DE4344929A1 - In vitro transformation complex for plants - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung bezieht sich auf einen in vitro Transformationskomplex.The invention relates to an in vitro transformation complex.
Es ist seit langem bekannt, daß Agrobacterium tumefaciens nach Befall höherer Pflanzen im Stammbereich Tumore erzeugt, die als "Wurzelhalsgallen" (crown galls) bezeichnet werden. Dabei wird ein ganz spezieller Teil des tumorinduzierenden Plasmids (Ti-Plasmid) vom Bakterium in die Pflanzenzelle übertragen und dort als T-DNA ins Kerngenom integriert. Dieser Vorgang wird von einigen chromosomalen Genen und beim Nopalin-Typ von insgesamt sechs Virulenzoperons gesteuert, die sich ebenfalls auf dem Ti-Plasmid befinden.It has long been known that Agrobacterium tumefaciens after infestation higher plants in the trunk area produced tumors that are considered "Crown galls" are called. It will be a whole special part of the tumor-inducing plasmid (Ti plasmid) from Bacteria transferred into the plant cell and there as T-DNA Integrated core genome. This process is used by some chromosomal Genes and in the nopaline type of a total of six virulence operons controlled, which are also on the Ti plasmid.
Dieses natürliche Transformationssystem, bei dem ein Stück DNA aus dem Bakterium in eine höhere Pflanze übertragen wird, wird seit mehreren Jahren erfolgreich dazu eingesetzt, um mittels gentechnischer Verfahren transgenische Pflanzen zu erzeugen. Daneben sind heute eine Reihe weiterer Verfahren bekannt, mit denen DNA-Sequenzen in pflanzliche Zellen, Protoplasten oder Pflanzen eingeschleust werden können, z. B. der direkte Gentransfer mittels PEG-Behandlung oder durch Elektroporation, der Partikelbeschuß oder die Verwendung von kationischen Liposomen. Diese Verfahren sind beispielsweise in folgenden Publikationen offenbart: Zambryski et al. (1983), EMBO J 12: 2143-2150; Deblaere et al. (1985), Nucleic Acid Research, Vol. 13, No. 13, 4777; Hain et al. (1985), Molec Gen Genet 199: 161-168; Paszkowski et al. (1984), EMBO J 3: 2717-2722; Negrutiu et al. (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363-373; Fromm etal. (1987), Methods Enzymol. 153: 351-366; Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417; Christou (1993), Curr. Opin. Biotechnol. 4: 135-141.This natural transformation system, in which a piece of DNA from the Bacteria transferred to a higher plant has been around for several Years successfully used to use genetic engineering to produce transgenic plants. There are a number of them today known further methods with which DNA sequences in plant Cells, protoplasts or plants can be introduced, e.g. B. direct gene transfer via PEG treatment or through Electroporation, particle bombardment or the use of cationic liposomes. These methods are as follows, for example Publications revealed: Zambryski et al. (1983), EMBO J 12: 2143-2150; Deblaere et al. (1985), Nucleic Acid Research, Vol. 13, No. 13, 4777; Hain et al. (1985) Molec Gen Genet 199: 161-168; Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 2717-2722; Negrutiu et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363-373; Fromm et al. (1987), Methods Enzymol. 153: 351-366; Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417; Christou (1993), Curr. Opin. Biotechnol. 4: 135-141.
Jedes der oben erwähnten Transformationssysteme besitzt bestimmte Vor- und Nachteile. Nachteilig sind die teilweise geringen Transformationsraten. Bei dem Agrobacterium-System ist vorteilhaft, daß in der Regel nur wenige oder nur eine Kopie der fremden DNA in das Pflanzengenom integriert wird und daß die übertragene DNA nur eine geringe Modifikation zeigt. Andererseits ist der Wirtsbereich von Agrobacterium eingeschränkt, so daß z. B. Getreide nicht transformiert werden können.Each of the transformation systems mentioned above has certain advantages and disadvantages. The sometimes small ones are disadvantageous Transformation rates. In the Agrobacterium system it is advantageous that usually only a few or only a copy of the foreign DNA in it Plant genome is integrated and that the transferred DNA is only one shows slight modification. On the other hand, the host range is from Agrobacterium restricted so that, for. B. Grain not transformed can be.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Transformationsmittel anzugeben, mit dem möglichst alle Arten von Pflanzen mit guter Effizienz transformiert werden können.The object of the invention is a means of transformation specify with the most possible all types of plants with good efficiency can be transformed.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen in vitro Transformationskomplex, der mindestens ein DNA-bindendes oder umhüllendes Protein, mindestens eine die Integration in ein pflanzliches Genom vermittelnde DNA-Sequenz und mindestens eine beliebige DNA-Sequenz aufweist, die an oder in die integrationsvermittelnde DNA-Sequenz gekoppelt oder integriert ist. The task is solved by an in vitro transformation complex, the at least one DNA binding or enveloping protein, at least one integration into a plant genome mediating DNA sequence and has at least any DNA sequence which on or in the integration-mediating DNA sequence is coupled or integrated.
Durch die in vitro-Herstellung eines derartigen Transformationskomplexes und dessen anschließende Übertragung in eine pflanzliche Zelle, einen Protoplasten, einen Pflanzenteil oder in die Pflanze selbst wird ein Transformationssystem bereitgestellt, mit dem alle höheren Pflanzen mit hoher Effizienz transformiert werden können.Through the in vitro production of such a transformation complex and its subsequent transfer into a plant cell, a Protoplasts, a part of a plant or in the plant itself becomes a Transformation system provided that all higher plants with high efficiency can be transformed.
Für den in vitro Transformationskomplex können beispielsweise die Komponenten aus Agrobacterium tumefaciens oder aus anderen Agrobacterium-Arten verwendet werden, die auch an dem natürlichen Transformationssystem beteiligt sind. Das mindestens eine DNA-bindende oder umhüllende Protein kann das VirD2- und/oder das VirE2-Protein umfassen. Als integrationsvermittelnde DNA-Sequenz kann die rechte und/oder die linke Bordersequenz der T-DNA aus Agrobacterium tumefaciens oder aus anderen Agrobacterium-Arten verwendet werden.For the in vitro transformation complex, for example Components from Agrobacterium tumefaciens or from others Agrobacterium species are used that are also on the natural Transformation system are involved. The at least one DNA binding or enveloping protein can be the VirD2 and / or the VirE2 protein include. The right-hand sequence can be used as an integration-mediating DNA sequence and / or the left border sequence of the T-DNA from Agrobacterium tumefaciens or from other Agrobacterium species.
