-
Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Reinigung von Hyaluronsäure mit hohem Molekulargewicht
oder eines Salzes davon.
-
Hyaluronsäure ist ein Mucoid-Polysaccharid
biologischen Ursprungs, welches in der Natur weit verbreitet ist.
Zum Beispiel ist bekannt, dass Hyaluronsäure in verschiedenen tierischen
Geweben wie Nabelschnur, Synovialfluid, Glaskörperflüssigkeit, Hahnenkamm und verschiedenen
Bindegeweben wie Haut und Knorpel vorhanden ist.
-
Chemisch ist Hyaluronsäure ein
Vertreter der Glycosaminglycane und sie ist aufgebaut aus abwechselnden
und wiederkehrenden Einheiten von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin,
wodurch eine lineare Kette gebildet wird, die ein Molekulargewicht
von bis zu 13 × 106 Dalton hat.
-
In der Bedeutung der vorliegenden
Erfindung ist Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht
von nicht weniger als etwa 0,5 × 106 Dalton.
-
Es soll angemerkt sein, dass der
Begriff "Hyaluronsäure" in der vorliegenden
Beschreibung und den Patentansprüchen
indifferent Hyaluronsäure
in ihrer Säureform
oder in ihrer Salzform, wie zum Beispiel Natriumhyaluronat, Kaliumhyaluronat,
Magnesiumhyaluronat, Calciumhyaluronat oder andere, bedeuten kann.
-
Hyaluronsäure ist bei hohem Molekulargewicht
viskos und in der Lage, einen gelartigen Zustand beizubehalten,
wodurch sie als Schmiermittel dient, das Eindringen von Bakterien
verhindert und Wasser zurückhält.
-
Wegen dieser Eigenschaften ist Hyaluronsäure in der
Lage, die Tonizität
und Elastizität
der Haut aufrechtzuhalten.
-
Die pharmazeutische Verwendung von
Hyaluronsäure
oder eines Salzes davon ist in der Literatur in breitem Umfang beschrieben.
-
Da Hyaluronsäure eine nicht-immunogene Substanz
ist und viskoelastische und hydrophile Eigenschaften hat, wird sie
seit mehreren Jahren als ein Augenglaskörper- oder Gelenkfluid-Ersatz oder als ein
Trägermedium
in der Augenchirurgie verwendet, wie es zum Beispiel in der US-A-4
141 973 von Balazs beschrieben wird.
-
In Gelenkfluiden dient die viskose
Hyaluronsäure
als Schmiermittel, um eine schützende
Umgebung für
die Zellen vorzusehen, und aus diesem Grund wird sie bei der Behandlung
von entzündeten
Kniegelenken verwendet.
-
Die EP-A-0 781 547 von Chemedica
S. A. offenbart eine auf Natriumhyaluronat basierende phthalmische
Formulierung zur Verwendung in der Augenchirurgie.
-
Die EP-A-0 719 559 von Chemedica
S. A. offenbart viskose Natriumhyaluronat-Lösungen zur Verwendung als Maskierungsfluid
in der therapeutischen Photokeratektomie mittels Excimer-Laser.
-
Die EP-A-0 875 248 von Chemedica
S. A. offenbart die Verwendung von Hyaluronsäure oder eines ihrer pharmazeutisch
annehmbaren Salze für
die Herstellung einer wässrigen
Lösung,
nützlich
als intra-artikuläre
Spülungsflüssigkeit.
-
Die EP-A-0 698 388 von Chemedica
S. A. offenbart eine ophthalmische Präparation zur Verwendung als
künstliche
Tränen,
enthaltend Hyalwonat als einen Viskositäts-Verdicker.
-
Dank ihrer stark hydrophilen Natur
kann Hyaluronsäure
auch in kosmetischen Produkten wie Lotionen und Cremes verwendet
werden.
-
Die pharmazeutische Verwendung von
Hyaluronsäure
oder eines Salzes davon erfordert ein hoch reines Produkt.
-
Hyaluronsäure kann zum Beispiel aus Nabelschnüren, aus
Hahnenkämmen
oder aus Gruppe-A-
und C-Streptococcen extrahiert und gereinigt werden, wie zum Beispiel
beschrieben in US-A-4 141 973 von Balazs und US-A-5 559 104 von
Romeo et al.
-
Die Herstellung von Hyaluronsäure durch
Streptococcen wurde zuerst 1937 von Forrest et al. (J. Biol. Chem.
118, 61 (1937)) offenbart, und später wurde gezeigt, dass Hyaluronsäure aus
einer tierischen Quelle identisch zu Hyaluronsäure aus einer mikrobiellen
Quelle ist.
-
Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure aus
einer mikrobiellen Quelle basieren auf der Eigenschaft von Streptococcen,
Hyaluronsäure
als Hauptkomponente ihrer Kapseln aufzuweisen.
