DE4135535A1 - METHOD FOR PRODUCING PEPTIDES AND / OR PROTEINS BASED ON AMINO ACID COVALENT - Google Patents
METHOD FOR PRODUCING PEPTIDES AND / OR PROTEINS BASED ON AMINO ACID COVALENTInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis von mit Aminosäuren kovalent angereicherten Peptiden und/oder Proteinen auf enzymatischem Wege.The invention relates to a method for manufacturing of products based on covalently with amino acids enriched peptides and / or proteins on enzymatic Ways.
Das sich von der enzymatischen Hydrolyse unterscheidende enzymkatalysierte Modifizieren von Proteinen wird seit langem und oft auch heute noch als "Plastein"-Reak tion bezeichnet. Schrifttumsangaben zufolge kann die Plastein-Reaktion für folgende Zwecke benutzt werden:The difference from the enzymatic hydrolysis enzyme-catalyzed modification of proteins for a long time and often still as a "plastein" react tion. According to literature, the Plastein reaction can be used for the following purposes:
- a) Zum Erhöhen der Löslichkeit von Proteinen, zum Ver ändern ihrer physikalischen Eigenschaften und zum Entfernen von bitteren Peptiden.a) To increase the solubility of proteins, to ver change their physical properties and to Remove bitter peptides.
- b) Zum Einbau von limitierenden essentiellen Aminosäuren, zum Entfernen von unerwünschten Farb-, Geruchs- und Geschmackskomponenten, zum Entfernen von uner wünschten Aminosäuren und zur Herstellung von ober flächenaktiven Stoffen (Whitaker, J. R. und Puigserver, A. J.: Advances in Chemistry Series, 198 [1982], Seiten 57 bis 87; Fujimaki, M. und Mitarbeiter: ibid. 160 [1977], Seiten 156 bis 184).b) for the incorporation of limiting essential amino acids, to remove unwanted color, odor and flavor components, for the removal of un desired amino acids and for the production of upper surfactants (Whitaker, J.R. and Puigserver, A.J .: Advances in Chemistry Series, 198 [1982], Pages 57 to 87; Fujimaki, M. and co-workers: ibid. 160 [1977], pages 156 to 184).
Die Reaktion wird im allgemeinen bei 37°C 24 Stunden lang durchgeführt. Die verwendete Protein- bzw. Peptidkon zentration beträgt im allgemeinen 25 bis 50 Gew.-%.The reaction is generally carried out at 37 ° C for 24 hours long done. The protein or peptide con concentration is generally 25 to 50 wt .-%.
Das enzymatische Modifizieren von Proteinen wurde zum Zwecke der Erhöhung des Nährwertes beschrieben. Zum Beispiel wurde der Methioningehalt von Sojaprotein auf diese Weise um 7 Gew.-% erhöht, in Gluten L-Lysin eingebaut und in Proteine photosynthetischer Herkunft kovalent gleichzeitig L-Lysin, L-Methionin und L-Tryptophan eingebaut (Phillips, R. D. und Beuchat, L. R.: ACS Symposium Series, 147 [1981], Seiten 275 bis 298; M. Fujimaki und Mitarbeiter in "Food Proteins: Improvement Through Chemical and Enzymatic Modi fication" [1977], Seite 156).The enzymatic modification of proteins became Described purposes of increasing the nutritional value. For example was the methionine content of soy protein in this way increased by 7% by weight, incorporated in gluten L-lysine and in Proteins of photosynthetic origin covalently at the same time L-lysine, L-methionine and L-tryptophan incorporated (Phillips, R.D. and Beuchat, L.R .: ACS Symposium Series, 147 [1981], Pages 275 to 298; M. Fujimaki and staff in "Food Proteins: Improvement Through Chemical and Enzymatic Modi fication "[1977], page 156).
Für das Sojaprotein wurde von S. Arai und Mitarbeitern (Agric Biol. Chem. 43 (5) [1977], Seiten 1069 bis 1074) ein in einem Schritt ablaufendes Methionin-Einbauverfahren beschrieben.For the soy protein was developed by S. Arai and co-workers (Agric Biol. Chem. 43 (5) [1977], pages 1069 to 1074) a one-step methionine incorporation process described.
In der US-PS 40 16 147 ist ein enzymatisches Verfahren, mit dessen Hilfe Proteine und Peptide mit einem geringen Phenylalaningehalt hergestellt werden können, beschrieben.US Pat. No. 4,016,147 describes an enzymatic process with the help of proteins and peptides with a low Phenylalanine content can be described.
Die Herstellung eines ebensolchen Proteinnährmittels mit verringertem Phenylalaningehalt für an Phenylketonurie leidende Patienten ist in der HU-PS 1 94 487 beschrieben.The production of such a protein food with reduced phenylalanine content for phenylketonuria suffering patients is described in HU-PS 1 94 487.
