DE4206585A1 - Vorrichtung zur behandlung von zellkulturen - Google Patents
Vorrichtung zur behandlung von zellkulturenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Behandlung
von Zellkulturen, insbesondere von Leberzellen (Hepa
tozyten), auf plattenartigen Zellkulturträgern.
In der Medizin und in der Pharmazie ist es oft erfor
derlich, Versuche mit Zellkulturen durchzuführen. Dies
gilt z. B. zu deren Zucht, zu deren Beobachtung, deren
Reaktion auf Fremd- und/oder Giftstoffe, zur Konser
vierung und dergleichen.
Darüber hinaus wird die Suche nach geeigneten Organer
satzen immer wichtiger.
Eines der Hauptgebiete sind Versuche bezüglich Stoff
wechselfunktionen, insbesondere der Leber.
Die Komplexität der vielfältigen hepatozellulären
Stoffwechselfunktionen stellt jedoch hohe Anforderun
gen an einen künstlichen Organersatz für die Leber.
Bei der künstlichen Niere stehen Filtrations- und
Stoffaustauschaufgaben im Vordergrund, die durch ein
Gerät im Sinne einer Dialyse erfüllt werden können.
Ähnlich wird bei einem künstlichen Herzen vor allem
die Pumpfunktion durch eine Maschine ersetzt. Die Le
ber hingegen besitzt eine Vielzahl von Einzelfunktio
nen, die sich grob in Kategorien wie Entgiftungsfunk
tion, Proteinsekretion, endokrine Aufgaben, Speicher
funktion, Phagozytose, Fett- und Kohlenhydratstoff
wechselaufgaben untergliedern lassen.
Bei bekannten Kultursystemen verlieren die Leberzel
len, nämlich die Hepatozyten, schon innerhalb der er
sten Tage nach Isolation ihre Funktionsfähigkeit. So
sind bereits nach 2 bis 3 Tagen, je nach untersuchter
Funktion, nur noch ca. 80% und nach 1 Woche nur noch
minimale Restfunktionen erhalten. Danach kommt es zum
Zelltod und zum Überwuchern mit fibroblastenartigen
Zellen. Bisherige Experimente mit Leberzellkulturen
mußten in einer Phase mit fortschreitendem Zellverfall
durchgeführt werden.
Zum Erhalt der hepatozytären Funktion in Kultur wurde
z. B. schon vorgeschlagen, die epitheliale Kokultur,
die Hinzufügung von Dimethylsulfoxid (DMSO) zum Me
dium, oder die Verwendung einer komplexen Matrix (Ma
trigel) zu praktizieren. Ist das Ziel jedoch die Ver
wendung einer Leberzellkultur, die der "in vivo"-Si
tuation möglichst nahe kommen soll, so entstehen durch
diese herkömmlichen Kulturtechniken eine Reihe von
Problemen. So ist DMSO eine chemische Substanz, die
auch hepatotoxische Wirkung besitzt. Epitheliale Ko
kulturen sind transformierte Zellinien und haben onko
genen Charakter. Rückschlüsse auf das Verhalten natür
licher volldifferenzierter Zellen sind daher nicht
zweifelsfrei möglich. Matrigel ist wiederum von Sar
komzellinien abgeleitet (Engelbrecht Holm Sarkom) und
in seinen Komponenten nicht charakterisiert. Ein kli
nischer Einsatz onkogener Zellen oder deren nicht nä
her definierter Produkte ist daher nicht erstrebens
wert.
Es wurde auch bereits ein System vorgeschlagen, wobei
dieses im allgemeinen aus einem Hepatozytenmonolayer
unter Anhaftung auf einer Seite an Glas, Kunststoff
oder proteinhaltiger extrazellulärer Matrix als Zell
kulturträger besteht.
Bekannt ist auch ein sogenanntes Sandwichkultursystem,
das einen Matrix-Hepatozyt-Matrix-Aufbau besitzt. Die
ses System benötigt jedoch zur Realisierung eine Flä
che als Unterlage, die zum Auftragen der zweiten obe
ren Schicht zugänglich sein muß. Vorrichtungen auf der
Basis von Hohlfasern (hollow fibers) oder microcar
riers ermöglichen zwar theoretisch eine Massenkultur,
werden jedoch immer mit herkömmlichen Kulturkonfigura
tionen verwendet. Dies bedingt einen raschen Funk
tionsverlust der Hepatozyten, wobei zusätzlich signi
fikante Oxygenationsprobleme entstehen. Ein Sandwich
kultursystem ist auf diese Weise nicht realisierbar,
da es zu Verklebungen kommen würde.
Ein weiterer Nachteil der bekannten Kulturen, insbe
sondere der Sandwichkulturen, besteht darin, daß die
Sauerstoffversorgung der Zellen nur unzureichend ge
löst werden konnte. Bereichsweise kam es zu einer Un
terversorgung, wohingegen in anderen Bereichen es bei
einer Erhöhung der Perfusionsgeschwindigkeit des Kul
turmediums zu unerwünschten Erhöhungen von Scherkräf
ten kam.
Um derartige Oxygenationsprobleme von Zellkulturen,
insbesondere von Hepatozyten in Kultur, zu umgehen,
sind auch bereits gaspermeable Membranen vorgeschlagen
worden. Dabei werden die Zellen, die auf der einen
Seite der Membrane liegen, entweder durch transmembra
nären Luftkontakt oder über mit Sauerstoff angerei
chertem Medium, das an der gegenüberliegenden Seite
vorbeiströmt, versorgt. Derartige Einzelmembranen sind
jedoch nur für Laborzwecke bzw. nur für geringe Mengen
und Größen geeignet.
