DE4036855C1 - Plasmid DNA (DSM-6237) and expression vectors - encoding human gamma interferon prodn., prepd. by cleavage of c-DNA - Google Patents

Abstract

Plasmid DNA (DSM-6237) and expression vectors contg. this recombinant DNA which encode the prodn. of human gamma-interferon are new. Prepn. of this plasmid DNA comprises cleavage of c-DNA (not contg. poly-A) contg. 1194 base pairs of the 3'-non-coding region up to the residue of 19 nucleotides, using a restriction endonuclease, cleavage of the 5'-non-translation region and the leader sequence of the protein using a restriction endonuclease and insertion of the gene in the plasma PKK-233-2 in host cells e.g. Escherichia coli. USE - The transformed cells are propagated to produce human gamma-interferon which is isolated and purified by cation exchange resin chromatography and gel filtration.

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 4 bis 6 angegebene Verfahren zur Herstellung von Interferon-γ und die Plasmid DNA DSM-6237 nach Anspruch 1, mit der das Interferon-γ exprimiert wird, sowie das Verfahren zur Herstellung dieser Plasmid-DNA nach den Ansprüchen 2 und 3.The invention relates to the method specified in claims 4 to 6 for the production of interferon-γ and the plasmid DNA DSM-6237 according to claim 1, with which the interferon-γ is expressed, and the method for the production of this plasmid DNA according to claims 2 and 3.

Interferon-γ aus Bakterienzellen ist seit einiger Zeit bekannt. So beschreibt die EP 00 87 686 Interferon-γ und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Das Gen für das Interferon-γ-Protein wird dabei in Bakterienzellen exprimiert, d. h. dieses Protein wird in Bakterienzellen synthetisiert und muß aus diesen Zellen gereinigt werden. Das Interferon-γ wird exprimiert in Bakterienzellen. Die Ausbeute, die bei der Expression mit dieser Methode erzielt wird, liegt bei ungefähr 10% des Gesamtproteins.Interferon-γ from bacterial cells has been known for some time. This is how EP 00 describes it 87 686 interferon-γ and a process for its preparation. The gene for that Interferon γ protein is expressed in bacterial cells, i.e. H. this protein will synthesized in bacterial cells and must be purified from these cells. The Interferon-γ is expressed in bacterial cells. The yield in the expression achieved with this method is approximately 10% of the total protein.

Neben den geringen Ausbeuten bei der Expression spielt aber auch noch die Reinigung über Kationenaustauscherprozesse beim bekannten Verfahren eine entscheidende Rolle. Der Reinigungsschritt durch Kationenaustauscherprozeß wird normalerweise nach dem Stand der Technik mit einer Säulenchromatographie durchgeführt, d. h., das Interferon-γ wird nach dem Renaturierungsschritt in Gegenwart von z. B. Guanidiniumchlorid und einem Phosphatpuffer auf eine Säule mit dem Kationenaustauschermaterial gepumpt. Dabei bindet das Kationenaustauschermaterial aufgrund der hohen Bindungskapazität für das Interferon-γ das Interferon-γ mit einer entsprechend hohen Konzentration im oberen Bereich der Säule. Dadurch sind, wegen der hohen Konzentration des gebundenen Interferon-γs, die Elutionsausbeuten sehr gering. Damit kann nur ein kleiner Teil des gebundenen Interferon-γs mit entsprechenden Salzlösungen von dem Kationenaustauschermaterial abgelöst werden.In addition to the low yields in expression, cleaning also plays a role a decisive one via cation exchange processes in the known method Role. The purification step through cation exchange process is usually carried out according to the prior art with column chromatography, d. that is Interferon-γ is after the renaturation step in the presence of z. B. guanidinium chloride and a phosphate buffer on a column with the Pumped cation exchange material. The cation exchange material binds due to the high binding capacity for the interferon-γ the interferon-γ with a correspondingly high concentration in the upper area of the column. Because of that, because the high concentration of bound interferon-γs, the elution yields very much low. This means that only a small part of the bound interferon-γs can be combined with the corresponding ones Saline solutions are detached from the cation exchange material.