Das L-Methionin spielt im lebenden Organismus eine besonders wichtige Rolle, einerseits als - in den Lebens mittelproteinen oftmals begrenzt vorliegende - essentielle Aminosäure, andererseits als alleiniges biologisches methylierendes Mittel. Daher muß besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, das fehlende Methionin im Organismus ent sprechend den altersmäßigen und gesundheitlichen Eigen schaften bzw. in einzelnen Streßsituationen rechtzeitig in entsprechender Menge und Weise zu ersetzen.L-methionine plays a role in the living organism particularly important role, on the one hand as - in life medium proteins are often limited - essential Amino acid, on the other hand as the sole biological methylating agent. Therefore special care must be taken be used ent ent missing methionine in the organism speaking of age and health or in time in individual stress situations appropriate amount and way to replace.
Physiologische Versuche zeigten, daß, wenn sich die im Interesse der Steigerung des Nährwertes zum Zwecke der Anreicherung verarbreichten essentiellen Aminosäure nur locker an das Basisprotein binden, diese nicht in befrie digendem Maße absorbiert und biologisch verwertet werden. Im Gegensatz dazu erfolgt eine maximale biologische Ver wertung, gegebenenfalls eine Verwertung als Nährstoff, wenn sich diese Aminosäuren auch kovalent in die Proteine einbauen.Physiological tests showed that if the Interest in increasing the nutritional value for the purpose of Enrichment only processed essential amino acid bind loosely to the base protein, do not freeze it be absorbed and used biologically. In contrast, there is a maximum biological ver evaluation, possibly a utilization as a nutrient, if these amino acids are also covalently in the proteins install.
Die Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis von mit Aminosäuren kovalent angereicherten Peptiden und/oder Proteinen auf enzymatischem Wege, durch welches der Nähr wert der Lebensmittel- und Nährmittelproteine verbessert und ihre Aminosäurezusammensetzung und Struktur geplant modifiziert werden kann und welches die Herstellung von Zielproteinen, die eine bedeutende Rolle bei der Erhaltung der Gesundheit und bei der richtigen Ernährung spielen, ermöglicht, zu schaffen.The invention is therefore based on the object Process for the manufacture of products based on peptides enriched with amino acids and / or Proteins enzymatically, through which the nutrient improved the value of food and nutrient proteins and planned their amino acid composition and structure can be modified and which the production of Target proteins that play a significant role in conservation health and proper nutrition play, enables to create.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Fest stellung, daß das Obige restlos erreicht und der kovalente Aminosäureeinbau gewährleistet werden kann, wenn die einzubau ende(n) Aminosäure(n) in Form eines aktivierten Derivates dem das/die anzureichernde(n) Protein(e) bzw. Peptid(e) ent haltenden Reaktionsgemisch, zugesetzt wird/werden, in welchem mittels einer mit dem Enzym Protease vorgenommenen, gerichteten Proteasenkatalyse ein enzymatisches Peptidmodi fizieren durchgeführt wird.The invention is based on the surprising hard position that the above completely achieved and the covalent Amino acid incorporation can be ensured if the incorporation end (s) amino acid (s) in the form of an activated derivative from which the protein (s) or peptide (s) to be enriched holding reaction mixture, is / are added, in which is carried out using a protease enzyme, directed protease catalysis an enzymatic peptide modes is performed.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis von mit Aminosäuren kovalent angereicherten Peptiden und/oder Proteinen durch Zugabe von 1 oder mehr Aminosäuren zu dem das/die als Substrat verwendete(n), anzureichernde(n) Protein(e) und/oder Peptide(e) enthaltenden Reaktionsgemisch und Iso lieren des/der erhaltenen Produkt[es] sowie des Überschusses an Aminosäurederivat(en) aus dem Reaktionsgemisch, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die einzubauende(n) Aminosäure(n) dem das/die Protein(e) und/oder Peptid(e) enthaltenden Reaktionsgemisch in Form eines aktivierten Derivates bzw. von aktivierten Derivaten zugesetzt wird bzw. werden, wobei mit Hilfe einer mit [einem] Protease- Enzym(en) vorgenommenen, gerichteten Proteasenkatalyse eine enzymatische Peptidmodifizierung durchgeführt wird.The invention therefore relates to a method for Manufacture of products based on amino acids covalently enriched peptides and / or proteins by adding 1 or more amino acids to which the protein (s) to be enriched as substrate and / or peptide (s) containing reaction mixture and iso lation of the product (es) obtained and the excess of amino acid derivative (s) from the reaction mixture, which is characterized in that the to be installed Amino acid (s) to which the protein (s) and / or peptide (s) containing reaction mixture in the form of an activated Derivatives or activated derivatives is added or be, whereby with the help of with a protease Enzyme (s) directed protease catalysis an enzymatic peptide modification is carried out.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die zum Zwecke der Ergänzung oder Anreicherung eingebrachten Amino säuren bzw. die diese tragenden Peptide in die Basis proteinkette eingebaut.The inventive method Purpose of supplementing or enriching brought in amino acids or the peptides carrying them into the base protein chain incorporated.
