DE4036067A1 - Verfahren zur gewinnung eines polyhydroxyalkanoates aus dem zellmaterial eines mikroorganismus und polyhydroxyalkanoatflocken - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines durch einen Mikroorganismus intrazellulär aufgebauten Polyhydroxyal­ kanoates aus dem Zellmaterial und Polyhydroxyalkanoatflocken.

Polyhydroxyalkanoate, insbesondere Homo- und Copolymere der D-(-)3-Hydroxybuttersäure (Poly-HB) werden als Speicherstoff für Energie und Kohlenstoff von vielen Mikroorganismen intrazellu­ lär aufgebaut und angereichert und stellen Polyester mit thermoplastischen Eigenschaften dar, die biologisch abbaubar sind. Poly-HB kann mit Hilfe von Mikroorganismen beispielsweise nach der in EP-A-01 44 017 oder EP-A-01 49 744 beschriebenen Verfahrensweise in guten Ausbeuten hergestellt werden. Copoly­ ester von Poly-HB, wie z. B. Copolyester, die aus 3-Hydroxybuttersäure- und 3-Hydroxyvaleriansäureeinheiten oder auch anderen Säureeinheiten bestehen, können beispielsweise nach einer der in EP-A-00 52 459, EP-A-02 04 442, EP-A-02 88 908, EP-A-03 04 293 oder EP-A-02 74 151 beschriebenen Vor­ gangsweise auf fermentativem Weg hergestellt werden. Die gebil­ deten Polyhydroxyalkanoate sind im Zellmaterial des Mikroorga­ nismus eingeschlossen und müssen vom Zellmaterial getrennt wer­ den, was erhebliche Schwierigkeiten bereitet. Eine der Möglich­ keiten zur Abtrennung ist die Extraktion mit Hilfe eines Lö­ sungsmittels, wobei die Durchführung der bisher beschriebenen Verfahren ebenfalls mit Schwierigkeiten verbunden ist.

Um nämlich das Polyhydroxyalkanoat, das im Zellmaterial des Mi­ kroorganismus eingeschlossen ist, dem Angriff des Lösungsmit­ tels besser zugänglich zu machen, mußte dem eigentlichen Ex­ traktionsschritt ein gesonderter Schritt zum Aufbrechen oder Löslichmachen des Zellmaterials vorgeschaltet werden. So ist beispielsweise in US-A-30 44 942 eine Vorbehandlung der Zellen mit Aceton, in US-A-32 75 610 eine mechanische Vorbehandlung der Zellen durch Zerstampfen der Zellen oder Schütteln mit har­ ten Gegenständen, in EP-A-00 15 123, EP-A-01 24 309 oder EP-A­ 01 68 095 eine Sprühtrocknung oder andere Vortrocknung der Mikroorganismenzellen, beispielsweise durch azeotropes Abde­ stillieren des Wassers und in EP-A-00 15 669 eine Vorbehandlung der Zellen durch osmotischen Schock, Ultraschall oder Zellwand­ lyse beschrieben. Weiters bereitet die Abtrennung des so vorbe­ handelten ungelösten Zellmaterials von dem gelösten Polyhydro­ xyalkanoat große Schwierigkeiten, da das ungelöste Zellmaterial als gallertartige Masse die Filter verstopft und die Abtrennung der organischen Phase vom Zellmaterial kaum vollständig durch­ führbar ist. Aus diesem Grund wird in EP-A-00 46 017 beschrie­ ben, das Zellmaterial vor der Extraktion mit Hilfe einer kombi­ nierten Alkali-, Säure- und Hitzebehandlung zwecks besserer Abtrennbarkeit auszuflocken, während in CA Vol. 108, 1988, Ref. 73835j (JA 62/2 05 787) der Einsatz einer Filterhilfe wie Perlit oder Diatomeenerde zur Abtrennung des Zellmaterials vom Lösungsmittel vorgeschlagen wird.

