DE4343261C2 - Process for the preparation of raw materials for immunoassays and bioassays - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method according to the preamble of claim 1.

Immunoassays und Bioassays sind sehr empfindliche spezifische Nachweisverfahren, die im Nano- und Picogramm­ bereich arbeiten. Daher kann man mit sehr verdünnten Lösungen arbeiten, und benötigt nur eine geringe Menge an Ausgangsstoffen.Immunoassays and bioassays are very sensitive specific detection methods in the nano- and picogram work area. Therefore you can use very diluted Solutions work, and only require a small amount of Raw materials.

Aber gerade in der organischen Chemie bereitet die Um­ setzung kleiner Stoffmengen (Nano- bis Mikrogrammbereich) auf Grund der Adsorption der Stoffe an der Glaswand des Reaktionsgefäßes Probleme. Daher kann kommt es oftmals vor, daß die Edukte an der Gefäßwand adsorbiert werden, und keine Reaktion stattfindet, oder daß das Produkt an der Gefäßwand adsorbiert wird, und nicht isoliert werden kann.But especially in organic chemistry the Um prepares settlement of small quantities (nano to microgram range) due to the adsorption of the substances on the glass wall of the Reaction vessel problems. Therefore, it can often happen that the starting materials are adsorbed on the vessel wall, and no reaction takes place, or that the product is on the vessel wall is adsorbed and not isolated can.

Zu dem Stand der Technik gehört das von Hosada und Ishikawa beschriebene Verfahren zur Kopplung von Haptenen an Trägersubstanzen. [H. Hosada, E. Ishikawa, Chemical Coupling Methods in Immunochemistry. In: R.F. Masseyeff, W. H. Albert, N. A. Staines (eds.): Methods of Immunological Analysis, Volume 2, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1993, Seiten 431-438]. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Haptene in Lösung auf verschiedene Art und Weise an Proteine und fluoreszierende oder lumineszierende Substanzen gekoppelt werden. Da die Kopplung in Lösung stattfindet, setzt dies eine einheitliche Löslichkeit der Substanzen und vor allem eine ausreichend große Stoffmenge voraus. Aus diesem Grund dürfte das Verfahren nicht für Mengen im Mikro- und Nanogrammbereich geeignet sein. Außerdem dauert die Reaktion mehrere Stunden. In dem von Hosada und Ishikawa vorgestellten Verfahren wird das hergestellte Produkt über eine Aluminiumsäule aufgereinigt. Diese Säule dient nur der Aufreinigung, die Kopplung erfolgt in Lösung.The state of the art includes that of Hosada and Ishikawa described method for coupling haptens on carrier substances. [H. Hosada, E. Ishikawa, Chemical Coupling Methods in Immunochemistry. In: R.F. Masseyeff, W.H. Albert, N.A. Staines (eds.): Methods of Immunological Analysis, Volume 2, VCH Publishing Company, Weinheim, 1993, pages 431-438]. It acts it is a process in which haptens in solution different ways of proteins and fluorescent or luminescent substances coupled become. Since the coupling takes place in solution, this sets uniform solubility of the substances and before ahead of everything a sufficiently large amount of substance. Out for this reason, the procedure should not apply to quantities be suitable in the micro and nanogram range. also the reaction takes several hours. In that of Hosada and Ishikawa The process presented will be the manufactured product cleaned over an aluminum column. This pillar serves purification only, coupling takes place in solution.

Das Patent DE 36 20 653 A1 beschäftigt sich mit der Herstellung von immunreaktiven Trägermaterialien für die heterogene immunologische Analyse. Darin wird ein Verfahren zur Herstellung von Trägermatrizen beschrieben.The patent DE 36 20 653 A1 deals with the Manufacture of immunoreactive carrier materials for the heterogeneous immunological analysis. This is a procedure described for the production of carrier matrices.

Die Kopplung von Haptenen an Trägerproteine erfolgt allgemein auf naßchemischem Wege, indem man ein Hapten mit Carboxylgruppe und ein Trägerprotein mit Aminogruppe unter Verwendung eines Säurekatalysators koppelt. Diese Reaktion wurde bereits 1957 beschrieben [Erlanger, B.F.; Borek, F.; Beiser, S.M:; Liebermann, S.; J. Biol. Chem. 288, 713 (1957)]. Ein Anwendungsbeispiel für diese Kopplungsreaktion ist z. B. die Bestimmung von Cannabinoiden in Körperflüssigkeiten, wie sie von Burstein S. [US 3656906] beschrieben wird. Dabei werden die Cannabinoide katalytisch mit einer Poly­ carbonsäure zu Delta-lactoncannabinoiden umgesetzt, die anschließend in die freie Säure oder das Salz überführt werden, die eine intensive Fluoreszenz zeigen.Haptens are coupled to carrier proteins generally by wet chemistry by using a hapten Carboxyl group and a carrier protein with amino group under Coupling using an acid catalyst. This reaction was already described in 1957 [Erlanger, B.F .; Borek, F .; Beiser, S.M :; Liebermann, S .; J. Biol. Chem. 288, 713 (1957)]. An application example for this coupling reaction is e.g. B.  the determination of cannabinoids in body fluids, as described by Burstein S. [US 3656906]. The cannabinoids are catalytically mixed with a poly carboxylic acid converted to delta-lactone cannabinoids, the then converted into the free acid or salt that show intense fluorescence.

