DE4142452A1 - AGENT FOR STIMULATING THE DIVIDING ACTIVITY OF ANIMAL CELLS - Google Patents

AGENT FOR STIMULATING THE DIVIDING ACTIVITY OF ANIMAL CELLS

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Abstract

An agent for stimulating animal and human cell division has applications in the areas of biological-medical fundamental research, in biotechnology and in the pharmaceutical industry. The disclosed agent is characterized by nucleotide sequences with a complementary (anti-sense) sequence to specific domains of the mRNA of tumor suppressor genes or other genes having a negative effect on cell division. Synthetic oligonucleotides having at least 15 nucleotides, preferably 18 to 21 nucleotides, in length are preferably used as a nucleotide sequence. An amount of the agent comprised between 5 and 30 mu M is added to the culture medium and its concentration should remain essentially constant during cultivation.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Stimulierung der Tei­ lungsaktivität tierischer und menschlicher Zellen sowie ein Verfahren zur Anwendung dieses Mittels. Sie ist sowohl in der biologisch-medizinischen Grundlagenforschung als auch in der Biotechnologie und der pharmazeutischen Industrie einsetzbar.The invention relates to a means for stimulating the Tei developmental activity of animal and human cells and a Procedure for using this agent. It is both in the basic biological-medical research as well Biotechnology and the pharmaceutical industry can be used.

Sowohl für die Aufklärung grundlegender biologischer Prozesse als auch für die Verwendung tierischer Zellen für biotechno­ logische Zwecke werden Zellen benötigt, die für eine beliebi­ ge Dauer in künstlichen Medien kultivierbar sind. Die unbe­ grenzte Zellteilungsfähigkeit ist ein Kriterium von Tumorzel­ len. Aber auch Zellen im "prämalignen" Zustand können un­ sterblich (immortal) sein. Prinzipiell basiert die Entwick­ lung einer immortalen Zelle auf genetischen Veränderungen, die zur Veränderung der Funktion eines oder mehrerer Proteine führen, die für die negative Regulation der Zellteilung we­ sentlich sind.Both for the elucidation of basic biological processes as well as for the use of animal cells for biotechno logical purposes, cells are required that can be used for any duration can be cultivated in artificial media. The unbe limited cell division ability is a criterion of tumor cell len. But cells in the "pre-malignant" state can also to be mortal (immortal). In principle, the development is based development of an immortal cell for genetic changes, to change the function of one or more proteins lead that we for the negative regulation of cell division are substantial.

Immortalisierte Zellinien können entweder aus bestimmten Tu­ moren direkt gewonnen werden oder über Umwege aus Primärzel­ len entstehen, die aus bestimmten Geweben isoliert wurden. Das spontane Entstehen einer immortalen Zellinie ist ein ex­ trem seltenes Ereignis, da vermutlich mindestens zwei Muta­ tionen dafür erforderlich sind. In der Vergangenheit wurden daher häufig Tumorviren als Induktoren der Immortalisierung verwendet. Diese hatten aber den Nachteil, daß sie auch eine vielfach unerwünschte tumorigene Veränderung der Zellen her­ vorriefen. In DD-WP 2 65 165 wurde bereits vorgeschlagen, zur Verbesserung der Immortalisierungsverfahren die Rekombinanten mit dem Gen für das große T-Antigen des Polyomavirus anzuwen­ den. Dadurch wurde das Problem der effektiven Immortalisie­ rung ohne gleichzeitige tumorigene Veränderung prinzipiell gelöst. Allerdings wird die Geschwindigkeit der Zellteilung in der Regel bei diesem Verfahren nicht beeinflußt. Immortalized cell lines can either be from certain Tu mor can be obtained directly or via detours from primary cell len arise, which were isolated from certain tissues. The spontaneous emergence of an immortal cell line is an ex Extremely rare event because there are probably at least two muta tions are required for this. In the past hence tumor viruses are often inducers of immortalization used. However, these had the disadvantage that they were also often undesirable tumorigenic changes in the cells called. In DD-WP 2 65 165 has already been proposed to Improve the immortalization process of the recombinants with the gene for the large T antigen of the polyomavirus the. This raised the problem of effective immortalization in principle without simultaneous tumorigenic change solved. However, the rate of cell division usually not affected by this procedure.  