Gemäß dem Stand der Technik erfolgte die Methioninan reicherung überall ausschließlich zur Erhöhung des Nähr wertes der Proteine, während die Produkte des erfindungs gemäßen Verfahrens auch als für den Organismus physiologisch wichtige, alleinige Methylierungsmittel, welche mit der Nah rung oral in den Körper gelangen können, verwendet werden können. Von besonderer Bedeutung ist dies in einem bestimmten Alter oder zur Zeit von Erkrankungen, wenn der Organismus an einem Mangel an methylierenden Mittel leidet, zum Beispiel in Streßsituationen, im Alter und in geschwächtem Zustand.According to the prior art, the methionine was carried out enrichment everywhere exclusively to increase the nutrient value of the proteins, while the products of the invention according to the method also as physiological for the organism important, sole methylating agent, which with the Nah tion can enter the body orally can. This is particularly important in a particular Age or time of illness when the organism suffers from a lack of methylating agents to Example in stressful situations, in old age and in weakened Status.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird - im Gegensatz zur im Schrifttum beschriebenen Plastein-Reaktion - als enzyma tisches Peptidmodifizieren (EPM) bezeichnet.The inventive method is - in contrast to plastein reaction described in literature - as enzyma called peptide modification (EPM).
In den dem Stand der Technik angehörenden sogenannten "Plastein-Produkten" werden die Kräfte des Zusammenhaltes zwischen den Stamm- und Komplementär-Aminosäuren bzw. zwischen den Peptidketten den Angaben im Fachschrifttum zufolge durch hydrophobe, van der Waals′sche und Ionen-Bin dungen (Salzbindungen) gewährleistet, während in den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkten die eingebauten Aminosäuren über kovalente Bindungen gebunden sind, was auf verschiedene Weise, so auch auf ana lytischem Wege, nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zur im Schrifttum oftmals beobachteten, im Falle der "Plastein- Produkte" charakteristisch zu erwartenden Erhöhung der durchschnittlichen Molekülmase (gegenüber der durchschnitt lichen Molekülmasse des Ausgangs-Hydrolysates) konnte beim erfindungsgemäßen Verfahren keine signifikante Erhöhung der durchschnittlichen Molekülmasse der Produkte festgestellt werden.In the so-called prior art "Plastein products" become the forces of cohesion between the parent and complementary amino acids or between the peptide chains the information in the specialist literature according to hydrophobic, van der Waals'sche and ion bin guarantees (salt bonds), while in the with products produced by the process according to the invention the built-in amino acids via covalent bonds what is bound in different ways, including ana lytic way, can be demonstrated. In contrast to often observed in literature, in the case of "plastic Products "characteristic increase to be expected average molecular mass (compared to the average molecular mass of the starting hydrolyzate) could method according to the invention no significant increase in average molecular weight of the products will.
Als aktivierte[s] Derivat(e) der einzubauenden Amino säure(n) kann/können [ein] solche[s] von [einer jeden] beliebigen Aminosäure(n) eingesetzt werden. Vorzugsweise wird/werden als aktivierte[s] Derivat(e) der einzubauenden Aminosäure(n) [ein] solche[s] einer essentiellen Aminosäure bzw. von essentiellen Aminosäuren verwendet. Insbesondere wird/werden als aktivierte(s) Derivat(e) der einzubauenden Aminosäure(n) [ein] kleingliedrige[s] Peptid(e) verwendet.As activated derivative (s) of the amino to be incorporated acid (s) can be used by anyone any amino acid (s) can be used. Preferably will be / are the activated derivative (s) of the to be installed Amino acid (s) of an essential amino acid or used of essential amino acids. In particular will be / are the activated derivative (s) of the to be installed Amino acid (s) [small] peptide (s) used.
Es ist auch bevorzugt, als aktivierte(s) Derivat(e) der einzubauenden Aminosäure(n) [ein(en)] Ester, Thioester, Anhydrid oder andere[s] aktive[s] Acylderivat(e), gegebenen falls in Salzform, zu verwenden.It is also preferred as the activated derivative (s) of amino acid (s) to be incorporated [an (es)] ester, thioester, Anhydride or other active acyl derivative (s) if in salt form.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als aktiviertes Aminosäure derivat L-Methionin-äthylester verwendet.According to a particularly advantageous embodiment of the The inventive method is used as an activated amino acid Derivative L-methionine ethyl ester used.
