganden enthaltende Spezies umfasst (Einfangsonde genannt, wenn der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist), die an die Elektrode über entweder einen Isolator oder ein leitfähiges Oligomer gebunden ist. Die zweiten Spezies sind leitfähige Oligomere, und die dritten Spezies sind Isolatoren. In dieser Ausführungsform können die ersten Spezies von etwa 90 % bis etwa 1 % umfassen, wobei etwa 20 % bis etwa 40 % bevorzugt sind. Sind die Zielanalyte Nucleinsäuren, werden etwa 30 % bis etwa 40 % für kurze Oligonucleotidtargets besonders bevorzugt, und etwa 10 % bis etwa 20 % werden für längere Targets bevorzugt. Die zweite Spezies kann von etwa 1 % bis etwa 90 % umfassen, wobei etwa 20 % bis etwa 90 % bevorzugt sind, und etwa 40 % bis etwa 60 % besonders bevorzugt sind. Die dritte Spezies kann von etwa 1 % bis etwa 90 % umfassen, wobei etwa 20 % bis etwa 40 % bevorzugt sind, und etwa 15 % bis etwa 30 & besonders bevorzugt sind. Um diese annähernden Proportionen zu erlangen, sind bevorzugte Verhältnisse für erste:zweite:dritte Spezies in SAM-Formations-Lösungsmitteln 2:2:1 für kurze Targets und 1:3:1 für längere Targets, wobei die gesamte Thiolkonzentration (wenn sie eingesetzt wird, um diese Spezies zu binden, wie nachstehend noch genauer erläutert wird) im Bereich von 500 μM bis 1 mM liegt, wobei 833 μM bevorzugt sind.
  • Alternativ dazu können Zwei-Komponenten-Systeme eingesetzt werden. In einer Ausführungsform zum Einsatz in Mechanismus-1- oder Mechanismus-2-Systemen sind die zwei Komponenten die erste und die zweite Spezies. In dieser Ausführungsform kann die erste Spezies etwa 1 % bis etwa 90 % umfassen, wobei etwa 1 % bis etwa 40 % bevorzugt sind, und etwa 10 % bis etwa 40 % besonders bevorzugt sind. Die zweite Spezies kann etwa 1 % bis etwa 90 % umfassen, wobei etwa 10 % bis etwa 60 % bevorzugt sind, und etwa 20 % bis etwa 40 % besonders bevorzugt sind. Alternativ dazu sind für Mechanismus-1-Systeme die zwei Komponenten die erste und die dritte Spezies. In dieser Ausführungsform kann die erste Spezies etwa 1 % bis etwa 90 % umfassen, wobei etwa 1 % bis etwa 40 % bevorzugt sind, und etwa 10 % bis etwa 40 % besonders bevorzugt sind. Die zweite Spezies kann etwa 1 % bis etwa 90 % umfassen, wobei etwa 10 % bis etwa 60 % bevorzugt sind, und etwa 20 % bis etwa 40 % besonders bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abscheidung der SAM unter Einsatz von wässrigen Lösungsmitteln. Wie im Allgemeinen in Steel et al., Anal. Chem. 70, 4670 (1998), Herme et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 8916 (1997), und Finklea, Electrochemistry of Organized Monolayers of Thiols and Related Molecules on Electrodes, von A.J. Bard, Electroanalytical Chemistry: A Series of Advances, Bd. 20, Dekker N.Y. (1996) beschrieben wird, kann die Abscheidung von SAM-bildenden Spezies aus wässrigen Lösungen heraus erfolgen, die häufig Salz umfassen.
  • Weiters können, wenn Elektrophoresesysteme eingesetzt werden, die Zusammensetzung und Integrität der Monoschicht davon abhängen, ob ein Ein-Elektroden-System oder Zwei-Elektroden-System eingesetzt wird. Wird ein Ein-Elektroden-System sowohl für die Elektrophorese als auch für die Detektion eingesetzt, so ermöglicht beispielsweise die Konfiguration des Systems, dass die elektroaktiven Ladungsträger, sofern sie eingesetzt werden, Zugang zur Elektrode haben. Fachleuten wird bekannt sein, dass, ist die Bindungschemie des leitfähigen Oligomers bei hohen Spannungen, die zum Hydrolysieren von Wasser eingesetzt werden, stabil, keine elektroaktiven Ladungsträger eingesetzt werden müssen. Dies kann auf unterschiedliche Arten geschehen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Monoschicht eine signifikante Komponente an elektronisch ausgesetzten, leitfähigen Oli gomeren; solch eine Monoschicht hebt wirksam die Oberfläche der Elektrode und ermöglicht somit, dass elektroaktive Ladungsträger indirekten Zugang zur Elektrode haben. Alternativ dazu kann eine schlechte Monoschicht eingesetzt werden, d.h. eine Monoschicht, die „Nadellöcher" oder „Mängel" aufweist, sodass das Lösungsmittel direkten Zugang zur Elektrode hat. Alternativ dazu kann die Konfiguration der Elektrode so beschaffen sein, dass weniger als die gesamte Oberfläche der Elektrode mit einer SAM bedeckt ist, um direkten Zugang zur Elektrode zu schaffen, gleichzeitig jedoch die Oberfläche für nicht spezifische Bindungen zu minimieren.
  • Die kovalente Bindung der leitfähigen Oligomere und Isolatoren an die Elektrode kann auf verschiedene Arten erlangt werden, die von der Elektrode und der Zusammensetzung der Isolatoren und der leitfähigen Oligomere, die eingesetzt werden, abhängen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungslinker mit kovalent gebundenen Nucleosiden oder Nucleinsäuren, wie hierin dargestellt, kovalent an eine Elektrode gebunden. So ist ein Ende oder Terminus des Bindungslinkers an das Nucleosid oder die Nucleinsäure gebunden, und das andere Ende ist an eine Elektrode gebunden. In manchen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, dass der Bindungslinker an einer anderen Position als am Terminus gebunden ist oder dass sogar ein verzweigter Bindungslinker eingesetzt wird, der an eine Elektrode an einem Terminus und an zwei oder mehr Nucleoside an anderen Termini gebunden ist, wobei dies nicht bevorzugt ist. Dem ähnlich kann der Bindungslinker an zwei Stellen an die Elektrode gebunden sein, wie im Allgemeinen in den Strukturen 11–13 dargestellt ist. Im Allgemeinen werden manche Linkertypen eingesetzt, die nachstehend als „A" in Struktur 10 bezeichnet sind, worin „X" das leitfähige Oligomer, „1" ein Isolator und die schraffierte Oberfläche die Elektrode ist:
  • Struktur 10
    Figure 00740001
  • In dieser Ausführungsform ist A ein Linker oder Atom. Die Auswahl von „A" hängt teilweise von den Eigenschaften der Elektrode ab. So kann A beispielsweise eine Schwefelgruppierung sein, wenn eine Goldelektrode eingesetzt wird. Alternativ dazu, wenn Metalloxidelektroden eingesetzt werden, kann A eine Silicium- (Silan-) Gruppierung sein, die an den Sauerstoff des Oxids gebunden ist (siehe beispielsweise Chen et al., Langmuir 10, 3.332–3.337 (1994); Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78, 195–201 (1977)). Werden Kohlenstoff-basierte Elektroden genutzt, kann A eine Aminogruppierung sein (vorzugsweise ein primäres Amin; siehe beispielsweise Deinhammer et al., Langmuir 10, 1.306–1.313 (1994). So umfassen bevorzugte A-Gruppierungen Silangruppierungen, Schwefelgruppierungen (umfassend Alkylschwefelgruppierungen) und Aminogruppierungen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bindungen vom Epoxidtyp mit Redox-Polymeren, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, nicht eingesetzt.
  • Obwohl sie hierin als eine einzelne Gruppierung dargestellt sind, können die Isolatoren und leitfähigen Oligomere an eine Elektrode über mehr als eine „A"-Gruppierung gebunden sein; die „A"-Gruppierungen können dieselben oder unterschiedliche sein. So können mehrere Schwefelatome eingesetzt werden, um das leitfähige Oligomer an die Elektrode zu binden, wenn beispielsweise die Elektrode eine Goldelektrode und „A" ein Schwefelatom oder eine Schwefelgruppierung ist, wie im Allgemeinen in den nachstehenden Strukturen 11, 12 und 13 dargestellt ist. Fachleuten wird bekannt sein, dass andere solche Strukturen gewählt werden können. In den Strukturen 11, 12 und 13 ist die A-Gruppierung nur ein Schwefelatom, es können jedoch gleichfalls substituierte Schwefelgruppierungen eingesetzt werden.
  • Struktur 11
    Figure 00750001
  • Struktur 12
    Figure 00760001
  • Struktur 13
    Figure 00760002
  • Es gilt auch anzumerken, dass es ahnlich wie in Struktur 13 möglich ist, ein leitfähiges Oligomer zu haben, das mit einem einzelnen Kohlenstoffatom mit drei Schwefelgruppierungen, die an die Elektrode gebunden sind, endet. Weiters können, auch wenn sie hierin nicht immer dargestellt sind, die leitfähigen Oligomere und Isolatoren auch eine „Q"-Endgruppe umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Elektrode eine Goldelektrode, und die Bindung erfolgt über eine Schwefelbindung, wie auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt ist, d.h. die A-Gruppierung ist ein Schwefelatom oder eine Schwefelgruppierung. Obwohl die genauen Eigenschaften der Gold-Schwefel-Bindung nicht bekannt sind, wird angenommen, dass diese Bindung im Sinne dieser Erfindung kovalent ist. Eine repräsentative Struktur ist in Struktur 14 dargestellt, wobei das leitfähige Oligomer der Struktur 3 eingesetzt wird, obwohl, wie auch bei allen anderen hierin abgebildeten Strukturen, jedes beliebige leitfähige Oligomer oder Kombinationen aus leitfähigen Oligomeren eingesetzt werden können. Dem ähnlich kann jedes der leitfähigen Oligomere oder der Isolatoren auch hierin beschriebene Endgruppen umfassen. Struktur 14 zeigt den „A"-Linker, der nur ein Schwefelatom umfasst, obwohl zusätzliche Atome auch vorhanden sein können (d.h. Linker vom Schwefel zum leitfähigen Oligomer oder zu Substitutionsgruppen). Weiters zeigt Struktur 14 das an die aromatische Y-Gruppe gebundene Schwefelatom, das, wie Fachleuten selbstver ständlich bekannt sein wird, jedoch auch an die B-D-Gruppe (d.h. an ein Acetylen) gebunden sein kann.
  • Struktur 14
    Figure 00770001
  • Im Allgemeinen sind Thiolbindungen bevorzugt. In Systemen, die Elektrophorese einsetzen, sind Thiolbindungen bevorzugt, wenn entweder zwei Elektrodensets eingesetzt werden (d.h. die Detektionselektroden, die die SAM umfassen, werden bei hohen elektrophoretischen Spannungen (d.h. höher als 800 oder 900 mV), die die Oxidation der Thiolbindung und somit den Verlust der SAM verursachen können, nicht eingesetzt) oder wenn ein Elektrodenset eingesetzt wird, wobei hier geringere elektrophoretische Spannungen, wie nachstehend noch im Allgemeinen beschrieben wird, eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Elektrode eine Kohlenstoffelektrode, d.h. eine glasartige Kohlenstoffelektrode, und die Bindung erfolgt über Stickstoff einer Aminogruppe. Eine repräsentative Struktur ist in Struktur 15 dargestellt. Wiederum können zusätzliche Atome vorhanden sein, d.h. Linker vom Z-Typ und/oder Endgruppen.
  • Struktur 15
    Figure 00770002
  • Struktur 16
    Figure 00770003
  • In Struktur 16 stammt das Sauerstoffatom vom Oxid der Metalloxidelektrode. Das Si-Atom kann auch andere Atome enthalten, d.h. eine Siliciumgruppierung mit Substitutionsgruppen. Andere Bindungen für die SAM an andere Elektroden sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt; siehe beispielsweise Napier et al., Langmuir (1997), für Bindungen an Indiumzinnoxidelektroden und auch die Chemisorption von Phosphaten an eine Indiumzinnoxidelektrode (Vortrag von H. Holden Thorpe, CHI conference, 4. – 5. Mai 1998).
  • Die SAM der Erfindung können auf verschiedene Arten erzeugt werden, umfassend Abscheidung aus organischen Lösungen und Abscheidung aus wässrigen Lösungen. Die hierin erläuterten Verfahren setzen eine Goldelektrode als Beispiel ein, wobei Fachleuten selbstverständlich bekannt ist, dass andere Metalle und Verfahren ebenfalls eingesetzt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Indiumzinnoxid (ITO) als Elektrode eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Goldoberfläche zuerst gereinigt. Eine Vielzahl an Reinigungsverfahren kann eingesetzt werden, umfassend chemische Reinigung oder Ätzmittel (umfassend Piranha-Lösung (Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure) oder Aqua regia (Salzsäure/Salpetersäure)), elektrochemische Verfahren, Flammbehandlung, Plasmabehandlung oder Kombinationen davon, jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Nach dem Reinigen wird das Goldsubstrat den SAM-Spezies ausgesetzt. Ist die Elektrode aus ITO, so sind die SAM-Spezies Phosphonat-hältige Spezies. Dies kann auch auf unterschiedliche Arten erfolgen, umfassend Lösungsabscheidung, Gasphasenabscheidung, Mikrokontaktdruck, Sprühabscheidung, Abscheidung unter Einsatz von reinen Komponenten usw., jedoch nicht darauf beschränkt. Eine bevorzugte Ausführungsform setzt eine Abscheidungslösung ein, die ein Gemisch aus verschiedenen SAM-Spezies in Lösung, im Allgemeinen Thio-hältige Spezies, umfasst. Gemischte Monoschichten, die Zielanalyte, insbesondere DNA, enthalten, werden üblicherweise unter Einsatz eines zweistufigen Verfahrens hergestellt. Die thiolierte DNA wird im Rahmen des ersten Abscheidungsschritts (im Allgemeinen in Gegenwart von zumindest einer anderen, Monoschichten bildenden Spezies) abgeschieden, und die gemischte Monoschichtformation wird im Laufe des zweiten Schrittes vervollständigt, in dem eine zweite Thiollösung minus DNA zugesetzt wird. Der zweite Schritt kann schwaches Erhitzen einbinden, um die Monoschicht-Reorganisation zu fördern, obwohl dies nicht in allen Ausführungsformen bevorzugt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Abscheidungslösung eine organische Abscheidungslösung. In dieser Ausführungsform wird eine saubere Goldoberfläche in eine saubere Phiole gegeben. Eine Bindungsligand-Abscheidungslösung in organischem Lösungsmittel wird hergestellt, in der die gesamte Thiolkonzentration zwischen mikromolarer Konzentration und Sättigungskonzentration liegt; bevorzugte Bereiche umfassen von etwa 1 μM bis 10 mM, wobei etwa 400 μM bis etwa 1,0 mM besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Abscheidungslösung Thiol-modifizierte DNA (d.h. an einen Bindungslinker gebundene Nucleinsäure) und Thiolverdünnermoleküle (entweder leitfähige Oligomere oder Isolatoren, wobei Letztere bevorzugt sind). Das Verhältnis von DNA zu Verdünner (sofern vorhanden) liegt üblicherweise zwischen 1.000:1 und 1:1.000, wobei ein Verhältnis von etwa 10:1 bis etwa 1:10 bevorzugt und ein Verhältnis von 1:1 besonders bevorzugt ist. Die bevorzugten Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran (THF), Acetonitril, Dimethylforamid (DMF), Ethanol oder Gemische davon; im Allgemeinen kann jegliches Lösungsmittel mit ausreichender Polarität, um den Einfangliganden zu lösen, eingesetzt werden, solange das Lösungsmittel frei von funktionellen Gruppen ist, die mit der Oberfläche reagieren. Eine ausreichende Menge an DNA-Abscheidungslösung wird der Phiole so zugesetzt, dass sie die Elektrodenoberfläche völlig abdeckt. Das Goldsubstrat wird bei Umgebungstemperatur oder einer Temperatur leicht über Umgebungstemperatur für eine Zeitspanne im Bereich von Sekunden bis Stunden, wobei 5–30 Minuten bevorzugt sind, inkubieren gelassen. Nach der anfänglichen Inkubation wird die Abscheidungslösung entfernt, und eine Lösung nur aus Verdünnermolekülen (von etwa 1 μM bis 10 mM, wobei etwa 100 μM bis etwa 1,0 mM bevorzugt sind) wird in organischem Lösungsmittel zugesetzt. Das Gold substrat wird bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur über Raumtemperatur für eine Dauer (Sekunden bis Tage, wobei etwa 10 Minuten bis etwa 24 Stunden bevorzugt sind) inkubieren gelassen. Die Goldprobe wird aus der Lösung entfernt, in sauberem Lösungsmittel gespült und eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine wässrige Abscheidungslösung eingesetzt. Wie zuvor wird eine saubere Goldoberfläche in eine saubere Phiole gegeben. Eine DNA-Abscheidungslösung in Wasser wird hergestellt, in der die gesamte Thiolkonzentration zwischen etwa 1 μM und 10 mM liegt, wobei eine Konzentration von etwa 1 μM bis etwa 200 μM bevorzugt ist. Die wässrige Lösung weist häufig Salz auf (bis hin zur Sättigung, wobei etwa 1 M bevorzugt ist), wobei jedoch auch reines Wasser eingesetzt werden kann. Die Abscheidungslösung enthält Thiol-modifizierte DNA und häufig ein Thiolverdünnermolekül. Das Verhältnis von DNA zu Verdünner liegt üblicherweise zwischen 1.000:1 und 1:1000, wobei ein Verhältnis von etwa 10:1 bis etwa 1:10 bevorzugt und ein Verhältnis von 1:1 besonders bevorzugt ist. Die DNA-Abscheidungslösung wird der Phiole in solch einem Volumen zugesetzt, dass sie die Elektrodenoberfläche völlig abdeckt. Das Goldsubstrat wird bei Umgebungstemperatur oder einer Temperatur leicht über Umgebungstemperatur 1–30 Minuten lang inkubieren gelassen, wobei 5 Minuten üblicherweise ausreichend sind. Nach der anfänglichen Inkubation wird die Abscheidungslösung entfernt, und eine Lösung nur aus Verdünnermolekülen (von etwa 10 μM bis 1,0 mM) wird in Wasser oder organischem Lösungsmittel zugesetzt. Das Goldsubstrat wird bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur über Raumtemperatur inkubieren gelassen, bis eine komplette Monoschicht gebildet ist (10 Minuten bis 24 Stunden). Die Goldprobe wird aus der Lösung entfernt, in sauberem Lösungsmittel gespült und eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wie hierin erläutert, wird eine Leiterplatte als das Substrat für die Goldelektroden eingesetzt. Die Bildung der SAM an der Goldoberfläche erfolgt im Allgemeinen zuerst mittels Reinigen der Platten, beispielsweise in einer 10%igen Schwefelsäurelösung 30 Sekunden lang, in Waschlaugen, Aqua regia, Plasma usw., wie hierin erläutert. Im Anschluss an die Schwefelsäurebehand lung werden die Platten gewaschen, beispielsweise durch Eintauchen in zwei Milli-Q-Wasserbäder für jeweils 1 Minute. Die Platten werden dann beispielsweise unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Das Besprenkeln der Platten mit der Abscheidungslösung erfolgt mittels verschiedenster, bekannter Besprenkelungssysteme, im Allgemeinen durch Platzieren der Platten auf einem Koordinatentisch, vorzugsweise in einer Feuchtigkeitskammer. Die Größe der Fleckentropfen variiert je nach der Größe der Elektroden an den Platten und der für das Bereitstellen der Lösung eingesetzten Vorrichtung; bei 250-μM-Elektroden beispielsweise wird ein 30-Nanoliter-Tropfen eingesetzt. Das Volumen sollte ausreichend sein, um die Elektrodenoberfläche völlig zu bedecken. Der Tropfen wird bei Raumtemperatur eine Zeit lang (Sekunden bis zu über Nacht, wobei 5 Minuten bevorzugt sind) inkubiert, woraufhin der Tropfen durch Spülen in einem Milli-Q-Wasserbad entfernt wird. Die Platten werden dann vorzugsweise mit einer zweiten Abscheidungslösung, die im Allgemeinen einen Isolator in organischem Lösungsmittel umfasst, vorzugsweise in Acetonitril, durch Eintauchen in ein 45-°C-Bad behandelt. Nach 30 Minuten werden die Platten entfernt und in ein Acetonitril-Bad 30 Sekunden lang eingetaucht, wonach ein Milli-Q-Wasserbad für 30 Sekunden folgt. Die Platten werden unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Detektionselektrode weiters einen Einfangbindungsliganden, der vorzugsweise kovalent gebunden ist. Als „Bindungsligand" oder „Bindungsspezies" wird hierin eine Verbindung bezeichnet, die eingesetzt wird, um die Gegenwart eines Zielanalyts zu sondieren, und die an den Zielanalyt bindet. Im Allgemeinen gibt es für die meisten der hierin beschriebenen Ausführungsformen zumindest zwei Bindungsliganden, die pro Zielanalytmolekül eingesetzt werden: einen „Einfang-" oder „Anker"-Bindungsliganden (hierin auch als eine „Einfangsonde" bezeichnet, insbesondere unter Verweis auf einen Nucleinsäure bindenden Liganden), der an die hierin beschriebene Detektionselektrode gebunden ist, und einen löslichen Bindungsliganden, der sich unabhängig an den Zielanalyt bindet und entweder direkt oder indirekt zumindest eine ETM umfasst.
  • Im Allgemeinen ermöglicht der Einfangbindungsligand die Bindung eines Zielanalyts an die Detektionselektrode, um ihn nachzuweisen. Wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, kann die Bindung des Zielanalyts an den Einfangbindungsliganden direkt (d.h. der Zielanalyt bindet an den Einfangbindungsliganden) oder indirekt (ein oder mehrere Einfangverlängerungsliganden können eingesetzt werden) erfolgen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung eine spezifische, und der Bindungsligand ist Teil eines Bindungspaares. Unter „spezifische Bindung" wird hierin verstanden, dass der Ligand den Analyt bindet, wobei eine ausreichende Spezifität vorliegt, um zwischen dem Analyt und anderen Komponenten oder Verunreinigungen in der Testprobe unterscheiden zu können. Fachleuten wird selbstverständlich bekannt sein, dass es jedoch auch möglich ist, Analyte unter Einsatz von Bindungen nachzuweisen, die nicht hoch spezifisch sind; beispielsweise können die Systeme verschiedene Bindungsliganden einsetzen, beispielsweise eine Anordnung von verschiedenen Liganden, wobei die Detektion eines bestimmten Analyts über seine Bindungs-„Signatur" an eine Gruppe von Bindungsliganden erfolgt, ähnlich der Art und Weise, wie „elektronische Nasen" arbeiten. Die Bindung sollte ausreichend sein, um zu ermöglichen, dass der Analyt unter den Bedingungen des Tests, umfassend Waschschritte, um nicht spezifische Bindungen zu entfernen, in gebundenem Zustand verbleibt. In manchen Ausführungsformen, beispielsweise bei der Detektion bestimmter Biomoleküle, belaufen sich die Bindungskonstanten des Analyts zum Bindungsligand auf zumindest etwa 10–4 bis 10–6 M–1 sein, wobei zumindest etwa 10–5 bis 10–9 M–1 bevorzugt und zumindest 10–7 bis 10–9 M–1 besonders bevorzugt sind.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die Zusammensetzung des Bindungsliganden von der Zusammensetzung des Zielanalyts abhängt. Bindungsliganden für zahlreiche Analyte sind bekannt oder können leicht mittels bekannter Techniken gefunden werden. Ist der Analyt beispielsweise eine einzelsträngige Nucleinsäure, ist der Bindungsligand im Allgemeinen eine im Wesentlichen komplementäre Nucleinsäure. Alternativ dazu, wie im Allgemeinen in den US-Patenten 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und verwandten Patenten beschrieben wird, können Nucleinsäure-„Aptomere" zum Binden an praktisch jeden Zielanalyt entwickelt werden. Dem ähnlich kann der Analyt ein Nucleinsäure bindendes Protein sein, und der Einfangbindungsligand ist entweder eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure; alternativ dazu kann der Bindungsligand ein Nucleinsäure bindendes Protein sein, wenn der Analyt eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure ist. Ist der Analyt ein Protein, umfassen die Bindungsliganden Proteine (insbesondere umfassend Antikörper oder Fragmente davon (FAb usw.)), kleine Moleküle oder Aptamere, wie oben beschrieben. Bevorzugte Bindungsligandenproteine umfassen Peptide. Ist der Analyt beispielsweise ein Enzym, umfassen geeignete Bindungsliganden Substrate, Inhibitoren und andere Proteine, die das Enzym binden, d.h. Komponenten eines Vielfach-Enzym- (oder -Protein-) Komplexes. Fachleuten wird bekannt sein, dass jegliche zwei Moleküle, die sich verbinden, vorzugsweise spezifisch verbinden, eingesetzt werden können, entweder als der Analyt oder als der Bindungsligand. Geeignete Analyt/Bindungsligand-Paare umfassen Antikörper/Antigene, Rezeptoren/Liganden, Proteine/Nucleinsäuren, Nucleinsäuren/Nucleinsäuren, Enzyme/Substrate und/oder Inhibitoren, Kohlenwasserstoffe (umfassend Glykoproteine und Glykolipide)/Lektine, Kohlenwasserstoffe und andere Bindungspartner, Proteine/Proteine; und Proteine/kleine Moleküle, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Diese können Sequenzen vom Wildtyp oder Derivatsequenzen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungsliganden Abschnitte (insbesondere die extrazellulären Abschnitte) von Zelloberflächenrezeptoren, die dafür bekannt sind, zu multimerisieren, wie z.B. der Wachstumshormonrezeptor, Glucosetransporter (insbesondere GLUT4-Rezeptor), Transferrinrezeptor, epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor, Rezeptor für Lipoprotein geringer Dichte, Rezeptor für Lipoprotein hoher Dichte, Leptinrezeptor, Interleukinrezeptoren, umfassend IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-15- und IL-17- Rezeptoren, VEGF-Rezeptor, PDGF-Rezeptor, EPO-Rezeptor, TPO-Rezeptor, Ciliary-neurotrophic-factor-Rezeptor, Prolactinrezeptor und T-Zell-Rezeptoren. Dem ähnlich gibt es zahlreiche Literatur in Bezug auf die Entwicklung von Bindungspartnern auf Grundlage von Verfahren der kombinatorischen Chemie.
  • In dieser Ausführungsform werden, wenn der Bindungsligand eine Nucleinsäure ist, bevorzugte Zusammensetzungen und Verfahren in den Patentanmeldungen WO 98/20.162, PCT/US98/12430, PCT/US98/12.082, PCT/US99/01.705, PCT/US99/01.703 und den U.S.S.N. 09/135.183, 60/105.875 und 09/295.691 erläutert.
  • Das Verfahren zum Binden des Einfangliganden an den Bindungslinker (entweder einen Isolator oder ein leitfähiges Oligomer) wird im Allgemeinen wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt durchgeführt und hängt sowohl von der Zusammensetzung des Verbindungslinkers als auch des Einfangbindungsliganden ab. Im Allgemeinen werden die Einfangbindungsliganden an den Bindungslinker mittels funktioneller Gruppen an jedem gebunden, der später zum Binden eingesetzt werden kann. Bevorzugte funktionelle Bindungsgruppen sind Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen. Diese funktionellen Gruppen können entweder direkt oder indirekt mittels eines Linkers angebunden werden, der hierin manchmal als „Z" bezeichnet ist. Linker sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt; beispielsweise homo- oder hetero-bifunktionelle Linker, die gut bekannt sind (siehe Katalog der Pierce Chemical Company, technischer Abschnitt über Vernetzer, S. 155–200 (1994)). Bevorzugte Z-Linker umfassen Alkylgruppen (umfassend substituierte Alkylgruppen und Alkylgruppen mit Heteroatom-Gruppierungen), sind jedoch nicht beschränkt darauf, wobei kurze Alkylgruppen, Ester, Amid, Amin, Expoxidgruppen und Ethylenglykol und Derivate bevorzugt sind, und Propyl, Acetylen und C2-Alken besonders bevorzugt sind. Z kann auch eine Sulfongruppe, die Sulfonamidbindungen bildet, sein.
  • Auf diese Weise können Einfangbindungsliganden, umfassend Proteine, Lektine, Nucleinsäuren, kleine organische Moleküle, Kohlenwasserstoffe usw., zugesetzt werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform setzt proteinartige Einfangbindungsliganden ein. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt kann jegliche Anzahl an Verfahren ein gesetzt werden, um einen proteinartigen Einfangbindungsliganden an einen Bindungslinker zu binden. Zahlreiche Verfahren sind bekannt, um Proteinen Gruppierungen zuzusetzen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform setzt Nucleinsäuren als Einfangbindungsliganden ein. Während sich die meisten der folgenden Erläuterungen auf Nucleinsäuren konzentrieren, lassen sich, wie Fachleuten selbstverständlich bekannt ist, zahlreiche der nachstehend beschriebenen Verfahren auf ähnliche Weise auf Systeme, die keine Nucleinsäuren einschließen, anwenden.
  • Die Einfangsonden-Nucleinsäure ist kovalent über einen „Bindungslinker" an die Elektrode gebunden, der entweder ein leitfähiges Oligomer (erforderlich für Mechanismus-1-Systeme) oder ein Isolator sein kann. Unter „kovalent gebunden" wird hierin verstanden, dass zwei Gruppierungen über zumindest eine Bindung, umfassend Sigmabindungen, Pi-Bindungen und Koordinationsbindungen, aneinander gebunden sind.
  • So ist ein Ende des Bindungslinkers an eine Nucleinsäure (oder anderen Bindungsliganden) gebunden, und das andere Ende (obwohl es Fachleuten bekannt sein wird, dass dies in beiden Fällen nicht genau der Terminus sein muss) ist an die Elektrode gebunden. So kann jede der hierin dargestellten Strukturen weiters eine Nucleinsäure umfassen, die als eine Endgruppe wirksam wird. So stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die Nucleinsäuren umfassen, die kovalent an die Elektroden gebunden sind, wie im Allgemeinen in der nachstehenden Struktur 17 dargestellt ist:
  • Struktur 17
    Figure 00850001
  • In Struktur 17 stellt die schraffierte Fläche an der linken Seite eine Elektrode dar. X ist ein leitfähiges Oligomer, und I ist ein hierin definierter Isolator. F1 ist eine Bindung, die die kovalente Bindung der Elektrode und des leitfähigen Oligomers oder Isolators ermöglicht, umfassend Bindungen, Atome oder Linker, wie sie hierin beschrieben werden, beispielsweise als „A", wie nachstehend beschrieben. F2 ist eine Bindung, die die kovalente Bindung des leitfähigen Oligomers oder Isolators an die Nucleinsäure ermöglicht und kann eine Bindung oder ein Atom, wie hierin beschrieben, sein. F2 kann Teil des leitfähigen Oligomers, Teil des Isolators, Teil der Nucleinsäure oder exogen zu diesen sein, wie beispielsweise für „Z" definiert wurde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Einfangsondennucleinsäure über ein leitfähiges Oligomer kovalent an die Elektrode gebunden. Die kovalente Bindung der Nucleinsäure und des leitfähigen Oligomers kann auf verschiedene Arten erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung über Bindung an die Base des Nucleosids, über Bindung an die Hauptkette der Nucleinsäure (entweder die Ribose, das Phosphat oder eine analoge Gruppe einer Nucleinsäure-Analoghauptkette) oder über einen Übergangsmetallliganden, wie nachstehend beschrieben wird. Die nachstehend erläuterten Verfahren werden im Allgemeinen für natürlich vorkommende Nucleinsäuren beschrieben, wobei ähnliche Verfahren, wie Fachleuten bekannt sein wird, auch mit Nucleinsäureanaloga, und in manchen Fällen mit anderen Bindungsliganden, eingesetzt werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das leitfähige Oligomer an die Base eines Nucleosids der Nucleinsäure gebunden. Dies kann auf mehrere Arten geschehen und hängt, wie nachstehend beschrieben, vom Oligomer ab. In einer Ausführungsform ist das Oligomer an ein Endnucleosid gebunden, d.h, entweder das 3'- oder das 5'-Nucleosid der Nucleinsäure. Alternativ dazu ist das leitfähige Oligomer an ein inneres Nucleosid gebunden.