Bei der Induktion der Virulenz (vir)-Genexpression durch pflanzliche Phenole werden die T-ONA-Borders spezifisch durch einen Proteinkomplex, der VirD1- und VirD2-Proteinuntereinheiten trägt, geschnitten (Stachel et al. (1986), Nature 322: 706-712; Zambryski (1988), Annu. Rev. Genet. 22: 1-30). VirD2 katalysiert unter Mitwirkung von VirD1 an den Borders der T-DNA eine Nicking-Reaktion und bindet anschließend selbst kovalent an das 5-Ende der genickten T-DNA. Außerdem ist die T-DNA noch von einem einzelstrangbindenden Protein (VirE2) umhüllt. Bisher sind am T-Komplex keine weiteren Proteine identifiziert worden. Auf dem Weg vom Bakterium zum pflanzlichen Zellkern muß der T-Komplex bakterielle und pflanzliche Membranen passieren, was nicht ohne spezifische Wechselwirkungen mit weiteren Proteinen vonstatten gehen kann. Man nimmt an, daß der T-Komplex durch die Proteinhülle vor DNAsen geschützt wird, durch VirE2 eine langgestreckte Form erhält und somit die Kernporen passieren kann, weil beide Proteine (VirD2 und VirE2) über Kernlokalisierungssignale verfügen (Zambryski (1992), Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 43: 465-490).In the induction of virulence (vir) gene expression by plant Phenols are the T-ONA Borders specific by a protein complex, which carries VirD1 and VirD2 protein subunits, cut (sting et al. (1986) Nature 322: 706-712; Zambryski (1988), Annu. Rev. Genet. 22: 1-30). VirD2 catalyzes with the participation of VirD1 to the Borders the T-DNA a nicking reaction and then binds itself covalently to the 5-end of the nodded T-DNA. In addition, the T-DNA is still encased by a single strand binding protein (VirE2). So far on T-complex no other proteins have been identified. On the way from The T complex must be bacterial and bacterial to the plant cell nucleus vegetable membranes happen, which is not without specific Interactions with other proteins can take place. One takes that the T complex is protected from DNAsen by the protein envelope, VirE2 maintains an elongated shape and thus the core pores can happen because both proteins (VirD2 and VirE2) are over Nuclear localization signals feature (Zambryski (1992), Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 43: 465-490).
Durch Klonierung z. B. der VirD1-, VirD2 und VirE2-Gene in einen Expressionsvektor und der Überproduktion der Genprodukte in E. coli mit anschließender Reinigung der entsprechenden Proteine können diese zur Herstellung des in vitro Transformationskomplexes verwendet werden. Als DNA-Substrat kann einzelsträngige T-DNA, z. B. die rechte T-DNA-Borderregion des Ti-Plasmids C58, verwendet werden. Es wurde gezeigt, daß das VirD2 Protein die gleiche Spaltungsreaktion zwischen der dritten und vierten Base der 25 bp T-DNA-Bordersequenz in vitro ausführt, wie dies bereits zuvor in vivo bestimmt wurde (Dürrenberger et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9154-9158). Ferner wurde gezeigt, daß das VirD2-Protein nach Spaltung der 25 bp T-DNA-Bordersequenz mit dem 5′-Ende des T-Stranges assoziiert bleibt und daß hinzugefügtes VirE2-Protein den T-Komplex umhüllt.By cloning z. B. the VirD1, VirD2 and VirE2 genes in one Expression vector and the overproduction of the gene products in E. coli with subsequent purification of the corresponding proteins can be used for Production of the in vitro transformation complex can be used. When DNA substrate can be single-stranded T-DNA, e.g. B. the right one T-DNA border region of the Ti plasmid C58 can be used. It was demonstrated that the VirD2 protein undergoes the same cleavage reaction between the third and fourth bases of the 25 bp T-DNA border sequence in vitro explains how this was previously determined in vivo (Dürrenberger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9154-9158). Further was demonstrated that the VirD2 protein after cleavage of the 25 bp T-DNA border sequence remains associated with the 5'-end of the T strand and that added VirE2 protein envelops the T complex.
Solch ein in vitro Transformationskomplex kann für die Transformation von höheren Pflanzen verwendet werden. Dazu kann ein Reportergen an die integrationsvermittelnde DNA-Sequenz gekoppelt werden. Dieses Reportergen kann beispielsweise das GUS-Gen (β-Glucuronidase) mit einem Intron verwendet werden (Töpfer et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15: 5890; Vancanneyt et al. (1990), Mol. Gen. Genet. 220: 245-250).Such an in vitro transformation complex can be used for transformation used by higher plants. A reporter gene can be sent to the integration-mediating DNA sequence are coupled. This For example, the reporter gene can contain the GUS gene (β-glucuronidase) Intron can be used (Töpfer et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15: 5890; Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220: 245-250).
In diesem Fall besteht der in vitro Transformationskomplex nach der Erfindung aus dem an die rechte Bordersequenz der T-DNA gekoppelten GUS-INT-Gen und den beiden Proteinen VirD2 und VirE2. Dieser in vitro Transformationskomplex kann nach seiner in vitro-Herstellung für die Transformation von höheren Pflanzen verwendet werden. In this case, the in vitro transformation complex exists after the Invention from that coupled to the right border sequence of the T-DNA GUS-INT gene and the two proteins VirD2 and VirE2. This in vitro Transformation complex can be used for the in vitro production Transformation of higher plants can be used.
Indem der in vitro Transformationskomplex in vitro hergestellt und direkt in die Pflanze übertragen wird, werden die vielfältigen chemischen Interaktionen zwischen den Agrobakterien und den verwundeten Pflanzenzellen bzw. die komplizierte Mobilisierung des T-Komplexes ausgeklammert. Der in vitro Transformationskomplex schützt die DNA vor einem Abbau und schleust die DNA in den Zellkern ein, wobei die DNA in transkriptionsaktive Bereiche integriert wird. Mit dem in vitro Transformationskomplex nach der Erfindung lassen sich somit alle Vorteile der Genfähre Agrobacterium nutzen und die Nachteile, z. B. eingeengter Wirtsbereich, vermeiden. Die Erfindung führt somit zu folgenden Verbesserungen: Alle Pflanzen können transformiert werden; in der Regel wird nur eine Kopie der fremden DNA in das Pflanzengenom integriert; die Transformationsrate übersteigt zum Teil deutlich alle bisher üblichen Methoden des sogenannten direkten Gentransfers; die übertragene DNA zeigt die für Agrobacterium übliche geringe Modfikation und die DNA wird vorzugsweise in transkribierbare Bereiche integriert.By making the in vitro transformation complex in vitro and is transferred directly into the plant, the diverse chemical interactions between the agrobacteria and the wounded Plant cells or the complicated mobilization of the T complex excluded. The in vitro transformation complex protects the DNA degradation and introduces the DNA into the cell nucleus, the DNA in transcription-active areas is integrated. With the in vitro Transformation complexes according to the invention can all be Take advantage of the Agrobacterium gene ferry and the disadvantages, e.g. B. Avoid restricted host area. The invention thus leads to following improvements: All plants can be transformed; in usually just a copy of the foreign DNA into the plant genome integrated; the transformation rate in some cases significantly exceeds all of them previously common methods of so-called direct gene transfer; the DNA transferred shows the minor modification customary for Agrobacterium and the DNA is preferably integrated into transcribable areas.