-
Solche Mikroorganismen sind in der
Lage, die in ihrer Umgebung vorhandene Glucose zu D-Glucuronsäure und
N-Acetyl-D-glucosamin umzuwandeln und Hyaluronsäure als einen sekundären Metaboliten
herzustellen, um ihre Schutzkapseln aufzubauen.
-
Die Biosynthese von Hyaluronsäure durch
Streptococcen wird zum Beispiel in der US-A-4 897 349 von Swann et al. offenbart.
-
Eine Anzahl von Verfahren ist bekannt,
um Hyaluronsäure
von pharmazeutischem Reinheitsgrad oder ein Natriumsalz davon aus
mikrobiellen Quellen zu erhalten.
-
Zum Beispiel offenbaren die US-A-4
780 414 von Nimrod et al., US-A-4 517 295 von Bracke et al., und US-A-5
563 051 von Ellwood et al. Verfahren zum Gewinnen von Hyaluronsäure durch
kontinuierliche Fermentation von Streptococcus-Bakterien und dann
Reinigen der so erhaltenen Hyaluronsäure zu einem pharmazeutischem
Reinheitsgrad.
-
Allerdings beteiligt in allen diesen
Verfahren die Reinigung von Hyaluronsäure die Fällung von Hyaluronsäure aus
einer mikrobiellen Quelle unter Verwendung grosser Mengen von organischen
Lösungsmitteln, wie
Ethanol, Aceton, Isopropanol etc.
-
Es sind einige Reinigungsverfahren
bekannt, in denen die Präzipitation
von Hyaluronsäure
aus einer mikrobiellen Quelle mittels quaternären Ammoniumsalzen (US-A-4
517 295 von Bracke et al.) oder mittels anionischer und kationischer
Tenside (US-A-5 316 926 von Brown et al.) erfolgt.
-
Jedoch sind die beschriebenen Vorgehensweisen
ziemlich komplex und führen
zu hohen Produktionskosten.
-
Die EP-A-0 694 616 offenbart ein
Verfahren zur Reinigung von Hyaluronsäure aus einer Streptococcus zooepidemicus-Fermentations-Nährlösung, umfassend
einen Schritt des Einstellens des pH-Werts der Fermentations-Nährlösung auf
einen pH von 3,5; einen Schritt der Filtration; einen Schritt des
Entfernens von Zellen aus der Hyaluronsäure-haltigen Lösung; und
einen Schritt der Sterilisation.
-
Es sind einige Reinigungsverfahren
bekannt, worin eine Hyaluronsäure-Lösung unter
Verwendung eines Filters mit einem nominellen Molekulargewichts-Ausschluss
von 10 000, 20 000 oder 30 000 Dalton diafiltriert wird, wie offenbart
zum Beispiel in US-A-5 563 051 von Ellwood et al. und US-A-4 517
295 von Bracke et al.
-
Wegen des verwendeten kleinen Nominal-Molekulargewichts-Ausschlusses
können
diese Diafiltrations-Vorgehensweisen jedoch nur verwendet werden,
um kleine lösliche
Moleküle
zu entfernen, und die diafiltrierte Hyaluronsäure-Lösung muss durch weitere Verarbeitung
behandelt werden, wobei verschiedene Präzipitations-Systeme beteiligt
sind, welche das ganze Reinigungsverfahren komplex machen.
-
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung
besteht darin, eine Hyalwonsäure
mit hohem Molekulargewicht von pharmazeutischem Reinheitsgrad oder
ein Salz davon aus irgendeiner biologischen Quelle, insbesondere aus
mikrobiellen Quellen, in hoher Ausbeute bei relativ geringen Kosten
und vorzugsweise ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel
oder anderer zugesetzter Substanzen zu erhalten.
-
Gemäss der vorliegenden Erfindung
ist dieses Ziel durch ein Verfahren zur Reinigung von Hyaluronsäure mit
hohem Molekulargewicht aus einer biologischen Quelle erreicht worden,
welches gekennzeichnet ist durch:
- a) einen
Schritt der Einstellung des pH-Werts einer wässrigen Lösung, enthaltend hochmolekulargewichtige Hyalwonsäure aus
einer biologischen Quelle, auf einen pH im Bereich von 1,7 bis 3,3
und dann des Diafiltrierens der wässrigen Lösung beim gleichen pH-Wert
unter Verwendung eines Filters mit einer Porengrösse im Bereich von 100 000
Dalton Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss bis zu 0,45 μm;
- b) einen Schritt des Entfernens von Zellen aus der wässrigen
Lösung,
enthaltend hochmolekulargewichtige Hyalwonsäure aus einer biologischen
Quelle, wobei der Schritt entweder vor dem Schritt a) oder nach
dem Schritt a) durchgeführt
wird;
- c) einen Sterilisationsschritt.
