DE60010742T2 - Verfahren zur herstellung eines produktes, welches gegen bluthochdruck gerichtete tripeptide enthält - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes, das antihypertensiv-wirkende Peptide enthält. Zudem betrifft die Erfindung das erhaltene Produkt und dessen Verwendung als ein funktionelles Produkt alleine oder als ein Bestandteil, oder Additiv, von essbaren Substanzen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gegenwärtig zählen kardiovaskuläre Erkrankungen zu den am meisten verbreiteten Volkskrankheiten in Industrieländern, und das Auftreten dieser Erkrankungen wird weiter zunehmen, je älter die Bevölkerung wird. Hoher Blutdruck leistet einen wesentlichen Beitrag zu der Entwicklung dieser Krankheiten. Aus diesem Grund stellt die Behandlung von Hypertension eine der wichtigsten Maßnahmen sowohl hinsichtlich der Prävention als auch hinsichtlich der wirksamen Behandlung dieser Erkrankung dar.
  • Bei der Regulierung des Blutdrucks spielt das Enzym Angiotensin-I-Converting-Enzyme, ACE, auf Zellniveau eine Schlüsselrolle. ACE wirkt auf zwei Weisen: es wandelt Angiotensin I in Angiotensin II um, das stark vasopressorisch wirkt und inaktiviert Bradykinin, das im Gegenzug vasodilatorisch wirkt. Daher führen beide Funktionen zu erhöhtem Blutdruck. ACE-Hemmer können diese Wirkung hemmen und folglich als antihypertensiv-wirkende Mittel agieren. Viele bekannte Arzneimittel die zur Behandlung der Hypertension verwendet werden sind ACE-Hemmer. Eines davon ist Captopril, d.h. D-2-methyl-3- mercaptopropanoyl-L-prolin, das in Finnland unter den Handelsnamen Capoten (von Bristol-Myers Squibb) und Captopril Generics (von Merck Generics) im Handel erhältlich ist.
  • Weitere Methoden zur Senkung von hohem Blutdruck wurden ebenfalls als eine Alternative zur Medikation, oder als Zusatz dazu, angestrebt. Diese umfassen zum Beispiel das Vermeiden von Fettleibigkeit, das Sorgen für vermehrte Bewegung und eine natriumarme Ernährung. Eine der neuesten Methoden ist es, funktionelle Nahrungsmittel als ein Teil einer normalen Ernährung zu sich zu nehmen, wobei die Konsumenten dies als eine willkommene Alternative entdeckt haben.
  • Über fermentierte Milchprodukte wird berichtet, dass sie Peptide enthalten, die eine antihypertensive Wirkung haben. Es wird angenommen, dass die Peptide in den Milchprodukten als ein Ergebnis der Milchproteinhydrolyse hergestellt werden, die durch Milchsäurebakterien und insbesondere von extrazellulären Proteinasen daraus, durchgeführt wird. In J. Biochem. 114 (1993) 740, beschreiben Yamamoto et al. die Purifikation und Charakterisierung einer aus dem Mikroorganismus Lactobacillus helveticus CP790 stammenden Proteinase. Yamamoto et al. berichteten zudem über eine Studie, in der αS1- und β-Casein mit der Proteinase hydrolysiert wurden und die erhaltenen Peptide hinsichtlich ihrer ACE-hemmenden Wirkung untersucht wurden (J. Dairy Sci. 77 (1994) 917). Die Gesamtanzahl der untersuchten Peptide betrug 25 und ihre Molekulargrößen und Wirkungen waren weitgehend unterschiedlich. Drei Peptide, die aus β-Casein erhalten wurden und 8, 18, beziehungsweise – 27 Aminosäuren enthielten, waren diejenigen, die am meisten aktiv waren. Die Untersuchung verglich zudem die ACE-Aktivität von Milch, die mit dem Stamm Lactobacillus helveticus CP790 und dessen Variante CP791, mit einer fehlerhaften Proteinaseaktivität, fermentiert wurde, wobei herausgefunden wurde, dass erstere bei spontan hypertensiven SHR-Ratten wirksam war, aber nicht bei einem gewöhnlichen Rattenstamm, wobei letzterer gar keine Aktivität aufwies.
  • In J. Dairy Sci. 78 (1995) 777–783, beschreiben Nakamura et al. die Verwendung einer Startkultur, die Lactobacillus helveticus und Saccharomyces cerevisiae enthält, für die Herstellung der zwei ACE-Hemmer. Fettfreie Milch wurde mit der Startkultur fermentiert, und danach wurden die ACE-Hemmer chromatographisch gereinigt und analysiert. Die aktiven Bestandteile waren beide Tripeptide, Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro. Die Veröffentlichung beschreibt keine antihypertensive Wirkung der Tripeptide und des mit der Startkultur hergestellten Sauermilchproduktes in vivo, dies wird jedoch als nächster Gegenstand für die Forschung genannt.