Für die Gewinnung, Darstellung und Reinigung der für den in vitro Transformationskomplex zu verwendenden Proteine und DNA-Sequenzen können die bekannten biochemischen Verfahren auf dem Gebiet der Protein- und Nucleinsäurechemie verwendet werden. Die Herstellung des in vitro Transformationskomplexes geschieht unter solchen in vitro-Bedingungen, daß das mindestens eine Protein bzw. Proteinfragment die mindestens eine DNA-Sequenz umhüllt und/oder an diese bindet. Die entsprechenden Bedingungen sind bekannt bzw. können in einfacher Weise ermittelt werden. Z. B. kann gereinigtes VirD2- und VirE2-Protein mit einzelsträngiger DNA in 20-100 mM Tris-Cl (pH 7-9), 2-50 mM Mgcl₂, 0,5-2 mM Dithiothreitol, 20-200 µM EDTA, 0-200 µg/ml Rinderserumalbumin bei 0-37°C für etwa 30 Minuten bis 24 Stunden inkubiert werden. Dazu können beispielsweise 200 µg Protein und 1 ng DNA verwendet werden. Dieser Inkubationsansatz kann anschließend direkt zur Transformation verwendet werden. Alternativ ist es möglich, den in vitro Transformationskomplex durch ionenaustauscher-Chromatographie oder durch Dichtegradientenzentrifugation zu reinigen. Der in vitro gebildete Transformationskomplex kann für Transformationsexperimente mit pflanzlichen Zellen, Protoplasten oder pflanzlichem Gewebe eingesetzt werden. Zur Kontrolle eines erfolgreichen Transfers in die Pflanzenzelle wird eine einzelsträngige Substrat-DNA benutzt, die beispielsweise neben dem unteren Strang der rechten Border der T-DNA die kodierenden Sequenzen eines Reportergens, z. B. das GUS-Reportergen, enthält. Der in vitro Transformationskomplex nach der Erfindung kann durch verschiedene Methoden in die Pflanzenzellen transferiert werden.For the extraction, presentation and purification of the for in vitro Transformation complex proteins and DNA sequences to be used the known biochemical methods in the field of protein and Nucleic acid chemistry can be used. The production of the in vitro Transformation complex happens under such in vitro conditions, that the at least one protein or protein fragment the at least one DNA sequence envelops and / or binds to it. The corresponding Conditions are known or can be determined in a simple manner become. For example, purified VirD2 and VirE2 protein can also single-stranded DNA in 20-100 mM Tris-Cl (pH 7-9), 2-50 mM Mgcl₂, 0.5-2 mM dithiothreitol, 20-200 µM EDTA, 0-200 µg / ml Bovine serum albumin at 0-37 ° C for about 30 minutes to 24 hours be incubated. For example, 200 µg protein and 1 ng DNA be used. This incubation approach can then be used directly for Transformation. Alternatively, it is possible to use the in vitro Transformation complex by ion exchange chromatography or by To clean density gradient centrifugation. The one formed in vitro Transformation complex can be used for transformation experiments plant cells, protoplasts or plant tissues become. To control a successful transfer into the plant cell a single-stranded substrate DNA is used, for example in addition to the lower strand of the right border of the T-DNA encoding Sequences of a reporter gene, e.g. B. the GUS reporter gene contains. The in vitro transformation complex according to the invention can by various Methods are transferred into the plant cells.
Blattmesophyll-Protoplasten, z. B. von N. tabacum cv. cultiva Petite Havanna SR1, oder Protoplasten aus einer Suspensionskultur der Gerstensorte Golden Promise können nach Zugabe des in vitro Transformationskomplexes mit Polyethylenglykol (PEG) nach der Methode von Negrutiu et al. (Plant Mol. Biol. 8: 363-373, 1987) oder nach Maas und Werr (Plant Cell Report 8: 148-151, 1989) behandelt werden. Ferner kann das Elektroporationsverfahren (Joersbo und Brunstedt (1991), Physiol. Plant. 81: 256-264) angewandt werden, wobei hier der in vitro Transformationskomplex zusammen mit Blattmesophyll-Protoplasten einem elektrischen Feld ausgesetzt wird.Leaf mesophyll protoplasts, e.g. B. from N. tabacum cv. cultiva petite Havana SR1, or protoplasts from a suspension culture of Barley variety Golden Promise can be added after in vitro Transformation complex with polyethylene glycol (PEG) according to the method by Negrutiu et al. (Plant Mol. Biol. 8: 363-373, 1987) or according to Maas and Werr (Plant Cell Report 8: 148-151, 1989). Further can the electroporation process (Joersbo and Brunstedt (1991), Physiol. Plans. 81: 256-264) are used, here the in vitro Transformation complex together with leaf mesophyll protoplasts electrical field is exposed.
Die Transformation kann ferner mit dem kationischen Liposomen-Verfahren durchgeführt werden (Spörlein und Koop (1991), Theor. Appl. Genet. 83, 1-5). Der in vitro Transformationskomplex wird dazu mit Liposomen "verpackt" und zu Protoplasten gegeben.The transformation can also be carried out using the cationic liposome method be carried out (Spörlein and Koop (1991), Theor. Appl. Genet. 83, 1-5). The in vitro transformation complex will do this with liposomes "packed" and added to protoplasts.
Der in vitro Transformationskomplex kann auch z. B. an Goldpartikel gebunden und mit einer pneumatischen Partikelkanone auf Pflanzengewebe, wie Suspensionskulturen von Tabak und Gerste, Pflanzenteilen, wie Blatt, Blattbasen, Wurzeln, trockene reife Samen, quellende Samen, unreife Embryonen sowie insbesondere Scutellum und Epiplast von Getreiden, geschossen werden. Der Partikelbeschuß ist beispielsweise beschrieben von Christou in Curr. Opin. Biotechnol. 4: 135-143 (1993).The in vitro transformation complex can also, for. B. on gold particles bound and with a pneumatic particle cannon on plant tissue, like suspension cultures of tobacco and barley, parts of plants like leaves, Leaf bases, roots, dry ripe seeds, swelling seeds, unripe Embryos and in particular scutellum and epiplast of cereals, be shot. Particle bombardment is described, for example by Christou in Curr. Opin. Biotechnol. 4: 135-143 (1993).
Alle oben erwähnten Pflanzenteile können grundsätzlich auch durch Mikroinjektion des in vitro Transformationskomplexes transformiert werden gemäß Reich et al. (Bio/Technol. 4: 1001-1004, 1986) bzw. Neuhaus et al. (Theor. Appl. Genet. 75: 279-290, 1987).All parts of the plant mentioned above can in principle also by Microinjection of the in vitro transformation complex transformed are according to Reich et al. (Bio / Technol. 4: 1001-1004, 1986) or Neuhaus et al. (Theor. Appl. Genet. 75: 279-290, 1987).