- Mittels eines Verfahrens, das einen Schritt der Diafiltration
bei einem pH-Wert im Bereich von 1,7 bis 3,3 und einen Schritt des
Entfernens von Zellen einschliesst, ist es vorteilhaft möglich, Hyaluronsäure von
hohem Molekulargewicht so zu reinigen, dass eine Hyaluronsäure mit
hohem Molekulargewicht oder ein Salz davon von pharmazeutischem
Reinheitsgrad in hoher Ausbeute aus irgendeiner biologischen Quelle
und insbesondere aus einer mikrobiellen Quelle erhalten wird.
-
Gemäss Schritt a) des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung wird Hyaluronsäure bei einem Nominal-Molekulargewicht-Ausschluss
oder einer Porengrösse
diafiltriert, welche das Zurückführen der
Hyaluronsäure
und den Durchtritt aller in der Lösung oder Nährlösung enthaltenen Substanzen
gestattet.
-
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
kann unter Verwendung irgendeiner biologischen Quelle von Hyaluronsäure durchgeführt werden.
-
Vorteilhafterweise kann Hyaluronsäure von
pharmazeutischem Reinheitsgrad durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung ohne Spuren organischer Lösungsmittel oder anderer zugegebener
Substanzen erhalten werden, da im Reinigungsverfahren der vorliegenden
Erfindung Hyaluronsäure
nicht mit organischen Lösungsmittelen
oder anderen Substanzen gefällt
wird, sondern während
des ganzen Verfahrens in wässriger Lösung gehalten
wird.
-
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile
der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung offensichtlich.
-
Hyaluronsäure aus einer beliebigen biologischen
Quelle kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung bis zu
einem pharmazeutischen Reinheitsgrad gereinigt werden.
-
Zum Beispiel kann die wässrige Hyaluronsäure-Lösung, enthaltend
Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht, welche zuerst entweder gemäss Schritt
a) der vorliegenden Erfindung oder gemäss Schritt b) der vorliegenden
Erfindung behandelt wird, eine wässrige,
Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht enthaltende Lösung sein, welche durch Extraktion
aus Nabelschnur, Hahnenkamm oder anderen erhalten wird.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die wässrige
Hyaluronsäure-Lösung, welche zuerst
entweder gemäss
Schritt a) oder gemäss
Schritt b) behandelt wird, jedoch eine wässrige, Hyaluronsäure von
hohem Molekulargewicht aus einer mikrobiellen Quelle enthaltende
Nährlösung.
-
Die mikrobielle Quelle ist vorzugsweise
eine Streptococcus-Spezies, welche Hyaluronsäure von hohem Molekulargewicht
herstellt, und weiter bevorzugt wird die mikrobielle Quelle aus
Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi und Streptococcus
pyogenes gewählt.
-
Eine Nährlösung, welche Hyaluronsäure von
hohem Molekulargewicht enthält,
kann durch irgendein gut bekanntes Verfahren, einschliesslich Fermentation
einer Streptococcus-Kultur, welche Hyaluronsäure von hohem Molekulargewicht
herstellt, in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen
hergestellt werden. Solche Verfahren werden zum Beispiel offenbart
in der US-A-4 780 414 von Nimrod et al., US-A-5 563 051 von Ellwood
et al. oder US-A-5 316 916 von Brown et al.
-
Das Verfahren zur Herstellung eines
wässrigen
Nährmediums,
enthaltend Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht gemäss
der vorliegenden Erfindung, kann beispielsweise das folgende sein:
-
Am Ende eines gewöhnlichen Fermentations-Verfahrens
wird das Hyaluronsäure
enthaltende Nährmedium
mit einem pH-Wert von etwa 7,4 geerntet und in einen Tank überführt, der
mit einer automatischen Temperatur-Regeleinrichtung ausgerüstet ist.
-
Die Temperatur wird auf einem Wert
im Bereich von 15°C
bis 25°C,
vorzugsweise 20°C,
gehalten.
-
Die so erhaltene wässrige Hyaluronsäure-Lösung oder
-Nährlösung kann
dann gemäss
des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
-
Die Diafiltration gemäss Schritt
a) der vorliegenden Erfindung einer Lösung von Hyaluronsäure aus
einer biologischen Quelle bei einem pH-Wert im Bereich von 1,7 bis
3,3 unter Verwendung eines Filters mit einer Porengrösse im Bereich
von 100 000 Dalton Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss
bis zu 0,45 μm,
führt zur Entfernung
aller Proteine und anderen löslichen
Materialien, die in der wässrigen
Lösung
vorhanden sind.