  • Der Bindungspunkt an die Base hängt von der Art der Base ab. Im Allgemeinen ist eine Bindung an jeglicher Position möglich. In manchen Ausführungsformen, bei spielsweise wenn die ETM enthaltende Sonde zur Hybridisierung eingesetzt werden kann (d.h. Mechanismus-1-Systeme), wird vorzugsweise an Positionen angebunden, die nicht in Wasserstoffbindungen zur komplementären Base eingebunden sind. So erfolgt beispielsweise im Allgemeinen die Bindung an Position 5 oder 6 von Pyrimidinen wie Uridin, Cytosin und Thymin. Bei Purinen wie Adenin und Guanin erfolgt die Bindung vorzugsweise über Position B. Bindungen an nicht standardgemäßen Basen erfolgen vorzugsweise an vergleichbaren Positionen.
  • In einer Ausführungsform erfolgt die Bindung direkt; das bedeutet, dass keine dazwischen liegenden Atome zwischen dem leitfähigen Oligomer und der Base liegen. In dieser Ausführungsform werden leitfähige Oligomer beispielsweise über terminale Acetylenbindungen direkt an die Base gebunden. Struktur 18 ist ein Beispiel für diese Bindung, wobei ein leitfähiges Oligomer der Struktur 3 und Uridin als Base herangezogen werden, obwohl andere Basen und leitfähige Oligomere ebenfalls eingesetzt werden können, wie Fachleuten bekannt ist: Struktur 18
    Figure 00870001
  • Es gilt anzumerken, dass die hierin dargestellten Pentosestrukturen Wasserstoff, Hydroxy, Phosphate oder andere Gruppen wie Aminogruppen gebunden haben können. Weiters sind die hierin dargestellten Pentose- und Nucleosidstrukturen nicht gewöhnlich, sondern als Spiegelbilder der normalen Wiedergabe abgebildet. Darüber hinaus können die Pentose- und Nucleosidstrukturen auch zusätzliche Gruppen wie Schutzgruppen an jeder Position, beispielsweise wenn sie während der Synthese benötigt werden, enthalten.
  • Weiters kann die Base, sofern erforderlich, zusätzliche Modifikationen enthalten, d.h. die Carbonyl- oder Aminogruppen können verändert oder geschützt werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform enthält die Bindung jede beliebige Zahl an unterschiedlichen Z-Linkern, umfassend Amid- und Aminbindungen, wie im Allgemeinen in Struktur 19 unter Einsatz von Uridin als Base und einem Oligomer der Struktur 3 dargestellt ist: Struktur 19
    Figure 00880001
  • In dieser Ausführungsform ist Z ein Linker. Vorzugsweise ist Z ein kurzer Linker von etwa 1 bis etwa 10 Atomen, vorzugsweise mit 1 bis 5 Atomen, die Alken-, Alkinyl-, Amin-, Amid-, Azo-, Imin- usw. Bindungen enthalten können oder nicht. Linker sind am Gebiet der Erfindung bekannt; beispielsweise homo- oder hetero-bifunktionelle Linker (siehe Katalog der Pierce Chemical Company, technischer Abschnitt über Vernetzer, S. 155–200 (1994)). Bevorzugte Z-Linker umfassen Alkylgruppen (umfassend substituierte Alkylgruppen und Alkylgruppen mit Heteroatomgruppierungen), sind jedoch nicht beschränkt darauf, wobei kurze Alkylgruppen, Ester, Amid, Amin, Expoxidgruppen und Ethylenglykol und Derivate bevorzugt sind, und Propyl, Acetylen und C2-Alken besonders bevorzugt sind. Z kann auch eine Sulfongruppe, die Sulfonamidbindungen bildet, sein, wie nachstehend erläutert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung der Nucleinsäure und des leitfähigen Oligomers über Bindung an die Hauptkette der Nucleinsäure. Dies kann auf zahlreiche Arten erfolgen, umfassend die Bindung an eine Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette oder an das Phosphat der Hauptkette oder an andere Gruppen analoger Hauptketten.
  • Zum grundlegenden Verständnis gilt anzumerken, dass die Stelle der Bindung in dieser Ausführungsform an einem 3'- oder 5'-terminalen Nucleotid oder an einem inneren Nucleotid sein kann, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das leitfähige Oligomer an die Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette gebunden. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, können Nucleoside, die an entweder der 2'- oder der 3'-Position der Ribose mit Aminogruppen, Schwefelgruppen, Siliciumgruppen, Phosphorgruppen oder Oxogruppen modifiziert sind, erzeugt werden (Imazawa et al., J. Org. Chem., 44, 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42(4), 714 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36(2), 250 (1971); McGee et al., J. Org. Chem. 61, 781–785 (1996); Mikhailopulo et al., Liebigs Ann. Chem, 513–519 (1993); McGee et al., Nucleosides & Nucleotides 14(6), 1329 (1995). Diese modifizierten Nucleoside werden dann eingesetzt, um die leitfähigen Oligomere hinzuzufügen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform setzt Amino-modifizierte Nucleoside ein. Diese Amino-modifizierten Ribosen können dann eingesetzt werden, um entweder Amidoder Aminbindungen zu den leitfähigen Oligomeren zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminogruppe direkt an die Ribose gebunden, obwohl, wie Fachleuten bekannt sein wird, kurze Linker, wie jene, die hierin für „Z" beschrieben sind, zwischen der Aminogruppe und der Ribose vorhanden sein können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Amidbindung zur Bindung an die Ribose eingesetzt. Vorzugsweise, sofern das leitfähige Oligomer der Strukturen 1–3 eingesetzt wird, ist m = null, und das leitfähige Oligomer endet mit der Amidbindung. In dieser Ausführungsform ist der Stickstoff der Aminogruppe der Aminomodifizierten Ribose das „D"-Atom des leitfähigen Oligomers. So ist eine bevorzugte Bindung dieser Ausführungsform in Struktur 20 dargestellt (unter Einsatz des leitfähigen Oligomers der Struktur 3):
  • Struktur 20
    Figure 00900001
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass in Struktur 20 die endständige Bindung als eine Amidbindung fixiert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Heteroatombindung eingesetzt, d.h. Oxo, Amin, Schwefel etc. Eine bevorzugte Ausführungsform setzt eine Aminbindung ein. Wie zuvor für die Amidbindungen erläutert kann der Stickstoff der Aminomodifizierten Ribose für Aminbindungen wiederum das „D"-Atom des leitfähigen Oligomers sein, wenn das leitfähige Oligomer der Struktur 3 eingesetzt wird. So zeigen beispielsweise Struktur 21 und Struktur 22 Nucleoside mit leitfähigen Oligomeren der Struktur 3 bzw. Struktur 9 unter Einsatz von Stickstoff als das Heteroatom, obwohl auch andere Heteroatome eingesetzt werden können:
  • Struktur 21
    Figure 00900002
  • In Struktur 21 sind vorzugsweise m und t nicht null. Ein bevorzugtes Z ist hierbei eine Methylengruppe oder andere aliphatische Alkyllinker. Ein, zwei oder drei Kohlenstoffatome in dieser Position sind aus synthetischen Gründen besonders nützlich.
  • Struktur 22
    Figure 00900003
  • In Struktur 22 ist Z wie zuvor definiert. Geeignete Linker umfassen Methylen und Ethylen.
  • In einer alternativen Ausführungsform ist das leitfähige Oligomer über das Phosphat der Ribose-Phosphat-Hauptkette (oder Analogon) einer Nucleinsäure kovalent an die Nucleinsäure gebunden. In dieser Ausführungsform ist die Bindung direkt, setzt einen Linker ein oder erfolgt über eine Amidbindung. Struktur 23 zeigt eine direkte Bindung, und Struktur 24 zeigt eine Bindung über eine Amidbindung (wobei beide leitfähige Oligomere der Struktur 3 einsetzen, obwohl leitfähige Oligomere der Struktur 8 ebenfalls möglich sind). Die Strukturen 23 und 24 zeigen das leitfähige Oligomer in der 3'-Position, obwohl die 5'-Position auch möglich ist. Weiters zeigen beide Strukturen 23 und 24 natürlich vorkommende Phosphodiesterbindungen, obwohl, wie Fachleuten bekannt sein wird, nicht dem Standard entsprechende Analoga von Phosphodiesterbindungen auch eingesetzt werden können.
  • Struktur 23
    Figure 00910001
  • In Struktur 23 ist Z vorzugsweise nicht vorhanden (d.h. t=0), wenn das terminale Y vorhanden ist (d.h. m=1). Ist das terminate Y nicht vorhanden, dann ist Z vorzugsweise vorhanden.
  • Struktur 24 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform, worin die terminale B-D-Bindung eine Amidbindung ist, das terminate Y nicht vorhanden ist und Z ein hierin definierter Linker ist.
  • Struktur 24
    Figure 00920001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das leitfähige Oligomer über einen Übergangsmetallliganden kovalent an die Nucleinsäure gebunden. In dieser Ausführungsform ist das leitfähige Oligomer kovalent an einen Liganden gebunden, der ein oder mehrere Koordinationsatome für ein Übergangsmetall bereitstellt. In einer Ausführungsform hat der Ligand, an den das leitfähige Oligomer gebunden ist, auch die Nucleinsäure an sich gebunden, wie im Allgemeinen in Struktur 25 dargestellt ist. Alternativ dazu ist das leitfähige Oligomer an einen Liganden gebunden, und die Nucleinsäure ist an einen anderen Liganden gebunden, wie im Allgemeinen in Struktur 26 dargestellt ist. So ist in Gegenwart des Übergangsmetalls das leitfähige Oligomer kovalent an die Nucleinsäure gebunden. Beide dieser Strukturen zeigen leitfähige Oligomere der Struktur 3, wobei auch andere Oligomere eingesetzt werden können. Die Strukturen 25 und 26 veranschaulichen zwei repräsentative Strukturen: Struktur 25
    Figure 00920002
    Struktur 26
    Figure 00920003
  • In den hierin dargestellten Strukturen ist M ein Metallatom, wobei Übergangsmetalle bevorzugt sind. Geeignete Übergangsmetalle zum Einsatz in der Erfindung umfas sen Cadmium (Cd). Kupfer (Cu), Cobalt (Co), Palladium (Pd), Zink (Zn), Eisen (Fe), Ruthenium (Ru), Rhodium (Rh), Osmium (Os), Rhenium (Re), Platin (Pt), Scandium (Sc), Titan (Ti), Vanadium (V), Chrom (Cr), Mangan (Mn), Nickel (Ni), Molybdän (Mo), Technetium (Tc), Wolfram (W) und Iridium (Ir), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Das bedeutet, dass die erste Serie der Übergangsmetalle, die Platinmetalle (Ru, Rh, Pd, Os, Ir und Pt) sowie Fe, Re, W, Mo und Tc bevorzugt sind. Besonders bevorzugt sind Ruthenium, Rhenium, Osmium, Platin, Cobalt und Eisen.
  • L sind die Co-Liganden, die die Koordinationsatome für die Bindung des Metallions bereitstellen. Fachleuten wird bekannt sein, dass die Anzahl und Beschaffenheit der Co-Liganden von der Koordinationszahl des Metallions abhängen. Ein-, zwei- oder mehrzähnige Co-Liganden können an jeder Position eingesetzt werden. Wenn das Metall beispielsweise eine Koordinationszahl von sechs aufweist, so ergänzen sich das L des Terminus des leitfähigen Oligomers, das L, das von der Nucleinsäure beigetragen wird, und r auf sechs. Weist das Metall also eine Koordinationszahl von sechs auf, so kann r im Bereich von null (wenn alle Koordinationsatome von den anderen zwei Liganden bereitgestellt werden) bis vier (wenn alle Co-Liganden einzähnig sind) liegen. So liegt r im Allgemeinen im Bereich von 0 bis 8, wobei dies von der Koordinationszahl des Metallions und der Auswahl der anderen Liganden abhängt.
  • In einer Ausführungsform hat das Metallion eine Koordinationszahl von sechs, und sowohl der an das leitfähige Oligomer gebundene Ligand als auch der an die Nucleinsäure gebundene Ligand sind zumindest zweizähnig; dies bedeutet, dass r vorzugsweise null, eins (d.h. dass der verbleibende Co-Ligand zweizähnig ist) oder zwei (zwei einzähnige Co-Liganden werden eingesetzt) ist.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die Co-Liganden dieselben oder unterschiedliche sein können. Geeignete Liganden fallen in zwei Kategorien: Liganden, die Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Kohlenstoff- oder Phosphoratome (je nach dem Metallion) als Koordinationsatome einsetzen (in der Literatur im Allgemeinen als Sigma- (σ-) Dono ren bezeichnet), und metallorganische Liganden wie Metallocen-Liganden (in der Literatur im Allgemeinen als Pi- (π-) Donoren bezeichnet und hierin als Lm dargestellt). Geeignete Stickstoff-Donorliganden sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen NH2; NHR; NRR'; Pyridin; Pyrazin; Isonicotinamid; Imidazol; Bipyridin und substituierte Derivate von Bipyridin; Terpyridin und substituierte Derivate; Phenanthroline, insbesondere 1,10-Phenanthrolin (als phen abgekürzt) und substituierte Derivate von Phenanthrolinen wie 4,7-Dimethylphenanthrolin und Dipyridol[3,2-a:2',3'-c]phenazin (als dppz abgekürzt), Dipyridophenazin; 1,4,5,8,9,12-Hexaazatriphenylen (als hat abgekürzt); 9,10-Phenanthrenchinondiimin (als phi abgekürzt); 1,4,5,8-Tetraazaphenanthren (als tap abgekürzt); 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan (als cyclam abgekürzt), EDTA, EGTA und Isocyanid, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Substituierte Derivate, umfassend kondensierte Derivate, können auch eingesetzt werden. In manchen Ausführungsformen können Porphyrine und substituierte Derivate der Porphyrinfamilie eingesetzt werden. Siehe beispielsweise Comprehensive Coordination Chemistry, Wilkinson et al. (Hrsg.), Pergammon Press, Kapitel 13.2 (73–98), 21.1 (813–898) und 21.3 (915–957) (1987).
  • Geeignete Sigmas-Donorliganden, die Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor einsetzen, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Geeignete Sigma-Kohlenstoff-Donoren können beispielsweise in Cotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5. Aufl., John Wiley & Sons (1988), z.B. auf Seite 38 gefunden werden. Dem ähnlich umfassen geeignete Sauerstoffliganden Kronenether, Wasser und andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Liganden. Phosphine und substituierte Phosphine sind auch geeignet; siehe Seite 38 aus Cotton und Wilkenson.
  • Die Sauerstoff-, Schwefel-, Phosphor- und Stickstoff-Donorliganden sind so gebunden, dass die Heteroatome als Koordinationsatome dienen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden metallorganische Liganden eingesetzt. Zusätzlich zu rein organischen Verbindungen für den Einsatz als Redox-Gruppierungen und verschiedenen Übergangsmetall-Koordinationskomplexen mit σ- gebundenem organischem Ligand mit Donoratomen als heterozyklische oder exozyklischen Substituenten gibt es eine breite Auswahl an erhältlichen metallorganischen Verbindungen von Übergangsmetall mit π-gebundenden organischen Liganden (siehe Advanced Inorganic Chemistry, 5. Aufl., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, Kapitel 26 (1988); Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2. Aufl., VCH (1992); und Comprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982–1994, Abel et al. (Hrsg.), Bd. 7, Kapitel 7, 8, 10 & 11, Pergamon Press). Solche metallorganischen Liganden umfassen zyklische aromatische Verbindungen wie das Cyclopentadienidion [C5H5(–1)] und verschiedene Ring-substituierte und Ring-kondensierte Derivate wie das Indenylid- (–1) Ion, das eine Klasse von Bis(cyclopentadienyl)-Metallverbindungen hervorbringt (d.h. die Metallocene); siehe beispielsweise Robins et al, J. Am. Chem. Soc. 104, 1.882–1893 (1982); und Gassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108, 4.228–4.229 (1986). Von diesen sind Ferrocen [(C5H5)2Fe] und seine Derivate prototypische Beispiele, die in zahlreichen chemischen (Connelly et al., Chem. Rev. 96, 877–910 (1996)) und elektrochemischen (Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23, 1–93; und Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24, 87) Elektronenübertragungs- oder „Redox"-Reaktionen eingesetzt wurden. Metallocen-Derivate aus einer Vielzahl der Übergangsmetalle der ersten, zweiten und dritten Reihe sind potentielle Kandidaten für Redox-Gruppierungen, die kovalent an entweder an den Ribosering oder die Nucleosidbase von Nucleinsäure gebunden sind. Andere potentiell geeignete metallorganische Liganden umfassen zyklische Arene wie Benzol, um Bis(aren)metallverbindung zu ergeben, und deren Ring-substituierte und Ring-kondensierte Derivate, von denen Bis(benzol)chrom ein prototypisches Beispiel ist. Andere azyklische π-gebundende Liganden wie das Allyl(-1)ion oder Butadien ergeben potentiell geeignete metallorganische Verbindungen, und alle diese Liganden, in Verbindung mit anderen π-gebundenden und σ-gebundenen Liganden, setzen die allgemeine Klasse metallorganischer Verbindungen zusammen, in der eine Metall-Kohlenstoff-Bindung vorkommt. Elektrochemische Studien verschiedener Dimere und Oligomere solcher Verbindungen mit organischen Verbrückungsliganden und zusätzliche, nicht verbrückende Liganden, sowohl mit als auch ohne Metall-Metall- Bindungen, sind potentielle Kandidaten für Redox-Gruppierungen bei der Nucleinsäureanalyse.
  • Sind ein oder mehrere Co-Liganden metallorganische Liganden, so ist der Ligand im Allgemeinen über eines der Kohlenstoffatome des metallorganischen Liganden gebunden, wobei die Bindung für heterozyklische Liganden auch über andere. Atome erfolgen kann. Bevorzugte metallorganische Liganden umfassen Metallocen-Liganden, umfassend substituierte Derivate und Metallocenophane (siehe Seite 1.174 aus Cotton and Wilkenson, s.o.). Derivate von Metallocenliganden wie Methylcyclopentadienyl, wobei zahlreiche Methylgruppen bevorzugt sind, wie z.B. Pentamethylcyclopentadienyl, können beispielsweise eingesetzt werden, um die Stabilität des Metallocens zu steigern. In einer bevorzugten Ausführungsform ist nur einer der zwei Metallocenliganden derivatisiert.
  • Wie hierin beschrieben kann jegliche Kombination von Liganden eingesetzt werden. Bevorzugte Kombinationen umfassen: a) alle Liganden sind Stickstoff-Donorliganden; b) alle Liganden sind metallorganische Liganden; und c) der Ligand am Terminus des leitfähigen Oligomers ist ein Metallocenligand und der durch die Nucleinsäure bereitgestellte Ligand ist ein Stickstoff-Donorligand, wobei die anderen Liganden, sofern erforderlich, entweder Stickstoff-Donorliganden oder Metallocenliganden oder ein Gemisch davon sind. Diese Kombinationen sind in den repräsentativen Strukturen, die das leitfähige Oligomer der Struktur 3 einsetzen, 27 (wobei Phenanthrolin und Amino als repräsentative Liganden eingesetzt werden), 28 (wobei Ferrocen als die Metall-Ligand-Kombination eingesetzt wird) und 29 (wobei Cyclopentadienyl und Amino als repräsentative Liganden eingesetzt werden) dargestellt.
  • Struktur 27
    Figure 00960001
  • Struktur 28
    Figure 00970001
  • Struktur 29
    Figure 00970002
  • In einer bevorzugten Ausführungsform zeigen die in der Erfindung eingesetzten Liganden in Abhängigkeit vom Redox-Zustand des chelatisierten Metallions veränderte Fluoreszenzeigenschaften. Wie nachstehend beschrieben dient dies als ein zusätzlicher Modus zur Detektion der Elektronenübertragung zwischen der ETM und der Elektrode.
  • Weiters können ähnliche Verfahren eingesetzt werden, um Proteine an die Detektionselektrode zu binden; siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5.620.850, das hierin durch Verweis aufgenommen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, ist der an die Nucleinsäure gebundene Ligand eine Aminogruppe, die an Position 2' oder 3' einer Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette gebunden ist. Dieser Ligand kann eine Vielzahl an Aminogruppen enthalten, um einen vielzähnigen Liganden zu bilden, der das Metallion bindet. Andere bevorzugte Liganden umfassen Cyclopentadien und Phenanthrolin.
  • Der Einsatz von Metallionen, um die Nucleinsäuren zu verbinden, kann als eine interne Kontrolle oder Kalibrierung des Systems dienen, um die Anzahl der verfügbaren Nucleinsäuren an der Oberfläche zu berechnen. Fachleuten wird jedoch bekannt sein, dass, werden Metallionen eingesetzt, um die Nucleinsäuren mit den leitfähigen Oligomeren zu verbinden, es im Allgemeinen wünschenswert ist, dass dieser Metallionenkomplex ein anderes Redox-Potential aufweist als die ETM, die im übrigen System eingesetzt werden, wie nachstehend noch beschrieben wird. Dies gilt im Allgemeinen, um in der Lage zu sein, die Gegenwart der Einfangsonde von der Gegenwart der Zielsequenz zu unterscheiden. Dies kann nützlich zur Identifizierung, Kalibrierung und/oder Quantifizierung sein. So kann die Menge einer Einfangsonde auf einer Elektrode mit der Menge hybridisierter, doppelsträngiger Nucleinsäure verglichen werden, um die Menge der Zielsequenz in einer Probe zu quantifizieren. Dies ist sehr bedeutend, um als innere Steuerung des Sensors oder Systems zu dienen. Es ermöglicht eher eine Messung, entweder vor der Zugabe des Targets oder danach, am selben Molekül, das auch zur Detektion eingesetzt wird, als sich auf ein ähnliches, aber doch anderes Steuerungssystem zu verlassen. So können die tatsächlichen Moleküle, die zur Detektion eingesetzt werden, vor jedem Experiment quantifiziert werden. Das ist ein bedeutsamer Vorteil gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Einfangsonden-Nucleinsäuren (oder andere Bindungsliganden) über einen Isolator kovalent an die Elektrode gebunden. Die Bindung der Nucleinsäuren (und anderer Bindungsliganden) an Isolatoren wie Alkylgruppen sind bekannt und können an die Base der Hauptkette, umfassend die Ribose oder das Phosphat für Hauptketten, die diese Gruppierungen enthalten, oder an alternierende Hauptketten von Nucleinsäureanaloga erfolgen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können eine oder mehrere unterschiedliche Einfangsondenspezies an der Oberfläche vorhanden sein. In manchen Ausführungsformen kann ein Einfangsondentyp oder ein Einfangsondenverlängerungstyp, wie nachstehend noch ausführlich beschrieben wird, vorhanden sein. Alternativ dazu können unterschiedliche Einfangsonden oder eine Einfangsonde mit einer Vielzahl an unterschiedlichen Einfangverlängerungssonden eingesetzt werden. Dem ähnlich kann es wünschenswert sein (insbesondere im Falle von Nucleinsäureanalyten und Bindungsliganden in Mechanismus-2-Systemen), Hilfseinfangsonden einzusetzen, die relativ kurze Sondensequenzen umfassen, die eingesetzt werden können, um Komponenten des Systems, beispielsweise Verstärkungslinker, „festzumachen", um die Konzentration der ETM an der Oberfläche zu erhöhen.
  • So stellt die vorliegende Erfindung Substrate bereit, die zumindest eine Detektionselektrode umfassen, die für Zielanalyt-Detektionssystemen nützliche Monoschichten und Einfangbindungsliganden aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen weiters eine Lösung oder lösliche Bindungsliganden, wobei dies nachstehend noch genauer beschrieben wird, und in Mechanismus-1-Systemen können die ETM in Form von nicht kovalent gebundenen Hybridisierungsindikatoren zugesetzt werden. Lösungsbindungsliganden sind den Einfangbindungsliganden darin ähnlich, dass sie sich, vorzugsweise spezifisch, an Zielanalyte binden. Der Lösungsbindungsligand kann derselbe oder ein anderer als der Einfangbindungsligand sein. Im Allgemeinen sind Lösungsbindungsliganden nicht direkt an die Oberfläche gebunden, obwohl sie, wie in 5A dargestellt, das sein können. Der Lösungsbindungsligand kann entweder direkt einen Verstärkungslinker umfassen, der zumindest eine ETM (4A) umfasst, oder der Verstärkungslinker bindet sich entweder direkt (4A) oder indirekt (4E) an den Lösungsbindungsliganden.
  • So werden „Lösungsbindungsliganden" oder „lösliche Bindungsliganden" oder „Signalträger" oder „Markierungssonden" oder „Markierungsbindungsliganden" mit Verstärkungslinkern, umfassend kovalent gebundene ETM, bereitgestellt.
  • Das bedeutet, dass ein Abschnitt der Markierungssonde oder des Lösungsbindungsliganden direkt oder indirekt an den Zielanalyt gebunden ist, und ein Abschnitt umfasst einen Verstärkungslinker, umfassend kovalent gebundene ETM. In manchen Systemen, beispielsweise in Mechanismus-1-Nucleinsäure-Systemen, können diese dieselben sein. Dem ähnlich umfasst der Verstärkungslinker in Mechanismus-1-Systemen Nucleinsäure, die an Detektionssonden hybridisiert. Die Bezeichnungen „Elektronendonorgruppierung", „Elektronenakzeptorgruppierung" und „ETM" oder grammatikalische Entsprechungen beziehen sich hierin auf Moleküle, die unter bestimmten Bedingungen zur Elektronenübertragung in der Lage sind. Es gilt anzumerken, dass die Elektronendonor- und Elektronenakzeptorfähigkeiten relativ sind; das bedeutet, dass ein Molekül, das unter bestimmten experimentellen Bedingungen ein Elektron abgeben kann, in der Lage ist, ein Elektron unter anderen experimentellen Bedingungen aufzunehmen. Es gilt anzumerken, dass die Anzahl möglicher Elektronendonorgruppierungen und Elektronenakzeptorgruppierungen sehr groß ist und dass Fachleute auf dem Gebiet der Elektronenübertragungsverbindungen in der Lage sein werden, eine Anzahl an Verbindungen in der vorliegenden Verbindung einzusetzen. Bevorzugte ETM umfassen Übergangsmetallkomplexe, organische ETM und Elektroden, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ETM Übergangsmetallkomplexe. Übergangsmetalle sind jene, deren Atome eine teilweise oder vollständige d-Elektronenschale aufweisen. Geeignete Übergangsmetalle zum Einsatz in der Erfindung sind zuvor gelistet.
  • Die Übergangsmetalle bilden mit einer Vielzahl an Liganden L, wie zuvor definiert, einen Komplex, um geeignete Übergangsmetallkomplexe, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zu bilden.
  • Zusätzlich zu Übergangsmetallkomplexen können andere organische Elektronendonoren und -akzeptoren kovalent an die Nucleinsäure zum Einsatz in dieser Erfindung gebunden sein. Diese organischen Moleküle umfassen Riboflavin, Xanthenfarbstoffe, Azinfarbstoffe, Acridinorange, N,N'-Dimethyl-2,7-diazapyreniumdichlorid (DAP2+), Methylviologen, Ethidiumbromid, Chinone wie N,N'-Dimethylanthra(2,1,9-def:6,5,10-d'e'f')diisochinolindichlorid (ADIQ2+); Porphyrine [Meso-tetrakis(N-methyl-x-pyridinium)porphyrintetrachlorid], Varlamine Blue B Hydrochlorid, Bindschedler-Grün; 2,6-Dichlorindophenol, 2,6-Dibromphenolindophenol; Brilliantkresylblau (3-Amino-9-dimethylamino-10-methylphenoxyazinchlorid), Methylen-Blau; Nilblau A (Aminoaphthodiethylaminophenoxazinsulfat), Indigo-5,5',7,7'-tetrasulfonsäure, Indigo-5,5',7-trisulfonsäure; Phenosafranin, Indigo-5-monosulfonsäure; Safranin T; Bis(dimethylglyoximat)eisen(II)-chlorid; Indulinscharlach, Neutralrot, Anthracen, Coronen, Pyren, 9-Phenylanthracen, Rubren, Binaphthyl, DPA, Phenothiazen, Fluoranthen, Phenanthren, Chrysen, 1,8-Diphenyl-1,3,5,7-octatetracen, Naphthalin, Acenaphthalin, Perylen, TMPD und Analoga und substituierte Derivate dieser Verbindungen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer Ausführungsform sind die Elektronendonoren und -akzeptoren Redoxproteine, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Redoxproteine sind jedoch in zahlreichen Ausführungsformen nicht bevorzugt.
  • In einer Ausführungsform, insbesondere wenn ein Elektrophoreseschritt eingesetzt wird, werden die ETM so ausgewählt, dass sie geladene Moleküle sind, vorzugsweise wenn der Zielanalyt nicht geladen ist. So können beispielsweise Lösungsbindungsliganden, die entweder direkt oder indirekt mehrere geladene ETM enthalten, vor der Elektrophorese an den Zielanalyt gebunden werden, um zu ermöglichen, dass der Zielanalyt eine ausreichende Ladung aufweist, um sich im elektrischen Feld zu bewegen, wodurch ein doppelter Zweck des Bereitstellens von Ladung und einer Detektionsgruppierung entsteht. So können beispielsweise Markierungssonden eingesetzt werden, die geladene ETM enthalten, die sich entweder direkt an den Zielanalyt oder an Übergangsspezies wie eine Amplifikationssonde binden. Alternativ dazu können andere geladene Spezies zusätzlich zu den ETM zugesetzt werden. Alternativ dazu können diese geladenen Spezies auch in das System integriert sein; ein Teil der Markierungssonde kann beispielsweise ein geladenes Polymer wie Polylysin sein. In dieser Ausführungsform jedoch kann die Wanderung von nicht spezifisch gebundenen Markierungssonden an die Detektionsoberfläche zu einer Steigerung der nicht spezifischen Signale führen. Daher kann in dieser Ausführungsform der Einsatz eines umgekehrten elektrischen Feldes (im Allgemeinen ein Impuls umgekehrter Polarität) nach der Elektrophorese dazu führen, dass nicht spezifisch gebundene Markierungssonden von der Detektionssondenoberfläche weg- oder fort bewegt werden, was wiederum zu einer Reduktion des nicht spezifischen Hintergrundsignals führt.