Die Transformation von pflanzlichem Gewebe oder pflanzlichen Zellen bzw. Protoplasten mit einem in vitro Transformationskomplex kann ferner durch zusätzliche Komponenten unterstützt werden, die den Integrationsprozeß optimieren. So können die pflanzlichen Zellen mit Restriktionsenzymen vor oder während der Transformation behandelt werden, um die Pflanzen-DNA zu öffnen. Mittels Chemikalien, UV- und/oder Röntgenstrahlen können Reparaturmechanismen induziert werden, die zu erhöhten Einbauraten führen können. Zur Erhöhung der Transformationsraten können ferner benutzt werden: Elektroschock, Ultraschall, Mikrowellen, Hitzeschock, Kälteschock, Trockenstreß, Welkereize oder die Induktion von Streßproteinen. Die Zellkulturen, deren Zellen zu transformieren sind, können ferner synchronisiert werden, wobei die DNA-Übertragung zu einem speziellen Zeitpunkt im Zellzyklus erfolgt. Ferner kann die Transformation mit einem in vitro Transformationskomplex und gleichzeitiger Cokultur mit z. B. Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes oder anderen Agrobacterium-Arten durchgeführt werden. Bei der Transformation mit dem in vitro Transformationskomplex ist es ferner möglich, das Gewebe gleichzeitig mit Enzymen zu inkubieren, wie Kinasen, Transferasen, Helikasen, Nukleasen, Topoisomerasen, Ligasen oder ONA/RNA-Polymerasen. Auch der Einsatz von integrationsfördernden Substanzen, wie ATP, ist möglich.The transformation of plant tissue or plant cells or Protoplasts with an in vitro transformation complex can also by additional components are supported that support the integration process optimize. So the plant cells with restriction enzymes to be treated before or during the transformation Open plant DNA. By means of chemicals, UV and / or X-rays can induce repair mechanisms that are too can lead to increased installation rates. To increase the Transformation rates can also be used: electric shock, Ultrasound, microwaves, heat shock, cold shock, dry stress, Wilting stimuli or the induction of stress proteins. The cell cultures, whose cells are to be transformed can also be synchronized the DNA transfer at a specific point in time Cell cycle occurs. Furthermore, the transformation with an in vitro Transformation complex and simultaneous coculture with z. B. Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes or others Agrobacterium species are carried out. When transforming with the in vitro transformation complex it is also possible to remove the tissue incubate simultaneously with enzymes such as kinases, transferases, Helicases, nucleases, topoisomerases, ligases or ONA / RNA polymerases. The use of substances that promote integration, such as ATP, is also possible.
Anstelle des oben beschriebenen VirE2- und/oder VirD2-Proteins kann die DNA des in vitro Transformationskomplexes auch mit anderen DNA-bindenden und/oder umhüllenden Proteinen versehen werden. Es sind alle Proteine geeignet, die mindestens eine oder mehrere der folgenden Funktionen aufweisen: Sie binden an DNA, schützen die DNA vor Degradation, transportieren die DNA in den Zellkern und vermitteln die Integration der DNA in das pflanzliche Genom. Solche geeigneten Proteine sind beispielsweise im Anspruch 3 aufgeführt. Diese Proteine können einzeln oder gemischt verwendet werden, wobei auch wesentliche Proteinteile ausreichend sind, sofern sie eine der obigen Funktionen ausüben können.Instead of the VirE2 and / or VirD2 protein described above, the DNA of the in vitro transformation complex also with other DNA-binding and / or enveloping proteins. They are all proteins capable of performing at least one or more of the following functions exhibit: They bind to DNA, protect the DNA from degradation, transport the DNA into the cell nucleus and mediate the integration of DNA in the plant genome. Such suitable proteins are listed for example in claim 3. These proteins can be used individually or mixed, with essential protein parts are sufficient if they can perform one of the above functions.
Die integrationsvermittelnde DNA-Sequenz des in vitro Transformationskomplexes kann jede DNA-Sequenz sein, sofern sie eine Integration in das Pflanzengenom vermittelt. Solche Sequenzen sind beispielsweise in den Ansprüchen 5 und 6 aufgeführt.The integration-mediating DNA sequence of the in vitro Transformation complex can be any DNA sequence, provided that it is a Integration into the plant genome mediated. Such sequences are listed for example in claims 5 and 6.
An oder in die integrationsvermittelnde DNA-Sequenz kann eine beliebige DNA-Sequenz gekoppelt bzw. integriert sein. Diese beliebige DNA-Sequenz kann z. B. die kodierende Sequenz eines Reportergens und/oder eines Resistenzgens sein. Die beliebige DNA-Sequenz kann ferner eine regulatorische Sequenz aufweisen. Any on or in the integration-mediating DNA sequence DNA sequence can be coupled or integrated. Any DNA sequence can e.g. B. the coding sequence of a reporter gene and / or one Resistance gene. Any DNA sequence can also be a have regulatory sequence.
Das bakterielle Gen für die β-Glucuronidase (GUS) wird vielfach als Reportergen in pflanzlichen Systemen benutzt. Durch das Einfügen eines Introns aus einem Kartoffelgen wird die Expression in Bakterien verhindert, so daß die gemessene Enzymaktivität allein auf Expression in der transformierten Pflanze zurückzuführen ist. Das GUS-Gen mit Intron wird GUS-INT genannt. Das GUS-INT befindet sich in Plasmid p35S GUS-INT in der Pflanzen-Expressionkassette des Vektors pRT102 (Töpfer et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15: 5890). Durch Schneiden mit Bam HI und HindIII wurde der 35S Promotor entfernt, die Polyadenylierungsstelle der Kassette jedoch belassen. Der binäre Agrobacterium-Vektor wurde ebenfalls mit den beiden Restriktionsenzymen geschnitten, wobei die Polyadenylierungsstelle des nos-Gens deletiert wurde. Durch die Ligation des GUS-INT-Fragments mit dem Vektor wurde das promotorlose GUS-INT mit seinem 5′-Ende direkt neben die rechte Border des Vektors gesetzt und das Plasmid pPCV6NF GUS-INT geschaffen. Aus diesem Plasmid wurde das GUS-1NT-Gen mitsamt der rechten Border mit Sph I ausgeschnitten und in die entsprechende Schnittstelle des Vektors pUC118 eingesetzt. Das neu gebildete Plasmid pGIRB 118 ist in den Fig. 1 und 2 dargestellt.The bacterial gene for β-glucuronidase (GUS) is widely used as a reporter gene in plant systems. By inserting an intron from a potato gene, expression in bacteria is prevented, so that the measured enzyme activity is solely due to expression in the transformed plant. The GUS gene with intron is called GUS-INT. The GUS-INT is in plasmid p35S GUS-INT in the plant expression cassette of the vector pRT102 (Töpfer et al. (1987), Nucl. Acids Res. 15: 5890). The 35S promoter was removed by cutting with Bam HI and HindIII, but the polyadenylation site of the cassette was left. The binary Agrobacterium vector was also cut with the two restriction enzymes, the polyadenylation site of the nos gene being deleted. By ligation of the GUS-INT fragment with the vector, the promoterless GUS-INT with its 5′-end was placed directly next to the right border of the vector and the plasmid pPCV6NF GUS-INT was created. The GUS-1NT gene, together with the right border, was cut out of this plasmid using Sph I and inserted into the corresponding interface of the vector pUC118. The newly formed plasmid pGIRB 118 is shown in FIGS . 1 and 2.
In den Figuren bezeichnen LB und RB die linke und rechte Border der T-DNA aus Agrobactium tumefaciens, Ap das Gen für β-Lactamase, P den 35S Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), pA die Polyadenylierungsstelle, GUS-INT das Gen für die β-Glucuronidase mit Intron. In the figures, LB and RB denote the left and right borders of the T-DNA from Agrobactium tumefaciens, Ap the gene for β-lactamase, P den 35S cauliflower mosaic virus (CaMV) promoter, pA die Polyadenylation site, GUS-INT with the gene for the β-glucuronidase Intron.
Aus dem Plasmid pGIRB118 kann mit Hilfe eines M13 Helferphagen aus E. coli einzelsträngige zirkuläre DNA gewonnen werden, die als Substrat für die Herstellung des in vitro Transformationskomplexes dient.From the plasmid pGIRB118, helper phage from E. coli single-stranded circular DNA can be obtained as a substrate for the production of the in vitro transformation complex serves.
