DE4313933A1 - Functional receptor expression in Dictyostelium discoideum - Google Patents

Functional receptor expression in Dictyostelium discoideum

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DE4313933A1 DE19934313933 DE4313933A DE4313933A1 DE 4313933 A1 DE4313933 A1 DE 4313933A1 DE 19934313933 DE19934313933 DE 19934313933 DE 4313933 A DE4313933 A DE 4313933A DE 4313933 A1 DE4313933 A1 DE 4313933A1
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Abstract

The invention relates to simple microbiological test system for finding and characterising receptor agonists and antagonists. It describes a receptor gene which is optimised for function in a microorganism, stable integration of the gene in Dictyostelium discoideum cells and use of the gene for finding and characterizing corresponding receptor agonists and antagonists using a single transgenic microorganism.

Description

Die Erfindung betrifft transgene Dictyostelium discoideum Zellen, die als mikrobiologisches System für die Testung von Rezeptoragonisten und -antagonisten eingesetzt werden können, sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger Systeme.The invention relates to transgenic Dictyostelium discoideum cells, which are called microbiological System for testing receptor agonists and antagonists can be used and a method for producing such systems.

In einem mikrobiologisches System für die Testung von Rezeptoragonisten und -antagonisten wird ein mikrobiologischer Stamm verwendet, der durch molekulartechnische Methoden so verändert wurde, daß er einen menschlichen Rezeptor exprimiert und dieses Protein auf seiner Oberfläche exponiert. Über diesen Rezeptor werden entsprechende Agonisten oder Antagonisten erkannt und gebunden. Durch Kopplung mit eigenen, intrazellulär lokalisierten O-Proteinen ist der transgene Organismus in der Lage, durch einen physiologischen Reiz - hier durch Chemotaxis - zu reagieren und so die Bindung eines Rezeptoragonisten oder - durch Kompetition mit einem Rezeptoragonisten - die Bindung eines Rezeptorantagonisten erkennbar zu machen.In a microbiological system for the testing of receptor agonists and antagonists a microbiological strain is used, which by molecular engineering methods so was changed to express a human receptor and to have this protein on its Exposed surface. Appropriate agonists or antagonists are produced via this receptor recognized and bound. By coupling with its own, intracellularly localized O proteins the transgenic organism is able through a physiological stimulus - through here Chemotaxis - to react and thus bind a receptor agonist or - through Competition with a receptor agonist - the binding of a receptor antagonist is recognizable close.

Bisher können Rezeptoren physiologisch nur an Gewebepräparaten charakterisiert werden. Diese Technologie ist technisch kompliziert und erfordert den Einsatz sehr vieler Versuchstiere. Für ein Massenscreening eignet sich diese Methode nicht. Darüber hinaus sind natürliche Gewebe meist mit mehreren Rezeptorsubtypen ausgestattet, was die eindeutige Interpretation der erhaltenen physiologischen Daten weiter erschwert. So far, receptors can only be characterized physiologically on tissue preparations. This Technology is technically complex and requires the use of a large number of experimental animals. For a Mass screening is not suitable for this method. In addition, natural tissues are mostly equipped with several receptor subtypes, which is the clear interpretation of the obtained physiological data further complicated.  

Menschliche Muskarinrezeptoren werden von 5 verschiedenen Genen (m1, m2, m3, m4, m5) kodiert. Vier der entsprechenden Genprodukte (M1, M2, M3, M4) wurden bisher pharmakologisch charakterisiert. Physiologisch koppeln die M2- und M4-Rezeptoren an intrazellulär lokalisierte Gi Proteine, die die Adenylatzyklase inhibieren. Dahingegen koppeln die M1-, M3- und M5-Rezeptoren an ein G-Protein, das die Phospholipase C stimuliert.Human muscarinic receptors are encoded by 5 different genes (m1, m2, m3, m4, m5). Four of the corresponding gene products (M1, M2, M3, M4) have so far been characterized pharmacologically. Physiologically, the M2 and M4 receptors couple to intracellularly localized G i proteins that inhibit the adenylate cyclase. In contrast, the M1, M3 and M5 receptors couple to a G protein that stimulates phospholipase C.

Die Expression von Muskarinrezeptorgenen in menschlichen Zellinien oder in Hefe ist zwar möglich, eine phänotypische Antwort wird jedoch nicht erhalten, so daß entweder nur Bindungsaffinitäten von Rezeptoragonisten oder -anatagonisten bestimmt werden können oder Rezeptoragonisten mit Hilfe komplexer biochemischer Methoden gemessen werden können. Ein mikrobiologisches Testsystem, das phänotypisch auf die Bindung eines Rezeptoragonisten reagiert, ist besonders auch unter dem zur Zeit heftig diskutierten Aspekt des Tierschutzes anstrebenswert.The expression of muscarinic receptor genes in human cell lines or in yeast is true possible, but a phenotypic answer is not received, so either only Binding affinities of receptor agonists or anatagonists can be determined or Receptor agonists can be measured using complex biochemical methods. A microbiological test system that is phenotypic for the binding of a receptor agonist reacts, is especially also under the currently hotly debated aspect of animal protection worth striving for.

Der zelluläre Schleimpilz Dictyostelium discoideum besitzt einen Rezeptor, der strukturell zur gleichen Klasse wie die menschlichen Muskarinrezeptoren zählt. Diese Rezeptoren sind nämlich dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zytoplasmamembran siebenmal durchspannen. Der N- Terminus befindet sich auf der extrazellulären Seite, während sich der C-Terminus auf der zytoplasmatischen Seite befindet. Der D. discoideum Rezeptor (cAMP-Rezeptor) erkennt extrazelluläres zyklisches AMP (cAMP). Dies gestattet es den Zellen, auf cAMP chemotaktisch zu reagieren und sich so entlang eines cAMP-Gradienten zu bewegen.The cellular slime mold Dictyostelium discoideum has a receptor that is used structurally for same class as human muscarinic receptors. Namely, these receptors are characterized in that they span the cytoplasmic membrane seven times. The N- The terminus is on the extracellular side, while the C-terminus is on the cytoplasmic side. The D. discoideum receptor (cAMP receptor) recognizes extracellular cyclic AMP (cAMP). This allows the cells to chemotactically target cAMP react and move along a cAMP gradient.

Mit der Expression von Rezeptorgenen in Dictyostelium discoideum wäre es möglich, einen chemotaktischen Reiz auf den transgenen Organismus durch einen Rezeptoragonisten auszulösen. Als Konsequenz können positiv reagierende Zellen durch Aggregation phänotypisch erkannt werden. In Analogie können Rezeptorantagonisten dadurch erkannt werden, daß sie die chemotaktische Antwort auf einen gleichzeitig vorhandenen Rezeptoragonisten inhibieren.With the expression of receptor genes in Dictyostelium discoideum it would be possible to Trigger chemotactic stimulus on the transgenic organism by a receptor agonist. As a consequence, positive reacting cells can be phenotypically recognized by aggregation become. Analogously, receptor antagonists can be recognized by the fact that they Inhibit chemotactic response to a concurrent receptor agonist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten mit Hilfe eines einfachen mikrobiologischen Testsystems durch eine physiologische Antwort des Mikroorganismus nachzuweisen. The object of the present invention is to include receptor agonists or antagonists Using a simple microbiological test system through a physiological response from the Detect microorganism.  

Die Aufgabe wurde gelöst durch Konstruktion eines transgenen Dictyostelium discoideum Stammes, umfassendThe problem was solved by constructing a transgenic Dictyostelium discoideum Tribal, comprehensive

  • (a) einen authentischen menschlichen M2-Rezeptor,(a) an authentic human M2 receptor,
  • (b) eine modifizierte m2 cDNA, deren Transkription von einem Aktin-Promotor aus Dictyostelium discoideum kontrolliert wird,(b) a modified m2 cDNA, the transcription of which is from an actin promoter Dictyostelium discoideum is controlled,
  • (c) ein Resistenzgen.(c) a resistance gene.

In einer bevorzugten Ausführung betrifft die Erfindung einen transgenen Dictyostelium discoideum Stamm, der in seiner Membran einen authentischen, menschlichen M2 Rezeptor trägt.In a preferred embodiment, the invention relates to a transgenic dictyostelium discoideum strain with an authentic human M2 receptor in its membrane.

Bei der m2 cDNA handelt es sich um eine modifizierte cDNA für das menschliche m2-Gen. Die Modifikationen betreffen die Codons 1-8, wobei nur der für Dictyostelium discoideum typische Codon-Gebrauch angepaßt wurde, das Codierungspotential - und damit die Aminosäure­ sequenz - jedoch nicht verändert wurde. Damit trägt die cDNA auch die Information für ein Leaderpeptid, das für den Einbau des Proteins in die Membran verantwortlich ist. Diese Information wird auch in Dictyostelium discoideum erkannt. Die Transkription der modifizierten m2 cDNA wird durch einen Aktin Promotor aus Dictyostelium discoideum kontrolliert. Die Fusion zwischen Aktin Promotor und m2 cDNA liegt im Dictyostelium discoideum Genom in tandem-artiger Anordnung multipler Copien stabil integriert vor.The m2 cDNA is a modified cDNA for the human m2 gene. The Modifications concern codons 1-8, whereby only the one typical for Dictyostelium discoideum Codon use was adapted, the coding potential - and thus the amino acid sequence - but was not changed. The cDNA also enters the information for Leader peptide responsible for the incorporation of the protein into the membrane. This Information is also recognized in Dictyostelium discoideum. The transcription of the modified m2 cDNA is controlled by an actin promoter from Dictyostelium discoideum. The Fusion between actin promoter and m2 cDNA is in the Dictyostelium discoideum genome tandem-like arrangement of multiple copies stably integrated.

Schließlich gehört zu dem erfindungsgemäßen einfachen mikrobiologischen Testsystem zur Auf­ findung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten noch ein Resistenzgen, das vorzugsweise in einem Eukaryonten exprimierbar ist; bevorzugt wird ein Neomycin (neo)- Resistenzgen. Das gesamte erfindungsgemäße einfache mikrobiologische Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten liegt auf einem Plasmid inseriert vor.Finally, the simple microbiological test system according to the invention belongs to the finding and characterizing receptor agonists or antagonists is still a resistance gene, which is preferably expressible in a eukaryote; a neomycin (neo) is preferred Resistance gene. The entire simple microbiological test system according to the invention for Discovery and characterization of receptor agonists or antagonists lies on one Plasmid inserted before.

Die Erfindung umfaßt auch Dictyostelium Zellen, in die auch andere G-Protein gekoppelte heterologe Rezeptoren integriert werden können. Das prinzipielle Testverfahren entspricht dem Verfahren auf dem das Auffinden und Charakterisieren von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten mit Hilfe des erfindungsgemäßen einfachen mikrobiologischen Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten basiert.The invention also includes Dictyostelium cells into which other G proteins are also coupled heterologous receptors can be integrated. The basic test procedure corresponds to that Procedure on the discovery and characterization of receptor agonists  or antagonists using the simple microbiological test system according to the invention Discovery and characterization of receptor agonists or antagonists based.

Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines einfachen mikrobiologischen Testsystems zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten.The invention further comprises a method for producing a simple microbiological Test systems for the detection and characterization of receptor agonists or antagonists.

Das erfindungsgemäße Verfahren geht so vonstatten, daß eine cDNA an ihrem 5′-Ende so verändert wird, daß einerseits innerhalb der ersten 8 Aminosäuren ein optimaler Codongebrauch für Dictyostelium discoideum gewährleistet ist, andererseits aber der Informationsgehalt - und damit die Aminosäuresequenz - authentisch erhalten bleibt. Diese modifizierte cDNA wird dann hinter einen Aktin Promotor aus Dictyostelium discoideum kloniert. Der verwendete Vektor enthält außerdem noch ein Neo-Resistenzgen, dessen Expression ebenfalls von einem Aktin Promotor aus Dictyostelium discoideum kontrolliert wird. In einem weiteren Verfahrensschritt wird dann das Plasmid durch Transformation stabil in das Genom einer Dictyostelium discoideum Zelle integriert.The inventive method is such that a cDNA at its 5'-end is changed that on the one hand an optimal codon usage within the first 8 amino acids for Dictyostelium discoideum, but on the other hand the information content - and so that the amino acid sequence - is authentically preserved. This modified cDNA is then cloned behind an actin promoter from Dictyostelium discoideum. The vector used also contains a neo-resistance gene, the expression of which is also from an actin Promoter from Dictyostelium discoideum is controlled. In a further step the plasmid then becomes stable by transformation into the genome of a Dictyostelium discoideum Integrated cell.

Das erfindungsgemäße einfache mikrobiologische Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten kann unter dem Aspekt alternativer Testsysteme zu Tierversuchen zum Massenscreening verwendet werden. Ein solches System ist nämlich in der Lage, nach erfolgter Rezeptor-spezifischer Signalperzeption das Signal Organismus-spezifisch zu transduzieren. Der Effekt der Signaltransduktion kann durch Dictyostelium discoideum-spezifische Chemotaxis - ausgelöst durch ein unphysiologisches Signal - beobachtet werden. Ferner läßt sich das erfindungsgemäße Testsystem auch im Rahmen automatisierter Verfahren verwenden.The inventive simple microbiological test system for detection and Characterization of receptor agonists or antagonists can be alternative under the aspect Test systems for animal testing can be used for mass screening. Such a system is namely capable of receiving the signal after receptor-specific signal perception Transduce organism-specific. The effect of signal transduction can be through Dictyostelium discoideum-specific chemotaxis - triggered by an unphysiological Signal - be observed. Furthermore, the test system according to the invention can also be used in Use framework of automated procedures.

Es wurde hier zunächst ein Muskarin m2-Rezeptorgen in Dictyostelium discoideum zur Expression gebracht, der den transgenen Organismus veranlaßt, z. B. auf den Rezeptoragonisten Carbachol chemotaktisch in analoger Weise zu reagieren, wie dies Dictyostelium discoideum physiologischer Weise auf cAMP tut.First there was a Muskarin m2 receptor gene in Dictyostelium discoideum Expression brought about, which causes the transgenic organism, for. B. on the receptor agonists Carbachol react chemotactically in an analogous manner to Dictyostelium discoideum physiologically does on cAMP.

Das verwendete Plasmid, das sowohl den Aktin Promotor zur Kontrolle der m2 cDNA als auch das in Dictyostelium discoideum exprimierbare neo-Resistenzgen enthält, ist das Plasmid pDneo2 (Mol. Cell Biol. 6, 3973). The plasmid used, which is both the actin promoter to control the m2 cDNA and The plasmid pDneo2 contains the neo-resistance gene which can be expressed in Dictyostelium discoideum (Mol. Cell Biol. 6, 3973).  

In den Transformanden werden sowohl das m2-Rezeptorgen als auch das neo-Resistenzgen unter Aktin-6-Promotorkontrolle konstitutiv exprimiert. Das ebenfalls in den Zellen natürlicherweise vorhandene cAMP-Rezeptorgen wird hingegen während des Wachstums der Zellen kaum exprimiert. Durch Stimulierung der Transformanden z. B. mit dem nicht selektiven M2- spezifischen Agonisten Carbachol werden die Zellen veranlaßt, entlang dem Carbachol- Gradienten zu aggregieren. In gleicher Weise würden nicht-transformierte - aber auch transformierte - Zellen reagieren, wenn sie einem cAMP Gradienten ausgesetzt würden. Demzufolge koppelt der durch Carbachol stimulierte heterologe Rezeptor ein homologes - intrazellulär lokalisiertes - G-Protein, wodurch das extrazelluläre Signal physiologisch weitergeleitet wird und phänotypisch durch Aggregation erkannt werden kann.Both the m2 receptor gene and the neo-resistance gene are found in the transformants Actin-6 promoter control expressed constitutively. This also occurs naturally in the cells Existing cAMP receptor genes, on the other hand, hardly become available during cell growth expressed. By stimulating the transformants z. B. with the non-selective M2 specific agonist carbachol, the cells are caused to move along the carbachol To aggregate gradients. In the same way would be non-transformed - but also transformed - cells react when exposed to a cAMP gradient. As a result, the heterologous receptor stimulated by carbachol couples a homologous - intracellularly localized - G protein, which makes the extracellular signal physiological is forwarded and can be identified phenotypically by aggregation.

Kurze Beschreibung der Figuren:Brief description of the figures:

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pDNeo2.hm2. Fig. 1 is a schematic representation of plasmid pDNeo2.hm2.

Dieses Plasmid enthält eine an ihrem 5′-Ende modifizierte cDNA (hm2) für den menschlichen M2 Rezeptor integriert hinter dem Aktin-6-Promotor (A6P) aus Dictyostelium discoideum. Die Termination der Transkription der A6P::hm2-Fusion erfolgt an dem entsprechenden Signal des Actih-8-Gens (A8T) aus Dictyostelium discoideum. Ferner trägt das Plasmid den Selektionsmarker für die Dictyostelium Transformation. Dieser Marker ist das bakterielle Neomycin-Resistenzgen (Neo®) aus dem Transposon Tn903, das in Dictyostelium discoideum unter Actin-15-Promotor- (A15P) und Terminator- (A15T) -Kontrolle transkribiert wird. Das Produkt, die Neomycinphosphotransferase, verleiht den Transformanden Resistenz gegenüber dem Neomycinanalogen G418.This plasmid contains a cDNA (hm2) modified at its 5'-end for human M2 Receptor integrated behind the actin 6 promoter (A6P) from Dictyostelium discoideum. The The transcription of the A6P :: hm2 fusion is terminated at the corresponding signal of the Actih-8 gene (A8T) from Dictyostelium discoideum. The plasmid also carries the Selection marker for the Dictyostelium transformation. This marker is the bacterial one Neomycin resistance gene (Neo®) from the transposon Tn903, which is in Dictyostelium discoideum is transcribed under actin 15 promoter (A15P) and terminator (A15T) control. The Product, neomycin phosphotransferase, confers resistance to the transformants the neomycin analog G418.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines Rezeptortests. Fig. 2 shows the result of a receptor test.

In (A) sind transfomierte Dictyostelium discoideum Zellen ohne chemischen Reiz dargestellt. In der Mitte der Kulturschale befindet sich ein Agarblock (Durchmesser ca. 0,5 cm) ohne weitere Zusätze.In (A) transformed Dictyostelium discoideum cells are shown without chemical stimulus. In In the middle of the culture dish there is an agar block (diameter approx. 0.5 cm) without further Additions.

  • (B) zeigt das Ergebnis einer ähnlichen Zellpopulation wie in (A) nach 30 Minuten, wobei die Zellen durch Carbachol chemotaktisch angelockt wurden, das sich in einer Konzentration von 100 µM in einem Agarblock (Durchmesser ca. 0,5 cm) im Zentrum einer Petrischale befand.(B) shows the result of a cell population similar to that in (A) after 30 minutes, the Cells were chemotactically attracted by carbachol, which is at a concentration of  100 µM in an agar block (diameter approx. 0.5 cm) in the center of a Petri dish.
  • (C) zeigt das Ergebnis einer ähnlichen Zellpopulation wie in (A) und (B) nach 30 Minuten, wobei die Zellen durch cAMP chemotaktisch angelockt wurden, das sich in einer Konzentration von 10 µM in einem Agarblock (Durchmesser ca. 0,5 cm) im Zentrum einer Petrischale befand.(C) shows the result of a similar cell population as in (A) and (B) after 30 minutes, where the cells were chemotactically attracted by cAMP, which was at a concentration of 10 µM in an agar block (diameter approx. 0.5 cm) in the center of a Petri dish.

Ein solches System hat folgende Vorteile:Such a system has the following advantages:

  • - Das System gestattet es, Rezeptoragonisten und -antagonisten in einem mikrobiologischen Testsystem zu detektieren.- The system allows receptor agonists and antagonists in a microbiological Detect test system.
  • - Die Detektion erfolgt über eine physiologische Reaktion, die sich dahingehend ergibt, daß die Zellen entlang eines Gradienten des Rezeptoragonisten chemotaktisch angelockt werden und aggregieren.- The detection takes place via a physiological reaction, which results in that the Cells are chemotactically attracted along a gradient of the receptor agonist and aggregate.
  • - Das System kann im Massenscreening als effiziente Alternative zu komplexen Tierversuchen eingesetzt werden.- The system can be used in mass screening as an efficient alternative to complex animal experiments be used.
BeispieleExamples Beispiel 1example 1 Organismen, Medien und Dictyostelium discoideum-TransformationOrganisms, media and Dictyostelium discoideum transformation

Der axenisch wachsende Dictyostelium discoideum Stamm Ax-2 wurde in HL-5 Medium (Biochem. J. 119, 175) bei 22°C gezüchtet Zellen, die zur Transformation eingesetzt werden sollten wurden in Morpholinäthansulfonsäure-haltigem HL-5 Medium gezüchtet (Mol. Cell. Biol. 4, 2890). Die Dictyostelium discoideum Transformation erfolgte wie publiziert (Gene 59, 99; Gene 39, 155; Mol. Cell. Biol. 4, 2890). Transformanden wurden in Gegenwart von Klebsiella aerogenes rekloniert (DNA 8, 193; Gene 85, 353). Die zur Transformation eingesetzte Plasmid- DNA lag in Transformanden stabil ins Genom integriert und 10 bis 100-fach amplifiziert vor.The axenic growing Dictyostelium discoideum strain Ax-2 was grown in HL-5 medium (Biochem. J. 119, 175) cells grown at 22 ° C., which are used for transformation should be grown in HL-5 medium containing morpholine ethanesulfonic acid (Mol. Cell. Biol. 4, 2890). The Dictyostelium discoideum transformation was carried out as published (Gene 59, 99; Gene 39, 155; Mol. Cell. Biol. 4, 2890). Transformants were in the presence of Klebsiella aerogenes cloned (DNA 8, 193; Gene 85, 353). The plasmid used for transformation DNA was stably integrated into the genome in transformants and was amplified 10 to 100 times.

Beispiel 2Example 2

Die physikalische Karte des Plasmids pDNeo2.hm2 ist in Fig. 1 dargestellt. Die cDNA des menschlichen M2-Rezeptors wurde durch PCR aus dem Plasmid pcD.hm2 aufamplifiziert (Science 237, 527). Dabei wurden folgende Primer verwendet: A) 5′-Primer: 5′- GAGAATTTCAAAATGAATAATTCAACTAACTCATCT-3′;B) 3′-Primer: 5′- CCTTCTAGATTTTTCAAAG-3′. Durch Mißpaarung im 5′-Primer an den Positionen 7, 8, 20, 26 und 32 wurden die Codons innerhalb der ersten 8 Aminosäuren an den Codon-Gebrauch von Dictyostelium discoideum angepaßt. Ferner wurde durch die Sequenz des Primers am unmittelbaren 5′-Ende der aufamplifizierten cDNA eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle eingeführt. Durch die Sequenz des 3′-Primers wurde am 3′-Ende der aufamplifizierten cDNA eine XbaI-Restriktionsschnittstelle eingeführt.The physical map of the plasmid pDNeo2.hm2 is shown in Fig. 1. The cDNA of the human M2 receptor was amplified by PCR from the plasmid pcD.hm2 (Science 237, 527). The following primers were used: A) 5′-primer: 5′- GAGAATTTCAAAATGAATAATTCAACTAACTCATCT-3 ′; B) 3′-primer: 5′- CCTTCTAGATTTTTCAAAG-3 ′. By mismatching in the 5'-primer at positions 7, 8, 20, 26 and 32, the codons within the first 8 amino acids were adapted to the codon use of Dictyostelium discoideum. Furthermore, an EcoRI restriction site was introduced through the sequence of the primer at the immediate 5 'end of the amplified cDNA. The sequence of the 3'-primer introduced an XbaI restriction site at the 3'-end of the amplified cDNA.