  • Die Auswahl der spezifischen ETM wird durch den Typ der eingesetzten Elektronenübertragungsdetektion beeinflusst, wie nachstehend im Allgemeinen noch beschrieben wird. Bevorzugte ETM sind Metallocene, wobei Ferrocen und Derivate davon besonders bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere ETM eingesetzt. Wie in den Beispielen gezeigt wird, führt der Einsatz von mehreren ETM zur Signalamplifikation und ermöglicht so empfindlichere Detektionsgrenzen. Nachstehend wird noch erläutert, dass, während der Einsatz von mehreren ETM an Nucleinsäuren, die an komplementäre Stränge hybridisieren, zu Senkungen der Tms der Hybridisierungskomplexe führen kann, was auch von der Anzahl, der Bindungsstelle und den Abständen zwischen den mehreren ETM abhängt, dies kein Faktor ist, wenn die ETM am Verstärkungslinker (d.h. in „Mechanismus-2"-Systemen) angebracht sind, da dieser nicht an eine komplementäre Sequenz hybridisiert. Demgemäß ist eine Vielzahl an ETM bevorzugt, wobei zumindest etwa 2 ETM pro Verstärkungslinker bevorzugt sind, und zumindest etwa 10 besonders bevorzugt sind, und zumindest etwa 20 bis 50 am meisten bevorzugt sind. In manchen Fällen können sehr große Mengen an ETM (50 bis 1.000) eingesetzt werden.
  • So werden Lösungsbindungsliganden oder Markierungssonden mit kovalent gebundenen ETM bereitgestellt. Das Verfahren des Bindens der ETM an den Lösungsbindungsliganden hängt vom Detektionsmodus (d.h. ob Mechanismus-1-Systeme oder Mechanismus-2-Systeme eingesetzt werden) und der Zusammensetzung des Lösungsbindungsliganden ab. Wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, wird in Mechanismus-2-Systemen der Abschnitt des Lösungsbindungsliganden (oder der Markierungssonde), der (die) die ETM umfasst, als ein „Verstärkungslinker" bezeichnet und kann entweder Nucleinsäure oder keine Nucleinsäure umfassen. In Mechanismus-1-Systemen muss der Verstärkungslinker Nucleinsäure sein.
  • So gibt es, wie Fachleuten bekannt sein wird, eine Vielzahl an Konfigurationen, die eingesetzt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Verstärkungslinker Nucleinsäure (umfassend Analoga), und die Bindung der ETM kann über (1) eine Base; (2) die Hauptkette, umfassend die Ribose, das Phosphat oder vergleichbare Strukturen in Nucleinsäureanaloga; (3) Nucleosidersetzung, die nachstehend beschrieben wird; oder (4) Metallocenpolymere, die nachstehend beschrieben werden, erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Verstärkungslinker keine Nucleinsäure und kann entweder ein Metallocen-Polymer oder ein Polymer vom Alkyl-Typ (umfassend Heteroalkyl, wie nachstehend genauer beschrieben wird) sein, das ETM-Substitutionsgruppen enthält. Diese Möglichkeiten sind im Allgemeinen in 7 dargestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Verstärkungslinker eine Nucleinsäure und umfasst kovalent gebundene ETM. Die ETM können an verschiedenen Positionen an die Nucleoside innerhalb der Nucleinsäure gebunden sein. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen (1) Bindung an die Base des Nucleosids, (2) Bindung der ETM als eine Basenersetzung, (3) Bindung an die Hauptkette der Nucleinsäure, entweder an eine Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette oder an eine Phosphatgruppierung oder an analoge Strukturen in Nucleinsäureanaloga, und (4) Bindung über Metallocenpolymere, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Weiters kann es, wie nachstehend beschrieben, wenn der Verstärkungslinker Nucleinsäure ist, wünschenswert sein, sekundäre Markierungssonden einzusetzen, die einen ersten Abschnitt, der an einen Abschnitt der primären Markierungssonde hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt, der einen hierin definierten Verstärkungslinker umfasst, aufweisen. Dies wird im Allgemeinen in den 6Q und 6R dargestellt; dies ist dem Einsatz einer Amplifikationssonde ähnlich, mit der Ausnahme, dass sowohl die primären als auch die sekundären Markierungssonden ETM umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ETM an die Base eines Nucleosids, wie zuvor im Allgemeinen erläutert, zur Bindung des leitfähigen Oligomers gebunden. Die Bindung kann an ein inneres Nucleosid oder an ein terminales Nucleosid erfolgen.
  • Die kovalente Bindung an die Base hängt teilweise von der ausgewählten ETM ab, ist im Allgemeinen jedoch der Bindung des leitfähigen Oligomers an Basen, wie zuvor erläutert, ähnlich. Die Bindung kann im Allgemeinen an jeder Position der Base erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ETM ein Übergangsmetallkomplex, wodurch die Bindung eines geeigneten Metallliganden an die Base zur kovalenten Bindung der ETM führt. Alternativ dazu können, wie Fachleuten bekannt sein wird, ähnliche Bindungstypen zur Bindung von organischen ETM eingesetzt werden.
  • In einer Ausführungsform können die C4-gebundene Aminogruppe von Cytosin, die C6-gebundene Aminogruppe von Adenin oder die C2-gebundene Aminogruppe von Guanin als ein Übergangsmetallligand eingesetzt werden.
  • Liganden, die aromatische Gruppen enthalten, können über auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Acetylenbindungen gebunden werden (siehe Comprehensive Organic Synthesis, Trost et al. (Hrsg.), Pergamon Press, Kapitel 2.4: Coupling Reactions Between sp2 and sp Carbon Centers, Sonogashira, S. 521–549 und 950–953). Struktur 30 stellt eine repräsentative Struktur in Gegenwart des Metallions und jeglicher anderer notwendiger Liganden dar; Struktur 30 stellt Uridin dar, obwohl, wie auch in allen anderen hierin gezeigten Strukturen, auch jede andere Base eingesetzt werden kann.
  • Struktur 30
    Figure 01040001
  • La ist ein Ligand, der Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- oder Phosphor-Donorliganden oder metallorganische Liganden wie Metallocenliganden einschließen kann. Geeignete La-Liganden umfassen Phenanthrolin, Imidazol, bpy und terpy, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Lr und M sind wie oben definiert. Fachleuten wird wiederum bekannt sein, dass ein Linker („Z") zwischen dem Nucleosid und der ETM eingebunden sein kann.
  • Ähnlich wie bei leitfähigen Oligomeren kann die Bindung mittels eines Linkers erfolgen, der eine Amidbindung einsetzen kann (siehe im Allgemeinen Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 7.221–7.226 (1989); Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 7.226–7.232 (1989)). Diese Strukturen sind im Allgemeinen nachstehend in Struktur 31 dargestellt, die wiederum Uridin als Base einsetzt, obwohl wie zuvor andere Basen ebenfalls eingesetzt werden können:
  • Struktur 31
    Figure 01050001
  • In dieser Ausführungsform ist L ein wie oben definierter Ligand, wobei Lr und M ebenfalls wie zuvor definiert sind. Vorzugsweise ist L Amino, phen, byp und terpy.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die an ein Nucleosid gebundene ETM ein Metallocen; d.h. dass L und Lr aus Struktur 31 beide Metallocen-Liganden sind, und Lm ist wie zuvor beschrieben. Struktur 32 stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar, worin das Metallocen Ferrocen und die Base Uridin ist, wobei andere Basen eingesetzt werden können:
  • Struktur 32
    Figure 01060001
  • Erste Daten schlagen vor, dass Struktur 32 zyklisch sein kann, wobei das zweite Acetylenkohlenstoffatom den Carbonylsauerstoff angreift und so eine Furan-ähnliche Struktur bildet. Bevorzugte Metallocene umfassen Ferrocen, Cobaltocen und Osmiumocen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die ETM an eine Ribose an jeder beliebigen Position der Ribose-Phosphat-Hauptkette der Nucleinsäure gebunden, d.h. entweder den 5'- oder 3'-Terminus oder jedes innere Nucleosid. Ribose kann in diesem Fall Riboseanaloga umfassen. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt können Nucleoside hergestellt werden, die entweder an Position 2' oder 3' der Ribose modifiziert sind, wobei Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphor-hältige Modifikationen möglich sind. Amino-modifizierte und Sauerstoff-modifizierte Ribose ist bevorzugt. Siehe im Allgemeinen die PCT-Veröffentlichung WO 95/15.971. Diese Modifikationsgruppen können als ein Übergangsmetallligand oder als eine chemisch funktionelle Gruppierung zur Bindung anderer Übergangsmetallliganden oder metallorganischen Liganden oder aber als organische Elektronendonorgruppierungen, wie Fachleuten bekannt sein wird, eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform kann auch ein Linker, der hierin als „Z" definiert ist, oder ein leitfähiges Oligomer zwischen der Ribose und der ETM eingesetzt werden. Bevorzugte Ausführungsformen setzen eine Bindung an Position 2' oder 3' der Ribose ein, wobei Position 2' bevorzugt ist. So können die leitfähigen Oligomere, die in den Strukturen 13, 14 und 15 dargestellt sind, durch ETM ersetzt werden; alternativ dazu können die ETM an freien Termini des leitfähigen Oligomers hinzugefügt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dient ein Metallocen als die ETM und ist über eine Amidbindung, wie nachstehend in Struktur 33 dargestellt, gebunden. Diese Beispiele erläutern die Synthese einer bevorzugten Verbindung, wenn das Metallocen Ferrocen ist.
  • Struktur 33
    Figure 01070001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Aminbindungen eingesetzt, wie im Allgemeinen in Struktur 34 dargestellt ist:
  • Struktur 34
    Figure 01070002
  • Z ist ein hierin definierter Linker, wobei 1–16 Atome bevorzugt sind, und 2–4 Atome besonders bevorzugt sind, und t ist entweder eins oder null.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Oxobindungen eingesetzt, wie im Allgemeinen in Struktur 35 dargestellt ist:
  • Struktur 35
    Figure 01070003
  • In Struktur 35 ist Z ein hierin definierter Linker, und t ist entweder eins oder null. Bevorzugte Z-Linker umfassen Alkylgruppen, umfassend Heteroalkylgruppen wie z.B. (CH2)n und (CH2CH2O)n, wobei n von 1 bis 10 bevorzugt ist, und n von 1 bis 4 besonders bevorzugt ist, und n = 4 am meisten bevorzugt ist.
  • Bindungen, die andere Heteroatome einsetzen, sind ebenfalls möglich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine ETM an ein Phosphat an jeder beliebigen Position der Ribose-Phosphat-Hauptkette der Nucleinsäure gebunden. Dies kann auf verschiedene Arten geschehen. In einer Ausführungsform können Phosphodiesterbindungsanaloga wie Phsophoramid- oder Phosphoramiditbindungen in eine Nucl einsäure eingebunden werden, wobei das Heteroatom (d.h. Stickstoff) als ein Übergangsmetallligand dient (siehe die PCT-Veröffentlichung WO 95/15.971). Alternativ dazu können die leitfähigen Oligomere der Strukturen 23 und 24 durch ETM ersetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Zusammensetzung die in Struktur 36 dargestellte Struktur auf:
  • Struktur 36
    Figure 01080001
  • In Struktur 36 ist die ETM über eine Phosphatbindung im Allgemeinen mittels eines Linkers Z gebunden. Bevorzugte Z-Linker umfassen Alkylgruppen, umfassend Heteroalkylgruppen wie z.B. (CH2)n, (CH2CH2O)n, wobei n von 1 bis 10 bevorzugt ist, und n von 1 bis 4 besonders bevorzugt ist, und n = 4 am meisten bevorzugt ist.
  • In Mechanismus-2-Systemen, wenn die ETM an die Base oder die Hauptkette des Nucleosids gebunden ist, ist es möglich, die ETM über „Dendrimer"-Strukturen zu binden, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird. Wie in 8 im Allgemei nen veranschaulicht wird, können Alkyl-basierte Linker eingesetzt werden, um vielfach verzweigte Strukturen zu schaffen, die eine oder mehrere ETM am Terminus jeder Verzweigung aufweisen. Im Allgemeinen erfolgt dies durch Schaffen von Verzweigungspunkten, die vielfache Hydroxygruppen umfassen, die gegebenenfalls eingesetzt werden können, um dann zusätzliche Verzweigungspunkte hinzuzufügen. Die terminalen Hydroxygruppen können dann in Phosphoramiditreaktionen eingesetzt werden, um ETM hinzuzufügen, wie es nachstehend im Allgemeinen zur Nucleosidersetzung und in Metallocenpolymerreaktionen durchgeführt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine ETM wie ein Metallocen als eine „Nucleosidersetzung" eingesetzt, die als eine ETM dient. Die Distanz zwischen den zwei Cyclopentadienringen von Ferrocen beispielsweise ist der orthogonalen Distanz zwischen zwei Basen in einer doppelsträngigen Nucleinsäure ähnlich. Andere Metallocene können zusätzlich zu Ferrocen eingesetzt werden, beispielsweise luftbeständige Metallocene wie jene, die Cobalt oder Ruthenium enthalten. So können Metallocengruppierungen in die Hauptkette einer Nucleinsäure eingebunden werden, wie im Allgemeinen in Struktur 37 (Nucleinsäure mit einer Ribose-Phosphat-Hauptkette) und in Struktur 38 (Peptidnucleinsäurehauptkette) dargestellt wird. Die Strukturen 37 und 38 stellen Ferrocen dar, wobei, wie Fachleute selbstverständlich erkennen werden, andere Metallocene ebenfalls eingesetzt werden können. Im Allgemeinen werden luftbeständige Metallocene, umfassend Metallocene, die Ruthenium und Cobalt als Metalle einsetzen, bevorzugt.
  • Struktur 37
    Figure 01090001
  • In Struktur 37 ist Z ein wie oben definierter Linker mit im Allgemeinen kurzen Alkylgruppen, wobei jene mit Heteroatomen wie z.B. Sauerstoff bevorzugt sind. Im Allgemeinen ist die Länge des Linkers maßgebend, sodass minimale Störungen einer doppelsträngigen Nucleinsäure bewirkt werden, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird. So sind Methylen, Ethylen, Ethylenglykole, Propylen und Butylen bevorzugt, wobei Ethylen und Ethylenglykol besonders bevo rzugt sind. Darüber hinaus können die jeweiligen Z-Linker dieselben oder unterschiedliche sein. Struktur 37 stellt eine Ribose-Phosphat-Hauptkette dar, wobei, wie Fachleute sicherlich erkennen werden, ebenfalls Nucleinsäureanaloga, umfassend Riboseanaloga und Phosphatbindungsanaloga, eingesetzt werden können.
  • Struktur 38
    Figure 01100001
  • Hinsichtlich Struktur 38 sind bevorzugte Z-Gruppen wie zuvor aufgelistet, wobei die jeweiligen Z-Linker wiederum dieselben oder unterschiedliche sein können. Wie zuvor können auch andere Nucleinsäureanaloga eingesetzt werden.
  • Obwohl die Strukturen und die Diskussion zuvor Metallocene, und besonders Ferrocen, darstellen, kann diese selbe allgemeine Idee darüber hinaus auch eingesetzt werden, um ETM zusätzlich zu Metallocenen als Nucleosidersatz oder in Poly merausführungsformen, wie nachstehend beschrieben, hinzuzufügen. So können, beispielsweise wenn die ETM ein Übergangsmetallkomplex ist, der kein Metallocen ist und einen, zwei oder drei (oder mehr) Liganden umfasst, die Liganden wie für Ferrocen dargestellt wurde funktionalisiert werden, um den Zusatz von Phosphoramiditgruppen zu ermöglichen. Besonders bevorzugt in dieser Ausführungsform sind Komplexe, die zumindest zwei Ring- (beispielsweise Aryl- und substituierte Aryl-) Liganden umfassen, worin jeder der Liganden funktionelle Gruppen zur Bindung über Phosphoramiditchemie umfasst. Fachleuten wird bekannt sein, dass dieser Reaktionstyp, der Polymere von ETM entweder als einen Abschnitt der Hauptkette der Nucleinsäure oder als „Seitengruppen" der Nucleinsäuren schafft, um die Amplifikation der hierin erzeugten Signale zu ermöglichen, mittels praktisch jeder ETM durchgeführt werden kann, die so funktionalisiert werden kann, dass sie die passenden chemischen Gruppen enthält.
  • So können durch Einführen eines Metallocens wie Ferrocen (oder andere ETM) in die Hauptkette einer Nucleinsäure Nucleinsäureanaloga erzeugt werden; das bedeutet, dass die Erfindung Nucleinsäuren bereitstellt, die eine Hauptkette mit zumindest einem Metallocen aufweisen. Dies wird von Nucleinsäuren unterschieden, die Metallocene an die Hauptkette gebunden haben, d.h. über eine Ribose, ein Phosphat usw. Das bedeutet, dass zwei Nucleinsäuren, wobei jede aus einer herkömmlichen Nucleinsäure oder einem Analogon (Nucleinsäuren, die in diesem Fall ein einziges Nucleosid umfassen) besteht, über ein Metallocen kovalent aneinander gebunden werden können. Anders gesehen wird ein Metallocenderivat oder substituiertes Metallocen bereitgestellt, worin jeder der zwei aromatischen Ringe des Metallocens eine Nucleinsäure-Substituentengruppe aufweist.
  • Weiters, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, ist es möglich, mehr als ein Metallocen in die Hauptkette einzubinden, entweder mit dazwischen liegenden Nucleotiden und/oder mit aneinandergrenzenden Metallocenen. Werden aneinandergrenzende Metallocene in die Hauptkette eingebunden, ist dies dem nachstehenden Verfahren, das nachstehend als „Metallocen-Polymere" beschrieben wird, ähn lich; dies bedeutet, dass es Metallocen-Polymer-Bereiche innerhalb der Hauptkette gibt.
  • Über die Nucleinsäure-Substituentengruppe hinaus ist es auch wünschenswert, in manchen Fällen zusätzliche Substituentengruppen zu einem oder beiden der aromatischen Ringe des Metallocens (oder der ETM) hinzuzufügen. Da diese Nucleosidersetzungen im Allgemeinen Teile von Sondensequenzen sind, die mit einer im Wesentlichen komplementären Nucleinsäure, beispielsweise einer Zielsequenz oder einer anderen Sondensequenz, hybridisiert werden, ist es beispielsweise möglich, den Metallocenringen Substituentengruppen hinzuzufügen, um die Wasserstoffbindung an die Base oder Basen des gegenüberliegenden Strangs zu erleichtern. Diese können an jeder beliebigen Position in die Metallocenringe eingefügt werden. Geeignete Substituentengruppen umfassen Amidgruppen, Aminogruppen, Carbonsäuren und Alkohole, umfassend substituierte Alkohole, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Darüber hinaus können diese Substituentengruppen auch über Linker gebunden werden, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt ist.
  • Weiters können Substituentengruppen an einer ETM, insbesondere Metallocene wie Ferrocen, hinzugefügt werden, um die Redox-Eigenschaften der ETM zu verändern. So kann es beispielsweise in manchen Ausführungsformen, wie nachstehend genauer beschrieben wird, wünschenswert sein, verschiedene ETM auf unterschiedliche Weisen (d.h. über Basen- oder Ribosenbindung) an unterschiedliche Sonden oder zu unterschiedlichen Zwecken gebunden zu haben (beispielsweise zur Kalibration oder als interner Standard). So kann der Zusatz von Substituentengruppen an das Metallocen ermöglichen, zwei verschiedene ETM zu unterscheiden.
  • Um diese Metallocen-Hauptketten-Nucleinsäure-Analoga zu erzeugen, werden auch Zwischenkomponenten bereitgestellt. So stellt in einer bevorzugten Ausführungsform die Erfindung Phosphoramiditmetallocene bereit, wie sie im Allgemeinen in Struktur 39 dargestellt sind:
  • Struktur 39
    Figure 01130001
  • In Struktur 39 ist PG eine Schutzgruppe, die im Allgemeinen zum Einsatz bei der Nucleinsäuresynthese geeignet ist, wobei DMT, MMT und auch TMT bevorzugt sind. Die aromatischen Ringe können entweder Metallocen-Ringe oder aromatische Ringe von Liganden für Übergangsmetallkomplexe oder andere organische ETM sein. Die aromatischen Ringe können dieselben oder unterschiedliche sein und können wie hierin erläutert substituiert sein. Struktur 40 stellt das Ferrocenderivat dar:
  • Struktur 40
    Figure 01130002
  • Diese Phosphoramiditanaloga können bei Standard-Oligonucleotidsynthese-verfahren, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zugesetzt werden.
  • Struktur 41 stellt das Ferrocen-Peptid-Nucleinsäure- (PNA-) Monomer dar, das der PNA-Synthese, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, zugesetzt werden kann.
  • Struktur 41
    Figure 01140001
  • In Struktur 41 ist die PG-Schutzgruppe geeignet, in Peptid-Nucleinsäure-Synthese eingesetzt zu werden, wobei MMT, boc und Fmoc bevorzugt sind.
  • Eben diese Zwischenverbindungen können eingesetzt werden, um ETM oder Metallocenpolymere zu bilden, die den Nucleinsäuren zugesetzt werden, und können eher nicht als Hauptkettenersetzungen eingesetzt werden, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, besonders für den Einsatz in Mechanismus-2-Systemen, werden die ETM als Polymere, beispielsweise als Metallocenpolymere, in einer „verzweigten" Anordnung ähnlich den „verzweigten DNA"-Ausführungsformen, die hierin und im US-Patent Nr. 5.124.246 erläutert werden, unter Einsatz modifizierter, funktionalisierter Nucleotide gebunden. Die allgemeine Idee wird im Folgenden erklärt. Ein modifiziertes Phosphoramiditnucleotid wird erzeugt, das schließlich eine freie Hydroxygruppe enthalten kann, die zur Bindung von Phosphoramidit-ETM wie Metallocene eingesetzt werden kann. Diese freie Hydroxygruppe könnte an der Base oder der Hauptkette, wie z.B. der Ribose oder dem Phosphat, vorhanden sein (wobei, wie Fachleuten bekannt sein wird, Nucleinsäureanaloga, die andere Strukturen aufweisen, auch eingesetzt werden können). Das modifizierte Nucleotid wird in eine Nucleinsäure inkorporiert, und jede das Hydroxy schützende Gruppe wird entfernt, wodurch das freie Hydroxy zurückbleibt. Bei der Zugabe einer Phosphoramidit-ETM wie eines Metallocens werden, wie zuvor in den Strukturen 39 und 40 beschrieben, ETM, wie Metallocen-ETM, zugesetzt. Zusätzliche Phosphoramidit-ETM wie Metallocene können zugesetzt werden, um „ETM-Polymere", umfassend „Metallocenpolymere", zu bilden, wie sie in 9 mit Ferrocen dargestellt sind. In manchen Ausführungsformen ist es weiters wünschenswert, die Löslichkeit der Polymere durch Hinzufügen einer „Capping"-Gruppe an die End-ETM im Polymer, beispielsweise einer Endphosphatgruppe an das Metallocen, wie im Allgemeinen in 9 dargestellt wird, zu erhöhen. Andere geeignete löslichkeitsfördernde „Capping"-Gruppen werden Fachleuten bekannt sein. Es gilt anzumerken, dass diese löslichkeitsfördernden Gruppen den Polymeren an anderen Stellen, umfassend die Ligandenringe, beispielsweise an den hierin erläuterten Metallocenen, hinzugefügt werden können.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform dieser allgemeinen Idee wird in den Fig. erläutert. In dieser Ausführungsform wird die Position 2' einer Ribose eines Phosphoramidit-Nucleotids zuerst funktionalisiert, um eine geschützte Hydroxygruppe zu enthalten, in diesem Fall über eine Oxo-Bindung, obwohl jede beliebige Anzahl an Linkern eingesetzt werden können, wie im Allgemeinen hierin für Z-Linker beschrieben wird. Das geschützte, modifizierte Nucleotid wird dann über Standard-Phosphoramiditchemie in eine wachsende Nucleinsäure eingefügt. Die Schutzgruppe wird entfernt, und die freie Hydroxygruppe wird wiederum unter Einsatz von Standard-Phosphoramiditchemie eingesetzt, um ein Phosphoramiditmetallocen wie Ferrocen hinzuzufügen. Eine ähnliche Reaktion ist bei Nucleinsäureanaloga möglich. Durch Einsatz von Peptid-Nucleinsäuren und dem in Struktur 41 dargestellten Metallocenmonomer könnten beispielsweise Nucleinsäurestrukturen erzeugt werden, die Metallocenpolymere enthalten.
  • So stellt die vorliegende Erfindung Verstärkungslinker von Nucleinsäuren bereit, die „Zweige" von Metallocenpolymeren, wie sie im Allgemeinen in den 8 und 9 dargestellt sind, umfassen. Bevorzugte Ausführungsformen setzen auch Metallocenpo lymere von einem bis zu etwa 50 Metallocenen in der Länge ein, wobei etwa 5 bis etwa 20 bevorzugt sind, und etwa 5 bis etwa 10 besonders bevorzugt sind.
  • Weiters kann jegliche Kombination aus ETM-Bindungen durchgeführt werden, wenn der Verstärkungslinker Nucleinsäure ist. Im Allgemeinen, wie hierin erläutert wird, wenn Mechanismus-1-Systeme verwendet werden, können Cluster von ETM-hältigen Nucleosiden die Tm der Hybridisierung der Sonde an ihre Zielsequenz herabsetzen; so erstrecken sich im Allgemeinen in Mechanismus-1-Systemen die ETM über die Länge der Sequenz, oder es werden nur geringe Mengen von ihnen eingesetzt.
  • In Mechanismus-1-Systemen können nicht-kovalent gebundene ETM eingesetzt werden. In einer Ausführungsform ist die ETM ein Hybridisierungsindikator. Hybridisierungsindikatoren dienen als eine ETM, die sich vorzugsweise mit doppelsträngiger Nucleinsäure assoziieren, und werden zugesetzt, üblicherweise reversibel, ähnlich dem Verfahren nach Millan et al., Anal. Chem. 65, 2.317–2.323 (1993); Millan et al., Anal. Chem. 66, 2943–2948 (1994). In dieser Ausführungsform können Steigerungen der lokalen Konzentration der ETM aufgrund der Assoziation des ETM-Hybridisierungsindikators mit doppelsträngiger Nucleinsäure an der Oberfläche unter Einsatz der die leitfähigen Oligomere enthaltenden Monoschichten überwacht werden. Hybridisierungsindikatoren umfassen Interkalatoren und Bindungsgruppierungen der kleinen und/oder großen Furche. In einer bevorzugten Ausführungsform können Interkalatoren eingesetzt werden; da Interkalation im Allgemeinen nur in Gegenwart von doppelsträngiger Nucleinsäure auftritt, werden sich die ETM auch nur in Gegenwart von doppelsträngiger Nucleinsäure konzentrieren. Interkalierende Übergangsmetallkomplext-ETM sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Dem ähnlich können auch Bindungsgruppierungen der großen oder kleinen Furche wie Methylen-Blau in dieser Ausführungsform eingesetzt werden.
  • Darüber hinaus kann das Bindungsbeschleunigungssystem der Erfindung in praktisch jedem Verfahren eingesetzt werden, das auf elektrochemischer Detektion von Zielanalyten beruht, wobei es sich als besonders nützlich zur Nucleinsäure-Detektion erweist. Beispielsweise können die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung in Nucleinsäure-Detektionsverfahren eingesetzt werden, die auf der Detektion von ETM beruhen, die dem Zielanalyt inhärent sind. Wie in Napier et al., Bioconj. Chem. 8, 906 (1997), im Allgemeinen beschrieben ist, können beispielsweise Guaninbasen von Nucleinsäure über Veränderungen des ßRedox-Zustands nachgewiesen werden, d.h. über Guaninoxidation durch Rutheniumkomplexe. Dem ähnlich finden Verfahren der Erfindung Einsatz in Detektionssystemen, die Kupferoberflächen als katalytische Elektroden einsetzen, um die Ribose von Nucleinsäuren zu oxidieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Verstärkungslinker nicht Nucleinsäure und kann stattdessen jede Art von Linker oder Polymer sein. Fachleuten wird bekannt sein, dass im Allgemeinen jeder beliebige Linker oder jedes Polymer, der/das modifiziert werden kann, um ETM zu enthalten, eingesetzt werden kann. Im Allgemeinen sollten die Polymere oder Linker ausreichend löslich sein und geeignete funktionelle Gruppen zur Hinzufügung von ETM enthalten.
  • Wie hierin verwendet umfasst ein „Verstärkungspolymer" zumindest zwei oder drei Untereinheiten, die kovalent gebunden sind. Zumindest ein gewisser Abschnitt der monomeren Untereinheiten enthält funktionelle Gruppen zur kovalenten Bindung von ETM. In manchen Ausführungsformen werden Kopplungsgruppierungen eingesetzt, um die Untereinheiten kovalent mit den ETM zu verbinden. Bevorzugte funktionelle Bindungsgruppen sind Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, wobei Aminogruppen besonders bevorzugt sind. Fachleuten wird bekannt sein, dass eine große Auswahl an möglichen Verstärkungspolymeren eingesetzt werden kann.
  • Geeignete Linker umfassen Alkyllinker (umfassend Heteroalkyl (umfassend Strukturen vom (Poly)ethylenglykol-Typ)), substituiertes Alkyl, Aryalkyllinker usw., sind jedoch nicht darauf beschränkt. Wie zuvor für die Polymere beschrieben umfassen die Linker eine oder mehrere funktionelle Gruppen zur Bindung von ETM, die, wie Fachleuten bekannt sein wird, beispielsweise über Einsatz von homo- oder heterobifunktionellen Linkern, die bekannt sind, erfolgt (siehe Katalog der Pierce Chemical Company, technischer Abschnitt über Vernetzer, S. 155–200 (1994)).
  • Geeignete Verstärkungspolymere umfassen funktionalisierte Styrole wie Aminostyrol, funktionalisierte Dextrane und Polyaminosäuren, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Bevorzugte Polymere sind Polyaminosäuren (sowohl Poly-D-Aminosäuren als auch Poly-L-Aminosäuren), wie Polylysin, und Polymere, die Lysin und andere Aminosäuren enthalten, sind besonders bevorzugt. Wie zuvor erläutert werden in manchen Ausführungsformen geladene Verstärkungslinker bevorzugt, beispielsweise wenn nicht geladene Zielanalyte nachzuweisen sind. Andere geeignete Polyaminosäuren sind Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Co-Polymere aus Lysin und Glutamin- oder Asparaginsäure, Co-Polymere aus Lysin mit Alanin, Tyrosin, Phenylalanin, Serin, Tryptophan und/oder Prolin.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Verstärkungslinker ein Metal-locenpolymer, wie zuvor beschrieben.
  • Die Bindung der Verstärkungslinker an den ersten Abschnitt der Markierungssonde, d.h. zum Abschnitt, der sich entweder direkt oder indirekt an den Zielanalyt bindet, hängt von der Zusammensetzung des Verstärkungslinkers ab, wie Fachleuten bekannt sein wird. Ist der Verstärkungslinker Nucleinsäure, so wird er im Allgemeinen 10während der Synthese des ersten Abschnitts der Markierungssonde gebildet, wobei ETM enthaltende Nucleoside wie erforderlich eingebunden werden. Alternativ dazu können der erste Abschnitt der Markierungssonde und der Verstärkungslinker getrennt erzeugt und dann gebunden werden. Beispielsweise kanpn ein überlappender Komplementärabschnitt vorhanden sein, der einen Abschnitt von doppelsträngiger Nucleinsäure bildet, die dann chemisch vernetzt werden kann, beispielsweise unter Einsatz von Psoralen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • Werden Verstärkungslinker eingesetzt, die keine Nucleinsäure sind, so erfolgt die Bindung des Linkers/Polymers des Verstärkungslinkers im Allgemeinen unter Einsatz von chemischen Standardverfahren, die Fachleuten bekannt sein werden. Beispielsweise kann die Bindung ähnlich der Bindung der Isolatoren an Nucleinsäuren erfolgen, wenn Alkyl-basierte Linker eingesetzt werden.
