DE4115029A1 - Hochdichtes, hochkonzentriertes medium fuer die zuechtung von tierischen zellen - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft ein hochdichtes bzw. ein hochkonzentriertes Medium zur Kultivierung und Züchtung von tierischen Zellen.

In den letzten Jahren hat der Fortschritt in ver­ schiedenen Techniken der Zellzüchtung, die meist auf der Anwendung von Ruhigstellungsmethoden beruhten, es ermöglicht, daß hochdichte Kulturen von Säugetierzellen in vitro künstlich angelegt werden konnten (Merten, O. W. Concentrating Mam­ malian Cells. I. Large Scale Animal Cell Culture. Trends Biotechnol. 5, 230-237 (1987); Altshuler, G. L. et al. Continuous Hybridoma Growth and Monoclonal Antibody Production in Hollow Fiber Reactors-Separators. Biotechnol. Bioeng. 28, 646-658 (1986); Jarvis, A. P. et al. Cell Growth and Hemoglobing Synthesis in Murine Erythro­ leukemic Cells propagated in High Density Micro­ capsule Culture. In Vitro 22 (10), 589-596 (1986); Velez, D. et al. Comparison of Cell Propagation Methods for Their Effect on Monoclonal Antibody Yield in Fermenters. J. Immunol. Methods 86, 61-69 (1986); Shirai, Y. et al. Continuous Production of Monoclonal Antibody with Immobilized Hybridoma Cells in an Expanded bed fermenter. Appl. Micro­ biol. Biotechnol. 26, 495-499 (1987); Konrad, W. G. & Hubertus, A. Medium für die Züchtung von mensch­ lichen und/oder tierischen Zellen in einem Fermenter. European Patent EP 02 05 790 (Dec. 30. 1986); Putnam, J. E. Monoclonal Antibody Production in a Ceramic Matrix. In: Commercial Production of Monoclonal Antibodies, Seaver, S. S. (Ed.). Marcel Dekker, New York, pp. 119-138 (1986)).

Indessen waren diese Techniken insbesondere ent­ wickelt worden, um die zugrundeliegenden komplexen Probleme der Zellen in vitro zu umgehen. Andererseits haben diese Techniken grundlegend einige Probleme mit der Fluid-Dynamik. Auf der anderen Seite bietet die Suspensionsmethode der Züchtung solche Probleme relativ gesehen nicht und hat viele grundlegende Vorteile für die industri­ elle Anwendung von Zellkulturen von Säugetieren. Außerdem ist es vielleicht eine bessere Methode, einige Probleme dadurch zu kontrastieren, daß man in vivo Zellmerkmale in vitro realisiert und daß es vielleicht ein besseres Mittel für die Lösung dieser Probleme ist (Dodge, T. C. et al. Loss of viability in Hybridoma Cell Culture - A Kinetic Study. Enzyme Microb. Technol. 9, 607-611 (1987); Backer, M. P. et al. Large-Scale Production of Monoclonal Antibodies in Suspension Culture. Bio­ technol. Bioeng. 32, 993-1000 (1988)).

Viele früheren Versuche wurden mit der Erwartung durchgeführt, daß der kombinierte Zusatz von Ener­ giequellen, Aminosäuren und Vitaminen zu einer Steigerung der maximalen lebensfähigen Zelldichte über die entscheidende Konzentration führen würde, d. h. um (1-3)·10⁶ Zellen/ml in Batch-Kulturen (Birch, J. R. & Boraston, R. G. Animal Cell Culture. PCT Patent WO 87/00 195 (Jan. 15, 1987); Luan, Y. T. et al. Strategies to Extend Longevity of Hybrido­ mas in Culture and Promote Yield of Monoclonal Antibodies. Biotechnol. Lett. 9 (10), 691-696 (1987); Howarth, W. et al. Cell Culture Medium for Enhanced Cell Growth, Culture Longevity and Product Expression. PCT Patent WO 90/03 430 (April 5, 1990)).

