DE4227066A1 - Langerhans Islands in pure form - Google Patents

Abstract

The invention relates to preparations of transplantable Langerhans' islets in particularly pure form, a novel production method and the therapeutic and/or diagnostic use of the islets.

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98%, bezogen auf das Volumen der gereinigten zellulären Partikel, Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitung sowie die diagnostische und/oder therapeutische Anwendung dieser Zubereitung am menschlichen oder tierischen Körper.The invention relates to a preparation of isolated Langerhans islands with a degree of purity of more than 98%, based on the volume of the cleaned cellular particles, process for making this preparation and diagnostic and / or therapeutic use of this preparation on human or animal Body.

Seit der Einführung des Insulins in die Diabetestherapie durch Banting und Best im Jahre 1922 ist das ketoazidotische Koma mit letalem Ausgang bei Diabetikern selten geworden. Die Behandlung mit Insulin hat aber bei der überwiegenden Mehrzahl der Erkrankten das Auftreten von diabetogenen Sekundärkomplikationen in Form von Mikroangiopathie u. a. an Auge, Nieren und Nerven nicht verhindern können.Since the introduction of insulin into diabetes therapy by Banting and Best in the year In 1922, ketoacidotic coma with a lethal outcome became rare in diabetics. However, treatment with insulin has that in the vast majority of sufferers Occurrence of diabetogenic secondary complications in the form of microangiopathy and. a. on the eyes, kidneys and nerves.

Seit 1966 wird versucht, die allseits bekannten Limitierungen der Insulintherapie durch Transplantation mit einer gesunden Bauchspeicheldrüse zu beheben. Die Risiken des chirurgischen Eingriffs und insbesondere die zur Vermeidung einer Abstoßungsreaktion lebenslang erforderliche immunsuppressive Behandlung des Empfängers rechtfertigen eine Pankreastransplantation als Wahleingriff nach Meinung namhafter Diabetologen nicht.Since 1966, attempts have been made to overcome the well-known limitations of insulin therapy Fix transplant with a healthy pancreas. The risks of surgical intervention and in particular to avoid a rejection reaction Justify lifelong immunosuppressive treatment of the recipient a pancreas transplantation as an elective procedure in the opinion of well-known diabetologists Not.

Seit langem war man bemüht, statt der Transplantation eines vollständigen Organs aus dem Pankreas von einem hirntoten Organspender, z. B. einem Unfallopfer, die Insulin-produzierenden Langerhans′schen Inseln zu isolieren und nur diese zu transplantieren, wobei deren Verabreichung in die Vena portae (Pfortader der Leber) im Vordergrund steht. Aus zahlreichen Tierversuchen ist bekannt, daß intraportal transplantierte Inseln in den Endästen der Portalvene einwachsen, die Insulinproduktion abhängig vom Bedarf, d. h. von der Höhe des Blutzuckerspiegels, aufnehmen, den diabetischen Stoffwechsel korrigieren und das Auftreten lebensbedrohender Diabeteskomplikationen verhindern. Ferner weiß man aus zahlreichen Tierversuchen, daß bei Inseltransplantationen im Gegensatz zur Pankreastransplantation keine oder nur eine vorübergehende immunsuppressive Behandlung des diabetischen Empfängers erforderlich ist.For a long time, efforts have been made to transplant a whole organ instead of the pancreas from a brain-dead organ donor, e.g. B. an accident victim, the Isolate insulin-producing islands of Langerhans and only these transplant, their administration into the vena portae (portal vein of the liver) in the The foreground is. It is known from numerous animal experiments that intraportal transplanted islands wax in the terminal branches of the portal vein, producing insulin depending on need, d. H. from the height of the blood sugar level correct diabetic metabolism and the occurrence of life-threatening Prevent diabetes complications. Numerous animal experiments also show that that in the case of island transplants, in contrast to the pancreas transplantation, none or only a temporary immunosuppressive treatment for the diabetic recipient  is required.

Es liegen auch Erfahrungen mit der Inseltransplantation bei diabetischen Menschen vor. Lediglich eine Patientin wurde bislang für die Dauer von fast zwei Jahren nach erfolgter Inseltransplantation Insulin-unabhängig (Warnock G.L. et al.: Diabetologia 35, 89-95, 1992). Die Mißerfolge bei zahlreichen weiteren Versuchen werden mit der Transplantation von Inselsuspensionen mit unzureichender Reinheit erklärt, d. h. unzureichend erfolgter Abtrennung von Nicht-Inselgeweben wie exokrinen Fragmenten, duktalen Elementen, Lymphknoten und Gefäßen. Solche Inselsuspensionen mit unzureichender Reinheit sind durch eine sehr hohe Immunogenität gekennzeichnet und nach Transplantation durch häufig auftretende Abstoßungsreaktionen bis hin zu vollständigem Transplantatverlust gefährdet. Trotz Verwendung immunsuppressiver Therapieprotokolle, welche sich bei der Transplantation von Herz, Leber und Niere bewährt haben, werden unreine Inselsuspensionen frühzeitig abgestoßen. Im Mittelpunkt des Interesses der Fachkreise stehen daher Reinigungsverfahren von transplantierfähigen Inselsuspensionen bzw. deren Präparation in besonders reiner Form aus Spenderorganen.There is also experience with island transplantation in diabetic people. Only one patient has been admitted for a period of almost two years Insulin-independent island transplantation (Warnock G.L. et al .: Diabetologia 35, 89-95, 1992). The failures in numerous other attempts are with the Transplantation of island suspensions with insufficient purity explained, d. H. inadequate separation of non-islet tissues such as exocrine fragments, ductal elements, lymph nodes and vessels. Such island suspensions with insufficient purity are characterized by a very high immunogenicity and after transplantation through frequent rejection reactions up to complete graft loss at risk. Despite using immunosuppressive Therapy protocols, which are involved in the transplantation of heart, liver and kidney have proven, impure island suspensions are rejected early. In the centre The interest of the specialist circles is therefore cleaning procedures of transplantable Island suspensions or their preparation in particularly pure form from donor organs.

In der publizierten PCT-Anmeldung WO 88109667 ist ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Zellisolaten aus Spenderorganen wie dem Pankreas beschrieben, indem man aus Gewebeverbänden herausgelöste Zellsuspensionen, wie Langerhans′schen Inseln enthaltende Suspensionen, der sogenannten Dichtegradientenzentrifugation unterwirft. In zahlreichen Publikationen, insbesondere in Übersichtsartikeln, wie London N.J.M. et al.: Islet Purification, in: Pancreatic Islet Cell Transplantation (Ricordi C. editor), R.G.Landes Austin, Texas USA, pp. 113-123, 1992, ist die spezielle Methodik der Dichtegradientenzentrifugation basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellen und/oder Zellverbänden mit unterschiedlicher Dichte (u. a. isopyknische Gradientenzentrifugation genannt) und deren Anwendung auf Reinigungsverfahren für Suspensionen mit Zellverbänden von Langerhans′schen Inseln beschrieben, wobei Reinheitsgrade bis zu 90%, bezogen auf das Volumen der gereinigten zellulären Partikel, erzielt werden. Die Verunreinigung der nach Anwendung dieser Methodik erhältlichen Inselsuspensionen mit unerwünschtem zellulären Partikeln, wie exokrinen Fragmenten, duktalen Elementen, Lymphknoten und Gefäßen ist unter dem Lichtmikroskop bei 100facher Vergrößerung deutlich erkennbar.In the published PCT application WO 88109667 there is a method for obtaining purified cell isolates from donor organs such as the pancreas by cell suspensions detached from tissue associations, such as Langerhans islands containing suspensions, the so-called density gradient centrifugation. In numerous publications, especially in review articles such as London N.J.M. et al .: Islet Purification, in: Pancreatic Islet Cell Transplantation (Ricordi C. editor), R.G. Landes Austin, Texas USA, pp. 113-123, 1992, is the special methodology of the Density gradient centrifugation based mainly on different sedimentation of cells and / or cell assemblies with different densities (including isopycnic Gradient centrifugation) and their application to cleaning processes for Suspensions with cell assemblies from Langerhans islands described Purity levels up to 90%, based on the volume of the cleaned cellular particles, be achieved. Contamination of those obtainable using this methodology Island suspensions with undesired cellular particles, such as exocrine fragments, ductal elements, lymph nodes and vessels is under the light microscope 100x magnification clearly visible.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln mit besonders hohem Reinheitsgrad herzustellen und die anhand von Standardversuchen in-vitro Immunogenität zu mindern.The present invention has for its object a preparation of isolated To produce Langerhans islands with a particularly high degree of purity and based on  of standard attempts to reduce in vitro immunogenicity.