  • Weiters ist es möglich, Verstärkungslinker zu haben, die Gemische aus Nucleinsäuren und Nicht-Nucleinsäuren sind und entweder in linearer Form (d.h. Nucleinsäuresegmente, die miteinander über Alkyllinker verbunden sind) oder in verzweigten Formen (Nucleinsäuren mit Alkyl-„Verzweigungen", die ETM enthalten und zusätzlich verzweigt sein können) vorliegen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, beispielsweise wenn der Zielanalyt eine Nucleinsäure ist, ist es die Zielsequenz selbst, die die ETM trägt, und nicht der Verstärkungslinker einer Markierungssonde. Beispielsweise ist es möglich, wie nachstehend noch im Detail beschrieben wird, Triphosphat-Nucleotide, die die ETM der Erfindung umfassen, einer wachsenden Nucleinsäure enzymatisch hinzuzufügen, beispielsweise während einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Fachleuten wird bekannt sein, dass, während für mehrere Enzyme gezeigt wurde, dass sie im Allgemeinen modifizierte Nucleotide tolerieren, manche der modifizierten Nucleotide der Erfindung, beispielsweise die „Nucleosid-Ersatz"-Ausführungsformen und mutmaßlich manche der Phosphatbindungen, durch die Enzyme erkannt werden können oder nicht, um so Einbindung in eine wachsende Nucleinsäure zu ermöglichen. Daher bestehen bevorzugte Bindungen in dieser Ausführungsform zur Base oder zur Ribose des Nucleotids.
  • So resultiert beispielsweise die PCR-Amplifikation einer Zielsequenz, wie es auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, in Zielsequenzen, die ETM umfassen, die im Allgemeinen zufällig verteilt in die Sequenz eingebunden sind. Das System der Erfindung kann dann so konfiguriert werden, dass Detektion unter Einsatz dieser ETM möglich ist, wie im Allgemeinen in den 6A und 6B dargestellt ist.
  • Alternativ dazu ist es möglich, wie nachstehend noch genauer erläutert wird, ETM umfassende Nucleotide enzymatisch am Terminus einer Nucleinsäure, beispielsweise einer Zielnucleinsäure, hinzuzufügen. In dieser Ausführungsform wird ein wirksamer „Verstärkungslinker" am Terminus der Zielsequenz zugesetzt, die zur Detektion eingesetzt werden kann, wie in 6Q allgemein dargestellt ist. So stellt die Erfindung Zusammensetzungen, die Elektroden einsetzen, die Monoschichten aus leitfähigen Oligomeren und Einfangsonden umfassen, und Zielsequenzen bereit, die einen ersten Abschnitt, der in der Lage ist, an eine Komponente eines Testkomplexes zu hybridisieren, und einen zweiten Abschnitt umfassen, der nicht an eine Komponente eines Testkomplexes hybridisiert und zumindest eine kovalent gebundene Elektronenübertragungsgruppierung umfasst. Dem ähnlich werden auch Verfahren bereitgestellt, die diese Zusammensetzungen einsetzen.
  • Es ist auch möglich, ETM einzusetzen, die mit Sondensequenzen verbunden sind, d.h. mit Sequenzen, deren Aufgabe es ist, an komplementäre Sequenzen zu hybridisieren, d.h. in Sequenzen nach Mechanismus-1, obwohl dies auch in Mechanismus-2-Systemen eingesetzt werden kann. So können ETM auch zu Linkern, die keine Verstärkungslinker sind, hinzugefügt werden. Beispielsweise können ETM Abschnitten von Markierungssonden zugesetzt werden, die an Komponenten des Testkomplexes, beispielsweise an den ersten Abschnitt, oder an die Zielsequenz hybridisieren, wie zuvor erläutert wurde und in 6R dargestellt ist. Diese ETM können zur Elektronenübertragungsdetektion in manchen Ausführungsformen eingesetzt werden oder auch nicht, dies hängt von der Position und dem System ab. In manchen Ausführungsformen, wenn beispielsweise die zufällig eingebundene ETM enthaltende Zielsequenz direkt an die Einfangsonde hybridisiert wird, wie in den 6A und 6B dargestellt ist, können beispielsweise ETM in dem Abschnitt vorhanden sein, der an die Einfangsonde hybridisiert. Ist die Einfangsonde unter Einsatz eines leitfähigen Oligomers an die Elektrode gebunden, so können diese ETM eingesetzt werden, um Elektronenübertragung, wie zuvor beschrieben wurde, nachzuweisen. Alternativ dazu können diese ETM nicht spezifisch nachgewiesen werden.
  • Dem ähnlich kann es in manchen Fällen wünschenswert sein, dass in manchen Ausführungsformen, wenn der Verstärkungslinker Nucleinsäure ist, manche oder alle der Verstärkungslinker doppelsträngig sind, beispielsweise in Mechanismus-2-Systemen. In einer Ausführungsform kann es einen zweiten Verstärkungslinker geben, der im Wesentlichen komplementär zum ersten Verstärkungslinker ist und der an den ersten Verstärkungslinker hybridisieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erste Verstärkungslinker die kovalent gebundenen ETM. In einer alternativen Ausführungsform enthält der zweite Verstärkungslinker die ETM und der erste Verstärkungslinker enthält keine, wobei die ETM an der Oberfläche durch Hybridisierung des zweiten Verstärkungslinkers an den ersten verstärkt werden. In wiederum einer anderen Ausführungsform umfassen sowohl der erste als auch der zweite Verstärkungslinker ETM. Es gilt anzumerken, dass, wie zuvor erläutert, Nucleinsäuren, die zahlreiche ETM enthalten, eventuell auch nicht hybridisieren, d.h. dass die Tm je nach der Stelle der Bindung und den Eigenschaften der ETM vermindert werden kann. Wenn also vielfache ETM an Hybridisierungssträngen eingesetzt werden, d.h. in Mechanismus-1-Systemen, so gibt es davon im Allgemeinen weniger als etwa 5, wobei weniger als etwa 3 bevorzugt sind, oder alternativ dazu könnten die ETM auch ausreichend voneinander beabstandet sein, sodass die dazwischen liegenden Nucleotide ausreichend hybridisieren können, um für gute Kinetik zu sorgen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt, um Zielanalyte in einer Probe nachzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt Nucleinsäure, und Zielsequenzen werden nachgewiesen. Die Bezeichnung „Zielsequenz" oder grammatikalische Entsprechungen davon beschreibt hierin eine Nucleinsäuresequenz an einem Einzelstrang einer Nucleinsäure. Die Zielsequenz kann ein Abschnitt eines Gens, eine Regulationssequenz, genomische DNA, cDNA, RNA umfassend mRNA und rRNA oder dergleichen sein. Sie kann jede beliebige Länge aufweisen, wobei längere Sequenzen natürlich spezifischer sind. Fachleuten wird bekannt sein, dass die komplementäre Zielsequenz zahlreiche Formen annehmen kann. Beispielsweise kann sie innerhalb einer größeren Nucleinsäuresequenz enthalten sein, d.h. unter anderem das gesamte Gen oder Teil eines Gens oder mRNA, ein Restriktionsfragment eines Plasmids oder genomische DNA sein. Wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben werden Sonden hergestellt, um an Zielsequenzen zu hybridisieren, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenz in einer Probe zu bestimmen. Ganz allgemein ist dieser Ausdruck Fachleuten bekannt. Die Zielsequenz kann auch aus unterschiedlichen Zieldomänen bestehen; beispielsweise kann eine erste Zieldomäne der Probenzielsequenz an eine Einfangsonde oder einen Abschnitt einer Einfangverlängerungssonde hybridisieren, eine zweite Zieldomäne kann an einen Abschnitt einer Amplifikationssonde, eine Markierungssonde oder eine andere Einfang- oder Einfangverlängerungssonde hybridisieren usw. Die Zieldomänen können aneinandergrenzend oder getrennt sein. Die Bezeichnungen „erste" und „zweite" sollen keine Ausrichtung der Sequenzen in Bezug auf die 5'-3'-Ausrichtung der Zielsequenz definieren. Wird beispielsweise eine 5'-3'-Ausrichtung der komplementären Zielsequenz angenommen, kann die erste Zieldomäne entweder in 5' zur zweiten Domäne oder in 3' zur zweiten Domäne angeordnet sein.
  • Sofern erforderlich wird der Zielanalyt unter Einsatz bekannter Verfahren hergestellt. Die Probe kann beispielsweise behandelt werden, um die Zellen unter Einsatz von bekannten Lysepuffern, Elektroporation usw. zu lysieren, wobei Reinigung und/oder Amplifikation wie PCR, wie erforderlich, eintreten, wie Fachleuten bekannt sein wird.
  • In Nucleinsäuresystemen ist beabsichtigt, dass die Sonden der vorliegenden Erfindung komplementär zu einer Zielsequenz (entweder zur Zielsequenz der Probe oder zu einer anderen Sondensequenz, wie nachstehend beschrieben wird) sind, sodass Hybridisierung der Zielsequenz und der Sonden der vorliegenden Erfindung eintritt. Wie nachstehend erläutert muss diese Komplementarität nicht perfekt sein; es kann eine bestimmte Anzahl an Basenpaarfehlpaarungen geben, die die Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und den einzelsträngigen Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung stören. Ist die Anzahl der Mutationen jedoch so groß, dass Hybridisierung nicht einmal unter den am wenigsten stringenten Hybridisierungsbedingungen auftre ten kann, so ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz. So wird hierin unter „im Wesentlichen komplementär" verstanden, dass die Sonden ausreichend komplementär zu den Zielsequenzen sind, um unter normalen Reaktionsbedingungen zu hybridisieren.
  • Im Allgemeinen sind die Nucleinsäurezusammensetzungen der Erfindung nützlich als Oligonucleotidsonden einzusetzen. Fachleuten wird bekannt sein, dass die Länge der Sonde je nach Länge der Zielsequenz und den Hybridisierungs- und Waschbedingungen variiert. Im Allgemeinen liegen Oligonucleotidsonden im Bereich von etwa 8 bist etwa 50 Nucleotiden, wobei etwa 10 bis etwa 30 bevorzugt und etwa 12 bis etwa 25 besonders bevorzugt sind. In manchen Fällen können sehr lange Sonden eingesetzt werden, z.B. mit einer Länge von 50 bis 200–300 Nucleotiden. In den hierin dargestellten Strukturen können somit Nucleoside durch Nucleinsäuren ersetzt werden.
  • Eine Vielzahl an Hybridisierungsbedingungen können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, umfassend hoch, mäßig und wenig stringente Bedingungen; siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989), und Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), die hierin durch Verweis aufgenommen sind. Stringente Bedingungen sind von der Sequenz abhängig und sind unter verschiedenen Umständen auch unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Ein ausführlicher Leitfaden bezüglich Hybridisierung von Nucleinsäuren kann in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993), gefunden werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Temperatur etwa 5–10 °C unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärken und pH liegt. Die Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke, pH und Nucleinsäurekonzentration), bei der 50 % der Sonden, die komplementär zur Zielsequenz sind, an die Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (da die Zielsequenzen im Überschuss vorhanden sind, sind bei Tm im Gleichgewicht 50 % der Sonden besetzt). Stringente Bedingungen sind jene, bei denen sich die Salzkonzentration auf weniger als etwa 1,0 M Natriumionen, typischerweise auf etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze), bei einem pH von 7,0 bis 8,3 und einer Temperatur von zumindest etwa 30 °C bei kurzen Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und von zumindest etwa 60 °C bei längeren Sonden (z.B. mehr als 50 Nucleotide) beläuft. Stringente Bedingungen können auch durch Zusatz von Destabilisierungsmitteln wie Formamid erreicht werden.
  • In einer anderen Ausführungsform werden weniger stringente Bedingungen eingesetzt; beispielsweise können mäßige oder wenig stringente Bedingungen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, eingesetzt werden; siehe Maniatis und Ausubel (s.o.) und Tijssen (s.o.).
  • Die Hybridisierungsbedingungen können auch variieren, wenn eine nichtionische Hauptkette, d.h. PNA, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, eingesetzt wird. Darüber hinaus können Vernetzer nach der Targetbindung zugesetzt werden, um zu vernetzen, d.h. um die zwei Stränge des Hybridisierungskomplexes kovalent zu binden.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die Systeme der Erfindung zahlreiche verschiedene Anordnungen aufweisen können, wie im Allgemeinen in den 3, 4, 5 und 6 dargestellt ist. Im Allgemeinen gibt es drei Systemtypen, die eingesetzt werden können: (1) Systeme, in denen die Zielsequenz selbst mit ETM markiert ist (siehe die 4A, 5A, 5B und 5D; dies ist in Nucleinsäuresystemen im Allgemeinen nützlich); (2) Systeme, in denen Markierungssonden direkt an die Zielanalyte binden (siehe die 4C und 4H für Nucleinsäurebeispiele und die 6A, 6B, 6D und 6E für Beispiele von Analyten, die keine Nucleinsäure sind); und (3) Systeme, in denen Markierungssonden indirekt an die Zielsequenzen gebunden sind, beispielsweise durch Einsatz von Amplifikationssonden (siehe die 4C, 5E, 5F und 5G für Nucleinsäurebeispiele und 6C als Beispiel für Zielanalyte, die nicht Nucleinsäure sind).
  • In allen drei Systemen ist es bevorzugt, wenn auch nicht erforderlich, dass die Zielsequenz an der Elektrodenoberfläche immobilisiert ist. Dies erfolgt vorzugsweise mittels Einfangsonden und gegebenenfalls eine oder mehrere Einfangverlängerungssonden; siehe 3 für repräsentative Nucleinsäurebeispiele. Werden nur Einfangsonden eingesetzt, so ist es erforderlich, einzigartige Einfangsonden für jede Zielsequenz zu haben; das bedeutet, dass die Oberfläche so angepasst beschaffen sein muss, dass sie einzigartige Einfangsonden enthält. Alternativ dazu können Einfangverlängerungssonden eingesetzt werden, die eine „universelle" Oberfläche schaffen, d.h. eine Oberfläche, die einen einzigen Typ an Einfangsonden umfasst, die eingesetzt werden können, um jegliche Zielsequenz nachzuweisen. „Einfangverlängerungs"-Sonden sind im Allgemeinen in den 4C, 5C, 5E, 5G und 5H sowie in 6B usw. dargestellt und weisen einen ersten Abschnitt, der an die gesamte Einfangsonde oder einen Teil davon hybridisiert, und einen zweiten Abschnitt auf, der an einen Abschnitt der Zielsequenz hybridisiert. Dies ermöglicht dann die Erzeugung von angepassten, löslichen Sonden, die, wie Fachleuten bekannt sein wird, im Allgemeinen einfacher und günstiger sind. Wie hierin dargestellt können zwei Einfangverlängerungssonden eingesetzt werden. Dies erfolgte im Allgemeinen, um Testkomplexe zu stabilisieren (beispielsweise wenn die Zielsequenz groß ist oder wenn große Amplifikationssonden (insbesondere verzweigte oder Dendrimer-Amplifikationssonden) eingesetzt werden).
  • Obgleich die Erläuterung und die hierin dargestellten Figuren auch Nucleinsäureausführungsformen zeigen, können eben dieselben Ideen für Zielanalyte, die keine Nucleinsäure sind, eingesetzt werden. Beispielsweise können Einfangverlängerungsliganden erzeugt werden, wie Fachleuten bekannt sein wird. Ein Nucleinsäure-„Schwanz" kann beispielsweise einem Bindungsliganden zugesetzt werden, wie im Allgemeinen in 6B dargestellt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Bindungsliganden nach der Bildung der SAM ((4) s.o.) zugesetzt. Dies kann, wie Fachleuten bekannt sein wird, über verschiedene Wege erfolgen. In einer Ausführungsform werden leitfähige Oli gomere mit terminalen funktionellen Gruppen erzeugt, wobei bevorzugte Ausführungsformen aktivierte Carboxylate und Isothiocyanate einsetzen, die mit primären Aminen reagieren, die entweder vorhanden sind oder auf den Bindungsliganden, wie beispielsweise eine Nucleinsäure, unter Einsatz eines aktivierten Carboxylates gegeben werden. Diese zwei Reagenzien haben den Vorteil, in wässriger Lösung stabil zu sein und doch mit primären Alkylaminen zu reagieren. Die aromatischen primären Amine und sekundären und tertiären Amine der Basen sollten jedoch nicht reagieren, wodurch der ortsspezifische Zusatz von Nucleinsäuren an der Oberfläche ermöglicht wird. Ähnliche Verfahren können mit Komponenten, die keine Nucleinsäure sind, eingesetzt werden; beispielsweise ist, wie zuvor erläutert, die Bindung von Proteinen an Metallchelate umfassende SAM bekannt; siehe die US-Patent Nr. 5.620.850. Dies ermöglicht das Aufsprenkeln der Sonden (entweder Einfang- oder Detektionssonden oder beides) mittels bekannter Verfahren (Tintenstrahl, Aufsprenkeln usw.) auf die Oberfläche.
  • Darüber hinaus gibt es eine Anzahl an Nicht-Nucleinsäure-Verfahren, die eingesetzt werden können, um eine Nucleinsäure an der Oberfläche zu immobilisieren. Beispielsweise können Bindungspartnerpaare eingesetzt werden; d.h. dass ein Bindungspartner an den Terminus des leitfähigen Oligomers gebunden ist und der andere an das Ende der Nucleinsäure. Dies kann auch ohne Einsatz einer Nucleinsäure-Einfangsonde erfolgen; das bedeutet, dass ein Bindungspartner als die Einfangsonde dient und der andere an entweder die Zielsequenz oder eine Einfangverlängerungssonde gebunden ist. Das heißt, dass entweder die Zielsequenz den Bindungspartner umfasst oder eine Einfangverlängerungssonde, die an die Zielsequenz hybridisiert, den Bindungspartner umfasst. Geeignete Bindungspartnerpaare umfassen Haptenpaare wie Biotin/Streptavidin; Antigene/Antikörper; NTA/Histidin-Markierungen; usw., sind jedoch nicht darauf beschränkt. Im Allgemeinen sind kleinere Bindungspartner bevorzugt, sodass die Elektronen von der Nucleinsäure in das leitfähige Oligomer übergehen können, um Detektion zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn die Zielsequenz selbst modifiziert wird, um einen Bindungspartner zu enthalten, wird der Bindungspartner über ein modifiziertes Nucleotid gebunden, das enzymatisch an die Zielsequenz, beispielsweise während einem PCR-Zielamplifikationsschritt, gebunden sein kann. Alternativ dazu sollte der Bindungspartner einfach an die Zielsequenz gebunden sein.
  • Alternativ dazu kann eine Einfangverlängerungssonde eingesetzt werden, die einen Nucleinsäureabschnitt zur Hybridisierung des Targets sowie eines Bindungspartners aufweist (beispielsweise kann die Einfangverlängerungssonde einen Nicht-Nucleinsäure-Abschnitt wie einen Alkyllinker aufweisen, der eingesetzt wird, um einen Bindungspartner zu binden). In dieser Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die doppelsträngige Nucleinsäure des Targets und die Einfangverlängerungssonde für größere Stabilität zu vernetzen, beispielsweise unter Einsatz von Psoralen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • In einer Ausführungsform ist das Target nicht mittels Einfangsonden an die Elektrodenoberfläche gebunden. In dieser Ausführungsform ist es wichtig, wie auch für alle Tests hierin, dass überschüssige Markierungssonden vor der Detektion entfernt werden und dass der Testkomplex (der Verstärkungslinker) nahe der Oberfläche liegt. Fachleuten wird bekannt sein, dass dies auf unterschiedliche Weise erfolgen kann. Beispielsweise kann der Testkomplex auf Kügelchen vorhanden sein, die der die Monoschicht umfassenden Elektrode zugesetzt werden. Die die ETM umfassenden Verstärkungslinker können nahe der Oberfläche des leitfähigen Oligomers mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren angeordnet werden, umfassend Schwerkraftabsetzung von Kügelchen an der Oberfläche, elektrostatischer oder magnetischer Wechselwirkungen zwischen Kügelchenkomponenten und der Oberfläche unter Einsatz von Bindungspartnerbindung, wie zuvor beschrieben. Alternativ dazu kann nach Entfernen der überschüssigen Reagenzien wie überschüssigen Markierungssonden der Testkomplex von der Oberfläche, beispielsweise über Elektrophorese, wie hierin erläutert, entfernt werden.
  • Bevorzugte Ausführungsformen setzen jedoch Testkomplexe ein, die über Nucleinsäure-Einfangsonden gebunden sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Zielsequenz selbst die ETM. Wie zuvor beschrieben kann dies über Einsatz von Zielsequenzen erfolgen, die ETM an zahlreichen Positionen, wie zuvor erläutert, eingebunden haben. In dieser Ausführungsform wie auch in den anderen des Systems wird die 3'-5'-Ausrichtung für die Sonden und Targets ausgewählt, um die ETM-enthaltende Strukturen (d.h. Verstärkungslinker oder Zielsequenzen) so nahe an der Oberfläche der Monoschicht wie möglich und in der korrekten Ausrichtung zu erhalten. Dies kann mittels Bindung über Isolatoren oder leitfähige Oligomere, wie im Allgemeinen in den Fig. dargestellt, erfolgen. Weiters, wie Fachleuten bekannt sein wird, können vielfache Einfangsonden eingesetzt werden, entweder in einer wie in 5D dargestellten Anordnung, worin die 5'-3'-Ausrichtung der Einfangsonden unterschiedlich ist, oder wo sich „Schleifen" des Targets bilden, wenn vielfache Einfangsonden eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren die Markierungssonden, wie im Allgemeinen in den Fig. dargestellt, direkt an die Zielsequenzen. In diesen Ausführungsformen ist die Zielsequenz vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, an der Oberfläche mittels Einfangsonden, umfassend Einfangverlängerungssonden, immobilisiert. Markierungssonden werden dann eingesetzt, um die ETM in die Nähe der Oberfläche der Monoschicht, die leitfähige Oligomere umfasst, zu bringen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vielfache Markierungssonden eingesetzt; das bedeutet, dass Markierungssonden so beschaffen sind, dass der Abschnitt, der an die Zielsequenz hybridisiert, für mehrere verschiedene Markierungssonden unterschiedlich sein kann, sodass Amplifikation des Signals eintritt, da sich vielfache Markierungssonden für jede Zielsequenz binden können. So ist, wie in den Fig. dargestellt, n eine ganze Zahl von zumindest eins. Je nach erwünschter Empfindlichkeit, der Länge der Zielsequenz, der Anzahl der ETM pro Markierungssonde usw. sind bevorzugte Bereiche für n von 1 bis 50, wobei ein Bereich von etwa 1 bis etwa 20 besonders bevorzugt ist, und ein Bereich von etwa 2 bis etwa 5 am meisten bevor zugt ist. Werden „generische" Markierungssonden erwünscht, so können weiters Markierungsverlängerungssonden eingesetzt werden, wie im Allgemeinen nachstehend für den Einsatz mit Amplifikationssonden beschrieben wird.
  • Wie zuvor zielen im Allgemeinen die Anordnung des Systems und der Markierungssonden in dieser Ausführungsform darauf ab, die ETM so nahe wie möglich an der Monoschicht-Oberfläche zu verstärken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Markierungssonden indirekt an die Zielsequenz hybridisiert. Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung Verwendung in neuen Kombinationen von Signalamplifikationstechnologien und Elektronenübertragungsdetektion an Elektroden findet, die in Sandwich-Hybridisierungstests, wie sie im Allgemeinen in den Fig. für Nucleinsäuren-Ausführungsformen dargestellt sind, besonders nützlich sein können; ähnliche Systeme können für Nicht-Nucleinsäure-Zielanalyte entwickelt werden. In diesen Ausführungsformen werden die Amplifikationssonden der Erfindung direkt oder indirekt an die Zielsequenz in einer Probe gebunden. Da die Amplifikationssonden vorzugsweise eine relativ große Anzahl an Amplifikationssequenzen enthalten, die zum Binden von Markierungssonden zur Verfügung stehen, wird das nachweisbare Signal signifikant verstärkt und ermöglicht so, die Detektionsgrenzen des Targets signifikant zu verbessern. Diese hierin beschriebenen Markierungs- und Amplifikationssonden und die Detektionsverfahren können im Wesentlichen für jedes bekannte Nucleinsäure-Hybridisierungsformat eingesetzt werden, wie jene, in denen das Target direkt an eine feste Phase gebunden ist, oder in Sandwich-Hybridisierungstests, in denen das Target an eine oder mehrere Nucleinsäuren gebunden ist, die wiederum an die feste Phase gebunden sind.
  • Im Allgemeinen können diese Ausführungsformen wie folgt unter besonderem Verweis auf Nucleinsäuren beschrieben werden. Eine Amplifikationssonde wird an die Zielsequenz entweder direkt (z.B. 4C und 5E) oder mittels Einsatz einer Markierungsverlängerungssonde (z.B. 5F und 5G) hybridisiert, was dazu dient, „generische" Amplifikationssonden herstellen zu können. Die Zielsequenz ist vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, an der Elektrode mittels Einfangsonden immobilisiert. Vorzugsweise enthält die Amplifikationssonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen, wobei in manchen Ausführungsformen, wie nachstehend beschrieben wird, die Amplifikationssonde auch nur eine einzelne Amplifikationssonde enthalten kann. Die Amplifikationssonde kann zahlreiche verschiedene Formen annehmen; entweder eine verzweigte Struktur, eine Dendrimer-Struktur oder einen unverzweigte „Strang" von Amplifikationssequenzen. Diese Amplifikationssequenzen werden eingesetzt, um Hybridisierungskomplexe mit Markierungssonden zu bilden, und die ETM können mittels der Elektrode nachgewiesen werden.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Testkomplexe bereit, die zumindest eine Amplifikationssonde umfassen. Unter „Amplifikationssonde" oder „Nucleinsäuremultimer" oder „Amplifikationsmultimer" oder grammatikalischen Entsprechungen hierin wird eine Nucleinsäurensonde verstanden, die eingesetzt wird, um die Signalamplifikation zu erleichtern. Amplifikationssonden umfassen zumindest eine erste einzelsträngige Nucleinsäure-Sondensequenz, wie nachstehend definiert, und zumindest eine einzelsträngige Nucleinsäure-Amplifikationssequenz, wobei eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen bevorzugt ist.
  • Amplifikationssonden umfassen eine erste Sondensequenz, die eingesetzt wird, um entweder direkt oder indirekt an die Zielsequenz zu hybridisieren. Das bedeutet, dass die Amplifikationssonde selbst eine erste Sondensequenz, die im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist (siehe 5E), oder eine erste Sondensequenz aufweisen kann, die im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt einer zusätzlichen Sonde ist, wobei sie in diesem Fall als eine Markierungsverlängerungssonde bezeichnet wird, die einen ersten Abschnitt aufweist, der im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist (z.B. 5F und 5G). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Sondensequenz der Amplifikationssonde im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz, wie im Allgemeinen in 5E dargestellt wird.
  • Im Allgemeinen weist, wie auch alle anderen Sonden hierin, die erste Sondensequenz eine ausreichende Länge auf, um Spezifität und Stabilität zu verleihen. So sind im Allgemeinen die Sondensequenzen der Erfindung, die darauf abzielen, an eine andere Nucleinsäure zu hybridisieren (d.h. Sondensequenzen, Amplifikationssequenzen, Abschnitte oder Domänen größerer Sonden), zumindest etwa 5 Nucleoside lang, wobei eine Länge von zumindest etwa 10 Nucleosiden bevorzugt und eine Länge von zumindest etwa 15 Nucleosiden besonders bevorzugt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Amplifikationssonden oder jegliche andere Sonden der Erfindung in Abwesenheit ihrer Targets Haarnadel-„Bäumchen"-Strukturen bilden. Die Länge der doppelsträngigen Stammsequenz wird so ausgewählt, dass die Haarnadel-Struktur in Gegenwart des Targets nicht begünstigt wird. Die Verwendung dieses Sondentyps in den Systemen der Erfindung oder in jedem beliebigen Nucleinsäure-Detektionssystem kann in einer signifikanten Abnahme der nicht spezifischen Bindungen resultieren und so das Signal/Rausch-Verhältnis erhöhen.
  • Im Allgemeinen umfassen diese Haarnadel-Strukturen vier Komponenten. Die erste Komponente ist eine Zielbindungssequenz, d.h. eine zum Target komplementäre Region (die die Probenzielsequenz oder eine andere Sondensequenz sein kann, an die eine Bindung erwünscht ist), die etwa 10 Nucleoside lang ist, wobei eine Länge von 15 Nucleosiden bevorzugt ist. Die zweite Komponente ist eine Schleifensequenz, die die Bildung von Nucleinsäureschleifen begünstigen kann. Besonders bevorzugt in dieser Hinsicht sind Wiederholungen von GTC, die im Fragiles-X-Chromosom-Syndrom als Windungen bildend identifiziert wurden. (Werden PNA-Analoga eingesetzt, können Windungen, die Prolinreste umfassen, bevorzugt werden.) Im Allgemeinen werden drei bis fünf Wiederholungen eingesetzt, wobei vier bis fünf bevorzugt sind. Die dritte Komponente ist eine selbstkomplementäre Region, die einen ersten Abschnitt, der zu einem Abschnitt der Zielsequenzregion komplementär ist, und einen zweiten Abschnitt, der einen ersten Abschnitt der Markierungssonden-Bindungssequenz umfasst, aufweist. Die vierte Komponente ist im Wesentlichen komplementär zu einer Markierungssonde (oder gegebenenfalls einer anderen Sonde). Die vierte Komponente umfasst weiters ein „klebriges Ende"; das bedeutet, dass ein Abschnitt nicht an einen anderen Abschnitt der Sonde hybridisiert und vorzugsweise den Großteil an, wenn nicht alle, ETM enthält. Fachleuten wird bekannt sein, dass jegliche oder alle hierin beschriebenen Sonden so angeordnet sein können, dass sie in Abwesenheit ihrer Targets Haarnadeln bilden, umfassend die Amplifikations-, Einfang-, Einfangverlängerungs-, Markierungs- und Markierungsverlängerungssonden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können mehrere verschiedene Amplifikationssonden eingesetzt werden, wobei jede eine erste Sondensequenz aufweist, die an unterschiedlichen Abschnitte der Zielsequenz hybridisiert. Das bedeutet, dass es mehr als ein Amplifikationsniveau gibt; die Amplifikationssonde sorgt aufgrund von zahlreichen Markierungsvorgängen für eine Signalamplifikation, und es werden mehrere unterschiedliche Amplifikationssonden für jede Zielsequenz eingesetzt, wobei jede diese Vielzahl an Markierungen aufweist. So setzen bevorzugte Ausführungsformen zumindest zwei verschiedene Gruppen an Amplifikationssonden ein, wobei jede Gruppe eine unterschiedliche Sondensequenz zur Hybridisierung an verschiedene Abschnitte der Zielsequenz aufweist; die einzige wahre Einschränkung der Anzahl der unterschiedlichen Amplifikationssonden betrifft die Länge der ursprünglichen Zielsequenz. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass die unterschiedlichen Amplifikationssonden unterschiedliche Amplifikationssequenzen enthalten, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert die Amplifikationssonde nicht direkt an die Probenzielsequenz, sondern hybridisiert stattdessen an einen ersten Abschnitt einer Markierungsverlängerungssonde, wie im Allgemeinen in 5F dargestellt ist. Dies ist besonders nützlich, um den Einsatz von „generischen" Amplifikationssonden zu ermöglichen, das heißt von Amplifikationssonden, die mit einer Vielzahl an verschiedenen Targets eingesetzt werden können. Dies kann wünschenswert sein, da mehrere Amplifikationssonden spezielle Syntheseverfahren erfordern.