Das Hauptmerkmal der oben beschriebenen Reaktion besteht darin, daß der Säurekatalysator die Carbonsäure aktiviert und das entstehende Reaktionswasser bindet. Daher besteht der Nachteil dieses Verfahrens darin, daß man für alle beteiligten Komponenten ein einheitliches, wasserfreies Lösemittel/-gemisch benötigt. Deshalb ist dieses Verfahren für wasserlösliche Substanzen oder schwerlösliche Substanzen, die sich in verschiedenen Lösemittel/-gemischen lösen nicht geeignet.The main feature of the reaction described above is in that the acid catalyst activates the carboxylic acid and binds the resulting water of reaction. Therefore there is the disadvantage of this method is that it is for everyone components involved a uniform, anhydrous Solvent / mixture required. That is why this procedure for water-soluble substances or poorly soluble substances Substances that are in different solvents / mixtures not suitable to solve.

Ein Alternativverfahren zu der oben beschriebenen Kopplungsreaktion, speziell für Phallotoxine, stellt das von Barak S.; Nothnagel E A.; Webb W W und Yocum R R [US 4489001] beschriebene Verfahren dar. Dabei koppelt man die Carbonsäure von Phallacidin mit einem Diamin oder Alkohol unter Zuhilfenahme von Diazomethan. Anschließend setzt man das so erhaltene Produkt mit einem Marker um, der eine mikroskopische Bestimmung erlaubt.An alternative method to that described above Coupling reaction, especially for phallotoxins, provides by Barak S .; Nothnagel E A .; Webb W W and Yocum R R [US 4489001] describes the method described the carboxylic acid of phallacidin with a diamine or Alcohol with the help of diazomethane. Subsequently the product thus obtained is reacted with a marker which microscopic determination allowed.

Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es auf die Carbonsäure des Phallacidins beschränkt ist. Außerdem handelt es sich um ein aufwendiges Verfahren, das mit Markern arbeitet, die lebende Zellen enthalten.The disadvantage of this method is that it is based on the carboxylic acid of phallacidine is limited. also it is a complex process that with Works with markers that contain living cells.

Das große Interesse an der Synthese von markierten Haptenen und der Kopplung von Haptenen mit Trägerproteinen begründet sich in ihrer Verwendung für Immunoassays. Wie variabel dieses Verfahren ist, wird von Deutsch D G beschrieben [US 4921788]. Bei den Immunoassays handelt es sich um sehr empfindliche Nachweisverfahren, die im Nano- bis Picogrammbereich arbeiten. Grundlage dieser Immunoassays ist die Reaktion von Haptenen oder Antigenen mit den dafür spezifischen Antikörpern. Markiert man ein Hapten, so konkurrieren die Haptene oder Antigene, die sich gegebenenfalls in der zu untersuchenden Probe befinden, mit den markierten Haptenen um die verfügbaren spezifischen Antikörper. Mißt man nun die Konzentration der gebundenen bzw. der nicht gebundenen markierten Haptenen, so kann man daraus auf die Konzentration an Haptenen oder Antigenen in der Probe schließen. Da es sich dabei um ein einfaches, reproduzierbares Verfahren handelt, ist das Interesse an markierten Haptenen, sowie an Antigenen für die Anti­ körperherstellung, verständlich.The great interest in the synthesis of labeled Haptens and the coupling of haptens with carrier proteins is based on their use for immunoassays. As This method is variable, is used by Deutsch D G described [US 4921788]. The immunoassays are are very sensitive detection methods in the nano to Picogram area work. Basis of this Immunoassays are the reaction of haptens or antigens with the specific antibodies. You mark one  Hapten, so do the haptens or antigens that compete if necessary, are in the sample to be examined with the marked haptens around the available specific ones Antibody. If you measure the concentration of the bound or the unbound labeled haptens, so you can from it to the concentration of haptens or antigens in close the sample. Since this is a simple, reproducible process is the interest on labeled haptens, as well as on antigens for the anti body making, understandable.

Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß man für jedes nachzuweisende Hapten oder Antigen ein markiertes Hapten, und ein Antigen für die Antikörperherstellung benötigt.The disadvantage of this method is that for each hapten or antigen to be detected is a labeled one Hapten, and an antigen for antibody production needed.

Betrachtet man z. B. die handelsüblichen Radio-immuno­ assays, so besteht ihr Nachteil oft in der relativ kurzen Halbwertszeit, und der dadurch bedingten kurzen Halt­ barkeit des markierten Haptens.Looking at z. B. the commercially available radio-immuno assays, their disadvantage is often the relatively short Half-life, and the resulting short stop availability of the marked hapten.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur präparitiven Herstellung von Ausgangsstoffen für Immunoassays und Bioassays anzugeben, welches auch noch mit kleinsten Stoffmengen in kürzester Zeit durchführbar ist.The invention is therefore based on the object of a method for preparative production of starting materials for immunoassays and bioassays indicate which can be carried out with the smallest amounts of substance in the shortest possible time.