Ein E. coli Stamm mit dem Plasmid pGIRB118 wurde unter der Bezeichnung GIRB118 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegte und hat die Hinterlegungsnummer . . . erhalten.An E. coli strain with the plasmid pGIRB118 was named GIRB118 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Federal Republic Germany, in accordance with the provisions of the Budapest Contract deposited and has the deposit number. . . receive.
Die Gene VirD1, VirD2 und VirE2 wurden aus dem Plasmid pGV0361 (Depicker et al. (1980), Plasmid 3: 193-211) isoliert, ein pBR322 Vektor, welcher ein 15,83 kb großes Fragment mit der VirD- und VirE-Region und Teile der VirC-Region des Nopalin-Typ Ti-Plasmides pTIC58 trägt. Zur besseren Handhabung wurden die Bam HI-Fragmente Nr. 13 (3,78 kb) mit den Vir-Genen VirD1 und VirD2 und Nr. 15 (3,39 kb) mit dem VirE2-Gen jeweils in den Vektor pBSK- kloniert. Die Nummern geben die Bam HI-Fragmente des pTIC58 nach der Größe sortiert an. Die neu gebildeten Plasmide erhielten die Namen Ba 13 BS bzw. Ba 15 BS. Zur Überexpression in Escherichia coli wurden die Vir-Gene in den Expressionsvektor pET3b kloniert (Rosenberg et al (1987), Gene 56: 125-135). Vom Fragment Nr. 15 wurde durch das Schneiden mit der Restriktionsendonuklease Bam HI das Startkodon ATG des VirE2-Gens entfernt. Durch Ligation des Fragments in richtiger Orientierung mit der Bam Hi-Schnittstelle des Vektors pET3b wurde eine translationale Fusion des VirE2-Gens mit den Kodons der ersten 12 Aminosäuren des Gens 10 des T7 Bacteriophagen hergestellt. Eine solche aminoterminale Fusion führt nicht zum Verlust der DNA-Bindungsaktivität des VirE2-Proteins (Citovsky et al. (1988), Science 240: 501-504). Das Plasmid wurde pET Ba15 genannt. Für die Klonierung der Gene VirD1 und VirD2 wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Mullis und Faloona (1987) Methods Enzymol. 155: 335-350) unter Verwendung der Taq-Polymerase (Saiki et al. (1988) Science 239: 487-491) eingesetzt, um eine optimale Expression in dem Expressionsvektor pET3b ohne translationale Fusion zu gewährleisten. Eine Fusion am N-Terminus des VirD1-Proteins führt zum Verlust der Aktivität des Proteins im heterologen E. coli System. Die Primer-Oligonukleotide für die PCR wurden so gestaltet, daß nur die offenen Leseramen der VirD1- und VirD2-Gene bzw. beide Gene zusammen als Transkriptionseinheit, aber ohne zusätzliche Sequenzen an den 5′ und 3′-Enden, amplifiziert wurden. Außerdem wurden an die Primer, die das 5′-Ende der PCR-Produkte definieren, die Schnittstellen für Nde I und Bam HI (vom Translationsstart aus gelesen) angehängt, und an die Primer, die das 3′-Ende definieren, die Schnittstelle für Bam HI. Für jedes Konstrukt wurde die PCR in drei unabhängigen Ansätzen durchgeführt. Die Größe der PCR-Produkte betrug für VirD1 0,44 kb, für VirD2 1,34 kb und für VirD1/VirD2 1,82 kb. Nach dem Schneiden mit Bam HI wurden die PCR-Produkte zunächst mit der Bam HI-Schnittstelle des Vektors pTTQ18 ligiert (Starck (1987) Gene 51: 255-267). Aus diesem Vektor wurden die PCR-Produkte mit Nde I und Bam HI wieder herausgeschnitten und in den ebenso geschnittenen Expressensionsvektor pET3b eingesetzt. Dadurch befand sich das Initiationscodon der Translation in optimaler Entfernung zu der Shine-Dalgarno-Sequenz des Expressionsvektors. Die gebildeten Konstrukte wurden pET VirD1, pET VirD2 und pET VirD1/D2 genannt.The genes VirD1, VirD2 and VirE2 were isolated from the plasmid pGV0361 (Depicker et al. (1980), plasmid 3: 193-211), a pBR322 vector which is a 15.83 kb fragment with the VirD and VirE region and carries parts of the VirC region of the nopalin-type Ti plasmid pTIC58. For better handling the Bam HI fragments were No. 13 (3.78 kb) with the Vir genes VirD1 and VirD2 and No. 15 (3.39 kb) with the VirE2 gene respectively into the vector pBSK -.. Cloned. The numbers indicate the Bam HI fragments of the pTIC58 sorted by size. The newly formed plasmids were given the names Ba 13 BS and Ba 15 BS. For overexpression in Escherichia coli, the Vir genes were cloned into the expression vector pET3b (Rosenberg et al (1987), Gene 56: 125-135). The start codon ATG of the VirE2 gene was removed from fragment No. 15 by cutting with the restriction endonuclease Bam HI. A translational fusion of the VirE2 gene with the codons of the first 12 amino acids of gene 10 of the T7 bacteriophage was produced by ligating the fragment in the correct orientation with the Bam Hi interface of the vector pET3b. Such an amino terminal fusion does not lead to loss of the DNA binding activity of the VirE2 protein (Citovsky et al. (1988), Science 240: 501-504). The plasmid was named pET Ba15. For the cloning of the VirD1 and VirD2 genes, the polymerase chain reaction (PCR; Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol. 155: 335-350) was used using Taq polymerase (Saiki et al. (1988) Science 239: 487- 491) used to ensure optimal expression in the expression vector pET3b without translational fusion. A fusion at the N-terminus of the VirD1 protein leads to the loss of the activity of the protein in the heterologous E. coli system. The primer oligonucleotides for the PCR were designed so that only the open reading names of the VirD1 and VirD2 genes or both genes were amplified together as a transcription unit, but without additional sequences at the 5 'and 3' ends. In addition, the interfaces for Nde I and Bam HI (read from the translation start) were added to the primers that define the 5'-end of the PCR products, and the interface for for the primers that define the 3'-end Bam HI. The PCR was carried out in three independent approaches for each construct. The size of the PCR products was 0.44 kb for VirD1, 1.34 kb for VirD2 and 1.82 kb for VirD1 / VirD2. After cutting with Bam HI, the PCR products were first ligated to the Bam HI site of the vector pTTQ18 (Starck (1987) Gene 51: 255-267). The PCR products with Nde I and Bam HI were cut out of this vector and inserted into the expression vector pET3b, which had also been cut. As a result, the initiation codon of the translation was at an optimal distance from the Shine-Dalgarno sequence of the expression vector. The constructs formed were called pET VirD1, pET VirD2 and pET VirD1 / D2.