  • So ist der Zusatz einer relativ kurzen Sonde als eine Markierungsverlängerungssonde bevorzugt. So ist die erste Sondensequenz der Amplifikationssonde im Wesentlichen komplementär zu einem ersten Abschnitt oder einer ersten Domäne einer ersten einzelsträngigen Nucleinsäuren-Markierungsverlängerungs-Sonde. Die Markierungsverlängerungssonde enthält auch einen zweiten Abschnitt oder eine zweite Domäne, die im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der Zielsequenz ist. Beide dieser Abschnitte sind vorzugsweise zumindest etwa 10 bis etwa 50 Nucleotide lang, wobei ein Bereich von etwa 15 bis etwa 30 Nucleotiden bevorzugt ist. Die Bezeichnungen „erste" und „zweite" sollen keine Ausrichtung der Sequenzen hinsichtlich der 5'-3'-Ausrichtung der Ziel- oder Sondensequenz beschreiben. Unter Annahme einer 5'-3'-Ausrichtung der komplementären Zielsequenz beispielsweise kann der erste Abschnitt entweder 5' zum zweiten Abschnitt oder 3' zum zweiten Abschnitt angeordnet sein. Aus praktischen Gründen wird die Reihenfolge der Sondensequenzen im Allgemeinen von links nach rechts dargestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann mehr als ein Markierungsverlängerungssondenpaar eingesetzt werden, d.h. dass n mehr als 1 ist. Das bedeutet, dass eine Vielzahl an Markierungsverlängerungssonden eingesetzt werden kann, wobei jede einen Abschnitt aufweist, der im Wesentlichen komplementär zu einem anderen Abschnitt der Zielsequenz ist; dies kann als ein unterschiedliches Amplifikationsniveau dienen. So setzt eine bevorzugte Ausführungsform Gruppen von zumindest zwei Markierungsverlängerungssonden ein, wobei die Obergrenze durch die Länge der Zielsequenz festgesetzt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird mehr als eine Markierungsverlängerungssonde eingesetzt, wobei eine einzelne Amplifikationssonde nicht spezifische Bindung reduziert, wie in 5G dargestellt ist und im Allgemeinen im US-Patent Nr. 5.681.697, das hierin durch Verweis aufgenommen ist, erläutert wird. In dieser Ausführungsform hybridisiert ein erster Abschnitt der ersten Markierungsverlängerungssonde an einen ersten Abschnitt der Zielsequenz, und der zweite Abschnitt der ersten Markierungsverlängerungssonde hybridisiert an eine erste Son densequenz der Amplifikationssonde. Ein erster Abschnitt der zweiten Markierungsverlängerungssonde hybridisiert an einen zweiten Abschnitt der Zielsequenz, und der zweite Abschnitt der zweiten Markierungsverlängerungssonde hybridisiert an eine zweite Sondensequenz der Amplifikationssonde. Diese bilden Strukturen, die manchmal als „kreuzförmige" Strukturen oder Anordnungen bezeichnet werden und die im Allgemeinen erzeugt werden, um Stabilität zu verleihen, wenn größere verzweigte oder dendrimere Amplifikationssonden eingesetzt werden.
  • Weiters können, wie Fachleuten bekannt sein wird, die Markierungsverlängerungssonden mit einer Präamplifikationssonde, wie nachstehend beschrieben, und nicht mit der Amplifikationssonde direkt, wechselwirken.
  • Dem ähnlich, wie zuvor erläutert, setzt eine bevorzugte Ausführungsform mehrere unterschiedliche Amplifikationssonden ein, wobei jede erste Sondensequenzen aufweist, die an unterschiedliche Abschnitte der Markierungsverlängerungssonde hybridisieren. Weiters, wie zuvor erläutert, ist es auch möglich, dass die unterschiedlichen Amplifikationssonden unterschiedliche Amplifikationssequenzen enthalten, obgleich dies jedoch im Allgemeinen nicht bevorzugt ist.
  • Zusätzlich zur ersten Sondensequenz kann die Amplifikationssonde auch zumindest eine Amplifikationssequenz umfassen. Eine „Amplifikationssequenz" oder ein „Amplifikationssegment" oder grammatikalische Entsprechungen davon bezeichnen hierin eine Sequenz, die eingesetzt wird, um entweder direkt oder indirekt an einen ersten Abschnitt einer Markierungssonde, wie nachstehend noch genauer beschrieben wird, zu binden. Vorzugsweise umfasst die Amplifikationssonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen, wobei etwa 3 bis etwa 1.000 Sequenzen bevorzugt sind, etwa 10 bis etwa 100 besonders bevorzugt sind, und etwa 50 am meisten bevorzugt sind. In manchen Fällen, beispielsweise wenn unverzweigte Amplifikationssonden eingesetzt werden, sind 1 bis etwa 20 Sequenzen bevorzugt, wobei etwa 5 bis etwa 10 Sequenzen besonders bevorzugt sind.
  • Die Amplifikationssequenzen können untereinander auf verschiedene Arten verbunden sein, wie Fachleuten selbstverständlich bekannt ist. Sie können direkt kovalent miteinander verbunden sein oder an dazwischen liegende Sequenzen oder chemische Gruppierungen über Nucleinsäurebindungen wie Phosphodiesterbindungen, PNA-Bindungen usw. oder über dazwischen angeordnete Bindungsmittel wie Aminosäure, Kohlenwasserstoff oder Polyolbrücken oder über andere Vernetzer oder Bindungspartner gebunden sein. Die Bindungsstelle(n) können sich an den Enden eines Segments und/oder an einem oder mehreren inneren Nucleotiden im Strang befinden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Amplifikationssequenzen über Nucleinsäurebindungen gebunden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden verzweigte Amplifikationssonden eingesetzt, wie sie im Allgemeinen im US-Patent Nr. 5.124.246 beschrieben werden. Verzweigte Amplifikationssonden können eine „gabelartige" oder „kammartige" Struktur annehmen. „Gabelartig" verzweigte Amplifikationssonden weisen im Allgemeinen drei oder mehr Oligonucleotidsegmente auf, die von einem Ausgangspunkt ausgehen, um eine verzweigte Struktur zu bilden. Der Ausgangspunkt kann ein anderes Nucleotidsegment oder ein multifunktionelles Molekül sein, an das zumindest drei Segmente kovalent oder eng gebunden sein können. „Kammartig" verzweigte Amplifikationssonden weisen eine unverzweigte Hauptkette mit einer Vielzahl an Seitenketten-Oligonucleotiden auf, die sich von der Hauptkette aus erstrecken. In jeder Struktur hängen die hängenden Segmente normalerweise an einem modifizierten Nucleotid oder anderen organischen Gruppierung mit den zur Bindung von Oligonucleotiden geeigneten funktionellen Gruppen. Darüber hinaus sind in beiden Strukturarten zahlreiche Amplifikationssequenzen für Bindungen, entweder direkt oder indirekt, an Detektionssonden verfügbar. Im Allgemeinen werden diese Strukturen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, mittels modifizierter multifunktioneller Nucleotide erzeugt, wie u.a. in den US-Patenten Nr. 5.635.352 und 5.124.246 beschrieben ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Dendrimer-Amplifikationssonden eingesetzt, wie sie im Allgemeinen im US-Patent Nr. 5.175.270 beschrieben sind. Dendrimer-Amplifikationssonden weisen Amplifikationssequenzen auf, die über Hybridisierung gebunden sind und so Abschnitte doppelsträngiger Nucleinsäure als eine Komponente ihrer Struktur aufweisen. Die äußere Oberfläche der Dendrimer-Amplifikationssonde weist zahlreiche Amplifikationssequenzen auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden unverzweigte Amplifikationssonden eingesetzt, die individuelle Amplifikationssequenzen aufweisen, die Ende an Ende entweder direkt oder mit kurzen, dazwischen liegenden Sequenzen gebunden sind, um ein Polymer zu bilden. Wie in den anderen Amplifikationsanordnungen können zusätzliche Sequenzen oder Gruppierungen zwischen den Amplifikationssequenzen liegen. Weiters, wie hierin erläutert wird, können unverzweigte Amplifikationssonden Haarnadel-„Bäumchen"-Strukturen bilden, wie sie in 12 dargestellt sind.
  • In einer Ausführungsform weist die unverzweigte Amplifikationssonde eine einzelne Amplifikationssequenz auf. Dies kann nützlich sein, wenn Hybridisierungs/Dissoziations-Zyklen auftreten, die eine Gruppe von Amplifikationssonden bilden, die an das Target hybridisiert und dann entfernt wurde, um die Bindung von mehr Sonden zu ermöglichen, oder wenn eine große Anzahl von ETM für jede Markierungssonde eingesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen unverzweigte Amplifikationssonden jedoch eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen.
  • Weiters kann die Amplifikationssonde zur Gänze unverzweigt, zur Gänze verzweigt oder zur Gänze dendrimer oder jede Kombination davon sein.
  • Die Amplifikationssequenzen der Amplifikationssonde werden eingesetzt, um entweder direkt oder indirekt an eine Markierungssonde zu binden, um Detektion zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Amplifikationssequenzen der Amplifikationssonde im Wesentlichen komplementär zu einem ersten Abschnitt einer Markierungssonde. Alternativ dazu werden Amplifikationsverlängerungssonden eingesetzt, die einen ersten Abschnitt, der an die Amplifikationssequenz bindet, und einen zweiten Abschnitt aufweisen, der an den ersten Abschnitt der Markierungssonde bindet.
  • Weiters können die Zusammensetzungen der Erfindung „Präamplifikations"-Moleküle umfassen, die als eine Verbrückungsgruppierung zwischen den Markierungsverlängerungsmolekülen und den Amplifikationssonden dienen. Auf diese Weise werden schließlich mehr Amplifier und daher mehr ETM an die Detektionssonden gebunden. Präamplifikationsmoleküle können entweder unverzweigt oder verzweigt sein und enthalten typischerweise etwa 30 bis 3.000 Nucleotide.
  • Die nachstehend erläuterten Reaktionen können, wie Fachleuten bekannt sein wird, auf zahlreiche verschiedene Arten erreicht werden. Komponenten der Reaktion können gleichzeitig oder nacheinander in jeder beliebigen Reihenfolge zugesetzt werden, wobei bevorzugte Ausführungsformen nachstehend erläutert werden. Darüber hinaus kann die Reaktion eine Vielzahl an anderen Reagenzien, die in den Tests eingebunden sein können, umfassen. Diese schließen Reagenzien wie Salze, Puffer, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien usw. ein, die eingesetzt werden können, um optimale Hybridisierung und Detektion zu erleichtern und/oder nicht spezifische oder Hintergrund-Wechselwirkungen zu reduzieren. Reagenzien, die sonst die Wirksamkeit des Tests verbessern, wie Protease-Inhibitoren, Nuclease-Inhibitoren, antimikrobielle Wirkstoffe usw., können, unter Berücksichtigung der Probenherstellungsverfahren und der Reinheit des Targets, auch eingesetzt werden.
  • Im Allgemeinen sind die Verfahren wie nachstehend beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Target anfänglich nach unten in die Nähe der Detektionssonde unter Einsatz jedes beliebigen der zuvor beschriebenen Verfahren geführt. Im Allgemeinen können zwei Verfahren eingesetzt werden; die Testkomplexe, wie nachstehend beschrieben, werden zuerst gebildet (d.h. alle löslichen Komponenten werden, entweder gleichzeitig oder nacheinander, zusammengegeben, umfassend Einfangverlängerungssonden, Markierungssonden, Amplifikationssonden, Markie rungsverlängerungssonden usw.), umfassend jegliche Hybridisierungsbeschleuniger, und anschließend wird der Komplex an die Oberfläche zur Bindung an eine Detektionselektrode hinzugefügt. Alternativ dazu kann das Target zugesetzt werden, Hybridisierungsbeschleunigung findet statt, um zu ermöglichen, dass das Target an den Einfangbindungsliganden gebunden wird, und dann werden zusätzliche Komponenten zugesetzt, um den Testkomplex zu bilden. Letzterer wird nachstehend im Detail beschrieben, doch es kann jedes Verfahren eingesetzt werden. Dem ähnlich können manche Komponenten zugesetzt werden, Elektrophorese unterzogen werden und wiederum andere Komponenten zugesetzt werden; beispielsweise kann der Zielanalyt mit jeglichen Einfangverlängerungssonden kombiniert und anschließend transportiert werden usw. Weiters, wie hierin erläutert, können Elektrophorese-Schritte eingesetzt werden, um „Waschschritte" zu bewirken, durch die überschüssige Reagenzien (nicht gebundene Analyte, überschüssige Sonden usw.) von der Oberfläche entfernt werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können unter Einsatz von mehreren elektrophoretischen Verfahren nicht spezifische Wechselwirkungen reduziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können Markierungssonden, die nicht spezifisch direkt oder indirekt an eine Zielsequenz gebunden sind, von der Oberfläche durch einen Impuls eines entgegengesetzten elektrischen Feldes entfernt werden, d.h. dass das elektrische Feld für eine bestimmte Zeit umgekehrt wird. Die Stärke des umgekehrten elektrischen Feldes wird so ausgewählt, dass spezifisch gebundene Markierungssonden (oder jegliche andere erforderlichen Komponenten der Bindung und Testkomplexe) nicht entfernt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, beispielsweise wenn Elektrophorese eingesetzt wird, tragen die Markierungssonden oder Markierungsbindungsliganden, die die ETM umfassen, eine dem Zielanalyt entgegengesetzte Ladung. Dies kann entweder mittels Nucleinsäure-Markierungssonden oder geladenen Lösungsbindungsliganden erfolgen, wobei sich die Erläuterung auf Nucleinsäureausführungsformen konzentriert. Dies kann in zwei verschiedenen Systemen nützlich sein. In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Zielanalyt einen großen Ladungsüberschuss, d.h. eine negative Ladung im Fall von Nucleinsäure. Das Binden einer oder mehrerer positiv geladener Markierungssonden verändert die negative Nettoladung am Zielkomplex nicht maßgeblich; das bedeutet, dass das Target immer noch von der Kathode angezogen wird. Dennoch werden ungebundene Markierungssonden oder Markierungssonden, die nicht spezifisch an das Target gebunden sind, abgestoßen, was zu einer Reduktion der nicht spezifischen Bindungen führt. PNA-Hauptketten beispielsweise können modifiziert werden, um eine positive Nettoladung zu tragen, und es gibt auf dem Gebiet der Erfindung bekannte, andere Nucleinsäureanaloga, die positiv geladen sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Markierungsonde eine große Menge an entgegengesetzter Ladung auf, sodass sich beim Binden an den Zielanalyt die Nettoladung des Zielanalyts verändert. So tragen beispielsweise bei Nucleinsäuren die Markierungssonden eine ausreichende positive Ladung, um dem Markierungssonden-Zielanalyt-Komplex eine positive Ladung zu verleihen. Dies führt dazu, dass der spezifische Zielanalyt von der Anode angezogen wird, alle anderen negativ geladenen Elemente, d.h. andere Nucleinsäuren, jedoch abgestoßen werden. Dies ist besonders nützlich, wenn ein Überschuss an anderen Targets vorhanden ist; beispielsweise, wenn der Zielanalyt eine kleinere Spezies eines großen Überschusses an anderen Nucleinsäuren ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Zielanalyt anfänglich elektrophoretisch zur Detektionselektrode transportiert und dann immobilisiert oder an die Detektionselektrode gebunden. In einer Ausführungsform erfolgt dies durch Bilden eines Bindungskomplexes (hierin häufig als ein Hybridisierungskomplex bezeichnet, wenn Nucleinsäurekomponenten eingesetzt werden) zwischen einer Einfangsonde und einem Abschnitt des Zielanalyts. Eine bevorzugte Ausführungsform setzt Einfangverlängerungsbindungsliganden (hierin auch als Einfangverlängerungssonden bezeichnet) ein; in dieser Ausführungsform wird ein Bindungskomplex zwischen einem Abschnitt der Zielsequenz und einem ersten Abschnitt einer Einfangverlängerungsson de und ein zusätzlicher Bindungskomplex zwischen einem zweiten Abschnitt der Einfangverlängerungssonde und einem Abschnitt der Einfangsonde gebildet. Zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen setzen zusätzliche Einfangsonden ein, die so einen Bindungskomplex zwischen einem Abschnitt der Zielsequenz und einem ersten Abschnitt einer zweiten Einfangverlängerungssonde und einen Bindungskomplex zwischen einem zweiten Abschnitt der zweiten Einfangverlängerungssonde und einem zweiten Abschnitt der Einfangsonde bilden.
  • Alternativ dazu erfolgt die Bindung der Zielsequenz an die Elektrode gleichzeitig mit den anderen Reaktionen.
  • Das Verfahren fährt mit der Einfügung von Amplifikationssonden fort, sofern diese eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Amplifikationssonde eine erste Sondensequenz, die im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der Zielsequenz ist, und zumindest eine Amplifikationssequenz.
  • In einer Ausführungsform wird die erste Sondensequenz der Amplifikationssonde an die Zielsequenz hybridisiert, und jegliche nicht hybridisierte Amplifikationssonde wird entfernt. Dies erfolgt im Allgemeinen wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist und hängt vom Testtyp ab. Wird die Zielsequenz an einer Oberfläche wie einer Elektrode immobilisiert, so erfolgt das Entfernen von überschüssigen Reagenzien im Allgemeinen über einen oder mehrere Waschschritte, wie Fachleuten bekannt sein wird. In dieser Ausführungsform kann das Target an jedem beliebigen festen Trägermaterial immobilisiert werden. Wird die Zielsequenz nicht an einer Oberfläche immobilisiert, so kann das Entfernen überschüssiger Reagenzien wie der Sonden der Erfindung mittels Zusetzen von Kügelchen (d.h. festen Trägerteilchen) erfolgen, die zu den Sonden komplementäre Sequenzen enthalten, sodass sich die überschüssigen Sonden an die Kügelchen binden. Die Kügelchen können dann, beispielsweise durch Zentrifugieren, Filtrieren, Anlegen magnetischer oder elektrostatischer Felder usw., entfernt werden.
  • Das Reaktionsgemisch wird dann Bedingungen (Temperatur, hohe Salzkonzentration, Veränderungen im pH usw.) unterzogen, unter denen die Amplifikationssonde von der Zielsequenz dissoziiert, und die Amplifikationssonde wird gesammelt. Die Amplifikationssonde kann einer Elektrode zugesetzt werden, die Einfangsonden für die Amplifikationssonden umfasst, Markierungssonden werden zugesetzt und die Detektion wird erreicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine größere Gruppe an Sonden durch Zusetzen einer größeren Menge an Amplifikationssonden zur Zielsequenz erzeugt, und die Hybridisierungs/Dissoziierungs-Reaktionen werden wiederholt, um eine größere Gruppe an Amplifikationssonden zu erzeugen. Diese Amplifikationssonden-Gruppe wird dann einer Elektrode zugesetzt, die Amplifikationseinfangsonden umfasst, Markierungssonden werden zugesetzt und die Detektion geht vonstatten.
  • In dieser Ausführungsform wird bevorzugt, dass die Zielsequenz an einem festen Trägermaterial, umfassend eine Elektrode, mittels hierin beschriebener Verfahren immobilisiert wird; Fachleuten ist jedoch sicherlich bekannt, dass auch andere Technologien zur Bindung an festes Trägermaterial eingesetzt werden können, wie Bindung an Glas, Polymere usw. Es ist möglich, die Reaktion auf einem festen Trägermaterial erfolgen zu lassen und anschließend die gesammelten Amplifikationssonde der Elektrode zur Detektion zuzusetzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Amplifikationssonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen.
  • In einer Ausführungsform wird die erste Sondensequenz der Amplifikationssonde an die Zielsequenz hybridisiert, und jegliche nicht hybridisierte Amplifikationssonde wird entfernt. Wiederum setzen bevorzugte Ausführungsformen immobilisierte Zielsequenzen ein, worin die Zielsequenzen durch Hybridisierung mit Einfangsonden, die an die Elektrode gebunden sind, oder durch Hybridisierung an Einfangverlängerungssonden, die wiederum mit immobilisierten Einfangsonden hybridisieren, wie hierin beschrieben wird, immobilisiert werden. Im Allgemeinen werden in diesen Ausführungsformen die Einfangsonden und die Detektionssonden an der Elektrode immobilisiert, und dies im Allgemeinen an derselben „Adresse".
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Sondensequenz der Amplifikationssonde an einen ersten Abschnitt von zumindest einer Markierungsverlängerungssonde hybridisiert, und ein zweiter Abschnitt der Markierungsverlängerungssonde wird an einen Abschnitt der Zielsequenz hybridisiert. Andere bevorzugte Ausführungsformen setzen mehr als eine Markierungsverlängerungssonde ein, wie im Allgemeinen in 5G dargestellt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Amplifikationssequenzen der Amplifikationssonde durch Hybridisieren zumindest einer Markierungssondensequenz direkt zur Detektion eingesetzt.
  • Die Erfindung stellt somit Testkomplexe bereit, die mindestens eine Zielsequenz und eine Markierungssonde umfassen. „Testkomplexe" hierin bezeichnen das Sammeln von Bindungen oder Hybridisierungskomplexen, die Analyte umfassen, einschließlich Bindungsliganden und Targets, die Detektion ermöglichen. Die Zusammensetzung des Testkomplexes hängt vom Einsatz der hierin erläuterten, unterschiedlichen Sondenkomponenten ab. So umfasst in 6A der Testkomplex die Einfangsonde und die Zielsequenz. Die Testkomplexe können je nach der eingesetzten Anordnung auch Einfangverlängerungssonden, Markierungsverlängerungssonden und Amplifikationssonden, wie hierin erläutert, umfassen.
  • Die Tests werden im Allgemeinen unter stringenten Bedingungen durchgeführt, die die Bildung des Markierungssonden-Bindungskomplexes nur in Gegenwart des Targets ermöglichen. Stringenz kann durch Verändern eines Schrittparameters gesteuert werden, der eine thermodynamische Variable ist, umfassend Temperatur, Formamidkonzentration, Salzkonzentration, chaotrope Salzkonzentration, pH, organische Lösungsmittelkonzentration usw., jedoch nicht darauf beschränkt. Stringenz kann auch den Einsatz eines Elektrophoreseschritts einbinden, um nicht spezifische Materialien (d.h. mit geringer Stringenz) von der Detektionselektrode zu entfernen.
  • Diese Parameter können auch eingesetzt werden, um nicht spezifische Bindungen zu überwachen, wie im Allgemeinen im US-Patent Nr. 5.681.697 erläutert wird. So kann es wünschenswert sein, bestimmte Schritte bei höher stringenten Bedingungen durchzuführen; beispielsweise, wenn ein anfänglicher Hybridisierungsschritt zwischen der Zielsequenz und den Markierungsverlängerungs- und Einfangverlängerungssonden durchgeführt wird. Das Durchführen dieses Verfahrensschritts bei Bedingungen, die spezifisches Binden begünstigen, kann das Reduzieren nicht spezifischer Bindungen ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Nucleinsäureausführungsform, sofern alle der hierin erläuterten Komponenten eingesetzt werden, entspricht ein bevorzugtes Verfahren den folgenden Beschreibungen. Einzelsträngige Zielsequenz wird unter Hybridisierungsbedingungen mit den Einfangverlängerungssonden und den Markierungsverlängerungssonden inkubiert. Eine bevorzugte Ausführungsform lässt diese Reaktion in Gegenwart der Elektrode mit den immobilisierten Einfangsonden ablaufen, wobei dies auch in zwei Schritten erfolgen kann, wobei Inkubation zuerst und der Zusatz der Elektrode anschließend erfolgt. Überschüssige Reagenzien werden weggewaschen, und Amplifikationssonden werden dann zugesetzt. Werden Präamplifikationssonden eingesetzt, so können diese entweder vor den Amplifikationssonden oder gleichzeitig mit den Amplifikationssonden zugesetzt werden. Überschüssige Reagenzien werden weggewaschen, und Markierungssonden werden dann zugesetzt. Überschüssige Reagenzien werden weggewaschen, und die Detektion geht wie nachstehend erläutert vonstatten.
  • In einer Ausführungsform werden zahlreiche Einfangsonden (oder Einfangsonden und Einfangverlängerungssonden) eingesetzt, die jeweils im Wesentlichen zu einem anderen Abschnitt der Zielsequenz komplementär sind.
  • Wiederum ist, wenn Amplifikationssonden eingesetzt werden, wie hierin erläutert, das System im Allgemeinen so angeordnet, dass beim Binden von Markierungssonden die die ETM umfassenden Verstärkungslinker entweder nahe der Monoschichtoberfläche, die leitfähige Oligomere (Mechanismus-2) umfasst, oder nahe den Detektionssonden angeordnet werden. So kann beispielsweise bei Mechanismus-2-Systemen, wenn die ETM über Strukturen vom „Dendrimer"-Typ, wie hierin erläutert, gebunden sind, die Länge der Linker vom Bindungspunkt der Nucleinsäure an die ETM variieren, besonders mit der Länge der Einfangsonde, wenn Einfangverlängerungssonden eingesetzt werden. Das bedeutet, dass längere Einfangsonden mit Einfangverlängerungen dazu führen können, dass die Zielsequenzen weiter weg von der Oberfläche „gehalten" werden als bei kürzeren Einfangsonden. Das Zusetzen von zusätzlichen Bindungssequenzen zwischen der Sondennucleinsäure und den ETM kann dazu führen, dass die ETM räumlich gesehen näher an der Oberfläche sind und dass dadurch bessere Resultate erzielt werden. Dem ähnlich können in Mechanismus-1-Systemen die Länge des Verstärkungslinkers, die Länge der Detektionssonde und deren Abstand optimiert werden.
  • Weiters können, sofern wünschenswert, eingesetzte Nucleinsäuren in der Erfindung auch vor der Detektion mittels Standardverfahren der Molekularbiologie, wie Einsatz einer Ligase, sofern dies anwendbar ist, miteinander ligiert werden. Dem ähnlich können, sofern für die Stabilität wünschenswert, Vernetzer zugesetzt werden, um die Strukturen stabil zu halten.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass die hierin erläuterten Systeme, auch wenn sie für Nucleinsäuren beschrieben werden, für andere Zielanalyte ebenfalls eingesetzt werden können.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung werden im Allgemeinen, wie nachstehend und in den U.S.S.N. 08/743.798, 08/873.978, 08/911.085 und PCT US97/20.014 beschrieben, synthetisiert, wobei im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren eingesetzt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass zahlreiche dieser nachstehend erläuterten Verfahren an Nucleinsäuren angewandt werden, die eine Ribose-Phosphat-Hauptkette enthalten. Dennoch, wie zuvor bereits erwähnt, können zahlreiche andere Nucleinsäureanaloga eingesetzt werden, wovon manche entweder Ribose oder Phosphat in der Hauptkette nicht enthalten können. In diesen Ausführungsformen wird die Bindung bei Bindungen an anderen Positionen als der Base, wie Fachleuten bekannt sein wird, durch die Hauptkette bestimmt. So kann beispielsweise die Bindung an den Kohlenstoffatomen der PNA-Hauptkette erfolgen, wie nachstehend beschrieben wird, oder an jedem Terminus der PNA.
  • Die Zusammensetzungen können auf verschiedene Weisen erzeugt werden. In einem bevorzugten Verfahren wird zuerst ein leitfähiges Oligomer, das an ein Nucleosid gebunden ist, unter Zusatz von zusätzlichen Nucleosiden synthetisiert, um die Einfangsonde zu bilden, wonach Anbindung an die Elektrode erfolgt. Alternativ dazu kann die gesamte Einfangsonde erzeugt werden und dann das gesamte leitfähige Oligomer zugesetzt werden, wonach Anbindung an die Elektrode erfolgt. Alternativ dazu wird eine Monoschicht aus leitfähigen Oligomeren (von denen manche funktionelle Gruppen zur Bindung von Einfangsonden aufweisen) zuerst an die Elektrode gebunden, wonach die Anbindung der Einfangsonde erfolgt. Die letzten zwei Verfahren können bevorzugt werden, wenn leitfähige Oligomere eingesetzt werden, die unter Bedingungen, die bei herkömmlicher Nucleinsäuresynthese eingesetzt werden, und in den Lösungsmitteln nicht stabil sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung zuerst durch Bilden des leitfähigen Oligomers, das kovalent an das Nucleosid gebunden ist, und anschließendes Zusetzen von zusätzlichen Nucleosiden erzeugt, um eine Einfangsondennucleinsäure zu bilden, wobei der letzte Schritt den Zusatz des leitfähigen Oligomers zur Elektrode umfasst.
  • Das Binden des leitfähigen Oligomers an das Nucleosid kann auf verschiedene Arten erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das gesamte leitfähige Oligomer oder ein Teil davon zuerst synthetisiert (im Allgemeinen mit einer funktionel len Gruppe am Ende zur Bindung an die Elektrode), das anschließend an das Nucleosid gebunden wird. Zusätzliche Nucleoside werden dann je nach Bedarf zugesetzt, wobei der letzte Schritt im Allgemeinen das Anbinden an die Elektrode ist. Alternativ dazu werden Oligomereinheiten, eine nach der anderen, dem Nucleosid zugesetzt, wobei zusätzliche Nucleoside zugesetzt werden und die Anbindung an die Elektrode erfolgt. Mehrere repräsentative Synthesen werden in den Figuren aus den WO 98/20.162; PCT/US98/12.430; PCT/US98/12.082; PCT/US99/01.705; PCT/US/01.703; und den U.S.S.N 09/135.183, 60/105.875 und 09/295.691 dargestellt.
  • Das leitfähige Oligomer wird dann an ein Nucleosid angebunden, das ein (oder mehrere) der Oligomereinheiten enthalten kann, die wie hierin dargestellt gebunden sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung an eine Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette, umfassend Amid- und Aminbindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es zumindest eine Methylengruppe oder andere kurze aliphatische Alkylgruppen (als eine Z-Gruppe) zwischen dem an die Ribose gebundenen Stickstoff und dem aromatischen Ring des leitfähigen Oligomers.
  • Alternativ dazu erfolgt die Bindung über ein Phosphat der Ribose-Phosphat-Hauptkette, wie im Allgemeinen in der PCT US97/20.014 dargestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung über die Base. In einer bevorzugten Ausführungsform können Schutzgruppen der Base vor Zusatz der leitfähigen Oligomere zugesetzt werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist. Weiters können Palladium-Kreuzkopplungs-Reaktionen so verändert werden, dass sie vor Dimerisationsproblemen schützen; d.h. dass zwei leitfähige Oligomere dimerisieren und sich nicht an die Base binden.
  • Alternativ dazu kann die Bindung an die Base auch über Erzeugen des Nucleosids mit einer Einheit des Oligomers erfolgen, wonach der Zusatz der anderen folgt.
  • Sind die modifizierten Nucleoside vor der Bindung an die Elektrode hergestellt, geschützt und aktiviert, können sie in ein wachsendes Oligonucleotid durch herkömmliche Syntheseverfahren auf unterschiedliche Arten eingebunden werden (Galt, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK 1984, Eckstein).