  • Das US-Patent 5,449,661 (Nakamura et al.) offenbart die Herstellung eines Peptides, das die Tripeptidsequenz Val-Pro-Pro enthält, sowie dessen Verwendung zur Senkung von Bluthochdruck. Das Peptid wird durch die Fermentation von fettfreiem Milchpulver mit dem Stamm Lactobacillus helveticus JCM-1004 hergestellt, und danach wird das Peptid chromatographisch gereinigt und gefriergetrocknet.
  • Die internationale Patent Anmeldung W099/16862 (Yamamoto et al.) beschreibt den Lactobacillus helveticus Stamm CM4, FERM BP-6060, der in der Lage ist, eine große Menge des Tripeptids Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro herzustellen, und der eine hohe extrazelluläre Proteaseaktivität aufweist. Zudem beschreibt die Veröffentlichung fermentierte Milchprodukte, die die Tripeptide und das Bakterium enthalten, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung durch Fermentation von Produkten, die die Tripeptidsequenzen mit dem Bakterium enthalten.
  • Zwei Nachteile treten in Verbindung mit den Produkten, die die antihypertensiv-wirkenden Peptide enthalten, die durch Fermentationsreaktionen von Milchsäurebakterien hergestellt wurden, auf. Das Hauptprodukt der Fermentation ist Milchsäure, und je wirksamer die Fermentationsreaktion ist, desto mehr wird davon produziert. Wie der Begriff an sich schon impliziert, ist Milchsäure sauer und verleiht dem Produkt, das antihypertensiv-wirkende Peptide enthält, zusätzlich einen bitteren Geschmack. Zudem empfinden viele Verbraucher den hohen Säuregehalt und den niedrigen pH-Wert als unangenehm. Eine große Anzahl an monovalenten Ionen, insbesondere Natriumionen, sind zudem in dem Produkt, das durch Fermentation hergestellte antihypertensiv-wirkende Peptide umfasst, vorhanden. Von diesen Ionen ist bekannt, dass sie den Blutdruck erhöhen, und daher wirken sie den erwünschten, antihypertensiv-wirkenden Peptiden entgegen.
  • Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Reinigung von durch Fermentation hergestellten Peptiden. Diese Verfahren ermöglichen es, die oben genannten Nachteile teilweise zu vermeiden, während ein konzentriertes Produkt erhalten wird. Es war jedoch Ziel der Verfahren des Standes der Technik, reine Produkte zur Verfügung zu stellen, die für Analysen und Aktivitätstests geeignet sind. Daher sind die Verfahren mehrstufige Verfahren, die überwiegend aus verschiedenen chromatographischen Reinigungen bestehen und für eine Produktion in großem Rahmen nicht geeignet sind.
  • Aus diesem Grund besteht noch immer ein offensichtlicher Bedarf an der Bereitstellung von neuen funktionellen Produkten, die eine antihypertensive Wirkung aufweisen und die von den Verbrauchern als angenehm und vertraut empfunden werden, und die aus diesem Grund leicht als Bestandteil der normalen Ernährung verwendet werden können. Es ist wichtig, dass die Produkte keine unangenehmen oder sogar schädlichen Bestandteile umfassen und dass sie leicht in industriellem Maßstab hergestellt werden können.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Produkt zur Verfügung zu stellen, das einen hohen Gehalt an antihypertensiv-wirkenden Peptiden aufweist und folglich eine antihypertensive Wirkung hat.
  • Vorteilhafterweise weist das erfindungsgemäße Produkt zusätzlich zu dem hohen Gehalt an antihypertensiv-wirkenden Peptiden einen vorteilhaften Salzgehalt auf, was bedeutet, dass die Menge an schädlichen monovalenten Kationen verglichen mit einem bekannten Produkt ähnlicher Art niedrig und die Menge an nützlichen divalenten Kationen hoch ist.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es zudem, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Produktes zur Verfügung zu stellen, dessen Ablauf einfach und leicht durchführbar ist und das aus diesem Grund zur Herstellung in industriellem Maßstab geeignet ist.
  • Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Produkt zur Verwendung an sich als ein antihypertensiv-wirkendes Mittel oder zur Verwendung bei der Herstellung von essbaren funktionellen Nahrungsmitteln oder Pharmazeutika zur Verfügung zu stellen.
  • Zudem ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Produkte zur Verfügung zu stellen, die zur oralen Einnahme verwendbar sind, wie zum Beispiel funktionelle Nahrungsmittel und Pharmazeutika, die das obenstehend beschriebene Produkt als einen der aktiven Bestandteile enthalten.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass diese Aufgaben durch ein neues Verfahren, das auf einer neuen und erfinderischen Kombination basiert, gelöst werden können: eine antihypertensiv-wirkende Peptide enthaltende Vor-Präparation wird durch Fermentation hergestellt, danach wird sie konzentriert, und die finale Zusammensetzung entsteht durch Nanofiltration. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung stellt ausgezeichnete Möglichkeiten zur Verfügung, Ausgangsmaterialien verschiedener Art zu verwenden und die Zusammensetzung des Endproduktes so zu modifizieren, dass es einer gewünschten Art entspricht, wie im Folgenden näher beschrieben.
  • Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes, das antihypertensiv-wirkende Peptide umfasst, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte der Fermentation eines Casein-enthaltenden Ausgangsmaterials mit einem Milchsäurebakterium und die Durchführung einer Nanofiltration mit dem erhaltenen Peptide-enthaltenden Fermentationsprodukt umfasst.
  • Die Erfindung betrifft zudem ein Produkt, das antihypertensiv-wirkende Peptide enthält, wobei das Produkt dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen hohen Gehalt an antihypertensiv-wirkenden Peptiden aufweist und durch ein Verfahren hergestellt wird, bei dem das Casein-enthaltende Ausgangsmaterial mit einem Milchsäurebakterium fermentiert wird und das erhaltene Peptid-enthaltende Fermentationsprodukt nanofiltriert wird.
  • Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung des obenstehend beschriebenen Produktes als ein antihypertensiv-wirkendes Mittel.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des obenstehend beschriebenen Produktes bei der Herstellung von essbaren Substanzen.
  • Die Erfindung betrifft zudem essbare Produkte, die das obenstehend genannte konzentrierte Produkt mit einem hohen Peptidgehalt umfassen, ebenso wie herkömmliche Inhaltsstoffe dieser Endprodukte.
  • In dem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Vorpräparation durch Fermentation hergestellt, die antihypertensiv-wirkende Peptide enthält. Bei der Fermentation kann das zu verwendende Ausgangsmaterial ein beliebiges Produkt sein, das Sequenzen der erwünschten Peptide als einen Teil ihrer eigenen Peptid- oder Proteinsequenz aufweist. Milchprotein, insbesondere Casein, wird vorteilhafterweise als solches oder in Form von verschiedenen Präparationen verwendet. Vorteilhafterweise umfassen geeignete Ausgangsmaterialien auch verschiedene Casein-beinhaltende Milchprodukte, wie zum Beispiel fettfreie Milch, oder Milch mit verschiedenen Fettgehalt, als solches oder in Form des entsprechenden Milchpulvers, und fermentierte Milchprodukte, wie zum Beispiel Sauermilch, Buttermilch, Joghurt, geronnene Milch, ungereifte Käsearten, usw.
  • Fermentation kann mit jedem beliebigen Milchsäurebakterium durchgeführt werden, das in der Lage ist, aus dem Ausgangsmaterial antihypertensiv-wirkende Tripeptide herzustellen. Geeignete Milchsäurebakterien sind zum Beispiel in Spezien der Gattungen Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus und Bifidobacterium Arten zu finden. Lactobacillus helveticus ist unter den Milchsäurebakterien das proteolytischste, und aus diesem Grund wird es als besonders geeignet für diesen Zweck angesehen. Ein vorteilhafter Lactobacillus helveticus Stamm ist L. helveticus LBK-16H. Milchsäurebakterien können als reine oder gemischte Kulturen verwendet werden, einzeln oder mit herkömmlich verwendeten und im Handel erhältlichen Startkulturen. Milchsäurebakterien können auch zusammen mit anderen Mikroorganismen verwendet werden. Was die Kombination von Mikroben anbelangt, werden geeignete Kombinationen nach der Wirkung ausgewählt, durch die in dem Endprodukt der bestmögliche Geschmack erzielt wird und bei der jegliche Gefahr einer Vergiftung vermieden wird.
  • Die Fermentationsbedingungen werden so ausgewählt, dass sie den Bedingungen des verwendbaren Stammes bei der Fermentation entsprechen, so dass eine ausreichende Menge an antihypertensiv-wirkenden Peptiden zur Zur-Verfügung-Stellung einer gewünschten Wirkung gebildet wird. Die Auswahl von geeigneten Bedingungen, wie zum Beispiel Temperatur, pH-Wert und Belüftung sind Teil des Fachwissens eines Fachmanns. Die Temperatur kann zum Beispiel 30 bis 45°C betragen.
  • Die Fermentation soll sich solange fortsetzen, bis die gewünschte Menge an antihypertensiv-wirkenden Peptiden gebildet ist. Für gewöhnlich dauert dies ca. 20 bis 30 Stunden, vorzugsweise 22 bis 24 Stunden.
  • Eine Mischung verschiedener Peptide wird bei der Fermentation gebildet. Dauert die Fermentation ausreichend lange, werden hauptsächlich relativ kleine di- und tri-Peptide, wie zum Beispiel Val-Pro-Pro (VPP) und Ile-Pro-Pro (IPP) erhalten.
  • Nach der Fermentation wird die Zellsuspension zurückgewonnen. Sie kann für sich in einem nächsten Schritt verwendet werden, d.h. zur Trennung und Konzentrierung von Peptiden. Die Zellsuspension kann zum Beispiel auch durch Verdampfen oder durch teilweises oder vollständiges Trocknen konzentriert werden, zum Beispiel durch Ausbreiten auf einer Platte, Trocknen und schließlich Mahlen zu einem gut haltbaren Trockenpulver.