Nichtsdestoweniger gelang mit diesen Versuchen nur, die stationäre Phase des Hybridoma-Wachstums zu verlängern, was zu einem relativen Anstieg in der Gesamt-Produktergiebigkeit führte. Man schloß überstürzt, daß die Nichtübereinstimmung mit der anfänglichen Erwartung unangemessen war, ohne jede wissenschaftliche Erklärung. Angesichts des in vivo aufrechterhaltenen Ernährungsgleichgewichts scheinen indessen jene Methoden das Gleichgewicht und verschiedene wichtige grundlegende Bedingungen für die Zellvermehrung in vitro unbeachtet zu lassen und sie benötigen ein nährstoffverstärktes Medium, das für hochdichte Kulturen geeignet ist.

Im Prinzip entwickeln sich komplexe Wechselwirkun­ gen zwischen Komponenten, die den individuellen Wachstumsanforderungen eines gegebenen Zelltyps entsprechen. Unter Bedingungen eines fast optima­ len Wachstums wird der Umfang der Zellmultiplika­ tion bestimmt durch einen ersten Begrenzungsfaktor (Ham, R. G. Formulation of Basal Nutrient Media. In: Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology. Vol. 1. Barnes, D. W., Sirbasku, D. A. & Sato, G. H. (Eds.) Alan R. Liss Inc., New York, pp. 3-21 (1984)) . Daher glauben wir, daß der gesamten Nährstoffbetrachtung die Verwirklichung der Zell­ merkmale in vivo, einer in vitro vorausgehen soll­ te. Indessen könnte dies eine zu starke Verein­ fachung sein, wenn wir uns nur auf einige Nähr­ stoffe oder auf empirische Regeln bei der Unter­ suchung verschiedener Kombinationen von Nährstoff­ zusätzen verlassen. Schließlich ist es entschei­ dend, alle Komponenten für den Bau eines hochdich­ ten Kulturen-Mediums in ein Gleichgewicht zu bringen.

In dieser Erfindung haben wir schlagende Beweise offengelegt, daß Säugetierzellen mit typischen Merkmalen eines Zellenwachstums kultiviert bzw. gezüchtet werden können bis fast 1·10⁷ Zellen/ml durch die Verstärkung aller Komponenten eines konventionellen Zellkulturmediums. Unsere Ver­ suchsbeispiele, die im einzelnen in bevorzugten Ausführungsarten der Erfindung beschrieben werden, weisen nach, daß eine zeitgemäße Formel eines Zellkulturmediums neu formuliert und weiter ausge­ wogen für hochdichte/hochkonzentrierte Kulturen verstärkt werden könnten, wenn die Unwirksamkeit der Nährstoffverwendung in vitro erkannt ist. Auch kann die Mediumverstärkung uns in die Lage ver­ setzen, die physiologischen Aspekte von Säugetier­ zellen in vivo durch Simulierung eines realen Systems zu untersuchen. Zum Beispiel sollte die zweifelhafte Wirkung sog. Hemm-Metaboliten, wie Milchsäure und das Ammonium-Ion, neu mit Hilfe der Anwendung dieses realen Systems durchforscht werden. Unsere Versuchsergebnisse zeigen, daß der schlüssige Faktor, der die Zellen hindert, über die kritische Dichte hinaus zu wachsen, nicht jene hemmenden Metaboliten sind, weil die kritische Zelldichte durch die ausgewogene, verstärkte Nährstoffzugabe überwunden wird.

Die Suspensionskulturmethode bietet viele grund­ legende Vorteile im scale-up. Weitere Studien und die Anwendung dieser Nährstoffverstärkungs­ methode beim scale-up mit den Vorteilen der Sus­ pensionskulturmethode würden einen einfachen und verbesserten Weg für die industrielle Anwendung des hochdichten Suspensionskultursystems schaffen.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Entwicklung von aus­ gewogen verstärkten hochdichten Medien für tieri­ sche Zellkulturen und für die Erzielung einer hochdichten Suspensionskultur unter Verwendung besagter Medien.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstel­ lung einer Reihe von hochdichten Medien (MBRI 40-01, 40-02 und 40-03), in denen alle Nährstoff­ komponenten des herkömmlichen RPMI 1640 Mediums außer (den) inorganischen Salzen verstärkt wurden, wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, und sie betrifft Verfahren der hochdichten Suspensionszellkulturen, die besagte Medien verwenden.