Diese Aufgabenstellung wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, welche eine Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98%, bezogen auf das Volumen des gereinigten Zellmaterials und das Herstellungsverfahren dieser Zubereitung betrifft.This problem is solved by the present invention, which a Preparation of isolated Langerhans islands with a degree of purity of more than 98%, based on the volume of the purified cell material and the Manufacturing process of this preparation concerns.

Die Zubereitung der isolierten Langerhans′schen Inseln gemäß vorliegender Erfindung ist durch folgende Merkmale gekennzeichnet:
Einen erhöhten Reinheitsgrad der Langerhans′schen Inseln verglichen mit Inselsuspensionen nach Anwendung nur einer Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte;
Die Zubereitung der isolierten Langerhans′schen Inseln gemäß vorliegender Erfindung ist außerdem durch folgende zusätzliche Merkmale gekennzeichnet:
Verlust von weniger als 3% des Inselvolumens;
Durchmesser der Mehrzahl des gereinigten Zellmaterials größer als 100 µm;
Reduktion der Immunogenität um durchschnittlich mehr als 75%;
Reduktion der potentiellen mikrobiologischen Kontamination;
Konstanz der mikrofluorometrischen Viabilitätsindizes;
Erhöhung der Glucose-stimulierten Insulinsekretionsindizes in-vitro um durchschnittlich mehr als 50% sowie
Erhöhung der Wiederfindung des Inselvolumens nach einer oder mehrerer immunmodulierender Behandlungen.The preparation of the isolated Langerhans islands according to the present invention is characterized by the following features:
An increased degree of purity of the Langerhans islands compared to island suspensions after application of only one separation measure mainly based on different sedimentation of cell material with different density;
The preparation of the isolated Langerhans islands according to the present invention is also characterized by the following additional features:
Loss of less than 3% of the island's volume;
Diameter of the majority of the cleaned cell material larger than 100 μm;
Reduction of immunogenicity by an average of more than 75%;
Reduction of potential microbiological contamination;
Constancy of the microfluorometric viability indices;
Increase in glucose-stimulated insulin secretion indices in vitro by an average of more than 50% as well
Increased recovery of island volume after one or more immunomodulatory treatments.

Diese Merkmale ergeben sich im Vergleich mit vorgereinigten Inselsuspensionen nach Anwendung einer Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte, aber vor Anwendung einer anschließenden Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser, welche als erfinderisches Verfahrensmerkmal im folgenden noch näher beschrieben wird.These characteristics follow in comparison with pre-cleaned island suspensions Use of a separation measure mainly based on different Sedimentation of cell material with different densities, but before using one subsequent separation measure mainly based on different Sedimentation of cell material with different diameters, which as inventive method feature is described in more detail below.

Als weiteres Merkmal kann noch der Amylasegehalt von weniger als 0,05% verglichen mit der Inselsuspension nach Herauslösung aus dem Gewebeverband des distendierten Pankreas und vor Anwendung von anschließend durchzuführenden Trennmaßnahmen genannt werden. Die Zubereitung enthält außerdem physiologisch annehmbare Trägerflüssigkeit.As a further feature, the amylase content of less than 0.05% can be compared with the island suspension after detachment from the tissue association of the dissected  Pancreas and before using any separation measures to be carried out afterwards to be named. The preparation also contains physiologically acceptable Carrier liquid.

Die Reinheit der Zubereitung der isolierten Langerhans′schen Inseln gemäß vorliegender Erfindung ist unter dem Lichtmikroskop deutlich erkennbar.The purity of the preparation of the isolated Langerhans islands according to the present Invention is clearly visible under the light microscope.

Die weiter vorn und im folgenden verwendeten allgemeinen Definitionen und Begriffe haben im Rahmen der Beschreibung der Erfindung die folgenden Bedeutungen:The general definitions and terms used earlier and below have the following meanings in the context of the description of the invention:

Der Begriff Zellmaterial umfaßt zelluläre Fragmente oder Partikel, ganze Zellen und Agglomerationen von ganzen Zellen bis hin zu Agglomerationen von Zellen, welche auch Zellcluster genannt werden.The term cell material encompasses cellular fragments or particles, whole cells and Agglomerations of whole cells up to agglomerations of cells, which also Cell clusters are called.

Die Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln ist nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren aus dem tierischen oder menschlichen Spenderorgan Pankreas erhältlich und für diagnostische und/oder therapeutische Verfahren vorzugsweise am Menschen aber auch an Tieren applizierbar. Für therapeutische Verfahren zur Behandlung von Diabetes mellitus, sowohl vom Typ I als auch II, ist die Zubereitung der isolierten Langerhans′schen Inseln aus dem menschlichen Pankreas bevorzugt. Wegen der begrenzten Verfügbarkeit von humanem Pankreas von Spendern und der hohen Prävalenz von Diabetes mellitus in der Bevölkerung wird auch tierische Pankreas, insbesondere vom Schwein, bevorzugt. Für diagnostische Verfahren ist die Zubereitung von isolierten tierischen Langerhans′schen Inseln, insbesondere vom Schwein, bevorzugt. Die Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln aus dem menschlichen Pankreas für die diagnostische Anwendung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.The preparation of isolated Langerhans islands is according to the following described method from the animal or human donor organ pancreas available and for diagnostic and / or therapeutic procedures preferably on Humans can also be applied to animals. For therapeutic procedures for treatment of diabetes mellitus, both type I and II, is the preparation of the isolated Langerhans islands from the human pancreas preferred. Because of the limited availability of human pancreas from donors and high prevalence Diabetes mellitus in the population also becomes animal pancreas, in particular from pork, preferred. For diagnostic procedures, the preparation of isolated animal Langerhans islands, especially pork, preferred. The Preparation of isolated Langerhans islands from the human pancreas for the diagnostic use is also the subject of the invention.

Die Zubereitung liegt vorzugsweise in Form einer Suspension der isolierten Langerhans′schen Inseln in einer physiologisch annehmbaren Trägerflüssigkeit vor, die vorzugsweise parenteral in die Vena portae (Pfortader der Leber), aber auch in die Vena lienalis, in die Milzpulpa, unter die Nierenkapsel, in eine Omentumtasche, intraperitoneal, intramuskulär, subcutan, intracerebral oder intratesticulär injizierbar ist.The preparation is preferably in the form of a suspension of the isolated Langerhans islands in a physiologically acceptable carrier liquid preferably parenterally into the vena portae (portal vein of the liver), but also into the vena lienalis, in the splenic pulp, under the kidney capsule, in an omentum, intraperitoneally, can be injected intramuscularly, subcutaneously, intracerebrally or intratesticularly.