Die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor zugsweise bei einer Temperatur von 37±15°C und einem pH- Wert von 4,0 bis 8,5 unter Verwendung eines Mengenanteiles des Substrates von 10 bis 25 Gew.-%, bezogen auf das Reak tionsgemisch, und eines Mengenanteiles des/der Aminosäure derivate(s) von ½ bis ¼₀, bezogen auf das Substrat und berechnet als Aminosäure, während 2 bis 16 Stunden. The implementation of the inventive method is before preferably at a temperature of 37 ± 15 ° C and a pH Value from 4.0 to 8.5 using a proportion of the substrate from 10 to 25 wt .-%, based on the reak tion mixture, and a proportion of the amino acid (s) derivatives (s) from ½ to ¼₀, based on the substrate and calculated as an amino acid for 2 to 16 hours.
A Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren als Substrat der enzymatischen Peptidmodifizierungsreaktion [EPM-Reaktion] eingesetzte[s] Protein(e) [ein] solche[s] pflanzlichen Ursprunges, [ein] Einzellprotein(e), [ein] Milchprotein(e) {bzw. mittels einer Teilhydrolyse derselben gewonnene[s] "vorzerlegte[s]" Milchprotein(e)}, [ein] aus der industriellen Verarbeitung stammende[s] Protein- Nebenprodukt(e) und/oder [ein] nicht konventionelle[s] Protein(e) verwendet. Hinsichtlich der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung von [einem] teilweise vorverdauten, "vorzerlegten" Milchprotein(en) bzw. nativen Milchprotein(en), wie Casein und/oder Molken protein(en) als Substrat von Vorteil.A In the process according to the invention, preference is given to Substrate of the enzymatic peptide modification reaction [EPM reaction] protein (s) used [such] of vegetable origin, [a] single-cell protein (s), [a] Milk protein (s) {or by means of partial hydrolysis of the same obtained "pre-cut" milk protein (s), [a] protein from industrial processing By-product (s) and / or [a] non-conventional [s] Protein (s) used. Regarding the implementation of the The inventive method is the use of [a] partially pre-digested, "pre-decomposed" milk protein (s) or native milk protein (s) such as casein and / or whey protein (s) is an advantage as a substrate.
Zur Durchführung der Reaktion der enzymatischen Peptid modifizierung (EPM) wird/werden zweckmäßig als Protease(n) das/die Enzym(e) [eine] Endo- und/oder Exopeptidase(n) und/oder Transpeptidase(n) verwendet. Bevorzugt wird/werden als Protease(n) [eine] in der Lebensmittelindustrie oder für die Herstellung von Nährmitteln zugelassene Protease(n), insbesondere α-Chymotrypsin, Papain, Trypsin, Pepsin, Pronase, Alkalase und/oder Carboxypeptidase in beliebigem Gewichtsverhältnis und beliebiger Reihenfolge verwendet.To carry out the reaction of the enzymatic peptide modification (EPM) is / will be useful as protease (s) the enzyme (s) [an] endo- and / or exopeptidase (s) and / or transpeptidase (s) used. Is / will be preferred as protease (s) in the food industry or Protease (s) approved for the production of nutrients, in particular α-chymotrypsin, papain, trypsin, pepsin, pronase, Alkalase and / or carboxypeptidase in any Weight ratio and any order used.
Das Isolieren der Produkte des erfindungsgemäßen Ver fahrens bzw. des Überschusses an dem/den verwendeten Amino säurederivat(en) aus dem Reaktionsgemisch kann mit Hilfe bekannter Trennverfahrensweisen, wie Dialyse, Lyophilisieren, Ultrafiltrieren, Membrantrennung bzw. deren Kombination, durchgeführt werden.Isolating the products of the invention driving or the excess of the amino (s) used acid derivative (s) from the reaction mixture can with the help known separation procedures, such as dialysis, lyophilization, Ultrafiltration, membrane separation or their combination, be performed.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Produkte können hauptsächlich auf folgenden Gebieten Ver wendung finden:The manufactured by the inventive method Products can mainly be used in the following areas: find application:
- I) Herstellung von Proteinen mit einer harmonischen Aminosäurezusammensetzung (Herstellung von sogenannten "Zielproteinen"), insbesondere für Nähr mittel (Säuglings- und Kindernahrung).I) Production of proteins with a harmonic Amino acid composition (production of so-called "target proteins"), especially for nutrients medium (baby and child food).