  • In einigen Fällen kann es angemessen sein, das fermentierte Produkt einer Vorbehandlung zu unterziehen, zum Beispiel, um vor der Nanofiltration Casein oder alle Milchproteine aus ihm zu entfernen. Die anwendbaren Verfahren zur Vorbehandlung sind auf diesem Gebiet bekannt und umfassen zum Beispiel verschiedene Präzipitations- und Filtrationsverfahren. Ein nützliches Verfahren umfasst das Anpassen des pH-Wertes des fermentierten Produktes auf ein Niveau auf dem Casein präzipitiert, zum Beispiel auf 4,6 bei einer Temperatur von etwa 37°C, wonach das präzipitierte Casein mittels einer Abtrennvorrichtung für geronnene Bestandteile abgesondert wird, eines Casein-trennenden Siebes, einer Dekantiervorrichtung oder durch Abscheidung oder durch ein anderes geeignetes Verfahren. Ein zweites Verfahren umfasst die Ultrafiltration des fermentierten Produktes, bei einem pH-Wert von 3 bis 3,5, wobei alle Proteine durch Membran zurückgehalten werden und das erhaltene Permeat eine fast Protein-freie Molke ist. Eine Co-Präzipitation, die eine fast Protein-freie, Peptid-enthaltende Molke herstellt, kann zum Beispiel durch das Hinzufügen von CaCl2, Wärmebehandlung oder das Hinzufügen von Säure erzielt werden. Falls nötig wird ein eventuell vorhandener Caseinstaub durch Zentrifugieren entfernt. Andere Substanzen, wie zum Beispiel Laktose, können ebenfalls vor der Nanofiltration entfernt werden, zum Beispiel durch enzymatische Hydrolyse oder Fermentation.
  • Das Fermentationsprodukt, das eventuell auf eine geeignete Art und Weise vorbehandelt wurde, wie zum Beispiel die wie obenstehend beschrieben erhaltene Molke, wird dann einer Nanofiltration unterzogen. Eine herkömmliche NF Membran, wie zum Beispiel Nanomax 50 (Millipore) oder Desal 5 (Desal Inc., USA), können als Nanofiltrationsmembran verwendet werden, und die Bedingungen werden so ausgewählt, dass sie den Anforderungen und Weisungen der Membranhersteller entsprechen. Die Auswahl der Art der Nanofiltrationsmembran und der Verfahrensbedingungen tragen wesentlich zu der Zusammensetzung der resultierenden Peptidfraktion, insbesondere zur Salz- und Zuckerzusammensetzung, bei.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Nanofiltration bis zu einem erwünschten Trockenmassengehalt oder einem volumerischen Konzentrationsverhältnis durchgeführt, der/das für gewöhnlich so hoch wie möglich ist. Der Trockenmassengehalt liegt im Bereich von etwa 20 bis 40% und das volumerischen Konzentrationsverhältnis beträgt etwa 5 bis 20. Das (Molke-) Konzentrat kann mit Wasser verdünnt werden, wobei bei der Nanofiltration mehr Salze und Milchsäure von dem Konzentrat entfernt werden können. Dies ist eine einfache und effektive Art, die Menge der Salze in dem Konzentrat auf das gewünschte Niveau einzustellen.
  • Kleine Peptide, wie zum Beispiel die tri-Peptide IPP und VPP mit etwa 350 D, die bei der Fermentation gebildet werden und eine Wirkung auf den Blutdruck haben, werden durch die Nanofiltrationsmembran vollständig zurückgehalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zudem das vollständige Entfernen von Laktose: vor dem Schritt der Nanofiltration kann Laktose enzymatisch abgebaut werden, wobei der Hauptteil der Monosaccharide entfernt wird. Bei der Nanofiltration, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren beinhaltet ist, durchdringen auch Milchsäure, Stickstoffverbindungen mit geringem Molekulargewicht, wie zum Beispiel Harnstoff, und monovalente Salze ebenfalls die Membran. Daher steigt der Peptidgehalt des Produktes durch die Nanofiltration. Aufgrund der Konzentration steigt der Gehalt an divalenten Ionen, insbesondere der erwünschten Calcium- und Magnesiumionen, wohingegen der relative Anteil an monovalenten Ionen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium- und Chloridionen, abnimmt. Insbesondere von Natriumionen ist bekannt, dass sie auf den Flüssigkeitsausgleich und den Blutdruck im menschlichen Körper eine wesentliche Wirkung haben, und aus diesem Grund kann eine Abnahme der Menge dieser schädlichen Ionen als ein sehr ansehnlicher Vorteil angesehen werden. Calcium- und Magnesiumionen sind wiederum dafür bekannt, dass sie den Blutdruck senken, und ein hoher Gehalt an diesen Ionen wird als sehr wünschenswert erachtet.