Die Klonierung der Gene VirD1, VirD2 und VirE2 in den Expressionsvektor pET3b ist in der Fig. 3 gezeigt. Der obere Abschnitt der Fig. 3 zeigt einen Ausschnitt aus der Bam HI-Restriktionskarte des pTiC58. Die Nummern geben die Bam HI-Fragmente des Ti-Plasmides, der Größe nach sortiert, an. Die mit "D" und "E gekennzeichneten Pfeile über der Restriktionskarte markieren die Region des VirD- und des VirE-Operons. PCR bezeichnet die Polymerase-Kettenreaktion, Ap das β-Lactamase-Gen, während P, S und T den Promotor, die Shine/Dalgarno-Sequenz und den Transkriptionsterminator des T7 RNA Polymerase-Expressionsvektors kennzeichnen.The cloning of the genes VirD1, VirD2 and VirE2 into the expression vector pET3b is shown in FIG. 3. The upper section of FIG. 3 shows a section of the Bam HI restriction map of pTiC58. The numbers indicate the Bam HI fragments of the Ti plasmid, sorted according to size. The arrows marked "D" and "E above the restriction map mark the region of the VirD and VirE operon. PCR denotes the polymerase chain reaction, Ap the β-lactamase gene, while P, S and T the promoter Characterize Shine / Dalgarno sequence and the transcription terminator of the T7 RNA polymerase expression vector.
- E. coli Stämme mit den Plasmiden pET VirD2 und pET Ba 15 wurden als ET VirD2 und ET Ba 15 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und haben die Hinterlegungsnummern erhalten.E. coli strains with the plasmids pET VirD2 and pET Ba 15 were identified as ET VirD2 and ET Ba 15 at the German Collection of Microorganisms and Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany, in accordance with the provisions of Budapest contract and have the deposit numbers receive.
Zur Überexpression der Vir-Gene wurden die Bakterien (E. coli BL21 (DE3); Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185: 60-89) mit den entsprechenden Expressionsplasmiden bis zu einer optischen Dichte (2 = 600 nm) von 0,5 herangezogen und dann durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert und für weitere drei Stunden inkubiert, bevor sie geerntet wurden.The bacteria (E. coli BL21 (DE3); Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185: 60-89) with the corresponding expression plasmids up to an optical density (2 = 600 nm) of 0.5 and then added by adding IPTG a final concentration of 0.5 mM induced and for another three hours incubated before they were harvested.
Die Isolation und Reinigung der Einschlußkörper aus E. coli erfolgte nach der Methode von Schmidt et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9581-9585, 1986). Das Zellsediment aus 250 ml Kulturvolumen wurde in 20 ml 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) aufgenommen. Dann wurden die Bakterienzellen durch Ultraschallbehandlung mit der Micro-Tip eines Branson Sonifiers in 30 Sekunden Abständen mit Kühlpausen für insgesamt 5-10 Minuten aufgeschlossen. Anschließend wurde der Ansatz 30 Minuten bei 10000 upm und 4°C zentrifugiert (JA 20 von Beckman). Das Sediment wurde in 10-20 ml 20% Saccharose, 3 mM EDTA (pH 7,6) aufgenommen und erneut für 30 Minuten bei 11000 upm und 4°C zentrifugiert. Das Einschlußkörper-Sediment wurde bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.The E. coli inclusion bodies were isolated and cleaned using the method of Schmidt et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9581-9585, 1986). The cell sediment from 250 ml culture volume was in 20 ml 50 mM Tris-Cl (pH 8.0) was added. Then the bacterial cells by ultrasound treatment with the micro tip of a Branson Sonifier in 30 second intervals with cooling breaks for a total of 5-10 minutes open minded. The mixture was then run at 10,000 rpm for 30 minutes and 4 ° C centrifuged (JA 20 from Beckman). The sediment was in 10-20 ml of 20% sucrose, 3 mM EDTA (pH 7.6) added and again Centrifuged for 30 minutes at 11000 rpm and 4 ° C. The Inclusion body sediment was stored at -20 ° C until use.
Die drei Vir-Proteine VirD1, VirD2 und VirE2 wurden der
Renaturierungsprozedur nach Buchner und Rudolph (Bio/Technol. 9:
157-162, 1991) unterzogen. Die Einschlußkörper einer 250-500 ml
Bakterienkultur wurden in 500 µl Solubilisierungspuffer aufgelöst, in
ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 30 Minuten bei 37°C mit
gelegentlichem Mischen (Vortex) inkubiert. Nach fünfminütiger
Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 13000 upm wurde der
Überstand in 50 ml Renaturierungspuffer (1 : 100) verdünnt (Falcon 2070).
Für VirD2 enthielt der Solubilisierungspuffer 100 mM Dithiothreitol
(Endkonzentration zur Renaturierung somit 1 mM). Die Inkubation im
Renaturierungspuffer erfolgte bei 22°C über Nacht. Für VirD1 und VirE2
enthielt der Renaturierungspuffer 5 mM/0,5 mM Glutathion
reduziert/oxidiert. Die Inkubation erfolgte für zwei Tage bei 8°C.
Anschließend wurden alle drei Proteine über Nacht gegen Dialysepuffer
dialysiert.
Solubilisierungspuffer: 20 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 6 M
Guanidiniumhydrochlorid.
Renaturierungspuffer: 20 mM Tris-Cl (pH 7,6), 1 mM EDTA, 0,4 M Arginin,
mit HCl auf pH 7,6 eingestellt.
Dialysepuffer:
für VirD1: 25 mM Tris-Cl (pH 7,6), 50 µM EDTA.
für VirD2: 25 mM Tris-Cl (pH 7,6), 50 µM EDTA, 1 mM Dithiothreitol.
für VirE2: 25 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM EDTA.The three Vir proteins VirD1, VirD2 and VirE2 were subjected to the renaturation procedure according to Buchner and Rudolph (Bio / Technol. 9: 157-162, 1991). The inclusion bodies of a 250-500 ml bacterial culture were dissolved in 500 μl solubilization buffer, transferred into an Eppendorf reaction vessel and incubated for 30 minutes at 37 ° C. with occasional mixing (vortex). After centrifugation for five minutes in an Eppendorf centrifuge at 13000 rpm, the supernatant was diluted in 50 ml renaturation buffer (1: 100) (Falcon 2070). For VirD2 the solubilization buffer contained 100 mM dithiothreitol (final concentration for renaturation thus 1 mM). Incubation in the renaturation buffer was carried out at 22 ° C. overnight. For VirD1 and VirE2, the renaturation buffer contained 5 mM / 0.5 mM glutathione reduced / oxidized. Incubation was at 8 ° C for two days. All three proteins were then dialyzed overnight against dialysis buffer.
Solubilization buffer: 20mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM EDTA, 6M guanidinium hydrochloride.
Renaturation buffer: 20 mM Tris-Cl (pH 7.6), 1 mM EDTA, 0.4 M arginine, adjusted to pH 7.6 with HCl.
Dialysis buffer:
for VirD1: 25 mM Tris-Cl (pH 7.6), 50 µM EDTA.
for VirD2: 25 mM Tris-Cl (pH 7.6), 50 µM EDTA, 1 mM dithiothreitol.
for VirE2: 25 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA.
Die Dialyseschläuche wurden nach der Methode von Pohl (Methods Enzymol. 182: 68-83, 1990) vor der Benutzung behandelt. Für VirD1 wurden Dialyseschläuche mit Poren einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 6-8 kDa (Spectra/Porl) verwandt, für VirD2 und VirE2 Schläuche mit Poren von 12-14 kDa Ausschlußgrenze (Servapor).The dialysis tubes were made according to the method of Pohl (Methods Enzymol. 182: 68-83, 1990) before use. For VirD1 Dialysis tubing with pores with a molecular weight cutoff of 6-8 kDa (Spectra / Porl) related, for VirD2 and VirE2 hoses with Pores of 12-14 kDa exclusion limit (Servapor).
