DE4413121A1 - Verfahren zur Enantiomerentrennung an chiralen Stationärphasen durch Flüssigchromatographie in Kapilarsäulen - Google Patents
Verfahren zur Enantiomerentrennung an chiralen Stationärphasen durch Flüssigchromatographie in KapilarsäulenInfo
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Description
Die Kapillar-Gaschromatographie zeichnet sich durch hohe Effizienz (geringe Bodenhöhe,
HETP), Trennleistung (hohe Auflösung, R1,2), geringe Analysenzeiten (kleine Retentionsfaktoren,
k) und hohe Detektionsempfindlichkeit aus. Außerdem sind geeignete Kopplungsmethoden
verfügbar. Dagegen wird die Flüssigchromatographie fast ausschließlich
in Gepacktsäulen unter Anwendung von Druck betrieben. Die universelle Golay-Gleichung,
die die maximale Effizienz einer Kapillarsäule (ausgedrückt durch die Höhe eines theoretischen
Bodens, HETP) mit der mittleren Flußgeschwindigkeit (v) verknüpft, sagt jedoch
voraus, daß die Kapillarflüssigchromatographie (open tubular liquid chromatography,
OTLC) eine wichtige Alternative zur Gepacktflüssigchromatographie darstellt (G.
Guichon, H. Colin, in P. Kucera (Ed.), "Micro Column High Performance Liquid Chromatography",
Elsevier, Amsterdam, (1984).)
Voraussetzung für diese Methode ist jedoch die Verwendung von Säulen mit geringem
Innendurchmesser (50 µm), Belegung mit Stationärphasen (z. B. Polysiloxane), die
bevorzugt immobilisiert werden, totvolumenarme oder -freie Injektionssysteme (split-
Technik) und on-column-Detektion (UV, Laser-induzierte Fluoreszenz). Fortschrittsberichte
und Originalpublikationen dokumentieren überzeugend die Anwendbarkeit der
OTLC (D. Ishi et al., J. High Resolut. Chromatogr., Chromatogr. Commun., 2 (1979)
371; T. Tsuda, G. Nakagawa, J. Chromatogr., 268 (1983) 369; H. Engelhardt, B. Lillig, J.
High Res. Chromatogr., Chromatogr. Commun., 8 (1985) 531; O. van Berkel, H. Poppe,
J. C. Kraak, Chromatographia, 24 (1987) 739. K. Jinno, Chromatographia, 25 (1988)
1004; S. Folestad, B. Josefsson, M. Larsson, J. Chromatogr., 391 (1987) 347.
Wichtige Vorteile der OTLC sind hohe Effizienz, hohe Permeabilität, einfache Apparaturen,
Kopplungsmöglichkeiten aufgrund geringer Flußraten und geringster Verbrauch an
ggf. umweltschädlichen und toxikologisch bedenklichen Lösungsmitteln.
Die Enantiomerentrennung wird in der Flüssigchromatographie ausschließlich mit Gepacktsäulen
betrieben. Es sind über 500 chirale Stationärphasen bekannt und die publizierten
Daten können nur noch durch Datenbanken (z. B. Chirabase) sinnvoll erfaßt werden.
Obwohl immobilisierte chirale Polysiloxane (CHIRASIL-DEX) in der Kapillar-Gas-
und Supercriticalfluid-Chromatographie routinemäßig eingesetzt werden, liegen nach unserer
Kenntnis überraschenderweise keine Anwendungen dieser Methode in der enantioselektiven
OTLC vor.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung chiral modifizierter Oberflächen von
Kapillarsäulen zur enantioselektiven Flüssigchromatographie wie am Beispiel von immobilisiertem
CHIRASIL-DEX (Peralkylierte Cyclodextrine, die über eine Polyalkylidenkette
an immobilisierbares Polysiloxan gebunden sind, z. B. Abb. 1) gezeigt wird. Die
apparativen Probleme der OTLC werden besonders einfach durch die Verwendung einer
Kapillarelektrophoreseanordnung mit dem PRINCE Injektionssystem und on-column-
Detektion ohne Spannungsanlegung durchgeführt. Da diese Geräte zunehmend in modernen
Laboratorien verfügbar sind, ist mit einer schnellen Verbreitung des erfindungsgemäßen
Verfahrens zu rechnen.