Viele tierische und menschliche Zellen haben ein auf ca. 50- 60 Zellteilungen beschränktes Teilungspotential ohne Immorta­ lisierung. Die längere Lebensfähigkeit ist häufig wünschens­ wert, aber nicht unbedingt erforderlich. Allerdings ist die Ausschöpfung des tatsächlichen Teilungspotentials auch bei vielen Zelltypen schwierig, da dies von einer optimalen Ver­ sorgung mit Wachstumsfaktoren abhängig ist. So wird bei vie­ len Zelltypen eine Begrenzung der Teilungsaktivität in vitro auf nur wenige Zyklen gefunden. Eine vordringliche Problem­ stellung für die biotechnologische Nutzung von Zellkulturen besteht daher in einer Prinziplösung zur Etablierung von Zel­ len unterschiedlichster Organe unter maximaler Ausschöpfung ihres natürlichen Teilungspotentials und möglichst zusätzli­ cher Stimulierung der Zellteilung hinsichtlich ihrer Geschwin­ digkeit.Many animal and human cells have an approx. 50- 60 cell divisions limited division potential without immorta lization. Longer viability is often desirable worth it, but not essential. However, that is Realization of the actual division potential also with difficult for many cell types, as this depends on an optimal ver supply with growth factors is dependent. So with vie len cell types limit the division activity in vitro found on just a few cycles. A pressing problem Position for the biotechnological use of cell cultures therefore consists in a principle solution for the establishment of Zel len of different organs with maximum exhaustion their natural division potential and, if possible, additional stimulation of cell division with regard to its speed efficiency.

Ziel der Erfindung sind die Schaffung und die Anwendung eines Mittels zur generellen Stimulierung der Teilungsaktivität tierischer und menschlicher Zellen in der Kultur sowohl hin­ sichtlich der Ausschöpfung des natürlichen Teilungspotentials als auch bezüglich der Geschwindigkeit des Zellzyklus. Das erfindungsgemäße Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es als wirksame Substanz eine oder mehrere Nukleotidsequenzen mit komplementärer Sequenz (antisense) zu bestimmten Berei­ chen der mRNA von Tumorsuppressorgenen oder anderen negativ auf die Zellteilungsaktivität wirkenden Genen enthält. Die Antisense-Nukleotidsequenz besteht vorzugsweise aus einem synthetischen Oligonucleotid einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden, wobei eine Länge von 13-21 Nukleotiden bevor­ zugt ist. Das Oligonukleotid muß in nukleaseresistenter Form vorliegen, wobei die Phosphothioatform besonders zweckmäßig ist. The aim of the invention is to create and use a For general stimulation of division activity animal and human cells in the culture both obviously the exploitation of the natural division potential as well as the speed of the cell cycle. The agent according to the invention is characterized in that it as an active substance one or more nucleotide sequences with complementary sequence (antisense) to certain areas the mRNA of tumor suppressor genes or other negative contains genes acting on cell division activity. The Antisense nucleotide sequence preferably consists of one synthetic oligonucleotide at least 15 in length Nucleotides, with a length of 13-21 nucleotides before is moving. The oligonucleotide must be in nuclease resistant form are present, the phosphothioate form being particularly expedient is.  