  • In einer Ausführungsform werden ein oder mehrere modifizierte Nucleoside zur Triphosphatform umgesetzt und in eine wachsende Oligonucleotidkette mittels herkömmlicher Molekularbiologieverfahren eingebunden, wie beispielsweise mittels der Enzyme DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase, reverse Transkriptase und RNA-Polymerasen. Zur Einbindung eines 3'-modifizierten Nucleosids in eine Nucleinsäure kann terminale Desoxynucleotidyltransferase eingesetzt werden. (Ratliff, Terminal deoxynucleotidyltransferase. In: The Enzymes, Bd. 14A, P.D. Boyer (Hrsg.), S. 105–118; Academic Press, San Diego, CA (1981)). So stellt die vorliegende Erfindung Desoxyribonucleosid-Triphosphate bereit, die eine kovalent gebundene ETM umfassen. Bevorzugte Ausführungsformen setzen ETM-Bindungen an die Base oder die Hauptkette ein, beispielsweise an die Ribose (vorzugsweise an Position 2'), wie im Allgemeinen nachstehend in den Strukturen 42 und 43 dargestellt ist:
  • Struktur 42
    Figure 01470001
  • Struktur 43
    Figure 01480001
  • So kann es in manchen Ausführungsformen möglich sein, die ETM umfassenden Nucleinsäuren in situ zu erzeugen. Beispielsweise kann eine Zielsequenz an eine Einfangsonde (beispielsweise an der Oberfläche) so hybridisieren, dass der Terminus der Zielsequenz ausgesetzt, d.h. nicht hybridisiert, ist. Der Zusatz von Enzymen und Triphosphatnucleotiden, die mit ETM markiert sind, ermöglicht die In-situ-Schaffung der Markierung. Dem ähnlich kann der Einsatz von markierten Nucleotiden, die durch Polymerasen erkannt werden, gleichzeitige PCR und Detektion ermöglichen; das bedeutet, dass die Zielsequenzen in situ erzeugt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das modifizierte Nucleosid zur Phosphoramidit- oder zur N-Phosphonatform umgesetzt, die dann in Festphasen- oder Lösungssynthesen von Oligonucleotiden eingesetzt werden. Auf diese Weise wird das modifizierte Nucleosid, entweder zur Bindung an die Ribose (d.h. Amino- oder Thiolmodifizierte Nucleoside) oder die Base, in das Oligonucleotid entweder an einer inneren Position oder dem 5'-Terminus eingebunden. Dies erfolgt im Allgemeinen über einen von zwei verschiedenen Wegen. Zuerst wird die 5'-Position der Ribose mit 4',4-Dimethoxytrityl (DMT) geschützt, woraufhin entweder eine Reaktion mit 2-Cyanoethoxybisdiisopropylaminophosphin in Gegenwart von Diisopropylammoniumtetrazolid oder eine Reaktion mit Chlordiisopropylamino-2'-cyanoethyoxyphosphin erfolgt, um das auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Phosphoramidit zu ergeben; doch auch andere Verfahren können eingesetzt werden, wie Fachleuten sicherlich bekannt ist. Siehe Gait (s.o.); Caruthers, Science 230, 281 (1985).
  • Zur Bindung einer Gruppe an den 3'-Terminus setzt ein bevorzugtes Verfahren die Bindung des modifizierten Nucleosids (oder des Nucleosidersatzes) an Controlled Pore Glass (CPG) oder andere oligomere Trägermaterialien ein. In dieser Ausführungsform wird das modifizierte Nucleosid am 5'-Ende mit DMT geschützt und dann mit Bernsteinsäureanhydrid unter Aktivierung umgesetzt. Die resultierende Succinylverbindung wird an CPG oder andere oligomere Trägermaterialien, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, gebunden. Weitere Phosphoramiditnucleoside werden, modifiziert oder nicht, an das 5'-Ende nach der Entfernung des Schutzes zugesetzt. So stellt die vorliegende Erfindung leitfähige Oligomere oder Isolatoren, die kovalent an Nucleoside gebunden sind, die ihrerseits an feste oligomere Trägermaterialien wie CPG gebunden sind, und Phosphoramiditderivate der Nucleoside der Erfindung bereit.
  • Die Erfindung stellt weiters Verfahren zur Herstellung von Markierungssonden mit ETM umfassenden Verstärkungslinkern bereit. Diese Synthesereaktionen hängen von der Eigenschaft des Verstärkungslinkers und dem Bindungsverfahren der ETM ab, wie Fachleuten bekannt sein wird. Im Falle von Nucleinsäure-Verstärkungslinker werden die Markierungssonden im Allgemeinen wie hierin erläutert über die Einbindung von ETM an einer oder mehreren Positionen hergestellt. Wird ein Übergangsmetallkomplex als die ETM eingesetzt, so kann die Synthese auf verschiedene Arten erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Ligand/werden die Liganden einem Nucleosid zugesetzt, wonach das Übergangsmetallion zugesetzt wird, und dann wird das Nucleosid mit dem gebundenen Übergangsmetallkomplex dem Oligonucleotid zugesetzt, d.h. durch Zusatz zu einem Nucleinsäuresynthesegerät. Alternativ dazu können der Ligand/die Liganden gebunden werden, wonach Einbindung in eine wachsende Oligonucleotidkette folgt, wonach der Zusatz des Metallions folgt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden ETM an eine Ribose der Ribose-Phosphat-Hauptkette gebunden. Dies erfolgt im Allgemeinen, wie hierin erläutert, für leitfähige Oligomere, wie sie hierin und in der PCT-Veröffentlichung WO 95/15.971 beschrieben sind, unter Einsatz Amino-modifizierter und Oxo-modifizierter Nucleoside entweder an 2'- oder 3'-Position der Ribose. Die Aminogruppe kann dann entweder als ein Ligand, beispielsweise als ein Übergangsmetallligand zur Bindung des Metallions, oder als eine chemisch funktionelle Gruppe eingesetzt werden, die zur Bindung anderer Liganden oder organischer ETM, beispielsweise über Amidbindungen, eingesetzt werden kann, wie Fachleuten bekannt sein wird. Die Beispiele beschreiben beispielsweise die Synthese von Nucleosiden mit einer Vielzahl an ETM, die über die Ribose gebunden sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden ETM an ein Phosphat der Ribose-Phosphat-Hauptkette gebunden. Wie hierin erläutert kann dies unter Einsatz von Phosphodiesteranaloga wie Phosphoramiditbindungen erfolgen (siehe im Allgemeinen die PCT-Veröffentlichung WO 95/15.971) oder kann auf ähnliche Weise erfolgen, wie in der PCT US97/20.014 beschrieben wird, worin das leitfähige Oligomer durch einen Übergangsmetallliganden oder -komplex oder eine organische ETM ersetzt wird.
  • Bindung an andere Hauptketten, beispielsweise Peptidnucleinsäuren oder andere Phosphatbindungen, erfolgen auf eine Weise, die Fachleuten bekannt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden ETM an eine Base des Nucleosids gebunden. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen. In einer Ausführungsform werden Aminogruppen der Base, die entweder natürlich vorkommen oder wie hierin beschrieben zugesetzt werden (siehe beispielsweise die Fig.), entweder als Liganden für Übergangsmetallkomplexe oder als eine chemisch funktionelle Gruppe eingesetzt, die eingesetzt werden kann, um andere Liganden, beispielsweise über eine Amidbindung, oder organische ETM hinzuzufügen. Dies erfolgt auf eine Weise, wie sie Fachleuten bekannt ist. Alternativ dazu sind Nucleoside, die Halogenatome enthalten, die an den heterozyklischen Ring gebunden sind, im Handel erhältlich. Über Acetylen gebundene Liganden können unter Einsatz der halogenierten Basen hinzugefügt werden, wie im Allgemeinen bekannt ist; siehe beispielsweise Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36(34), 6.017–6.020 (1995); Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36(2), 3.489–3.490 (1995); und Tzalis et al., Chem. Communications (in press) (1996). Siehe auch die Figuren und die Beispiele, welche die Synthese von Metallocenen (in diesem Fall Ferrocen), die über Acetylenbindungen an die Basen gebunden sind, beschreiben.
  • In einer Ausführungsform werden die Nucleoside mit Übergangsmetallliganden erzeugt, die in eine Nucleinsäure eingebunden sind, und anschließend werden das Übergangsmetallion und jegliche verbleibende, notwendige Liganden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, zugesetzt. In einer alternativen Ausführungsform werden das Übergangsmetallion und zusätzliche Liganden vor der Einbindung in die Nucleinsäure zugesetzt.
  • Nachdem die Nucleinsäuren der Erfindung mit einem kovalent gebundenen Bindungslinker (d.h. entweder einem Isolator oder einem leitfähigen Oligomer) einmal erzeugt wurde, wird der Bindungslinker an die Elektrode gebunden. Das Verfahren hängt vom Typ der eingesetzten Elektrode ab. Wie hierin beschrieben werden die Bindungslinker im Allgemeinen mit einem terminalen „A"-Linker erzeugt, um die Bindung an die Elektrode zu erleichtern. Für die Zwecke dieser Anwendung wird eine Schwefel-Gold-Bindung als eine kovalente Bindung betrachtet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden leitfähige Oligomere, Isolatoren und Bindungslinker über Schwefelbindungen an die Elektrode gebunden. Erstaunlicherweise sind jedoch herkömmliche Schutzgruppen für die Bindung von Molekülen an die Goldelektroden im Allgemeinen weder ideal für den Einsatz in der Synthese der hierin beschriebenen Zusammensetzungen noch zur Einbindung in Oligonucleotidsynthesereaktionen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung neue Verfahren zur Bindung leitfähiger Oligomere an Goldelektroden bereit, wobei unübliche Schutzgruppen, umfassend Ethylpyridin und Trimethylsilylethyl, wie in den Fig. dargestellt, zum Einsatz kommen. Enthalten jedoch die leitfähigen Oligomere keine Nucleinsäu ren, so können, wie Fachleuten bekannt sein wird, herkömmliche Schutzgruppen wie Acetylgruppen und andere eingesetzt werden. Siehe Greene et al. (s.o.).
  • Dies kann über verschiedene Wege erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Untereinheit des leitfähigen Oligomers, das das Schwefelatom zur Bindung an die Elektrode enthält, mit einer Ethylpyridin- oder einer Trimethylsilylethylgruppe geschützt. Hinsichtlich der ersten Gruppe erfolgt dies im Allgemeinen über Kontaktieren der das Schwefelatom (vorzugsweise in Form eines Sulfhydryls) enthaltenden Untereinheit mit einer Vinylpyridingruppe oder Vinyltrimethylsilylethylgruppe unter Bedingungen, wobei eine Ethylpyridingruppe oder Trimethylsilylethylgruppe dem Schwefelatom hinzugefügt wird.
  • Diese Untereinheit enthält im Allgemeinen auch eine funktionelle Gruppierung zur Bindung zusätzlicher Untereinheiten, und so werden zusätzliche Untereinheiten gebunden, um das leitfähige Oligomer zu bilden. Das leitfähige Oligomer wird dann an ein Nucleosid gebunden, und zusätzliche Nucleoside werden gebunden. Die Schutzgruppe wird dann entfernt, und die kovalente Schwefel-Gold-Bindung wird hergestellt. Alternativ dazu wird das gesamte leitfähige Oligomer oder ein Teil davon erzeugt, und anschließend wird entweder eine Untereinheit, die ein geschütztes Schwefelatom enthält, zugesetzt, oder es wird ein Schwefelatom selbst zugesetzt und dann geschützt. Das leitfähige Oligomer wird dann an ein Nucleosid gebunden, und zusätzliche Nucleoside werden gebunden. Alternativ dazu wird das an die Nucleinsäure gebundene, leitfähige Oligomer erzeugt, und anschließend wird entweder eine ein geschütztes Schwefelatom enthaltende Untereinheit zugesetzt, oder es wird ein Schwefelatom zugesetzt und dann geschützt. Alternativ dazu kann wie oben die Ethylpyridin-Schutzgruppe eingesetzt werden, muss jedoch nach einem oder mehreren Schritten wieder entfernt und durch eine herkömmliche Schutzgruppe wie ein Disulfid ersetzt werden. So können Ethylpyridin- oder Trimethylsilylethylgruppen als Schutzgruppe für manche der Synthesereaktionen dienen und anschließend entfernt und durch eine herkömmliche Schutzgruppe ersetzt werden.
  • Unter „Untereinheit" eines leitfähigen Polymers wird hierin zumindest die Gruppierung des leitfähigen Oligomers bezeichnet, an die das Schwefelatom gebunden ist, obwohl zusätzliche Atome vorhanden sein können, umfassend entweder funktionelle Gruppen, die den Zusatz von zusätzlichen Komponenten des leitfähigen Oligomers ermöglichen, oder zusätzliche Komponenten des leitfähigen Oligomers. So umfasst beispielsweise, wenn Oligomere der Struktur 1 eingesetzt werden, eine Untereinheit zumindest die erste Y-Gruppe.
  • Ein bevorzugtes Verfahren umfasst 1) das Zusetzen einer Ethylpyridin- oder Trimethylsilylethyl-Schutzgruppe zu einem Schwefelatom, das an eine erste Untereinheit eines leitfähigen Oligomers gebunden ist, was im Allgemeinen durch Hinzufügen einer Vinylpyridin- oder Trimethylsilylethylgruppe zu einem Sulfhydryl erfolgt; 2) das Zusetzen zusätzlicher Untereinheiten, um das leitfähige Oligomer zu bilden; 3) das Zusetzen von zumindest einem ersten Nucleosid zum leitfähigen Oligomer; 4) das Zusetzen zusätzlicher Nucleoside zum ersten Nucleosid, um eine Nucleinsäure zu bilden; 5) das Binden des leitfähigen Oligomers zur Goldelektrode. Dies kann auch in Abwesenheit von Nucleosiden erfolgen, wie in den Beispielen beschrieben wird.
  • Das obige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Isolatormoleküle an eine Goldelektrode zu binden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Monoschicht, die leitfähige Oligomere (und gegebenenfalls Isolatoren) umfasst, einer Elektrode hinzuzgefügt. Im Allgemeinen ist die Chemie dieses Hinzufügens ähnlich oder dieselbe wie das Hinzufügen von leitfähigen Oligomeren zur Elektrode, d.h. sie erfolgt unter Einsatz eines Schwefelatoms zur Bindung an eine Goldelektrode usw. Zusammensetzungen, die zusätzlich zu den leitfähigen Oligomeren Monoschichten umfassen, die kovalent an Nucleinsäuren gebunden sind, können auf zumindest eine von fünf verschiedenen Arten erzeugt werden: (1) Hinzufügen der Monoschicht, gefolgt von folgendem Hinzufügen des Bindungslinker-Nucleinsäure-Komplexes; (2) Hinzufügen des Bindungslinker-Nucleinsäure-Komplexes, gefolgt vom Hinzufügen der Monoschicht; (3) gleich zeitiges Hinzufügen der Monoschicht und des Bindungslinker-Nucleinsäure-Komplexes; (4) Bildung einer Monoschicht (unter Einsatz von 1, 2 oder 3), die Bindungslinker umfasst, die mit einer funktionellen Gruppierung enden, welche zur Bindung einer vollständigen Nucleinsäure geeignet ist; oder (5) Bildung einer Monoschicht, die Bindungslinker umfasst, die mit einer funktionellen Gruppierungen enden, welche zur Nucleinsäuresynthese geeignet ist, d.h. die Nucleinsäure wird an der Oberfläche der Monoschicht, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, synthetisiert. Solche geeigneten funktionellen Gruppierungen umfassen Nucleoside, Aminogruppen, Carboxygruppen, geschützte Schwefelgruppierungen oder Hydroxygruppen für Phosphoramiditzusätze, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Beispiele beschreiben die Bildung einer Monoschicht an einer Goldelektrode unter Einsatz des bevorzugten Verfahrens (1).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäure eine Peptidnucleinsäure oder ein Analogon. In dieser Ausführungsform stellt die Erfindung Peptidnucleinsäuren mit zumindest einer kovalent gebundenen ETM oder Bindungslinker bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Gruppierungen kovalent an eine monomere Untereinheit der PNA gebunden. Als „monomere Untereinheit der PNA" wird hierin das -NH-CH2CH2-N(COCH2-Base)-CH2-CO-Monomer oder Derivate (hierin in der Definition von „Nucleosid" eingebunden) von PNA bezeichnet. Die Anzahl der Kohlenstoffatome in der PNA-Hauptkette kann beispielsweise verändert werden; siehe im Allgemeinen Nielsen et al., Chem. Soc. Rev., 73 (1997), worin mehrere PNA-Derivate offenbart sind. Dem ähnlich kann die Amidbindung, die die Base an die Hauptkette bindet, verändert werden; Phosphoramid- und Schwefelamidbindungen können eingesetzt werden. Alternativ dazu werden die Gruppierungen an eine innere monomere Untereinheit gebunden. Unter „innere" wird hierin verstanden, dass die monomere Untereinheit weder die N-terminale monomere Untereinheit noch die C-terminale monomere Untereinheit ist. In dieser Ausführungsform können die Gruppierungen entweder an eine Base oder die Hauptkette der monomeren Untereinheit gebunden sein. Bindung an die Base erfolgt wie hierin erläutert wird oder aus der Literatur bekannt ist. Im Allgemeinen werden Gruppierungen einer Base hin zugefügt, die anschließend in die PNA, wie hierin erläutert, eingebunden wird. Diese Base kann entweder geschützt sein, wie es bei der Einbindung in die PNA-Synthesereaktion erforderlich ist, oder derivatisiert sein, um Einbindung zu ermöglichen, und dies entweder vor oder nach dem Hinzufügen des chemischen Substituenten. Schutz und Derivatisierung der Basen werden in der PCT US97/20.014 gezeigt. Die Basen können anschließend in monomere Untereinheiten eingebunden werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gruppierungen kovalent an die Hauptkette des PNA-Monomers gebunden. Die Bindung erfolgt im Allgemeinen zu einem der unsubstituierten Kohlenstoffatome der monomeren Untereinheit, vorzugsweise des α-Kohlenstoffs der Hauptkette, obwohl die Bindung an den Kohlenstoff an Position 1 oder 2 oder an den α-Kohlenstoff der Amidbindung, die die Base an die Hauptkette bindet, auch möglich ist. In Fall von PNA-Analoga können andere Kohlenstoffe oder Atome auch substituiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Gruppierungen an den α-Kohlenstoffatomen, entweder an eine terminale monomere Untereinheit oder eine innere Untereinheit, zugesetzt.
  • In dieser Ausführungsform wird eine modifizierte monomere Untereinheit mit einer ETM oder einem Bindungslinker oder eine funktionelle Gruppe für ihre Bindung synthetisiert, und anschließend wird die Base zugesetzt, und das modifizierte Monomer kann in eine wachsende PNA-Kette eingebunden werden.
  • Nachdem sie erzeugt wurden, werden die monomeren Untereinheiten mit kovalent gebundenen Gruppierungen in eine PNA unter Einsatz von Verfahren eingebunden, die in Will et al., Tetrahedron 51(44), 12.069–12.082 (1995), und Vanderlaan et al., Tett. Let. 38, 2.249–2.252 (1997), erläutert werden. Diese Verfahren ermöglichen den Zusatz von chemischen Substituenten zu Peptidnucleinsäuren, ohne dabei die chemischen Substituenten zu zerstören.
  • Fachleuten wird bekannt sein, dass Elektroden erzeugt werden können, die jede beliebige Kombination von Nucleinsäuren, leitfähigen Oligomeren und Isolatoren aufweisen können.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich eine oder mehrere Markierungen an jeder beliebigen Position aufweisen. Unter „Markierung" wird hierin ein Element (d.h. ein Isotop) oder eine chemische Verbindung verstanden, das/die gebunden ist, um die Detektion der Verbindung zu ermöglichen. Bevorzugte Markierungen sind radioaktive Isotopen-Markierungen und färbige oder fluoreszierende Farbstoffe. Die Markierungen können in die Verbindung an jeglicher Position eingebunden sein. Weiters können die Zusammensetzungen der Erfindung auch andere Gruppierungen wie Vernetzer enthalten, um Vernetzen des Zielsonden-Komplexes zu erleichtern. Siehe beispielsweise Lukhtanov et al., Nucl. Acids. Res. 24(4), 683 (1996), und Tabone et al., Biochem. 33, 375 (1994).
  • Nachdem sie erzeugt wurden, finden die Zusammensetzungen Einsatz in zahlreichen Anwendungen, die hierin beschrieben werden. Insbesondere finden die Zusammensetzungen der Erfindung Einsatz in Bindungstests zur Detektion von Zielanalyten, insbesondere von Nucleinsäure-Zielsequenzen. Fachleuten wird bekannt sein, dass Elektroden erzeugt werden können, die eine einzelne Spezies an Bindungsliganden oder mehrere Bindungsliganden-Spezies, d.h. in einem Anordnungsformat, aufweist.
  • Weiters, wie hierin erläutert wird, ermöglicht der Einsatz eines festen Trägermaterials wie einer Elektrode die Verwendung dieser Tests in einer Anordnung. Beispielsweise ist der Einsatz von Oligonucleotid-Anordnungen auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt. Darüber hinaus sind Verfahren zum „Adressieren" von Orten innerhalb einer Elektrode und zur Oberflächenmodifikation von Elektroden bekannt. So werden in einer bevorzugten Ausführungsform Anordnungen unterschiedlicher Bindungsliganden, umfassend Nucleinsäuren, auf der Elektrode abgelegt, wobei jede davon kovalent an die Elektrode über einen Bindungslinker gebunden ist. In dieser Ausfüh rungsform kann die Anzahl unterschiedlicher Bindungsliganden stark variieren, von eins bis zu mehreren Tausenden, wobei ein Bereich von etwa 4 bis etwa 100.000 bevorzugt und von etwa 10 bis etwa 10.000 besonders bevorzugt ist.
  • Nach Erzeugung der Testkomplexe der Erfindung, die zumindest einen Zielanalyt und eine Markierungssonde umfassen, erfolgt die Detektion mit elektronischer Initiierung. Ohne durch den Mechanismus oder die Theorie eingeschränkt zu sein, beruht die Detektion auf Elektronenübertragung von der ETM zur Elektrode, umfassend über den „π-Weg".
  • Detektion von Elektronenübertragung, d.h. der Gegenwart der ETM, wird im Allgemeinen elektronisch ausgelöst, wobei Spannung bevorzugt wird. Eine Spannung wird am Testkomplex angelegt. Genaue Steuerung und Veränderungen der angelegten Spannung können über einen Potentiostat und entweder ein Drei-Elektrodensystem (eine Bezugs-, eine Beispiels- (oder Arbeits-) und eine Gegenelektrode) oder ein Zwei-Elektrodensystem (eine Beispiels- und eine Gegenelektrode) erfolgen. Dies ermöglicht das Anpassen der angelegten Spannung an die Höchstspannung des Systems, die teilweise von der Auswahl der ETM und teilweise vom eingesetzten, leitfähigen Oligomer, von der Zusammensetzung und Integrität der Monoschicht und vom Typ der Bezugselektrode abhängt. Wie hierin beschrieben ist Ferrocen eine bevorzugte ETM.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Co-Reduktant oder Co-Oxidans (zusammen Co-Redoxant) als eine zusätzliche Elektronenquelle oder -senke eingesetzt. Siehe im Allgemeinen Sato et al., Bull. Chem. Soc. Jpn 66, 1.032 (1993); Uosaki et al., Electrochimica Acta 36, 1.799 (1991); und Alleman et al., J. Phys. Chem. 100, 17.050 (1996).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Eingangselektronenquelle in Lösung zur Initiation der Elektronenübertragung eingesetzt, vorzugsweise wenn Einleitung und Detektion mittels Gleichstrom oder bei einer Wechselstromfrequenz, bei der Diffusion nicht einschränkend ist, erfolgen. Im Allgemeinen, wie Fachleuten bekannt sein wird, setzen bevorzugte Ausführungsformen Monoschichten ein, die ein Minimum an „Löchern" enthalten, sodass ein Kurzschluss des Systems vermieden werden kann. Dies kann auf verschiedene Arten geschehen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Eingangselektronenquelle eingesetzt, die ein geringeres oder ein ähnliches Redox-Potential aufweist wie die ETM der Markierungssonde. So werden bei Spannungen über dem Redox-Potential der Eingangselektronenquelle sowohl die ETM als auch die Eingangselektronenquelle oxidiert und können so Elektronen abgeben; die ETM gibt ein Elektron an die Elektrode ab, und die Eingangselektronenquelle gibt an die ETM ab. Ferrocen beispielsweise, als eine ETM, die an die Zusammensetzungen der Erfindung gebunden ist, wie in den Beispielen beschrieben, weist ein Redox-Potential von etwa 200 mV in wässriger Lösung auf (die sich signifikant verändern kann, je nachdem, woran das Ferrocen gebunden ist, je nach Art der Bindung und der Gegenwart jeglicher Substituentengruppen). Ferrocyanid, eine Elektronenquelle, weist ebenfalls ein Redox-Potential von etwa 200 mV auf (in wässriger Lösung). Demgemäß wird bei Spannungen von etwa 200 mV oder darüber Ferrocen zu Ferricenium umgesetzt, das dann ein Elektron zur Elektrode überträgt. Nun kann das Ferricyanid oxidiert werden, um ein Elektron zur ETM zu übertragen. Auf diese Weise dient die Elektronenquelle (oder der Co-Reduktant) dazu, das im System erzeugte Signal zu verstärken, da die Elektronenquellenmoleküle rasch und wiederholt Elektronen an die ETM, die an die Nucleinsäure gebunden ist, übertragen. Die Geschwindigkeit der Elektronenabgabe oder – annahme ist durch die Geschwindigkeit der Diffusion des Co-Reduktanten, den Elektronentransfer zwischen dem Co-Reduktanten und der ETM, eingeschränkt, die wiederum durch die Konzentration und Größe usw. beeinflusst wird.
  • Alternativ dazu werden Eingangselektronenquellen eingesetzt, die geringere Redox-Spannungen aufweisen als die ETM. Bei Spannungen unter dem Redox-Potential der ETM, jedoch über dem Redox-Potential der Elektronenquelle, ist die Eingangsquelle wie Ferrocyanid nicht in der Lage, oxidiert zu werden, und ist so somit nicht in der Lage, ein Elektron an die ETM abzugeben; d.h. dass keine Elektronenübertra gung erfolgt. Ist Ferrocen einmal oxidiert, dann ist ein Weg zur Elektronenübertragung geschaffen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Eingangselektronenquelle eingesetzt, die ein höheres Redox-Potential aufweist als die ETM der Markierungssonde. Luminol beispielsweise, eine Elektronenquelle, weist ein Redox-Potential von etwa 720 mV auf. Bei Spannungen über dem Redox-Potential der ETM, jedoch unter dem Redox-Potential der Elektronenquelle, d.h. von 200 bis 720 mV, wird das Ferrocen oxidiert und überträgt ein einzelnes Elektron über das leitfähige Oligomer zur Elektrode. Die ETM ist jedoch nicht in der Lage, jegliche Elektronen aus der Luminol-Elektronenquelle anzunehmen, da die Spannungen geringer sind als das Redox-Potential des Luminols. Bei oder über dem Redox-Potential von Luminol jedoch überträgt das Luminol dann der ETM ein Elektron und ermöglicht so rasche und wiederholte Elektronenübertragung. Auf diese Weise dient die Elektronenquelle (oder der Co-Reduktant) dazu, das im System erzeugte Signal zu verstärken, da die Elektronenquellenmoleküle rasch und wiederholt der ETM der Markierungssonde Elektronen übertragen.
  • Luminol hat den zusätzlichen Vorteil, dass es bei Oxidation zu einer chemilumineszierenden Spezies wird (siehe Jirka et al., Analytica Chimica Acta 284, 345 (1993)), wodurch Photo-Detektion der Elektronenübertragung von der ETM zur Elektrode möglich gemacht wird. Solange das Luminol nicht in der Lage ist, die Elektrode direkt zu kontaktieren, d.h. in Gegenwart der SAM, sodass es keinen wirksamen Elektronenübertragungsweg zur Elektrode gibt, kann Luminol nur mittels Übertragung eines Elektrons zur ETM an der Markierungssonde oxidiert werden. Ist die ETM jedoch nicht vorhanden, d.h. ist die Zielsequenz nicht an die Zusammensetzung der Erfindung hybridisiert, wird Luminol nicht signifikant oxidiert, wodurch es zu einer geringen Photonenemission kommt und so nur ein schwaches (wenn überhaupt ein) Signal vom Luminol ausgehend erzeugt wird. In Gegenwart des Targets wird ein viel stärkeres Signal erzeugt. Somit ist die Messung von Luminoloxidation durch Photonenemission eine indirekte Messung der Fähigkeit der ETM, Elektronen an die Elek trode abzugeben. Darüber hinaus kann die Empfindlichkeit des Systems gesteigert werden, da Photonendetektion im Allgemeinen empfindlicher als elektronische Detektion ist. Anfängliche Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Lumineszenz von der Wasserstoffperoxidkonzentration, dem pH und der Luminolkonzentration abhängen kann, wobei Letztere nicht linear zu sein scheint.
  • Geeignete Elektronenquellenmoleküle sind auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt und umfassen Ferricyanid und Luminol, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Alternativ dazu könnten Ausgangselektronenempfänger oder -senken eingesetzt werden, d.h. die obigen Reaktionen könnten auch in umgekehrter Richtung erfolgen, wobei die ETM wie ein Metallocen ein Elektron von der Elektrode empfängt, wodurch es zu Metallicenium umgesetzt wird, wobei der Ausgangselektronenempfänger anschließend das Elektron rasch und wiederholt aufnehmen würde. In dieser Ausführungsform ist Cobalticenium als ETM bevorzugt.
  • Die Gegenwart der ETM an der Oberfläche der Monoschicht kann auf verschiedene Arten nachgewiesen werden. Zahlreiche verschiedene Detektionsverfahren können eingesetzt werden, umfassend, jedoch nicht darauf beschränkt, optische Detektion (als ein Ergebnis von spektralen Veränderungen bei Änderungen der Redox-Zustände), die Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Lumineszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz und Brechungsindex umfasst; und elektronische Detektion, umfassend, jedoch nicht darauf beschränkt, Amperometrie, Voltammetrie, Kapazitanz und Impedanz. Diese Verfahren umfassen Zeit- oder Frequenz-abhängige Verfahren, die auf Grundlage von Gleich- oder Wechselstrom arbeiten, gepulste Verfahren, Lock-in-Verfahren, Filtern (Hochpass, Tiefpass, Bandpass) und zeitaufgelöste Verfahren, umfassend zeitaufgelöste Fluoreszenz.
  • In einer Ausführungsform resultiert die wirksame Übertragung von Elektronen von der ETM zur Elektrode in stereotypen Veränderungen des Redox-Zustandes der ETM. Bei zahlreichen ETM, die die Ruthenium-Komplexe, die Bipyridin-, Pyridin- und Imidazolringe enthalten, einschließen, sind diese Veränderungen des Redox-Zustands mit Veränderungen der spektralen Eigenschaften verbunden. Es können signifikante Unterschiede hinsichtlich der Absorption zwischen reduzierten und oxidierten Zuständen dieser Moleküle beobachtet werden. Siehe beispielsweise Fabbrizzi et al., Chem. Soc. Rev., 197–202 (1995). Diese Unterschiede können unter Einsatz eines Spektralphotometers oder eines einfachen Photoelektronenvervielfachers beobachtet werden.