  • Tabelle 1 zeigt, wie sich die Bestandteile der Vorpräparation, die bei dem Fermentationsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildet wurde, bei dem Schritt der Nanofiltration verhalten. Die Zusammensetzung wird beispielhaft dargestellt, um die Erfindung zu verdeutlichen, und sie wird durch Fermentation von fettfreier Milch mit einem Lactobacillus helveticus Stamm hergestellt. Wie aus der obenstehenden Beschreibung deutlich hervorgeht, können auch andere Produkte als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Überdies tragen Fermentationsbedingungen, Nanofiltration und andere Vorbehandlungen und Zusatzbehandlungen, falls durchgeführt, zum Ergebnis bei, somit können die Zusammensetzungen und die Nanofiltrationsergebnisse des Endproduktes variieren und sich von den hierin dargestellten unterscheiden.
  • Tabelle 1
  • Verhalten von Molkebestandteilen, die antihypertensiv-wirkende Peptide enthalten, bei der Nanofiltration.
  • Membran: Nanomax 50; Bedingungen: 40°C, 30 bar, volumerisches Konzentrationsverhältnis C=9, pH 4,6
  • Figure 00120001
  • Das Produkt, das hinsichtlich der antihypertensiv-wirkenden Peptide konzentriert wurde und das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurde, kann an sich als ein antihypertensiv-wirkendes Mittel verwendet werden. Das Produkt kann auch getrocknet sein und in Pulverform oder in Form einer lyophilisierten Präparation verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Produkt jedoch vorteilhafterweise bei der Herstellung von funktionellen Lebensmitteln oder anderen Produkten verwendet.
  • In der vorliegenden Druckschrift wird der Begriff "Nahrungsmittel" in einem weiten Sinne verwendet, der alle essbaren Produkte umfasst, die in fester, gelierter oder flüssiger Form vorliegen können, und sowohl Fertigprodukte als auch Produkte, zu denen das erfindungsgemäße Produkt im Zusammenhang mit der Konsumierung als ein Additiv oder als ein einzelner Bestandteil des Produktes hinzugefügt wird, umfasst. So können Nahrungsmittel zum Beispiel Produkte der Milchindustrie, der fleischverarbeitenden Industrie, der nahrungsmittelverarbeitenden Industrie, der Getränkeindustrie und der Süßwarenindustrie sein. Typische Produkte umfassen Milchprodukte, wie zum Beispiel Joghurt, geronnene Milch, Quark, Sauermilch, Buttermilch und andere fermentierte Milchgetränke, unreife Käsearten und gereifte Käsearten, Snack-Füllungen, usw. Getränke, wie zum Beispiel Molkegetränke, Fruchtgetränke und Biere, stellen eine weitere wichtige Gruppe dar.
  • Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt wird in einer ausreichenden Menge verwendet, um die erwünschte antihypertensive Wirkung zur Verfügung zu stellen. Die verwendbare Menge hängt wesentlich von dem Konzentrationsgrad der Molke ab, der zum Beispiel von 0,1 bis 30% beträgt, bevorzugt 5 bis 15%, berechnet aus dem Gewicht des Endproduktes.
  • Da das erfindungsgemäße Verfahren und insbesondere dessen Schritt der Nanofiltration einen guten Rahmen für die Herstellung eines Produktes der erwünschten Art darstellt, ist es zudem möglich, den Gehalt der Bestandteile, die eine nachteilige Wirkung auf den Geschmack haben, zu reduzieren oder sie vollständig zu entfernen und demzufolge den Geschmack des Produktes beizubehalten oder sogar noch zu verbessern.
  • Das antihypertensiv-wirkende Peptide-enthaltende Produkt kann einem Nahrungsmittel während dessen Zubereitung hinzugefügt werden. Alternativ kann es einem bereits fertigen Produkt hinzugefügt werden. Somit enthalten diese Nahrungsmittel das obenstehend beschriebene konzentrierte antihypertensiv-wirkende Peptide-enthaltende Produkt zusätzlich zu weiteren Inhaltsstoffen, die in derartigen Nahrungsmitteln herkömmlicherweise beinhaltet sind, und der Geschmack sowie die Verwendung entsprechen vollständig dem Geschmack und der Verwendung der herkömmlichen Produkte.
  • Somit stellt das erfindungsgemäße zweistufige Verfahren ein Produkt zur Verfügung, das einen erheblich höheren Anteil an einem antihypertensiven Peptid als die Produkte, die nur durch Fermentation hergestellt wurden, aufweist. Das Verfahren ermöglicht es, außer dem Peptidgehalt zudem ebenso einfach die Gehalte der Salze und deren wechselseitige Verhältnisse auf ein gewünschtes Niveau anzupassen. Es ist insbesondere möglich, den Gehalt der gewünschten divalenten Ionen anzuheben und den Gehalt an schädlichen monovalenten Ionen zu senken. Das Verfahren ist einfach und kostengünstig, zudem ist es für eine Produktion in großem Umfang gut geeignet; in diesem Punkt unterscheidet es sich von den Verfahren des Standes der Technik.
  • Überdies sollte festgehalten werden, dass die durch die Abspaltung von Casein oder des gesamten Proteins erhaltene Proteinfraktion entsprechend bei der Herstellung von antihypertensiven Produkten verwendet werden kann, wie zum Beispiel bei den obenstehend beschriebenen Milchprodukten oder Würsten. Daher ist das Verfahren insgesamt sehr ökonomisch.