-
Es wird angenommen, dass wenn der
pH-Wert eine Hyaluronsäure-Lösung im
Bereich von 1,7 bis 3,3 eingestellt wird, eine Art reversibler Vernetzung
stattfindet, in welcher die Hyaluronsäure-Moleküle ein Netzwerk bilden, das
unter anderen pH-Bedingungen zerbrochen werden kann.
-
Im pH-Bereich von 1,7 bis 3,3 ist
das Netzwerk in der Lage, von dem Filter zurückgehalten zu werden, der eine
Porengrösse
im Bereich von 100 000 Dalton Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss bis zu
0,45 μm aufweist,
wohingegen Proteine und andere Materialien durch den Filter hindurchtreten,
wodurch es möglich wird,
Hyaluronsäure
von jeglichen in der Lösung
enthaltenen löslichen
Substanzen zu trennen.
-
Im Schritt a) wird der pH der wässrigen
Lösung
vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von 2,0 bis 2,7 eingestellt,
und dann wird diese Lösung
beim gleichen pH-Wert diafiltiert.
-
Weiter bevorzugt wird im Schritt
a) der pH-Wert der wässrigen
Lösung
auf einen Wert im Bereich von 2,3 bis 2,7 eingestellt, und dann
wird diese Lösung
beim gleichen pH-Wert diafiltiert.
-
Im Schritt a) wird der pH-Wert vorzugsweise
mittels einer wässrigen
HCl-Lösung
eingestellt.
-
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung, worin der Schritt b) des Entfernens
von Zellen nach dem Diafiltrationsschritt a) durchgeführt wird,
wird der pH-Wert der wässrigen
Hyaluronsäure-Lösung oder
-Nährlösung, erhalten
aus einer biologischen Quelle, zuerst auf einen Wert im Bereich
von 1,7 bis 3,3, vorzugsweise 2,5–2,6, vorzugsweise mit einer
wässrigen
HCl-Lösung
eingestellt.
-
Bei diesem pH-Wert wird die wässrige Hyaluronsäure-Lösung oder
-Nährlösung zu
einer sehr viskoelastischen wässrigen
Lösung
oder Nährlösung umgewandelt,
welche Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht in einer Netzwerk-Anordnung enthält.
-
Die so erhaltene wässrige Lösung oder
Nährlösung, welche
Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht enthält,
wird dann vorzugsweise gemäss
eines Querstrom-Diafiltrations-Verfahrens
diafiltriert, während der
gleiche pH-Wert während
des gesamten Diafiltrationsschritt beibehalten wird.
-
Im Schritt a) des Reinigungsverfahrens
gemäss
der ersten bevorzugten Ausführungsform
hat ein Filter besonders bevorzugt eine Porengrösse von 0,2 μm.
-
Im Diafiltrationsschritt a) wird
die viskoelastische wässrige
Lösung
oder Nährlösung, enthaltend
Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht, in einen Querstrom-Filterhalter gepumpt,
der mit einer geeigneten Anzahl von Filterpatronen mit einer Porengrösse im Bereich
von 100 000 Dalton Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss bis zu einer
Porengrösse
von 0,45 μm,
vorzugsweise einer Porengrösse
von 0,2 μm,
ausgestattet ist, und dann wird pyrogenfreies destilliertes Wasser
in den Tank, der die viskoelastische wässrige, Hyaluronsäure mit
hohem Molekulargewicht enthaltende Lösung enthält, bei der gleichen Fliessgeschwindigkeit
zugegeben wie das abfliessende Filtrat, so dass ein konstantes Volumen
beibehalten wird.
-
Im Schritt a) des Reinigungsverfahrens
gemäss
der ersten bevorzugten Ausführungsform
wird die viskoelastische wässrige
Lösung
oder Nährlösung, enthaltend
Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht, vorzugsweise diafiltriert, bis das Filtrat,
das verworfen wird, eine optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 280
nm gleich oder weniger als 0,02 aufweist. In die sem Fall sollte
die optische Dichte des Filtrats bei dieser Wellenlänge während des
gesamten Diafiltrations-Verfahrens überwacht werden.
-
Gemäss der ersten bevorzugten Ausführungsform
schliesst sich an den Schritt a) der Diafiltration ein Schritt b)
des Entfernens von Zellen an, vorzugsweise ein Schritt b) der Zentrifugation
zur Entfernung jeglicher Zellen oder Proteine, die noch in der diafiltrierten
Lösung
oder Nährlösung vorhanden
sind.
-
Im Falle einer mikrobiellen Quelle,
kann der Schritt der Zentrifugation zum Beispiel das Einstellen
des pH der diafiltrierten Nährlösung auf
einen pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 5,0, vorzugsweise 4,0, und
dann des Zentrifugierens der diafiltrierten wässrigen Nährlösung umfassen, wodurch ein Überstand
erhalten wird, der Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht enthält.