Die vorliegende Erfindung grenzt sich von einer vorhergehenden
Offenlegung (Deutsche Patentanmeldung P 41 36 462.7), die die Enantiomerentrennung
mit dem gleichen Säulentyp durch Elektromigration in einem elektrokinetischen
Verfahren ("Elektrochromatographie") beschreibt, dadurch ab, daß im letzteren Fall die
Wanderung der Analyte durch Elektroosmose und/oder Elektrophorese erfolgt, während
im vorliegenden Beispiel die Wanderung aufgrund einer angelegten Druckdifferenz zustandekommt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Auftrennung von Enantiomeren durch
Flüssigchromatographie in Kapillarsäulen, die mit chiralen oberflächen-gebundenen und/oder
quervernetzten, immobilisierten enantioselektiven Stationärphasen, z. B. CHIRASIL-DEX
(ein Polysiloxan, an das Cyclodextrin chemisch angebunden ist) belegt wurden.
Bei diesem Verfahren werden die zu trennenden Enantiomere durch Druckdifferenz durch
die Trennkapillare bewegt. Die Aufbringung des Cyclodextrins auf die Oberfläche erfolgt
durch vorausgehende chemische Anbindung an ein Polysiloxan und dessen
Immobilisierung. Erfindungsgemäß muß die Anbindung jedoch nicht ausschließlich
durch vorherige chemische Bindung an ein unlösliches oder immobilisierbares Polymer
erfolgen, sondern kann prinzipiell auch durch direkte Reaktion an Silanolgruppen der
Oberfläche erfolgen. Die Belegung der Kapillarinnenwand kann auch durch chirale Selektoren
erfolgen, die in einem Lösungsmittel (z. B. ein Polysiloxan, Carbowax) gelöst
werden, wie in der Gaschromatographie üblich. Um das Auswaschen der ungebundenen
Stationärphase zu erschweren, kann die mobile Phase mit dem Lösungsmittel gesättigt
werden. Bevorzugt wird jedoch der Einsatz von chiralen Polymeren auf Polysiloxanbasis
wie zum Beispiel CHIRASIL-DEX (oder anderen chiralen Polymeren) (V. Schurig, D.
Schmalzing, M. Schleimer, Angew. Chem. 103 (1991) 994). In diesen Polymeren ist
der chirale Selektor kovalent an das Polymer angebunden. Aufgrund der oft hohen Enantioselektivität
verbunden mit den Vorteilen von Polysiloxanen, wie einfaches Belegen
von Oberflächen, leichte Immobilisierbarkeit und hohe chemische Stabilität hat sich die
chirale Stationärphase CHIRASIL-DEX bewährt wie auch schon in anderen Verfahren,
z. B. Gaschromatographie und Superkritische-Fluid-Chromatographie (V. Schurig et al.,
J. High Resolut. Chromatogr. 13 (1990) 713 und 14 (1991) 58) und Elektrochromatographie
(Deutsche Patentanmeldung P 41 36 462.7).
Erfindungsgemäß wird das für die OTLC kritische Problem der Vermeidung von Peakverbreiterungen
durch Extra-Säulen-Effekte (Injektion, Detektion) durch Anlehnung an
die inzwischen verfügbare Technologie für elektronische Verfahren optimal gelöst. So
wurde konnte erstmals mit dem Kapillarelektrophoresesystem der Firma Bischoff (Leonberg)
PRINCE eine Enantiomerentrennung mittels Kapillarflüssigkeitschromatographie
durchgeführt werden (Abb. 2-4).
PRINCE ist ein automatisches, variables Druckinjektionsgerät für die Kapillarelektrophorese.