  • In dieser Ausführungsform umfassen mögliche Elektronendonoren oder -akzeptoren alle zuvor aufgelisteten Derivate zur Photoaktivierung oder -initüerung. Bevorzugte Elektronendonoren oder -akzeptoren weisen charakteristisch große spektrale Veränderung bei Oxidation und Reduktion auf, was in einer hochempfindlichen Überwachung von Elektronenübertragung resultiert. Solche Beispiele umfassen Ru(NH3)4py und Ru(bpy)2 im als bevorzugte Beispiele. Es sollte beachtet werden, dass nur der Donor oder Akzeptor, der durch Absorption beobachtet wird, ideale spektrale Eigenschaften aufzuweisen hat.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Elektronenübertragung fluorimetrisch nachgewiesen. Zahlreiche Übergangsmetallkomplexe, umfassend jene von Ruthenium, weisen ganz bestimmte Fluoreszenz-Eigenschaften auf. Daher kann die Veränderung des Redox-Zustandes der Elektronendonoren und Elektronenakueptoren, die an die Nucleinsäure gebunden sind, mittels Fluoreszenz sehr genau beobachtet werden, beispielsweise bei Ru(4,7-biphenyl2-phenanthrolin)3 2+. Die Herstellung dieser Verbindung kann unter Einsatz von herkömmlichen Fluoreszenztest-Verfahren leicht gemessen werden. Beispielsweise kann Laser-induzierte Fluoreszenz in einem herkömmlichen Einzell-Fluorimeter, einem Durchfluss-„Direkt"-Fluorimeter (wie jene, die an ein Chromatographie-System gebunden sind) oder einem Mehrproben-„Plattenleser", ähnlich jenen, die als 96-Well-Immuntests erhältlich sind, aufgezeichnet werden.
  • Alternativ dazu kann Fluoreszenz unter Einsatz von faseroptischen Sensoren mit Nucleinsäuresonden in Lösung oder an die Faseroptik gebunden gemessen werden. Fluoreszenz wird mittels einer Phototelektronenvervielfachers oder eines Lichtdetektionsinstruments, das an die Faseroptik gebunden ist, beobachtet. Der Vorteil dieses Systems sind die äußerst kleinen Volumina der Proben, die getestet werden können.
  • Weiters sind Scanning-Fluoreszenz-Detektoren wie der Fluorlmager, erhältlich bei Molecular Dynamics, ideal geeignet, um die Fluoreszenz modifizierter Nucleinsäuremoleküle, die an einer festen Oberfläche angeordnet sind, zu beobachten. Der Vorteil dieses Systems ist die große Anzahl der Elektronenübertragungssonden, die zugleich unter Einsatz von Chips, die mit Tausenden an einzelnen Nucleinsäuresonden bedeckt sind, gescannt werden können.
  • Viele Übergangsmetallkomplexe weisen Fluoreszenz mit großen Stokes-Verschiebungen auf. Geeignete Beispiele umfassen Bis- und Trisphenanthrolin-Komplexe und Bis- und Trisbipyridyl-Komplexe von Übergangsmetallen wie Ruthenium (siehe Juris, A., Balzani, V., et al., Coord. Chem. Rev. 84, 85–277 (1988)). Bevorzugte Beispiele weisen wirksame Fluoreszenz (ausreichend hohe Quantenausbeute) sowie geringe Reorganisationsenergie auf. Diese umfassen Ru(4,7-biphenyl2-phenanthrolin)3 2+, Ru(4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin)3 2+ und Platinkomplexe (siehe Cummings et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 1.949–1.960 (1996). Alternativ dazu kann eine Reduktion der Fluoreszenz in Verbindung mit Hybridisierung unter Einsatz dieser Systeme gemessen werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird Elektrochemilumineszenz als Grundlage für die Elektronentransferdetektion eingesetzt. Bei manchen ETM wie Ru2+(bpy)3 geht direkte Lumineszenz mit dem Verfall des angeregten Zustandes einher. Veränderungen dieser Eigenschaft sind mit Nucleinsäurehybridisierung verbunden und können mit einer einfachen Photoelektronenvervielfachervorrichtung beobachtet werden (siehe Blackburn, G. F., Clin. Chem. 37, 1.534–1.539 (1991); und Juris et al. (s.o.)).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird elektronische Detektion eingesetzt, umfassend Amperometrie, Voltammetrie, Kapazitanz und Impedanz. Geeignete Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Elektrogravimetrie; Coulometrie (umfassend Coulometrie mit gesteuertem Potential und Coulometrie mit konstantem Strom); Voltametrie (zyklische Voltametrie, Impuls-Voltametrie (normale Impuls-Voltametrie, Rechteckwellen-Voltametrie, Differenzpuls-Voltametrie, Osteryoung-Rechteckwellen-Voltametrie und coulostatische Impulsverfahren)); Strippinganalyse (anodische Strippinganalyse, kathodische Strippinganalyse, Rechteckwellen-Stripping-Voltammetrie); Leitfähigkeitsmessungen (elektrolytische Leitfähigkeit, direkte Analyse); zeitabhängige elektrochemische Analysen (Chronoamperometrie, Chronopotentiometrie, zyklische Chronopotentiometrie und -amperometrie, Wechselstrom-Polographie, Chronogalvametrie und Chronocoulometrie); Wechselstrom-Impedanz-Messung; Kapazitanz-Messung; Wechselstrom-Voltametrie; und Photoelektrochemie.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Beobachten der Elektronenübertragung über amperometrische Detektion. Dieses Detektionsverfahren umfasst das Anlegen einer Spannung (im Vergleich zu einer getrennten Bezugselektrode) zwischen der Nucleinsäure-verbundenen Elektrode und einer Bezugs- (Gegen-) Elektrode in der Probe, die die relevanten Zielgene enthält. Elektronenübertragung unterschiedlicher Wirksamkeit wird in Proben in Gegenwart oder Abwesenheit von Zielnucleinsäure induziert; das bedeutet, dass die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielnucleinsäure, und so auch der Markierungsonde, zu unterschiedlichen Stromflüssen führen kann.
  • Die Vorrichtung zur amperometrischen Messung von Elektronenübertragung umfasst empfindliche Stromdetektion und umfasst auch ein Mittel zur Steuerung der Spannung, üblicherweise einen Potentiostat. Diese Spannung wird hinsichtlich des Potentials des Elektronen abgebenden Komplexes an der Markierungsonde optimiert. Mögliche Elektronen abgebende Komplexe umfassen die zuvor genannten, wobei Komplexe von Eisen, Osmium, Platin, Cobalt, Rhenium und Ruthenium bevorzugt sind und Eisen-Komplexe besonders bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden unterschiedliche Elektronendetektionsmodi eingesetzt. Beispielsweise umfassen potentiometrische (oder voltammetrische) Messungen nichtfaradaysche (kein Netto-Stromfluss) Verfahren und werden üblicherweise in pH- oder anderen Ionendetektoren eingesetzt. Ähnliche Sensoren werden eingesetzt, um den Elektronentransfer zwischen der ETM und der Elektrode zu beobachten. Weiters könnten andere Eigenschaften von Isolatoren (wie Widerstand) und von Leitern (wie Leitfähigkeit, Impedanz und Kapazitanz) eingesetzt werden, um die Elektronenübertragung zwischen der ETM und der Elektrode zu beobachten. Schließlich erzeugt jedes beliebige System, das Strom erzeugt (wie Elektronenübertragung), auch ein schwaches magnetisches Feld, das in manchen Ausführungsformen beobachtet werden kann.
  • Es gilt anzumerken, dass ein Vorteil der hohen Elektronenübertragungsgeschwindigkeit, die in den Zusammensetzungen der Erfindung beobachtet werden, ist, dass die Zeitauflösung die Signal/Rausch-Ergebnisse der Monitore, die auf Absorption, Fluoreszenz und elektronischem Strom basieren, erheblich verbessern kann. Die hohen Elektronenübertragungsgeschwindigkeiten der vorliegenden Erfindung resultieren in starken Signalen und stereotypen Verzögerungen zwischen Beginn und Ende der Elektronenübertragung – durch Verstärken der Signale bestimmter Verzögerungen, wie beispielsweise durch den Einsatz von gepulster Auslösung von Elektronenübertragung und „Lock-in"-Detektionsverstärkern, und Fouriertransformierte.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird Elektronenübertragung unter Einsatz von Wechselstrom-Verfahren eingeleitet. Ohne durch eine Theorie gebunden zu sein, scheinen ETM, die an eine Elektrode gebunden sind, im Allgemeinen ähnlich auf eine Wechselstromspannung über einen Stromkreis, der Widerstände und Kondensatoren umfasst, zu reagieren. Prinzipiell können jegliche Verfahren, die die Bestim mung der Beschaffenheit dieser Komplexe ermöglichen, die als ein Widerstand oder Kondensator agieren, als Grundlage zur Detektion eingesetzt werden. Erstaunlicherweise gibt die herkömmliche elektrochemische Theorie, wie sie in Laviron et al, J. Electroanal. Chem. 97, 135 (1979), und Laviron et al., J. Electroanal. Chem. 105, 35 (1979), dargestellt wird, nicht genau die hierin beschriebenen Systeme wieder, außer bei sehr geringen EAC (weniger als 10 mV) und relativ großen Molekülmengen. Das bedeutet, dass der Wechselstrom (I) durch Lavirons Gleichung nicht exakt beschrieben wird. Dies kann teilweise auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass diese Theorie von einer uneingeschränkten Elektronenquelle und -senke ausgeht, was in den vorliegenden Systemen nicht der Fall ist.
  • Die Wechselstrom-Voltametrie-Theorie, die diese Systeme gut wiedergibt, ist in O'Connor et al., J. Electroanal. Chem. 466(2), 197–202 (1999), gut erläutert, das hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen ist. Die Gleichung, die diese Systeme vorhersagt, wird als folgende Gleichung 1 dargestellt:
  • Gleichung 1
    Figure 01650001
  • In Gleichung 1 ist n die Anzahl der pro Redox-Molekül oxidierten oder reduzierten Elektronen, f ist die angelegte Frequenz, F ist die Faradaysche Konstante, Ntotal ist die Gesamtanzahl der Redox-Moleküle, E0 ist die formale Potential der Redox-Moleküle, R ist die Gaskonstante, T ist die Temperatur in Kelvin, und EDC ist die Elektrodenspannung. Das Modell passt sehr gut zu den experimentellen Daten. In manchen Fällen ist der Strom geringer als vorhergesagt, wobei jedoch gezeigt wurde, dass dies durch den Abbau von Ferrocen verursacht wird, dem durch zahlreiche Mittel Abhilfe geschaffen werden kann.
  • Weiters kann der Faradaysche Strom auch als eine Funktion der Zeit ausgedrückt werden, wie in Gleichung 2 gezeigt wird: Gleichung 2
    Figure 01660001
    IF ist der Faradaysche Strom und qe ist die Elementarladung.
  • Gleichung 1 umfasst jedoch weder die Wirkung der Elektronenübertragungsgeschwindigkeit noch die Wirkung der Instrumentenfaktoren. Elektronenübertragungsgeschwindigkeit ist wichtig, wenn die Geschwindigkeit nahe bei oder unter der angelegten Frequenz liegt. So sollte der tatsächliche iAC eine Funktion aller drei sein, wie in Gleichung 3 dargestellt ist:
  • Gleichung 3 iAC = f(Nernst-Faktoren)f(kET)f(Instrumentenfaktoren)
  • Diese Gleichungen können eingesetzt werden, um die erwarteten Wechselstromflüsse in Systemen zu modellieren und vorherzusagen, die Eingangssignale verwenden, welche Gleichstrom- und Wechselstromkomponenten umfassen. Wie zuvor erläutert gibt die herkömmliche Theorie erstaunlicherweise dieses Systeme, außer im Falle von sehr geringen Spannung, absolut nicht wieder.
  • Im Allgemeinen weisen nicht spezifisch gebundene Markierungsonden/ETM Unterschiede hinsichtlich der Impedanz (d.h. höhere Impedanzen) auf als wenn die Markierungsonden, die die ETM enthalten, spezifisch in korrekter Ausrichtung gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die nicht spezifisch gebundenen Materialien weggewaschen, was zu einer effektiven Impedanz von unendlich führt.
  • So weist Wechselstrom-Detektion mehrere Vorteile auf, wie im Allgemeinen nachstehend erläutert wird, umfassend eine Steigerung der Empfindlichkeit und die Fähigkeit, Hintergrundgeräusche „herauszufiltern". Insbesondere können Veränderungen der Impedanz (umfassend beispielsweise Gesamtimpedanz) zwischen nicht spezifischer Bindung von ETM-enthaltenden Sonden und zielspezifischer Testkomplexbildung beobachtet werden.
  • Demgemäß verändert sich, wenn Wechselstrominitiierung und -Detektionsverfahren eingesetzt werden, die Frequenzreaktion durch die Gegenwart von ETM. Unter „Frequenzreaktion" wird hierin eine Veränderung der Signale als ein Ergebnis der Elektronenübertragung zwischen der Elektrode und der ETM verstanden. Diese Veränderung variiert je nach Signalfrequenz. Eine Frequenzreaktion umfasst Wechselstromflüsse bei einer oder mehreren Frequenzen, Phasenverschiebungen, Gleichstromoffsetspannungen, Faradaysche Impedanz usw.
  • Nachdem der Testkomplex, umfassend die Zielsequenz und die Markierungsonde, erzeugt wurde, wird ein erstes elektrisches Eingangssignal an das System angelegt, vorzugsweise über zumindest die Probenelektrode (die die Komplexe der Erfindung enthält) und die Gegenelektrode, um Elektronenübertragung zwischen der Elektrode und der ETM einzuleiten. Drei-Elektrodensysteme können ebenfalls eingesetzt werden, wobei die Spannung an der Bezugs- und Arbeitselektrode angelegt wird. Das erste Eingangssignal umfasst zumindest eine Wechselstromkomponente. Die Wechselstromkomponente kann variable Amplituden und Frequenzen aufweisen. Im Allgemeinen liegt die Wechselstromamplitude für den Einsatz in den vorliegenden Verfahren im Bereich von etwa 1 mV bis etwa 1,1 V, wobei ein Bereich von etwa 10 mV bis etwa 800 mV bevorzugt ist, und ein Bereich von etwa 10 mV bis etwa 500 mV besonders bevorzugt ist. Die Wechselstromfrequenz liegt im Bereich von etwa 0,01 Hz bis etwa 100 MHz, wobei ein Bereich von etwa 10 Hz bis etwa 10 MHz bevorzugt ist, und ein Bereich von etwa 100 Hz bis etwa 20 MHz besonders bevorzugt ist.
  • Der Einsatz einer Kombination von Gleichstrom- und Wechselstromsignalen birgt eine Vielzahl von Vorteilen, umfassend erstaunliche Empfindlichkeit und Signalmaximierung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erste Eingangssignal eine Gleichstromkomponente und eine Wechselstromkomponente. Das bedeutet, dass eine Gleichstromoffsetspannung zwischen der Probe und der Gegenelektrode durch das elektrochemische Potential der ETM läuft (wird beispielsweise Ferrocen eingesetzt, liegt die Durchlaufspannung im Bereich von 0 bis 500 mV) (oder alternativ dazu wird die Arbeitselektrode geerdet, und die Bezugselektrode wird mit einer Spannung von 0 bis –500 mV durchlaufen). Die Durchlaufspannung wird eingesetzt, um die Gleichstromspannung zu identifizieren, bei der die Maximalreaktion des Systems festgestellt werden kann. Dies liegt im Allgemeinen bei oder etwa bei dem elektrochemischen Potential der ETM. Ist diese Spannung einmal bestimmt, so kann eine Durchlaufspannung oder eine oder mehrere gleichförmige Gleichstromoffsetspannung(en) eingesetzt werden. Gleichstromoffsetspannungen im Bereich von etwa –1 V bis etwa +1,1 V sind bevorzugt, wobei etwa –500 mV bis etwa +800 mV besonders bevorzugt sind, und etwa –300 mV bis etwa 500 mV am meisten bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gleichstromoffsetspannung nicht null. Über der Gleichstromoffsetspannung wird eine Wechselstromsignalkomponente mit variabler Amplitude und Frequenz angelegt. Ist die ETM vorhanden und kann sie auf die Wechselstromstörung reagieren, so wird aufgrund der Elektronenübertragung zwischen der Elektrode und der ETM Wechselstrom erzeugt.
  • In definierten Systemen kann es ausreichend sein, ein einziges Eingangssignal anzulegen, um zwischen Gegenwart oder Abwesenheit der ETM-Nucleinsäure (d.h. der Gegenwart der Zielsequenz) zu differenzieren. Alternativ dazu wird eine Vielzahl an Eingangssignalen angelegt. Wie hierin erläutert kann dies verschiedene Formen annehmen, umfassend den Einsatz vielfacher Frequenzen, vielfacher Gleichstromoffsetspannungen oder vielfacher Wechselstromamplituden oder einer Kombination aus all diesen.
  • So werden in einer bevorzugten Ausführungsform vielfache Gleichstromoffsetspannungen eingesetzt, obwohl, wie zuvor erläutert, Gleichstromdurchlaufspannungen bevorzugt werden. Dies kann bei einer einzigen Frequenz oder bei zwei oder mehr Frequenzen erfolgen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Wechselstromamplitude variiert. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, scheint es, dass das Anheben der Amplitude zu einer Steigerung der Triebkraft führt. So ergeben höhere Amplituden, die zu höheren Überspannungen führen, größere Elektronenübertragungsgeschwindigkeiten. So ergibt im Allgemeinen dasselbe System durch den Einsatz höherer Überspannungen bei dieser Frequenz eine verbesserte Reaktion (d.h. höhere Ausgangssignale) bei jeder einzelnen Frequenz. So kann die Amplitude bei hohen Frequenzen gesteigert werden, um die Geschwindigkeit der Elektronenübertragung durch das System zu erhöhen, was zu größerer Empfindlichkeit führt. Weiters kann dies beispielsweise eingesetzt werden, um Reaktionen in langsameren Systemen, wie jenen, die keine optimale Abstandsanordnung aufweisen, auszulösen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Messungen am System bei zumindest zwei getrennten Amplituden oder Überspannungen vorgenommen, wobei Messungen bei vielen verschiedenen Amplituden bevorzugt sind. Wie zuvor angemerkt können Veränderungen als Ergebnis von Veränderungen der Amplitude die Grundlage zu Identifikation, Kalibrierung und Quantifizierung des Systems bilden. Weiters können auch eine oder mehrere Wechselstromfrequenzen eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Wechselstromfrequenz variiert. Bei unterschiedlichen Frequenzen reagieren unterschiedliche Moleküle auf unterschiedliche Arten. Fachleuten wird bekannt sein, dass das Erhöhen der Frequenz im Allgemeinen auch den Ausgangsstrom erhöht. Ist die Frequenz jedoch höher als die Geschwindigkeit, mit der sich Elektronen zwischen der Elektrode und der ETM bewegen können, so führen höhere Frequenzen zu einem Verlust oder einem Rück gang des Ausgangssignals. An einem gewissen Punkt ist die Frequenz höher als die Geschwindigkeit der Elektronenübertragung zwischen der ETM und der Elektrode, und das Ausgangssignal wird dann ebenfalls abnehmen.
  • In einer Ausführungsform wird zur Detektion eine einzelne Messung des Ausgangssignals bei einer einzelnen Frequenz durchgeführt. Das bedeutet, dass die Frequenzreaktion des Systems in Abwesenheit der Zielsequenz und somit in Abwesenheit der die ETM enthaltenden Markierungsonde im Vorhinein als sehr gering bei einer bestimmten hohen Frequenz bestimmt werden kann. Unter Einbeziehung dieser Information zeigt jede Reaktion bei einer bestimmten Frequenz die Gegenwart des Testkomplexes. Das bedeutet, dass jede Reaktion bei einer bestimmten Frequenz für den Testkomplex charakteristisch ist. So ist es nur mehr notwendig, eine einzelne hohe Eingangsfrequenz einzusetzen, und jegliche Veränderungen der Frequenzreaktion ist ein Hinweis, dass die ETM und somit auch die Zielsequenz vorhanden ist.
  • Weiters ermöglicht der Einsatz von Wechselstromverfahren eine signifikante Reduktion der Hintergrundsignale bei jeder einzelnen Frequenz, die durch andere Einheiten als die ETM erzeugt werden, d.h. es erlaubt „Blockieren" oder „Filtern" von unerwünschten Signalen. Das bedeutet, dass die Frequenzreaktion eines Ladungsträgers oder Redox-aktiven Moleküls in Lösung durch seinen Diffusionskoeffizienten und Ladungsübertragungskoeffizienten beschränkt ist. Demgemäß kann bei hohen Frequenzen ein Ladungsträger nicht rasch genug diffundieren, um seine Ladung auf die Elektrode zu übertragen, und/oder die Ladungsübertragungskinetik kann nicht schnell genug sein. Dies ist besonders bedeutend in Ausführungsformen, die keine gute Monoschichten aufweisen, d.h. die teilweise vorhandene oder unzureichende Monoschichten aufweisen, d.h. wo das Lösungsmittel zu den Elektroden durchdringen kann. Wie zuvor erläutert kann bei Gleichstromverfahren die Gegenwart von „Löchern", an denen die Elektrode dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, dazu führen, dass Lösungsladungsträger das System „kurzschließen", d.h. dass sie die Elektrode erreichen und Hintergrundsignale erzeugen. Unter Einsatz der vorliegenden Wechselstromverfahren jedoch kann eine oder können mehrere Frequenzen ausgewählt werden, die eine Frequenzreaktion einer oder mehrerer Ladungsträger in Lösung unterbinden, unabhängig davon, ob eine Monoschicht vorhanden ist oder nicht. Dies ist besonders bedeutend, da zahlreiche biologische Fluide wie Blut signifikante Mengen an Redox-aktiven Molekülen enthalten, die amperometrische Detektionsverfahren beeinträchtigen können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Messungen am System bei zumindest zwei getrennten Frequenzen vorgenommen, wobei Messungen bei zahlreichen Frequenzen bevorzugt sind. Zahlreiche Frequenzen umfassen eine Scan. Beispielsweise zeigt das Messen des Ausgangssignals, z.B. des Wechselstroms bei einer geringen Eingangsfrequenz wie 1–20 Hz, und der Vergleich der Reaktion auf das Ausgangssignal bei hoher Frequenz wie 10–100 kHz einen Frequenzreaktionsunterschied bei Gegenwart oder Abwesenheit der ETM. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Frequenzreaktion bei zumindest zwei, vorzugsweise bei zumindest fünf, und noch bevorzugter bei zumindest zehn, Frequenzen bestimmt.
  • Nach Übertragung des Eingangssignals, um Elektronenübertragung auszulösen, wird ein Ausgangssignal empfangen oder detektiert. Die Gegenwart und Größe des Ausgangssignals hängt von zahlreichen Faktoren ab, umfassend die Überspannung/Amplitude des Eingangssignals; die Frequenz des Eingang-Wechselstromsignals; die Zusammensetzung des dazwischen liegenden Mediums; die Gleichstromoffsetspannung; die Umgebung des Systems; die Beschaffenheit der ETM; das Lösungsmittel; und Typ und Konzentration des Salzes. Bei einem bestimmten Eingangssignal hängen die Gegenwart und Größe des Ausgangsignals im Allgemeinen von der Gegenwart oder Abwesenheit der ETM, der Anordnung und Distanz der ETM von der Oberfläche der Monoschicht und der Eigenschaft des Eingangssignals ab. In manchen Ausführungsformen kann es möglich sein, zwischen nicht spezifischen Bindungen der Markierungsonde und der Bildung von zielspezifischen Testkomplexen, die die Markierungsonde enthalten, auf Grundlage der Impedanz zu unterscheiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Ausgangssignal einen Wechselstrom. Wie zuvor erläutert hängen die Größe des Ausgangstroms von zahlreichen Parametern ab. Durch Verändern dieser Parameter kann das System auf zahlreiche verschiedene Arten optimiert werden.
  • Im Allgemeinen liegt der in dieser Erfindung erzeugte Wechselstrom im Bereich von etwa 1 Femtoampere bis etwa 1 Milliampere, wobei Stromstärken von etwa 50 Femtoampere bis etwa 100 Mikroampere bevorzugt sind, und etwa 1 Picoampere bis etwa 1 Mikroampere besonders bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ausgangssignal in der Wechselstromkomponente relativ zum Eingangssignal phasenverschoben. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, scheint es, dass die Systeme der vorliegenden Erfindung ausreichend gleichförmig sein können, um auf Phasenverschiebung basierende Detektion zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass die komplexen Biomoleküle der Erfindung, durch die Elektronenübertragung erfolgt, auf den Wechselstromeingang auf homogene Weise reagieren, ähnlich den Standard-Elektronikkomponenten, sodass eine Phasenverschiebung bestimmt werden kann. Dies kann als Basis zur Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit der ETM und/oder zur Detektion von Unterschieden zwischen der Gegenwart zielspezifischer Testkomplexe, umfassend Markierungsonden, und nicht spezifischer Bindung der Markierungsonden an die Systemkomponenten dienen.
  • Das Ausgangssignal ist charakteristisch für die Gegenwart der ETM; das bedeutet, dass das Ausgangssignal charakteristisch für die Gegenwart des zielspezifischen Testkomplexes, umfassend Markierungsonden und ETM, ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Grundlage der Detektion ein Unterschied hinsichtlich der Faradayschen Impedanz des Systems als Ergebnis der Bildung des Testkomplexes. Faradaysche Impedanz ist die Impedanz des Systems zwischen der Elektrode und der ETM. Faradaysche Impedanz unterscheidet sich von der Gesamt- oder dielektrischen Impedanz sehr stark, die die Impedanz der Gesamtlösung zwischen den Elektroden ist. Zahlreiche Faktoren können die Faradaysche Impedanz verändern, die die Gesamtimpedanz nicht beeinflussen können, und umgekehrt. So weisen die die Nucleinsäuren umfassenden Testkomplexe in diesem System eine bestimmte Faradaysche Impedanz auf, die u.a. vom Abstand zwischen der ETM und der Elektrode, deren elektronischen Eigenschaften und der Zusammensetzung des dazwischen liegenden Mediums abhängt. Wichtig bei den Verfahren der Erfindung ist, dass die Faradaysche Impedanz zwischen der ETM und der Elektrode signifikant unterschiedlich ist, abhängig davon, ob die die ETM enthaltenden Markierungsonden spezifisch oder nicht spezifisch an die Elektrode gebunden sind.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung weiters Vorrichtungen oder Geräte zur Detektion von Analyten unter Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung bereit. Die Vorrichtungen umfassen eine Testkammer zur Aufnahme einer Probenlösung, die zumindest eine erste Mess- oder Probenelektrode und eine zweite Mess- oder Gegenelektrode aufweist. Drei-Elektroden-Systeme sind auch nützlich. Die erste und die zweite Messelektrode stehen mit einer die Testprobe aufnehmenden Region in Kontakt, sodass in Gegenwart einer flüssigen Testprobe die zwei Elektrophoreseelektroden in elektrischem Kontakt stehen können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung außerdem Detektionselektroden, umfassend Einzelstrang-Nucleinsäuren-Einfangsonden, die kovalent über einen Bindungslinker gebunden sind, und eine Monoschicht, die leitfähige Oligomere umfasst, wie sie hierin beschrieben sind.
  • Die Vorrichtung umfasst weiters eine Wechselstromspannungsquelle, die elektrisch mit der Testkammer, das bedeutet, mit den Messelektroden, verbunden ist. Vorzugsweise ist die Wechselstromspannungsquelle in der Lage, ebenfalls Gleichstromoffsetspannung zu liefern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung weiters einen Prozessor, der in der Lage ist, das Eingangssignal und das Ausgangssignal zu verglei chen. Der Prozessor ist mit den Elektroden verbunden und so konfiguriert, dass er ein Ausgangssignal erhält und so die Gegenwart der Zielnucleinsäure nachweist.
  • Somit können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in zahlreichen Bereichen der Forschung, der Medizin, der Qualitätskontrolle oder in Feldversuchsanordnungen eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden zur genetischen Diagnose eingesetzt. Sonden können beispielsweise unter Einsatz der hierin offenbarten Verfahren erzeugt werden, um Zielsequenzen, wie z.B. das Gen von nicht-polypösem Kolonkarzinom, das BRCA1-Brustkarzinom-Gen, P53, das ein Gen ist, das mit zahlreichen Krebsarten in Verbindung gebracht wird, das Apo-E4-Gen, das ein größeres Risiko, an der Alzheimerkrankheit zu erkranken, angibt, was leichte präsymptomatische Untersuchungen von Patienten ermöglicht, Mutationen im Gen für Mukoviszidose oder jegliche andere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, nachzuweisen.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform erfolgt virale und bakterielle Detektion durch Einsatz der Komplexe der Erfindung. In dieser Ausführungsform sind Sonden dafür bestimmt, Zielsequenzen aus einer Vielzahl von Bakterien und Viren nachzuweisen. Beispielsweise beruhen geläufige Blutuntersuchungsverfahren auf der Detektion von Anti-HIV-Antikörpern. Die hierin offenbarten Verfahren ermöglichen direktes Screenen von klinischen Proben, um HIV-Nucleinsäuresequenzen, insbesondere hoch konservierte HIV-Sequenzen, nachzuweisen. Darüber hinaus ermöglichen sie auch direktes Beobachten von zirkulierenden Viren in einem Patienten als verbessertes Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit von anti-viralen Therapien. Dem ähnlich können Viren, die mit Leukämie, HTLV-I und HTLV-II zusammenhängen, auf diese Weise detektiert werden. Bakterielle Infektionen wie Tuberkulose, Chlamydien und andere Geschlechtskrankheiten können auch nachgewiesen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform finden die Nucleinsäuren der Erfindung Einsatz als Sonden für toxische Bakterien beim Screenen von Wasser- und Lebensmittelproben. Beispielsweise können Proben behandelt werden, um die Bakterien so zu lysieren, dass sie ihre Nucleinsäure freigeben, und dann Sonden, die dafür bestimmt sind, bakterielle Stämme zu erkennen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, pathogene Stämme wie z.B. Salmonella, Campylobacter, Vibrio chloerae, Leishmania, enterotoxische Stämme von E. coli und Bakterien der Legionärskrankheit. Dem ähnlich können Verfahren zur biologischen Sanierung unter Einsatz der Zusammensetzungen der Erfindung bewertet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden für forensische „DNA-Fingerabdrücke" eingesetzt, um DNA vom Tatort mit Proben von Opfern und Verdächtigen zu vergleichen.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden in einer Testanordnung zum Sequenzieren durch Hybridisierung eingesetzt.
  • So sorgt die vorliegende Erfindung für äußerst spezifische und empfindliche Sonden, die in manchen Ausführungsformen Zielsequenzen nachweisen können, ohne dass die nicht hybridisierte Sonde entfernt werden muss. Dies ist in der Erzeugung von automatisierten Gensondentests nützlich.