Ein weiterer Hauptnachteil der bekannten Verfahren und
Konstruktionen liegt in den Raumproblemen, d. h. deren
großer Platzbedarf. So erfordert z. B. die Beseitigung
der Oxygenations- und Nährstoffversorgungsprobleme
aufwendige getrennte Pumpenkreisläufe, was zu einer
enormen Vergrößerung des Aggregats im Verhältnis zur
tatsächlich kultivierten Zellzahl führt. Eine Massen
kultur ist auf diese Weise nicht möglich, da ein Ge
samtorganersatz, z. B. einer menschlichen Leber, mit
einer derartigen Technik den Platzbedarf eines ganzen
Hauses besitzen würde.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu
grunde, eine Vorrichtung der eingangs erwähnten Art zu
schaffen, mit der eine Massenkultur unter sinnvollen
räumlichen Verhältnissen und in einem Zustand möglich
ist, der soweit wie möglich an einen "in vivo"-Zustand
herankommt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß
wenigstens ein Teil der Oberflächen der Zellkulturträ
ger gasdurchlässig ist, wobei in das Innere der Zell
kulturträger Sauerstoff einleitbar ist, daß auf dem
Zellkulturträger eine Kollagenschicht aufgetragen ist,
auf der oder in der die Zellkultur angeordnet ist, und
daß mit geringem Abstand über der Kollagenschicht der
nächste Zellkulturträger angeordnet ist, wobei in den
Zwischenraum zwischen der Kollagenschicht und dem
nächsten Zellkulturträger Kulturmedium einleitbar ist.
Das erfindungsgemäße Bauprinzip in Form eines Bioreak
tors ermöglicht es, auf engstem Raum eine Anordnung
zur Behandlung von Zellkulturen zu schaffen, mit dem
eine im Vergleich zu den bekannten Lösungen wesentlich
höhere Anzahl von Zellen kultiviert werden kann. Durch
die erfindungsgemäße Ausgestaltung der Zellkulturträ
ger ist auch eine ausreichende und im wesentlichen
überall gleichmäßige Sauerstoffversorgung der Zellkul
tur geschaffen.
Das erfindungsgemäße Bauprinzip des Bioreaktors imi
tiert die mikroanatomische und funktionelle Einheit
des Leberparenchyms, den Leberlobulus. Dies ermöglicht
bei getrennter arterieller und portalvenös-venöser
Phase gleichzeitig mehrere wesentliche Vorteile gegen
über bekannten Anlagen und Verfahren. So ist z. B. eine
optimale, da unmittelbare, genau dosierbare und
gleichmäßig verteilte Versorgung der Hepatozyten mit
Sauerstoff möglich. Weiterhin kann die Gesamtzellzahl
beliebig hoch den jeweiligen Bedürfnissen angepaßt
werden (Massenkultur). Das Totvolumen des Bioreaktors
kann minimal gehalten werden.
Wenn in einer sehr vorteilhaften Weiterbildung der Er
findung vorgesehen ist, daß die Zellkultur auf einer
ersten Kollagenschicht angeordnet ist, und daß über
der Zellkultur eine zweite, obere Kollagenschicht
liegt, dann sind die Hepatozyten in einem Kollagen
sandwich immobilisiert, wodurch eine noch bessere "in
vivo"-artige Morphologie und Funktion der Zellen er
möglicht wird.
Eine weitere sehr vorteilhafte Weiterbildung der Er
findung besteht darin, daß aufgrund der erfindungsge
mäßen Ausgestaltung des Bioreaktors es auch möglich
ist, neben der ersten Zellkultur noch eine zweite
Zellkultur zu behandeln, z. B. nichtparenchymale Zel
len. Auf diese Weise ist eine Kokultivierung in geord
neten dreidimensionalen Strukturen ermöglicht, wie
z. B. Sinusoid-Matrix-Hepatozyt-Matrix-nichtparenchyma
le Zelle-Sinusoid . . . Dabei stellt das erste Sinusoid
den Sauerstoffzufuhrraum in dem Zellkulturträger dar,
während das zweite Sinusoid durch den Spaltraum zwi
schen der oberen Kollagenschicht und dem nächsten
Zellkulturträger bzw. der nächsten Zellkulturschicht
gebildet ist.
Wird der erfindungsgemäße Bioreaktor z. B. für die Kul
tivierung von Hepatozyten verwendet, so stellt der
Zellkulturträger einen Querschnitt durch einen Leber
lobulus dar. Die Leberzellen (Hepatozyten) sind in
konfluierenden Schichten innerhalb der Kollagenmatrix,
bestehend aus unterer und oberer Kollagenschicht, ana
log dem Disseschen Spaltraum verankert. Oberhalb und
unterhalb der stapelbaren Zellschichten befinden sich
kapillare Zwischenräume, die den Sinusoiden entspre
chen. Diese transportieren portalvenöses Nährmedium
als Kulturmedium und, in einer getrennten arteriellen
Phase, Sauerstoff durch das Innere der Zellkulturträ
ger herbei. Die Versorgung erfolgt über an der Peri
pherie des Zellkulturträgers gelegene Portalfelder.
Sauerstoff tritt auch in die portalvenöse Phase über
und strömt mit dieser in die venöse Phase, die durch
den Spaltraum gebildet wird. Analog der Zentralvene
wird hier von allen Zellkulturträgern, die die Lobuli
imitieren, bzw. Spalträumen das Nährmedium gesammelt
und abgeführt.
Das Nährmedium von allen Spalträumen kann dann in ei
nem Reservoir gesammelt und über eine Pumpe z. B. eine
peristaltische Pumpe im Kreislauf zum Bioreaktor zu
rückgeführt werden. Durch eine dazwischen geschaltete
Filtereinrichtung können gegebenenfalls Stoffe aus dem
Kreislauf ausgeschieden werden. Dies gilt z. B. für
Gallenflüssigkeit, sofern man nicht in einfacher Weise
das Kulturmedium zwischendurch auswechselt.