Durch die Anwendung von kontrollierten Druckrampen in einem geschlossenen
System sind die physikalischen Gesetze von Boyle (Druck) und Poiseuille (Strömung)
konsequent verwirklicht. Das Gerät erzeugt zuverlässige und genaue Injektionsergebnisse
mit einer Fehlerquote unter 1%. So lag es nahe, dieses System für die Kapillarflüssigchromatographie
(OTLC) einzusetzen. Probleme, die bei der HPLC mit Kapillarsäulen
auftreten, wie z. B. Totvolumina, bedingt durch Injektionstechnik sowie multiple
Verschraubungen, treten hier nicht auf. Des weiteren erzeugt das PRINCE-System einen
gegenüber üblichen HPLC-Pumpen impulsfreien Druck, der das System für Kopplungsmethoden
(z. B. LC-MS etc.) prädestiniert. Der für die Injektion aufgebaute Überdruck
wird für die Wanderung der Enantiomere in der Kapillarsäule nutzbar gemacht.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch unter größerem Aufwand auch in einer für
die OTLC ausgelegten HPLC-Anordnung, wie sie aus der Literatur bekannt ist, betrieben
werden.
Vorteile der hier beschriebenen Erfindung gegenüber der konventionellen Gepackt-HPLC
für die Enantiomeranalytik sind neben einfacher Handhabung ein geringer Verbrauch an
mobiler und stationärer Phase (Kostenfaktor), Verzicht auf Trägermaterial, Zunahme der
Massenempfindlichkeit für mengenspezifische Detektoren, hohe Präzision, hohe Effizienz
und deshalb bessere Enantiomeren-Auflösung, einfache Kopplung (hyphenated techniques)
mit spektroskopischen (LC-MS, LC-FTIR) und sekundären chromatographischen
Systemen aufgrund geringerer Flußraten. In multidimensionaler Anordnung lassen sich
Kapillarsäulen einfacher in Serie oder hintereinander schalten. Aufgrund des geringen
Säulenvolumens ist die Wärmekapazität des Systems gering und die Kapillarsäulen eignen
sich besonders für die Temperaturprogrammierung.
Eine erfindungsgemäße Variante ist die Beimischung des chiralen Selektors in die Mobilphase
und Trennung der Enantiomere durch OTLC an einer achiralen Stationärphase
(z. B. Polysiloxan) bzw. die Kombination beider Methoden (chirale Stationärphase und
chirale mobile Phase).
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, ohne dieses jedoch
einzuschränken.
Es wurde ein Kapillarelektrophoresegerät der Firma Bischoff (Leonberg) PRINCE verwendet,
ausgestattet mit einem on-column UV-Detektor. Die Injektion erfolgte durch
dynamische Druckinjektion (PRINCE-System). Alle Proben wurden in Methanol gelöst
und auf eine Konzentration von 0,1 mg in 1 ml eingestellt. Die Detektion erfolgte
bei 220 nm. Bevor die Säulen in das Gerät eingebaut wurden, wurde 17 cm vor dem
Säulenende durch Abbrennen von etwa 3 mm Polyimidschicht mit schwacher Flamme
das optische Fenster für die on-column UV-Detektion angebracht. Die Säulenlängen
wurden so gewählt, daß die effektive Länge 80 cm (vom Injektor zum optischen Fenster)
betrug. Der für die Messung benötigte Druck wurde mittels des "PRINCE-Systems" erzeugt.
Die Chromatogramme wurden mit einem Integrator CR-6A der Firma Shimadzu
aufgezeichnet.