Aufgrund der großen Bedeutung von Interferon-γ für die Therapie ist es aber äußerst erstrebenswert, das Verfahren zur Herstellung von Interferon-γ in der Weise zu verbessern, daß sowohl die Expressionsausbeute wie auch die Ausbeute beim Reinigungsschritt vergrößert wird.However, due to the great importance of interferon-γ for therapy, it is extreme Desirable, the method for producing interferon-γ in the way improve that both the expression yield and the yield in Cleaning step is enlarged.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Interferon-γ anzugeben, wobei sowohl eine Verbesserung der Expressionsrate angestrebt werden soll wie auch eine Verbesserung bei der Reinigung.It is therefore an object of the invention to provide an improved process for the production of Interferon-γ indicate, both an improvement in the expression rate the aim is to improve the cleaning as well.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß eine Plasmid-DNA vorgeschlagen wird, mit der das Interferon-γ mit einem um den Faktor 4 höheren Wert exprimiert wird, wobei die DNA dadurch ausgezeichnet ist, daß sie sowohl eine Verkürzung des 3′ nicht translatierten Bereiches sowie auch eine Verkürzung des 5′ nicht translatierten Bereiches aufweist. Erfindungsgemäß wird weiter vorgeschlagen, den Reinigungsprozeß derart abzuwandeln, daß die Reinigung in einem sog. Batch-Verfahren durchgeführt wird. Dieses Batch-Verfahren ist dadurch ausgezeichnet, daß eine Interferon-γ-Lösung mit dem Kationenaustauschermaterial gleichmäßig verteilt wird, um damit eine gleichmäßige Belegung des ganzen Materials zu erzielen, dadurch wird bei der Reinigungsausbeute eine weitere Steigerung der Ausbeute um den Faktor 4 erreicht.The object is achieved in that a plasmid DNA is proposed with which the interferon-γ is expressed with a value 4 times higher, the DNA is characterized in that it is both a shortening of the 3 ' translated area as well as a shortening of the 5 'non-translated area having. According to the invention, the cleaning process is further proposed in this way to modify that the cleaning is carried out in a so-called batch process. This batch process is characterized in that an interferon-γ solution with the cation exchange material is evenly distributed, so that a To achieve even occupancy of the entire material, this is the case with Cleaning yield achieved a further increase in yield by a factor of 4.

Im folgenden wird die Herstellung der Plasmid-DNA wie auch der Reinigungsschritt zur Herstellung von INF-γ ausführlich beschrieben.In the following, the preparation of the plasmid DNA as well as the purification step is used Production of INF-γ described in detail.

Fig. 1 zeigt hierbei die genaue Sequenz der Ausgangs-cDNA für humanes Interferon-γ; Fig. 1 shows this case the exact sequence of the starting cDNA for human interferon-γ;

Fig. 2 zeigt die Verkürzung des 5′ sowie des 3′ nicht translatierten Bereiches ausgehend von einer c-DNA; Fig. 2 shows the shortening of the 5 'and the 3' non-translated area based on a c-DNA;

Fig. 3 zeigt die Protein- und DNA-Sequenz von Interferon-γ. Figure 3 shows the protein and DNA sequence of interferon-γ.

Fig. 1 zeigt die genaue Sequenz der Ausgangs cDNA. Die cDNA enthält dabei den gesamten kodierten Bereich, sowie 5′ und 3′ nicht translatierte Sequenzen. Diese cDNA wurde mit Standardmethoden aus menschlichen Zellen gewonnen. Die für das reife Interferon kodierende Sequenz (179-607) ist fettgedruckt. Signalsequenz (110-178) und Stopcondon (608-610) sind unterstrichen. Diese cDNA wurde sequenziert und ist ohne polyA 1194 Basenpaare (Bp) lang. Für die Konstruktion des Expressionsplasmides wurden die Nukleotide 182 bis 629 verwendet. Fig. 1 shows the exact sequence of the starting cDNA. The cDNA contains the entire coded area, as well as 5 'and 3' untranslated sequences. This cDNA was obtained from human cells using standard methods. The sequence coding for the mature interferon (179-607) is printed in bold. Signal sequence (110-178) and stop London (608-610) are underlined. This cDNA was sequenced and is long without polyA 1194 base pairs (bp). Nucleotides 182 to 629 were used for the construction of the expression plasmid.

Der genaue Ablauf, der zur Verkürzung der cDNA führt, geht aus Fig. 2 hervor.The exact sequence which leads to the shortening of the cDNA is shown in FIG. 2.