-
II) Herstellung von mit Methionin angereicherten
Proteinprodukten
- a) für in Streßsituationen stehende Personen,
- b) als Radikalfänger auf natürlicher Basis, als Entgifter sowohl zur Prophylaxe als auch zur Heilung von Schäden karzinogenen Charakters,
- c) zur Heilung von Leberkranken und Alkoholikern und
- d) zur Gewährleistung des für den Organismus notwendigen methylierenden Mittels.
- a) for people in stressful situations,
- b) as a radical scavenger on a natural basis, as a detoxifier both for the prophylaxis and for the healing of damage of carcinogenic character,
- c) for the healing of liver patients and alcoholics and
- d) to ensure the methylating agent necessary for the organism.
-
III) Herstellung von der Befriedigung spezieller Bedürf
nisse dienenden diätetischen Produkten, Lebensmittel
mit Heilwirkung
- a) als nach Operationen zu verabreichende, leicht verdauliche Proteine mit entsprechender Amino säurezusammensetzung,
- b) als die Absorption von Medikamenten ver zögernde Proteinkomponente,
- c) als Nährmittel im Alter und
- d) als die Kondition erhöhende Mittel, allgemeine Roborantia für Sportler.
- a) as easily digestible proteins to be administered after operations with a corresponding amino acid composition,
- b) as protein component retarding the absorption of medicaments,
- c) as a nutrient in old age and
- d) as a condition-increasing agent, general Roborantia for athletes.
- IV) Als Zusatzstoffe in der Lebensmittelindustrie.IV) As additives in the food industry.
Darüber hinaus können bestimmte nach dem erfindungsge mäßen Verfahren hergestellte Produkte auch in der Tier zucht, beispielsweise als zur Fütterung von Fasanen oder Kälbern dienende Futtermittel bzw. in der Pelztierzucht, Verwendung finden.In addition, certain according to the Invention Products manufactured in accordance with the method also in animals breeding, for example as for feeding pheasants or Feed used for calves or in fur farming, Find use.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die durch dieses hergestellten Produkte haben die folgenden wichtigsten Vorteile:The method according to the invention and by this Manufactured products have the following main ones Advantages:
- A) Es wird der kovalente Einbau der zugesetzten Aminosäuren ermöglicht, wodurch sich die biolo gische Verwertung des Produktes, seine Verwertung als Nährstoff bedeutend verbessert.A) It is the covalent incorporation of the added Allows amino acids, whereby the biolo recycling of the product, its recovery significantly improved as a nutrient.
- B) Es wird die Verbesserung des Nährwertes von Lebensmittel- und Nährmittelproteinen ermöglicht.B) It will improve the nutritional value of Food and nutrient proteins enabled.
- C) Es wird das geplante Modifizieren der Aminosäure zusammensetzung und Struktur der Lebensmittel- und Nährmittelproteine sowie die Herstellung von sogenannten Zielproteinen für Säuglings- und Kindernahrung ermöglicht.C) It will be the planned modification of the amino acid composition and structure of food and Nutritional proteins and the production of so-called target proteins for infants and Allows children's food.
- D) Die Produkte können eine bedeutende Rolle bei der Erhaltung der Gesundheit und bei der richtigen Ernährung spielen.D) The products can play a significant role in maintaining health and being correct Play nutrition.
- E) Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von mit Methionin angereicherten Protein produkten, die vorteilhaft bei der Behandlung von Leberkranken und Alkoholikern sowie von an Krebs erkrankungen leidenden Patienten verwendet werden können. E) The method according to the invention enables Production of protein enriched with methionine products that are beneficial in the treatment of Liver patients and alcoholics as well as from cancer patients suffering from diseases can be used can.
- F) Es wird die Verwendung von in der Tierzucht vorteil haft anwendbaren Futtermitteln und Futterzusätzen ermöglicht.F) The use of animal breeding is advantageous feed and feed additives that can be used enables.
- G) Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch im technischen Maßstab bzw. Industriemaßstab durchführbar.G) The method according to the invention is also technical Scale or industrial scale feasible.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated by the following examples explained in more detail.
8 g Casein (Hersteller: Hammersten) wurden in destilliertem Wasser gelöst, der pH der Lösung wurde mit etwa 75 ml 0,1 m NaOH auf 7,5 eingestellt; das Endvolumen betrug 800 ml. Es wurden 80 mg α-Chymotryp sin (Hersteller: Sigma, St Louis, USA) zugesetzt, und die Suspension wurde mit einem Magnetrührer bei 37°C eine Stunde lang gerührt, dann eingefroren und lyophilisiert.8 g of casein (manufacturer: Hammersten) were in distilled water, the pH of the solution was adjusted to 7.5 with about 75 ml of 0.1 M NaOH; the Final volume was 800 ml. There were 80 mg of α-chymotryp sin (manufacturer: Sigma, St Louis, USA) added, and the suspension was added with a magnetic stirrer Stirred at 37 ° C for one hour, then frozen and lyophilized.