Der Begriff physiologisch annehmbare Trägerflüssigkeit definiert sämtliche wäßrige Medien, die in der Literatur als geeignet für Reinigungs-, Diagnose- und Transplantationsverfahren von Langerhans′schen Inseln beschrieben sind. Bevorzugt sind Medien, die unter Bezeichnungen wie Hank′s Balanced Saline Solution (Hanksche Lösung), Krebs-Puffer, Minimum Essential Medium, Medium 199, RPMI, 1640, CMRL 1066, University of Wisconsin Solution geläufig sind.The term physiologically acceptable carrier liquid defines all aqueous Media that are suitable in the literature for cleaning, diagnostic and Transplantation procedures from Langerhans islands are described. Are preferred  Media under names such as Hank’s Balanced Saline Solution (Hanksche Solution), Krebs buffer, Minimum Essential Medium, Medium 199, RPMI, 1640, CMRL 1066, University of Wisconsin Solution.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Herstellungsverfahren für die weiter vom beschriebene Zubereitung der isolierten Langerhans′schen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98% des Zellmaterials. Dieses Verfahren ist durch folgende Verfahrensmerkmale gekennzeichnet, daß manThe present invention also relates to the production process for the further from the described preparation of the isolated Langerhans islands with one Purity of more than 98% of the cell material. This procedure is as follows Process features characterized that one

• a) das Pankreas mit einer physiologisch annehmbaren Trägerflüssigkeit, welche gegebenenfalls Collagenase und/oder weiter Proteasen enthält, distendiert und aus dem Gewebeverband Langerhans′sche Inseln mit zusätzlichem Zellmaterial durch Digestion herauslöst,a) the pancreas with a physiologically acceptable carrier fluid, which optionally contains collagenase and / or further proteases, and extends from the Tissue bandage Langerhans islands with additional cell material by digestion detaches,
• b) die herausgelösten Langerhans′schen Inseln vom zusätzlichen Zellmaterial durch mindestens eine Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlichem Durchmesser abtrennt und gewünschtenfallsb) the extracted Langerhans islands by the additional cell material at least one separation measure based primarily on different Separates and separates cell aggregates with different diameters if desired
• c) die erhältlichen Langerhans′schen Inseln einer ihre potentielle Immunogenität/Antigenität reduzierenden Behandlung unterwirft und/oder die behandelten Inseln konserviert.c) the available Langerhans islands one of their potential Subject to immunogenicity / antigenicity reducing treatment and / or treated islands preserved.

Verfahrensschritt a)Process step a)

Dieser Verfahrensschritt ist an sich bekannt und findet generell bei den bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren von Langerhans′schen Inseln Anwendung.This process step is known per se and is generally found in the known ones Isolation and purification methods of Langerhans Islands application.

Der Begriff Distension bedeutet Aufdehnung. Zur Distension wird der Ausführungsgang des Pankreas, z. B. vom Mensch oder Schwein, über den im Körper die im exokrinen Anteil des Pankreas gebildeten Verdauungsenzyme in den Dünndarm abgegeben werden, kanüliert und über diese Kanüle werden meist 2 ml Haksche Lösung mit ca. 0,2-0,4% (w/v) Collagenase pro g Pankreasmasse retrograd in den Pankreasgang injiziert. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise nach der von Lacy P.E. et al. in Diabetes 16 : 35-39 (1967) und von Gray D.W.R. et al. in Diabetes 33 : 1055-1061(1984) beschriebenen Methodik durchgeführt.The term distension means expansion. The execution corridor becomes distension the pancreas, e.g. B. from humans or pigs, in the body in the exocrine Portion of the pancreas formed digestive enzymes are released into the small intestine, cannulated and usually 2 ml Haksche solution with approx. 0.2-0.4% (w / v) Collagenase per g pancreatic mass injected retrograde into the pancreatic duct. This The process step is preferably carried out according to the procedure described by Lacy P.E. et al. in Diabetes 16: 35-39 (1967) and by Gray D.W.R. et al. in Diabetes 33: 1055-1061 (1984) Methodology performed.

Der Begriff Digestion bedeutet Verdauung. Während der Digestion wird das Pankreas unter enzymatischer und mechanischer Einwirkung in Langerhans′sche Inseln und Zellmaterial dissoziiert. Diese Maßnahme wird vorzugsweise nach der von Ricordi C. et al.: Diabetes 37 : 413-420, 1988 sowie in der PCT-Anmeldung WO 88109667 beschriebenen Methode durchgeführt.The term digestion means digestion. During digestion, the pancreas becomes under enzymatic and mechanical influence in Langerhans islands and  Cell material dissociates. This measure is preferably carried out according to the Ricordi C. et al .: Diabetes 37: 413-420, 1988 and in PCT application WO 88109667 described method performed.

Der Begriff Protease umfaßt neben reinen Collagenasen die unter Bezeichnung wie Neutral Protease, Clostripain, Trypsin, Elastase, Dispase etc. bekannten Enzyme.In addition to pure collagenases, the term protease encompasses those labeled as Neutral protease, clostripain, trypsin, elastase, dispase etc. known enzymes.

Nach Durchführung des Verfahrensschritts a) erhält man eine Suspension der herausgelösten Langerhans′schen Inseln in den weiter vorn definierten Medien, die noch durch zusätzliches Zellmaterial verunreinigt ist.After carrying out process step a), a suspension of extracted Langerhans islands in the media defined above, which still is contaminated by additional cell material.

Verfahren b)Procedure b)

Der Begriff Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser definiert ein Trennverfahren, das an sich bekannt ist, dessen Anwendung zur Isolierung und Reinigung von Langerhans′schen Inseln noch neu und daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Diese Trennmaßnahme wird in internationalen Publikationen mit dem Begriff velocity sedimentation bezeichnet, die u. a. folgende Verfahrensvarianten umfaßt: Sedimentation bei 1 g, Gegenstromzentrifugation (Elutriation), Zentrifugation in reorientierenden Zonalrotoren und isokinetische Gradientenzentrifugation. Bevorzugt ist die unter der üblichen Bezeichnung isokinetische Gradientenzentrifugation bekannte Verfahrensvariante.The term separation measure based primarily on different sedimentation of cell material with different diameters defines a separation process that is known, its application for the isolation and cleaning of Langerhans'schen Islands are still new and therefore the subject of the present invention. This Separation measure is used in international publications with the term velocity called sedimentation, which u. a. includes the following process variants: sedimentation at 1 g, countercurrent centrifugation (elutriation), centrifugation in reorienting Zonal rotors and isokinetic gradient centrifugation. Preferred is that under the Common name isokinetic gradient centrifugation Process variant.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die isokinetische Gradientenzentrifugation mit einer weiteren Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlicher Dichte kombiniert.In a particularly preferred embodiment of the method, the isokinetic Gradient centrifugation with another separation measure based mainly on different sedimentation of cell aggregates with different density combined.

Der Begriff Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte definiert ein weiteres Trennverfahren, das an sich bekannt ist und auch bei der Isolierung und Reinigung von Langerhans′schen Inseln angewendet worden ist, siehe Publikation von London N.J.M., loc. cit. Seite 5. Diese Trennmaßnahme ist in internationalen Publikationen auch unter dem Begriff isopyknische Gradientenzentrifugation beschrieben. Die bevorzugt anzuwendende Methodik wird im Beispiel näher erläutert. The term separation measure based primarily on different sedimentation of cell material with different density defines another separation process, the is known per se and also in the isolation and cleaning of Langerhans'schen Islands has been applied, see publication by London N.J.M., loc. cit. Page 5. This separation measure is also known in international publications isopycnic gradient centrifugation. The preferred one The methodology is explained in more detail in the example.  

Die besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß manThe particularly preferred embodiment of the method is characterized in that that he

• b) die herausgelösten Langerhans′schen Inseln von zusätzlichem Zellmaterial durch aufeinander folgende Trennmaßnahmen basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlicher Dichte und unterschiedlichem Durchmesser abtrennt.b) through the extracted Langerhans islands of additional cell material successive separation measures based mainly on different Sedimentation of cell aggregates with different density and different Separates diameter.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann man umgekehrt vorgehen, indem man die Trennmaßnahmen basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlichem Durchmesser und unterschiedlicher Dichte miteinander kombiniert. Ebenfalls kann man beide Trennmaßnahmen in kontinuierlichen Verfahren miteinander kombinieren.In a further embodiment of the method, the procedure can be reversed by the separation measures are based mainly on different sedimentation of cell assemblies with different diameters and different densities combined with each other. You can also do both separation measures in continuous Combine procedures with each other.