-
Vorzugsweise wird der pH-Wert der
diafiltrierten Nährlösung mittels
einer wässrigen
NaOH-Lösung eingestellt.
Allerdings könnten
andere basische wässrige
Lösungen
ebenfalls verwendet werden.
-
Gemäss der ersten bevorzugten Ausführungsform
schliesst sich an den Schritt b) des Entfernens von Zellen ein Schritt
c) der Sterilisation an.
-
Gemäss einer zweiten bevorzugten
Ausführungsform
wird der Schritt b) des Entfernens von Zellen vor dem Diafiltrationsschritt
a) durchgeführt.
-
In der zweiten bevorzugten Ausführungsform
ist der Schritt b) des Entfernens von Zellen vorzugsweise ein Querstrom-Diafiltrationsschritt
zum Entfernen von Zellen.
-
In dem Diafiltrationsschritt zum
Entfernen von Zellen b), wird der pH-Wert der wässrigen Hyaluronsäure-Lösung oder
-Nährlösung, erhalten
aus einer biologischen Quelle, zuerst auf 3,5, vorzugsweise mit
einer wässrigen
HCl-Lösung,
eingestellt, und dann wird die so erhaltene wässrige Lösung oder Nährlösung beim gleichen pH-Wert
unter Verwendung eines Filters mit einer Porengrösse von 0,2 μm diafiltriert.
-
Im Diafiltrationsschritt b) zum Entfernen
von Zellen wird die wässrige
Lösung
oder Nährlösung, welche Hyaluronsäure mit
hohem Molekulargewicht enthält,
in einen Querstrom-Filterhalter
gepumpt, der mit einer geeigneten Anzahl von Filterpatronen mit
einer Porengrösse
von 0,2 μm
ausgestattet ist; und dann wird pyrogenfreies destilliertes Wasser
in den Tank, der die wässrige,
Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht enthaltende Lösung oder Nährlösung enthält, bei der gleichen Fliessgeschwindigkeit
zugegeben wie das abfliessende Filtrat, damit ein konstantes Volumen
beibehalten wird.
-
Bei diesem pH-Wert erlaubt der Filter
mit der Porengrösse
0,2 μm das
Zurückhalten
von Zellen und den Durchtritt von Hyaluronsäure durch den Filter.
-
Im Schritt b) des Reinigungsverfahrens
gemäss
der zweiten bevorzugten Ausführungsform
wird die Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht enthaltende wässrige Lösung vorzugsweise diafiltriert,
bis 10 Äquivalentvolumen
steriles pyrogenfreies destilliertes Wasser zugegeben wurden.
-
Im Schritt a) der zweiten bevorzugten
Ausführungsform
wird der pH-Wert der in Schritt b) erhaltenen, im wesentlichen zellfreien,
wässrigen
Hyaluronsäurelösung zuerst
auf 1,7 bis 3,3, bevorzugt 2,4, vorzugsweise mit einer wässrigen
HCl-Lösung
eingestellt.
-
Bei diesem pH-Wert wird die wässrige Hyaluronsäurelösung zu
einer sehr viskoelastischen wässrigen Lösung umgewandelt,
welche Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht in einer Netzwerk-Anordnung enthält.
-
Die so erhaltene wässrige Lösung, welche
Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht enthält,
wird dann vorzugsweise gemäss
eines Querstrom-Verfahrens diafiltriert, während der gleiche pH-Wert während des
gesamten Diafiltrationsschritt beibehalten wird.
-
Im Schritt a) des Reinigungsverfahrens
der vorliegenden Erfindung gemäss
der zweiten bevorzugten Ausführungsform
hat ein Filter besonders bevorzugt einen Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss von 300 000
D.
-
Im Diafiltrationsschritt a) wird
die viskoelastische wässrige
Lösung,
enthaltend Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht, vorzugsweise in einen Filterhalter gepumpt,
der mit einer geeigneten Anzahl von Filterpatronen mit einer Porengrösse im Bereich
von 100 000 Dalton Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss bis zu einer
Porengrösse
von 0,45 μm,
vorzugsweise 300 000 D Nominal-Molekulargewicht-Ausschluss ausgestattet
ist, und konzentriert, und dann wird steriles pyrogenfreies destilliertes
Wasser in den Tank, der die konzentrierte viskoelastische, Hyaluronsäure mit
hohem Molekulargewicht enthaltende wässrige Lösung enthält, bei der gleichen Fliessgeschwindigkeit
zugegeben wie das abfliessende Filtrat, damit ein konstantes Volumen beibehalten
wird.
-
Im Schritt a) des Reinigungsverfahrens
der vorliegenden Erfindung gemäss
der zweiten bevorzugten Ausführungsform
wird die viskoelastische wässrige
Lösung,
enthaltend Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht, vorzugsweise diafiltriert, bis 15 Äquivalentvolumen
steriles pyrogenfreies destilliertes Wasser zugegeben wurden. Das
Filtrat, wird verworfen.