25 g des so hergestellten Hydrolysats wurden mit destilliertem Wasser suspendiert, es wurden 21,1 g L-Methionin-methylester-hydrochlorid zugesetzt, das Gemisch wurde gut verrührt, und es wurden einige ml destilliertes Wasser zugegeben. Der pH wurde mit etwa 20 ml 0,1 m NaOH auf 6,0 eingestellt, dann wurde mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml aufgefüllt. Es wurden 250 mg α-Chymotrypsin (Hersteller: Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Deutsch land) zugesetzt und verrührt. Dann wurde das Gemisch ohne Rühren bei 37°C 16 Stunden lang bebrütet. Das gelierte Produkt wurde 48 Stunden lang dialysiert, um den Überschuß an Methionin-Derivat zu entfernen, dann eingefroren und lyophilisiert.25 g of the hydrolyzate thus prepared were mixed with distilled water suspended, there were 21.1 g L-methionine methyl ester hydrochloride added, the The mixture was stirred well and a few ml distilled water added. The pH was around 20 ml of 0.1 M NaOH was adjusted to 6.0, then was with distilled water to a volume of 100 ml replenished. There were 250 mg of α-chymotrypsin (Manufacturer: Serva Feinbiochemica, Heidelberg, German land) added and stirred. Then the mixture incubated for 16 hours at 37 ° C without stirring. The gelled product was dialyzed for 48 hours, to remove the excess methionine derivative, then frozen and lyophilized.
10 kg Casein wurden in 1000 l Wasser suspendiert, dann wurde der pH mit verdünnter Salzsäure auf 1,6 eingestellt. Danach wurde mit 100 g Pepsin bei 37°C 2 Stunden lang hydrolysiert. Während der gesamten Reaktionszeit wurde das Reaktionsgemisch ständig gerührt. Danach wurde der pH der Suspension mit NaOH auf 6,0 eingestellt, dann wurde mit Papain wie oben beschrieben eine erneute Hydrolyse vorgenommen.10 kg of casein were suspended in 1000 l of water, then the pH was adjusted to 1.6 with dilute hydrochloric acid set. Thereafter, with 100 g of pepsin at 37 ° C. Hydrolyzed for 2 hours. Throughout the entire The reaction time became constant touched. After that, the pH of the suspension was adjusted with NaOH set to 6.0, then using papain as above described a renewed hydrolysis.
Die Konzentration des so hergestellten Substrats betrug 300 kg/cm³, das Gewichtsverhältnis Enzym/Sub strat 1 : 100, die Bebrütungstemperatur 37°C, der pH 6,0 und die Bebrütungszeit - ohne Rühren und Schütteln - 16 Stunden. Zum Einbau der Aminosäure betrug das Gewichtsverhältnis L-Methionin-methylester/Substrat 5 : 100. Der Methionineinbau erfolgte mit dem Enzym Pronase (Hersteller: Calbiochem, Palo Alto, USA bzw. Serva) und α-Chymotrypsin (Hersteller: Sigma) sowie mit Papain. In letzterem Fall wurde L-Cystein als Aktivator des Papains verwendet.The concentration of the substrate so produced was 300 kg / cm³, the weight ratio enzyme / sub strat 1: 100, the incubation temperature 37 ° C, the pH 6.0 and the incubation time - without stirring and shaking - 16 hours. To incorporate the amino acid was the weight ratio of L-methionine methyl ester / substrate 5: 100. The methionine was incorporated with the enzyme Pronase (manufacturer: Calbiochem, Palo Alto, USA or Serva) and α-chymotrypsin (manufacturer: Sigma) as well as with papain. In the latter case, it became L-cysteine used as an activator of papain.
16 g Casein wurden in destilliertem Wasser gelöst, der pH der Lösung wurde auf 7,5, das Endvolumen auf 800 ml eingestellt, dann wurde unter Zugabe von 160 mg α-Chymotrypsin (Hersteller: Serva) hydroly siert. Die Reaktionszeit betrug bei einer Temperatur von 37°C eine Stunde.16 g of casein were in distilled water dissolved, the pH of the solution was 7.5, the final volume adjusted to 800 ml, then was added with 160 mg α-chymotrypsin (manufacturer: Serva) hydroly siert. The reaction time was at one temperature from 37 ° C an hour.