Diese Erfindung bringt höhere Werte für die Her­ stellung verschiedener Pharmazeutika und biolo­ gisch aktiver Substanzen, die über tierische Zell­ kulturen produziert werden, dadurch, daß hoch­ dichte Zellkulturen in diesen Verfahren verwendet werden.

Diese Erfindung minimiert in vorteilhafter Weise die Probleme während des scale-up für großtechni­ sche Verfahren, indem sie die Vereinfachung und die Reduzierung von herkömmlichen Züchtungsprozes­ sen und Reinigungsschritten hiervon ermöglichen.

Diese Erfindung unterscheidet sich von den her­ kömmlichen hochdichten Züchtungsprozessen wie dem Perfusions-Verfahren dadurch, daß die Erfindung nur die Serie besagter hochdichter Medien verwen­ det und daher eine hochdichte Zellzüchtung ohne jede anderen Geräte möglich macht und speziell für die hochdichte Zellzüchtung bestimmt sind.

Infolgedessen ist eine bemerkenswerte Reduzierung von Investitionen und Unterhaltungskosten für Spezialgeräte durchaus erklärlich.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt Wachstumsprofile von Hybridoma 2c3.1 in einem RPMI 1640 Medium und in den nährstoffver­ stärkten MBRI 40-01 & 40-02 Medien.

Fig. 2 zeigt Produktionsprofile von monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern, hergestellt durch Hybridoma 2c3.1 in einem RPMI 1640 Medium und in den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 Medien.

Fig. 3 zeigt Wachstumsprofile eines menschlichen akuten lymphoblastischen Leukämie-CCRF-CEM in einem RPMI 1640 Medium und in den nährstoffver­ stärkten MBRI 40-01 & 40-02 Medien.

Fig. 4 zeigt Wachstumsprofile eines menschlichen Myelom RPMI 8226 in einem RPMI 1640 Medium und in den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 & 40-02 Medien.

Fig. 5 zeigt das Rest-Glukose-Konzentrationsprofil während der "fed-batch"-Züchtung von Hybridoma 2c3.1 unter Verwendung von MBRI 40-02 & 40-03 Medien und des Ernährungsplans des Ernährungs­ mediums dabei.

Fig. 6 zeigt ein Wachstumsprofil von Hybridoma 2c3.1 während der "fed-batch"-Züchtung unter Verwendung von MBRI 40-02 & 40-03 Medien.

Fig. 7 zeigt ein Produktionsprofil von Anti-HBs, hergestellt während der "fed-batch"-Züchtung von Hybridoma 2.c3.1 unter Verwendung von MBRI 40-02 & 40-03 Medien.

Beim ersten Schritt in Richtung einer ausgewogenen Verstärkung des RPMI 1640 Medium für eine hoch­ dichte Hybridoma-Kultur nahmen wir die ursprüng­ lichen Molar-Anteile einer jeden Komponente wie sie waren, denn das Medium war bereits durch Ver­ fahren zur Nährstoffoptimierung entwickelt worden (Ham, R. G. Formulation of Basal Nutrient Media. In: Cell culture Methods for Molecular and Gell Biology. Vol. 1. Barnes, D. W., Sirbasku, D. A. & Sato, G. H. (Eds.) Alan R. Liss Inc., New York, pp. 3-21 (1984); Moore, G. E. et al. Culture of Normal Human Leukocytes. J. Amer. Med. Assoc. 199, 519-524 (1967)).

