DE4439748A1

DE4439748A1 - Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen

Info

Publication number: DE4439748A1
Application number: DE4439748A
Authority: DE
Inventors: Georg Dr Leggewie; Joerg Dr Riesmeier; Wolf-Bernd Dr Frommer
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1994-10-31
Filing date: 1994-10-31
Publication date: 1996-05-02
Also published as: JPH10507920A; EP0789773A1; US6025544A; WO1996013595A1; AU701718B2; AU3979495A; HU221005B1; CA2204023A1; HUT77471A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einem im Vergleich zu Wildtyppflanzen veränderten Blühverhalten, insbesondere einer vorzeitigen Blütenbildung und einem verstärkten Blütenansatz. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für pflanzliche Saccharosetransporter kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit einem im Vergleich zu Wildtyppflanzen veränderten Blühverhalten.

Die Blütenbildung ist in Pflanzen eine Voraussetzung für die sexuelle Fortpflanzung und ist daher essentiell für die Vermehrung von Pflanzen, die nicht auf vegetativem Wege vermehrt werden können, sowie für die Bildung von Samen und Früchten. Der Zeitpunkt, zu dem Pflanzen vom rein vegetativen Wachstum zur Blütenbildung übergehen, ist von zentraler Bedeutung beispielsweise in der Landwirtschaft, dem Gartenbau und der Pflanzenzüchtung. Ebenso ist die Anzahl der Blüten häufig von wirtschaftlichem Interesse, z. B. bei verschiedenen Nutzpflanzen (Tomate, Gurke, Zucchini, Baumwolle etc.), bei denen eine höhere Anzahl der Blüten unter Umständen einen höheren Ertrag bedeutet, oder bei der Herstellung von Zierpflanzen und Schnittblumen.

In vielen Anwendungsbereichen ist eine sehr frühzeitige Blütenbildung der Pflanzen von Vorteil. In der Landwirtschaft beispielsweise würde bei verschiedenen Nutzpflanzen eine vorzeitige Blüte eine Verkürzung der Zeit zwischen Aussaat und Ernte und so das Ausbringen von zwei Aussaaten pro Jahr ermöglichen bzw. eine Verlängerung des Zeitraums zwischen Blüte und Ernte, wodurch unter Umständen eine Ertragssteigerung erreicht werden kann. Auch in der Pflanzenzüchtung kann eine vorzeitige Blütenbildung zu einer erheblichen Verkürzung der Züchtungsverfahren beitragen und so eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit bewirken. Der wirtschaftliche Nutzen einer vorzeitigen Blüte ist auch für den Gartenbau und die Zierpflanzenproduktion offensichtlich.

Die bisherigen Bemühungen zur Aufklärung der Mechanismen, die den Zeitpunkt der Blütenbildung in Pflanzen bestimmen, lassen keinen eindeutigen Schluß auf die beteiligten und ausschlaggebenden Faktoren zu. Für eine Reihe von Pflanzen ist bekannt, daß Umwelteinflüsse den Übergang zwischen vegetativem Wachstum und Blütenbildung bestimmen, z. B. Licht/Dunkel-Rhythmen, Temperatur und Wasserangebot. Wie diese Reize von der Pflanze aufgenommen und in physiologische Signale umgesetzt werden, die im apikalen Meristem die Blütenbildung induzieren, ist weitgehend unbekannt. Es werden verschiedene Theorien diskutiert und eine ganze Reihe von möglichen Faktoren in Betracht gezogen, wie beispielsweise Blühhormone (Florigen /Antiflorigen), Kohlenhydrate, Cytokinine, Auxin, Polyamine und Calcium-Ionen (Bernier et al., 1993, Plant Cell 5: 1147-1155).