25 g des so hergestellten Hydrolysats wurden in destilliertem Wasser suspendiert, es wurden 21,1 L-Methionin-methylester-hydrochlorid zugesetzt, der pH wurde auf 6,0, das Endvolumen des Gemisches auf 100 ml eingestellt, dann wurde mit 250 mg α-Chymotrypsin (Hersteller: Serva) bei 37°C 16 Stunden lang bebrütet. Das erhaltene gelierte Produkt wurde dialysiert, dann lyophilisiert.25 g of the hydrolyzate thus prepared were in distilled water, there were 21.1 L-methionine methyl ester hydrochloride added, the pH was brought to 6.0, the final volume of the mixture to 100 ml then stopped with 250 mg of α-chymotrypsin (Manufacturer: Serva) incubated at 37 ° C for 16 hours. The resulting gelled product was dialyzed, then lyophilized.
Casein wurde in 1 gew.-%iger wäßriger Lösung mit Alkalase (Hersteller: Novo Nordisk, Dänemark) 2 Stunden lang bei 55°C und einem pH von 8,5 hydrolysiert. Nach zweistündigem Rühren wurde der pH des Gemisches mit Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Es wurde 5 Minuten lang bei 85°C wärmebehandelt, dann lyophilisiert.Casein was alkalized in 1% by weight aqueous solution (Manufacturer: Novo Nordisk, Denmark) for 2 hours 55 ° C and a pH of 8.5 hydrolyzed. After two hours The pH of the mixture was stirred with hydrochloric acid set to 6.0. It was at 85 ° C for 5 minutes heat treated, then lyophilized.
Bei der Durchführung der Reaktion wurde der pH mit NaOH-Lösung auf 6,9 eingestellt und das wie oben her gestellte Hydrolysat in einer Konzentration von 12,7 Gew.-% verwendet. Es wurde auf 330,2 g Hydrolysat- Trockenmaterial bezogen 63,9 g L-Methionin- äthylester sowei 8 ml Alkalase (Hersteller: Novo) zum obigen Hydrolysat gegeben. Sowohl der Ester als auch das Enzym wurden dem Reaktionsgemisch in gelöstem Zustand zugesetzt. When carrying out the reaction, the pH was adjusted to NaOH solution adjusted to 6.9 and as above provided hydrolyzate in a concentration of 12.7 wt .-% used. It was made up to 330.2 g of hydrolyzate Dry material sourced 63.9 g L-methionine ethyl ester and 8 ml alkalase (manufacturer: Novo) for given above hydrolyzate. Both the ester as well the enzyme was dissolved in the reaction mixture Condition added.
Als Substrat wurde das Papain-Hydrolysat von Eiweiß verwendet. Das Eiweiß war in manchen Versuchen frisch, in anderen Versuchen lyophilisiert, getrocknet, tief gefroren oder strahlenbehandelt.The papain hydrolyzate of protein was used as the substrate used. The protein was fresh in some trials, in other experiments lyophilized, dried, deep frozen or radiation treated.
Die enzymatische Peptidmodifizierungsreaktion ging wie folgt vonstatten: 15 g Eiweiß-Hydrolysat wurden 6 Stunden lang bei 37°C in 100 ml Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 in Gegenwart von Papain und 9,75 g L-Methionin-äthylester bebrütet.The enzymatic peptide modification reaction proceeded as follows 15 g of protein hydrolyzate were in at 37 ° C. for 6 hours 100 ml of buffer with a pH of 6.0 in the presence incubated by papain and 9.75 g of L-methionine ethyl ester.
16 g Promine-E 500 (Hersteller: Purina Proteins B. V., Puurs, Belgien) wurden in 800 ml destilliertem Wasser suspendiert, dann erfolgte mit 80 mg α-Chymotrypsin die Verdauung 2 Stunden lang bei einem pH von 7,5. Das erhaltene Produkt wurde lyophilisiert.16 g Promine-E 500 (manufacturer: Purina Proteins B. V., Puurs, Belgium) were in 800 ml of distilled water suspended, then with 80 mg of α-chymotrypsin digestion at pH 7.5 for 2 hours. The the product obtained was lyophilized.
2,0 g des Produktes, 1,8 g L-Methionin-äthylester und 20 mg α-Chymotrypsin wurden 10 Stunden lang bei einem pH von 6,0 und bei 37°C ohne Rühren bebrütet.2.0 g of the product, 1.8 g of L-methionine ethyl ester and 20 mg of α-chymotrypsin was given to one for 10 hours pH of 6.0 and incubated at 37 ° C without stirring.