Zusätzlich zu den molaren Mengen einer jeden Kom­ ponente wurden mehrere andere Aspekte für wichtig erachtet. Dies sind die Konzentrationen der jewei­ ligen Nährstoffe im Serum, hemmende Konzentratio­ nen einiger Komponenten gegen Zellwachstum, molare Anteile von eng verwandten Komponenten und inorga­ nische Salze und die Osmolalität des hergestellten Endmediums, usw. (Schwartz, W. B. et al. Part XX. Diseases of Metablism. In: Textbook of Medicine. Beeson, P. B., McDermott, W. & Wyngaarden, J. B. (Eds.). W. B. Saunders, Philadelphia, pp. 1949-1997 (1979)). All diese Aspekte für die Verstärkung des Mediums zusammen ergeben die endgültigen Rezeptu­ ren, wie in Tabelle 1 beschrieben. Zusammengefaßt wurde das RPMI 1640 Medium fünfmal verstärkt in Aminosäuren, Vitaminen und Glutathion-Konzentra­ tionen und 2,5mal in einer Glukose-Konzentration in einem MBRI 40-01 Medium. Die Konzentrationen inorganischer Salze wurden überhaupt nicht geän­ dert, ausgenommen Natriumchlorid (reduziert von 6 g/l auf 4 g/l). Daher wurde die sich ergebende End-Osmolalität bei 270 mos/kg Wasser gemessen.

Alle gleichen Nährstoffkomponenten im RPMI 1640 Medium wurden zehnmal im MBRI 40-02 Medium ver­ stärkt, während die Konzentrationen an Glukose, Glutamin und an inorganischen Salzen so blieben wie im MBRI 40-01 Medium.

Das MBRI 40-03 Medium wurde entwickelt, um für ein Nährmedium in einer "fed-batch"-Züchtung verwendet zu werden. Es war aus Nährstoffkomponenten des RPIMI 1640 Medium, fünfzigmal verstärkt, zusammen­ gesetzt, während die Konzentrationen an inorgani­ schen Salzen die des RPMI 1640 Medium waren. Durch Reduktion der Konzentrationen von NaCl (von 6 g/l auf 4 g/l für MBRI 40-01 & 40-02 Medien und her­ unter auf 2 g/l für das MBRI 40-03 Medium) wurden die Osmolaten aller hochdichten Medien zwischen 270-320 mos/kg Wasser gemessen.

Eine hochdichte Züchtung einer großen Zahl veran­ kerungs-unabhängiger Zellen ist möglich bei Ver­ wendung der Serie von hochdichten Kulturmedien dieser Erfindung. Im allgemeinen können veranke­ rungs-unabhängige Zellen für hochdichte Kulturen untersucht werden. Auf diese Weise kann die Erfin­ dung verwendet werden, um das Zellwachstum und die Produktion von Biochemikalien für bestimmte veran­ kerungs-unabhängige Zellen zu erhöhen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Tabelle 1

Vergleich des RPMI 1640 Mediums mit den aufkonzentrierten erfindungsgemäßen Medien, (mg/l)

Beispiel 1

Das Hybridoma 2c3.1 wurde durch Fusion der CRL 1580 Myeloma-Zellen (P3 63.Ag.8.653) an die/mit den Milz-Zellen der immunisierten Balb c Maus mit gereinigten menschlichen HBsAg (200 mg/ml, Produkt des Koreanischen Grünen Kreuzes) geklont. Die Hybridoma-Zellreihe wurde beim Koreanischen Kul­ turen-Center für Mikroorganismen (KCCM) gemäß dem Budapester Abkommen hinterlegt und als KCCM-10003 bezeichnet. Die Hybridoma-Zellen wurden in einem RPMI 1640 Medium gezüchtet, ergänzt mit 10% FBS bei 37°C in einer 5% CO₂ Luftatmosphäre, die ständig Anti-HBs monoklonale Antikörper des IgG 1 Untertyps absonderte. Das "Seed-lot"-System wurde angewandt für eine Rührer-Kolben-Kultur jedesmal, um die Zellreihe stabil zu halten.

Für eine quantitative Bestimmung der Rest-Glukose­ konzentration wurde ein YSI Glukoseanalysator ver­ wendet.