Die Kontrolle des Zeitpunktes der Blütenbildung durch Regulation exogener Reize, wie beispielsweise Licht/Dunkel-Rhythmus, Temperatur oder Wasserangebot, läßt sich in der Praxis nur in begrenztem Umfang umsetzen, beispielsweise in Gewächshäusern. Um eine vorzeitige Blütenbildung in Pflanzen zu erreichen, die unter Freilandbedingungen wachsen, ist es daher notwendig, Pflanzen zu verwenden, die eine vorzeitige Blütenbildung unabhängig von exogenen Reizen zeigen. Möglichkeiten, derartige Pflanzen zu erzeugen, bestehen zum einen in Mutageneseverfahren, die jedoch nicht für alle Spezies anwendbar sind, in züchterischen Verfahren, die jedoch sehr zeitintensiv sind und für jede Pflanzenspezies gesondert durchgeführt werden müssen, oder in gentechnischen Verfahren. Voraussetzung für die Anwendbarkeit eines gentechnischen Verfahrens ist jedoch, daß zum einen Genloci identifiziert sind, die einen wesentlichen Einfluß auf den Blühzeitpunkt haben, und daß DNA-Sequenzen zur Verfügung stehen, die für die relevanten Produkte kodieren. Dies ist bisher jedoch nicht der Fall. Für die Spezies Arabidopsis thaliana, an der bisher die meisten Untersuchungen zur Regulation des Blühzeitpunktes durchgeführt wurden, wurden zwar verschiedene Mutanten beschrieben, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen vorzeitig blühen (siehe Referenzen in Lee et al., 1994, Plant Cell 6: 75-83), jedoch konnten diese Mutanten bisher nicht näher charakterisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Ursachen, die zu der vorzeitigen Blütenbildung führt, gelang bisher ebenfalls nicht.

Bell et al. (1993, Plant Mol. Biol. 23: 445-451) beschreiben Tabakpflanzen, die mit der cdc25-cDNA aus Schizosaccharomyces pombe transformiert wurden und die als Folge der Expression dieses Mitose-induzierenden Proteins eine vorzeitige Blütenbildung und eine stark erhöhte Anzahl der Blüten zeigen. Diese Pflanzen weisen jedoch den Nachteil auf, daß es zu starken Veränderungen in der Blattmorphologie kommt. Insbesondere sind die Blätter dieser Pflanzen gerollt. Dieses Verfahren scheint daher nicht geeignet zu sein, um Nutzpflanzen herzustellen, die in ihrem Blühverhalten verändert sind.

Zur Herstellung von intakten Pflanzen mit einer höheren Anzahl an Blüten pro Pflanze bzw. einer vorzeitigen Blütenbildung ist man daher heute nach wie vor auf die klassischen Züchtungsverfahren oder Mutageneseverfahren angewiesen.

In der WO 94/00574 werden DNA-Sequenzen beschrieben, die für Saccharosetransporter aus Spinat und Kartoffel kodieren. In dieser Anmeldung wird auch die Möglichkeit erwähnt, diese Sequenzen in Verbindung mit DNA-Sequenzen für die Regulation der Transkription in Pflanzen einzubringen mit dem Ziel der Überexpression derartiger Saccharosetransporter. Die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Saccharosetransporter kodieren, zur Herstellung von Pflanzen, die ein verändertes Blühverhalten zeigen, wurde nicht beschrieben.

Von dem Saccharosetransporter wird angenommen, daß er eine zentrale Rolle bei dem Transport von Saccharose, der wichtigsten Transportform der durch Photosynthese gebildeten Photoassimilate, aus den photosynthetisch aktiven Geweben in das Phloem spielt. In welchem Ausmaß er auch bei dem Transport von Saccharose aus dem Phloem in photosynthetisch nicht aktive Gewebe, die auf den Import von Photoassimilaten angewiesen sind (sogenannte "sink"-Organe) eine Rolle spielt, ist bisher umstritten (Riesmeier et al., 1993, Plant Cell 5: 1591-1598; Riesmeier et al., 1994, EMBO J. 13: 1-7).

