DE4217353A1 - Verfahren zur säulenchromatographischen Trennung von Proteinen mittels Lipidbilayer-beschichteter Silicagele - Google Patents
Verfahren zur säulenchromatographischen Trennung von Proteinen mittels Lipidbilayer-beschichteter SilicageleInfo
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Description
Die Säulenchromatographie ist ein grundlegendes Verfahren der Biochemie zur
Trennung von Proteinen und Peptiden entsprechend ihrer Größe bzw. ihres
Molekulargewichts (sogenannte Gelfiltration) oder entsprechend ihres elektrischen
Ladungszustandes (sogenannte Ionenaustausch-Chromatographie).
Bei der Gelfiltration wird eine Chromatographiesäule mit einem in Wasser
quellenden Polymer oder mit einem Silicagel (Kugeln aus Siliziumdioxid mit Poren
auf der Kugeloberfläche) gefüllt und das zu trennende Proteingemisch wird (in Puffer
gelöst) von oben auf die Säule gegeben. Danach wird der Säule von oben
kontinuierlich Pufferlösung zugeführt und das Proteingemisch wird langsam durch
die Säule zum Säulenausgang gespült. Auf dem Weg durch die Säule werden
kleinere Proteine verlangsamt, da sie stärker (d. h. länger) mit dem Chroma
tographiematerial wechselwirken. Auf diese Weise kann man am Säulenausgang mit
einem Fraktionensammler die einzelnen Proteinfraktionen, entsprechend ihrer Größe
geordnet, sammeln (sh. z. B. Cooper, T.G. "Biochemische Arbeitsmethoden" Kapitel
5 pp 157. Verlag de Gruyter, Berlin, New York, 1981).
Die Ionenaustausch-Chromatographie ist im grundsätzlichen Aufbau der Gelfiltration
ähnlich. Im Unterschied verwendet sie jedoch Chromatographiegele mit kovalent
gebundenen, elektrisch geladenen Gruppen. Diese Gele binden Proteine mit der
entsprechenden Gegenladung und lassen andere Proteine (Proteine mit gleicher
Ladung wie das Gel oder elektrisch neutrale Proteine) ungehindert oder sogar
beschleunigt (infolge elektrostatischer Abstoßung) die Säule passieren. Nachdem die
nichtgebundenen Proteine aus der Säule gespült worden sind, gibt man eine
Pufferlösung über die Säule, die eine hohe Konzentration von zum Gel entgegen
gesetzt geladenen Ionen enthält. Diese verdrängen die Proteine von ihren Bindungs
stellen im Gel und ermöglichen damit ein Sammeln dieser Proteine am Säulen
ausgang. In bestimmten Fällen werden zum Abtrennen der Proteine auch
Detergenzlösungen verwendet. Das Resultat des Verfahrens sind entsprechend ihrer
Ladung getrennte Proteinfraktionen (sh. z. B. Cooper, T.G. "Biochemische
Arbeitsmethoden" Kapitel 4 pp 126. Verlag de Gruyter, Berlin, New York, 1981).
Ein Problem bei beiden Arten von Chromatographie kann die Denaturierung
empfindlicher Proteine während des Chromatographielaufes sein. Derartige Prozes
se geschehen u. a. bei Kontakt zwischen den Proteinen und anorganischen Substan
zen. Dies kann insbesondere bei Silicagelen zu einem beträchtlichen Verlust an
Proteinaktivität führen. Um dies zu verhindern, werden Silicagele mit verschiedenen
organischen (z. B. polymeren) Beschichtungen (Coatings) angeboten. Ziel ist hierbei,
eine Oberfläche durch das Coating so zu gestalten, daß das mit ihr wechselwirkende
Protein sie als natürliche Umgebung "empfindet" (biokompatible Oberfläche). Bei
spiele hierfür ist die Bindung von Dextranmolekülen auf der Oberfläche von Latex
gelen oder die kovalente Bindung einer Monoschicht von Phospholipiden (dem
Hauptbestandteil biologischer Membranen) auf der Oberfläche von Silicagelen
(immobilisierte Membran). Diese Verfahren sind technisch aufwendig und somit sind
derartige Chromatographiegele relativ teuer.
Bei der Ionenaustausch-Chromatographie kommt noch ein Problem hinzu: Das
Abtrennen der durch Ladungswechselwirkung an das Chromatographiegel gebun
denen Proteine durch eine Pufferlösung hoher Ionenstärke oder Detergenzien kann
zu einem Ausfällen der Proteine (und damit zur Denaturierung) führen.