Es wurden 1 m Fused silica Kapillarsäulen der Firma Ziemer (Mannheim) mit einem
Innendurchmesser von 50 µm verwendet. Vor dem Belegen wurden die Säulen bei schwachem
Wasserstoffstrom zwei Stunden lang bei 250°C dehydratisiert. Die Anbindung der
Cyclodextrinderivate an das Polysiloxan erfolgt durch Hydrosilylierung (V. Schurig et al.,
J. High Resolut. Chromatogr. 13 (1990) 713 und 14 (1991) 58). Die Säulen wurden mit
sorgfältig filtrierten 2,0% (w/v) Lösungen von Chirasil-Dex in Diethylether bei 30°C und
0.01 Torr statisch belegt, so daß sich eine Filmdicke von ca. 0,25 µm ergab. Anschließend
wurden die Kapillaren zwölf Stunden bei 0,5 bar Wasserstoff und 100°C konditioniert.
Die Immobilisierung wurde durch Einbau der Kapillarsäulen in Gaschromatographen der
Firma Carlo Erba (Fisons, Mainz) der Typen Fractovap 2101, 2150, 2350 und Vega
durchgeführt. Diese waren mit Split-Injektor (1 : 100) und Flammenionisationsdetektor
(FID) versehen. Als Trägergas wurde Wasserstoff (Reinheit 99,999%) und Druckluft
verwendet.
Zur thermischen Immobilisierung von mit Chirasil-Dex belegten Kapillarsäulen wurden
diese am Injektor an den Gaschromatographen eingebaut und 24 Stunden bei einem
äußerst geringen Wasserstofffluß (etwa 30 Blasen pro Minute am Säulenende, bei
geöffnetem Split) auf 190°C erhitzt. Zur Berechnung des Immobilisierungsgrades wurden
Testchromatogramme (n-Decan-, n-Tridecan und 1-Phenylethanol) nach der Immobilisierung
und nach dem Auswaschen der Kapillaren mit 5 ml Methanol, einem Gemisch aus
Methanol/Dichlormethan (1 : 1) und 5 ml Dichlormethan aufgenommen. Aus der prozentualen
Abnahme der k-Werte für die n-Alkane nach der Immobilisierung und nach dem
Auswaschen wurde der Immobilisierungsgrad (meist 80%) berechnet.
Alle Puffer wurden mit Wasser für die HPLC hergestellt, im Kühlschrank gelagert und vor
Einsatz in der LC mit einem Filter (0,45 µm Porengröße) (Machery Nagel, Düren) gefiltert.
Zur Herstellung des Borat/Phosphat Puffers wurden jeweils Lösungen aus NaH₂P₄
× 2 H₂O und Na₂B₄O₇ × 10 H₂O in der Konzentration von 20 mM bereitet und auf pH 7
durch Mischen der Lösungen gleicher Konzentration eingestellt. Je nach Bedarf wurde
dem Puffer Methanol für die HPLC beigefügt.
Die Kapillarsäule wird in das Kapillarelektrophoresesystem der Firma Bischoff (Leonberg)
PRINCE eingebaut.
Auf vorsichtige Justierung des Injektionsfensters wird geachtet. Die Kapillarsäule wird
mit Pufferlösung (z. B. Borat-Phosphat Puffer pH 7) langsam gespült. Diese Spülung wird
solange durchgeführt, bis sich bei sehr empfindlicher Einstellung des Detektors und des
Integrators (z. B. Shimadzu CR-6A Chromatopac) eine stabile Basislinie zu beobachten
ist.
Nach Beispiel 2 wurde eine Kapillarsäule belegt und die chirale stationäre Phase CHIRASIL-
DEX nach Beispiel 3 immobilisiert. Mit dieser Kapillarsäule gelang die Enantiomerentrennung
von Hexobarbital, Methylphenobarbital und Thiamylal (Abb. 2-4).
Folgende Parameter sind für alle drei Trennungen gültig:
Injektion: 60 mbar, 0,12 min;
Säuleninnendurchmesser: 50 µm;
effektive Säulenlänge bis zum Detektor: 80 cm;
totale Länge 97 cm;
es wird ein Borat-Phosphat Puffer pH 7 verwendet, der mit Methanol versetzt wurde (Puffer-Methanol 80/20 (v/v));
Detektion 220 nm.