Aus diesen Gründen besteht ein Bedarf an lumineszenz­ markierten Haptenen und einem Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie zur Herstellung der haptenkorrespon­ dierenden Antigene für die Antikörperherstellung. Das Verfahren sollte auch für schwerlösliche und wasserlösliche Substanzen ausführbar sein, und stabile Verbindungen liefern.For these reasons there is a need for luminescence labeled haptens and a process for their Manufacturing, as well as manufacturing the hapten correspondence antigens for antibody production. The Procedures should also be for poorly soluble and water soluble Substances are executable, and stable connections deliver.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den kennzeichnen­ den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Aus­ führungen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.According to the invention, this object is characterized by the solved the features of claim 1. Favorable off guidance results from the characteristics of the subclaims.

Überraschenderweise war es dadurch möglich, mehrere verschiedene Lösungen mit saurem, basischem und/oder wäßrigem Charakter auf eine handelsübliche Trägermatrix aufzutragen, und dennoch die gewünschte Umsetzung zu erhalten. Dieser uner­ wartete Effekt beruht wahrscheinlich darauf, das die als erstes aufgetragene Komponente an der Trägeroberfläche adsorbiert und damit fixiert wird. Dadurch wird eine größere Oberfläche geschaffen, an der die Umsetzung erfolgen kann. Es scheint so zu sein, daß durch diese Adsorption an der Trägeroberfläche die unterschiedlichen Lösemitteleigenschaften abgeschwächt werden und die Reaktivität der Substanzen erhöht wird.Surprisingly, this made it possible to have several different solutions with acidic, basic and / or to apply aqueous character to a commercially available carrier matrix, and still get the desired implementation. This unbelievable waited effect is probably due to the fact that the first applied component on the carrier surface  is adsorbed and thus fixed. This will make one created larger surface on which to implement can be done. It seems that through this The different adsorption on the carrier surface Solvent properties are weakened and the Reactivity of the substances is increased.

Überraschenderweise ist dadurch eine Reaktion möglich, die ohne Trägermatrix auf naßchemischem Wege so nicht möglich gewesen wäre.Surprisingly, this enables a reaction that not possible in a wet chemical way without a carrier matrix would have been.

Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß man dabei nicht auf gepackte Kartuschen oder Säulen angewiesen ist, sondern daß man handelsübliche Dünnschicht-Chromatographie- Platten verwenden kann. Das hat den Vorteil, daß man die Platten nach dem Gebrauch verwerfen kann und keine Recycling-Verfahren braucht. Außerdem sind diese Platten kostengünstig und in einer großen Auswahl an modifizierten Kieselgelen zu erhalten. Deshalb kann man je nach der Be­ schaffenheit der umzusetzenden Komponenten die entsprechend modifizierten Kieselgelplatten verwenden. Außerdem gibt es diese Platten in unterschiedlichen Schichtdicken, so daß man je nach der umzusetzenden Substanzmenge die ent­ sprechende Platte auswählen kann.Surprisingly, it has been shown that you can does not rely on packed cartridges or columns, but that commercially available thin-layer chromatography Can use plates. This has the advantage that you can Discard plates after use and none Recycling process needs. Besides, these are plates inexpensive and in a large selection of modified Obtain silica gels. Therefore, depending on the Be the components to be implemented accordingly use modified silica gel plates. There is also these plates in different layer thicknesses, so that depending on the amount of substance to be converted, the ent can choose speaking plate.

Dabei gibt es zwei Vorgehensweisen:There are two ways of doing this:

• a) Zeigt das betreffende Hapten bei 254 nm keine Absorption und besitzt auch keine Eigenfluoreszenz, dann koppelt man zuerst den Lumineszenzmarker mit dem Spacer unter Zuhilfenahme eines Säurekatalysator, und erhält das fluoreszierende Zwischenprodukt (I).
  Anschließend koppelt man (I) mit dem entsprechenden Hapten, wobei man ebenfalls einen Säurekatalysator verwendet, und erhält das Endprodukt (II).
  Der Vorteil besteht darin, daß man bei jedem Umsetzungs­ schritt ein fluoreszierendes Edukt und Produkt hat. Auf diese Weise kann man nach der Chromatographie unter einer handelsüblichen UV-Lampe überprüfen, ob die Reaktion erfolgt ist. Da bei beiden Teilschritten Dünnschichtchromatographie-Platten verwendet werden, kann nach der Derivatisierung eine chromatographische Auftrennung von Edukt und Produkt erfolgen.a) If the hapten in question shows no absorption at 254 nm and also has no inherent fluorescence, then the luminescence marker is first coupled to the spacer with the aid of an acid catalyst, and the fluorescent intermediate (I) is obtained.
  Then you couple (I) with the corresponding hapten, also using an acid catalyst, and the end product (II) is obtained.
  The advantage is that you have a fluorescent starting material and product with each implementation step. In this way you can check after chromatography under a commercially available UV lamp whether the reaction has taken place. Since thin-layer chromatography plates are used in both sub-steps, the starting material and product can be separated chromatographically after derivatization.
• b) Zeigt das Hapten eine Absorption bei 254 nm, dann koppelt man das Hapten mit dem betreffenden Spacer unter An­ wesenheit eines Säurekatalysator zum Zwischenprodukt (I). Dann koppelt man (I) mit dem Lumineszenzmarker unter Zuhilfenahme eines Säurekatalysators, und enthält das Endprodukt (II).
  Auf diese Weise kann man den ersten Reaktionsschritt unter der UV-Lampe bei 254 nm betrachten, um festzu­ stellen, ob die Reaktion erfolgt ist. Der zweite Reaktionsschritt liefert ein fluoreszierendes Produkt, das unter der UV-Lampe bei 366 nm lokalisiert werden kann.
  Diese Vorgehensweise kann man natürlich auch für Haptene anwenden, die keine Absorption bei 254 nm zeigen, wenn man einen handelsüblichen Scaner besitzt, um die Zwischen- und Endprodukte zu lokalisieren. Auch hier erfolgt die Trennung von Edukt und Produkt chromato­ graphisch.b) If the hapten shows an absorption at 254 nm, then the hapten is coupled to the spacer in question in the presence of an acid catalyst for the intermediate (I). Then one couples (I) with the luminescence marker with the aid of an acid catalyst and contains the end product (II).
  In this way, the first reaction step under the UV lamp at 254 nm can be seen to determine whether the reaction has taken place. The second reaction step provides a fluorescent product that can be located under the UV lamp at 366 nm.
  This procedure can of course also be used for haptens that do not show absorption at 254 nm if you have a commercially available scanner to localize the intermediate and end products. Here, too, the educt and product are separated chromatographically.

Sowohl bei a) als auch bei b) werden die reagierenden Komponenten in molaren Mengenverhältnissen eingesetzt, der Säurekatalysator in 10 bis 100fachem Überschuß.Both in a) and in b) the reacting Components used in molar proportions, the Acid catalyst in a 10 to 100-fold excess.

Die Auftragsreihenfolge dabei ist so, daß man zuerst das Amin aufträgt, dann die Carbonsäure und zum Schluß den Säurekatalysator.The order of the orders is such that one first Amine applies, then the carboxylic acid and finally the Acid catalyst.

Bei beiden Vorgehensweisen erhält man Endprodukte der allgemeinen Formel:With both approaches you get end products of general formula:

HAPTEN - SPACER - Lumineszenzmarker.HAPTEN - SPACER - luminescent marker.

Dabei benötigt man ein Hapten mit einer reaktionsfähigen funktionellen Gruppe, wie z. B. -NH₂, -COOH, -COOR, -NHR usw. oder eine in eine reaktionsfähige Gruppe ohne Zerstörung des Haptens umwandelbare Gruppe, wie z. B. -NO₂ (katalytische Hydrierung: Reduktion zur Aminogruppe).You need a hapten with a reactive one functional group, such as B. -NH₂, -COOH, -COOR, -NHR etc. or one in a reactive group without Destruction of the hapten convertible group, such as B. -NO₂  (Catalytic hydrogenation: reduction to the amino group).

Der Spacer muß zwei funktionelle Gruppen besitzen, wie z. B. -NH₂ oder -COOH. Geeignet dafür ist z. B. β-Alanin oder Bernsteinsäure und alle linearen oder verzweigten Derivate.The spacer must have two functional groups, such as e.g. B. -NH₂ or -COOH. Suitable for this is B. β-alanine or Succinic acid and all linear or branched derivatives.

Außerdem benötigt man einen handelsüblichen Lumineszenz­ marker, wie z. B. ABEI (4-Aminobutylethylisoluminol).You also need a commercially available luminescence markers such as B. ABEI (4-aminobutylethylisoluminol).

Das oben beschriebene Verfahren läßt sich auch für die Antigenherstellung einsetzen. Dabei trägt man zuerst das Trägerprotein auf die entsprechende Trägermatrix auf, um eine größere Oberfläche zu schaffen, mit der das Hapten anschließend besser reagieren kann. Auch hier benötigt man einen Säurekatalysator.The method described above can also be used for Use antigen production. You wear that first Carrier protein onto the corresponding carrier matrix in order to to create a larger surface with which the hapten can then react better. Needed here too one an acid catalyst.

Das beschriebene Verfahren ist ein sehr variables Verfahren, daß sich produktspezifisch variieren läßt. Es eignet sich besonders für schwerlösliche und/oder reaktionsträge Verbindungen, da durch das Verwenden der Trägermatrix Lösemitteleinflüsse abgeschwächt werden. Außerdem kann man während des Auftragens die Auftragezone mit Warm- oder Kaltluft trocknen, um den Lösemitteleinfluß zusätzlich zu vermindern. Dies ist besonders geeignet für leicht flüchtige Lösemittel.The process described is a very variable process that can be varied depending on the product. It is suitable especially for poorly soluble and / or inert Connections because by using the carrier matrix Solvent influences are weakened. You can also during application the application zone with warm or Dry cold air to further increase the influence of solvent Reduce. This is particularly suitable for easy volatile solvents.