Der produzierte monoklonale Antikörper wurde durch eine ELISA-Methode quantifiziert, wovon das Stan­ dardprotokoll folgendes ist: das Standard-Anti-HBs wurde in HBsAg-überzogenen Polystyrenstreifen bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Der affinitäts­ gereinigte Standard-Anti-HBs wurde mit 0,15M PBS (pH 7,2) verdünnt, das 5% Rinderserum-Albumin enthielt, um Standardlösungen von 4,5 bis 300 IU/ml herzustellen. Nach der Inkubation wurde der Polysteren-Streifen dreimal mit 0,1 ml einer 0,1%igen PBST gewaschen und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert, mit 100 ng HBsAG-HRP konjugiert und mit 0,1 ml eines normalen menschlichen Serums verdünnt. Dann wurde es erneut fünfmal mit 0,1% PBST gewa­ schen. Die chromogene Substratlösung wurde bei Raumtemperatur auf 0,1 ml/well/Behälter erhöht; dann folgte der Zusatz von 0,1 ml einer Stopp- Lösung für jeden Behälter eine Stunde später. Schließlich wurde die Farbentwicklung durch einen "plate reader" (SLT Lab.) bei 405 µm überwacht. Der für die Ouantifizierung produzierte MAb verwendete Standard Anti-HBs wurde affinitäts­ gereinigt mit Kultur-Supernatants von Hybridoma 2c3.1 (Adachi, H. et al. Sandwich Enzymoimmuno­ assay of HBsAg antigen. In: Enzyme Immunoassay, Ishikawa, E., Kawai, T. & Miyai, K. (Eds.) IGAKU- SHOIN, Tokio, pp. 212-216 (1981)).

In 100 ml von nährstoffverstärkten oder ursprüng­ lichen RPMI 1640 Medien wurden die Hybridoma- Zellen mit Inoculum-Dichten von 1·10⁵ Zellen/ml und 10·10⁶ Zellen/ml in 250 ml Bellco Rührer- Kolben kultiviert; gerührt wurde mit 50 UpM in einem biologischen Rührer (Techne) bei 37°C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator. Das Medium wurde ergänzt durch 10% Rinderfötus-Serum (Hyclone). Der pH-Wert wurde während der Züchtung bei etwa 7,0 gehalten, mit diskontinuierlicher Zugabe einer sterilen 0,4 N Natriumhydroxidlösung. Die Lebens­ fähigkeit wurde durch die Farbstoffausschlußmetho­ de unter Verwendung von Trypanblau bestimmt. Mit einem MBRI 40-01 Medium wurde eine Hybridoma­ zellreihe 2c3.1 erfolgreich bis zu einer Konzen­ tration von 9,3·10⁶ Zellen/ml kultiviert, ange­ fangen von 1·10⁶ Zellen/ml, während in dem normalen RPMI 1640 Medium kultivierte Zellen schnell nach nur 22 Stunden Kultivierung abstarben (Fig. 1). Mit dem MBRI 40-02 Medium war die maximale Zelldichte 1,2·10⁷ Zellen/ml, die um 30% erhöht wurde, verglichen mit der im MBRI 40-01 Medium. Diese Daten zeigen deutlich, daß die ausgewogen verstärkten Nährstoffmedien viel zur Zelltätigkeit beitragen, um die in vitro Zell­ wachstumsbeschränkung durch Schaffung eines geeigneten Umfeldes für diese Hybridoma-Zellen zu überwinden.

Wenn die anfängliche Zellkonzentration 1·10⁵ Zellen/ml betrug, was die übliche Inoculum-Dichte ist, wuchsen die Zellen bis 8·10⁶ Zellen/ml in einem MBRI 40-01 Medium (Fig. 1). Der Wert ist auch vergleichbar mit dem bei höherem Inoculum. Die Ergebnisse beweisen, daß hochdichte Batch- Kulturen möglich sind, unabhängig von der Inoculum-Dichte.