Säuleninnendurchmesser: 50 µm;
effektive Säulenlänge bis zum Detektor: 80 cm;
totale Länge 97 cm;
es wird ein Borat-Phosphat Puffer pH 7 verwendet, der mit Methanol versetzt wurde (Puffer-Methanol 80/20 (v/v));
Detektion 220 nm.
Die Enantiomerentrennung von Hexobarbital wird mit einem Druck von 0,5 bar, die von
Methylphenobarbital und Thiamylal bei 1 bar durchgeführt. Die Säule wird nach jeder
Messung 0,5 min bei 2 bar mit Methanol und anschließend 0,5 min bei 2 bar mit dem
entsprechenden Puffer gespült.
Claims (6)
1. Verfahren zur Trennung von Enantiomeren durch Flüssigchromatographie in Kapillarsäulen,
dadurch gekennzeichnet, daß chirale Stationärphasen verwendet werden, die
als Film auf die Innenoberflächen der Kapillare aufgebracht werden.
2. Verfahren zur Trennung von Enantiomeren durch Flüssigchromatographie in Kapillarsäulen,
dadurch gekennzeichnet, daß chirale Stationärphasen verwendet werden, die
als Film auf die Innenoberfläche der Kapillare aufgebracht werden und anschließend immobilisiert
werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß immobilisiertes CHIRASIL-
DEX zur Oberflächenmodifizierung eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxylgruppen
der Cyclodextrinkomponente im CHIRASIL-DEX frei oder alkyliert (unverzweigt,
verzweigt bis C₁₀₀) oder acyliert oder perfluoroacyliert (unverzweigt, verzweigt bis C₁₀₀)
vorliegen und daß α, β, γ oder δ-Cyclodextrin eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anbindung der
Cyclodextrinkomponente an das Polysiloxan in CHIRASIL-DEX über eine verzweigte
oder unverzweigte Alkylidenkette beliebiger Länge erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysiloxankomponente
in CHIRASIL-DEX, deren organische Reste alle bisher bekannten Radikale
(Alkyle, Aryle, funktionalisiert oder unfunktionalisiert) darstellen können, auf Kapillaroberflächen
(bevorzugt Fused Silica) immobilisiert wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4413121A DE4413121A1 (de) | 1994-04-17 | 1994-04-17 | Verfahren zur Enantiomerentrennung an chiralen Stationärphasen durch Flüssigchromatographie in Kapilarsäulen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4413121A DE4413121A1 (de) | 1994-04-17 | 1994-04-17 | Verfahren zur Enantiomerentrennung an chiralen Stationärphasen durch Flüssigchromatographie in Kapilarsäulen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4413121A1 true DE4413121A1 (de) | 1995-02-16 |
Family
ID=6515548
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4413121A Withdrawn DE4413121A1 (de) | 1994-04-17 | 1994-04-17 | Verfahren zur Enantiomerentrennung an chiralen Stationärphasen durch Flüssigchromatographie in Kapilarsäulen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4413121A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999005288A2 (de) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Verfahren zur herstellung und identifizierung von neuen hydrolasen mit verbesserten eigenschaften |
DE112005000772B4 (de) * | 2004-04-07 | 2017-12-28 | Waters Technologies Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware) | Flüssigchromatographiereagenz und Verfahren zum Auftrennen von Enantiomeren |
-
1994
- 1994-04-17 DE DE4413121A patent/DE4413121A1/de not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999005288A2 (de) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Verfahren zur herstellung und identifizierung von neuen hydrolasen mit verbesserten eigenschaften |
WO1999005288A3 (de) * | 1997-07-25 | 1999-07-08 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Verfahren zur herstellung und identifizierung von neuen hydrolasen mit verbesserten eigenschaften |
DE112005000772B4 (de) * | 2004-04-07 | 2017-12-28 | Waters Technologies Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware) | Flüssigchromatographiereagenz und Verfahren zum Auftrennen von Enantiomeren |
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