Die isokinetische Gradientenzentrifugation wird bevorzugt nach der von Pretlow T.G. in Anal.Biochem.: 41 : 248-255, 1971 sowie in der von Pretlow T.G.II und Pretlow T.P. in Cell Separation: methods and Selected Applications, Vol.5, Academic Press, pp. 281-309, beschriebenen Methodik in einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium mit linearem Dichtegradienten durchgeführt. Ein solches Medium wird in Publikationen mit der Bezeichnung "Gradient" versehen und z. B. in einem sogenannten Gradientenmischer geformt oder bei der Zentrifugation selbst gebildet. Der Gradient hat am Boden des Zentrifugenröhrchens die größte Dichte und nimmt mit der Höhe an Dichte ab. Geeignete Medien zur Bildung von Gradienten sind z. B. unter der Bezeichnung Ficoll®, Percoll® (Pharmacia, Freiburg) bekannt und können Hilfsstoffe wie Polysucrose, Polyvinylpyrrolidon, Albumin oder Dextran enthalten. Für Trennmaßnahmen basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser ist die Migration des sedimentierenden Zellmaterials durch einen Gradienten charakteristisch, dessen maximale Dichte nicht größer ist als die des am wenigsten dichten sedimentierenden Materials. Während der Zentrifugation bewegt sich das sedimentierende Zellmaterial mit einer weitgehend konstanten Geschwindigkeit durch den Gradienten. Die Trennmaßnahme ist beendet, wenn die ersten zellulären Partikel den Boden des Zentrifugenröhrchens erreichen. Diese Methodik ist für Trennmaßnahmen von Zellmaterialien geeignet, die sich im wesentlichen durch ihren Durchmesser, aber weniger durch ihre Dichte unterscheiden. Isokinetic gradient centrifugation is preferred after that described by Pretlow T.G. in Anal.Biochem .: 41: 248-255, 1971 and in that of Pretlow T.G.II and Pretlow T.P. in Cell Separation: methods and Selected Applications, Vol.5, Academic Press, pp. 281-309, described methodology in a physiologically acceptable aqueous medium linear density gradient. Such a medium is included in publications labeled "Gradient" and z. B. in a so-called gradient mixer shaped or formed during centrifugation. The gradient has at the bottom of the Centrifuge tube the greatest density and decreases with the height of density. Suitable Media for the formation of gradients are e.g. B. under the name Ficoll®, Percoll® (Pharmacia, Freiburg) and can use auxiliary substances such as polysucrose, Contain polyvinylpyrrolidone, albumin or dextran. Based on separation measures predominantly on different sedimentation of cell material with different Diameter is the migration of the sedimenting cell material through a Characteristic gradients, the maximum density of which is not greater than that of the am least dense sedimenting material. Moves during centrifugation through the sedimenting cell material at a largely constant speed the gradient. The separation measure has ended when the first cellular particles reach the Reach the bottom of the centrifuge tube. This methodology is for separation measures from Suitable cell materials, which differ mainly by their diameter, but less differentiate by their density.  

Verfahrensschritt c)Process step c)

Eine die potentielle Immunogenität/Antigenität reduzierende Behandlung, z. B. Kultivierung, UV-Bestrahlung, Gamma-Bestrahlung, Inkubation mit Antikörpern oder Verkapselung, betrifft übliche Aufarbeitungsverfahren von Zellmaterial in Kulturen für die weiter vorn beschriebenen Anwendungen, welche ebenfalls in den in dieser Anmeldung zitierten Publikationen beschrieben werden. Die Kryopräservierung kann sich bevorzugt als Konservierungsmaßnahme anschließen. Aufgrund der besonderen Reinheit der erhältlichen Inseln erzielt man nach Anwendung bei allen Maßnahmen die sich an die Trennmaßnahmen anschließen, ein verbessertes Resultat, welches die therapeutischen und/oder diagnostischen Befunde verbessert.A treatment that reduces the potential immunogenicity / antigenicity, e.g. B. Cultivation, UV radiation, gamma radiation, incubation with antibodies or Encapsulation, relates to customary processing methods for cell material in cultures for the applications described above, which are also included in this Registration cited publications are described. The cryopreservation can preferably connect as a preservation measure. Because of the special purity of the available islands can be achieved after application with all measures that are related to the Connect separation measures, an improved result, which the therapeutic and / or diagnostic findings improved.

Das folgende Beispiel illustriert die Erfindung ohne dadurch diese zu limitieren (Temperaturangaben in Grad Celsius, die Ortsangaben der Hersteller bzw. der Herausgeber und Verlage von Publikationen beziehen sich auf in der Bundesrepublik Deutschland gelegene Orte):The following example illustrates the invention without thereby limiting it (Temperature in degrees Celsius, the location of the manufacturer or the Publishers and publishers of publications refer to in the Federal Republic Places in Germany):

Beispiel:Example: 1. Pankreasgewebe1. Pancreatic tissue

Das Pankreas wird in einem Schlachthaus bei einer Zuchtsau (Deutsches Bundeshybridzuchtprogramm, 240 kg, 34 Monate) nach Bolzenschuß, Entblutung und Entnahme des Darmsitus unter Schonung der Organkapsel aus dem umgebenden Fettgewebe unter sterilen Kautelen freipräpariert. Der Schlachtvorgang bedingt eine warme Ischämiezeit von 10 min. Das entnommene Organ wird in 40° kalter Eurocollins®-Lösung (Fresenius, Bad Homburg) in das kalte Insellabor transportiert. Die kalte Ischämiezeit vor Beginn der Inselisolierung beträgt ca. 30 min.The pancreas is in a slaughterhouse at a breeding sow (German Federal hybrid breeding program, 240 kg, 34 months) after bolt shooting, bleeding and Removal of the intestinal site while protecting the organ capsule from the surrounding Adipose tissue prepared under sterile cautery. The slaughtering process requires one warm ischemia time of 10 min. The removed organ becomes 40 ° colder Eurocollins® solution (Fresenius, Bad Homburg) transported to the cold island laboratory. The cold ischemia time before island isolation begins is approx. 30 min.

2. Pankreaspräparation und Pankreasdistension2. Pancreatic preparation and pancreatic distension

Alle weiteren Schritte der Inselpräparation werden unter sterilen Kautelen durchgeführt. Nur der milznahe Schenkel des Pankreas wird für die Inselisolierung benutzt. Das Gewicht des präparierten Organsegementes beträgt ca. 120 g. Der Ausführungsgang der Bauchspeicheldrüse (Ductus pancreaticus) wird an der Schnittfläche zwischen milznahem und rechtem Schenkel aufgesucht, mit einer 19 G Kanüle kanüliert und die Kanüle mit einem chirurgischen Faden fixiert. All further steps of the island preparation are carried out under sterile cauldrons. Only the leg near the spleen of the pancreas is used for island isolation. The The weight of the prepared organ segment is approx. 120 g. The execution course of the Pancreas (ductus pancreaticus) is located on the cut surface between the spleen and the right leg, cannulated with a 19 G cannula and the cannula with fixed with a surgical thread.  