Als Antisense-Nukleotidsequenzen werden vor allem Sequenzen eingesetzt, die komplementär zu einer Region des 5′-Endes, der Region um das Startcodon, einer Region eines Exons oder einer Region an einem Intron-Exon-Übergang des betreffenden Gens ist. Bevorzugt werden kompläre Sequenzen zu den Tumor­ suppressorgenen Retinoblastomgen, p53-Gen oder das E-cadherin ausgewählt. Beispiele für konkrete Sequenzen der wirksamen Substanz im erfindungsgemäßen Mittel sind 3′-CAGTACGGCGGGTTTT GG-5′ und 3′-AGCAAGTGAAAATGACTC-5′. Zur Herstellung des Mit­ tels wird die Antisense-Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung in Lösung, vorzugsweise in wäßrige Lösung gebracht.Above all, sequences are used as antisense nucleotide sequences used that are complementary to a region of the 5'-end, the region around the start codon, a region of an exon or a region at an intron-exon junction of that Gens is. Complete sequences to the tumor are preferred suppressor gene retinoblastoma gene, p53 gene or the E-cadherin selected. Examples of concrete sequences of the effective Substance in the agent according to the invention are 3'-CAGTACGGCGGGTTTT GG-5 ′ and 3′-AGCAAGTGAAAATGACTC-5 ′. To make the Mit The antisense nucleotide sequence according to the invention brought in solution, preferably in aqueous solution.

Zum Einsatz des Mittels zur Stimulierung der Zellteilungsak­ tivität werden die folgenden näheren Angaben gemacht: Es werden Oligonukleotide nach bekannten Verfahren syntheti­ siert.To use the agent to stimulate cell division ac The following details are given: Oligonucleotides are synthesized by known methods siert.

Um eine Zellkultur in ihrer Zellteilungsaktivität zu stimu­ lieren, werden die bevorzugt adhärent auf Plastik wachsenden Zellen mit den ausgewählten antisense-Oligonukleotiden behan­ delt. Dazu werden die Oligonukleotide durch Alkohol-Fällung sterilisiert, in sterilem dest. Wasser gelöst und in einer Konzentration von 5-30 µM in das Kulturmedium ohne Serum gegeben. Die Oligonukleotide können zusätzlich mit Lipofectin gemischt werden, um eine noch effektivere Aufnahme durch die Zellen zu erreichen. Nach einer Stunde kann dem Medium Serum zugefügt werden. Die Zellen werden mit dem Oligonukleotid haltigen Medium über mehrere Tage inkubiert. Die Zellzahl wird in Parallelansätzen täglich im Vergleich zu einer unbe­ handelten Kultur bestimmt.To stimulate a cell culture in its cell division activity lations, they will preferentially adhere to plastic Treat cells with the selected antisense oligonucleotides delt. To do this, the oligonucleotides are precipitated by alcohol sterilized, in sterile dist. Dissolved water and in one Concentration of 5-30 µM in the culture medium without serum given. The oligonucleotides can additionally with lipofectin can be mixed to make the absorption even more effective To reach cells. After an hour, the medium can be serum be added. The cells are labeled with the oligonucleotide incubated medium for several days. The cell number is compared daily in parallel approaches to an unrelated one acted culture determined.

Bei primären menschlichen Lungenfibroblasten (HEL) zeichnet sich nach drei Tagen ein rascherer Zuwachs der Zellzahl im Vergleich zur Kontrolle ab. Diese Tendenz hält bei einmaliger Gabe von Oligonukleotiden für mindestens 7 Tage an. Innerhalb von 10 Tagen wird bei diesem Zelltyp mindestens die 3fache Zahl von Zellen mit Behandlung im Vergleich zu den nichtbe­ handelten Zellen erzielt. Die Analyse der spezifischen Rb­ mRNA mittels Hybridisierung zeigt eindeutig, daß die mRNA im Bereich der Paarung mit dem antisense-Oligonukleotid degra­ diert wird. Der immunologische Proteinnachweis zeigt, daß spätestens 3 Tage nach dem Beginn der Behandlung mit Oligonu­ kleotiden die Neusynthese von pRb vollständig eingestellt ist.In primary human lung fibroblasts (HEL) after three days there is a faster increase in the number of cells in the Comparison to control. This tendency stops at one time Use of oligonucleotides for at least 7 days. Within 10 days is at least 3 times this cell type Number of cells with treatment compared to the nonbe  acted cells achieved. Analysis of the specific Rb mRNA by means of hybridization clearly shows that the mRNA in the Area of pairing with the antisense oligonucleotide degra is dated. The immunological protein detection shows that at the latest 3 days after the start of treatment with Oligonu kleotiden completely stopped the synthesis of pRb is.