  • Im Folgenden wird die Erfindung durch die Beispiele ausführlicher beschrieben werden. Diese Beispiele dienen jedoch lediglich der Erläuterung der Erfindung und sollen ihren Schutzumfang in keinster Weise einschränken.
  • Referenzbeispiel 1
  • Antihypertensive Wirkung des erfindungsgemäßen Produktes
  • Die ACE-inhibitorische Aktivität wurde für die Peptide IPP und VPP sowie für einen bekannten ACE-Inhibitor, Lisinopril, auf der Basis der sogenannten Inhibitorkonstante (Holmquist B., Bunning P., Riordan J. F., „A continuous spectrophotometric assay for Angiotensin converting enzyme", Analytical Biochemistry 95 (1979) 540-548) bestimmt. Je kleiner die Zahl war, desto wirksamer war der ACE-Inhibitor. Die Ergebnisse waren wie folgt: IPP 4,4 × 10–6, VPP 1,8 × 10–5 und Lisinopril 7,5 × 10–9. Es wurde daher festgestellt, dass IPP und VPP eine deutliche ACEinhibitorische Aktivität aufweisen.
  • Die antihypertensive Wirkung des erfindungsgemäßen Produktes wurde untersucht, indem die in Beispiel 5 beschriebenen erfindungsgemäßen Sauermilchprodukte an spontan hypertensive SHR Ratten von Geburt an verfüttert wurden. Die Kontrollen bestanden aus drei entsprechenden Gruppen von Ratten, an die Wasser, Milch beziehungsweise im Handel erhältliche Sauermilch verfüttert wurde. Als Referenz diente eine entsprechende Rattengruppe, der das japanische Calpis Sauermilchprodukt gefüttert wurde (von Calpis Food Industry Company Ltd.). Der Blutdruck von allen Ratten wurde 13 Wochen lang 1 mal wöchentlich gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 als Anstieg des systolischen Druckes als eine Funktion der Zeit dargestellt. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass das erfindungsgemäße Produkt in der Lage ist, ein deutliches Ansteigen des Blutdrucks zu vermeiden, sowohl im Vergleich mit den Kontrollgruppen als auch mit der Referenzgruppe.
  • Referenz Beispiel 2
  • Antihypertensive Wirkung des erfindungsgemäßen Produktes
  • Die antihypertensive Wirkung des erfindungsgemäßen Produktes wurde ebenfalls am Menschen untersucht. Bei einem Vorversuch bestand die Testgruppe aus 12 willkürlich ausgewählten Personen, die täglich 1,5dl des in Beispiel 5 beschriebenen erfindungsgemäßen Produktes zu sich nahmen, und die Kontrollgruppe bestand aus 11 willkürlich ausgewählten Personen, die die gleiche Menge von im Handel erhältlicher fettfreier Sauermilch zu sich nahmen. Der Blutdruck wurde 8 Wochen lang in einwöchigen Intervallen gemessen. Der Blutdruck von acht Personen der Testgruppe war deutlich reduziert: der systolische Druck um durchschnittlich etwa 13% und der diastolische Druck um durchschnittlich etwa 12%, bei einer Person wurde eine geringe Verringerung des Blutdrucks festgestellt, um weniger als 5%, und bei drei Personen wurden keine Veränderungen festgestellt. Bei der Kontrollgruppe wurde bei zwei Personen eine deutliche Senkung des Blutdrucks festgestellt, wohingegen sieben Personen keine Veränderungen aufwiesen. Die Ergebnisse von zwei Personen wurden verworfen. Die Ergebnisse dieses Vorversuches zeigen daher deutlich, dass das erfindungsgemäße Produkt in der Lage ist, das Ansteigen des Blutdrucks bei Menschen zu verhindern.
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines antihypertensiv-wirkende Peptide enthaltenden Produktes
  • Der Stamm Lactobacillus helveticus LBK 16-H wurde in einer MRS-Nährlösung bei einer Temperatur von 37°C 24 Stunden lang kultiviert und zur Herstellung eines Inokulums in wieder hergestellte Milch (10 %) inokuliert. Nach zwei Kultivierungsrunden wurde das Inokulum (15 %) in einem Fermentierungsmedium aus 9 bis 10 % Milch, die aus fettfreiem Milchpulver hergestellt wurde, und die 10 Minuten bei 100°C sterilisiert wurde, inokuliert. Die Fermentation wurde bei 37°C 22 bis 24 Stunden unter andauerndem starken Mischen durchgeführt. Das Produkt kann getrocknet und pulverisiert werden oder als solches der Nanofiltrationsbehandlung übergeben werden.
  • Der pH-Wert der auf die obenstehende Weise erhaltenen fermentierten Sauermilch wurde auf mit KOH etwa 4,6 erhöht, und das, Casein wurde mit einem Schrägsieb entfernt. Rückständiger Caseinstaub wurde durch Klären mittels einer Zentrifuge entfernt. GLL Conc. Lactase (Biocon Ltd., Japan) wurde der Molke hinzugefügt und es wurde bei 5°C 24 Stunden lang hydrolysieren gelassen, damit die Laktose zu Monosacchariden abgebaut wird. Die auf diese Art vorbehandelte Molke wurde durch eine Nanomax-50 Membrane (Millipore) nanofiltriert.