Ein weiterer Vorteil besteht auch darin, daß man, falls die Umsetzung nicht erfolgt, die Edukte chromatographisch abtrennen, ausschaben und eluieren kann. Dies ist besonders bei Feinchemikalien vorteilhaft.Another advantage is that if the reaction does not take place, the starting materials chromatographically can separate, scrape and elute. This is special advantageous for fine chemicals.

Ein großer Vorteil der Verfahren a) und b) besteht darin, daß man das Produkt aufgezogen auf Kieselgel erhält. Das erlaubt nicht nur eine Einwaage in Milligramm Kieselgel mit Nano- bis Picogrammengen an markiertem Hapten, sondern auch eine Stabilisierung des Endproduktes, denn Lösungen von Lumineszenzmarkern weisen oft innerhalb von Wochen Spaltprodukte auf, die ebenfalls fluoreszieren und dadurch die Messung stören können.A great advantage of methods a) and b) is that that the product is grown on silica gel. The not only allows weighing in milligrams of silica gel Nano to picogram quantities on marked hapten, but also a stabilization of the end product, because solutions of luminescent markers often show up within weeks Fission products that also fluoresce  and can interfere with the measurement.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu beschränken:The following examples illustrate the invention without it to restrict:

Beispiel 1example 1 Herstellung von ABEI-markiertem β-AmanitinProduction of ABEI-labeled β-amanitin

• a) Herstellung des Zwischenproduktes (I):
  35 µl (0,9 µmol) einer ABEI-Lösung [7,2 mg ABEI gelöst in 1 ml Ethylacetat/Eisessig = 1+1], 10 µl (0,9 µmol) einer β-Alaninlösung [8,6 mg gelöst in 1 ml MeOH/H₂Obidest.= 2+0,25) und 100 µl (10 µmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) [20 mg in 1 ml CH₂Cl₂] werden in dieser Reihenfolge bandförmig auf eine DC-Platte Kieselgel 60 (MERCK) auf­ getragen. Nach dem Trocknen der Auftragezone entwickelt man die Platte in einer Trogkammer bei Kammersättigung mit dem Fließmittel MeOH/H₂O/Essigsäure = 10+1+0,1. Die Laufzeit beträgt 20 min. Anschließend lokalisiert man das Produkt unter der UV-Lampe bei 366 nm. Der hRf-Wert für ABEI beträgt 20-35 und der für das Zwischenprodukt 70-80. Das so lokalisierte Zwischenprodukt wird ausgeschabt und in Ethylacetat/Essigsäure = 3+1 gelöst.a) Preparation of the intermediate (I):
  35 µl (0.9 µmol) of an ABEI solution [7.2 mg ABEI dissolved in 1 ml ethyl acetate / glacial acetic acid = 1 + 1], 10 µl (0.9 µmol) of a β-alanine solution [8.6 mg dissolved in 1 ml of MeOH / H₂Obidest. = 2 + 0.25) and 100 µl (10 µmol) of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) [20 mg in 1 ml of CH₂Cl₂] are applied in the form of a tape to a TLC plate of silica gel 60 (MERCK). After the application zone has dried, the plate is developed in a trough chamber with chamber saturation using the eluent MeOH / H₂O / acetic acid = 10 + 1 + 0.1. The run time is 20 min. The product is then located under the UV lamp at 366 nm. The hRf value for ABEI is 20-35 and that for the intermediate 70-80. The intermediate product thus localized is scraped out and dissolved in ethyl acetate / acetic acid = 3 + 1.
• b) Kopplung des Zwischenproduktes mit β-Amanitin (II):
  18 µl (0,01 µmol) einer Lösung von (I) [0,2 µg/µl], 20 µl einer β-Amanitin-Lösung [0,5 mg/ ml MeOH] und 10 µl DCC [20 mg in 1 ml CH₂Cl₂] werden in dieser Reihenfolge auf eine Diphenyl-F-reversed phase Platte (WHATMAN) band­ förmig aufgetragen. Nach dem Trocknen der Auftragezone wird die Platte in einer Trogkammer bei Kammersättigung mit dem Fließmittel MeOH/H₂Obidest. = 4+1 entwickelt. Die Laufzeit beträgt 15 Minuten. Das entstandene Produkt kann unter der UV-Lampe bei 366 nm lokalisiert werden. Der hRf-Wert von (I) beträgt 80-90 und der von (II) 62-72.b) Coupling of the Intermediate with β-Amanitin (II):
  18 µl (0.01 µmol) of a solution of (I) [0.2 µg / µl], 20 µl of a β-amanitin solution [0.5 mg / ml MeOH] and 10 µl DCC [20 mg in 1 ml CH₂Cl₂] are applied in this order to a diphenyl-F-reversed phase plate (WHATMAN). After drying the application zone, the plate is in a trough chamber with chamber saturation with the eluent MeOH / H₂Obidest. = 4 + 1 developed. The running time is 15 minutes. The resulting product can be located under the UV lamp at 366 nm. The hRf of (I) is 80-90 and that of (II) 62-72.

Beispiel 2Example 2 Herstellung der ABEI-markierten Tetrahydrocannabinol­ carbonsäure (THC-carbonsäure)Production of the ABEI-labeled tetrahydrocannabinol carboxylic acid (THC-carboxylic acid)

• a) Herstellung des Zwischenproduktes (I):
  Die Herstellung von (I) erfolgt wie unter Beispiel 1a) beschrieben.a) Preparation of the intermediate (I):
  (I) is prepared as described in Example 1a).
• b) Kopplung des Zwischenproduktes (I) mit der THC- carbonsäure:
  20 µl (0,11 µmol) einer Lösung von (I) [0,2 µg/µl], 38 µl (0,11 µmol) einer THC-carbonsäure-Lösung [1 µg/µl Ethanol absolut] und 12 µl (1,1 µmol) einer DCC-Lösung [20 mg in 1 ml CH₂Cl₂] werden in dieser Reihenfolge auf eine Diphenyl-F-reversed phase Platte (WHATMAN) band­ förmig aufgetragen. Nach dem Trocknen der Auftragezone wird die Platte in einer Trogkammer bei Kammersättigung mit dem Fließmittel MeOH/H₂Obidest. = 4+1 entwickelt. Die Laufzeit beträgt 15 Minuten. Das entstandene Produkt kann unter der UV-Lampe bei 366 nm lokalisiert werden. Der hRf-Wert von (I) beträgt 80-90 und der von (II) 62-72.b) Coupling of the intermediate (I) with the THC carboxylic acid:
  20 µl (0.11 µmol) of a solution of (I) [0.2 µg / µl], 38 µl (0.11 µmol) of a THC-carboxylic acid solution [1 µg / µl absolute ethanol] and 12 µl (1st , 1 µmol) of a DCC solution [20 mg in 1 ml CH₂Cl₂] are applied in this order to a diphenyl-F-reversed phase plate (WHATMAN) tape-shaped. After drying the application zone, the plate is in a trough chamber with chamber saturation with the eluent MeOH / H₂Obidest. = 4 + 1 developed. The running time is 15 minutes. The resulting product can be located under the UV lamp at 366 nm. The hRf of (I) is 80-90 and that of (II) 62-72.

Beispiel 3Example 3 Herstellung von ABEI-markiertem FlunitrazepamProduction of ABEI-labeled flunitrazepam

• a) Kopplung von Flunitrazepam mit der Bernsteinsäure:
  Da Flunitrazepam eine Nitrogruppe als funktionelle Gruppe besitzt, muß diese zunächst zur Aminogruppe reduziert werden. Dabei wendet man das allgemein bekannte Verfahren der Mikrohydrierung an.
  Dabei löst man 10 mg Flunitrazepam in 10 ml MeOH und spült die Apparatur mit Stickstoff. Dann fügt man 10 mg eines Hydrierungskatalysators (PtO₂/Adams-Katalysator) hinzu, spült erneut mit Stickstoff und leitet anschließend Wasserstoff in die Lösung. Die Reaktion dauert mehrere Stunden und kann mit Hilfe der Dünnschichtchromato­ graphie überprüft werden [Fließmittel: CH₂Cl₂, Kammer­ sättigung, Laufzeit 13 Minuten, HPTLC-Platten Kieselgel 60 (MERCK)].
  Ausbeute: 1-2%.
  Eine Aufreinigung der so hergestellten Lösung, die Nebenprodukte enthält, ist nicht erforderlich.
  50 µl der so hergestellten Lösung, 20 µl (0,17 µmol) einer Bernsteinsäurelösung [1 µg/µl MeOH] und 35 µl (1,7 µmol) einer DCC-Lösung [10 mg in 1 ml CH₂Cl₂] werden in dieser Reihenfolge auf eine HPTLC-Platte Kieselgel 60 (MERCK) mit F₂₅₄ bandförmig aufgetragen. Nach dem Trocknen der Auftragezone wird die Platte in einer Trogkammer in dem Fließmittel CH₂Cl₂/MeOH = 10+2 entwickelt. Die Laufzeit beträgt 7 Minuten. Die Lokalisierung des Zwischen­ produktes (I) erfolgt unter der UV-Lampe bei 254 nm. Der hRf-Wert für (I) beträgt 35-40, die Nebenprodukte der Hydrierungsreaktion laufen mit der Front.
  Das Zwischenprodukt wird ausgeschabt und in MeOH gelöst.a) Coupling of flunitrazepam with succinic acid:
  Since flunitrazepam has a nitro group as a functional group, this must first be reduced to the amino group. The generally known method of microhydration is used.
  10 mg of flunitrazepam are dissolved in 10 ml of MeOH and the apparatus is flushed with nitrogen. Then you add 10 mg of a hydrogenation catalyst (PtO₂ / Adams catalyst), flushed again with nitrogen and then passes hydrogen into the solution. The reaction takes several hours and can be checked using thin layer chromatography [eluent: CH₂Cl₂, chamber saturation, running time 13 minutes, HPTLC plates silica gel 60 (MERCK)].
  Yield: 1-2%.
  Purification of the solution prepared in this way, which contains by-products, is not necessary.
  50 µl of the solution thus prepared, 20 µl (0.17 µmol) of a succinic acid solution [1 µg / µl MeOH] and 35 µl (1.7 µmol) of a DCC solution [10 mg in 1 ml CH₂Cl₂] are in this order an HPTLC plate silica gel 60 (MERCK) with F₂₅₄ applied in tape form. After the application zone has dried, the plate is developed in a trough chamber in the flow agent CH₂Cl₂ / MeOH = 10 + 2. The running time is 7 minutes. The intermediate (I) is located under the UV lamp at 254 nm. The hRf value for (I) is 35-40, the by-products of the hydrogenation reaction run with the front.
  The intermediate product is scraped off and dissolved in MeOH.
• b) Kopplung des Zwischenproduktes (I) mit ABEI:
  28 µl (0,01 µmol) einer ABEI-Lösung [0,1 µg/µl Ethyl­ acetat/Eisessig = 1+1], 40 µl (0,01 µmol) einer Lösung von (I) [0,1 µg/µl MeOH] und 20 µl einer DCC-Lösung [1 µg/µl CH₂Cl₂] werden in dieser Reihenfolge bandförmig auf eine HPTLC-Platte Kieselgel 60 (MERCK) aufgetragen. Nach dem Trocknen der Auftragezone wird die Platte in einer Trogkammer in dem Fließmittel CH₂Cl₂/MeOH = 10+2 entwickelt. Die Laufzeit beträgt 7 Minuten. Die Lokali­ sierung des Produktes erfolgt unter der UV-Lampe bei 366 nm. Der hRf-Wert für das Produkt beträgt 78-87.b) Coupling the intermediate (I) with ABEI:
  28 µl (0.01 µmol) of an ABEI solution [0.1 µg / µl ethyl acetate / glacial acetic acid = 1 + 1], 40 µl (0.01 µmol) of a solution of (I) [0.1 µg / µl MeOH] and 20 µl of a DCC solution [1 µg / µl CH₂Cl₂] are applied in this order to an HPTLC plate of silica gel 60 (MERCK). After the application zone has dried, the plate is developed in a trough chamber in the flow agent CH₂Cl₂ / MeOH = 10 + 2. The running time is 7 minutes. The product is localized under the UV lamp at 366 nm. The hRf value for the product is 78-87.

Beispiel 4Example 4 Herstellung eines Antigens: Kopplung von β-Amanitin mit AlbuminPreparation of an antigen: coupling of β-amanitin with albumin

Herstellung einer Albuminlösung 20 mg eines handelsüblichen Rinderserumalbumins werden in 1 ml H₂O bidest. gelöst und mit wenigen Tropfen verdünnter Natronlauge auf pH 7-7,5 einge­ stellt.Preparation of an albumin solution 20 mg of a commercially available Bovine serum albums are bidest in 1 ml H₂O. solved and with a few drops of dilute sodium hydroxide solution to pH 7-7.5 poses.

100 µl dieser Lösung, 200 µl einer β-Amanitinlösung [1 mg/1 ml MeOH], 100 µl der Albuminlösung und 200 µl einer DCC-Lösung [20 mg/1 ml CH₂Cl₂] werden in dieser Reihenfolge auf eine DC-Platte der Firma Nacherey & Nagel aufgetragen. Nach dem Trocknen der Startzone entwickelt man die Platte in einer Trogkammer mit Kammersättigung in dem Fließmittel CH₂Cl₂/MeOH/Essig­ säure = 10+2+1 bis einen Zentimeter über die Startzonen. Nach dem Trocknen der Platte schabt man die Startzone aus, die das gewünschte Antigen enthält, da Albumin auf Kieselgel am Start fixiert bleibt. Das herge­ stellte Antigen löst sich in H₂O bidest., das man mit Essigsäure auf einen pH von 6-6,6 einstellt.100 µl of this solution, 200 µl of a β-amanitin solution [1 mg / 1 ml MeOH], 100 µl of the albumin solution and 200 µl of a DCC solution [20 mg / 1 ml CH₂Cl₂] are in this order on a DC plate from Nacherey & Nagel applied. After this Drying the starting zone develops the plate in one Trough chamber with chamber saturation in the flow agent CH₂Cl₂ / MeOH / vinegar acid = 10 + 2 + 1 to one centimeter above the Start zones. After the plate has dried, you scrape it Starting zone, which contains the desired antigen, because Albumin remains fixed on silica gel at the start. The herge Antigen dissolves in H₂O bidest., which one with Acetic acid to a pH of 6-6.6.