Die Zellkulturträger können aus verschiedenen Materia
lien hergestellt werden. Wesentlich ist lediglich, daß
sie bilaminär sind, d. h. daß wenigstens ihre großen,
sich gegenüberliegenden Oberflächen gasdurchlässig,
jedoch nicht flüssigkeitsdurchlässig sind. Im Bedarfs
falle können die Oberflächen jedoch auch semipermeabel
bzw. flüssigkeitsdurchlässig sein. In einem derartigen
Falle kann gegebenenfalls ein Stoffaustausch durch die
Zellkulturträger erfolgen.
In einer einfachen Ausgestaltung kann dabei vorgesehen
sein, daß der Zellkulturträger aus einem oberen und
einem unteren Sintermetallband gebildet ist, die durch
Abstandshalter voneinander getrennt sind. Zwischen die
beiden Bänder wird dann Sauerstoff bzw. Luft mit Koh
lendioxyd eingebracht. Je nach Anzahl und Art der
Zellkulturträger kann dabei normaler atmospärischer
Druck oder ein geringer Überdruck ausreichend sein,
damit erreicht wird, daß Sauerstoff durch die gas
durchlässige Schicht diffundiert, und damit in die an
liegende Kollagenschicht gelangt.
Derartige Zellkulturträger besitzen eine hohe mechani
sche Stabilität.
Anstelle von Sintermetall sind als Zellkulturträgerma
terial auch Kunststoffe geeignet, die entsprechend
gasdurchlässig sind. Hierfür sind z. B. Polypropylen-
und Silikonfolien geeignet, welche den zusätzlichen
Vorteil besitzen, daß sie lichtdurchlässig sind. Auf
diese Weise ist eine lichtmikroskopische Beobachtung
der Zellen möglich.
Die erfindungsgemäße Ausgestaltung des Bioreaktors ge
währleistet eine weitgehend uniforme Verteilung der
Sauerstoffversorgung, da jede Zelle ihren eigenen Sau
erstoffplatz hat. Die Sauerstoffversorgung ist zudem
über die Zufuhr exakt den Bedürfnissen angepaßt do
sierbar und unabhängig von internen strömungstechni
schen Verhältnissen.
Durch Übereinanderschichtung einer beliebigen Anzahl
Zellkulturträger über eine gemeinsame Sauerstoffzufüh
rung kann die erforderliche Gesamtzellzahl recht ein
fach beliebig hoch den Bedürfnissen angepaßt werden
(Modultechnik). Die das Kulturmedium führenden Spalt
räume werden über Dichtungsringe von den Zellkultur
trägern und deren Sauerstoffzufuhr getrennt.
Die Bedeutung dieser unmittelbaren Oxygenierung mit
tels bilaminärer Membranen und deren Stapelungsmodus
wird klar, wenn man bedenkt, daß so erstmals auch gro
ße Zellaggregate in dreidimensionalen Strukturen auf
engstem Raum gleichmäßig mit Sauerstoff versorgt wer
den können. Die Abstände der Platten werden über die
Dichtungsringe, z. B. elastische Silikondichtungsringe,
die zugleich als Abstandshalter, wie auch als Trenn
mittel zwischen der Flüssigkeitsphase (venös) und Gas
phase (arteriell) wirken, reguliert. Durch Wahl der
Größe bzw. der Durchmesser der Dichtungsringe sind die
Abstände zwischen den Platten beliebig regulierbar. Im
Bedarfsfalle kann nur ein kapillarer Spalt zwischen
den Platten verbleiben und es entsteht damit ein "Si
nusoid". Ein weiterer Vorteil hierbei ist, daß die Ab
stände somit unter Einsparung von Totvolumen minimiert
werden können.
Statt einer Herstellung der plattenförmigen Zellkul
turträger aus Sintermetall können diese gegebenenfalls
auch vollständig aus einem nichttoxischem Kunststoff
gebildet sein, wobei man vorzugsweise hierfür einen
durchsichtigen Kunststoff verwenden wird, da in diesem
Falle eine einfache Beobachtung der Kultur möglich
ist.
Eine mögliche Ausgestaltung hierfür kann darin beste
hen, daß die Zellkulturträger jeweils aus einem Trag
gerippe gebildet sind, auf bzw. über das jeweils eine
gasdurchlässige Membrane gespannt ist.
Das Traggerippe kann dabei aus einem äußeren Ringkör
per und einem inneren, die zentrale Bohrung umschlie
ßenden Ringkörper bestehen, wobei beide Ringkörper
durch speichenförmige Rippen miteinander verbunden
sind.
Diese Ausgestaltung ist sehr einfach herstellbar, wo
bei eine genügend große Stabilität für das Traggerippe
gegeben ist, so daß die Zellkulturträger gegebenen
falls mit einer Dicke von weniger als 1 mm hergestellt
werden können. Die gasdurchlässige Membrane kann z. B.
eine Teflonfolie sein, mit einer Dicke von 0,0025 mm.
In vorteilhafter Weise wird man in wenigstens einen
Teil der Rippen die Zufuhröffnungen für Sauerstoff an
ordnen, wobei in den Rippen Luftleitkanäle angeordnet
sind. Die Luftleitkanäle sorgen für die Verteilung des
zugeführten Sauerstoffes im Inneren des Zellkulturträ
gers.
Mit einer erfindungsgemäßen Hepatozytenkultivierung
wird bisher z. B. eine bis zu 7 Wochen stabile Funktion
erreicht. Zellschichten, die zwischen den Platten lie
gen, können dabei von zwei Seiten voll ausreichend
oxygeniert werden. Dies ermöglicht die dreidimensiona
le Rekonstruktion einer normalen Leberarchitektur: Si
nusoid - Matrix - Hepatozyt - Matrix - nichtparenchy
male Zelle - Sinusoid usw. ohne Ischämieprobleme. Über
die Zellschichten hinweg entsteht ein freier Gasaus
tausch mit der arteriellen und portalvenös-venösen
Phase.