  • Die Filtration wurde bei 40°C mit einem Druck von 30 bar durchgeführt. Die Molke wurde auf ein volumerischen Konzentrationsverhältnis von 9 filtriert. Die Zusammensetzung des erhaltenen Konzentrats und des getrockneten daraus hergestellten Pulvers sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2 Zusammensetzung eines Konzentrats und eines getrockneten das antihypertensiv-wirkende Peptid enthaltenden Pulvers
    Figure 00170001
  • Das entfernte Casein wurde zu Caseinat neutralisiert und getrocknet.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines antihypertensiv-wirkende Peptide enthaltenden Produktes
  • Die in Beispiel 1 beschriebene Fermentation wurde unter Verwendung von (a) Fett-enthaltender Milch und (b) Buttermilch anstatt der fettfreien Milch wiederholt.
  • Der pH-Wert des Produktes aus Beispiel 2 (b) wurde auf etwa 4,5 angehoben und das Casein wurde mittels einer Abtrennvorrichtung für geronnene Bestandteile entfernt. Lactase wurde der Molke hinzugefügt und der Staub wurde mittels einer Bactofuge entfernt. Die Molke wurde danach durch eine NF Membran (Desal-5, Desal Inc.) nanofiltriert, verdampft und getrocknet. Die Zusammensetzung des erhaltenen Nanofiltrationskonzentrates war derjenigen, die in Tabelle 2 dargestellt ist, sehr ähnlich.
  • Das entfernte Casein umfasst große Mengen an Molke, deren Gehalt an antihypertensiv-wirkenden Peptiden demjenigen von fermentierten Sauermilchprodukten entspricht. Das Casein wurde für sich in Quark verwendet, in den auf diese Weise antihypertensiv-wirkende Peptide eingebracht wurden.
  • Beispiel 3
  • Herstellung eines antihypertensiv-wirkende Peptide enthaltenden Produktes
  • Der Stamm Lactobacillus helveticus LBK 16-H wurde in MRS-Nährlösung bei 37°C 24 Stunden lang kultiviert, um ein Inokulum, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu erzeugen. Das Inokulum wurde in ein Fermentationsmedium inokuliert, das aus einer wässrigen Caseinlösung bestand, die mit Säure (2, 8 %) und Glukose (2, 5 %) präzipitiert wurde. Das Casein wurde aufgelöst, indem der pH-Wert mit 10% KOH auf 6,7 angehoben wurde. Die Kultivierung wurde bei 37°C 24 Stunden lang durchgeführt. Bei dem Produkt war es möglich, antihypertensiv-wirkende Peptide (VPP, IPP) in Mengen, die denen, die bei der Fermentation von Milch entstehen, entsprechen, zu produzieren, dabei war es jedoch einfacher, die Peptide von der Caseinlösung zu trennen als von Milch.
  • Der pH-Wert der Fermentationslösung wurde mit KOH, bei einer Temperatur von 37°C auf 4,6 angehoben, wobei das Casein präzipitierte. Das Casein wurde mittels einer Abtrennvorrichtung für geronnene Bestandteile abgetrennt, und die erhaltene Molke wurde rückgewonnen. Die Molke enthält Peptide, Milchsäure und Salze, jedoch keine Laktose. Der Hauptteil der Milchsäure und der monovalenten Salze und der Glukoserückstände der Molke können durch Nanofiltration entfernt werden. Das Nanofiltrationsretentat kann zu einem Konzentrat verdampft werden oder zu Pulver eingetrocknet werden, wobei eine stark konzentrierte und lange haltbare Präparation mit antihypertensiv-wirkenden Peptiden erhalten wird.
  • Beispiel 4
  • Herstellung eines antihypertensiv-wirkende Peptide enthaltenden Produktes
  • Die Fermentation wurde unter Verwendung von (a) einer Mischung von mehreren Stämmen, d.h. L. helveticus LB161, L. helveticus LBK-16 H und L. helveticus LB230, (b) einer Mischung der Stämme L. helveticus LBK-16 H und L. rhamnosus LC705, und (c) einer Mischung der Stämme L. helveticus LBK-16 H und Streptococcus thermophilus T101 wiederholt. Alle diese Stämme sind aus der Sammlung von Mikroorganismen von Valio Oy erhältlich.
  • Das verwendete Kultivierungsmedium war 9% Milch, die 15 Minuten lang bei 100°C sterilisiert wurde. Zur Herstellung von Inokula wurden die L. helveticus Stämme und L. rhamnosus LC705 24 Stunden lang bei 37°C in MRS-Nährlösung, von der 1% Inokulum in Milch eingebracht wurde, kultiviert. Str. thermophilus T101 wurde in LM17 Nährlösung 18 Stunden lang bei 37°C kultiviert, woraus ein Inokulum in Milch eingebracht wurde.
