DE4027154A1 - Mutation der hrv2 2a - Google Patents
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind
Oligonukleotide, die für ein modifiziertes aktives
Zentrum der HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen
die "cis"-Aktivität der Proteinase beeinflussen,
vorzugsweise diese inhibieren.
Viele tierische und pflanzliche Viren benötigen
während ihres Replikationszyklus den Einsatz von
viral-kodierten Proteinasen. Die Picornaviren, eine
Familie von bedeutenden human- und animalpathogenen
Viren, sind zum Beispiel vollständig von einem
proteolytischen Prozessieren abhängig. Die bei der
Replikation involvierten proteolytischen Enzyme sind
hoch Substrat-spezifisch und erkennen meist eine
Spaltregion -also ein strukturell determiniertes
Erkennungsmerkmal- und weniger ein genau definiertes
Aminosäurepaar, wie es üblicherweise als
Erkennungssequenz dient. Einen generellen Überblick zu
dieser Thematik geben H.G. Kräusslich und E. Wimmer
(1988, Ann. Rev. Biochem. 57, 701-751) und Kay, J.
und Dunn, B. M. (1990, Biochim. Biophys. Acta 1048,
1-18) Die viralen Proteinasen stellen aufgrund ihrer
Substratspezifität und ihres katalytischen Mechanismus
einen guten therapeutischen Angriffspunkt dar
(Johnston, M. I. et al., 1989, Trends Pharmacol. Sci.
10, 305-307). Durch die Bereitstellung der
dreidimensionalen Struktur der Proteinasen des Rous
Sarcoma virus (Leis, J. et al., 1990, ASM-News 56,
77-81) und von HIV I (Navia, M. A. et al., 1989,
Nature 337, 615-620; Miller, M. et al., 1989, Science
246 1149-1152) ist es möglich, ein
Computer-unterstütztes molekulares "designing" hoch
spezifischer Inhibitoren durchzuführen (Meek, T. D. et
al., 1990, Nature 343, 90-92). Spezifische
Proteinaseinhibitoren könnten somit neue antivirale
Substanzen darstellen, welche beispielsweise gegen
Viren gerichtet sind, gegen die die Entwicklung eines
Vakzins aus rein technischen Gründen nicht möglich
ist; z. B. sind bei Rhinoviren derzeit weit über 115
nicht miteinander kreuz reagierende Serotypen bekannt,
wovon 90 bereits als definierte Serotypen
klassifiziert wurden (Cooney, M. K. et al., 1982,
Infect. Immun. 37, 642-647).
Proteolytisches Prozessieren des Polyproteins
(Jacobson, M.F. und Baltimore, D., 1968, Proc. Natl.
Acad. Sci. 83, 5392) durch viral kodierte Proteinasen
ist bevorzugt bei (+)Strang RNA Viren (Hellen, C.U.T.
et al., 1989, Biochemistry 28, 9881-9890) und
Retroviren anzutreffen (Skalka, A. M., 1989, Cell 56,
911-913). Mit Hilfe von molekularbiologischen Studien,
Sequenzvergleichen und Röntgenstrukturanalysen stellte
sich heraus, daß die von Viren kodierten Proteinasen
zwei Gruppen von proteolytischen Enzymen zugeordnet
werden können, nämlich den Pepsin-ähnlichen
Aspartat-Proteinasen (Meek, T. D. et al., 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. 86, 1841-1845) und den
Cystein-Proteinasen mit Trypsin-ähnlicher
Proteinkettenfaltung (Bazan, J. F. and Fletterick, R.
J., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 7872-7876). Nicht
immer sind beim proteolytischen Prozessieren des
viralen Polyproteins ausschließlich viral-kodierte
Proteinasen beteiligt, so z. B. sind bei der
Reifungsspaltung des Polyproteins des "Yellow Fever
Virus", welches zu den Flaviviridae gehört, zelluläre
Proteinasen beteiligt (Ruiz-Linares, A. et al., 1989,
J. Virol. 63, 4199-4209).
Die Substratspezifität der viralen Enzyme konnte
mittels detaillierter Studien wie
Punktmutationsanalysen, Spaltung von Peptidsubstraten
"in vitro" und Aminosäure-Sequenzierung der nativen
Spaltprodukte näher analysiert werden. Dabei stellte
sich heraus, daß, wie oben bereits erwähnt, weniger
die Spaltsstelle selbst als einige Positionen
"up"- oder "downstream" eine tragende Rolle bei der
Spaltstellenerkennung spielen. Jene
Sequenz-Heterogenität der Spaltsignale bzw. deren
unmittelbarer Umgebung führt jedoch zu einer Art
"Hierarchie" der Spaltereignisse im Polyprotein
(Kräusslich, H. G. et al., 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci. 86, 807-811; Pichuantes, S. et al., 1989,
PROTEINS: Structure, Function and Genetics 6, 324-337;
Darke, P. L. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264,
2307-2312; Nicklin, M. J. H. et al., 1988, J. Virol.
62, 4586-4593; Libby, R. T. et al., 1988, Biochemistry
27, 6262-6268; Sommergruber, W. et al., 1989, Virology
169, 68-77). Die Variation der einzelnen Spaltregionen
im Polyprotein erlaubt so eine genau determinierte
Abfolge von kinetisch "günstigen" bis zu kinetisch
"ungünstigen" Spaltungen, die in weiterer Folge eine
differenzierte Proteolyse der einzelnen Spaltprodukte
ermöglicht. Dadurch kommt den viralen Proteinasen eine
Art von regulatorischem Potential während des viralen
Replikationszyklus zu. Das Prinzip der Erkennung einer
spezifischen Sekundärstruktur im Spaltstellenbereich
ist nicht auf Picornaviren beschränkt, sondern dürfte
ein allgemeines Prinzip der viralen Proteinasen
darstellen. So werden diese Eigenschaften z. B. im
Adenovirussystem (Webster, A. et al., 1989, J. Gen.
Virol. 70, 3225-3234; Webster, A. et al., 1989, J.
Gen. Virol. 70, 3215-3223) und in pflanzenviralen
Systemen ebenso angetroffen (Carrington, J.C. und
Dougherty, W.G., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85,
3391-3395; Dougherty, W.G. et al., 1988, EMBO J. i,
1281-1288).
Kaum ein anderes virales System ist bei seiner
Regulation des Infektionsablaufes dermaßen von einer
kontrolliert limitierten Proteolyse abhängig, wie das
der Picornaviridae. Diese Virenfamilie läßt sich in 4
verschiedene Genera unterteilen: Entero-, Rhino-,
Aphto- und Cardioviren. Rhinoviren sind wie alle
anderen Vertreter dieser Virenfamilie einzelsträngige
(+)RNA - Viren (Cooper, P. D et al., 1978,
Intervirology 10, 165-180; MacNaughton, M. R., 1982,
Current Top. Microbiol. Immunol. 97, 1-26). Sie sind
weit verbreitet, befallen den oberen respiratorischen
Trakt des Menschen und verursachen akute Infektionen,
die zu Schnupfen, Husten, Heiserkeit etc. führen und
allgemein als Erkältungen bezeichnet werden (Stott, E.
J. und Killington, R. A., 1972, Ann. Rev. Microbiol.
26, 503-524). Infektionen durch Rhinoviren zählen zu
den häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die
Krankheit verläuft zwar meist harmlos, dennoch kommt
es - bedingt durch eine vorübergehende Schwächung des
Organismus - zu Sekundärinfektionen durch andere Viren
oder Bakterien, die dann unter Umständen schwere
Erkrankungen zur Folge haben. Von den insgesamt ca.
115 verschiedenen, bekannten Serotypen von humanen
Rhinoviren sind bis jetzt 4 Serotypen (HRV 1B, 2, 14
und 89) kloniert und komplett sequenziert worden:.
Deutsche Patentanmeldung P 35 05 148.5; Skern; T. et
al., 1985; Nucleic Acids Res. 13, 2111-2126; Düchler,
M. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
2605-2609; Stanway, G. et al., 1984, Nucleic Acids
Res. 12, 7859-7877; Callahan, P. L. et al., 1985,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 732-736; Hughes, R. et
al., 1988, J. Gen Virol. 69, 49-58).
Die genomische einzelsträngige (+)RNA der Rhinoviren
wird kurz nach der Infektion durch Abspaltung des an
das 5′ Ende gebundenen Oligopeptids VPg modifiziert und
dient in der Folge als mRNA für die Synthese eines
Polyproteins, das den gesamten durchgehenden
Leserahmen der Nukleinsäuresequenz umfaßt
(Butterworth, B. E., 1973, Virology 56, 439-453; Mc
Lean, C. und Rueckert, R. R., 1973, J. Virol. 11,
341-344; Mc Lean, C. et al., 1976, J. Virol. 19,
903-914; Agol, V.I., 1980, Prog. med. Virol. 26,
119-157; Putnak, J.R. und Phillips, B.A., 1981,
Microbiol. Rev. 45, 287-315). Die reifen viralen
Proteine entstehen ausschließlich durch proteolytische
Spaltung aus diesem Polyprotein, wobei -zumindest bei
Entero- und Rhinoviren- die dabei wirksamen
Proteinasen selbst Bestandteil dieses Polyproteins
sind. Das Prozessieren erfolgt in 3 Stufen
(Palmenberg, A., 1987, J. Cell. Biochem. 33, 191-198;
Kräusslich, H.G. und Wimmer, E., 1988, loc. cit.):
1. Die Primärspaltung: Trennung der Kapsidvorläufer von der wachsenden Polypeptidkette;
2. die Sekundärspaltung: Prozessieren struktureller und nicht-struktureller Vorläuferproteine und
3. die Reifespaltung des Kapsids.
1. Die Primärspaltung: Trennung der Kapsidvorläufer von der wachsenden Polypeptidkette;
2. die Sekundärspaltung: Prozessieren struktureller und nicht-struktureller Vorläuferproteine und
3. die Reifespaltung des Kapsids.
Der erste Schritt dient somit der Abspaltung der
Vorstufe der Hüllenproteine und wird (bei Entero- und
Rhinoviren) autokatalytisch durch die Proteinase 2A
vorgenommen ("cis"-Aktivität). In der Reihenfolge der
Gene liegt die Sequenz der Proteinase 2A (in der Folge
2A genannt) unmittelbar hinter dem für die
Hüllenproteine kodierenden Abschnitt. 2A ist somit
aufgrund ihrer Lokalisation im Polyprotein die erste
nachweisbare enzymatische Funktion des Virus. Die
Trennung der Hüllenproteinregion von dem für die
Replikation verantwortlichen Abschnitt findet bereits
während der Translation des Polyproteins "in statu
nascendi" statt. Bei Poliovirus kann diese primäre
Spaltung an der P1-P2 Region intermolekular d. h. "in
trans" von der reifen Proteinase 2A vorgenommen werden
(Kräusslich, H.G. und Wimmer, E., 1988, loc. cit.).
Das Spaltsignal, welches dabei von der Proteinase 2A
erkannt wird, wurde einerseits durch direkte
Aminosäuresequenzanalyse des N-Terminus von 2A
und/oder des C-Terminus von VPl bestimmt oder
andererseits durch Vergleich der Primärstruktur
aufgrund von Homologiestudien abgeleitet. Es ist dies
bei Polio (Pallansch, M.A. et al., 1984, J. Virol.,
49, 873-880), BEV und HRV14 (Callahan, P.L. et al.,
1985, loc. cit.) ein Tyr/Gly-, bei HRV2 (Kowalski, H.
et al., 1987, J. Gen. Virol. 86, 3197-3200;
Sommergruber, W. et al., 1989, Virology 169, 68-77)
ein Ala/Gly-, bei HRVlB (Hughes, P.J. et al., 1988, J.