Die durch PCR aufamplifizierte cDNA wurde zunächst mit EcoRI, dann mit XbaI geschnitten. Das resultierende Fragment wurde in den Vektor pATIII.2 (Appl. Mikobiol. 35, 496) ligiert, der durch Hydrolyse mit EcoRI und XbaI vorbereitet war. Das Plasmid pATIII.2 ist eine Variante des Plasmids pDNeo2 (Mol. Cell. Biol. 6, 3973). Dieses Plasmid trägt ein Neomycin-Restistenzgen, das in Dictyostelium discoideum unter der Kontrolle des homologen Aktin-15-Promoters exprimiert wird und den Transformanden eine Resistenz gegen das Neomycin-Analoge 0418 verleiht.The cDNA amplified by PCR was cut first with EcoRI, then with XbaI. The resulting fragment was ligated into the vector pATIII.2 (Appl. Mikobiol. 35, 496), which prepared by hydrolysis with EcoRI and XbaI. The plasmid pATIII.2 is a variant of the Plasmids pDNeo2 (Mol. Cell. Biol. 6, 3973). This plasmid carries a neomycin resistance gene,  that in Dictyostelium discoideum under the control of the homologous actin 15 promoter is expressed and the transformants are resistant to neomycin analog 0418 gives.

Beispiel 3Example 3 Test auf RezeptoragonistReceptor agonist test

Suspensionen transgener Dictyostelium discoideum Zellen wurden in einer Konzentration von ca. 1 × 10⁵ Zellen/ml HL-5 Medium in Petrischalen (Durchmesser 12cm) ausgebracht. Nach 3 Stunden wurden ins Zentrum der Petrischalen Agarblöcke (Durchmesser ca. 0,5 cm) gelegt, die keine weiteren Zusätze (A), Carbachol in einer Konzentration von 100 µM (B) oder cAMP in einer Konzentration von 10 µM (C) enthielten.Suspensions of transgenic Dictyostelium discoideum cells were in a concentration of approx. 1 × 10⁵ cells / ml HL-5 medium applied in petri dishes (diameter 12cm). After 3 Hours were placed in the center of the petri dish agar blocks (diameter approx. 0.5 cm) no further additives (A), carbachol in a concentration of 100 µM (B) or cAMP in one Concentration of 10 µM (C) contained.

Nach 30 Minuten war das Ergebnis wie in Fig. 2 dokumentiert. In der Negativkontrolle (A) hatte sich die Verteilung der Zellen während Inkubationszeitraums nicht signifikant verändert. Durch Carbachol werden die transgenen Dictyostelium discoideum Zellen chemotaktisch angelockt und konzentrieren sich am Rand des Agar-Blocks, der das Chemoattraktant in einer Konzentration von 100 µM enthält. Ein ähnliches Resultat wird in der Positivkontrolle erhalten, wo Zellen physiologischer Weise von cAMP (10 µM) durch den homologen cAMP-Rezeptor chemotaktisch angelockt werden und sich ebenfalls am Rand des Agar-Blocks konzentrieren (C).After 30 minutes the result was as documented in Fig. 2. In the negative control (A), the distribution of the cells had not changed significantly during the incubation period. The transgenic Dictyostelium discoideum cells are chemotactically attracted by carbachol and concentrate at the edge of the agar block, which contains the chemoattractant in a concentration of 100 μM. A similar result is obtained in the positive control, where cells are chemotactically attracted by cAMP (10 µM) by the homologous cAMP receptor and also concentrate at the edge of the agar block (C).

Claims (15)

1. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten, umfassend
  • (a) ein authentischer menschlicher Rezeptor,
1. A simple microbiological test system for the detection and characterization of receptor agonists or antagonists, comprising
  • (a) an authentic human receptor,
eine an ihrem 5′-Ende modifizierte cDNA für ein Rezeptorgen, die in Dictyostelium discoideum expimierbar ist,
ein Resistenzgen, das in Dictyostelium discoideum exprimierbar ist.a cDNA modified at its 5′-end for a receptor gene, which is expandable in Dictyostelium discoideum,
a resistance gene that is expressible in Dictyostelium discoideum. 2. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA für ein menschliches Rezeptorgen codiert.2. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claim 1, characterized in that the cDNA encoded for a human receptor gene. 3. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA für ein menschliches Rezeptorgens in ihren ersten 8 Codons dem Codongebrauch von Dictyostelium discoideum angepaßt ist.3. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 2, characterized in that the cDNA for a human recipe gene in its first 8 codons using the codon of Dictyostelium discoideum is adapted. 4. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das die cDNA des Rezeptorgens ein Leaderpeptid trägt, das in Dictyostelium discoideum erkannt wird. 4. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 3, characterized in that that the cDNA of the receptor gene carries a leader peptide that is recognized in Dictyostelium discoideum becomes.   5. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese des Rezeptors unter der Transkriptionskontrolle des Aktin 6-Promotors aus Dictyostelium discoideum gebildet wird.5. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 4, characterized in that the Synthesis of the receptor under the transcriptional control of the actin 6 promoter Dictyostelium discoideum is formed. 6. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktin-6-Promotor:Rezeptorgen-Fusion stabil in Dictyostelium discoideum integriert ist.6. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 5, characterized in that the Actin-6 promoter: receptor gene fusion is stably integrated in Dictyostelium discoideum. 7. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA für den menschlichen M2-Rezeptor kodiert.7. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 6, characterized in that the cDNA encoded for the human M2 receptor. 8. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß von der modifizierten cDNA ein authentischer, humaner M2-Rezeptor gebildet wird.8. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 7, characterized in that an authentic, human M2 receptor is formed from the modified cDNA. 9. Plasmid pDNeo2.hm2 (Fig. 1).9. Plasmid pDNeo2.hm2 ( Fig. 1). 10. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pDNeo2.hm2 stabil ins Dictyostelium discoideum Genom integriert ist.10. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 9, characterized in that the plasmid pDNeo2.hm2 is stably integrated into the Dictyostelium discoideum genome. 11. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 10, dadurch kennzeichnet, daß der authentische M2-Rezeptor von entsprechenden Agonisten oder Antagonisten erkannt wird.11. Simple microbiological test system for the detection and characterization of  Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 10, characterized in that the authentic M2 receptor is recognized by appropriate agonists or antagonists. 12. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der im heterologen System Dictyostelium discoideum gebildete Rezeptor/Agonist-Komplex eine für Dictyostelium discoideum homologe Signaltransduktion auslöst.12. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 11, characterized in that the receptor / agonist complex formed in the heterologous system Dictyostelium discoideum triggers homologous signal transduction for Dictyostelium discoideum. 13. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die durch den Rezeptor/Agonist-Komplex ausgelöste homologe Signaltransduktion durch Chemotaxis äußert, wobei die transgenen Zellen entlang eines Gradienten gebildet durch den Rezeptoragonisten chemotaktisch angelockt werden.13. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 12, characterized in that the homologous signal transduction triggered by the receptor / agonist complex Chemotaxis expresses the transgenic cells along a gradient formed by the Receptor agonists are attracted chemotactically. 14. Einfaches mikrobiologisches Testsystem zur Auffindung und Charakterisierung von Rezeptoragonisten bzw. -antagonisten nach Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Rezeptorantagonisten mit einem Rezeptoragonisten um die Bindung am Rezeptor konkurrieren und damit die Signaltransduktionseffektivität des Rezeptoragonisten schwächen.14. Simple microbiological test system for the detection and characterization of Receptor agonists or antagonists according to claims 1 to 13, characterized in that Receptor antagonists compete with a receptor agonist for binding to the receptor and thus weaken the signal transduction effectiveness of the receptor agonist.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5606951A (en) * 1993-06-30 1997-03-04 Orbital Engine Company (Australia) Pty. Limited Engine air supply systems

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