Es wurde nun unerwarteterweise ein einfaches Verfahren gefun­ den, bei dem die Zellen nicht aufgebrochen werden müssen und bei dem die Zellrückstände ohne jeglichen Aufwand und ohne Schwierigkeiten entfernt werden, wobei gleichzeitig das Polyhy­ droxyalkanoat in Form gut handzuhabender Flocken isoliert wird, die überraschend gut zu Gegenständen weiterverarbeitbar sind.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Gewin­ nung eines durch einen Mikroorganismus intrazellulär aufge­ bauten Polyhydroxyalkanoates aus dem Zellmaterial einer fermen­ tierten, wäßrigen Zellsuspension, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zumindest ein Teil der Fermentierlösung oder des in der Fermentierlösung enthaltenen Wassers aus der Zellsuspension entfernt wird, worauf das Zellmaterial mit einem organischen Lösungsmittel für das Polyhydroxyalkanoat, das mit Wasser nicht mischbar ist und das einen Siedepunkt von weniger als 100°C aufweist mit oder ohne Zusatz von Wasser, versetzt wird, worauf die entstandene Extraktionsmischung bei Temperaturen von Raum­ temperatur bis zum Siedepunkt des organischen Lösungsmittels gerührt, mit oder ohne Zentrifugieren unter Ausbildung einer wäßrigen und einer organischen Phase absetzen gelassen und die organische Phase, die das Polyhydroxyalkanoat gelöst enthält von der wäßrigen Phase, die die Zellrückstände ungelöst ent­ hält, abgetrennt wird, worauf die organische Phase in heißes Wasser einer Temperatur, die höher ist als der Siedepunkt des organischen Lösungsmittels, eingedüst wird, wodurch das organi­ sche Lösungsmittel verdampft, das Polyhydroxyalkanoat im Wasser ausfällt und auf übliche Art und Weise gewonnen wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zuerst aus der fermentierten, wäßrigen Zellsuspension zumindestens ein Teil der Fermentierlösung oder des Wassers entfernt. Dazu kon­ nen Trennverfahren wie z. B. Abdekantieren, Abzentrifugieren, Abfilterien des Zellmaterials von der Fermentierlösung einge­ setzt werden, oder es wird zumindestens ein Teil des in der Fermentierlösung enthaltenen Wassers durch Abdestillieren ent­ fernt. Bevorzugt wird ein Teil der Fermentierlösung durch Abzentrifugieren vom Zellmaterial, bevorzugt mit Hilfe eines Separators entfernt. Dadurch wird die Konzentration der Suspen­ sion an Zellen erhöht, was für das weitere Verfahren von Bedeu­ tung ist.

Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß das Zellmaterial nicht durch Aufbrechen oder Trock­ nen vorbehandelt werden muß. Es ist aber auch möglich, vorbe­ handeltes Zellmaterial im erfindungsgemäßen Verfahren ein­ zusetzen.

Das vorzugsweise Wasser enthaltende Zellmaterial oder die kon­ zentrierte Zellsuspension wird mit einem organischen Lösungs­ mittel für das Polyhydroxyalkanoat, das mit Wasser nicht misch­ bar ist und das einen Siedepunkt aufweist, der unter dem des Wassers liegt, versetzt. Geeignete Lösungsmittel sind etwa halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chlo­ roform, Trichlorethylen. Bevorzugt wird Methylenchlorid einge­ setzt.

Gegebenenfalls wird der Mischung aus Zellmaterial und organi­ schem Lösungsmittel auch noch Wasser zugesetzt, da es wesent­ lich ist, daß ein optimales Verhältnis von Zellmaterial, orga­ nischem Lösungsmittel und Wasser entsteht, damit später eine optimale Phasentrennung erfolgt.

Bevorzugt wird soviel organisches Lösungsmittel und soviel Was­ ser zugegeben, daß nach der Zugabe das Gewichtsverhältnis Zell­ material bezogen auf das Zelltrockengewicht : Wasser : Lösungs­ mittel etwa 2 : 1 : 10 bis 1 : 10 : 100, besonders bevorzugt etwa 2 : 3 : 20 bis 1 : 5 : 50, ganz besonders bevorzugt etwa 1 : 3 : 20, beträgt.