Eine Funktion von Saccharosetransportern bei der Regulation des Blühverhaltens war bisher nicht in Erwägung gezogen worden. Zwar wurde Saccharose bereits mehrfach als potentielles Signal für die Blühinduktion im apikalen Meristem diskutiert (Bernier et al., 1993 Plant Cell 5: 1147-1155; Lejeune et al., 1993, Planta 190: 71-74; Lejeune et al., 1991, Plant Physiol. Biochem. 29: 153-157), einen Einfluß eines Saccharosetransporters auf das Blühverhalten als Folge einer erhöhten Aktivität dieses Transporters ist bisher jedoch weder bekannt und war auch aus verschiedenen Gründen nicht zu erwarten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie in ihrem Blühverhalten verändert sind, insbesondere dahingehend daß sie eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz zeigen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei transgenen Pflanzen, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurden, das zu einer Überexpression eines pflanzlichen Saccharosetransporters in den Geweben transformierter Pflanzen führt, ein verändertes Blühverhalten beobachtet werden kann. Unter einem veränderten Blühverhalten wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, daß transformierte Pflanzen im Vergleich zu nicht- transformierten Pflanzen

a) vorzeitig blühen, wobei vorzeitig bedeutet, daß die transformierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyppflanzen mindestens einige Tage, vorzugsweise eine bis mehrere Wochen, insbesondere 2-4 Wochen früher blühen, und/oder
b) einen verstärkten Blütenansatz zeigen, was bedeutet, daß die transformierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyppflanzen durchschnittlich mehr Blüten pro Pflanze ansetzen, in der Regel mindestens 5% mehr Blüten ansetzten, insbesondere 10-100% und vorzugsweise 10-40% mehr Blüten ansetzen.

Überexpression eines Saccharosetransporters bedeutet in Rahmen dieser Anmeldung, daß es in Zellen, in die eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für einen Saccharosetransporter kodieren, eingeführt und stabil ins Genom integriert wurden, zur Synthese zusätzlicher Proteine mit der Aktivität eines Saccharosetransporters kommt, so daß in den Geweben transformierter Pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen insgesamt eine erhöhte Transporter-Aktivität auftritt. Unter Saccharosetransportern werden Proteine verstanden, die in der Lage sind, Saccharose über biologische Membranen zu transportieren. Die Aktivität derartiger Transporter läßt sich nach der in Riesmeier et al. (1992, EMBO J. 11: 4705-4713) beschriebenen Methode bestimmen.

Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Saccharosetransporter, vorzugsweise pflanzliche Saccharosetransporter, kodieren, zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen. Gegenstand ist ebenfalls die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Saccharosetransporter, vorzugsweise pflanzliche Saccharosetransporter, kodieren, zur Herstellung von Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen ein verändertes Blühverhalten zeigen, insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz.

Um eine Überexpression eines Saccharosetransporters in den Geweben transformierter Pflanzen zu erreichen, wird die kodierende Region einer DNA-Sequenz, die für einen Saccharosetransporter kodiert, mit DNA-Sequenzen verknüpft, die für die Transkription in pflanzlichen Zellen erforderlich sind. Hierbei handelt es sich zum einen um Transkriptionspromotoren und gegebenenfalls Enhancer-Elemente, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, und gegebenenfalls um Terminationssignale, die zur Termination der Transkription sowie zur Addition eines Poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript führen. Diese Sequenzen sind derart miteinander verknüpft, daß sich an das 3′-Ende des Promotors die kodierende Region eines Saccharosetransporter-Gens in sense-Orientierung anschließt, so daß eine mRNA synthetisiert wird, die in ein Protein mit der Aktivität eines Saccharosetransporters translatiert werden kann, und sich an das 3′-Ende der kodierenden Region das Terminationssignal anschließt.

Die Herstellung transgener Pflanzen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen ein verändertes Blühverhalten aufweisen, insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz, erfolgt in der Regel durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für einen Saccharosetransporter kodiert und in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
- iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

Für den unter i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet und das in der WO/9401571 beschriebene Promotorkonstrukt. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279) oder in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Hadash et al., 1992, Plant Cell 4: 149-159, Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2245-2251).