Alternativ zu der oben angegebenen Reihenfolge kann im
Bedarfsfalle auch eine komplette Doppeleinheit jeweils
auf der Oberseite eines Zellkulturträgers angeordnet
werden. In einem derartigen Falle ist der Schichtauf
bau auf der Oberseite eines Zellkulturträgers in fol
gender Reihenfolge: erste Kollagenschicht - Zellkultur
- zweite Kollagenschicht - Zellkultur - dritte Kolla
genschicht. Auf die dritte, d. h. die obere Kollagen
schicht wird dann der nächste Zellkulturträger aufge
setzt. Dabei ist beim Zusammenbau lediglich darauf zu
achten, daß ein Spaltraum zwischen der dritten, oberen
Kollagenschicht und der Unterseite des daraufgesetzten
Zellkulturträgers erfolgt. In diesen Spaltraum wird
dann das Kulturmedium eingebracht. In einem derartigen
Falle entfällt somit eine vierte Kollagenschicht, da
die mittlere Kollagenschicht beide Zellkulturen nach
außen abschließt. Zwar erfolgt die Zufuhr von Kultur
medium daher nicht zentral zwischen den zwei mittleren
Kollagenschichten, aber da die Kollagenschichten von
dem Kulturmedium problemlos durchsetzt werden können,
ist auch in diesem Falle für die untere Zellkultur ei
ne ausreichende Versorgung gegeben.
Die Gas- bzw. Sauerstoffzuführung zu den bilaminären
Zellkulturträgern kann an der Peripherie der Zellkul
tur entsprechend der arteriellen Versorgung im Portal
feld eines Leberlobulus erfolgen. Die Zellkulturträger
können sich in einem Glasgefäß als Gehäuse befinden.
Kulturmedium kann auch peripher und von unten (portal
venöser Zustrom) zugefügt werden und verteilt sich
dann aufsteigend an der Zirkumferenz der Platten und
strömt ober- und unterhalb jedes einzelnen bilaminären
Zellkulturträgers zu einer zentralen Öffnung. Dort be
findet sich z. B. ein sich nach oben verjüngender Ke
gel. Dies führt damit zu einer nach oben gerichteten
Lumenzunahme bzw. Vergrößerung der lichten Weite des
Spaltes der "Zentralvene" und ermöglicht bei Wegfall
von unnötigem Totvolumen ein geordnetes Abströmen des
Kulturmediums vom Umfang zum Zentrum und dann nach
oben. Der Bioreaktor entleert sich oben und medial
(venöse Phase). Beim Überströmen der Zellschichten
vollzieht sich somit der Übergang von der portalvenö
sen und arteriellen Phase in die venöse Phase. Dies
entspricht der "in vivo"-Organisation der Leber.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor besitzt vielfache An
wendungsmöglichkeiten in der Medizin und Pharmazie.
Eines seiner Schwerpunkte ist dabei der Einsatz als
künstliche Leber bzw. als Leberersatz.
Die Metabolisierung einer Vielzahl von Medikamenten
erfogt in der Leber. Lipophile Medikamente wie z. B.
Ciclosporin oder FK 506 werden speziesabhängig zu ver
schiedenartigen Metaboliten verstoffwechselt. Diese
Metaboliten sind zum Teil für die Wirkung der Substanz
aber auch deren Toxizität verantwortlich. Erst durch
die klinische Prüfung konnte das andersartige Metabo
litenmuster und deren Toxizität beim Menschen im Un
terschied zum Tierversuch aufgezeigt werden.
Die Entwicklung eines dynamischen menschlichen Sy
stems, jedoch ohne den Menschen, hätte prinzipielle
Vorteile gegenüber dem Tierversuch vor Beginn einer
klinischen Prüfung hinsichtlich der Gültigkeit der Er
gebnisse. Auch in ethischer Hinsicht stellt sich die
Frage, ob wegen der unsicheren Tierversuche, die erst
malige Austestung, insbesonders hoher Wirkstoffkonzen
trationen lipophiler Medikamente beim Menschen im Rah
men der klinischen Prüfung noch vertretbar ist.
Weiterhin wird in Großtier- und Primatenversuchen die
Entwicklung eines temporären Organersatzes mittels der
tierischen Leber angestrebt. Die Kreuzperfusion mit
einer Pavianleber wird mit wechselnden Erfolgen schon
klinisch verwendet.
Erfindungsgemäß können die pulsatilen Eigenschaften
des Bioreaktorkreislaufs ausgenützt und Metaboliten
von Pharmaka erfaßt werden. Medikamente und Hormone
erreichen "in vivo" pulsatil die Leber.
Diese Bedingungen lassen sich durch den Bioreaktor si
mulieren. Es können peak- und through-Werte einer Mut
tersubstanz als auch ihrer Metaboliten ermittelt wer
den. First pass- und Rezirkulierungsstudien sind mög
lich. Weiterhin können Metabolitenmuster bei tieri
schen und menschlichen Zellen ermittelt werden. Eine
Untersuchung der direkten Toxizität, insbesonders bei
hohen Dosierungen, ist ebenfalls möglich.
Weiterhin ist die kontrollierte Ermittlung einer do
sisabhängigen Kinetik der Metabolitenentstehung reali
sierbar. Eine derartige Situation konnte bisher nur im
Tierversuch untersucht werden.
Es bestehen physiologische Unterschiede im Verhalten
zwischen humanen und Rattenhepatozyten. Auch der Tier
versuch an sich unterliegt diesen Einschränkungen.