Läßt man die behandelte Kultur länger als 7 Tage im konfluen­ ten Zustand, dann entstehen dichte Inseln von Zellen, die an transformierte Foci erinnern, aber tatsächlich keine trans­ formierten Zellen enthalten. Nach etwa 14 Tagen sind die Kul­ turgefäße gleichmäßig mit einer "multilayer" von Zellen be­ wachsen. Werden die Zellen passagiert und dabei erneut mit Oligonukleotid (5-30 µM) behandelt, dann hält das be­ schleunigte Wachstum weiter an, bis die natürliche Grenze von etwa 60 Zellteilungen erreicht ist. Im Einzelfall können auch etwa 80 Teilungen erreicht werden. Da sich die behandelten Zellen aber mehr als doppelt so schnell teilen wie die Kontrollzellen, beenden sie ihre Lebensspanne erheblich frü­ her.Allow the treated culture to conflict for more than 7 days state, then there are dense islands of cells attached to it remember transformed foci, but actually no trans formed cells included. After about 14 days the Kul are door vessels evenly with a "multilayer" of cells to grow. The cells are passaged and again with Treated oligonucleotide (5-30 µM), then it keeps accelerated growth further until the natural limit of about 60 cell divisions is reached. In individual cases, too about 80 divisions can be achieved. Since the treated But dividing cells more than twice as fast as that Control cells, they end their lifespan significantly early forth.

Der Vergleich verschiedener Oligonukleotide mit Komplementa­ rität zu unterschiedlichen Bereichen der Rb-mRNA zeigt, daß mit vielen ein annähernd gleicher Effekt zu erreichen ist. Generell erweist sich aber ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz 3′-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5′, das komplementär zur Region um das Start-Codon ist, als besonders effektiv. Dies bedeu­ tet, daß bei relativ niedriger Konzentration (10 µM) des Oligonukleotids ein maximaler Stimulierungseffekt und voll­ ständige Ausschaltung der pRb-Synthese erreicht werden. Eine Kombination von zwei Oligonukleotiden, z. B. gegen die Region des Start-Codons und gegen eine Exon-Sequenz erweist sich bei halber Konzentration (je 5 µM) als ähnlich effektiv. Dagegen sind bei Verwendung von Oligonukleotiden gegen andere Regio­ nen der mRNA höhere Konzentrationen (30 µM) erforderlich. Comparison of different oligonucleotides with complements Rity to different areas of the Rb mRNA shows that with many an almost identical effect can be achieved. In general, however, an oligonucleotide with the following has been found Sequence 3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5 ', which is complementary to the region around the start codon is particularly effective. This means tet that at a relatively low concentration (10 µM) Oligonucleotide a maximum stimulation effect and full permanent deactivation of the pRb synthesis can be achieved. A Combination of two oligonucleotides, e.g. B. against the region of the start codon and against an exon sequence proves to be half the concentration (5 µM each) as similarly effective. On the other hand are against other regions when using oligonucleotides higher concentrations (30 µM) of the mRNA are required.  

Frisch angelegte Zellen anderer Organe, z. B. der Leber, die ohne Behandlung nur 1-2 Zellteilungen durchlaufen, können nach Behandlung mit einem Rb-antisense-Oligonukleotid signi­ fikant länger kultiviert werden, wobei die Zellteilung deut­ lich stimuliert ist.Freshly created cells from other organs, e.g. B. the liver, the can only undergo 1-2 cell divisions without treatment after treatment with an Rb antisense oligonucleotide signi fictionally longer cultivated, whereby the cell division indicates is stimulated.

Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht, die Zahl der Zelltei­ lungen pro Zeiteinheit deutlich zu erhöhen. Seine Anwendung ermöglicht auch die Kultivierung von Zellen, die sonst nicht kultivierbar sind. Damit wird sowohl in der biotechnologi­ schen Stoffproduktion als auch in der biologisch-medizini­ schen Grundlagenforschung ein großer Fortschritt ermöglicht. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die Antisense-Nukleotidsequenz zur Stimulierung des Zellwachstums nicht zuzusetzen, sondern in der zu kultivierenden Zelle selbst zu erzeugen. Das ward dadurch erreicht, daß eine Re­ kombinante mit expremierbarer Antisense-Sequenz durch Trans­ fektion in die Zellen eingebracht wird. In diesem Falle be­ steht die bevorzugte Sequenz aus 30-400 Nukleotiden. Zum Einsatz des Mittels werden die folgenden Angaben gemacht: Es wird eine Rekombinante hergestellt, wobei eine ausgewählte Sequenz, bevorzugt 50-400 Nukleotide lang, aus dem betref­ fenden Tumorsuppressor-Gen in antisense-Orientierung hinter einen geeigneten Promoter kloniert wird. Diese Rekombinante wird zusammen mit einem Selektionsmarker nach an sich bekann­ ten Verfahren in die betreffenden Zellen transfiziert. Nach Selektion auf Vorhandensein des Markers (z. B. neo) werden Zellen erhalten, deren Teilungsaktivität deutlich stimuliert ist.The agent according to the invention enables the number of cell parts lungs per unit of time. Its application also enables the cultivation of cells that would not otherwise are cultivable. This is used both in biotechnology fabric production as well as in biological-medical fundamental research makes great progress possible. Another embodiment of the invention is that Antisense nucleotide sequence to stimulate cell growth not to clog, but in the cell to be cultivated generate yourself. This was achieved by a re combined with expressible antisense sequence by trans is introduced into the cells. In this case be the preferred sequence is 30-400 nucleotides. The following information is given on the use of the agent: A recombinant is made, a selected one Sequence, preferably 50-400 nucleotides long, from the subject find tumor suppressor gene in antisense orientation behind a suitable promoter is cloned. This recombinant is known along with a selection marker transfected into the relevant cells. To Selection for the presence of the marker (e.g. neo) Get cells whose division activity is clearly stimulated is.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele nä­ her erläutert werden.The invention is to nä by embodiments forth be explained.