Nach der Dialyse wurden die Proben 30 Minuten bei 8000 upm und 4°C im JS13 (Beckman) zentrifugiert. Das Sediment wurde in der Solubilisierungslösung wieder aufgenommen. Die Proteingehalte im Sediment und im Überstand wurden gegen die Solubilisierungslösung bzw. den Dialysepuffer bestimmt und auf das ursprüngliche Gesamtvolumen bestimmt. Aus den gewonnenen Werten wurde die Löslichkeit nach der Renaturierungsprozedur, ausgedrückt in % des löslichen Proteins von der insgesamt eingesetzten Proteinmenge, ermittelt.After dialysis, the samples were kept at 8000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes JS13 (Beckman) centrifuged. The sediment was in the Solubilization solution resumed. The protein content in the Sediment and in the supernatant were against the solubilization solution or determined the dialysis buffer and to the original total volume certainly. The solubility after the Renaturation procedure, expressed in% of the soluble protein from the total amount of protein used.
Das nach der Dialyse in Lösung gebliebene Protein wurde mit Hilfe einer P1 Peristaltikpumpe auf eine HiTrap Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia Biotech) mit einem Bettvolumen von 1 ml aufgetragen, die mit 10 ml Dialysepuffer äquilibriert worden war. Danach wurde die Säule mit 5 ml Dialysepuffer gewaschen. Die Elution der Proteine erfolgte in einem NaCl Stufengradienten im Dialysepuffer. Zunächst wurde eine Salzkonzentration auf die Säule gegeben, bei der ein Teil der kontaminierenden Proteine, aber noch nicht das überproduzierte Protein von der Säule eluiert wurde. Dann wurde das überproduzierte Protein bei höherer Salzkonzentration (380 mM für VirD2; 250 mM NaCl für VirD1) in 3 ml Dialysepuffer eluiert. Anschließend wurden jegliche noch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine mit 2 M NaCl eluiert. Die Flußrate betrug 2 ml/Minuten.The protein remaining in solution after dialysis was removed using a P1 peristaltic pump on a HiTrap heparin-Sepharose column (Pharmacia Biotech) with a bed volume of 1 ml, that with 10 ml Dialysis buffer had been equilibrated. The column was then washed with 5 ml Dialysis buffer washed. The proteins were eluted in a NaCl Step gradients in the dialysis buffer. First there was a salt concentration placed on the column where some of the contaminating proteins but the overproduced protein has not yet been eluted from the column. Then the overproduced protein became at higher salt concentration (380 mM for VirD2; 250 mM NaCl for VirD1) eluted in 3 ml dialysis buffer. Then any that were still attached to the column material Proteins eluted with 2 M NaCl. The flow rate was 2 ml / minutes.
Für die Herstellung des in vitro Transformationskomplexes wurde gereinigtes VirD2-Protein und VirE2-Protein verwendet. Ein einzelsträngiges DNA-Fragment, bestehend aus dem GUS INT-Gen und der rechten Bordersequenz der T-DNA aus Agrobacterium tumefaciens, wurde mit bekannten Methoden aus dem Plasmid pGIRB118 gewonnen. Je 100 µg der Proteine wurden mit 1 ng DNA für eine Stunde bei 37°C in 20 mM Tris-HCl (pH 9,0), 5 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 100 µM EDTA, 100 µg/ml Rinderserumalbumin inkubiert.For the production of the in vitro transformation complex purified VirD2 protein and VirE2 protein used. A single-stranded DNA fragment consisting of the GUS INT gene and the right border sequence of T-DNA from Agrobacterium tumefaciens, was with known methods from the plasmid pGIRB118. 100 µg each Proteins were mixed with 1 ng DNA for one hour at 37 ° C in 20 mM Tris-HCl (pH 9.0), 5 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol, 100 µM EDTA, 100 µg / ml Bovine serum albumin incubated.
Der so hergestellte in vitro Transformationskomplex wurde zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten eingesetzt. In einigen Fällen wurde der in vitro Transformationskomplex durch Ionenaustauscher-Chromatographie oder Dichtegradientenzentrifugation gereinigt.The in vitro transformation complex produced in this way became Transformation of plant protoplasts used. In some Cases, the in vitro transformation complex was developed Ion exchange chromatography or density gradient centrifugation cleaned.
Es konnte gezeigt werden, daß VirD2 eine sequenz- und strangspezifische (unterer Strang der T-DNA-Bordersequenz) Spaltung eines einzelsträngigen DNA-Substrates an den 25 bp Bordersequenzen der T-DNA katalysiert. Dies wurde bestätigt mit in vitro Transformationskomplexen, bei denen nur VirD2 oder VirD2 und VirD1 eingesetzt wurden. Dazu wurden die DNA-Substrate an ihren 5′-Enden mittels T7 Polynucleotidkinase markiert. Um die Verbindung zwischen dem 5′-Ende des T-Stranges und VirD2 zu zeigen, wurde ein T-DNA-Borderfragment an seinem 3′-Ende des unteren Stranges durch DNA Polymerase Klenow Fragment markiert. Für diese Untersuchungen wurden bekannte molekularbiologische Verfahren eingesetzt (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, USA). Es wurde eine durchschnittliche 50%ige Spaltung der T-Strang-DNA festgestellt, wobei ein Sättigungsgleichgewicht beobachtet wurde. Das VirD2-Protein verbleibt kovalent, zumindest sehr fest an dem 5′-Ende der T-DNA gebunden. Es wurde ferner gezeigt, daß das VirE2-Protein an dem Transformationskomplex haftet.It could be shown that VirD2 is a sequence and strand specific (lower strand of the T-DNA border sequence) Cleavage of a single strand DNA substrate catalyzed at the 25 bp border sequences of the T-DNA. This was confirmed with in vitro transformation complexes in which only VirD2 or VirD2 and VirD1 were used. For this, the DNA substrates labeled at their 5 'ends using T7 polynucleotide kinase. To the connection between the 5'-end of the T-strand and VirD2 too show was a T-DNA border fragment at its 3'-end of the lower Stranges marked by DNA polymerase Klenow fragment. For this Known molecular biological methods have been used (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, USA). there has been a averaged 50% cleavage of the T-strand DNA, whereby a saturation balance was observed. The VirD2 protein remains covalent, at least very firmly at the 5 'end of the T-DNA bound. It has also been shown that the VirE2 protein on the Transformation complex is liable.