Das vorgeschlagene neue Verfahren reduziert den technischen Aufwand zur Bio
kompatibilisierung von Silicagelen beträchtlich und soll darüber hinaus neue Mög
lichkeiten zum Abtrennen der Proteine vom Gel ohne Gefahr ihrer Denaturierung
eröffnen.
Das neue Verfahren baut auf dem bereits vorhandenen Kenntnisstand der Säulen
chromatographie (Gelfiltration, Ionen-Austausch-Chromatographie) auf. Auch für das
neue Verfahren werden Kugeln aus einem amorphen Festkörper (z. B. Glas oder
amorpher Quartz) mit kolloiden Dimensionen (Kugeldurchmesser im Bereich nm-µm)
in einer Chromatographiesäule dicht gepackt. Der wesentliche Unterschied zu allen
bisherigen Verfahren besteht nun darin, daß jede dieser Kugeln an ihrer Oberfläche
vollständig mit einer ca. 50-60 Å dicken Doppelschicht aus Lipiden (die sogenannte
Lipiddoppelschicht oder Lipidbilayer) beschichtet ist. Zwischen der Lipiddoppel
schicht und der Kugeloberfläche existiert außerdem noch eine 10-20 Å dicke
Wasserschicht (sh. Abb. 1). Die Lipide selbst können je nach den Anfor
derungen des Chromatographie-Experimentes entweder natürliche, aus Gewebe
extrahierte Lipidspezies sein oder auf synthetischem Weg erzeugt worden sein. Die
Präparationsmethode zur Erzeugung derartig beschichteter Kugeln wurde von einem
der Anmelder dieses Patentes entwickelt und ist veröffentlicht worden (T. M. Bayerl
+ M. Bloom, 1990, "Physical properties of single phospholipid bilayers adsorbed to
micro glass beads", Biophysical Journal 58: 357-362 Rockefeller Press, New York).
Der Anmelder konnte in derselben Veröffentlichung zeigen, daß ein derartig präpa
riertes Kugelsystem mit einem adsorbierten Lipidbilayer über einen Zeitraum von
Wochen stabil ist und die Lipiddoppelschicht auch durch hydrodynamische Kräfte
und mechanische Einwirkung (wie sie z. B. beim Waschen einer solchen Probe im
strömenden Medium oder bei Zentrifugation im wäßrigen Medium entstehen) nicht
von den Kugeln abgelöst wird.
Die Vorteile der Verwendung solcher mit einem Lipidbilayer beschichteter Silicagele
für säulenchromatographische Zwecke sind wie folgt:
- 1) Durch die vollständige Abschirmung der Silicaoberfläche durch den Lipidbilayer wird ein Kontakt der zu trennenden Proteine mit dem Silica unterbunden. Damit wird die möglicherweise bei einem solchen Kontakt stattfindende Denaturierung eines Teiles der Proteine vermieden, denn die Proteine können nun nur mit der hydro philen Lipidoberfläche in Wechselwirkung treten. Da Lipide biologische, amphiphile Moleküle sind (wie sie auch in jeder Zellmembran zu finden sind) und ein Lipidbilayer weiterhin ein extrem weiches Material ("soft surface") darstellt, findet an solchen Oberflächen praktisch keine Proteindenaturierung statt. Durch den Lipidbilayer ist die Kugel mit einer sogenannten "biokompatiblen Oberfläche" versehen. Damit läßt sich die Ausbeute eines Chromatographielaufes bezüglich Proteinaktivität beträchtlich steigern und die Trennung von sehr empfindlichen, bisher als schwer trennbar erachteten Proteinen, erscheint möglich (sh. Beispiel 1).
- 2) Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist die gezielte Ausnutzung elektrostatischer
Oberflächenladungseffekte zur ladungsselektiven Trennung von Proteinen. Obwohl
das in eukariotischen Zellen am häufigsten vorkommende Phospholipid, das Lezithin
(Phosphatidylcholin), über einen weiten pH Bereich nach außen elektrisch neutral ist,
existieren eine Vielzahl anderer Lipide, die bei neutralem pH Wert eine negative
Überschußladung aufweisen (z. B. Phosphatidylserine, Phosphatidylglycerole,
Cardiolipin). Durch gezielte Beimischung solcher Lipide zur Beschichtung der
Silicagele läßt sich somit eine definierte negative Oberflächenladung auf dem die
Kugel umgebenden Lipidbilayer erzeugen. Dadurch werden Proteine mit positiver
Überschußladung auf ihrem Weg durch die Säule infolge anziehender Coulomb
Wechselwirkung mit dem Lipidbilayer verzögert bzw. gebunden (ohne dabei zu
denaturieren, sh. 1), negativ geladene Proteine hingegen werden beschleunigt.