Die Anzahl der verwendeten Tiere für pharmakokineti
sche und metabolische Untersuchungen in der Industrie
ist sehr hoch, da diese fast ausschließlich an Ver
suchstieren durchgeführt werden. Aus Gründen der Über
tragbarkeit auf den Menschen muß eine von 2 Tierarten
dem Menschen im Stoffwechselgeschehen ähnlich sein.
Dies kann jedoch je nach verwendeter Substanz unter
schiedlich sein. Eine geeignete Tierart ist daher nur
mit Einschränkungen vorhersagbar. Die Belastung ist
selbstredend abhängig von der verwendeten Substanz.
Mit dem erfindungsgemäßen Einsatz des Bioreaktors kön
nen nun derartige Versuche gegebenenfalls weitgehend
entfallen. So stehen z. B. humane Hepatozyten aus Ope
rationspräparaten nach Leberresektion oder aus nicht
oder nur teilweise transplantierten Organen zur Verfü
gung und können damit in dem erfindungsgemäßen Biore
aktor verwendet werden.
Lebererkrankungen, die zum völligen Ausfall des Organs
führen können, sind weit verbreitet und können jeden
Menschen akut und unversehens betreffen. Dazu zählen
die Hepatitis genauso, wie Lebertumore, als auch Le
berschädigungen durch Gifte (Knollenblätterpilz, Alko
hol), wie auch Unfälle.
Der künstliche Organersatz durch den erfindungsgemäßen
Bioreaktor verfolgt zwei Ziele:
- 1. Es soll die Wartezeit zwischen dem Eintritt des Le berversagens und der Verfügbarkeit eines neuen Or gans bei geplanter Lebertransplantation überbrückt werden. Nicht selten versterben Patienten gerade in dieser Wartefrist.
- 2. Ein Leberausfall muß nicht immer endgültig sein. Würde man einem Patienten in einer solchen Situa tion die Möglichkeit einer unterstützenden Behand lung durch einen anderweitigen Organersatz einräu men, könnte der Patient unter Umständen eine derar tige Situation überleben. Die eigene Leber hätte Zeit zur Regeneration. Dies ist vor allem denkbar bei akut traumatischen oder toxischen Schädigungen der Leber. Aber auch bei ausgedehnten Tumoropera tionen kann die Reserve eines temporären Organer satzes das Operationsrisiko reduzieren oder größere Eingriffe ermöglichen. Der Körper produziert selbst eine große Menge von Wachstumsfaktoren, die ein Nachwachsen der verbliebenen, gesunden Restleber ermöglichen.
Bisherige Behandlungsmethoden beinhalten die Entfer
nung von Stoffwechselgiften und eine Filtration des
Blutes. Leider werden dadurch auch die Wachstumsfak
toren mitentfernt und eine Heilung behindert.
Eine weitere Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen
Bioreaktors besteht in der großtechnischen Herstellung
von Blutgerinnungsfaktoren, wie z. B. Lebersynthesepro
dukte. Bisher hat man Blutgerinnungsfaktoren aus dem
menschlichen Blut von Blutspendern gewonnen. Dabei be
steht jedoch die Gefahr einer Hepatitis-Ansteckung
oder einer Aids-Infizierung. Mit dem erfindungsgemäßen
Bioreaktor lassen sich nunmehr unabhängig von Blut
spendern infektionsfrei z. B. Blutgerinnungsfaktoren
gewinnen. Dies ist eine Alternativlösung zu der auf
wendigen gentechnischen Gewinnung von Lebersynthese
produkten.
Nachfolgend ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung
anhand der Zeichnung prinzipmäßig dargestellt.
Es zeigt:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Bauprinzi
pes des Bioreaktors im Ausschnitt;
Fig. 2 eine Prinzipdarstellung der Wirkungsweise des
Bioreaktors;
Fig. 3 eine Draufsicht auf eine Zellkulturträger
platte;
Fig. 4 den erfindungsgemäßen Bioreaktor in Gesamtan
sicht;
Fig. 5 eine Draufsicht auf eine Zellkulturträger
platte anderer Bauart.
Den Kern des Bioreaktors bilden eine Vielzahl von auf
Abstand übereinander angeordneter Zellkulturträger 1,
die als silikonbeschichtete Platten aus Sintermetall
ausgebildet sind.
Wie in der vergrößerten Darstellung in Fig. 1 ersicht
lich ist, ist jede Platte aus einer dünnen Oberflä
chenschicht, z. B. einem Sintermetall- oder Kunststoff
band 1A gebildet, das an der äußeren Peripherie umge
bogen und nach innen zurückgeführt ist. Durch nicht
näher dargestellte Abstandshalter 2, die damit einen
freien Innenraum zwischen dem oberen Bandteil und dem
unteren Bandteil bilden, wird ein Freiraum geschaf
fen. Wie aus der Fig. 3 ersichtlich ist, ist jede
Platte mit einer zentralen Öffnung 3 versehen. Weiter
hin sind zwei diametral sich gegenüberliegende Bohrun
gen 4 vorhanden, wobei sich die Bohrungen 4 zwischen
dem äußeren Umfang und der zentralen Öffnung 3 befin
den. Die Bohrungen 4 dienen zur Zufuhr von Sauerstoff
in das Innere der Platten 1. Aus diesem Grunde sollten
die Bohrungen 4 in einer derartigen Verteilung in je
der Platte 1 angeordnet sein, daß eine ausreichende
und gleichmäßige Sauerstoffverteilung erfolgen kann.