Als Ergebnis der mit dem nährstoffverstärkten Medium erreichten hochdichten Kultur haben wir eine 6- bis 8mal höhere Produktion des monoklo­ nalen Antikörpers erzielt (Anti-HBs, IgGl; Fig. 2). Bei 1·10⁶ Zellen/ml Inoculum, wurden 340 µg/ml der Anti-HBs nach 118 Stunden Kultivierung erreicht im Vergleich zu 56 µg/ml in einem normalen RPMI 1640 Medium. Sogar noch höhere Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers, d. h. 450 µg/ml, wurden in der Kultur bei 1·10⁵ Zellen/ml Inoculum nach 161 Stunden Kultivierung erreicht. Diese bedeuten­ de Steigerung monoklonaler Antikörper-Produktion ergab sich aus der Tatsache, daß die Produktion von monoklonalen Antikörpern mit der lebensfähi­ gen Hybridoma-Zelldichte und der Lebensdauer der Zellen in linearer Beziehung steht. In dieser Hinsicht ist es gewiß, daß die Hybridoma 2c3.1 mit ausreichenden Arten und Konzentrationen an Nähr­ stoffen geliefert worden ist, die für hochdichte Kulturen im Batch-Verfahren geeignet sind und genügen, um eine signifikante Steigerung des Anti-HBs monoklonalen Antikörpers zu erreichen.

Beispiel 2

Die humanen Zellen mit akuter Lymphoblasten- Leukämie (CCRF-CEM; ATCC CCL 119) wurden in einem RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10% FBS bei 37°C in einer 5% CO₂ enthaltenden Luft vorkultiviert. In 100 ml RPMI 1640, MBRI 40-01 und MBRI 40-02 Medien wurden die Zellen jeweils mit Inoculum-/Impfstoff -Dichten von (1,3-1,5)·10⁶ Zellen/ml in 250 ml Bellco Rührer-Kolben kultiviert; gerührt wurde mit 50 Upm mit einem biologischen Rührer (Techne) bei 37°C in einem befeuchteten CO₂ Inkubator. Das Medium wurde ergänzt durch 10% Rinderfötus-Serum (Hyclone). Der pH-Wert wurde während der Züchtung mit diskontinuierlichem Zusatz einer sterilen 0,4 N Natriumhydroxidlösung etwa bei 7,0 gehalten. Eine lebensfähige Zellkonzentration wurde durch die Farbstoffausschlußmethode unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.

Bei den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 und MBRI 40-02 Medien wurden die Zellen bis zu Konzentra­ tionen von 8,1·10⁶ Zellen/ml und 8,9·10⁶ Zellen/ml nach 96 Stunden Züchtung kultiviert, während die in dem normalen RPMI 160 Medium kultivierten Zellen schnell abstarben, nachdem sie 3,9·10⁶ Zellen/ml nach 42 Stunden Züchtung erreicht hatten (Fig. 3). Die Versuchsergebnisse (Fig. 3) zeigen im Gegensatz hierzu, daß die ausgewogen verstärkte Nährstoffzufuhr viel zur Zellenaktivität beiträgt, um die Zellenwachstums­ begrenzung in vitro zu überwinden, indem man ein geeignetes Umfeld für diese Zellen schafft. Die Ergebnisse beweisen, daß die hochdichten Kulturen auch für die humanen Zellen mit akuter Lympho­ blasten-Leukämie geeignet sind.

Beispiel 3

Die humanen Myolema-Zellen (RPMI 8226; ATCC CCL 155) wurden in einem RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS bei 37°C in 5% CO² enthaltender Luft vorkultiviert. Jeweils in 100 ml RPMI 1640, MBRI 40-01 und MBRI 40-02 Medien wurden die Zellen jeweils mit Inoculum/Impfstoffdichten von (1,3·10⁶ Zellen/ml in 250 ml in Bellco Rührer-Kolben kultiviert; gerührt wurde mit 50 Upm mit einem biologischen Rührer (Techne) bei 37°C in einem befeuchteten CO₂ Inkubator. Das Medium wurde ergänzt mit 10% Rinderfötus-Serum (Hyclone). Der pH-Wert wurde während der Züchtung mit diskonti­ nuierlichem Zusatz einer sterilen 0,4 N Natrium­ hydroxydlösung etwa bei 7,0 gehalten. Eine lebens­ fähige Zellkonzentration wurde durch die Farb­ stoffausschlußmethode unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.