  • Die erste Kultivierung wurde durchgeführt, indem alle Stämme einzeln in Milch kultiviert wurden, Inkubation 24 Stunden lang bei 37°C. Für die zweite Kultivierung wurde 1% der Stämme in jeder Mischung in Milch pipettiert, wonach eine Cokultivierung 24 Stunden lang bei 37°C durchgeführt wurde. Für die dritte Kultivierung wurden 5 bis 10% der zuvor erhaltenen Cokultivierung in Milch pipettiert und bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert.
  • Die durch den Stamm L. helveticus LBK-16H und den verschiedenen Mikrobenmischungen produzierten Mengen an VPP und IPP sowie die Konzentration von einigen der Bakterien sind in Tabelle 3 dargestellt. Zwischen den Mischungen oder dem puren LBK-16H Stamm wurden keine Unterschiede beobachtet, aber auch die anderen Stämme wirkten nicht in die Proteolyse ein.
  • Tabelle 3 IPP und VPP Mengen, die durch Mikrobenmischungen erzeugt wurden
    Figure 00210001
  • Beispiel 5
  • Herstellung eines fermentierten Milchproduktes
  • Eine antihypertensiv-wirkende Peptide-enthaltende Sauermilch wurde durch das Hinzufügen von 3,5% des Peptidkonzentrats, das wie in Beispiel 3 erhalten wurde, zu im Handel erhältlicher Sauermilch hergestellt. Die Zusammensetzung des erhaltenen Produktes ist in Tabelle 4 dargestellt, die zum Vergleich zudem die Zusammensetzung des im Handel erhältlichen Sauermilchproduktes, AB Sauermilch von Valio Oy, zeigt.
  • Tabelle 4 Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Produktes sowie Zusammensetzung eines im Handel erhältlichen fermentierten Milchproduktes
    Figure 00220001

Claims (23)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Produktes, das antihypertensiv-wirkende Peptide enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es den Schritt der Fermentierung eines Casein-enthaltenden Ausgangsmaterials mit einem Milchsäurebakterium, den Schritt der Durchführung einer Nanofiltration des erhaltenen Peptid-enthaltenden Fermentationsproduktes, sowie den Schritt der Rückgewinnung des Retentats umfasst.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsmaterial Casein ist.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsmaterial Milch oder ein auf Milch basierendes Produkt ist.
  4. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung eines Milchsäurebakteriums und weiteren Mikroben bei der Fermentation verwendet wird.
  5. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Lactobacillus helveticus bei der Fermentation verwendet wird.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus der Stamm Lactobacillus helveticus LBK-16H ist.
  7. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es vor der Nanofiltration zusätzlich einen Schritt der Entfernung von Casein aus dem fermentierten Produkt umfasst.
  8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es vor der Nanofiltration zusätzlich einen Schritt der Entfernung aller Milchproteine aus dem Fermentationsprodukt umfasst.
  9. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es vor der Nanofiltration zusätzlich einen Schritt der Entfernung von Laktose aus dem Fermentationsprodukt umfasst.
  10. Ein Produkt, das antihypertensiv-wirkende Peptide enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es einen hohen Gehalt an antihypertensiv-wirkenden Peptiden aufweist und durch ein Verfahren hergestellt wird, in dem ein Casein-enthaltendes Ausgangsmaterial mit einem Milchsäurebakterium fermentiert wird und wobei eine Nanofiltration an dem erhaltenen Peptid-enthaltenden Fermentationsprodukt durchgeführt wird und das Retentat rückgewonnen wird.
  11. Das Produkt gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide eine Mischung aus kurzkettigen Peptiden umfassen.
  12. Das Produkt gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide di- oder tri-Peptide sind.
  13. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es einen hohen Gehalt an Tripeptiden aufweist, insbesondere an Ile-Pro-Pro und/oder Val-Pro-Pro.
  14. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es einen hohen Gehalt an divalenten Kationen aufweist.
  15. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es einen niedrigen Gehalt an monovalenten Kationen aufweist.
  16. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an Trockenmasse von etwa 20 bis 60 % aufweist.
  17. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es zu Pulver getrocknet wird und einen Trockenmassegehalt aufweist, der 90% übersteigt.
  18. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17, zur Verwendung als ein antihypertensiv-wirkendes Mittel.
  19. Das Produkt gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17, zur Verwendung bei der Herstellung von essbaren Substanzen.
  20. Das Produkt gemäß Anspruch 19, zur Verwendung in der Milchindustrie, Getränkeindustrie, Nahrungsmittel-Weiterverarbeitungs-Industrie, Fleisch-Weiterverarbeitungs-Industrie, Backindustrie und Konditoreiindustrie.
  21. Essbares Produkt; dadurch gekennzeichnet, dass es das Produkt wie in einem der Ansprüche 10 bis 20 beansprucht umfasst.
  22. Das essbare Produkt gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es ein fermentiertes Milchprodukt ist.
  23. Das essbare Produkt gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Getränk ist, bevorzugt ein Molkegetränk, ein Fruchtsaftgetränk oder ein Bier.
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