Zur Herstellung eines Nährmittels auf Milchprotein- Basis und mit einer harmonischen Zusammensetzung von essentiellen Aminosäuren wurde als Ausgangssubstrat der enzymatischen Peptidmodifizierungsreaktion ein in Ungarn produ ziertes, unter dem Namen Sportrobi® im Handel befindliches, enzy matisch vorzerlegtes Milchprotein (Hersteller: EGIS Lacta, Körmend) verwendet.To make a nutrient based on milk protein Basis and with a harmonious composition of essential amino acids was used as the starting substrate the enzymatic peptide modification reaction a produ in Hungary adorned, enzy under the name Sportrobi® matically decomposed milk protein (manufacturer: EGIS Lacta, Körmend) used.
Die Anreicherung des enzymatisch vorzerlegten Milch protein-Präparates mit L-Methionin hatte zum Ziel, die diätetischen Vorteile eines leicht verdaulichen, enzy matisch vorhydrolysierte Proteins durch Annäherung an ein harmonisches Verhältnis an essentiellen Aminosäuren noch zu erhöhen.Enrichment of enzymatically pre-broken milk protein preparations with L-methionine aimed at that dietary benefits of an easily digestible, enzy matically pre-hydrolyzed protein by approximation a harmonious ratio of essential amino acids still increase.
Die Versuche erfolgten einerseits a) mit einem vorher nicht hydrolysierten, andererseits b) mit einem einer weiteren zweistündigen Papain-Hydrolyse unter worfenen Milchprotein-Präparat. Als einzubauendes Amino säure-Derivat wurde dem Reaktionsgemisch in beiden Fällen L-Methionin-äthylester zugesetzt. Das Ausmaß der Methioninanreicherung ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.The tests were carried out on the one hand a) with a previously not hydrolyzed, on the other hand b) with a another two-hour papain hydrolysis under thrown milk protein preparation. As an amino to be installed Acid derivative was added to the reaction mixture in both Cases of L-methionine ethyl ester added. The extent The methionine enrichment is in the table below summarized.
Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, konnte die größte L-Methioninanreicherung mit der enzymatischen Peptidmodifie rungsreaktion des durch zweistündige Papain-Hydrolyse erhaltenen Hydrolysates erreicht werden, den in der von der FAO/WHO gemeinsam herausgegebenen Empfehlung angeführte L-Methionin-Gewichtsanteil übersteigen jedoch schon die 4,6 Gew.-% (bei der Verwendung des vorverdauten Milchproteins).As can be seen from the table, the greatest L-methionine enrichment with the enzymatic peptide modification reaction of papain hydrolysis for two hours Hydrolysates can be achieved in a manner shared by the FAO / WHO published L-methionine weight percentage however, already exceed the 4.6% by weight (when using the pre-digested milk protein).
L-DOPA (3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin) wurde in aktivierter Form als L-DOPA-äthylester in die Casein- Hydrolysate eingebaut. Das Reaktionsgemisch enthielt auf die Substratmenge bezogen ¹/₅ Gew.-Teil L-DOPA- äthylester.L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) was found in activated form as L-DOPA ethyl ester in the casein Hydrolyzates installed. The reaction mixture contained based on the amount of substrate ½ part by weight of L-DOPA ethyl ester.
Die Versuche erfolgten mit zweierlei Enzymen, und zwar indem das L-DOPA a) in das durch vierstündige α-Chymo trypsin-Hydrolyse des Caseins erhaltene Hydrolysat mit α-Chymo trypsin und Alkalase bzw. b) in das durch ein- und zweistündige Alkalase-Hydrolyse des Caseins erhaltene Hydrolysat eingebaut wurde.The experiments were carried out with two types of enzymes, and namely by the L-DOPA a) in the by four-hour α-chymo trypsin hydrolysis of the casein obtained hydrolyzate with α-chymo trypsin and alkalase or b) in that by one and two hours Alkalase hydrolysis of the casein hydrolyzate obtained was incorporated.
Für die Versuche wurde mittels geregelter Autolyse teilweise hydrolysiertes Hefeprotein bzw. eine mittels Ultraschall-Zellaufschließung gewonnene Proteinfraktion verwendet. Aus dem lyophilisierten Substrat wurde eine Lösung mit einer Konzentration von 200 g/l bzw. 400 g/l bereitet. Das L-Methionin wurde in Form des Äthylesters, als Katalysator wurden α-Chymotrypsin, Carboxypeptidase bzw. das eigene Carboxypeptidase- Enyzm der Hefe verwendet. Aus dem Produkt wurde das nicht eingebaute L-Methionin mittels Dialyse entfernt.Regulated autolysis was used for the experiments partially hydrolyzed yeast protein or one Ultrasound cell disruption protein fraction obtained used. The lyophilized substrate became a solution with a concentration of 200 g / l or 400 g / l. The L-methionine was in the form of the ethyl ester, α-chymotrypsin, Carboxypeptidase or your own carboxypeptidase Enyzm of yeast used. The product didn't built-in L-methionine removed by dialysis.
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