Die DNA-Sequenzen, die eine kodierende Region umfassen, die für einen Saccharosetransporter kodiert, können sowohl nativen bzw. homologen Ursprungs als auch fremden bzw. heterologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies sein. Es können sowohl DNA-Sequenzen verwendet werden, die aus prokaryontischen Organismen stammen, als auch solche, die aus eukaryontischen Organismen, insbesondere Pflanzen, stammen. Prokaryontische Sequenzen sind beispielsweise bekannt aus E. coli (Bockman et al., 1992, Mol. Gen. Genet. 235: 22-32; EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X63740). Vorzugsweise werden DNA-Sequenzen verwendet, die für pflanzliche Saccharosetransporter kodieren. Bekannt sind beispielsweise DNA-Sequenzen aus Arabidopsis thaliana (suc1- und suc2-Gene; EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X75365), Solanum tuberosum (Riesmeier et al., 1993, Plant Cell 5: 1591-1598; EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X69165 und WO 94/00547), Plantago major (EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X75764), L. esculentum (EMBL-Genbank: Zugriffsnummer X82275) und Nicotiana tabacum (EMBL-Genbank: Zugriffsnummern X82276 und X82277), die für Saccharosetransporter kodieren. Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung einer DNA-Sequenz aus Spinacia oleracea vor, die für einen Saccharosetransporter kodiert (siehe auch Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713 und WO 94/00547).

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, daß DNA-Sequenzen verwendet werden, die für Saccharosetransporter mit einem möglichst niedrigen K_m-Wert kodieren. Eine derartige Transporteraktivität ist beispielsweise aus Candida albicans (Williamson et al., 1993, Biochem. J. 291: 765-771) bekannt.

Bei den Sequenzen, die für Saccharosetransporter kodieren, kann es sich sowohl um cDNA-Sequenzen, als auch um genomische Sequenzen handeln. Die Sequenzen können aus den entsprechenden Organismen mittels der gängigen Techniken isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind, oder sie können auf synthetischem Wege hergestellt werden.

Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander austauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens (siehe z. B. Gielen et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29).

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Zur Transformation pflanzlicher Zellen mit der in dem Verfahren beschriebenen Expressionskassette werden vorzugsweise Plasmide verwendet.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explan tate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Verwendung einer DNA-Sequenz, die für einen pflanzlichen Saccharosetransporter kodiert, zur Transformation pflanzlicher Zellen mit dem Ziel einer Überexpression dieses Transporters in den Geweben transgener Tabakpflanzen beschrieben wird, was in den transformierten Pflanzen zu einer vorzeitigen Blütenbildung und einem verstärkten Blütenansatz führt. Analog zu den dargestellten Beispielen können auch andere Pflanzenspezies insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie z. B. Raps, Kartoffel, Getreidearten, Mais, Baumwolle, Tomate, Melone, etc. verändert werden.

Verwendete Medien und Lösungen
20 × SSC
175,3 g NaCl
	88,2 g Natrium-Citrat
	ad 1000 ml mit ddH₂O
	pH 7,0 mit 10 N NaOH
10 × MEN	200 mM MOPS
	50 mM Natriumacetat
	10 mM EDTA
	pH 7,0
NSEB-Puffer	0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
	7% SDS
	1 mM EDTA
	1% BSA (w/v)
4 × Laemmli-Puffer	200 mM Tris pH 6,8
	8% SDS
	0,4% Bromphenolblau
	40% Glycerin

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid pΩA7DE-S21-Myc8.
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294); im 5′-Bereich des Promotors wurden in die NcoI-Schnittstelle zwei 35S-Enhancerelemente (330 bp HincII/EcoRV-Fragment) inseriert
B = Fragment B: 73 bp langes NcoI/Asp718-Fragment (TMV-U1) mit dem Translationsenhancer aus dem Tabakmosaik-Virus
C = Fragment C: ca. 1600 bp langes DNA-Fragment, das die Nukleotide 70 bis 1644 der cDNA, die für den Saccharosetransporter aus Spinat kodiert (Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713), umfaßt
D = Fragment D: 33 bp langes DNA-Fragment, das für die Aminosäuresequenz EQKLISEEDLN-COOH kodiert
E = Fragment E: Terminationssequenz des Octopinsynthase-Gens; nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846)

Die Fragmente A, B, C, D und E befinden sich in dem Vektor pUC18.