  • Alternativ dazu sind die Zusammensetzungen der Erfindung nützlich, um erfolgreiche Genamplifikation in PCR nachzuweisen, was ermöglicht, dass erfolgreiche PCR-Reaktionen als Beweis für die Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielsequenz dienen. PCR kann so auf verschiedene Arten eingesetzt werden. Beispielsweise erfolgt in einer Ausführungsform die PCR-Reaktion wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, und anschließend wird sie einer Zusammensetzung der Erfindung zugesetzt, die die Zielnucleinsäure mit einer ETM umfasst und kovalent an eine Elektrode über ein leitfähiges Oligomer gebunden ist, worauf die Detektion der Zielsequenz folgt. Alternativ dazu erfolgt PCR unter Einsatz von Nucleotiden, die mit einer ETM markiert sind, entweder in Gegenwart von oder mit nachfolgendem Zusetzen zu einer Elektrode mit einem leitfähigen Oligomer und einer Zielnucleinsäure. Das Binden des ETM enthaltenden PCR-Produkts an die Elektrodenzusammensetzung ermöglicht eine Detektion mittels Elektronenübertragung. Schließlich kann die über ein leitfähiges Polymer an die Elektrode gebundene Nucleinsäure ein PCR-Primer sein, wobei ein zweiter Primer, der mit einer ETM markiert ist, zugesetzt wird. Verlängerung führt zu einer doppelsträngigen Nucleinsäure mit einer kovalent gebundenen ETM und Elektrode. Auf diese Weise wird die vorliegende Erfindung für PCR-Detektion von Zielsequenzen eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Anordnungen zur mRNA-Detektion eingesetzt. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet entweder Einfangsonden oder Einfangerweiterungssonden, die dicht an dem 3'-Polyadenylierungs-Schwanz der mRNA hybridisieren. Dies ermöglicht den Einsatz einer Spezies von Zielbindungssonden zur Detektion, d.h. die Sonde enthält einen poly-T-Abschnitt, der an den poly-A-Schwanz des mRNA-Targets bindet. Im Allgemeinen enthält die Sonde einen zweiten Abschnitt, vorzugsweise einen nicht-poly-T-Abschnitt, der sich an die Detektionssonde (oder eine andere Sonde) bindet. Dies ermöglicht die Erzeugung einer zielbindenden Sonde, wodurch die Anzahl der unterschiedlichen Sondensynthese, die durchgeführt wird, reduziert werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht der Einsatz von Restriktionsenzymen und Ligationsverfahren die Schaffung von „universellen" Testanordnungen. In dieser Ausführungsform sind Monoschichten, die Einfangsonden umfassen, die Restriktionsendonuclease-Enden umfassen, wie im Allgemeinen in 6 dargestellt ist. Durch den Einsatz von komplementären Nucleinsäure-Abschnitten, während die „klebrigen Enden" zurückgelassen werden, wird eine Anordnung erzeugt, die jede beliebige Anzahl an Restriktionsnucleasestellen umfasst. Das Behandeln einer Zielprobe mit einer oder mehrerer dieser Restriktionsendonucleasen ermöglicht es, die Targets an die Anordnung zu binden. Dies kann durchgeführt werden, ohne die Sequenz des Targets zu kennen. Die Zielsequenzen können, sofern erwünscht, mittels Standardverfahren wie mittels Ligasen verbunden werden, und die Zielsequenz kann entweder mittels Standardmarkierungen oder mittels der Verfahren der Erfindung detektiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die zu einer empfindlichen Detektion von Nucleinsäuren führen können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden weniger als etwa 10 × 106 Moleküle nachgeweisen, wobei weniger als etwa 10 × 105 bevorzugt sind, weniger als etwa 10 × 104 besonders bevorzugt sind, weniger als etwa 10 × 103 besonders noch bevorzugter sind, und weniger als etwa 10 × 102 am meisten bevorzugt sind. Fachleuten wird bekannt sein, dass hierbei von einer 1:1-Korrelation zwischen Zielsequenzen und Reportermolekülen ausgegangen wird; werden mehr als ein Reportermolekül (d.h. Elektronenübertragungsgruppierung) pro Zielsequenz eingesetzt, so steigt die Empfindlichkeit.
  • Während die Detektionsgrenzen zur Zeit bewertet werden, basierend auf den veröffentlichten Elektronenübertragungsgeschwindigkeiten durch DNA, die etwa bei 1 × 106 Elektronen/s/Doppelstrang für eine 8-Basenpaar-Trennung liegt (siehe Meade et al., Angw. Chem. Eng. Ed. 34, 352 (1995)), und hohen Triebkräften, sollten Wechselstromfrequenzen von etwa 100 kHz möglich sein. Wie erste Resultate zeigen, ist Elektronenübertragung über diese Systeme sehr effizient, mit einem Ergebnis von beinahe 100 × 103 Elektronen/s, was bei sehr wenigen Molekülen zu einer möglichen Femtoampere-Empfindlichkeit führt.
  • Alle hierin zitierten Verweise sind hierin durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Allgemeine Verfahren zur Herstellung von Substraten und Monoschichten
  • SAM-Bildung auf Substraten – Allgemeines Verfahren
  • Die sich selbst organisierenden Monoschichten werden auf einer sauberen Goldoberfläche gebildet. Die Goldoberfläche kann mittels zahlreicher verschiedener Verfahren hergestellt werden: geschmolzener oder polierter Golddraht, aufgestäubtes oder aufgedampftes Gold auf Glas- oder Glimmer- oder Siliciumscheibchen oder auf ein anderes Substrat, galvanisiertes oder stromlos plattiertes Gold auf einem Leiterplattenmaterial oder Glas oder Silicium oder einem anderen Substrat. Sowohl die unter Vakuum abgeschiedenen Goldproben (aufgedampft und aufgestäubt) und die Lösungs-abgeschiedenen Goldproben (stromlos plattiert und galvanisiert) erfordern oft den Einsatz einer Haftschicht zwischen dem Substrat und dem Gold, um gute mechanische Stabilität sicherzustellen. Chrom, Titan, Titan/Wolfram oder Tantal werden häufig mit aufgestäubtem oder aufgedampftem Gold eingesetzt. Galvanisiertes Nickel wird häufig gemeinsam mit galvanisiertem und stromlos plattiertem Gold eingesetzt, wobei andere Haftmaterialien auch eingesetzt werden können.
  • Das Goldsubstrat wird vor der Monoschichtenbildung gereinigt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Verfahren wurden eingesetzt. Reinigen mit einer chemischen Lösung ist die häufigste Variante. Piranha-Lösung (Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure) oder Königswasser-Reinigung (Salzsäure/Salpetersäure) sind am häufigsten, wobei elektrochemische Verfahren, Flammbehandlung und Plasmaverfahren auch eingesetzt wurden.
  • Nach dem Säubern wird das Goldsubstrat in einer Abscheidungslösung inkubiert. Die Abscheidungslösung besteht aus einem Gemisch aus verschiedenen Thiolen in einem Lösungsmittel. Ein Gemisch aus Alkanthiolen in einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol wird am häufigsten eingesetzt, wobei zahlreiche Varianten bereits entwickelt wurden. Alternative Verfahren umfassen Gasphasenabscheidung des Alkanthiols, Mikrokontaktdrucken, Abscheidung unter Einsatz von reinem Thiol, Abscheidung aus wässrigem Lösungsmittel und Zwei-Schritt-Verfahren, die entwic kelt wurden. Die Konzentration des Alkanthiols in der Abscheidungslösung liegt im Bereich molarer bis submikromolarer Konzentration, wobei eine Konzentration von 0,5 bis 2,0 millimolar am häufigsten eingesetzt wird. Das Goldsubstrat wird in Kontakt mit der Abscheidungslösung weniger als eine Sekunde bis Tage lang (dies hängt vom Verfahren ab) inkubiert/angeordnet. Die üblichste Inkubationszeit beläuft sich auf 1 h bis eine Nacht. Die Inkubation wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei Temperaturen von bis zu 50 °C jedoch üblich sind.
  • Gemischte Monoschichten, die DNA enthalten, werden üblicherweise in einem Zwei-Schritt-Verfahren hergestellt. Die thiolierte DNA wird während des ersten Abscheidungsschritts abgelagert, und die gemischte-Monoschicht-Bildung wird während des zweiten Schritts abgeschlossen, während dem eine zweite Thiollösung minus DNA zugesetzt wird. Der zweite Schritt umfasst häufig schwaches Erhitzen, um die Monoschicht-Reorganisation zu unterstützen.
  • Allgemeines Verfahren zur SAM-Bildung – Abscheidung aus der organischen Lösung
  • Eine saubere Goldoberfläche wurde in eine saubere Phiole gegeben. Eine DNA-Abscheidungslösung in organischem Lösungsmittel wurde hergestellt, in der die gesamte Thiolkonzentration zwischen 400 μM und 1,0 mM liegt. Die Abscheidungslösung enthielt Thiol-modifizierte DNA und Thiolverdünnermoleküle. Das Verhältnis von DNA zu Verdünner lag üblicherweise zwischen 10:1 und 1:10, wobei ein Verhältnis von 1:1 bevorzugt war. Die bevorzugten Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran (THF), Acetonitril, Dimethylformamid (DMF) oder Gemische davon. Eine ausreichende Menge an DNA-Abscheidungslösung wird der Phiole so zugesetzt, dass sie die Elektrodenoberfläche völlig abdeckt. Das Goldsubstrat wird bei Umgebungstemperatur oder einer Temperatur leicht über Umgebungstemperatur 5–30 Minuten lang inkubieren gelassen. Nach der anfänglichen Inkubation wird die Abscheidungslösung entfernt, und eine Lösung nur aus Verdünnermolekülen (100 μM –1,0 mM) in organischem Lösungsmittel wird zugesetzt. Das Goldsubstrat wird bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur über Raumtemperatur inkubieren gelassen, bis sich eine komplette Monoschicht gebildet hat (10 Minuten bis 24 Stunden). Die Goldprobe wird aus der Lösung entfernt, in sauberem Lösungsmittel gespült und eingesetzt.
  • Allgemeines Verfahren zur SAM-Bildung – Abscheidung aus wässriger Lösung
  • Eine saubere Goldoberfläche wurde in eine saubere Phiole gegeben. Eine DNA-Abscheidungslösung in Wasser wurde hergestellt, in der die gesamte Thiolkonzentration zwischen 1 μM und 200 μM liegt. Die wässrige Lösung weist häufig Salz auf (etwa 1 M), wobei jedoch auch reines Wasser eingesetzt werden kann. Die Abscheidungslösung enthält Thiol-modifizierte DNA und häufig ein Thiolverdünnermolekül. Das Verhältnis von DNA zu Verdünner liegt üblicherweise zwischen 10:1 und 1:10, wobei ein Verhältnis von 1:1 bevorzugt ist. Die DNA-Abscheidungslösung wird der Phiole in solch einem Volumen zugesetzt, dass sie die Oberfläche der Elektrode völlig abdeckt. Das Goldsubstrat wird bei Umgebungstemperatur oder einer Temperatur leicht über Umgebungstemperatur 1–30 Minuten lang inkubieren gelassen, wobei 5 Minuten üblicherweise ausreichend sind. Nach der anfänglichen Inkubation wird die Abscheidungslösung entfernt, und eine Lösung nur aus Verdünnermolekülen (10 μM –1,0 mM) entweder in Wasser oder in organischem Lösungsmittel wird zugesetzt. Das Goldsubstrat wird bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur über Raumtemperatur inkubieren gelassen, bis sich eine komplette Monoschicht bildet (10 Minuten bis 24 Stunden). Die Goldprobe wird aus der Lösung entfernt, in sauberem Lösungsmittel gespült und eingesetzt.
  • Monoschichten auf Au-Kugelelektroden
  • Erzeugen von Au-Kugelelektroden: Man setze eine Rasierklinge ein, um ein 10 cm langes Stück Golddraht (127 μm Durchmesser, 99,99 % rein; z.B. von Aldrich) abzuschneiden. Man setze eine 16-Messnadel ein, um den Draht durch ein natürliches Kautschukseptum Nr. 4 zu führen (mit einer Größe, um es über eine 1/2-ml-PCR-Eppendorf-Röhre zu stülpen). (Dies dient als Träger für den Draht und als Abdichtung für die Röhren während der Abscheidung. Siehe unten.) Man setze eine klar brennende Flamme (Methan oder Propan) ein, um einen Zentimeter des Drahts zu schmelzen und um eine Kugel zu bilden, der am Drahtende anhaftet. Die Drahtlänge ist so einzustellen, dass, wenn er in einer PCR-Röhre dicht eingeschlossen wird, die Goldkugel in der Nähe des Bodens der Röhre angeordnet ist und so in 20 μl Flüssigkeit eingetaucht sein kann. Bei Gebrauch sind die Elektroden in Königswasser (4:3:1 H2O:HCl:HNO3) 20 Sekunden lang zu tauchen und dann sorgfältig mit Wasser abzuspülen.
  • Derivatbildung: 5 Minuten lang 20-μl-Allquoten der Abscheidungslösung (2:2:1 DNA/H6/M44 zu gesamt 833 μM in DMF) in PCR-Röhren auf einem PCR-Block auf 50 °C erhitzen. Anschließend jede Elektrode in eine Röhre mit Abscheidungslösung geben (wobei nur die Goldkugel mit Lösung bedeckt sein soll – so wenig des Draht-„Stammes" wie möglich soll bedeckt sein) und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. 15 Minuten lang inkubieren, bevor die Elektroden in PCR-Röhren mit 200 μl von 400 μM M44 in DMF übertragen werden (hierbei ebenfalls den Drahtstamm umspülen). 5 Minuten in M44 bei Raumtemperatur ruhen lassen, dann auf den PCR-Block geben und HCLONG ausführen. Elektroden aus der M44-Lösung entfernen, in 6 × SSC tauchen und in PCR-Röhren mit 20 μl Hybridisierungslösung geben. Elektroden vor der ACV-Messung in 6 × SSC tauchen.
  • HCLONG: 65 °C 2', –0,3 °C/s bis 40 °C, 40 °C 2', +0,3 °C/s bis 55 °C, 55 °C 2', –0,3 °C/s bis 30 °C, 30 °C 2', +0,3 °C/s bis 35 °C, –0,3 °C/s bis 22 °C
  • Herstellung der Leiterplatten
  • Eine Platte von 18" × 24" × 0,047" von FR-4 (General Electric) mit einer Kupferfolie einer halben Unze auf beiden Seiten wurde gemäß den Angaben (Gerber-Dateien) durchbohrt. Die FR-4-Platte wird mit stromlosem Kupfer plattiert (500 Mikrozoll), um die spezifizierten Bohrlöcher leitfähig zu machen, und die Platte wird dann mit zusätzlichen 500 Mikozoll galvanisiertem Kupfer plattiert. Nach der Kupferplattierung wird die Platte gemäß den Angaben mittels Kupfer(II)-chloridätzung (Säureetzen) geätzt. Die geätzte Platte wird dann mit 400 Mikrozoll galvanisiertem Nickel mit Aufheller plattiert, wonach 50 Mikrozoll weiches Gold (99,99% Reinheit) aufgetragen wird. Die Goldplatte wird mit einer flüssigen photoabbildbaren Lötmaske (Probimer 52, Ciba-Geigy Co.) an beiden Seiten der Platte beschichtet. Die Bilderzeugung erfolgt gemäß den Angaben. 14 Sensorelektroden mit einem Durchmesser von 250 μm und 2 größere Elektroden (500 μm Durchmesser) werden mit isolierten Leitungen hergestellt, die zu goldplattierten Kontakten an der Kante der Platte führen. Die Platte mit Lötmaske wird dann gemäß den Angaben geritzt, um einzelne Scheibchen zu schaffen, die 1'' × 1'' groß sind. Eine Silber/Silberchlorid-Paste wird auf eine der zwei größeren Elektroden (ERCON R-414) aufgetragen. Die Platte wird dann mit Argon/Sauerstoff-Plasmagemisch Plasma-gereinigt. Nach dem Reinigen wird die Platte in einem folierten Sack bis zur Verwendung gelagert.
  • Monoschichten-Abscheidung auf Leiterplatten
  • Die Leiterplatten werden aus den folierten Säcken entfernt und in eine 10%ige Schwefelsäurelösung 30 Sekunden lang getaucht. Nach der Behandlung mit Schwefelsäure werden die Platten in zwei Milli-Q-Wasserbäder jeweils 1 Minute lang getaucht. Die Platten werden dann unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die Platten werden auf einen Koordinatentisch in einer Feuchtigkeitskammer platziert, und ein 30-Nanoliter-Tröpfchen der DNA-Abscheidungslösung wird auf jede der 14 Elektroden gegeben. Die DNA-Abscheidungslösung besteht aus 33 μM thiolierter DNA, 33 μM 2-Einheit Phenylacetylendraht (H6) und 16 μM M44 in 6 × SSC (900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, pH7) mit 1 % Triethylamin. Das Tröpfchen wird bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert, und dann wird das Tröpfchen durch Spülen in einem Milli-Q-Wasserbad entfernt. Die Platten werden in ein 45-°C-Bad von M44 in Acetonitril getaucht. Nach 30 Minuten werden die Platten entfernt und in ein Acetonitrilbad 30 Sekunden lang getaucht, wonach ein Milli-Q-Wasserbad für 30 Sekunden folgt. Die Platten werden unter einem Stickstoffstrom getrocknet.
  • BEISPIEL 2
  • Detektion der Zielsequenzen
  • Monoschichten-Abscheidung auf den Leiterplatten
  • Wie zuvor wurden die Leiterplatten aus den folierten Säcken entfernt und 30 Sekunden lang in eine 10%ige Schwefelsäurelösung getaucht. Nach der Schwefelsäurebehandlung wurden die Platten in zwei Milli-Q-Wasserbäder jeweils 1 Minute lang getaucht. Die Platten wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Die Platten wurden auf einen Koordinatentisch in einer Feuchtigkeitskammer platziert, und ein 30-Nanoliter-Tröpfchen der DNA-Abscheidungslösung wurde auf jede der 14 Elektroden gegeben. Die DNA-Abscheidungslösung bestand aus 33 μM thiolierter DNA, 33 μM 2-Einheit Phenylacetylendraht (H6) und 16 μM Undec-1-en-11-yltri(ethylenglykol)(HS-CH2)11-(OCH2CH2)3-OH) in 6 × SSC (900 mM Natriumchlorid, 90 mM Natriumcitrat, pH7) mit 1 % Triethylamin. 3 Elektroden wurden mit einer Lösung besprenkelt, die DNA 1 (5'-ACCATGGACACAGAT(CH2)16SH-3') enthielt. 4 Elektroden wurden mit einer Lösung besprenkelt, die DNA 2 (5'TCATTGATGGTCTCTTTTAACA(CH2)16SH-3') enthielt. 4 Elektroden wurden mit DNA 3 (5'CACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA(CH2)16SN-3') besprenkelt. 3 Elektroden wurden mit DNA 4 (5'-TGTGCAGTTGACGTGGAT(CH2)16SH-3') besprenkelt. Die Abscheidungslösung wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubieren gelassen, und dann wurde das Tröpfchen durch Spülen in einem Milli-Q-Wasserbad entfernt. Die Platten wurden in ein 45-°C-Bad von M44 in Acetonitril getaucht. Nach 30 Minuten wurden die Platten entfernt und in ein Acetonitrilbad 30 Sekunden lang getaucht, wonach ein Milli-Q-Wasserbad für 30 Sekunden folgte. Die Platten wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet und in folierten Säcken gelagert, die bis zur Verwendung unter Stickstoff standen.
  • Hybridisierung und Messung
  • Die modifizierten Platten wurden aus den folierten Säcken entfernt und in eine spritzgegossene Probenkammer (Patrone) angepasst. Die Kammer wurde an die Platte mittels doppelseitigen Klebebands geheftet und hatte ein Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern. Eine Hybridisierungslösung wurde hergestellt. Die Lösung enthielt 10 nM DNA-Target (5'-TGTGCAGTTGACGTGGATTGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAGTCATCCAGT-3') (D-998), 30 nM signalisierende Sonde (D-1055) und 10 nM 5'-TCTACAG(N6)C(N6)ATCTGTGTCCATGGT-3' (N6 ist in 1D aus der PCT US99/01.705 gezeigt; es umfasst ein Ferrocen, das über eine 4-Kohlenstoffkette mit dem 2'-Sauerstoff der Ribose eines Nucleosids verbunden ist).
  • Die signalisierende Sonde ist wie folgt:
  • Figure 01840001
  • N87 ist ein Verzweigungspunkt, der eine Ringstruktur umfasst. C23 wird in 1F aus der PCT US99/01.705 dargestellt. In einer Lösung, die 25 % Quiagen-Lyse-Puffer AL, 455 mM NaClO4, 195 mM NaCl, 1,0 mM Mercaptohexanol und 10 % fötales Kälberserum enthält. 250 Mikroliter Hybridlösung wurden in die Patrone injiziert und 12 Stunden lang hybridisieren gelassen. Nach 12 Stunden wurde der hybridisierte Chip in einen selbst hergestellten Übergangsleitwert-Amplifier mit wechselnder Schaltung gesteckt. Der Übergangsleitwert-Amplifier war mit Summierschaltungsanordnung versehen, die eine Gleichstromrampe von der Computer-DAQ-Karte und eine Wechselstrom-Sinuswelle vom Lock-in-Amplifier (SR830 Stanford Instruments) kombiniert. Jede Elektrode wurde nacheinander gescannt, und die Daten wurden gespeichert und unter Einsatz eines selbst hergestellten Programms manipuliert, das auf die Verwendung von Labview (National Instruments) abgestimmt ist. Der Chip wurde bei zwischen –100 mV und 500 mV (Pseudo-Ag/Ag/Cl-Bezugselektrode) mit 25 mV Gleichstrom (50 mV Spitze zu Spitze), 1.000 Hz überlagerte Sinuswelle, gescannt. Der Ausgangsstrom wurde in den Lock-in-Amplifier ein geführt, und das 1.000-Hz-Signal wurde aufgezeichnet (ACV-Verfahren). Die Daten für jedes Einlagen-Set wurden gesammelt, und der Durchschnitt wurde ermittelt.
  • Figure 01850001
  • Die Ergebnisse werden in 14 gezeigt.

Claims (9)

  1. Zusammensetzung, umfassend ein Substrat, das umfasst: a) eine erste Oberfläche, die umfasst: i) eine Anordnung von Detektionselektroden, die jeweils einen kovalent gebundenen Einfangliganden umfassen; ii) zumindest eine erste Elektrophoreseelektrode; b) eine zweite Oberfläche, die zumindest eine zweite Elektrophoreseelektrode umfasst; und c) zumindest einen Kanal, der die erste und die zweite Oberfläche verbindet.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Kanal ein Permeationsschichtmaterial umfasst.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Kanal eine Membran umfasst.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die außerdem eine Detektionskammer umfasst, wobei die Detektionskammer die Oberfläche umfasst.
  5. Zusammensetzung, umfassend eine Detektionskammer, die umfasst: a) ein Substrat, das umfasst: i) eine erste Oberfläche, die 1) eine Anordnung von Detektionselektroden umfasst, die jeweils einen kovalent gebundenen Einfangliganden umfassen; ii) eine zweite Oberfläche; iii) zumindest einen Kanal, welcher die erste und die zweite Oberfläche verbindet; und b) ein Absorbensmaterial, das mit der zweiten Oberfläche in Kontakt steht.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin der Kanal ein Permeationsschichtmaterial umfasst.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin der Kanal eine Membran umfasst.
  8. Verfahren zum Detektieren eines Zielanalyts in einer Probe, umfassend: a) Konzentrieren des Zielanalyts in einer Detektionskammer, die umfasst: i) eine erste Oberfläche, die umfasst: 1) eine Anordnung von Detektionselektroden, die jeweils einen kovalent gebundenen Einfangliganden umfassen; 2) zumindest eine erste Elektrophoreseelektrode; ii) eine zweite Oberfläche, die zumindest eine zweite Elektrophoreseelektrode umfasst; und iii) zumindest einen Kanal, der die erste und die zweite Oberfläche verbindet; b) Binden des Zielanalyts an den Einfangliganden, um einen Testkomplex zu bilden, worin der Testkomplex außerdem zumindest eine Elektronenübertragungsgruppierung ("electron transfer moiety", ETM) umfasst; und c) Nachweisen der Gegenwart der ETM unter Verwendung der Detektionselektrode.
  9. Verfahren zum Detektieren eines Zielanalyts in einer Probe, umfassend: a) Konzentrieren des Zielanalyts in einer Detektionskammer, die umfasst: i) ein Substrat, das umfasst: 1) eine erste Oberfläche, die A) eine Anordnung von Detektionselektroden umfasst, die jeweils einen kovalent gebundenen Einfangliganden umfassen; 2) eine zweite Oberfläche; 3) zumindest einen Kanal, der die erste und die zweite Oberfläche verbindet; und ii) ein Absorbensmaterial, das mit der zweiten Oberfläche in Kontakt steht; b) Binden des Zielanalyts an den Einfangliganden, um einen Testkomplex zu bilden, worin der Testkomplex außerdem zumindest eine Elektronenübertragungsgruppierung ("electron transfer moiety", ETM) umfasst; und c) Nachweisen der Gegenwart der ETM unter Verwendung der Detektionselektrode.
DE60011821T 1999-11-12 2000-11-13 Bindungsbeschleunigungsverfahren zum nachweis von analyten Expired - Fee Related DE60011821T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44037199A 1999-11-12 1999-11-12
US440371 1999-11-12
US17198199P 1999-12-23 1999-12-23
US171981P 1999-12-23
PCT/US2000/031233 WO2001035100A2 (en) 1999-11-12 2000-11-13 Binding acceleration techniques for the detection of analytes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60011821D1 DE60011821D1 (de) 2004-07-29
DE60011821T2 true DE60011821T2 (de) 2005-07-07

Family

ID=26867628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60011821T Expired - Fee Related DE60011821T2 (de) 1999-11-12 2000-11-13 Bindungsbeschleunigungsverfahren zum nachweis von analyten

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP1254372B1 (de)
JP (1) JP3548159B2 (de)
AT (1) ATE269977T1 (de)
AU (1) AU778556B2 (de)
CA (1) CA2388780C (de)
DE (1) DE60011821T2 (de)
ES (1) ES2225264T3 (de)
WO (1) WO2001035100A2 (de)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6071699A (en) 1996-06-07 2000-06-06 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US6761816B1 (en) 1998-06-23 2004-07-13 Clinical Micro Systems, Inc. Printed circuit boards with monolayers and capture ligands
WO2000024941A1 (en) 1998-10-27 2000-05-04 Clinical Micro Sensors, Inc. Detection of target analytes using particles and electrodes
US6942771B1 (en) 1999-04-21 2005-09-13 Clinical Micro Sensors, Inc. Microfluidic systems in the electrochemical detection of target analytes
US6602400B1 (en) 2000-06-15 2003-08-05 Motorola, Inc. Method for enhanced bio-conjugation events
DE10049901C2 (de) * 2000-10-10 2003-01-02 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Vorrichtung und Verfahren zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung und zur Detektion von Molekülen
AU2002220583A1 (en) * 2000-10-10 2002-04-22 Aventis Research And Technologies Gmbh And Co Kg Device and method for electrically accelerated immobilisation of molecules
US7198754B2 (en) 2001-08-31 2007-04-03 Kabushiki Kaisha Toshiba Biological material detection element, biological material detection method and apparatus, charged material moving apparatus
EP1461596B1 (de) * 2001-11-30 2013-07-17 Northwestern University Direktes-schreiben-nanolithographische abscheidung von nukleinsäuren aus nanoskopischen spitzen
CA2474530A1 (en) * 2002-02-07 2003-08-14 Eastern Virginia Medical School Of The Medical College Of Hampton Roads Diagnostic microarray and method of use thereof
TWI221523B (en) 2002-05-21 2004-10-01 Sony Corp Bioassay method, bioassay device, and bioassay substrate
WO2004101785A1 (ja) * 2003-05-13 2004-11-25 Jsr Corporation 目的遺伝子の抽出方法およびプローブｄｎａ結合粒子
JP4464664B2 (ja) * 2003-06-13 2010-05-19 独立行政法人理化学研究所 生体分子マイクロアレイ用基板、生体分子マイクロアレイ、相互作用促進用装置および方法、ならびに、相互作用の検出方法
US7470466B2 (en) 2005-12-23 2008-12-30 Boston Scientific Scimed, Inc. Nanoparticle structures and composite materials comprising a silicon-containing compound having a chemical linker that forms a non-covalent bond with a polymer
US8455088B2 (en) 2005-12-23 2013-06-04 Boston Scientific Scimed, Inc. Spun nanofiber, medical devices, and methods
US20070151856A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-05 Fazzio R S Fluidic device having contiguous conductive layer over interior and exterior surfaces thereof
JP2007267644A (ja) * 2006-03-30 2007-10-18 Toshiba Corp 単位塩基の繰り返し回数の測定方法
WO2008020364A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Koninklijke Philips Electronics N. V. Biochemical sensor device
JP5455220B2 (ja) * 2007-03-14 2014-03-26 オゲノ ゲーエムベーハー 組織、細胞又は検体を濃縮するための生検装置
KR102062565B1 (ko) * 2012-06-20 2020-01-06 도레이 카부시키가이샤 핵산의 검출 방법 및 핵산 검출 키트
US10114015B2 (en) 2013-03-13 2018-10-30 Meso Scale Technologies, Llc. Assay methods
US9587268B2 (en) * 2014-01-29 2017-03-07 Agilent Technologies Inc. Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment
EP3143401A4 (de) * 2014-05-15 2017-10-11 Meso Scale Technologies, LLC Verbesserte testverfahren
WO2019147525A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Advanced Electrofluidic Systems, Llc Method and apparatus for isolating and detecting biological and other particles
CN115895279B (zh) * 2022-11-24 2023-07-21 西北大学 一种SPAN/MOFs@Luminol发光材料及其制备方法和应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4787963A (en) * 1987-05-04 1988-11-29 Syntro Corporation Method and means for annealing complementary nucleic acid molecules at an accelerated rate
US6017696A (en) * 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
CA2244891C (en) * 1996-02-09 2008-12-30 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
WO1998051823A1 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 Mosaic Technologies Electrophoretic analysis of molecules using immobilized probes
EP1051517A2 (de) * 1998-01-27 2000-11-15 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplifizierung von nukleinsäuren mit elektronischer erkennung
WO1999057319A1 (en) * 1998-05-06 1999-11-11 Clinical Micro Sensors Electronic detection of nucleic acids using monolayers
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003514227A (ja) 2003-04-15
EP1254372A2 (de) 2002-11-06
AU1606301A (en) 2001-06-06
DE60011821D1 (de) 2004-07-29
EP1254372B1 (de) 2004-06-23
WO2001035100A3 (en) 2002-01-03
ATE269977T1 (de) 2004-07-15
CA2388780A1 (en) 2001-05-17
WO2001035100A2 (en) 2001-05-17
ES2225264T3 (es) 2005-03-16
WO2001035100A9 (en) 2002-07-04
JP3548159B2 (ja) 2004-07-28
AU778556B2 (en) 2004-12-09
CA2388780C (en) 2006-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60011821T2 (de) Bindungsbeschleunigungsverfahren zum nachweis von analyten
US7087148B1 (en) Binding acceleration techniques for the detection of analytes
US6761816B1 (en) Printed circuit boards with monolayers and capture ligands
AU772382B2 (en) Binding acceleration techniques for the detection of analytes
US6753143B2 (en) Target analyte detection using asymmetrical self-assembled monolayers
US6541617B1 (en) Detection of target analytes using particles and electrodes
DE60007306T2 (de) Verwendung von mikrofluidischen systemen zur elektrochemischen detektion von zielanalyten
US20050244954A1 (en) Binding acceleration techniques for the detection of analytes
ES2319380T3 (es) Determinacion de secuencias de acido nucleico usando la deteccion electronica.
US6833267B1 (en) Tissue collection devices containing biosensors
JP2002533694A (ja) バイオセンサーを有する組織収集装置
WO2003019194A2 (de) Verdrängungsassay zur detektion von ligat-ligand assoziationsereignissen
WO2004099430A2 (de) Substrat als träger von ligaten
AU2004201066A1 (en) Binding acceleration techniques for the detection of analytes
DE10221091B4 (de) SECM zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee