DE4303646A1 - The use of thrombin inhibitors to combat neurodegenerative diseases - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Thrombinin­ hibitoren zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen.The present invention relates to the use of thrombinin hibitors for the treatment of neurodegenerative diseases.

Thrombininhibitoren sind wichtige therapeutische Substanzen, die zur Prophylaxe und Behandlung von Gerinnungsstörungen wie Throm­ bosen oder arteriellen Reokklusionen bei Herzinfarkt und Hirn­ schlag (Talbot, M.D. und Butler, K.D., Drug News and Perspecti­ ves, 3, 357-363 (1990)) verwendet werden. Bei diesen Krankheiten ist die zentrale Rolle des Thrombins schon lange bekannt (J.W. Fenton II, et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, 69-75 (1991)).Thrombin inhibitors are important therapeutic substances that for the prophylaxis and treatment of coagulation disorders such as thrombus malignant or arterial reocclusions in heart attack and brain Schlag (Talbot, M.D. and Butler, K.D., Drug News and Perspecti ves, 3, 357-363 (1990)) can be used. With these diseases the central role of thrombin has long been known (J.W. Fenton II, et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, 69-75 (1991)).

Die Koagulation ist ein Prozeß sich kaskadenartig aktivierender Proteasen, an deren Ende die Umwandlung von Prothrombin zu Throm­ bin steht. Thrombin selbst setzt aus dem Fibrinogenmolekül durch Abspaltung von Peptiden das Fibrin frei. Fibrin polymerisiert zu einem unlöslichen Netzwerk und verschließt Wunden oder - im Krankheitsfall - ein lebenswichtiges Blutgefäß. Unter den zahl­ reichen Substanzen, die am Thrombin angreifen, lassen sich zwei Substanzklassen unterscheiden: hochmolekulare Stoffe wie Peptide und Proteine (MW < 1000 DA) und niedermolekulare Substanzen.Coagulation is a process of cascading activation Proteases, at the end of which the conversion of prothrombin to throm am standing. Thrombin itself asserts from the fibrinogen molecule Cleavage of peptides releases the fibrin. Fibrin polymerizes too an insoluble network and closes wounds or - in Illness - a vital blood vessel. Among the number rich substances that attack thrombin can be two Differentiate between substance classes: high-molecular substances such as peptides and proteins (MW <1000 DA) and small molecules.

Zu den hochmolekularen Substanzen gehören Stoffe, die in den Patentanmeldungen WO 92/01710; WO 91/19734 und WO 91/02750 beschrie­ ben sind. Es handelt sich hierbei um Thrombininhibitoren, die mit einem aus dem Hirudin abgeleiteten Peptid, das die Fibrinogenbin­ dungsstelle des Thrombins erkennt, besteht. Dieser funktionelle Molekülteil ist gekoppelt über einen peptidischen oder nicht-pep­ tidischen Linker mit einem die Proteasetasche besetzenden Mole­ külteil, der vom D-PHE-PRO-ARG-Typ ist.The high-molecular substances include substances that are in the Patent applications WO 92/01710; WO 91/19734 and WO 91/02750 described ben are. These are thrombin inhibitors with a peptide derived from hirudin, which is fibrinogen detection point of thrombin exists. This functional Molecular part is coupled via a peptide or non-pep tidic linker with a mole occupying the protease pocket cooling part, which is of the D-PHE-PRO-ARG type.

Noch höhere Molekulargewichte haben Antithrombine aus blutsau­ genden Tieren wie Hirudin aus dem Blutegel Hirudo Medicinalis (Markwardt, F., Hematology 7, 255-269, (1988)) oder Hirulline aus Hirudo Mallinensis (Electricwald, A. et al., Blood Coag. Fibrin. 2, 83-89, (1991)). Neben Egeln sind Zecken, Wanzen und Stechfliegen und Mücken blutsaugende Tiere. Antithrombines from blood sau have even higher molecular weights animals such as hirudin from the leech Hirudo Medicinalis (Markwardt, F., Hematology 7, 255-269, (1988)) or Hirulline from Hirudo Mallinensis (Electricwald, A. et al., Blood Coag. Fibrin. 2, 83-89, (1991)). In addition to leeches are ticks, bugs and Sting flies and mosquitoes sucking blood.  

Diese Verbindungen binden in die Proteasetasche des Thrombin und hemmen nur die katalytische Eigenschaft der Serinprotease Throm­ bin.These compounds bind into the protease pocket of thrombin and only inhibit the catalytic property of the serine protease throm am.

Verbindungen, die sich vom C-Terminus des Hirudinmoleküls ablei­ ten sind auch wirksam.Compounds derived from the C-terminus of the hirudin molecule ten are also effective.

Die Serinprotease Thrombin spielt im Hirn eine wichtige Rolle bei dem Auswachsen von Nervenzellen, um für die wachsenden Neuriten den Weg zu bahnen (Gurwitz, D. und Cunningham, D.D.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3440-3444 (1988)). Thrombin trennt Gehirnzel­ len, so daß andere Gehirnzellen Verbindungen aufnehmen können. Wird die proteolytische Aktivität des Thrombin aber nicht mehr kontrolliert, so werden viele Zell-Zell-Verbindungen unterbrochen und es kommt zu neurodegenerativen Erscheinungen.The serine protease thrombin plays an important role in the brain the outgrowth of nerve cells in order for the growing neurites to pave the way (Gurwitz, D. and Cunningham, D.D .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3440-3444 (1988)). Thrombin separates brain cells len so that other brain cells can make connections. However, the proteolytic activity of thrombin is no longer controlled, many cell-cell connections are interrupted and there are neurodegenerative phenomena.

Darüber hinaus bindet Thrombin an den Thrombinrezeptor und akti­ viert ihn durch das Schneiden in der Aminosäuresequenz NATLDPR↓ SFLLRNPN zwischen Arginin und Serin. Durch Aktivierung des Thrombinrezeptors werden intrazelluläre Signalprozesse ange­ stoßen und verursachen so einen destruktiven Effekt an der zellu­ lären Architektur (Hana S. et al., Neuron 8, 363-375 (1992)).In addition, thrombin binds to the thrombin receptor and acti fourth by cutting in the amino acid sequence NATLDPR ↓ SFLLRNPN between arginine and serine. By activation of the thrombin receptor intracellular signaling processes are indicated bump and cause a destructive effect on the cell linear architecture (Hana S. et al., Neuron 8, 363-375 (1992)).

Bei diesen Prozessen spielt auch Kalzium eine wichtige Rolle. In der Patentanmeldung WO 92/11850 wird die Verwendung von Calpain- Inhibitoren zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen be­ schrieben. Die beschriebenen Inhibitoren gehören zum Isokumarin- Typ. Sie hemmen neben Calpain auch viele andere Proteasen und sind daher sehr unspezifisch.Calcium also plays an important role in these processes. In patent application WO 92/11850 describes the use of calpain Inhibitors for the treatment of neurodegenerative diseases wrote. The inhibitors described belong to the isocoumarin Type. In addition to calpain, they also inhibit many other proteases and are therefore very unspecific.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Thrombininhibito­ ren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Bekämpfung neurodegene­ rativer Erkrankungen.The invention relates to the use of thrombin inhibito ren for the production of drugs for combating neurodegenes ratative diseases.

Für die Erfindung geeignete Thrombininhibitoren sind hochmoleku­ lare Inhibitoren wie Hirudine, Hirulline und deren Muteine, C-Terminale Hirudinfragmente oder Abwandlungen, Protease Nexin I und Thrombininhibitoren, die aus einem C-Terminalen Peptid des Hirudin oder seiner Abwandlung davon in Verbindung mit einem die Proteasetasche bindenden D-PHE-PRO-ARG bestehen. Die beiden funk­ tionellen Molekülteile werden dabei durch peptidische oder nicht­ peptidische Spacer verbunden (WO 92/01710; WO 91/10734; WO 91/02750). Darüber hinaus sind auch Thrombininhibitoren aus blutsaugenden Tieren wie Zecken, Wanzen und anderen Blutegeln ge­ eignet. Thrombin inhibitors suitable for the invention are high molecular weight lare inhibitors such as hirudins, hirullins and their muteins, C-terminal hirudin fragments or modifications, protease Nexin I and thrombin inhibitors consisting of a C-terminal peptide of the Hirudin or its modification in connection with one of the Protease bag binding D-PHE-PRO-ARG exist. The two radio tional parts of the molecule are peptide or not peptide spacers connected (WO 92/01710; WO 91/10734; WO 91/02750). In addition, thrombin inhibitors are also out blood-sucking animals such as ticks, bugs and other leeches is suitable.  

Diese hochmolekularen Inhibitoren durchdringen die Blut-Hirn­ schranke in der Regel nicht.These high molecular weight inhibitors penetrate the blood brain usually do not limit.

Die Blut-Hirnschranke kann jedoch durch osmotische Schocks permeabel gemacht werden oder die beschriebenen Substanzen werden direkt in z. B. die Rückenmarksflüssigkeit eingebracht, von wo sie den Wirkort erreichen.However, the blood-brain barrier can be caused by osmotic shocks be made permeable or the substances described directly in z. B. introduced the spinal fluid from where they reach the place of action.

Weitere geeignete Thrombininhibitoren sind niedermolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht unter 1000 DA.Other suitable thrombin inhibitors are low molecular weight Compounds with a molecular weight below 1000 DA.

Als niedermolekulare Thrombininhibitoren sind beispielsweise folgende Substanzklassen bekannt: substituierte Guanidinoalkyl­ derivate, Amidinophenylderivate, Guanidinophenylderivate, Lysin­ derivate, Boronsäure- und Phosphonsäurederivate von Arginin und Lysin.Examples of low molecular weight thrombin inhibitors are the following classes of substances are known: substituted guanidinoalkyl derivatives, amidinophenyl derivatives, guanidinophenyl derivatives, lysine derivatives, boronic acid and phosphonic acid derivatives of arginine and Lysine.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, die Thrombininhibitoren und einen Nerve-Growth-Factor enthalten. Sol­ che Arzneimittel eignen sich ebenfalls zur Bekämpfung von neuro­ degenerativen Erkrankungen.Another object of the invention are drugs that Thrombin inhibitors and a nerve growth factor included. Sol Chemicals are also suitable for combating neuro degenerative diseases.

Unter Nerve-Growth-Factor versteht man ein Protein, das für die Entwicklung und Aufrechterhaltung des sympathischen Nervensystems und sensorischer Nerven und andere Hirnfunktionen wichtig ist (Borsani, G. et al., Nucleic Acids Res., 18, 4020 (1990)). Es stimuliert Teilung und Differenzierung dieser Zellen.Nerve growth factor is a protein that is used for Development and maintenance of the sympathetic nervous system and sensory nerves and other brain functions is important (Borsani, G. et al., Nucleic Acids Res., 18, 4020 (1990)). It stimulates division and differentiation of these cells.

Unter neurodegenerativen Erkrankungen sind Krankheiten zu verste­ hen, bei denen die neuronale Organisation des Gehirns durch Krankheiten und Verletzungen direkt oder indirekt lokal oder über weite Gehirnbereiche verteilt, zerstört wird.Diseases are to be understood as neurodegenerative diseases see where the neuronal organization of the brain goes through Diseases and injuries directly or indirectly locally or via wide areas of the brain are distributed, destroyed.

Hierzu sind Neurodegeneration infolge von Hyper-Erregung (Excito toxicity), HIV-induzierte Neuropathie, Ischämie, Subarachnoide Blutung, Schlaganfall, Gehirnverletzungen, Herzinfarkt-Folgeer­ scheinungen im Hirn, Demenz durch vielfachen Hirnschlag, die Alzheimersche Erkrankung, Huntingtons′s Erkrankung und die Par­ kinson′sche Erkrankung zu rechnen.Neurodegeneration due to hyper-excitation (Excito toxicity), HIV-induced neuropathy, ischemia, subarachnoids Bleeding, stroke, brain injury, heart attack follower symptoms in the brain, dementia due to multiple stroke, the Alzheimer's disease, Huntingtons disease and the par kinson's disease.

Die Thrombininhibitoren können in üblicher Weise oral oder paren­ teral, subkutan, intravenös, intramuskulär, transdermal, intra­ steral, intrathekal auch als Infusion und direkt in das Hirn oder als Spray verabreicht werden. The thrombin inhibitors can be administered orally or parene in the usual way teral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, transdermal, intra sterally, intrathecally as an infusion and directly into the brain or administered as a spray.  

Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Applikationsart ab. In der Regel beträgt die tägli­ che Wirkstoffdosis zwischen etwa 100 µg und 10 mg/kg Körpergewicht bei oraler Gabe und zwischen etwa 10 µg und 10 mg/kg Körpergewicht bei parenteraler Gabe.The dosage depends on the age, condition and weight of the patient as well as on the type of application. As a rule, the daily is active substance dose between about 100 µg and 10 mg / kg body weight with oral administration and between about 10 µg and 10 mg / kg body weight with parenteral administration.