Der 5′ nicht translatierte Bereich (1-109) sowie die Leadersequenz des Proteins (110- 181) wurden durch Spaltung mit der Restruktionsendonuklease Ava II (Erkennungssequenz GGA/TCC. 181-185) entfernt. Das Initiationscodon ATG (für Met) sowie das Codon für die erste Aminosäure wurden durch synthetische DNA- Stücke (kommerziell erhältliche Linker) dem 5′-Ende der cDNA hinzugefügt. Die dafür nötigen Einzelschritte sind allgemeiner Stand der Technik.The 5 ′ untranslated region (1-109) and the leader sequence of the protein (110- 181) were cleaved with the restriction endonuclease Ava II  (Recognition sequence GGA / TCC. 181-185) removed. The initiation codon ATG (for Met) and the codon for the first amino acid were determined by synthetic DNA Pieces (commercially available linkers) added to the 5 'end of the cDNA. The one for that necessary individual steps are general state of the art.

Der 3′ nicht translatierte Bereich der c-DNA wurde durch partielle Spaltung durch die Restriktionsendonuklease Ssp I (Erkennungssequenz AATATT. 627-632) entfernt. Die verkürzte cDNA wurde durch Ligation eines Bam H I - Linkers sowie einer Hilfssequenz (siehe Anlage) in den Expreßkonvektor eingefügt.The 3 'untranslated region of the c-DNA was partially cleaved by the Restriction endonuclease Ssp I (recognition sequence AATATT. 627-632) removed. The shortened cDNA was obtained by ligation of a Bam HI linker and a Auxiliary sequence (see attachment) inserted in the express convector.

Für die Expression von Interferon-γ in E. coli wurde das Plasmid-pKK 233-2, konstruiert von E. Amann und J. Brosius (Gene 40 (1985) 183-190) verwendet. Es besitzt den induzierbaren trc-Promotor, eine multiple cloning site, die das Startcodon (ATG) enthält sowie Terminatoren für die RNA-Polymerase.The plasmid pKK 233-2 was constructed for the expression of interferon-γ in E. coli by E. Amann and J. Brosius (Gene 40 (1985) 183-190). It owns the inducible trc promoter, a multiple cloning site that contains the start codon (ATG) contains as well as terminators for the RNA polymerase.

Dieses Plasmid-DNA (Hinterlegungsnummer DSM 6237), bei der der 3′ nicht translatierte Bereich bis auf einen Rest von 19 Nukleotiden entfernt wurde, exprimiert Interferon-γ mit einer um den Faktor 4 höheren Effizienz. Die Expression wird dadurch von 10 auf 40% des Gesamtproteins erhöht.This plasmid DNA (accession number DSM 6237), in which the 3 'does not translated region except for a residue of 19 nucleotides was expressed Interferon-γ with a factor 4 higher efficiency. The expression is thereby increased from 10 to 40% of the total protein.

Erfindungsgemäß wird weiter vorgeschlagen, die Ausbeute noch zusätzlich dadurch zu erhöhen, daß das Reinigungsverfahren nun in einem sog. Batch-Prozeß durchgeführt wird.According to the invention, it is further proposed to additionally increase the yield increase that the cleaning process is now carried out in a so-called batch process becomes.

Das komplette 143 Aminosäure lange menschliche Interferon-γ mit einem zusätzlichen Methionin am NH₂-Terminus wird - wie gezeigt - mit einer Rate von 40% des totalen Proteins einer Bakterienzelle exprimiert, wenn sein Gen in einer Konstruktion vorliegt, in der - wie bereits gezeigt - der 3′ nicht kodierende Bereich bis auf einen Rest von 19 Nukleotiden herausgeschnitten wurde. Bei dieser hohen Expressionsrate werden mehr als 90% des Interferon-γs in Form von "Einschlußkörper" abgelagert, die das Ausgangsmaterial für die Reinigung darstellen.The complete 143 amino acid human interferon-γ with an additional one Methionine at the NH₂ terminus is - as shown - at a rate of 40% of the total Expressed in a bacterial cell when its gene is in a construct, in the - as already shown - the 3 ′ non-coding area except for a remainder of 19 Nucleotides was cut out. With this high expression rate, more will be deposited as 90% of the interferon-γs in the form of "inclusion body", which the Present raw material for cleaning.