-
Bei der Anwendung der zweiten bevorzugten
Ausführungsform,
wird eine Zentrifugation vorteilhafterweise vermieden.
-
Gemäss der zweiten bevorzugten
Ausführungsform,
schliesst sich an den Schritt a) der Diafiltration ein Sterilisations-Schritt
c) an.
-
Der Schritt der Sterilisation gemäss der vorliegenden
Erfindung ist vorzugsweise ein Filtrier-Sterilisations-Schritt.
-
In der vorliegenden Erfindung kann
die Filtrier-Sterilisation gemäss
eines Standard-Sterilfiltrier-Verfahrens
durchgeführt
werden.
-
Gemäss der ersten bevorzugten Ausführungsform,
wird der Filtrier-Sterilisations-Schritt durch Einstellen des pH-Werts
des im Zentrifugationsschritt b) erhaltenen Überstands auf einen Wert von
7,0 und dann Filtrieren des Überstands
durch einen Filter mit einer Porengrösse von 0,2 μm durchgeführt.
-
Gemäss der zweiten bevorzugten
Ausführungsform
wird der Filtrier-Sterilisations-Schritt durchgeführt durch
Einstellen des pH der Hyaluronsäure
enthaltenden diafiltrierten Lösung,
erhalten in Schritt a), auf einen Wert von 7,0 und dann Filtrieren
der Lösung
durch einen Filter mit einer Porengrösse von 0,2 μm durchgeführt.
-
In diesen zwei bevorzugten Ausführungsformen,
wird der pH-Wert vorzugsweise mittels einer wässrigen NaOH-Lösung eingestellt.
Allerdings könnten
andere basische wässrige
Lösungen
verwendet werden.
-
Dann kann die sterile Lösung unter
Verwendung eines Filters mit 5000–10000 Dalton Nominal-Molekulargewichts-Ausschluss
konzentriert werden.
-
Nach der Konzentrierung, kann die
sterile Lösung
schliesslich gefriergetrocknet werden, um ein trockenes Pulver von
Hyaluronsäure
oder eines Salzes hiervon zu erhalten.
-
Die durch das Reinigungsverfahren
nach der vorliegenden Erfindung erhaltene Hyaluronsäure oder ein
Salz hiervon haben einen pharmazeutischen Reinheitsgrad, und die
Ausbeute beträgt
etwa 70–90
Gew.-% hinsichtlich des Hyaluronsäure-Gehalts in der Rohlösung.
-
Die durch das Reinigungsverfahren
der vorliegenden Erfindung erhaltene Hyaluronsäure oder das Salz hiervon ist
hinsichtlich der Abwesenheit von Pyrogenität und entzündlicher Aktivität bemerkenswert.
-
Die durch das Reinigungsverfahren
der vorliegenden Erfindung erhaltene Hyaluronsäure oder das Salz hiervon enthält zwischen
90 Gew.-% und 95 Gew.-% Hyaluronsäure, bestehend aus D-Glucuronsäure und
N-Acetyl-D-glucosamin in einem Verhältnis von 1 : 1, etwa 3 Gew.-%
bis 5 Gew.-% Wasser, weniger als 0,2 Gew.-% Proteine, weniger als
0,3 Gew.-% Nukleinsäuren
und weniger als 0,3 Gew.-% neutralen Zucker.
-
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
ist sehr einfach und sehr vorteilhaft vom ökonomischen und ökologischen
Gesichtspunkt, da keine andere Substanz als HCl oder NaOH beteiligt
sind.
-
Wenn das Reinigungsverfahren der
vorliegenden Erfindung angewandt wird, enthält die Hyaluronsäure oder
das Salz davon keine Spur von organischen Lösungsmitteln.
-
Die folgenden Beispiele des Verfahrens
zum Erhalten von hochmolekulargewichtiger Hyaluronsäure pharmazeutischer
Reinheit oder eines Salzes hiervon gemäss der vorliegenden Erfindung
sind nur aus Zwecken der Veranschaulichung angegeben, und mit ihnen
wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu beschränken.
-
Beispiele
-
Herstellung einer wässrigen
Nährlösung, enthaltend
Hyaluronsäure
mit hohem Molekulargewicht aus einer mikrobiellen Quelle Zellen
von Streptococcus equi wurden bei einer Temperatur von 37°C in einem
angemessenen Medium kultiviert, welches besteht aus:
Glucose | 60
g |
Soytone | 15
g |
Hefeextrakt | 5
g |
einwertiges
Kaliumphosphat | 2,5
g |
Magnesiumsulfat-Heptahydrat | 1,2
g |
gereinigtes
und pyrogenfreies Wasser | 1
Liter |
-
Zehn Liter dieses Mediums wurden
sterilisiert und mit einer 1–2%igen
Kultur von Streptococcus equi mit einer optischen Dichte (D) von
etwa 7, gemessen bei einer Wellenlänge von 650 nm, inokuliert.