Auf die Oberseite des oberen Bandes 1A wird eine erste
hydrierte Kollagenschicht 5 (z. B. Protein von Haut,
Knochen und Knorpel) in einer Stärke von ca. 0,5 mm
aufgetragen. Auf diese Kollagenschicht 5 folgt eine
Zellkulturschicht 6, z. B. Hepatozyten. Auf die Zell
kulturschicht 6 ist eine zweite, obere Kollagenschicht
7 aufgebracht. Gegebenenfalls kann darüber nochmals
eine Schicht aus z. B. nichtparenchymalen Zellen 8 auf
gebracht werden (siehe gestrichelte Darstellung in der
Fig. 1). Die beiden Kollagenschichten 5 und 7 stellen
für die Gas- bzw. Luftzufuhr und die Nährstoffdiffu
sion zu den Hepatozyten keine wesentliche Barriere
dar. Selbst große Moleküle können problemlos durch
diese Schicht hindurchtreten. Da die Zellen 6 dem
Zellkulturträger 1 als Sauerstoffträger mittels der
ersten Kollagenschicht 5 direkt aufliegen, ergibt sich
dadurch hinsichtlich der Gasdiffusion eine Situation
wie in einem Inkubator nach Entfernung des Mediums.
Dies ist dort die Voraussetzung für die Optimierung
einer Sauerstoffversorgung bei der Kultivierung großer
Zellzahlen in konfluierenden Schichten. In dem Biore
aktor wird jedoch nicht auf das nährstofftragende Kul
turmedium verzichtet. Dieses wird über den geringen
Abstand bzw. Spalt zwischen der oberen Kollagenschicht
7 und einer weiteren Auflageeinheit zugeführt. Die
weitere (und folgende) Auflageeinheit besteht wiederum
aus einer unteren bzw. inneren Kollagenschicht 5′, die
auf dem mit Abstand über dem ersten Zellkulturträger 1
angebrachten weiteren Zellkulturträger 1′ aufgebracht
ist. Auf die innere Kollagenschicht 5′ folgt wiederum
die Zellkulturschicht 6′, die außenseitig durch die
zweite bzw. äußere Kollagenschicht 7′ abgedeckt ist.
Diese Einheit ist praktisch über Kopf angeordnet und
die Versorgung mit z. B. Nährstoff oder Plasma erfolgt
über den gemeinsamen Spaltraum 9.
In einer Abwandlung des in der Fig. 1 dargestellten
Aufbaues kann auch die dargestellte Doppeleinheit mit
zwei Schichten aus Zellkulturen 6 und 6′, die jeweils
zwischen zwei Zellkulturträger 1 bzw. 1′ angeordnet
ist, von der Oberseite des unteren Zellkulturträgers 1
vollständig aufgebaut sein. Dieses Verfahren bietet
sich insbesondere dann an, wenn die Gefahr besteht,
daß die Kollagenschicht 5′ nicht oder nur schlecht auf
der Unterseite des jeweils darüber angeordneten Zell
kulturträgers 1′ haftet. Außerdem wird das Arbeiten am
bzw. der Aufbau des Bioreaktors damit gegebenenfalls
erleichtert.
In diesem Falle wird statt dem Spaltraum 9 auf die
obere Kollagenschicht 7 direkt die obere Zellkultur 6′
aufgelegt, wie es z. B. durch die nichtparenchymale
Zellkulturschicht 8 dargestellt ist. Auf die obere
Zellkulturschicht 6′ wird dann die obere Kollagen
schicht 5′ aufgebracht und anschließend der nächste
Zellkulturträger 1′ aufgesetzt. Dabei ist lediglich
darauf zu achten, daß beim Zusammenbau zwischen der
oberen Kollagenschicht 5′ und der Unterseite des Zell
kulturträgers 1′ ein geringer Zwischenraum zur Zufuhr
von Kulturmedium verbleibt. In diesem Falle erfolgt
somit die Nährstoffversorgung der Zellkulturschichten
6 und 6′ von oben her durch die Kollagenschicht 5′.
Die Kollagenschicht 7′ entfällt und es gibt nun eine
mittlere Kollagenschicht 7.
Wie ersichtlich, wird der Sauerstoffbedarf stoffwech
selaktiven Hepatozyten unabhängig vom Medium und der
Durchflußgeschwindigkeit des Mediums garantiert. Die
Zellkulturträger 1 selbst stellen den Oxygenator dar,
wodurch auch konfluierende Zellschichten 6 unter Ein
satz des Kapillarnetzes exakt dosiert mit Sauerstoff
versorgt werden können.
In der Fig. 2 ist schematisch der Aufbau des Bioreak
tors dargestellt. Dabei stellen die schwarzen Pfeile
den Weg bzw. die Fließrichtung des Kulturmediums dar,
während die weißen Pfeile den Verlauf des Sauerstoffes
darstellen. Gleiches gilt auch für die übrigen Pfeil
darstellungen in den Fig. 1 und 4.
Dabei wird Sauerstoff über eine gemeinsame Sauerstoff
leitung 23, die im Zusammenhang mit der Fig. 4 näher
erläutert wird, eingebracht. Kulturmedium wird eben
falls über eine gemeinsame Leitung 18 in gleichmäßiger
Verteilung allen Spalträumen 9 zugeführt.
Der Gesamtaufbau des Bioreaktors ist aus der Fig. 4
ersichtlich. Wie dargestellt, wird eine Vielzahl von
Zellkulturträger 1 auf Abstand übereinander angeord
net, wobei Abdichtringe in Form von Silikondichtungs
ringe 10, die um die Sauerstoffbohrungen 4 jeder Plat
te gelegt werden, sowohl für eine Einhaltung eines Ab
standes zwischen den Platten 1 als auch für eine Ab
dichtung zwischen der Flüssigphase (venös) und der
Gasphase (arteriell) sorgen. Die Wahl der Größe bzw.
der Dicke der Silikondichtungsringe 10, die beim Zu
sammenbau der Platten verpreßt werden, sorgt auch da
für, daß ein kapillarer Spaltraum 9 zwischen den Plat
ten verbleibt und damit das "Sinusoid" bildet.