Bakterien mit diesen Interferon-γ Einschlußkörpern werden mechanisch aufgebrochen und die Einschlußkörper durch mehrfaches Waschen von löslichen bakteriellen Proteinen befreit. Die Einschlußkörper und damit das Interferon-γ werden durch einen Denaturierungsschritt mit Guanidiniumchlorid in Lösung gebracht; in einem Renaturierungsschritt durch Verdünnen in einen Phosphatpuffer wird das Interferon-γ in die biologisch aktive Form gefaltet. Das dadurch zu mehr als 90% saubere Interferon- γ, wird durch einen Kationenaustauscherprozeß im "Batch-Verfahren" konzentriert und weiter gereinigt und erreicht durch einen weiteren Gelfiltrationsschritt einen Reinheitsgrad von mehr als 95%.Bacteria with these interferon-γ inclusion bodies are broken up mechanically and the inclusion bodies by multiple washing of soluble bacterial Free protein. The inclusion bodies and thus the interferon-γ are replaced by a Denaturing step with guanidinium chloride in solution; in one The interferon-γ is renaturation step by dilution in a phosphate buffer folded into the biologically active form. The result is more than 90% clean interferon  γ, is concentrated by a cation exchange process in the "batch process" and further cleaned and reaches another through a further gel filtration step Purity level of more than 95%.

Dieser Kationenaustauscherprozeß wird normalerweise mit einer Säulenchromatographie durchgeführt, d. h. das Interferon-γ wird nach dem Renaturierungsschritt in Gegenwart von 0,2 M Guanidiniumchlorid und einem Phosphatpuffer auf eine Säule mit dem Kationenaustauschermaterial gepumpt und bindet wegen der hohen Bindungskapazität des Kationenaustauschermaterials für das Interferon-γ mit dementsprechend hoher Konzentration im oberen Teil der Säule. Wegen der hohen Konzentration des gebundenen Interferon-γ sind die Elutionsausbeuten sehr gering, d. h. nur ein kleiner Teil des gebundenen Interferon-γ kann mit entsprechenden Salzlösungen von dem Kationenaustauschermaterial abgelöst werden.This cation exchange process is usually carried out using column chromatography carried out, d. H. the interferon-γ after the renaturation step in Presence of 0.2 M guanidinium chloride and a phosphate buffer on a column pumped the cation exchange material and binds because of the high Binding capacity of the cation exchange material for the interferon-γ with accordingly high concentration in the upper part of the column. Because of the high Concentration of the bound interferon-γ, the elution yields are very low, i.e. H. only a small part of the bound interferon-γ can with corresponding Saline solutions are detached from the cation exchange material.

Das Batch-Verfahren umgeht dieses Hochkonzentrieren auf der Säule. Das Verfahren läuft erfindungsgemäß beispielhaft so ab: das Kationenaustauschermaterial wird gleichmäßig so in eine Interferon-γ-Lösung mit 0,1 mg Protein pro ml 0,2 M Guanidiniumchlorid in Phosphatpuffer eingerührt, daß das Interferon-γ gleichmäßig verteilt an alles Kationenaustauschermaterial bindet und die Interferon-γ- Proteinkonzentration nicht mehr als 2 mg/ml gepacktes Kationenaustauschermaterial beträgt. Dieses Verfahren wird als Batch-Verfahren bezeichnet. Das mit Interferon-γ beladene Kationenaustauschermaterial wird auch im Batch mit Phosphatpuffer gewaschen und das Interferon-γ dann im Batch mit 2 M NaCl in Phosphatpuffer eluiert.The batch process avoids this high concentration on the column. The procedure runs according to the invention as an example: the cation exchange material is evenly so in an interferon-γ solution with 0.1 mg protein per ml 0.2 M Guanidinium chloride stirred in phosphate buffer that the interferon-γ evenly distributed to all cation exchange material and binds the interferon-γ- Protein concentration not more than 2 mg / ml packed cation exchange material is. This process is known as the batch process. That with interferon-γ loaded cation exchange material is also batched with phosphate buffer washed and the interferon-γ then eluted in a batch with 2 M NaCl in phosphate buffer.

Durch das Batchverfahren wird bei gleicher Anreicherung die Ausbeute von 10% im Säulenverfahren auf 40% beim erfindungsgemäßen Verfahren angehoben.Through the batch process, the yield of 10% in the same enrichment Column process increased to 40% in the process according to the invention.

Fig. 3 zeigt nun die Protein- und DNA-Sequenz des humanen Interferon-γ, wie sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird. Fig. 3 shows the protein and DNA sequence of human interferon-γ, as obtained with the inventive method.