Das Plasmid hat eine Größe von ca. 5700 bp.

Fig. 2 zeigt das Plasmid pΩ-S21.
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294); im 5′-Bereich des Promotors wurden in die NcoI-Schnittstelle zwei 35S-Enhancerelemente (330 bp HincII/EcoRV-Fragment) inseriert
B = Fragment B: 73 bp langes NcoI/Asp718-Fragment (TMV-U1) mit dem Translationsenhancer aus dem Tabakmosaik-Virus
C = Fragment C: ca. 1600 bp langes DNA-Fragment, das die Nukleotide 70 bis 1644 der cDNA, die für den Saccharosetransporter aus Spinat kodiert (Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713), umfaßt
D = Fragment D: 33 bp langes DNA-Fragment, das für die Aminosäuresequenz EQKLISEEDLN-COOH kodiert
E= Fragment E: Terminationssequenz des Octopinsynthase-Gens; nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846)

Das Plasmid hat eine Größe von ca. 12,6 kb

Fig. 3 zeigt das Plasmid p35S-Ω-OCS

Fig. 4 zeigt die durchschnittliche Anzahl der Blattansätze vor der Induktion der Blütenbildung in Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformiert wurden (Tabaklinien 5, 12 und 32) im Vergleich zu nicht-transformierten Tabakpflanzen. Die Pflanzen wurden im Phytrotron gehalten und waren ca. 28 Tage alt.

Fig. 5a und b zeigen transformierte Tabakpflanzen im Vergleich mit nicht- transformierten Tabakpflanzen.

a: Drei Pflanzen der Tabaklinie 12, die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformiert wurden, (hinten) sind im Vergleich gezeigt mit zwei nicht-transformierten Tabakpflanzen (vorne). Die Pflanzen sind ca. 28 Tage alt und wurden im Phytotron gehalten.

b: Drei Pflanzen der Tabaklinie 32, die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformiert wurden, (hinten) sind im Vergleich gezeigt mit zwei nicht-transformierten Tabakpflanzen (vorne). Die Pflanzen sind ca. 28 Tage alt und wurden im Phytotron gehalten.

Fig. 6 zeigt die durchschnittliche Anzahl der Blüten bei Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformiert wurden (Tabaklinien 5, 12 und 32) im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus gehalten und waren ca. 28 Tage alt.

In den Beispielen 1 und 2 werden die folgenden Standardverfahren und Spezialtechniken verwendet:

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung in E.coli wurde der Vektor pUC18 verwendet.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die pUC-Vektoren und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 durchgeführt (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J. 8: 23-29).

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Transformation von Tabak

Eine Übernachtkultur des entsprechenden Agrobacterium tumefaciens-Klons wurde abzentrifugiert (6500 rpm; 3 min) und die Bakterien wurden in YEB-Medium resuspendiert.

Tabakblätter einer Tabaksterilkultur (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurden in kleine ca. 1 cm² große Stücke zerschnitten und in der Bakteriensuspension gebadet. Die Blattstücke wurden anschließend auf MS-Medium (0,7% Agar) gelegt und 2 Tage im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blattstücke zur Sproßinduktion auf MS-Medium (0,7% Agar) mit 1,6% Glukose, 1 mg/l 6-Benzylaminopurin, 0,2 mg/l Naphthylessigsäure, 500 mg/l Claforan und 50 mg/l Kanamycin gelegt. Das Medium wurde alle 7 bis 10 Tage gewechselt. Wenn sich Sprosse entwickelt hatten, wurden die Blattstücke in Glasgefäße, die dasselbe Medium, enthielten, überführt. Entstehende Sprosse wurden abgeschnitten und auf MS-Medium + 2% Saccharose + 250 mg/l Claforan gegeben und aus ihnen ganze Pflanzen regeneriert.

5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

6. Northern Blot-Analyse

RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN-Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham UK) transferiert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken.

Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.