Das Gewicht des verwendeten milznahen Pankreasschenkels determiniert das Volumen der Distensionslösung. Pro Gramm Pankreas werden über die liegende Kanüle 2 ml Distensionslösung, d. h. insgesamt 240 ml, retrograd in den Ductus pancreaticus injiziert. Zur Distension verwendet man University of Wisconsin (UW)-Lösung (DuPont, Bad Homburg) mit 0,4% (wt/vol) Collagenase (Serva, Heidelberg, Katalog-Nr. 17449), die Temperatur der Distensionlösung beträgt 220.The weight of the pancreatic leg near the spleen determines the volume the distension solution. For each gram of pancreas, 2 ml Distension solution, d. H. a total of 240 ml, retrogradally injected into the pancreatic duct. University of Wisconsin (UW) solution (DuPont, Bad Homburg) with 0.4% (wt / vol) collagenase (Serva, Heidelberg, Catalog No. 17449), the Temperature of the distension solution is 220.

Nach erfolgter Distension werden die Kanüle, weiteres umgebendes Fett- und Bindegewebe, die Organkapsel, und nicht distendiertes Parenchym entfernt (insgesamt 15 g ohne Kanüle, d. h. das Gewicht des weiter verwendeten Pankreas beträgt ca. 105 g).After distension, the cannula, further surrounding fat and Connective tissue, the organ capsule, and undissolved parenchyma removed (total 15 g without cannula, d. H. the weight of the pancreas used is approx. 105 g).

3. Pankreasdigestion3. Pancreatic digestion

Langerhans′sche Inseln (Inseln) werden nach einer von Ricordi C. et al.: Diabetes 37 : 413-420 (1988) und ebenfalls in der publizierten PCT-Anmeldung WO 88109667 für die Isolierung von humanen Langerhans′schen Inseln beschriebenen Methodik aus dem Gewebeverband zusammen mit exokrinen Fragmenten, Ductuselementen, Gefäßbruchstücken, Lymphknoten etc. herausgelöst.Langerhans islands (islands) are based on one of Ricordi C. et al .: Diabetes 37: 413-420 (1988) and also in the published PCT application WO 88109667 for the isolation of human Langerhans islands described methodology from the Tissue bandage together with exocrine fragments, duct elements, Vascular fragments, lymph nodes etc. removed.

Zu diesem Zweck wird das distendierte Pankreassegment in den unteren Teil einer 450 ml Distensions-Kammer, deren Anordnung in derselben PCT-Anmeldung WO 88109667 beschrieben ist, zusammen mit 7 Glaskugeln gegeben. Anschließend werden der untere Teil der Kammer, ein 400 µm Sieb, der Deckel der Kammer sowie ein Schlauchsystem zur Rezirkulation der Collagenaselösung, wie in Abb. 2 der PCT-Anmeldung WO 88109667 beschrieben, zusammengefügt.For this purpose, the dilated pancreatic segment is placed in the lower part of a 450 ml Distension chamber, their arrangement in the same PCT application WO 88109667 is given, together with 7 glass balls. Then the bottom one Part of the chamber, a 400 µm sieve, the lid of the chamber and a hose system for Recirculation of the collagenase solution, as in Fig. 2 of the PCT application WO 88109667 described, put together.

Man füllt das Schlauchsystem mit zusätzlicher Hankschen Lösung, schaltet die Pumpe zur Rezirkulation der Lösung ein und stellt die Durchflußgeschwindigkeit (flow rate) auf 200 ml/min. Man bewegt die Digestionskammer mit dem distendierten Pankreas und den Glaskugeln in der vertikalen Achse mit einer Frequenz von 300 Oszillationen pro min. und einer Amplitude von 10 mm. Man erhöht die in der Digestionskammer gemessene Temperatur mit einem Wärmetauscher um 3°/min. auf 32-34° und hält die Temperatur während der Rezirkulationsphase (Phase I) bei diesem Wert konstant.You fill the hose system with additional Hank solution, the pump switches on Recirculate the solution and set the flow rate 200 ml / min. You move the digestion chamber with the dilated pancreas and the Glass balls in the vertical axis with a frequency of 300 oscillations per min. and an amplitude of 10 mm. The one measured in the digestion chamber is increased Temperature with a heat exchanger around 3 ° / min. to 32-34 ° and maintains the temperature constant at this value during the recirculation phase (phase I).

Anhand mikroskopischer Beobachtung von Proben, welche im Abstand von jeweils 1-2 min. dem Schlauchsystem entnommen werden, läßt sich der Fortgang der Pankreasdigestion verfolgen. Nach 14 min. wird erstmals eine große Zahl freier Inseln in einer entnommenen Probe identifiziert. Man stoppt die Rezirkulation der Collagenase-haltigen Hankschen Lösung zu diesem Zeitpunkt und spült die Kammer 15 min. lang mit frischer, enzymfreier Hankschen Lösung und einer Durchflußgeschwindigkeit von 250 ml/min, bis in den Proben keine Inseln sichtbar sind (Phase II). Die Temperatur während der Phase II nimmt von 32-34° innerhalb von 15 min auf 15° ab. Um die freiwerdenden Inseln vor der Einwirkung der Collagenase und weiterer, aus dem Pankreas freigesetzter proteolytischer Enzyme zu schützen, nimmt man die Gewebesuspension in gekühlten (8°) 250 ml Zentrifugenbechern mit konischem Boden auf, in die man 35 ml Hanksche Lösung vorlegt.Using microscopic observation of samples, which are at intervals of each  1-2 min. can be removed from the hose system, the progress of the Track pancreatic digestion. After 14 min. is a large number of free islands in identified from a sample taken. One stops the recirculation of the Hank's collagenase-containing solution at this point and rinsed the chamber 15 minutes. long with a fresh, enzyme-free Hank solution and one Flow rate of 250 ml / min until no islands are visible in the samples (Phase II). The temperature during phase II increases from 32-34 ° within 15 min to 15 °. To release the islands before exposure to collagenase and to protect further proteolytic enzymes released from the pancreas is taken the tissue suspension in chilled (8 °) 250 ml centrifuge beakers with a conical bottom into which 35 ml of Hank's solution are placed.

Man zentrifugiert diesen mit Gewebesuspension gefüllten Zentrifugenbecher 2 min. lang bei 4° in einem Schwerefeld von 120×g, verwirft den Überstand, füllt bei 4° das Gesamtpellet auf 200 ml mit UW-Lösung auf, resuspendiert und lagert bei 8°. Zur Bestimmung der Inselzahl, des Inselvolumens, des DNA-Gehalts, der Insulin-Konzentration und der Amylaseaktivität werden repräsentative Proben entnommen.This centrifuge beaker filled with tissue suspension is centrifuged for 2 min. long at 4 ° in a gravitational field of 120 × g, discards the supernatant, fills that at 4 ° Total pellet to 200 ml with UW solution, resuspended and stored at 8 °. For Determination of the number of islands, the island volume, the DNA content, the Insulin concentration and amylase activity are representative samples taken.