-
Während
der Fermentierung wurde der pH-Wert der Nährlösung automatisch durch Zugabe
von 5 N NaOH bei 7,4 gehalten. Die Belüftung wurde bei 1 Volumen Luft
pro Volumen Medium pro Minute gehalten, und die Bewegung wurde während der
gesamten Fermentations-Dauer
bei 250 U/min gehalten.
-
Nach 20 Stunden wurde die Nährlösung geerntet
und in einen geeigneten Tank mit einer Volumenkapazität von 50
Litern überführt.
-
Reinigungsverfahren gemäss einer
ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
-
Unter kontinuierlichem Rühren wurde
der pH-Wert der wie obenstehend hergestellten Nährlösung mit 6 N HCl auf 2,5 eingestellt,
wodurch eine sehr viskose Nährlösung erhalten
wurde, welche als ein dicker Klumpen erscheint.
-
Die wässrige Nährlösung wurde dann in einen Querstromfilter-Halter
gepumpt, ausgestattet mit drei 0,2 μm Filter-Patronen, welche übereinander
angeordnet waren. Der verwendete Filter ist eine SARTOCON-Kassette,
Mod. Nr. 302 186 07 06 W-SG, hergestellt von SARTO-RIUS, mit einer Porengrösse von
0,2 μm.
-
Zum Beginn der Einspeisung der wässrigen
Nährlösung in
den Filter, wurde das Filtrat-Ventil geschlossen gehalten, um die
wässrige
Nährlösung mehrere
Minuten lang zu rezirkulieren, bis das System stabil war und keine
Blasen im Retentat vorhanden waren.
-
Das Filtratventil wurde dann geöffnet und
steriles pyrogenfreies destilliertes Wasser wurde kontinuierlich
in den Tank, der die wässrige
Nährlösung enthält, bei
der gleichen Fliessgeschwindigkeit zugegeben wie das abfliessende
Filtrat, damit ein konstantes Volumen der wässrigen Nährlösung beibehalten wird. Der
Eingangsdruck wird im Bereich von 1 bis 3 Bar, vorzugsweise bei
2 Bar gehalten.
-
Die Diafiltration wurde beendet,
als die Extinktion des Filtrats bei einer Wellenlänge von
280 nm 0,012 OD betrug. Das Filtrat wurde verworfen.
-
Der pH-Wert der diafiltrierten Nährlösung wurde
dann mit 5 N NaOH auf 4 eingestellt, und daraufhin wurde die Nährlösung bei
9000 U/min und bei 15°C
mit einer Kühlzentrifuge
zentrifugiert.
-
Der pH-Wert des Überstands wurde dann mit 5
N NaOH auf pH 7,0 eingestellt, und die Lösung wurde durch einen Filter
mit 0,2 μm
Porengrösse
filtriert, um die Lösung
gemäss
eines Standard-Filtrier-Sterilisationsverfahrens zu sterilisieren.
-
Die sterile Lösung wurde dann gemäss eines
Standardgefriertrocknungs-Verfahrens gefriergetrocknet, um ein trockenes
Pulver von Natriumhyaluronat zu erhalten.
-
In diesem Beispiel belief sich die
Ausbeute an Hyaluronsäure
auf etwa 85–87%
in Hinblick auf den Hyaluronsäure-Gehalt
in der Rohlösung,
und das Produkt hatte die folgenden Merkmale;
– Natriumhyaluronat-Gehalt | 96,5% |
– Grenzviskosität (25°C) = 2100
ml/gr (entsprechend einem Molekulargewicht von 1,7 × 106 Dalton) | |
– Wassergehalt | 3,1 |
– Proteingehalt | 0,08% |
– Nukleinsäuregehalt | 0,01% |
– Gehalt
an neutralem Zucker | 0,01% |
-
Das so erhaltene Natriumhyaluronat
von hohem Molekulargewicht kann zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen verwendet werden.
-
Reinigungsverfahren gemäss einer
zweiten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
-
Unter kontinuierlichem Rühren wurde
der pH-Wert von 5 Litern der wie obenstehend hergestellten wässrigen
Nährlösung, welche
Hyaluronsäure
von hohem Molekulargewicht aus einer mikrobiellen Quelle enthält, mit
6 N HCl auf 3,5 eingestellt und während des gesamten Querfluss-Diafiltrationsschrittes
zur Entfernung von Zellen auf diesem Spiegel gehalten.