Durch Einsatz von Amphiphilen mit positiver Überschußladung kann auch eine positive Oberflächenladung des Lipidbilayers erzeugt werden, falls das zu trennende Gemisch dies erfordert.
Damit gestattet das neue Chromatographieverfahren die Durchführung von Ionen- Austausch-Chromatographie (sh. Beispiel 2). - 3) Ein wesentlicher Vorteil liegt in der Verwendung eines Lipidbilayers (anstelle der bisher verwendeten immobilisierten Membran = Lipidmonoschicht) zur Beschichtung der Kugeln begründet. Die vom Antragsteller entwickelte Präparationsmethode (wird im Beispiel unten erläutert) erlaubt eine Beschichtung der Kugeln in der Chromatographiesäule unmittelbar vor dem Aufbringen der zu trennenden Proteinmischung. Dieses Verfahren ist damit äußerst vielseitig und kostengünstig, da nur Kugeln der gewünschten Größe (die problemlos über Jahre gelagert werden können) in die Säule gepackt werden und dann erst die Beschichtung mit dem Lipidbilayer vorgenommen wird. Auch können Veränderungen in der Lipidzusammensetzung der Kugeloberflächen (und damit Veränderungen der Oberflächenladung der die Kugeln umgebenden Lipidbilayer) ohne Entfernen der Kugeln aus der Säule vorgenommen werden (sh. Beispiel). Damit ist das vorgeschlagene Verfahren gegenüber der immobilisierten Membran (kovalent an die Geloberfläche gebundene Lipidmonoschicht) weit überlegen, da letztere nur mit hohen technischen Aufwand und keinesfalls in der Säule selbst erzeugt werden kann.
- 4) Schließlich kann ein solches Lipidbilayer - beschichtetes Silicagel zur ladungs empfindlichen Trennung von Proteinen unter Ausnutzung des Mischungsverhaltens binärer Lipidgemische angewandt werden. Reine synthetische Lipide (i.a. Lipide mit gesättigten Fettsäureketten) weisen einen scharfen, reversiblen Phasenübergang 1. Ordnung zwischen kristalliner und flüssig - kristalliner Struktur des Lipidbilayers auf (sh z. B. Sackmann, E."Polymorphism of Lipid/water Systems" in "Biophysics" (Hoppe, W., Lohmann, W., Markl, H., Ziegler, H., eds) pp. 425. Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1983). Durch Mischung von 2 Lipiden (eines davon elektrisch neutral, das andere negativ geladen), von denen mindestens eines gesättigt ist und über eine Phasenübergangstemperatur (PÜT) verfügt, die in einem für die zu eluierenden Proteine verträglichen Bereich liegt (z. B. zwischen 0-8°C), können nun durch Veränderung der Temperatur Ladungsmuster auf der Oberfläche des die Kugeln umgebenden Lipidbilayer erzeugt werden (sh z. B. Sackmann, E."Charge induced changes in the microstructure of membranes" in "Biophysics" (Hoppe, W., Lohmann, W., Markl, H., Ziegler, H., eds) pp. 438-444. Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1983). In der kristallinen Phase (Temperatur < PÜT) kann unter geeigneten Bedingungen eine quasi-zweidimensionale Domänenbildung im Lipidbilayer (Domänengröße im nm bis µm Bereich) stattfinden, die durch unterschiedlich hohe Anteile an negativ geladenen Lipid gekennzeichnet ist.
Kristalline Bereiche mit hoher negativer Oberflächenladung können dann in eine
fluide Matrix mit geringer negativer Oberflächenladung eingebettet sein. Positiv
geladene Proteine werden unter diesen Bedingungen mit hoher Bindungskraft
(Coulomb Wechselwirkung) an die kristallinen Bereiche gebunden. Wird nun die
Temperatur erhöht (Temperatur der Säule < PÜT) wird die Domänenstruktur
aufgelöst (durch Schmelzen der kristallinen Bereiche) und die negativ geladene
Lipidkomponente verteilt sich gleichmäßig (durch laterale Diffusion) über den
gesamten Lipidbilayer. Damit sinkt die Bindungskraft zwischen Protein und
Oberfläche drastisch und das zuvor gebundene Protein kann sich vom Lipidbilayer
lösen (sh. Anwendungsbeispiel 3).
Im folgenden sollen die Vorteile des Verfahrens in drei Beispielen dargestellt werden.
Eine Chromatographiesäule wird mit kommerziell erhältlichen Silicagel (Kugeln aus
Siliziumdioxid (Durchmesser 3 µm), die mit Poren auf der Oberfläche
(Porendurchmesser 100 nm) versehen sind) gepackt und Puffermedium (der pH
Wert kann zwischen pH 3-9, je nach den Elutionsbedingungen, frei gewählt werden)
wird aufgefüllt.