Die Mischung aus Zellmaterial, organischem Lösungsmittel für das Polyhydroxyalkanoat und Wasser wird bei Temperaturen von Raumtemperatur bis zum Siedepunkt des verwendeten Lösungsmit­ tel, bevorzugt unter Rückfluß des verwendeten Lösungsmittels, gut gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Gemisch absitzen gelas­ sen oder es wird zentrifugiert, wobei sich eine wäßrige und eine organische Phase ausbilden. Bevorzugt wird das Gemisch zentrifugiert, da die Phasentrennung auf diese Weise erleich­ tert wird. Die wäßrige Phase enthält danach den unlöslichen Zellrückstand, die organische Phase das gelöste Polyhydro­ xyalkanoat. Zur Entfernung des Zellmaterials ist keine Filtra­ tion nötig, da die organische Phase durch einfache Phasentren­ nung von der wäßrigen Phase abgetrennt wird, wobei die Zell­ rückstände in der wäßrigen Phase verbleiben.

Es kann vorkommen, daß die organische Lösung trüb anfällt. Zur Entfernung der Trübung kann die organische Lösung durch ein Tiefenfilter, z. B. durch ein Sandbett durchgeleitet werden.

Die abgetrennte, organische Phase, welche das Polyhydroxyalka­ noat gelöst enthält, wird anschließend in heißes Wasser einge­ düst, das in einem Behälter vorgelegt wird.

Die Temperatur des vorgelegten Wassers muß über dem Siedepunkt des organischen Lösungsmittels und unter dem Siedepunkt des Wassers, das auch unter Druck vorgelegt werden kann, liegen.

Zum Eindüsen der organischen Phase können alle geeigneten Dü­ sen, wie Einstoff- oder Zweistoffdüsen geeigneter Bauart ver­ wendet werden. Vorteilhafterweise wird die organische Phase mit Hilfe von Wasserdampf als Treibmittel mittels einer Zweistoff­ düse in das heiße Wasser eingedüst. Sobald das organische Lö­ sungsmittel mit dem vorgelegten, heißen Wasser in Berührung kommt, verdampft das organische Lösungsmittel und das Polyhydroxyalkanoat fällt im vorgelegten Wasser in Form von Flocken aus.

Da sich das vorgelegte heiße Wasser durch das Verdampfen des organischen Lösungsmittels abkühlt, wird der Wasserbehälter vorteilhafterweise etwa mit Hilfe einer Mantelheizung beheizt und auf annähernd konstanter Temperatur gehalten, wobei bei der Verwendung von Wasserdampf als Treibmittel zumindest ein Teil der Verdampfungswärme des Lösungsmittels durch die Kondensa­ tionswärme des Treibdampfes aufgebracht wird.

Die Menge des vorgelegten, heißen Wassers ist für den Erfolg der Verfahrensdurchführung nicht ausschlaggebend. Vorteilhaf­ terweise wird aber soviel Wasser vorgelegt, daß durch einfaches Rühren des Vorlageninhaltes ein Absetzen des abgeschiedenen Po­ lyhydroxyalkanoates vermieden wird. Dies ist bei einer Polyhydroxyalkanoatkonzentration von etwa 3% im allgemeinen noch der Fall.

Das verdampfte organische Lösungsmittel und der entsprechend den Dampfdruckverhältnissen mitgeführte Wasserdampf werden au­ ßerhalb des Wasserbehälters auf übliche Weise kondensiert. Das kondensierte Wasser kann unmittelbar in den Wasserbehälter zu­ rückgeführt und das organische Lösungsmittel erneut in ein Ver­ fahren nach Anspruch 1 eingesetzt werden.

Die ausgefallenen Polyhydroxyalkanoatflocken werden anschlie­ ßend im heißen Wasser 15 bis 60, bevorzugt 20 bis 40 Minuten gerührt, um das organische Lösungsmittel möglichst vollständig auszutreiben und anschließend durch geeignete Methoden, wie Filtrieren, Absaugen, Abzentrifugieren, bevorzugt durch Abzen­ trifugieren vom Wasser abgetrennt und auf geeignete Weise, bei­ spielsweise durch Trocknung im Vakuum, Trocknung in Hordenöfen, bei Temperaturen von 60 bis 110°C getrocknet.