Bei den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 und MBRI 40-02 Medien wurden die Zellen bis zu Konzentra­ tionen von 3,8·10⁶ Zellen/ml und 3,9·10⁶ Zellen/ml nach 76 Stunden Züchtung kultiviert, während in dem normalen RPMI 1640 Medium kulti­ vierte Zellen schnell abstarben, nachdem sie 1,3·10⁶ Zellen/ml nach 28 Stunden Züchtung erreicht hatten (Fig. 4). Die Versuchsergebnisse (Fig. 4) zeigen im Gegensatz hierzu, daß die ausgewogen verstärkte Nährstoffzufuhr erheblich zur Zellen­ aktivität beiträgt, um die Zellenwachstumsbegren­ zung in vitro durch die Schaffung eines geeigneten Umfeldes für diese Zellen zu überwinden. Die Ergebnisse beweisen, daß die hochdichte Serien- Kultur auch für humane Zellen mit akuter Lympho­ blasten-Leukämie geeignet ist.

Beispiel 4

In 100 ml dieses verstärkten bzw. ursprünglichen RPMI 1640 Medium wurden die Hybridomazellen mit Inoculum/Impfstoffdichten von 1·10⁶ Zellen/ml in 250 ml Bellco Rührer-Kolben kultiviert; gerührt wurde mit 50 Upm mit einem biologischen Rührer (Techne) bei 37°C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator. Das Medium wurde mit 10% Rinderfötus- Serum (Hyclone) angereichert/ergänzt. Der pH-Wert wurde während der Kultivierung etwa bei 7,0 gehalten; diskontinuierlich wurde eine sterile 0,4 N Natriumhydroxydlösung beigegeben. Die Lebens­ fähigkeit wurde durch die Färbausschlußmethode unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.

Bei dem MBRI 40-02 Medium wurde eine "fed-batch" Kultur der Hybridoma-Zellen 2c3.1 initiiert, mit einer Inoculum-Dichte von 1·10⁶ Zellen/ml (Fig. 6). Nährmedium war das MBRI 40-03 Medium ergänzt durch Glukose, Glutamin und 10% FBS. Die Konzen­ trationen von Glukose und Glutamin betrugen 2,5 g/l und bzw. 750 mg/l. Der "fed-batch"-Vorgang verlief abhängig von der Restglukosekonzentration während der Kultivierung, wie in Fig. 5 angegeben. Das heißt die Restglukosekonzentration wurde durch die Zufuhr des "fed-batch"-Medium über 1 g/l gehalten. Das Volumen der Nährmedien betrug ca. 10% des Arbeitsvolumens zum Zeitpunkt der (Nährstoff)- Zufuhr. Die lebensfähige Zellkonzentration er­ reichte 1,2·10⁷ Zellen/ml bei etwa 70 Stunden Kultivierung und sie wurde um (0,7-1,0)·10⁷ Zellen/ml während mehr als 1500 Stunden Kultivie­ rung aufrechterhalten, wie in Fig. 6 erläutert.

Als Ergebnis wurde die monoklonale Antikörper­ produktion bemerkenswert verbessert und die hohe Produktion wurde für ca. 2000 Stunden aufrecht­ erhalten, nachdem 1 g/l der monoklonale Produktion erreicht war (siehe Fig. 7). Die Höchstkonzentra­ tion des produzierten MAb betrug 1,5 g/l. Diese signifikante Steigerung der monoklonalen Antikör­ perproduktion kann der Tatsache zugeschrieben werden, daß die Produktion von monoklonalen Anti­ körpern mit der lebensfähigen Hybridoma Zelldichte und der Lebensdauer der Zellen linear verwandt ist. Daraus folgert, daß die Hybridoma 2c3.1 reichlich mit den erforderlichen Arten und Konzen­ trationen von Nährstoffen versorgt wurden, die für eine hochdichte Kultur im "fed-batch"-Mode geeig­ net sind, ausreichend, um eine signifikante Steigerung des Anti-HBs monoklonalen Antikörpers zu erreichen.