Die Zufuhr von Sauerstoff in das Gehäuse 11 des Biore
aktors erfolgt über eine Sauerstoffleitung 23 in die
fluchtend übereinanderliegenden Sauerstoffbohrungen 4
der Zellkulturträger 1. Zur Verbindung der Zellkultur
träger 1 miteinander dient ein Stab 12, der - im Quer
schnitt gesehen - dreiecksförmig ist. Auf diese Weise
verbleibt zwischen den Bohrungswandungen der Sauer
stoffbohrungen 4 und dem Stab 12 genügend Freiraum zum
Einleiten von Sauerstoff (siehe Fig. 3). Der Stab 12
ist mit einer zentralen Bohrung 13 versehen, durch die
eine Spannschraube gesteckt wird, welche in nicht mehr
dargestellter Weise zusammen mit einer Kontermutter
bzw. Konterplatte 14 auf der Unterseite für eine Ver
bindung und eine gasdichte Verspannung der Silikon
dichtungsringe 10 sorgt. In den Freiraum, der durch
die fluchtend übereinanderliegenden zentralen Öffnun
gen 3 der Zellkulturträger 1 entsteht, ist ein Kegel
z. B. ein Glaskegel 15 eingesetzt. Der Glaskegel 15 be
sitzt einen geringeren Durchmesser wie die Durchmesser
der zentralen Öffnungen 3, wodurch ein Spaltraum 16
entsteht. Da sich der Kegel 15 nach oben verjüngt,
vergrößert sich auf diese Weise der Spaltraum 16, wo
durch für einen guten und gleichmäßigen Ablauf des
Kulturmediums über eine gemeinsame Ablaufleitung 17
gesorgt ist.
Wie ersichtlich, strömt das Kulturmedium an beiden
Seiten des Bioreaktors über Zulaufleitungen 18 in das
Gehäuse 11 ein und von dort aus von außen her peripher
längs des Spaltraumes 9 nach innen, wo es über den
Spaltraum 16 abfließt.
Das Kulturmedium kann im Kreislauf geführt werden, wo
bei ein Sammelreservoir 19 und eine nachfolgende Pumpe
20 vorgesehen ist, die über die gestrichelt darge
stellte Leitung das Kulturmedium wieder zu den Zulauf
leitungen 18 führt. Gegebenenfalls kann in der Kreis
laufleitung auch noch eine Filtereinrichtung zum Ab
scheiden von unerwünschten Bestandteilen aus dem vom
Bioreaktor auftretenden Kulturmedium angeordnet sein.
Sofern der Bioreaktor nicht in einem Inkubator ange
ordnet ist, wird man im allgemeinen den Sauerstoff,
der mit ca. 5% Kohlendioxyd versetzt sein kann, über
einen Vorwärmer 21 und eine Befeuchter 22 dem Bio
reaktor zuführen. Die den Bioreaktor verlassende Luft
kann durch eine Wassersäule hindurchgeführt werden.
Auf diese Weise wird ein Kohlendioxydaustausch mit der
umgebenden Luft verhindert, wodurch der gewünschte ho
he Kohlendioxydgehalt praktisch in einer Art geschlos
senem System stabilisiert werden kann.
In der Fig. 5 ist eine konstruktive Ausgestaltung ei
nes scheibenförmigen Zellkulturträgers 1 dargestellt,
der vorzugsweise aus einem nichttoxischen Kunststoff
besteht. Als Traggerippe dienen dabei ein äußerer
Ringkörper 24 und ein innerer Ringkörper 25, der die
zentrale Bohrung 3 umschließt. Die Verbindung der bei
den Ringkörper 24 und 25 miteinander erfolgt durch
speichenförmige Rippen 26. In zwei gegenüberliegenden
Rippen 26 sind die Zufuhröffnungen 4 für Sauerstoff
angeordnet. Dieses Traggerippe wird auf der Oberseite
und auf der Unterseite durch eine transparente Membra
ne, z. B. einer Teflonfolie, überspannt. Damit der Sau
erstoff im Inneren des Zellkulturträgers 1 gleichmäßig
verteilt wird, sind die Rippen 26 jeweils mit einem
oder mehreren Luftleitkanälen 27 auf ihren Oberflächen
(Ober- und Unterseite) versehen, welche die Rippen in
ihrer Breite jeweils durchsetzen.
Die Dicken bzw. Abstände der einzelnen Schichten sind
in Abhängigkeit von den zu behandelnden Zellkulturen
zu wählen. Für die Kultivierung von Hepatozyten haben
sich Dicken von ca. 0,5 mm für die Zellkulturträger 1
als sehr geeignet herausgestellt, wobei die gasdurch
lässige Oberflächenschicht bzw. das Sinterband gegebe
nenfalls nur 0,1 mm oder weniger betragen kann. Für
die beiden Kollagenschichten haben sich Dicken von je
weils 0,4 bis 0,6 mm, vorzugsweise 0,5 mm als geeignet
herausgestellt. Die Zellkulturschicht kann eine Dicke
von 0,002 bis 0,003 mm besitzen. Für den Spaltraum 9
genügen ebenfalls wenige zehntel Millimeter.
Schätzt man den Gehalt an Hepatozyten von 1 g Leber
auf 100 Millionen, so würde die Leber einer 250 g
schweren Ratte bei 8 bis 10 g 800 Millionen bis 1 Mil
liarde Hepatozyten enthalten. Versuche haben gezeigt,
daß dies der Kapazität eines Bioreaktors mit einer In
nenhöhe von ca. 30 mm und einem Durchmesser der plat
tenförmigen Zellkulturträger von ca. 10 bis 15 cm
hierfür ausreicht.