Beispiel 1example 1

Ein Oligonukleotid mit der Sequenz 3′-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5′ wird als Phosphothioat nach bekanntem Verfahren am automati­ schen Syntheseapparat (Applied Biosystems) synthetisiert und getrocknet. Ca. 100 O. D.-Einheiten werden in 100 µl H2O ge­ löst, auf 0,3 M Na-Azetat eingestellt und mit 10 Volumen 96% Äthanol bei -70°C gefällt. Das Präzipitat ward abzentrifu­ giert und in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Nach Messung der Konzentration wird auf 1 µg/µl durch Zugabe von Wasser ver­ dünnt. Von dieser Lösung werden 60 µl in 1 ml Zellkulturme­ dium verdünnt, was einer Konzentration von 10 µM entspricht. Diese Lösung wird auf die zuvor in einer 5 cm-Kulturschale eingesäten Zellen gegeben. Im Beispiel werden HEL-Zellen in einer Dichte von 5×104 Zellen pro Schale verwendet. Es wer­ den je 8 Schalen mit Oligonukleotid und ohne (Kontrolle) an­ gesetzt. Nach einer Stunde wird 1 ml Medium mit 10% Serum zugesetzt. An jedem folgenden Tag werden die Zellen von je­ weils einer Schale geerntet und in einer Zählkammer gezählt. Die Ergebnisse werden grafisch dargestellt (siehe Abb. 1) und zeigen einen deutlich schnelleren Anstieg der Zellzahl vom 2.-10. Tag. Nach 10 Tagen wird eine Subkultur angelegt, die in oben beschriebener Weise erneut mit Oligonukleotid be­ handelt wird. Die erneute tägliche Zellzählung ergibt einen prinzipiell gleichen Kurvenverlauf, wobei die Differenz nach dem 1. und 2. Tag deutlicher erkennbar ist als bei der ersten Runde.An oligonucleotide with the sequence 3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5 'is synthesized and dried as a phosphothioate by a known method on the automatic synthesis apparatus (Applied Biosystems). Approx. 100 OD units are dissolved in 100 µl H 2 O, adjusted to 0.3 M Na acetate and precipitated with 10 volumes of 96% ethanol at -70 ° C. The precipitate was centrifuged off and dissolved in 0.5 ml of sterile water. After measuring the concentration, dilute to 1 µg / µl by adding water. 60 µl of this solution are diluted in 1 ml cell culture medium, which corresponds to a concentration of 10 µM. This solution is applied to the cells previously sown in a 5 cm culture dish. In the example, HEL cells with a density of 5 × 10 4 cells per dish are used. There are 8 dishes with oligonucleotide and without (control). After one hour, 1 ml of medium with 10% serum is added. The following day, the cells are harvested from one dish each and counted in a counting chamber. The results are shown graphically (see Fig. 1) and show a significantly faster increase in the number of cells from the 2nd to the 10th. Day. After 10 days, a subculture is created, which is treated again with oligonucleotide in the manner described above. The renewed daily cell count results in basically the same curve, whereby the difference after the 1st and 2nd day is more clearly recognizable than in the first round.

Beispiel 2Example 2

Ein Oligonukleotid mit der Sequenz 3′-AGCAAGTGAAAATGACTC-5′ wird wie unter 1 beschrieben hergestellt, zur Verwendung vor­ bereitet und der Zellkultur zugesetzt. Die Aufnahme einer Wachstumskurve durch tägliche Zellzählung ergibt einen prin­ zipiell gleichen Kurvenverlauf wie in Abb. 1, wobei nach 10 Tagen nicht 3,5 mal, sondern nur 2,5 mal mehr Zellen vor­ handen sind. An oligonucleotide with the sequence 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5 'is prepared as described under 1, prepared for use and added to the cell culture. The inclusion of a growth curve by daily cell counting results in the same curve as in Fig. 1, whereby after 10 days there are not 3.5 times, but only 2.5 times more cells.

Beispiel 3Example 3

Die beiden Oligonukleotide der Beispiele 1 und 2 werden in Kombination in einer Konzentration von jeweils 5 µM einge­ setzt, und die Zellzahl wird täglich bestimmt. Dabei ergibt sich ein steilerer Kurvenanstieg mit einer 5fachen Zellzahl im Vergleich zu den Kontrollzellen nach 10 Tagen.The two oligonucleotides of Examples 1 and 2 are shown in Combination at a concentration of 5 µM each sets, and the cell count is determined daily. Here results there is a steeper curve increase with a 5-fold cell number compared to the control cells after 10 days.

Claims (13)