Die dabei entstandenen Flocken aus Polyhydroxyalkanoat sind hervorragend handzuhaben, da diese Flocken praktisch keinen Staubanteil enthalten und als Haufwerk sehr gut durchströmbar sind. Polyhydroxyalkanoate in Form von Flocken sind neu und ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung.

Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durch­ geführt werden, wird aber bevorzugt kontinuierlich durchge­ führt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Poly-HB enthal­ tende Zellmaterial von der Fermentierlösung abzentrifugiert, worauf dem Zellmaterial soviel Methylenchlorid und gegen­ benenfalls soviel Wasser zugesetzt wird, daß das Gewichtsver­ hältnis von Zellmaterial bezogen auf das Zelltrockengewicht : Wasser : Methylenchlorid etwa 1 : 3 : 10 bis 1 : 5 : 30 be­ trägt. Die entstandene Mischung wird anschließend unter Rühren 10 bis 60 Minuten auf Rückfluß erhitzt, abgekühlt und zentrifu­ giert, wobei sich eine wäßrige Phase, die die Zellrückstände ungelöst und eine organische Phase, die die Poly-HB gelöst ent­ hält, ausbildet.

Die Methylenchloridphase wird von der wäßrigen Phase abgelassen und mit Hilfe von Wasserdampf in einen geheizten Behälter, in dem Wasser einer Temperatur von 70 bis 90°C gerührt vorgelegt wurde, eingedüst. Die dadurch im Wasser in Flocken ausgefällte Poly-HB wird 20 bis 40 Minuten im heißen Wasser gerührt, mit Hilfe einer Zentrifuge abgetrennt und in einem Hordenofen bei 80 bis 100°C getrocknet.

Die Polyhydroxyalkanoate, die nach dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren erhalten werden, lassen sich unerwartet gut zu Ge­ genständen weiterverarbeiten. So werden beispielsweise beim Spritzgußverfahren annähernd gleiche Zykluszeiten, wie bei Po­ lypropylen erreicht. Dies ist für den Fachmann völlig überra­ schend, da bekannt ist, daß Polyhydroxyalkanoate langsamer kri­ stallisieren als Polypropylen.

Auf die beschriebene Art und Weise wird das Polyhydroxyalkanoat in guten Ausbeuten auf einfache Weise vom Zellmaterial des Mi­ kroorganismus abgetrennt, wobei das Polyhydroxyalkanoat in Form von Flocken anfällt, die gut handzuhaben und gut weiterzuverarbeiten sind. Das Verfahren stellt somit eine Be­ reicherung der Technik dar.

Beispiel

60 l einer wäßrigen Fermentierlösung, die 26 Gew.% eines Zell­ materials von Alcaligenes latus mit einem Poly-HB Gehalt von 72 Gew.% enthielt, erhalten nach der in EP-A-01 44 017 beschrie­ benen Vorgangsweise und Abzentrifugieren eines Teils der Fer­ mentierlösung mittels eines Tellerseparators mit Feststoffaus­ trag, wurde mit 30 l Wasser und 400 l Methylenchlorid versetzt und unter Rühren 30 Minuten auf Rückfluß erhitzt. Das entstan­ dene Gemisch wurde in einer Siphonzentrifuge mit einem Trommel­ durchmesser von 630 mm bei 2200 U/min zentrifugiert, wobei sich eine wäßrige Phase, die das Mikroorganismenzellmaterial unge­ löst und eine organische Phase, die Poly-HB gelöst enthielt, bildete. Die organische Unterphase wurde von der wäßrigen Ober­ phase abgelassen und mittels einer Zweistoffdüse mit einer Boh­ rung von 4 mm Durchmesser für die PHB-Lösung und ca. 2 mm Ringspaltweite für das Treibmittel, nämlich Wasserdampf, mit einem Treibmittelvordruck von 3 bar in 800 l Wasser einer Temperatur von 80°C, das in einem gerührten, Behälter vorgelegt worden war, mit einem Volumenstrom von 300 l/h einge­ düst. Die Temperatur des Wassers wurde dabei mit Hilfe einer Mantelheizung, die den Behälter umgab, annähernd konstant gehalten.