Das Interferon-γ enthält demnach 144 Aminosäuren. Die erste Aminosäure, Methionin in Position Null, ist zusätzlich vorhanden und wurde durch Protein-Sequenzierung nachgewiesen. Die anderen Aminosäuren (1-143) entsprechen denen des natürlichen Interferon-γs.The interferon-γ therefore contains 144 amino acids. The first amino acid, methionine in position zero, is additionally present and was by protein sequencing proven. The other amino acids (1-143) correspond to those of the natural one Interferon-γs.

Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt demnach unter gleichen Fermentationsbedingungen 16mal mehr sauberes IFN-γ (in mg) wie beim Stand der Technik. Dadurch steht erstmalig ein Verfahren zur Verfügung, daß es erlaubt, Interferon-γ kostengünstig herzustellen. Damit können neue Anwendungsmöglichkeiten und eine breitere Therapie erschlossen werden.The method according to the invention therefore yields the same Fermentation conditions 16 times more clean IFN-γ (in mg) than in the prior art Technology. This is the first time that a procedure is available that allows  Interferon-γ inexpensively. This can create new applications and a broader therapy can be developed.

Claims (6)

1. Plasmid-DNA mit der Hinterlegungsnummer DSM 6237.1. Plasmid DNA with the accession number DSM 6237. 2. Herstellung der Plasmid-DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß a) aus einer c-DNA (ohne Poly-A) mit 1194 Basenpaaren der 3′ nicht kodierende Bereich bis auf einen Rest von 19 Nukleotiden mit einer Restriktionsendonuklease, entfernt wird und daß b) der 5′ nicht translatierte Bereich sowie die Leadersequenz des Proteins durch Spaltung mit einer Restriktionsendonuklease entfernt wird und daß c) dieses Gen im Plasmid PKK 233-2 in Bakterienzellen überführt wird.2. Production of the plasmid DNA according to claim 1, characterized, that a) from a c-DNA (without poly-A) with 1194 base pairs of the 3 'not coding Region except for a residue of 19 nucleotides with a restriction endonuclease, is removed and that b) the 5 'non-translated area and the leader sequence of the protein by cleavage with a restriction endonuclease is removed and that c) this gene in the plasmid PKK 233-2 in bacterial cells is transferred. 3. Herstellung der Plasmid-DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium E coli ist.3. Production of the plasmid DNA according to claim 2, characterized, that the bacterium is E coli. 4. Herstellung von Interferon-γ, gekennzeichnet durch Kombination folgender Merkmale:

• a) das Interferon-γ aus der Plasmid-DNA DSM 6237 in Form von Einschlußkörpern exprimiert und
• b) die Einschlußkörper aufgebrochen und von löslichen Proteinen befreit werden und
• c) daß diese Einschlußkörper einer Denaturierung unterzogen werden und
• d) anschließend mit einem Renaturierungsschritt in die aktive Form gebracht werden und
• e) in einem Kationenaustauscherprozeß im Batch-Verfahren konzentriert und anschließend einer Gel-Filtration unterzogen werden.

4. Production of interferon-γ, characterized by a combination of the following features:

• a) the interferon-γ is expressed from the plasmid DNA DSM 6237 in the form of inclusion bodies and
• b) the inclusion bodies are broken up and freed from soluble proteins and
• c) that these inclusion bodies are subjected to denaturation and
• d) subsequently brought into the active form with a renaturation step and
• e) concentrated in a cation exchange process in a batch process and then subjected to gel filtration.

5. Herstellung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß beim Batch-Verfahren das Kationenaustauschermaterial in gleichmäßigen Kontakt mit der Interferon-γ-Lösung gebracht wird, um eine gleichmäßige Belegung zu erreichen und daß anschließend im Batch mit einem Puffer gewaschen und eluiert wird.5. Production according to claim 4, characterized, that in the batch process the cation exchange material in uniform Contact with the interferon-γ solution is brought to an even occupancy to achieve and that then washed in batch with a buffer and is eluted. 6. Herstellung nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Kationenaustauscher die üblichen Materialien wie z. B. CM-Cellulose oder Affi-Gel-Blue verwendet werden.6. Production according to claim 4 and 5, characterized, that as a cation exchanger, the usual materials such. B. CM cellulose or Affi-Gel-Blue can be used.