Tabak-Mesophyllprotoplasten, Petite SR1, wurden nach bekannten Verfahren isoliert (Pröls et al. (1988), Plant Cell Report 17: 221-224). Ca. 2,5-3 g Blattmaterial wurde in 20 ml Enzymlösung (1,5% Cellulase R10; 0,5% Mazerozym R10 (SERVA), pH 5,7, im Kulturmedium) für 16 Stunden im Dunkeln inkubiert. Nach 20-minütigem Schütteln bei 100 upm wurden Gewebereste bei der Filtration durch Stahlsiebe mit 300 und 100 µm Maschenweite abgetrennt. Durch Zentrifugation wurden Zelltrümmer und flotierende Protoplasten voneinander abgetrennt. Die Protoplasten wurden dreimal in dem Kulturmedium gewaschen und zentrifugiert. Die Protoplastenausbeute wurde mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.Tobacco mesophyll protoplasts, Petite SR1, were made by known methods isolated (Pröls et al. (1988) Plant Cell Report 17: 221-224). Approx. 2.5-3 g of leaf material was dissolved in 20 ml of enzyme solution (1.5% cellulase R10; 0.5% Mazerozym R10 (SERVA), pH 5.7, in the culture medium) for 16 hours in Incubated in the dark. After shaking at 100 rpm for 20 minutes Tissue residues during filtration through steel sieves with 300 and 100 µm mesh size separated. Cell debris became by centrifugation and floating protoplasts separated. The protoplasts were washed three times in the culture medium and centrifuged. The Protoplast yield was determined using a Neubauer counting chamber.
Die Gewinnung von Gerste-Protoplasten der Sorte Golden Promise bzw. deren Kultur erfolgte nach bekannten Methoden (Lührs und Lörz (1987), Theor. Appl. Genet. 75: 16-25; Lührs und Lörz (1988), Planta 175: 71-81). The extraction of barley protoplasts of the Golden Promise variety or their culture was carried out according to known methods (Lührs and Lörz (1987), Theor. Appl. Genet. 75: 16-25; Lührs and Lörz (1988), Planta 175: 71-81).
Die Transformation der Protoplasten erfolgte nach den Methoden von Negrutiu et al. (Plant Mol. Biol. 8: 363-373, 1987), Fromm et al. (Methods Enzymol. 153: 351-366, 1987) und Maas und Werr (Plant Cell Report 8: 148-150, 1989).The protoplasts were transformed using the methods of Negrutiu et al. (Plant Mol. Biol. 8: 363-373, 1987), Fromm et al. (Methods Enzymol. 153: 351-366, 1987) and Maas and Werr (Plant Cell Report 8: 148-150, 1989).
Durch die Expression des GUS-Reportergens kann die Effizienz des Gentransfers verfolgt werden. Mittels des Substrates X-Gluc wird die Enzymaktivität der β-Glucuronidase anhand der Blaufärbung der transformierten Zellen nachgewiesen. Hier wurde ein Reportergen ohne Promotor verwendet, so daß der Nachweis der Enzymaktivität ein Zeichen für die Integration der transferierten DNA in der Nähe eines Promotors im pflanzlichen Genom ist. Dieses Gen erlaubt auch eine quantitative colorimetrische Bestimmung nach Jefferson et al. (EMB0 J 6: 3901-3907, 1987). Die Vergleichsversuche wurden mit "nackter" DNA durchgeführt, d. h. mit dem entsprechenden DNA-Fragment aus pGIRB118 bzw. mit diesem Plasmid selbst.By expressing the GUS reporter gene, the efficiency of the Gene transfers are tracked. By means of the substrate X-Gluc Enzyme activity of β-glucuronidase based on the blue color of the transformed cells detected. Here was a reporter gene without Promoter used so that the detection of enzyme activity is a sign for the integration of the transferred DNA in the vicinity of a promoter is in the plant genome. This gene also allows quantitative colorimetric determination according to Jefferson et al. (EMB0 J 6: 3901-3907, 1987). The comparative experiments were carried out with "naked" DNA, i.e. H. with the corresponding DNA fragment from pGIRB118 or with this Plasmid itself.
Bei transformierten Tabakprotoplasten zeigten die Kulturen, welche mit dem in vitro Transformationskomplex transformiert worden waren, nach 7-tägiger Kulturdauer eine mindestens 5- bis 10-fach erhöhte Transformationsrate im Vergleich zu den Kulturen, die mit "nackter" DNA transformiert worden waren. Ebenso konnte eine Blaufärbung von mit dem in vitro Transformationskomplex transformierten Gerste-Protoplasten gezeigt werden.In the case of transformed tobacco protoplasts, the cultures which the in vitro transformation complex had been transformed, after 7-day culture duration increased at least 5 to 10 times Transformation rate compared to the cultures with "naked" DNA had been transformed. Likewise, a blue color from with the in vitro transformation complex transformed barley protoplasts to be shown.
Die Verwendung des in vitro Transformationskomplexes für die Transformation von höheren Pflanzen führt somit zu höheren Transformationsraten bei Tabak- und Gersten-Protoplasten bzw. bei Tabak- und Gerstenpflanzen. The use of the in vitro transformation complex for the Transformation of higher plants thus leads to higher ones Transformation rates for tobacco and barley protoplasts or for tobacco and barley plants.
Die Getreide-Transformation ist heute gebräuchlich, z. B. bei Reis (Toriyama et al. (1988), Bio/Technol. 6: 1072-1074; Zhang und Wu (l988), Theor. Appl. Genet. 76: 135-140; Peng et al. (1992), Theor. Appl. Genet. 83: 855-863), Weizen (Vasil et al. (1991), Bio/Technol. 10: 667-674; Weeks et al. (1983), Plant Physiol. 102: 1077-1084), Mais (Dhalluin et al. (1992), Plant Cell 4: 1495 - 1505; Gordon-Kamm et al. (1990), Plant Cell 2: 603-618) oder Hafer (Somers et al. (1992), Bio/Technol. 10: 1589-1594).The grain transformation is common today, e.g. B. with rice (Toriyama et al. (1988) Bio / Technol. 6: 1072-1074; Zhang and Wu (l988), Theor. Appl. Genet. 76: 135-140; Peng et al. (1992), Theor. Appl. Genet. 83: 855-863), wheat (Vasil et al. (1991) Bio / Technol. 10: 667-674; Weeks et al. (1983) Plant Physiol. 102: 1077-1084), Maize (Dhalluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505; Gordon-Kamm et al. (1990), Plant Cell 2: 603-618) or oats (Somers et al. (1992), Bio / Technol. 10: 1589-1594).
Claims (20)
mindestens ein DNA-bindendes oder umhüllendes Protein,
mindestens eine die Integration in ein pflanzliches Genom vermittelnde DNA-Sequenz und
mindestens eine beliebige DNA-Sequenz aufweist, die an oder in die integrationsvermittelnde DNA-Sequenz gekoppelt oder integriert ist.1. In vitro transformation complex, characterized in that it
at least one DNA-binding or enveloping protein,
at least one DNA sequence mediating the integration into a plant genome and
has at least any DNA sequence that is coupled to or integrated into the integration-mediating DNA sequence.
- a) die DNA-Sequenz des in vitro Transformationskomplexes wird in das Genom einer Pflanzenzelle oder eines Protoplasten inseriert.
- b) die erzielten transformierten pflanzlichen Zellen exprimieren mindestens ein Genprodukt, dessen Information auf der beliebigen DNA-Sequenz liegt und
- c) die transformierten Zellen werden zu genetisch transformierten Pflanzen regeneriert.
- a) the DNA sequence of the in vitro transformation complex is inserted into the genome of a plant cell or a protoplast.
- b) the transformed plant cells obtained express at least one gene product, the information of which lies on any DNA sequence, and
- c) the transformed cells are regenerated to genetically transformed plants.
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1993
- 1993-12-31 DE DE19934344929 patent/DE4344929A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
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