4. Isopyknische Dichtegradientenzentrifugation4. Isopycnic density gradient centrifugation

Nach nochmaliger Zentrifugation (2 min bei 4° in einem Schwerefeld von 120×g) verwirft man den Überstand, resuspendiert das Pellet mit einem Volumen von 32 ml in 15 ml hitzeinaktiviertes Newborn Calf Serum (NCS, Biochrom Berlin) und überführt in ein 600 ml Becherglas, welches man mit 400 ml FICOLL-Natriumdiatrizoat-Lösung auffüllt. Man stellt diese Lösung durch Zusammengeben von 500 ml Seromed®-FICOLL-Trennmitrel (1,090 g/cm³, Biochrom Berlin), 12 ml HEPES 1 M (Gibco, Eggenstein), 5 ml Penicillin-Streptomycin (10000 IU/ml P., 10 000 µg/ml S.,Flow, Irvine GB), 1 ml 1 N NaOH-Lösung und 50 ml Medium 199 (1x, Biochrom, Berlin) her. Man überführt den Inhalt des Becherglases (Bodenschicht) in einen 500 ml Bluttransportbeutel (Modell Biopack, Biotrans, Dreieich), verbindet diesen Bluttransportbeutel mit einem zuvor in das Blutzellwaschgerät 2991 (Cobe, Kirchheim/München) gemäß Vorschrift eingelegten Einmalsystem (Blood Cell Processor Processing Set, Cobe, Katalog-Nr. 912-647-819) und füllt den Inhalt des Bluttransportbeutels in das Einmalsystem ein. Man beschleunigt die Zentrifuge des Blutzellwaschgerätes 2 min. lang auf 2000 rpm (rotations per minute). Man schichtet 200 ml Medium 199 auf die Bodenschicht mit einer Schlauchpumpe bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 60 ml/min. auf, während man die Zentrifuge auf 2400 rpm beschleunigt. Anschließend entlüftet man das Einmalsystem und verschließt den Zuführungsschlauch. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 2400 rpm und Raumtemperatur werden bei derselben Umdrehungszahl mit einem integrierten "Gradientenunloader" nacheinander folgende Fraktionen aus dem "Processing Set"in Zentrifugenbecher überführt:
Fraktion I: 180 ml
Fraktion IIa: 25 ml
Fraktion IIb: 10 ml
Fraktion IIc: 10 ml
Fraktion IId: 10 ml
Fraktion IIe: 25 ml
Fraktion III: 290 ml.After repeated centrifugation (2 min at 4 ° in a gravitational field of 120 × g), the supernatant is discarded, the pellet with a volume of 32 ml is resuspended in 15 ml of heat-inactivated Newborn Calf Serum (NCS, Biochrom Berlin) and transferred to a 600 ml Beaker, which is filled with 400 ml of FICOLL sodium diatrizoate solution. This solution is prepared by combining 500 ml Seromed® FICOLL separating medium (1.090 g / cm ³ , Biochrom Berlin), 12 ml HEPES 1 M (Gibco, Eggenstein), 5 ml penicillin streptomycin (10000 IU / ml P., 10,000 µg / ml S., Flow, Irvine GB), 1 ml 1 N NaOH solution and 50 ml medium 199 (1x, Biochrom, Berlin). The contents of the beaker (bottom layer) are transferred to a 500 ml blood transport bag (model Biopack, Biotrans, Dreieich), this blood transport bag is connected to a disposable system (Blood Cell Processor Processing Set) previously inserted in the blood cell washing machine 2991 (Cobe, Kirchheim / Munich) , Cobe, catalog No. 912-647-819) and fills the contents of the blood transport bag into the single-use system. The centrifuge of the blood cell washing machine is accelerated for 2 min. long to 2000 rpm (rotations per minute). Layer 200 ml of medium 199 on the bottom layer with a peristaltic pump at a flow rate of 60 ml / min. while accelerating the centrifuge to 2400 rpm. The disposable system is then vented and the supply hose is closed. After centrifugation at 2400 rpm and room temperature for 10 minutes, the following fractions from the "Processing Set" are transferred to the centrifuge beaker at the same speed with an integrated "gradient unloader":
Fraction I: 180 ml
Fraction IIa: 25 ml
Fraction IIb: 10 ml
Fraction IIc: 10 ml
Fraction IId: 10 ml
Fraction IIe: 25 ml
Fraction III: 290 ml.

Nach Abstellen der Zentrifuge entnimmt man das "Processing Set" und überführt die
Fraktion IV: 50 ml
in ein Becherglas.After the centrifuge has been switched off, the "Processing Set" is removed and transferred
Fraction IV: 50 ml
in a beaker.

Die Fraktionen werden in Medium 199 mit 10%iger NCS suspendiert und 5 min. lang bei 250×g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Man verwirft den Überstand, resuspendiert das Pellet der Fraktionen separat in Leibovitz-Medium (Biochrom Berlin) mit 10%igem fetalem Kälberserum (FCS, Biochrom Berlin), 1%iger Penicillin-Streptomycin-Lösung und 2 mM Glucyl-Glutamin (Biochrom, Berlin), überführt die Suspensionen in Kulturflaschen und beurteilt die Suspensionen hinsichtlich ihrer Inselreinheit (prozentualer Anteil der mit Inselgewebe bedeckten Oberfläche). Die Fraktionen, die die Masse des Volumens der Inseln enthalten, sind nahezu ohne erkennbare exokrine Kontamination und werden anschließend der isokinetischen Gradientenzentrifugation zugeführt. Zur Bestimmung der Inselzahl, des Inselvolumens, des DNA-Gehalts, der Insulin-Konzentration, der Amylaseaktivität, der Glucose-abhängigen Insulinsekretion in-vitro sowie der Immunogenität werden repräsentative Proben entnommen. The fractions are suspended in medium 199 with 10% NCS and 5 min. long Centrifuged at 250 × g at room temperature. The supernatant is discarded, resuspended the pellet of the fractions separately in Leibovitz medium (Biochrom Berlin) with 10% fetal calf serum (FCS, Biochrom Berlin), 1% penicillin streptomycin solution and 2 mM glucyl-glutamine (Biochrom, Berlin), converts the suspensions into Culture bottles and assesses the suspensions for their island purity (percentage of the surface covered with island tissue). The fractions that the Mass of the volume of the islands included are almost without discernible exocrine Contamination and then the isokinetic gradient centrifugation fed. To determine the number of islands, the island volume, the DNA content, the Insulin concentration, amylase activity, glucose-dependent insulin secretion Representative samples are taken in vitro and immunogenicity.  

5. Isokinetische Gradientenzentrifugation5. Isokinetic gradient centrifugation

In ein 100 ml Rundboden-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit einer Höhe von 166 mm und einem Durchmesser von 31,5 mm (Nalge, Braunschweig) wird eine Bodenschicht in Form eines Kissens mit einem Volumen von 4 ml, einer Höhe von 15 mm, einer Dichte von 1,026 g/cm³ und einer Viskosität von 3,5 cP bei 16° bestehend aus FICOLL und Leibovitz-Medium pipettiert.In a 100 ml round-bottom centrifuge tube made of polycarbonate with a height of 166 mm and a diameter of 31.5 mm (Nalge, Braunschweig) is a bottom layer in the form of a cushion with a volume of 4 ml, a height of 15 mm, a density of 1.026 g / cm ³ and a viscosity of 3.5 cP at 16 ° consisting of FICOLL and Leibovitz medium.

Auf die kissenförmige Bodenschicht wird mit Hilfe eines Zweikammer-Gradientenformers ein kontinuierlicher Gradient mit einem Volumen von 76 ml und einer Höhe von 120 mm, einem Dichtebereich von 1,026 bis 1,017 g/cm³ und einem Viskositätsbereich von 3,5 cP bis 2,0 cP bei 16° bestehend aus FICOLL und Leibovitz-Medium aufgeschichtet. Auf den kontinuierlichen Gradienten wird eine 5 ml Probe entsprechend einer Höhe von 8 mm und bis zu 50 000 Inseläquivalenten (ein Inseläquivalent ist eine volumenkorrigierte Inselzahl, ein Inseläquivalent bedeutet eine Insel mit einem Durchmesser von 150 µm, siehe Ricordi et al.: Acta Diabetol.Lat. 27: 185-195, 1990) und zellulärer Restmasse in Leibovitz Medium hinzugefügt.A continuous gradient with a volume of 76 ml and a height of 120 mm, a density range from 1.026 to 1.017 g / cm ³ and a viscosity range from 3.5 cP to 2.0 cP is applied to the pillow-shaped bottom layer with the aid of a two-chamber gradient former layered at 16 ° consisting of FICOLL and Leibovitz medium. A 5 ml sample corresponding to a height of 8 mm and up to 50,000 island equivalents (an island equivalent is a volume-corrected island number, an island equivalent means an island with a diameter of 150 µm, see Ricordi et al .: Acta Diabetol. Lat. 27: 185-195, 1990) and cellular residual mass in Leibovitz Medium.