-
Die wässrige Nährlösung (5 Liter) wurde dann in
einen Querstromfilter-Halter gepumpt, ausgestattet mit drei 0,2 μm Filter-Patronen,
welche übereinander
angeordnet waren. Der verwendete Filter ist eine SARTOCON-Kassette,
Mod. Nr. 302 186 07 04 O-SG, hergestellt von SARTORIUS, mit einer
Porengrösse
von 0,2 μm.
-
Zum Beginn der Einspeisung der wässrigen
Nährlösung in
den Filter, wurde das Filtrat-Ventil geschlossen gehalten, um die
wässrige
Nährlösung mehrere
Minuten lang zu rezirkulieren, bis das System stabil war und keine
Blasen im Retentat vorhanden waren.
-
Das Filtratventil wurde dann geöffnet und
10 Äquivalent-Volumen
steriles pyrogenfreies destilliertes Wasser wurden kontinuierlich
in den Tank, der die wässrige
Nährlösung enthält, bei
der gleichen Fliessgeschwindigkeit zugegeben wie das abfliessende
Filtrat, damit ein konstantes Volumen der wässrigen Nährlösung beibehalten wird. Der
Eingangsdruck wird im Bereich von 1 bis 3 Bar, vorzugsweise bei
2 Bar gehalten.
-
Das Retentat wurde verworfen und
das zellfreie Filtrat (50 Liter) mit der Hyaluronsäure von
hohem Molekulargewicht wurde weiter behandelt.
-
Der pH-Wert der diafiltrierten Lösung (50
Liter) mit der so erhaltenen Hyaluronsäure wurde danach auf 2,4 eingestellt,
wodurch eine sehr viskose Lösung
erhalten wurde, und während
des gesamten Querfluss-Diafiltrations-Verfahrens auf diesem Spiegel
gehalten.
-
Die wässrige Nährlösung (50 Liter) wurde dann
in einen Querstromfilter-Halter gepumpt, ausgestattet mit drei 300
000 D-Filter-Patronen, welche übereinander
angeordnet waren. Der verwendete Filter ist eine SARTOCON-Kassette,
Mod. Nr. 302 146 790 07 7E-SG, hergestellt von SARTORIUS, mit einer
Porengrösse von
300 000 D.
-
Zum Beginn der Einspeisung der wässrigen
Nährlösung in
den Filter, wurde das Filtrat-Ventil geschlossen gehalten, um die
wässrige
Nährlösung mehrere
Minuten lang zu rezirkulieren, bis das System stabil war und keine
Blasen im Retentat vorhanden waren.
-
Das Filtratventil wurde dann geöffnet, und
die wässrige
Nährlösung wurde
dann konzentriert, um das Volumen auf 7,5 Liter zu verringern. Das
Filtrat (42,5 Liter) wurde verworfen.
-
Dann wurden 15 Äquivalent-Volumen steriles
pyrogenfreies destilliertes Wasser kontinuierlich in den Tank, der
die wässrige
Nährlösung enthält, bei
der gleichen Fliessgeschwindigkeit zugegeben wie das abfliessende
Filtrat, damit ein konstantes Volumen der wässrigen Nährlösung beibehalten wird. Der
Eingangsdruck wird im Bereich von 1 bis 3 Bar, vorzugsweise bei
2 Bar gehalten. Das Filtrat (116 Liter) wurde verworfen.
-
Die Zufuhr von Wasser wurde dann
gestoppt und die wässrige
Nährlösung wurde
konzentriert.
-
Der pH-Wert der konzentrierten diafiltrierten
Lösung
(4 Liter) wurde dann mit 5 N NaOH auf einen pH von 7 eingestellt,
und die Lösung
wurde durch einen statischen Filter mit einer Porengrösse von
0,2 μm filtriert, um
die Lösung
gemäss
eines Standard-Sterilfiltrier-Verfahrens zu sterilisieren.
-
Die sterile Lösung wurde dann gemäss eines
Standardgefriertrocknungs-Verfahrens gefriergetrocknet, um ein trockenes
Pulver von Natriumhyaluronat zu erhalten.
-
In diesem Beispiel belief sich die
Ausbeute an Hyaluronsäure
auf etwa 83–85%
in Hinblick auf den Hyaluronsäure-Gehalt
in der Rohlösung,
und das Produkt hatte die folgenden Merkmale;
– Natriumhyaluronat-Gehalt | 97,0% |
– Grenzviskosität (25°C) = 2100
ml/gr (entsprechend einem Molekulargewicht von 1,7 × 106 Dalton) | |
– Wassergehalt | 2,9% |
– Proteingehalt | 0,08% |
– Nukleinsäuregehalt | 0,01% |
– Gehalt
an neutralem Zucker | 0,01% |
-
Das so erhaltene Natriumhyaluronat
von hohem Molekulargewicht kann zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen verwendet werden.