7. Isolierung von Proteinen aus Blattgewebe und Western Blot-Analyse

Für die Isolierung von Proteinen aus Blattgewebe wurden 2 kreisrunde Blattstücke mit einem Durchmesser von ca. 5 mm aus Tabakblättern ausgestanzt und in 100 µl 4 × Laemmli-Puffer, 5% β-Mercaptoethanol in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß zerkleinert. Die entstehende Suspension wurde kurz abzentrifugiert. 10 µl des Überstandes wurden direkt auf ein "MighTy Small" SDS-Polyacrylamid-Gel der Firma Höfer (Trenngel 10% Polyacrylamid; Sammelgel 3,5% Polyacrylamid) aufgetragen und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine mit Hilfe der Semidry-Elektroblot-Methode auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Identifizierung des Saccharosetransporters aus Spinat in den Extrakten transgener Tabakpflanzen erfolgte unter Verwendung eines "Blotting detection kit- for rabbit antibodies" (Amersham UK) nach den Angaben des Herstellers. Als primärer Antikörper wurde der monoklonale Antikörper aus Maus 9E10 (Kolodziej und Young, 1991, In: Methods in Enzymology 194: 508-519) verwendet, der gegen das in Fig. 1 als Fragment D gezeigte myc-Epitop gerichtet ist.

8. Pflanzenhaltung

Beispiele Beispiel 1 Konstruktion des Plasmides pΩ-S21 und Einführung des Plasmids in das Genom von Tabakpflanzen

Zur Konstruktion eines Plasmides, das zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet ist und zur Überexpression eines Saccharosetransporters in pflanzlichen Zellen führt, wurde zunächst die kodierende Region einer cDNA, die für einen Saccharosetransporter aus Spinat kodiert, isoliert. Hierfür wurde der Klon pS21 (beschrieben in Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705-4713) verwendet. Unter Verwendung der Oligonukleotide

wurde mit Hilfe der PCR-Technologie ein ca. 1600 bp langes DNA-Fragment amplifiziert, das die Nukleotide 70 bis 1644 der in Riesmeier et al. (1992, EMBO J. 11: 4705-4713) dargestellten Sequenz des Klons pS21 umfaßt. Durch das Oligonukleotid 1 wurden am 5′-Ende der kodierenden Region eine PstI- und eine NocI-Schnittstelle eingeführt. Durch das Oligonukleotid 2 wurde die kodierende Region um eine 11 Aminosäuren lange Sequenzen (EQKLISEEDLN-COOH) am C-Terminus verlängert und außerdem eine PstI-Schnittstelle eingeführt. Diese Sequenz stammt aus dem c-Myc-Gen und stellt das Erkennungsepitop für den monoklonalen Antikörper aus Maus 9E10 (Kolodziej und Young, 1991, In: Methods in Enzymology 194: 508-519; kommerziell erhältlich bei Dianova, Hamburg) dar.

Das resultierende PCR-Produkt wurde mit der Restriktionsendonuklease PstI geschnitten und in einen mit PstI geschnittenen pUC18-Vektor ligiert. Das resultierende Plasmid wurde p-S21-Myc8 genannt. Aus diesem wurden durch NcoI/PstI-Partialverdau ein ca. 1600 bp langes Fragment isoliert, das das PCR-Produkt enthält, und in den mit NcoI und PstI geschnittenen Vektor p35SDE-Ω-OCS ligiert wurden.

Der Vektor p35SDE-Ω-OCS wurde folgendermaßen hergestellt:
Aus dem Promotorbereich des Cauliflower Mosaic Virus wurde ein 530 bp langes EcoRI/Asp718-Fragment (Nukleotide 6909-7439 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294)) isoliert und in einen mit EcoRI und Asp718 geschnittenen pUC18-Vektor ligiert. Das entstehende Plasmid wurde p35S genannt. Anschließend wurde aus dem EcoRI/Asp718-Promotorfragment durch Restriktionsverdau mit den Endonukleasen HincII und EcoRV ein ca. 330 bp langes Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend in die aufgefüllte NcoI-Schnittstelle des 35S-Promotors in dem Plasmid p35S kloniert. Hierbei entstand ein Konstrukt, bei dem zwei HincII/EcoRV-Fragmente hintereinander in reverser Orientierung in der NcoI-Schnittstelle inseriert waren, wobei die Anordnung folgende war:

EcoRI-(NcoI)/(EcoRV)-330bp-(HincII)/(EcoRV)-330bp-(HincII)/(NcoI)-52-5bp-Asp718

Das resultierende Plasmid wurde p35SDE genannt. Der in diesem Fragment enthaltene 35S-Promotor mit zwei zusätzlichen HincII/EcoRV-Fragmenten wurde mit 35SDE bezeichnet.

Es wurde ein weiteres pUC-Plasmid konstruiert, das wie in Fig. 3 gezeigt aufgebaut ist. Zwischen die EcoRI und die HindIII-Schnittstellen des Polylinkers eines pUC18-Vektors wurden folgende DNA-Fragmente inseriert:

1. EcoRI/Asp718-Fragment des 35S-Promotors (Nukleotide 6909-7439 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294))
2. Asp718/NcoI-Fragment (TMV-U1) aus dem Ω-Translationsenhancer des Tabakmosaik-Virus mit der folgenden Sequenz:
3. ein Polylinker mit folgenden Restriktionsschnittstellen NcoI/SacI/XhoI/SmaI/BamHI/XbaI/SalI/PstI/SphI
4. eine Terminationssequenz aus dem Octopinsynthasegen (nt 11 748-11 939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846)
Dieses Plasmid wurde p35S-Ω-OCS genannt.

Das Plasmid p35S-Ω-OCS wurde mit EcoRI/Asp718 geschnitten, wodurch der 35S-Promotor entfernt wurde. Dieser wurde durch den mit EcoRI und Asp718 aus dem Plasmid p35SDE isolierten Promotor 35SDE ersetzt. Das resultierende Plasmid wurde p35SDE-Ω-OCS genannt.

Dieses Plasmid wurde mit NcoI und PstI im Polylinker geschnitten. In die Schnittstellen wurde das aus dem Plasmid p-S21-Myc8 durch Partialverdau mit NcoI und PstI isolierte ca. 1600 bp lange Fragment, das das obenbeschriebene PCR-Produkt enthält, ligiert. Dadurch entstand das Plasmid pΩA7DE-S21-Myc8. Dieses Plasmid ist in Fig. 1 dargestellt.

Aus dem Plasmid pΩA7DE-S21-Myc8 wurde durch Verdau mit EcoRI und HindIII die gesamte Expressionskassette umfassend den Promotor 35SDE, den Translationsverstärker, die kodierende Region für den Saccharosetransporter aus Spinat mit der Sequenz, die für das c-Myc-Epitop kodiert, und der Terminationssequenz isoliert.

Diese Sequenz wurde in den mit EcoRI und HindIII geschnittenen Vektor TCSAS (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM 9358) ligiert, aus dem zuvor durch den EcoRI/HindIII-Verdau die zwischen diesen beiden Restriktionsschnittstellen enthaltene Expressionskassette entfernt wurde.

Das resultierende Plasmid wurde pΩ-S21 genannt und ist in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 2 Transformation von Tabakpflanzen mit dem Plasmid pΩ-S21

Das Plasmid pΩ-S21 wurde für die Transformation von Tabakpflanzen mit Hilfe des Agrobakterien-vermittelten Gentransfers verwendet.

Als Ergebnis der Transformation ließ sich in transgenen Tabakpflanzen in verschiedenen Mengen das für den Saccharosetransporter aus Spinat kodierende Transkript nachweisen. Der Nachweis erfolgte mit Hilfe einer Northern-Blot-Analyse. Hierfür wurde RNA aus Blattgewebe transgener und nicht-transformierter Pflanzen isoliert. 50 µg dieser RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit der radioaktiv markierten cDNA, die für den Saccharosetransporter aus Spinat kodiert, hybridisiert. Eine derartige Northern-Blot-Analyse zeigte, daß von drei Transformanden (Transformanden Nr. 5, 12 und 32) zwei Transformanden (Nr. 12 und Nr. 32) eine hohe Expression des Saccharosetransporters aus Spinat aufweisen, eine Transformande (Nr. 5) im Vergleich dazu nur eine relativ geringe Expression des Saccharosetransporters aus Spinat zeigt, und sich in nicht-transformierte Kartoffelpflanzen keine Transkripte nachweisen ließen, die für den Saccharosetransporter aus Spinat kodierten.