1. Mittel zur Stimulierung der Teilungsaktivität tierischer Zellen, gekennzeichnet dadurch, daß es als wirksame Sub­ stanz eine oder mehrere Nukleotidsequenzen mit komplemen­ tärer Sequenz (antisense) zu bestimmten Bereichen der mRNA von Tumorsuppressorgenen oder anderen negativ auf die Zellteilungsaktivität wirkenden Genen enthält.1. Means for stimulating the division activity of animal cells, characterized in that it contains as effective substance one or more nucleotide sequences with complementary sequence (antisense) to certain areas of the mRNA of tumor suppressor genes or other genes which have a negative effect on cell division activity. 2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleotidsequenzen synthetische Oligonukleotide einer Län­ ge von mindestens 15 Nukleotiden, bevorzugt 18-21 Nu­ kleotiden, sind.2. Composition according to claim 1, characterized in that the Nucleotide sequences synthetic oligonucleotides of a Län ge of at least 15 nucleotides, preferably 18-21 nu kleotiden, are. 3. Mittel nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die synthetischen Oligonukleotide in nukleaseresistenter Form vorliegen, bevorzugt als Phosphothioat-Oligonukleo­ tide.3. Composition according to claim 1 and 2, characterized in that the synthetic oligonucleotides in nuclease resistant Form are present, preferably as a phosphothioate oligonucleo tide. 4. Mittel nach Anspruch 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß als Nukleotidsequenz eine Sequenz gewählt wird, die komplementär zu einer Region des 5′-Endes, der Region um das Startcodon, einer Region eines Exons oder einer Region an einem Intron-Exon-Übergang des betreffenden Gens ist.4. Means according to claims 1-3, characterized in that a sequence is selected as the nucleotide sequence which complementary to a region of the 5′-end, the region around the start codon, a region of an exon or a region at an intron-exon junction of the gene in question. 5. Mittel nach Anspruch 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß als Nukleotidsequenzen bevorzugt komplementäre Sequenzen der Tumorsuppressorgene Retinoblastomgen, p53-Gen und E- cadherin ausgewählt werden.5. Composition according to claim 1-4, characterized in that complementary sequences are preferred as nucleotide sequences the tumor suppressor gene retinoblastoma gene, p53 gene and E- Cadherin can be selected. 6. Mittel nach Anspruch 1-5, gekennzeichnet durch die Oligonukleotidsequenzen der Retinoblastom-mRNA mit folgen­ der Bausteinreihenfolge: 3′-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5′ und 3′-AGCAAGTGAAAATGACTC-5′.6. Means according to claims 1-5, characterized by the Follow oligonucleotide sequences of the retinoblastoma mRNA the block order: 3′-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5 ′ and 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5 '. 7. Mittel noch Anspruch 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß die wirksame Substanz in Lösung, vorzugsweise in wäßriger Lösung, vorliegt.7. Means still claims 1-6, characterized in that the active substance in solution, preferably in aqueous Solution. 8. Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 1-6 zur Sti­ mulierung der Teilungsaktivität tierischer Zellen. 8. Use of the agent according to claims 1-6 for Sti simulation of the division activity of animal cells.   9. 3′-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5′.9. 3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5 '. 10. 3′-AGCAAGTGAAAATGACTC-5′.10. 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5 '. 11. Verfahren zur Stimulierung der Zellteilung von tierischen und menschlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel nach Anspruch 1-6 dem Kulturmedium beim Ansetzen der Subkultur in einer Konzentration von 5-30 µM zuge­ setzt wird, ständig im Kulturmedium vorhanden ist und bei Subkultivierung erneut in dieser Konzentration zugesetzt wird.11. Method for stimulating animal cell division and human cells, characterized in that the Agent according to claims 1-6 the culture medium when preparing the subculture in a concentration of 5-30 µM is set, is constantly present in the culture medium and Subcultivation added again in this concentration becomes. 12. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die antisense-Nukleotidsequenz als RNA von einer Rekombinante in der zu kultivierenden Zelle synthetisiert wird, bevor­ zugt als Teilsequenz von 50-400 Nukleotiden.12. Composition according to claim 1, characterized in that the antisense nucleotide sequence as RNA from a recombinant is synthesized in the cell to be cultivated before moves as a partial sequence of 50-400 nucleotides. 13. Mittel nach Anspruch 1 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Rekombinante eine antisense-RNA kodiert, die komple­ mentär zu einem bestimmten Bereich der mRNA ist, der be­ vorzugt im kodierenden Bereich und in einer Region mit fehlender Selbstkomplementarität liegt.13. Composition according to claim 1 and 12, characterized in that the recombinant encodes an antisense RNA, the comple is mental to a specific area of the mRNA that be preferably in the coding area and in a region with lack of self-complementarity.
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