Als Lipid zur Beschichtung wird ein natürlich vorkommendes Phosphatidylcholin, das
sogenannte Lecithin, verwendet. Das lyophilisierte Lipidpulver wird in 10 ml Puffer
medium gelöst und (bei Zimmertemperatur) 15 min unter leichtem Schütteln
inkubiert. Anschließend wird die Lösung in einem Ultraschall-Disintegrator für 10-15
min bei hoher Leistung beschallt, bis die zuvor milchige Lipidlösung klar geworden
ist. Die Lipidmenge ist so berechnet, daß die von den Lipiden in einer Doppel
schichtanordnung zu bedeckende Fläche etwa der doppelten Oberfläche der
Silicakugeln (einschließlich Porenoberfläche) entspricht (Oberflächenbedarf eines
Lezithinmoleküls ca. 80 Å2). Die durch Ultrabeschallung erzeugten kleinen
unilamellaren Lezithinvesikel (Durchmesser 40-100 nm) werden nun auf die Säule
gegeben und langsam eluiert. Dabei fusionieren die Vesikel auf der Oberfläche der
Silicakugeln (und in den Poren) und bilden einen abgeschlossenen, stabilen
Lipidbilayer auf der Oberfläche aus. Überschüssige Vesikel , die keine freien Plätze
zur Fusion auf der Kugeloberfläche finden, werden eluiert. Nach Spülen der Säule
mit Puffer ist diese für die Filtration bereit.
Alternativ kann die Beschichtung der Kugeln auch außerhalb der Säule (vor dem
Packen) durchgeführt werden. Hierzu wird die Lezithinvesikellösung mit den Kugeln
(Silicagel) im Puffermedium unter leichten Schütteln für ca. 1 min. gemischt. Mittels
einer Tischzentrifuge wird das Säulenmaterial dann ca. 5 mal gewaschen (d. h.
Dispersion der beschichteten Kugeln in einem größeren Volumen von Puffer,
Zentrifugation der Dispersion und Absaugen des, die überschüssigen Vesikel
enthaltenden, Überstandes) und kann dann in der Säule gepackt werden.
Das zu trennende Gemisch von Proteinen wird (im Elutionspuffer gelöst) auf die
Säule gegeben. Auf dem Weg durch die Säule werden nun die kleinen Proteine des
Gemisches (durch Wechselwirkung mit den Poren) verzögert. Die Lezithin
bilayerschicht verhindert dabei eine mögliche Denaturierung der Proteine. Die
einzelnen Fraktionen unterschiedlicher Größe (Molekulargewicht) werden am
Ausgang der Säule mit einem Fraktionssammler getrennt aufgefangen.
Präparation der Säule wie in Beispiel 1 beschrieben, allerdings wird statt reinem
Lezithin nun ein binäres Lipidgemisch von Lezithin und Phosphatidylserin (molares
Mischungsverhältnis 4 : 1) verwendet. Da Phosphatidylserin bei neutralem pH Wert
eine negative Überschußladung trägt, wird die gesamte, das Kugelmaterial bedec
kende Lipiddoppelschicht nun mit einer negativen Oberflächenladung versehen. Da
Phosphatidylserin insbesondere stark gekrümmte Lipiddoppelschichtbereiche bevor
zugt, wird es sich in den Poren der Kugel anreichern und dort ein besonders starkes
elektrisch negatives Oberflächenpotential bewirken.
Eine weitere Methode der Säulenpräparation ist möglich, falls eine mit reinen
Lezithindoppelschichten präparierte Säule bereits vorhanden ist und nicht neu
gepackt werden soll. In diesem Fall werden durch Beschallung mit Ultraschall (sh.
Beispiel 1) unilamellare Vesikel aus Phosphatidylserin hergestellt und auf die Säule
gegeben und langsam eluiert. Auf dem Weg durch die Säule tauschen die negativ
geladenen Phosphatidylserin-Vesikel Lipide mit dem aus dem Kugelmaterial
adsorbierten Lipidbilayer (Lezithin) aus. Dadurch erhält der Lipidbilayer auf dem
Kugelmaterial eine negative Oberflächenladung. Nach Spülung der Säule zur
Entfernung der Austauschvesikel ist diese für die Chromatographie bereit.