Um zu zeigen, daß das Transkript, das für einen Saccharosetransporter aus Spinat kodiert, in transgenen Tabakpflanzen zur Synthese eines Saccharosetransporters führt, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Dazu wurden aus Blattgewebe transgener Pflanzen Proteine isoliert, auf einem SDS-Gel aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemem bran transferiert. Der Nachweis des Spinat-Saccharosetransporters in transgenen Tabakpflanzen erfolgte mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern, die gegen das Epitop des c-Myc-Gens gerichtet sind, das sich am 3′-Ende der kodierenden Region in dem Plasmid pΩ-S21 befindet. In derartigen Western Blot-Analysen ließ sich spezifisch in Proteinextrakten transgener Tabakpflanzen ein ca. 48 kd großes Protein nachweisen. Dies entspricht dem erwarteten Molekulargewicht des Saccharosetransporters aus Spinat.

Infolge der Expression des Saccharosetransporters aus Spinat wiesen die mit dem Plasmid pΩ-S21 transformierten Tabakpflanzen im Vergleich zu nicht- transformierten Tabakpflanzen ein verändertes Blühverhalten auf. Insbesondere war bei den Transformanden 12 und 32, die eine starke Expression des Spinat-Saccharosetransporters zeigten, eine vorzeitige Blütenbildung sowie ein leicht verstärkter Blütenansatz zu beobachten.

Transformierte Tabakpflanzen zeigten im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen deutlich weniger Blattansätze, bevor die Induktion des apikalen Meristems zur Bildung der Blütenstände einsetzt. In Fig. 4 ist dargestellt, wieviele Blattansätze transformierte bzw. nicht-transformierte Tabakpflanzen, die im Phytotron gehalten wurden, vor der Differenzierung des apikalen Meristems zu Blütenständen durchschnittlich aufwiesen.

Durch die vorzeitige Induktion des Meristems zur Bildung von Blütenständen kommt es zur vorzeitigen Bildung von Knospen und zur vorzeitigen Blüte im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen. Dies veranschaulichen auch die Fig. 5a und b, die im Phytotron gehaltene transformierte Tabakpflanzen der Linie 12 (Fig. 5a) bzw. der Linie 32 (Fig. 5b) im Vergleich zu nicht-transformierten Tabakpflanzen zeigen. Unter gleichen Kultivierungsbedingungen setzte bei nicht-transformierten Tabakpflanzen die Blütenbildung und Blüte deutlich später ein, im Durchschnitt ca. 14 Tage bei im Phytotron gehaltenen Pflanzen.

Neben der vorzeitigen Blütenbildung setzten die transformierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyppflanzen zahlenmäßig mehr Blüten an. Dies ist in Fig. 6 dargestellt.

Claims

1. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Saccharosetransporter kodieren, zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen.

2. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Saccharosetransporter kodieren, zur Herstellung von Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen ein verändertes Blühverhalten zeigen, insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz.

3. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die im Vergleich zu nicht- transformierten Pflanzen ein verändertes Blühverhalten aufweisen, insbesondere eine vorzeitige Blütenbildung und/oder einen verstärkten Blütenansatz, das folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellen einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) mindestens eine DNA-Sequenz, die für einen Saccharosetransporter kodiert und in sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist, und
- iii) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entstehende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist,
b) Einführung der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette in pflanzliche Zellen und stabile Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom, und
c) Regeneration ganzer, intakter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die für einen Saccharosetransporter kodierenden DNA-Sequenzen aus Pflanzen stammen.