Dabei fiel Poly-HB in Form von Flocken aus, während das Methylenchlorid und ein kleiner Teil des Wassers verdampfte und außerhalb des Behälters kondensiert und aufgefangen wurde. Nach Beendigung des Eindüsens wurde die Suspension 30 Minuten bei 80°C gerührt. Anschließend wurde der Behälterinhalt in eine Schälzentrifuge mit einem Trommeldurchmesser von 630 mm ge­ pumpt und bei einer Schleuderdrehzahl von 2000 U/min in Wasser und zentrifugenfeuchte Poly-HB-Flocken getrennt. Die zentrifugenfeuchten Flocken wurden in einem Hordentrockner bei 80°C 24 Stunden getrocknet.

Dabei wurden 9,5 kg Poly-HB, das sind 85% der Theorie mit ei­ ner Reinheit <99%, und einem Gehalt an Methylenchlorid von <1 ppm erhalten.

Claims (10)

1. Verfahren zur Gewinnung eines durch einen Mikroorganismus intrazellulär aufgebauten Polyhydroxyalkanoates aus dem Zellmaterial einer fermentierten, wäßrigen Zellsuspension, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der Fermentierlösung oder des in der Fermentierlösung enthalte­ nen Wassers aus der Zellsuspension entfernt wird, worauf das Zellmaterial mit einem organischen Lösungsmittel für das Polyhydroxyalkanoat, das mit Wasser nicht mischbar ist und das einen Siedepunkt von weniger als 100°C aufweist mit oder ohne Zusatz von Wasser, versetzt wird, worauf die entstandene Extraktionsmischung bei Temperaturen von Raum­ temperatur bis zum Siedepunkt des organischen Lö­ sungsmittels gerührt, mit oder ohne Zentrifugieren unter Ausbildung einer wäßrigen und einer organischen Phase ab­ setzen gelassen und die organische Phase, die das Polyhy­ droxyalkanoat gelöst enthält von der wäßrigen Phase, die die Zellrückstände ungelöst enthält, abgetrennt wird, wo­ rauf die organische Phase in heißes Wasser einer Tempera­ tur, die höher ist als der Siedepunkt des organischen Lö­ sungsmittels, eingedüst wird, wodurch das organische Lösungsmittel verdampft, das Polyhydroxyalkanoat im Wasser ausfällt und auf übliche Art und Weise gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxyalkanoat ein Homo- oder Copolymer der Poly-D(-)- 3-hydroxybuttersäure ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zumindest ein Teil der Fermentierlösung durch Zentrifugieren aus der Zellsuspension entfernt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Zellmaterial mit soviel organischem Lö­ sungsmittel und soviel Wasser versetzt wird, daß das Gewichtsverhältnis von Zellmaterial bezogen auf das Zelltroxkengewicht : Wasser : Lösungsmittel von 2 : 3 : 20 bis 1 : 5 : 50 beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Extraktionsmischung beim Siedepunkt des organischen Lösungsmittels gerührt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Extraktionsmischung nach dem Rühren zen­ trifugiert wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die organische Phase mit Hilfe von Wasser­ dampf als Treibmittel in heißes Wasser eingedüst wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das ausgefällte Polyhydroxyalkanoat 20 bis 40 Minuten im heißen Wasser gerührt wird.

9. Polyhydroxyalkanoat, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form von Flocken vorliegt.

10. Verfahren zur Herstellung von Flocken aus Polyhydroxyalka­ noat, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxyalkanoat in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist und das einen Siedepunkt aufweist, der unter dem des Wassers liegt, gelöst und in heißes Wasser einer Temperatur, die über dem Siedepunkt des organischen Lö­ sungsmittels liegt, eingedüst wird, wodurch das organische Lösungmittel verdampft, die Flocken aus Polyhydroxyalkanoat im Wasser ausfallen und auf übliche Art und Weise gewonnen werden.