Das zu trennende Proteingemisch wird auf die Säule gegeben und unter neutralen
pH Bedingungen (und relativ niedriger Ionenstärke) eluiert. Auf dem Weg durch die
Säule werden elektrisch positiv geladene Proteine durch Coulomb Wechselwirkung
in den Poren oder auf der Kugeloberfläche gebunden, negativ oder neutral geladene
Proteine passieren die Säule beschleunigt (repulsive Coulomb Wechselwirkung)
oder unbeeinflußt. Der Lipidbilayer verhindert eine Denaturierung der gebundenen
Proteine. Nachdem die negativ oder neutral geladenen Bestandteile des Gemisches
die Säule verlassen haben, wird diese mit einem Puffer hoher Ionenstärke (z. B. 200
mM NaCl) gespült. Alternativ können Detergenzlösungen niedriger Konzentration
verwendet werden. Die Ionen verdrängen hierbei die elektrostatisch gebundenen
Proteine von den Oberflächen und die Proteine können im Fraktionssammler am
Säulenausgang aufgefangen werden. Damit wurden positiv geladene Proteine aus
dem Gemisch ohne Gefahr einer Denaturierung (und damit höchstmöglicher Protein
aktivität) abgetrennt.
Es werden Kugeln aus Siliziumdioxid mit glatter Oberfläche (ohne Poren) zum
Packen der Säule verwendet. Der Lipidbilayer wird, wie in Beispiel 1 beschrieben,
auf der Oberfläche der Kugeln adsorbiert. Als Lipidmischung wird ein binäres
Gemisch aus 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-glycero-phosphocholine (POPC) mit 20 mol-%
1,2-dimyristoyl-sn-3-glycero-phosphatidylglycerol (DMPG) verwendet. Diese
Mischung hat einen Phasenübergang bei einer Temperatur (PÜT) von ca. 4°C.
Das zu eluierende Proteingemisch (mit Proteinen gegensätzlicher elektrischer
Überschußladung) wird bei einer Säulentemperatur von 1°C auf die Säule gegeben.
Bei dieser Temperatur sind kristalline Domänen mit einem hohen Anteil von negativ
geladenen DMPG im Lipidbilayer vorhanden. Während der Elution werden positiv
geladenen Proteine (und von dienen bevorzugt jene mit der höchsten Über
schußladung) an den Lipidbilayer gebunden. Nachdem negativ geladene und
elektrisch neutrale Proteine die Säule verlassen haben, wird die Säulentemperatur
auf 8°C erhöht, die gebundenen Proteine lösen sich von der Oberfläche (infolge der
Auflösung der kristallinen Domänen) und können eluiert werden.
Claims (7)
1. Verfahren zur säulenchromatographischen Trennung von Proteinen mittels
Lipidbilayer-beschichteter Silicagele, dadurch gekennzeichnet, daß reine
Silicagele mit einer Doppelschicht aus Lipiden (Lipiddoppelschicht, Lipid
bilayer) beschichtet werden und daß das erhaltene Chromatographiegel mit
biokompatibler Oberfläche zur Säulenchromatographie verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen der
Doppelschicht aus Lipiden auf das Silicagel durch die spontane Adsorption
und Fusion sehr kleiner unilamellarer Vesikel auf der Silicaoberfläche erfolgt.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Klasse der Phospholipide und insbesondere das Phosphatidylcholin zur Be
schichtung verwendet werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß Lipide
mit negativer elektrischer Ladung der Kopfgruppe oder amphiphile Moleküle
mit positiver oder negativer elektrischer Ladung zur Modifikation der Ober
flächenladung der beschichteten Gele verwendet werden.
5. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet,
daß das Mischungsverhalten einer zwei - oder mehrkomponentigen
Lipidmischung, welche zur Beschichtung verwendet wurde, zur Erzeugung
von Ladungsmustern auf der Oberfläche der Silicagele angewandt wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
amphiphile Moleküle, die spezifische funktionelle Gruppen im hydrophilen
Bereich besitzen, in die zur Beschichtung des Silicagels verwendete Doppel
schicht aus Lipiden inkorporiert oder interkaliert werden, um spezifische
Bindungen zwischen dem Silicagel und einem oder mehreren Proteinen zu
ermöglichen.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silicagel durch
ein anderes, für die Beschichtung mit einer Doppelschicht aus Lipiden
geeignetes, Chromatographiematerial ersetzt wird.
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Legal Events
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8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: BAYERL, SIBILLE, DR., 97074 WUERZBURG, DE BAYERL, |
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8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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Owner name: NIMBUS BIOTECHNOLOGIE GMBH, 04299 LEIPZIG, DE |
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Free format text: BAYERL, SYBILLE, DR., 97074 WUERZBURG, DE BAYERL, THOMAS, PROF. DR., 97074 WUERZBURG, DE |
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