Die neuen Verbindungen können in den gebräuchlichen galenischen Applikationsformen fest oder flüssig angewendet werden, z. B. in üblichen galenischen Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Dragees oder Lösungen. Diese werden in üblicher Weise hergestellt. Die Wirkstoffe können dabei mit den üblichen galeni­ schen Hilfsmitteln wie Tablettenbindern, Füllstoffen, Konservie­ rungsmitteln, Tablettensprengmitteln, Fließreguliermitteln, Weichmachern, Netzmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lö­ sungsmitteln, Retardierungsmitteln, Antioxidantien und/oder Treibgasen verarbeitet werden (vgl. Sucker et al., Pharmazeuti­ sche Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978).The new compounds can be used in the usual galenic Application forms can be applied in solid or liquid form, e.g. B. in usual galenic tablets, film-coated tablets, capsules, powders, Granules, dragees or solutions. These are done in the usual way produced. The active ingredients can with the usual galeni auxiliaries such as tablet binders, fillers, preserves agents, tablet disintegrants, flow regulators, Plasticizers, wetting agents, dispersants, emulsifiers, solvents agents, retardants, antioxidants and / or Propellant gases are processed (see Sucker et al., Pharmaceuti technology, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978).

Beispiel 1example 1

In vivo Versuche zur Wirkung von Thrombininhibitoren auf die Ge­ dächtnisleistung und die Regeneration des Gehirns nach Läsion.In vivo experiments on the effect of thrombin inhibitors on the Ge memory performance and brain regeneration after lesion.

Die Versuche wurden wie von Casamenti F. et al. (Neuroscience Letters 103, 87-91 (1989); Neuroscience 24, 209-215 (1988)) be­ schrieben, durchgeführt.The experiments were carried out as described by Casamenti F. et al. (Neuroscience Letters 103: 87-91 (1989); Neuroscience 24: 209-215 (1988)) wrote, performed.

Zu diesem Zweck wurden Ratten operiert (einseitige Läsion) oder schein-operiert und durch eine in den lateralen Ventrikel implan­ tierte Kanüle mit Thrombininhibitoren verschiedenster Konzentra­ tion behandelt. Zwanzig Tage nach der Läsion begann das Training in einem "two-compartment step through passive avoidance" Appa­ rat. Dabei waren die Ratten in verschiedene Gruppen eingeteilt. Unbehandelte Ratten erhielten Kontrollösungen verabreicht, bei denen der Thrombininhibitor durch Serumalbumin ersetzt war. Als Thrombininhibitor wurden Hirudin und Protease Nexin-1 eingesetzt. Die Mengen betrugen zwischen 1 µg/kg bis 100 µg/kg Körpergewicht. Beobachtet wird die Latenzzeit des Verweilens in einer beleuch­ teten Kammer nach Elektroschock in einer benachbarten dunklen Kammer.For this purpose, rats were operated on (unilateral lesion) or sham-operated and through an implant in the lateral ventricle cannulated with thrombin inhibitors of various concentrations tion treated. Training began twenty days after the lesion in a "two-compartment step through passive avoidance" appa advice. The rats were divided into different groups. Control solutions were given to untreated rats where the thrombin inhibitor was replaced by serum albumin. When Thrombin inhibitor, hirudin and protease Nexin-1 were used. The amounts were between 1 µg / kg to 100 µg / kg body weight. The latency of the dwell in an illuminator is observed chamber after an electric shock in a neighboring dark one Chamber.

Nach der Trainingsphase wurden die Ratten betäubt und das Hirn in situ fixiert. Von so gewonnenen und nachfixierten Gehirnen wurden Schnitte angefertigt und kortikale Cholin-Acetyltransferase posi­ tive Neurone mit einem Avidin-Biotin-Antikörpersystem nachgewie­ sen. Die Auswertung der angefärbten Neuronen erfolgte wie bei Casamenti et al. beschrieben (Zeiss-Kontron IBASII).After the training phase, the rats were anesthetized and the brain in fixed in situ. Brains thus obtained and subsequently fixed Sections made and cortical choline acetyltransferase posi tive neurons with an avidin-biotin antibody system  sen. The staining neurons were evaluated as in Casamenti et al. described (Zeiss-Kontron IBASII).

Schein-operierte Ratten dienten als Normwert. Operierte aber ohne Thrombininhibitor behandelte Ratten zeigten eine 30 bis 40%ige Abnahme cortikaler Cholin-Acetlytransferase positiver Neurone. Konzentrationsabhängig ist dieser Effekt geringer bei der Gabe von Thrombininhibitoren. So beträgt die Abnahme bei allen einge­ setzten Inhibitoren (Hirudin, Nexin-1) nur 10-20% und ist stati­ stisch signifikant. Bei 100 µg/kg befindet man sich schon deutlich im Plateau-Bereich.Sham-operated rats served as the norm. But operated without Rats treated with thrombin inhibitor showed a 30 to 40% strength Decrease in cortical choline acetlytransferase positive neurons. Depending on the concentration, this effect is less when administered of thrombin inhibitors. So the decrease is on everyone set inhibitors (hirudin, nexin-1) only 10-20% and is stati statistically significant. At 100 µg / kg you are already clearly in the plateau area.