Das Zentrifugenröhrchen mit Bodenschicht (Kissen), Gradienten und Probe wird so in eine Zentrifuge positioniert, daß der Abstand der Grenzschicht zwischen Kissen und Gradienten 22,2 cm und der Abstand der Grenzschicht zwischen Probe und Gradienten 10,2 vom Zentrum der Hettich Rotixa RP Zentrifuge (Tuttlingen) beträgt, welche mit einem Ausschwingrotor Typ 5094 und passenden Gehängen und Reduzierungen zur Aufnahme von 100 ml Zentrifugenröhrchen versehen ist. Gegenüberliegend werden weitere Zentrifugenröhrchen gleichen Inhalts oder Balanceröhrchen positioniert. Man beschleunigt die Zentrifugenröhrchen 30 sec. lang bis auf 490 rpm. Bei dieser Drehzahl wirkt einem Zentrifugalkraft von 27,4×g an der Grenzschicht zwischen Probe und Gradienten und von 59,6×g an der Grenzschicht zwischen der Bodenschicht und Gradienten. Man zentrifugiert bei 16° sechzig sec. lang und bremst in 30 sec. auf 0 rpm ab.The centrifuge tube with bottom layer (cushion), gradient and sample is thus in a centrifuge positioned that the distance between the cushion and cushion Gradients 22.2 cm and the distance between the boundary layer between sample and gradient 10.2 from the center of the Hettich Rotixa RP centrifuge (Tuttlingen), which with a swing-out rotor type 5094 and suitable buckets and reducers for 100 ml centrifuge tube is provided. Be opposite positioned further centrifuge tubes of the same content or balance tubes. Man accelerates the centrifuge tube to 490 rpm for 30 seconds. At this speed acts at a centrifugal force of 27.4 × g at the interface between the sample and Gradients and of 59.6 × g at the boundary layer between the soil layer and Gradients. The mixture is centrifuged at 16 ° for sixty seconds and braked to 0 rpm in 30 seconds from.

Das Zentrifugenröhrchen wird aus der Zentrifuge genommen, aspiriert die erste Fraktion bestehend aus 80 ml und die zweite Fraktion bestehend aus 5 ml, verdünnt mit Leibovitz Medium und wäscht durch erneute Zentrifugation 2 min. bei 120×g und 16°. Man verwirft den Überstand und resuspendiert die verbleibende Zellsuspension mit Leibovitz Medium oder anderen Kulturmedien und konventionellen Zusätzen. Zur Bestimmung der Inselzahl, des Inselvolumens, des DNA-Gehalts, der Insulin-Konzentration, der Amylaseaktivität, der Glucose-abhängigen Insulinsekretion in-vitro sowie der Immunogenität werden repräsentative Proben entnommen. Die erhältliche Inselsuspension wird der weiteren Verwendung, z. B. Kultur, zugeführt. The centrifuge tube is removed from the centrifuge, aspirates the first fraction consisting of 80 ml and the second fraction consisting of 5 ml, diluted with Leibovitz Medium and washes by centrifugation again 2 min. at 120 × g and 16 °. Man discards the supernatant and resuspends the remaining cell suspension with Leibovitz Medium or other culture media and conventional additives. To determine the Island number, the island volume, the DNA content, the insulin concentration, the  Amylase activity, glucose-dependent insulin secretion in vitro and Representative samples are taken from immunogenicity. The available island suspension the further use, e.g. B. culture supplied.  

6. Nachbehandlung6. Post-treatment

Die Inselzahl, das Inselvolumen, die Insulinkonzentration, der mikrofluorometrische Viabilitätstest, die Glucose-abhängige Insulinsekretion in-vitro werden in den einzelnen Proben nach internationalem Standard bestimmt, z. B. Ricordi C. et al.: Acta Diabetol.Lat. loc. cit . . Die Bestimmung des DNA-Gehalts erfolgt nach der Methode von Labarca C. und Paigen K., Anal.Biochem.: 102, 344-352, 1980. Die Amylaseaktivität der einzelnen Proben wird mit dem α-Amylase EPS®-Kit (Boehringer Mannheim) bestimmt. Zur Erfassung der Immunogenität wird eine gemischte Lymphozyten-Insel-Kultur durchgeführt, siehe Ulrichs K. et al.: Horm. Metbol. Res. 25/S, 123-127, 1990. 100 Schweineinseln werden zusammen mit 10⁵ humanen Lymphozyten drei Tage lang bei 37° kultiviert, anschließend nach Zugabe von 10 µCi ³H-Thymidin kokultiviert man 20 h. lang Inseln und xenogene Lymphozyten. Die Lymphozytenproliferation korreliert mit dem ³H-Thymidin-Einbau und wird mit einem β-Counter als counts per minute (cpm) und unter Berücksichtigung von Kontrollwerten nach Umrechnung als Stimulationsindex ausgedrückt.The number of islands, the island volume, the insulin concentration, the microfluorometric viability test, the glucose-dependent insulin secretion in vitro are determined in the individual samples according to international standards, e.g. B. Ricordi C. et al .: Acta Diabetol.Lat. loc. cit. . The DNA content is determined by the method of Labarca C. and Paigen K., Anal.Biochem .: 102, 344-352, 1980. The amylase activity of the individual samples is determined using the α-amylase EPS® kit (Boehringer Mannheim ) certainly. A mixed lymphocyte-island culture is carried out to determine the immunogenicity, see Ulrichs K. et al .: Horm. Metbol. Res. 25 / S, 123-127, 1990. 100 pork islets are cultured together with 10 ⁵ human lymphocytes for three days at 37 °, then after the addition of 10 μCi ³ H-thymidine they are cultured for 20 hours. long islets and xenogeneic lymphocytes. Lymphocyte proliferation correlates with ³ H-thymidine incorporation and is expressed with a β-counter as counts per minute (cpm) and taking into account control values after conversion as a stimulation index.

Claims (23)

1. Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98%, bezogen auf das Volumen des gereinigten Zellmaterials, gekennzeichnet durch einen erhöhten Reinheitsgrad der Langerhans′schen Inseln verglichen mit Inselsuspensionen nach Anwendung nur einer Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte;
Verlust von weniger als 3% des Inselvolumens;
Durchmesser der Mehrzahl des gereinigten Zellmaterials größer als 100 µm;
Reduktion der Immunogenität um durchschnittlich mehr als 75%;
Reduktion der potentiellen mikrobiologischen Kontamination;
Konstanz der mikrofluorometrischen Viabilitätsindizes;
Erhöhung der Glucose-stimulierten Insulinsekretionsindizes in-vitro um durchschnittlich mehr als 50% sowie
Erhöhung der Wiederfindung des Inselvolumens nach einer oder mehrerer immunmodulierender Behandlungen, jeweils verglichen mit vorgereinigten Inselsuspensionen nach Anwendung einer Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte, aber vor Anwendung einer anschließenden Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser;
und physiologisch annehmbare Trägerflüssigkeit.1. Preparation of isolated Langerhans islands with a degree of purity of more than 98%, based on the volume of the purified cell material, characterized by an increased degree of purity of the Langerhans islands compared to island suspensions after application of only one separation measure, mainly based on different sedimentation from Cell material with different density;
Loss of less than 3% of the island's volume;
Diameter of the majority of the cleaned cell material larger than 100 μm;
Reduction of immunogenicity by an average of more than 75%;
Reduction of potential microbiological contamination;
Constancy of the microfluorometric viability indices;
Increase in glucose-stimulated insulin secretion indices in vitro by an average of more than 50% as well
Increasing the recovery of the island volume after one or more immunomodulating treatments, in each case compared to pre-cleaned island suspensions after application of a separation measure based primarily on different sedimentation of cell material with different density, but before application of a subsequent separation measure mainly based on different sedimentation of cell material with different diameter;
and physiologically acceptable carrier liquid. 2. Zubereitung gemäß Anspruch 1 von isolierten humanen Langerhans′schen Inseln.2. Preparation according to claim 1 of isolated human Langerhans islands. 3. Zubereitung gemäß Anspruch 1 von isolierten tierischen Langerhans′schen Inseln.3. Preparation according to claim 1 of isolated animal Langerhans islands. 4. Zubereitung gemäß Anspruch 3 von isolierten Langerhans′schen Inseln des Schweins.4. Preparation according to claim 3 of isolated Langerhans islands of the pig. 5. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Form einer parenteral injizierbaren Suspension.5. Preparation according to one of claims 1 to 4 in the form of a parenterally injectable Suspension. 6. Zubereitung gemäß Anspruch 5 in Form einer in die Vena portae injizierbaren Suspension.6. Preparation according to claim 5 in the form of an injectable into the vena portae Suspension. 7. Zubereitung gemäß Anspruch 5 in Form einer Vena lienalis, in die Milzpulpa, unter die Nierenkapsel, in eine Omentumtasche, intraperitoneal, intramuskulär, subcutan, intracerebral oder intratesticulär injizierbaren Suspension. 7. Preparation according to claim 5 in the form of a vena lienalis, in the splenic pulp, under the Kidney capsule, in an omentum, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intracerebral or intratesticular injectable suspension.   8. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von isolierten Langerhans′schen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98% des Zellmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) das Pankreas mit einer physiologisch annehmbaren Trägerflüssigkeit, welche gegebenenfalls Collagenase und/oder weiter Proteasen enthält, distendiert und aus dem Gewebeverband Langerhans′sche Inseln mit zusätzlichem Zellmaterial durch Digestion herauslöst,
• b) die herausgelösten Langerhans′schen Inseln vom zusätzlichen Zellmaterial durch mindestens eine Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlichem Durchmesser abtrennt und gewünschtenfalls
• c) die erhältlichen Langerhans′schen Inseln einer ihre potentielle Immunogenität/Antigenität reduzierenden Behandlung unterwirft und/oder die behandelten Inseln konserviert.