Alle Ergebnisse wurden in Tabelle 2 zusammenge­ faßt. Die höchsten Zellkonzentrationen in allen Kulturen erhöhten sich um das 2,1- bis 5,2fache verglichen mit denen in der Kontrollkultur im RPMI 1640 Medium. Die monoklonale Antikörperproduktion wurde um einen Faktor 6-8 im Vergleich zu der Kontrollkultur erhöht. Durch die Schaffung einer "fed-batch"-Kultur eines Hybridoma 2c3.1 wurden die Zellkultur und die Antikörperproduktion um das 3,0- bis 5,2fache bzw. das 27fache erhöht, verglichen mit den Werten in der Kontroll-Serienkultur. Die Möglichkeit von langfristigen Arbeiten wurde bestätigt durch Bearbeitung der Kultur bis zu 2500 Stunden.

Claims (18)

1. Konzentrationsverstärktes Kulturmedium für Zellen von Säugetieren, in dem alle Nährstoff­ komponenten eines herkömmlichen Mediums ausge­ wogen verstärkt sind zur Kultivierung von ver­ ankerungsunabhängigen Säugetierzellen.

2. Kulturmedien nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Medium, hergestellt unter Berücksich­ tigung von Faktoren, wie die molaren Mengen einer jeden Komponente, die Konzentrationen der entsprechenden Nährstoffe im Serum, die hemmen­ den Konzentrationen einiger Komponenten gegen Zellwachstum, die molaren Anteile von eng ver­ wandten Komponenten und der inorganischen Salze und der Osmolalität in den hergestellten Medien.

3. Kulturmedien nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Glukose und Glutamin um das 2,5fache bzw. 5fache verstärkt wurden und die anderen Nährstoffkomponenten 5fach im Vergleich zu den Konzentrationen im RPMI 1640 Medium.

4. Kulturmedien nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Glukose und Glutamin um das 2,5fache bzw. 5fache verstärkt wurden; und andere Nährstoffkomponenten der Medien 10fach im Vergleich zu den Konzentrationen im RPMI 1640 Medium.

5. Zellkulturmedien nach Anspruch 1, in denen Glukose und Glutamin 2,5fach bzw. 5fach ver­ stärkt sind; und die anderen Nährstoffkompo­ nenten der Medien 50fach im Vergleich zu den Konzentrationen im RPMI 1640 Medium.

6. Zellkulturmedien nach Anspruch 3, 4 und 5, da­ durch gekennzeichnet, daß eine Osmolalität zwischen 250-320 mos/kg Wasser durch Regulie­ rung der Konzentration mit Natriumchlorid ein­ gehalten wird, ohne die Konzentrationen ande­ rer inorganischer Salze im Vergleich zu denen im RPMI 1640 Medium zu ändern.

7. Zellkulturmedien nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Kultivierungen von ver­ ankerungsunabhängigen Säugetierzellen, wie murine Hybridoma, humane lymphoblastoide Zellen und humane Myeloma-Zellen eingesetzt sind.

8. Verfahren zur Kultivierung von Zellen durch Kontaktierung besagter Zellen mit dem Zellkul­ turmedium nach Anspruch 3.

9. Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem Medium nach Anspruch 4.

10. Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem Medium nach Anspruch 5.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 3, 4 oder 5, da­ durch gekennzeichnet, daß die besagte Zellen antikörperabsondernde Zellen sind.

12. Biochemikalien produziert durch in den Medien des Anspruchs 3 gezüchtete Zellen.

13. Biochemikalien produziert durch in den Medien des Anspruchs 4 gezüchtete Zellen.

14. Biochemikalien produziert durch Zellen, gezüchtet in den Medien des Anspruchs 5.

15. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach Anspruch 8, 9 und 10, durch Verwendung von Kombinationen besagter Medien, um Biochemi­ kalien durch Säugetierzellen kontinuierlich zu produzieren.

16. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach Anspruch 15, in dem die Zufuhr einer Kombina­ tion besagter Medien vorgenommen wird, um die Restglukosekonzentration von 1 g/l aufrechtzu­ erhalten.

17. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach Anspruch 15, daß es bis zu 2500 Stunden wirksam ist.

18. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach Anspruch 15, in der besagte Media bis zu ca. 10% eines Arbeitsvolumens einer Kultur zugeführt werden.