Für alle beschriebenen Beispiele wurden handelsübliche Lösemittel in p.a.-Qualität verwendet.Commercial examples were used for all of the examples described Solvents used in p.a. quality.

Claims (14)

1. Verfahren zur präparativen Herstellung von Ausgangs­ stoffen für Immunoassays und Bioassays, gekennzeichnet durch die Verwendung einer saugfähigen Trägermatrix, wobei man die gelösten Komponenten (Edukte) der gewünschten Ausgangsstoffe in Anwesenheit eines Reagenz zur Kopplung der Komponenten auf die Trägermatrix aufbringt, diese mit einem Fließmittel kontaktiert, die gewünschten Ausgangsstoffe (Produkte) auf der Trägermatrix lokalisiert und die Produkte von der Trägermatrix gewinnt.1. A process for the preparative preparation of starting materials for immunoassays and bioassays, characterized by the use of an absorbent carrier matrix, the dissolved components (starting materials) of the desired starting materials being applied to the carrier matrix in the presence of a reagent for coupling the components, these using a flow agent contacted, localized the desired starting materials (products) on the carrier matrix and won the products from the carrier matrix. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich eine Lokalisierung und Gewinnung von Zwischenprodukten erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that in addition a localization and extraction of Intermediates are made. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von lumineszenzmarkierten Haptenen einen Lumineszenzmarker mit einem Spacer koppelt, und das so erhaltene Zwischenprodukt mit dem entsprechenden Hapten koppelt.3. The method according to claim 1, characterized characterized in that one for the production of luminescence-labeled Haptens using a luminescent marker couples a spacer, and the intermediate product thus obtained couples with the corresponding hapten. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von lumineszenzmarkierten Haptenen ein Hapten mit einem Spacer koppelt, und das so erhaltene Zwischenprodukt mit einem Lumineszenzmarker koppelt.4. The method according to claim 1, characterized characterized in that one for the production of luminescence-labeled Haptens a hapten with a spacer couples, and the intermediate product thus obtained with a Luminescence marker couples. 5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lokalisierung mittels UV-Licht erfolgt.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the localization by means of UV light he follows. 6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix aus Aluminiumoxid, Kieselgel oder modifiziertem Kieselgel besteht. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the carrier matrix made of aluminum oxide, Silica gel or modified silica gel exists.   7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsstoffe (Produkte) lumineszenzmarkierte Haptene oder haptenkorrespondierende Antigene sind.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that the starting materials (products) luminescence-labeled haptens or hapten-corresponding ones Are antigens. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Haptene mit reaktiven funktionellen Gruppen, wie z. B. -NH₂, -COOH, -COOR, -NHR oder mit in reaktionsfähige funktionelle Gruppen umwandelbare funktionelle Gruppen, wie z. B. -NO₂ verwendet.8. The method according to claim 7, characterized in that haptens with reactive functional groups, such as e.g. B. -NH₂, -COOH, -COOR, -NHR or with in reactive functional groups convertible functional groups, such as B. -NO₂ used. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Lumineszenzmarkierung Spacer mit zwei reaktiven funktionellen Gruppen, wie z. B. -NH₂ oder -COOH verwendet.9. The method according to claim 8, characterized in that one for the luminescence marking spacer with two reactive functional groups, such as. B. -NH₂ or -COOH used. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Spacer β-Alanin oder Bernsteinsäure und alle linearen oder verzweigten Derivate verwendet.10. The method according to claim 9, characterized in that as spacer β-alanine or succinic acid and all linear or branched derivatives used. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Lumineszenzmarker, wie z. B. Aminobutylethylisoluminol verwendet.11. The method according to any one of claims 3 or 4, characterized characterized in that a luminescent marker, such as. B. Aminobutylethylisoluminol used. 12. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Haptene Amatoxine, Phallotoxine, Cannabinoide, wie z. B. Tetrahydrocannabinol, oder Diazepame, wie z. B. Flunitrazepam, als Spacer β-Alanin oder Bernsteinsäure oder Derivate von beiden und als Lumineszenzmarker z. B. Aminobutylethylisoluminol verwendet.12. The method according to claim 3 or 4, characterized in that as haptens amatoxins, phallotoxins, Cannabinoids such as B. tetrahydrocannabinol, or Diazepame, e.g. B. flunitrazepam, as a spacer β-alanine or succinic acid or derivatives of both and as Luminescence markers e.g. B. Aminobutylethylisoluminol used. 13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Verwendung von haptenkorrespondierenden Antigenen Trägerproteine mit Haptenen koppelt. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that one uses hapten correspondents Antigenic carrier proteins with haptens couples.   4. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hapten Amatoxine, Phallotoxine, Cannabinoide, wie z. B. Tetrahydrocannabinolcarbonsäure, oder Diazepame, wie z. B. Flunitrazepam und als Trägerprotein z. B. Albumin verwendet.4. The method according to claim 12, characterized in that hapten amatoxins, phallotoxins, cannabinoids, such as B. tetrahydrocannabinol carboxylic acid, or Diazepame, e.g. B. flunitrazepam and as a carrier protein e.g. B. albumin used.