8. A process for the preparation of a preparation of isolated Langerhans islands with a degree of purity of more than 98% of the cell material, characterized in that

• a) the pancreas is distended with a physiologically acceptable carrier liquid, which optionally contains collagenase and / or further proteases, and is dissolved out of the Langerhans islets with additional cell material by digestion,
• b) the extracted Langerhans islands from the additional cell material by at least one separation measure based primarily on different sedimentation of cell groups with different diameters and if desired
• c) subject the available Langerhans islands to a treatment that reduces their potential immunogenicity / antigenicity and / or preserve the treated islands.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) das Pankreas mit einer physiologisch annehmbaren Trägerflüssigkeit, welche gegebenenfalls Collagenase enthält, distendiert.

9. The method according to claim 8, characterized in that one

• a) the pancreas is diluted with a physiologically acceptable carrier liquid which may contain collagenase.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) aus dem Gewebeverband des distendierten Pankreas durch enzymatische und gegebenenfalls mechanische Einwirkung Langerhans′schen Inseln mit zusätzlichen zellulären Partikeln herauslöst.

10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that one

• a) from the tissue association of the distended pancreas by enzymatic and, if appropriate, mechanical action, detaches Langerhans islands with additional cellular particles.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) als Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlichem Durchmesser die isokinetische Gradientenzentrifugation anwendet.

11. The method according to any one of claims 8 to 10, characterized in that

• b) uses isokinetic gradient centrifugation as a separation measure based primarily on different sedimentation of cell assemblies with different diameters.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) die isokinetische Gradientenzentrifugation in einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium mit linearem Dichtegradienten durchführt.

12. The method according to claim 11, characterized in that one

• b) the isokinetic gradient centrifugation is carried out in a physiologically acceptable aqueous medium with a linear density gradient.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) die isokinetische Gradientenzentrifugation in einem wäßrigen Medium enthaltend Polysucrose mit einem Molekulargewicht von ca. 400 000 durchführt.

13. The method according to claim 12, characterized in that

• b) the isokinetic gradient centrifugation is carried out in an aqueous medium containing polysucrose with a molecular weight of approximately 400,000.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) ein geeignetes Gefäß mit einer Bodenschicht bestehend aus einem Kolloid und einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium versieht, darauf weiteres Medium, welches in dem eingenommenen Volumen einen kontinuierlichen Gradienten mit einem einem Dichtebereich von ca. 1,005 bis 1,600 g/cm³ und einem Viskositätsbereich von ca. 1,1 bis 15 cP bei ca. 40 bis 37°C aufweist, aufschichtet und die nach Verfahrensschritt a) erhältliche Suspension von Langerhans′schen Inseln mit zusätzlichem Zellmaterial hinzufügt.

14. The method according to any one of claims 8 to 13, characterized in that

• b) a suitable vessel with a bottom layer consisting of a colloid and a physiologically acceptable aqueous medium, then another medium, which in the volume taken up a continuous gradient with a density range of approx. 1.005 to 1.600 g / cm ³ and a viscosity range of 1.1 to 15 cP at about 40 to 37 ° C, layered and adds the suspension of Langerhans' islands available after process step a) with additional cell material.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) die herausgelösten Langerhans′schen Inseln von zusätzlichem Zellmaterial durch aufeinander folgende Trennmaßnahmen basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlicher Dichte und unterschiedlichem Durchmesser abtrennt.

15. The method according to any one of claims 8 to 14, characterized in that

• b) the extracted Langerhans islands of additional cell material by successive separation measures based mainly on different sedimentation from cell assemblies with different densities and different diameters.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) als Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte die isopyknische Gradientenzentrifugation anwendet.

16. The method according to claim 15, characterized in that one

• b) as a separation measure based mainly on different sedimentation of cell material with different density, the isopycnic gradient centrifugation is used.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) die isopyknische Gradientenzentrifugation in einem wäßrigen Medium mit diskontinuierlichem Dichtegradienten durchführt.

17. The method according to claim 16, characterized in that one

• b) the isopycnic gradient centrifugation is carried out in an aqueous medium with a discontinuous density gradient.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man

• b) die isopyknische Gradientenzentrifugation in einem wäßrigen Medium enthaltend Polysucrose mit einem Molekulargewicht von ca. 400 000 und Natriumdiatrizoat durchführt.

18. The method according to claim 17, characterized in that one

• b) the isopycnic gradient centrifugation is carried out in an aqueous medium containing polysucrose with a molecular weight of approximately 400,000 and sodium diatrizoate.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8-18, dadurch gekennzeichnet, daß man

• c) die erhältlichen Langerhans′schen Inseln in ihrer potentiellen Immunogenität/Antigenität durch eine Nachbehandlung aus der Gruppe der üblichen Verfahren bestehend aus Kultivierung, UV-Bestrahlung, Gamma-Bestrahlung, Inkubation mit Antikörpern oder Verkapselung reduziert.

19. The method according to any one of claims 8-18, characterized in that

• c) the available Langerhans islands in their potential immunogenicity / antigenicity reduced by an aftertreatment from the group of conventional methods consisting of cultivation, UV radiation, gamma radiation, incubation with antibodies or encapsulation.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8-19, dadurch gekennzeichnet, daß man

• c) die erhältlichen Langerhans′schen Inseln durch Kryopräservierung konserviert.

20. The method according to any one of claims 8-19, characterized in that

• c) the available Langerhans islands are preserved by cryopreservation.

21. Die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8 erhältlichen Langerhans′schen Inseln.21. The Langerhans islands available according to the method of claim 8. 22. Zubereitung gemäß Anspruch 1 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung am menschlichen oder tierischen Körper.22. Preparation according to claim 1 for diagnostic and / or therapeutic Use on the human or animal body. 23. Zubereitung gemäß Anspruch 1 zur Behandlung des Diabetes mellitus am Menschen.23. Preparation according to claim 1 for the treatment of diabetes mellitus in humans.