Um die Aufgaben einer menschlichen Leber übernehmen zu
können, bzw. als künstliche menschliche Leber, wären
schätzungsweise ca. 2000 übereinanderliegende Platten
erforderlich, was bei einer Anordnung der Platten in 4
Säulen, z.B in einer Kleeblattstruktur, eine Gesamthö
he von ca. 80 bis 100 cm ergeben würde. Der Eigenvolu
menbedarf des Bioreaktors an Kulturmedium wäre dabei
mit ca. 10 l relativ gering. Über ein Reservoir könnte
dabei der Stoffaustausch mit dem Patientenplasma er
folgen.
Claims (23)
1. Vorrichtung zur Behandlung von Zellkulturen, ins
besondere von Hepatozyten, auf plattenartigen
Zellkulturträgern,
dadurch gekennzeichnet, daß
wenigstens ein Teil der Oberflächen der Zellkul
turträger (1) gasdurchlässig ist, wobei in das In
nere der Zellkulturträger (1) Sauerstoff einleit
bar ist, daß auf dem Zellkulturträger (1) eine
Kollagenschicht (5, 7) aufgetragen ist, auf der
oder in der die Zellkultur (6) angeordnet ist, und
daß direkt oder mit geringem Abstand über der Kol
lagenschicht (5, 7) der nächste Zellkulturträger
(1) angeordnet ist, wobei in die Kollagenschicht
(5, 7) Kulturmedium einleitbar ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkultur (6) auf einer ersten Kollagen
schicht (5) angeordnet ist, und daß über der Zell
kultur (6) eine zweite, obere Kollagenschicht (7)
liegt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
zwischen zwei Kollagenschichten (7, 7′) oder zwi
schen einer Kollagenschicht (5′) und der Untersei
te eines Zellkulturträgers (1′) ein Zwischenraum
(9) zur Zufuhr von Kulturmedium angeordnet ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
neben der ersten Zellkultur (6) eine zweite Zell
kultur (8) angeordnet ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
die zweite Zellkultur (8) nichtparenchymale Zellen
sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die nichtparenchymalen Zellen (8) auf der zweiten
Kollagenschicht (7) angeordnet sind.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkulturträger (1) Sintermetall aufweisen.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
jeder Zellkulturträger (1) aus einer oberen und
einer unteren gasdurchlässigen Schicht oder Band
(1A) gebildet ist, die bzw. das durch Abstandshal
ter voneinander getrennt sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Schicht (1A) aus Sintermetall gebildet ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkulturträger (1) aus einem gasdurchlässi
gen Kunststoff gebildet sind, bzw. einen gasdurch
lässigen Kunststoff aufweisen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkulturträger (1) aus einem Traggerippe
(24, 25, 26) gebildet sind, auf bzw. über das je
weils eine gasdurchlässige Membrane gespannt ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Traggerippe aus einem äußeren Ringkörper (24)
und einem inneren, die zentrale Bohrung (3) um
schließenden Ringkörper (25) besteht, wobei beide
Ringkörper (24, 25) durch speichenförmige Rippen
(26) miteinander verbunden sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß
in wenigstens einem Teil der Rippen (26) die Zu
fuhröffnungen (4) für Sauerstoff angeordnet sind,
und daß in den Rippen (26) Luftleitkanäle (27) an
geordnet sind.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß
die gasdurchlässigen Oberflächen durch eine Sili
kon- oder Polypropylenfolie gebildet sind.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet, daß
zwischen den einzelnen Zellkulturträgern (1) Ab
dichtringe (10) angeordnet sind, die als Abstands
halter und/oder zur Abdichtung dienen.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet, daß
er bausteinartig mit einer Vielzahl von in einem
Gehäuse übereinander angeordneten Zellkulturträ
gern (1) ausgebildet ist, mit wenigstens einer Zu
fuhrleitung (23) für Sauerstoff und mit wenigstens
einer Zulaufleitung (18) und wenigstens einer Ab
laufleitung (17) für Kulturmedium.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkulturträger (1) wenigstens annähernd eine
Scheibenform aufweisen, wobei die Zufuhr von Kul
turmedium umfangsseitig und der Ablauf vom zentra
len Bereich der an dieser Stelle mit einem Frei
raum versehenen Zellkulturträger (1) erfolgt, und
daß die Zellkulturträger (1) jeweils mit wenig
stens zwei gleichmäßig über den Umfang der Zell
kulturträger (1) angeordnete Zufuhröffnungen (4)
für Sauerstoff versehen sind.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkulturträger (1) jeweils mit einer zentra
len Bohrung (3) versehen sind, und daß sich durch
die zentralen Bohrungen ein sich in Ablaufrichtung
verjüngender Kegel (15) angeordnet ist, der einen
derartigen Durchmesser aufweist, daß ein Ringraum
zu den Wänden der zentralen Bohrungen (3) der
Zellkulturträger (1) verbleibt.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellkulturträger (1) durch eine sich durch die
Sauerstoffzufuhröffnungen (4) erstreckende Spann
einrichtung (12, 13) miteinander zu einer Einheit
verbunden sind.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Sauerstoffzufuhröffnungen (4) kreisförmig aus
gebildet sind und die Spanneinrichtung einen von
der Kreisform abweichenden Führungsstab (12) auf
weist, durch dessen Inneres eine Spannschraube ge
steckt ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß
mehrere aus Zellkulturträgern (1) gebildete Türme
kleeblattartig nebeneinander angeordnet sind.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Nährmedium über ein Sammelreservoir (19) und
eine Pumpe (20) im Kreislauf geführt ist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet, daß
in dem Kreislauf eine Filtereinrichtung für abzu
scheidende Stoffe angeordnet ist.
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