Beispiel 2Example 2

In vivo Versuche zur Wirkung von Thrombininhibitoren auf die Ge­ dächtnisleistung und die Regeneration des Gehirns durch Alterung.In vivo experiments on the effect of thrombin inhibitors on the Ge memory performance and brain regeneration through aging.

Die Versuche wurden wie bei Fischer et al. (Nature 329, 65-68 (1987)) beschrieben, durchgeführt.As with Fischer et al. (Nature 329, 65-68 (1987)).

Alte (23-25 Monate), im Verhalten beeinträchtigte oder nicht beeinträchtigte weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden im Wasser­ tank nach Morris (Morris R.G.M., Neurosci. Meth. 11, 47-60 (1984)) getestet. Die beeinträchtigten Ratten wurden zufällig in Kontroll- (1) und Experimentalgruppen (2) aufgeteilt und operiert. Eine mit Kanüle versorgte osmotische Pumpe (Alzet Modell 2002) wurde in den lateralen Ventrikel implantiert. Mit der Hälfte der Kontrollratten wurde gleich verfahren.Old (23-25 months), behaviorally impaired or not female Sprague-Dawley rats were affected in the water tank after Morris (Morris R.G.M., Neurosci. Meth. 11, 47-60 (1984)) tested. The affected rats happened to be in Control (1) and experimental groups (2) divided and operated. A cannulated osmotic pump (Alzet model 2002) was implanted in the lateral ventricle. With half the Control rats were treated in the same way.

Eine Experimentalgruppe erhielt den Thrombininhibitor (Hirudin und Nexin-1) zwischen 10-1000 µg/Woche.An experimental group received the thrombin inhibitor (hirudin and Nexin-1) between 10-1000 µg / week.

Eine zweite Experimentalgruppe erhielt den Thrombininhibitor (Hirudin, Nexin-1) in einer Konzentration von 10-1000 µg/Woche zusammen mit 1-10 µg Nerve-Growth-Factor.A second experimental group received the thrombin inhibitor (Hirudin, Nexin-1) in a concentration of 10-1000 µg / week together with 1-10 µg nerve growth factor.

Kontrollratten erhalten unter Weglassung des Thrombininhibitors (z. B. Hirudin) die gleiche Füllung (eine künstliche Cerebrospi­ nalflüssigkeit mit Serumalbumin der Ratte) der Pumpe mit einer einmaligen Ergänzung nach 2 Wochen.Control rats are given the omission of the thrombin inhibitor (e.g. hirudin) the same filling (an artificial cerebrospi nal fluid with rat serum albumin) of the pump with a one-time supplement after 2 weeks.

Die Ratten wurden jeweils nach 1 bis 2 (Test 1) und 3 bis 4 Wo­ chen (Test 2) erneut im Wassertank getestet. Im ersten Test zeig­ ten die mit Thrombininhibitor behandelten, beeinträchtigen Ratten noch keine signifikante Verbesserung ihres Verhaltens und ihrer Leistungen im Vergleich zu den Kontrollratten. The rats were each after 1 to 2 (test 1) and 3 to 4 weeks Chen (Test 2) tested again in the water tank. Show in the first test affected the rats treated with thrombin inhibitor no significant improvement in their behavior and their Performance compared to the control rats.  

Nach der zweiten Testung war die Leistung im Wassertank deutlich besser als die der Kontrollratten und vergleichbar der Leistung der nicht beeinträchtigten Ratten. Die Verbesserung der Leistun­ gen ist auf ein besseres Bewahren der Erinnerungen aus dem ersten Test zurückzuführen.After the second test, the performance in the water tank was clear better than that of the control rats and comparable in performance of the unaffected rats. Improving performance is for better preservation of memories from the first Test attributed.

Die zweite Experimentalgruppe, die die Kombination aus Thrombi­ ninhibitor und Nerve-Growth-Factor erhalten hatte, zeigte deut­ lich verbesserte Leistungen.The second experimental group, which is the combination of Thrombi ninhibitor and nerve growth factor, showed deut improved performance.

Folgendes Ergebnis wurde erhalten:The following result was obtained:

Claims (2)

1. Verwendung von Thrombininhibitoren zur Herstellung von Arz­ neimitteln zur Bekämpfung neurodegenerativer Erkrankungen.1. Use of thrombin inhibitors for the manufacture of medic drugs to combat neurodegenerative diseases. 2. Arzneimittel, enthaltend Thrombininhibitoren und einen nerve- growth-factor.2. Drugs containing thrombin inhibitors and a nerve growth factor.