Gen. Virol. 69, 49-58) und HRV89 (Düchler, M. et al.,
1987, loc. cit.) ein Val/Gly-, sowie bei Cox B1
(Iizuka, N. et al., 1987, Virology 156, 64-73), Cox B3
(Lindberg, A.M. et al., 1987, Virology 156, 50-63) und
Cox B4 (Jenkins, O. et al., 1987, J. Gen. Virol. 68,
1835-1848) ein Thr/Gly-Aminosäurepaar. Dieser Schritt
ist für den weiteren Ablauf der viralen Infektion
essentiell (Kompartimentierung von Replikation und
virus-assembly). Bei Cardio- und Aphtoviren wird, im
Gegensatz zu den Polioviren, diese Spaltung von der
Proteinase 3C katalysiert (Kräusslich, H.-G. and
Wimmer, E., 1988, loc. cit.). Vom Poliovirussystem
weiß man, daß wahrscheinlich alle an dieser
Reifungsspaltung beteiligten Enzyme viral kodiert sind
(Toyoda, H. et al., 1986, Cell 45, 761-770). Im
Poliovirus findet man drei Typen von Spaltsignalen;
die Aminosäurepaare Q-G, welche von der viralen
Proteinase 3C (im folgenden 3C genannt) erkannt
werden, das oben erwähnte Y-G Paar, welches als
2A-Erkennungssignal dient und das bei der
Reifespaltung des Kapsids verwendete N-S Spaltsignal.
Zunächst rückte die Proteinase 3C in den Mittelpunkt
des Interesses bei der Aufklärung des proteolytischen
Prozessierens von Picornaviren. Schon sehr früh konnte
eine der 3C äquivalente proteolytische Aktivität in
EMC beschrieben werden (Pelham, H. R. B. , 1978, Eur.
J. Biochem. 85, 457-461; Palmenberg A. C. et al.,
1979, J. Virol. 32, 770-778). Im Laufe weiterer
Untersuchungen stellte sich heraus, daß das
Leaderpeptid (L) von Cardio- (z. B. EMCV) und
Aphtoviren (z. B. FMDv), welches bei Rhino- und
Enteroviren nicht vorhanden ist, am proteolytischen
Prozessieren von Aphto- und Cardioviren beteiligt ist
(Palmenberg, A. C., 1987, J. Cell. Biochem. 33,
1191-1198). In weiterer Folge konnte durch die
Isolierung von Polio 3C und mit Hilfe von
immunologischen Methoden gezeigt werden, daß 3C sich
selbst autokatalytisch aus dem Polyprotein
herausschneidet, um dann intermolekular ("trans") alle
potentiellen Q-G Spaltstellen anzugreifen. Der Einsatz
von rekombinanten Systemen, die unter anderem die
3C-Region repräsentierten, ermöglichte die Expression
von 3C einiger Entero- und Rhinoviren (Werner, G. et
al., 1986, J. virol. 57, 1084-1093) und die genaue
Charakterisierung der 3C von Polio (Hanecak, R. et
al., 1984, Cell 37, 1037-1073; Korant, B. D. und
Towatari, T., 1986, Biomed. Biochim. Acta 45,
1529-1535) sowie der äquivalenten proteolytischen
Funktion in FMDV (Klump, W. et al., 1984, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81, 3351-3355; Burroughs, J. N. et
al., 1984, J. Virol. 50, 878-883). Durch "in vitro"
Mutagenesestudien konnte nachgewiesen werden, daß der
Austausch der hoch konservierten Aminosäuren Cystein
(Positionsnummer 47) und Histidin (Positionsnummer
161) in 3C von Poliovirus zu einem inaktiven Enzym
führt, während die Mutation des nicht konservierten
Cysteins (Positionsnummer 153) keinen nennenswerten
Einfluß auf die proteolytische Aktivität von Polio-3C
hat. Diese durch Oligonukleotide bewirkte Mutagenese
von rekombinanter 3C und die zusätzlich durchgeführten
Inhibitorstudien lassen den Schluß zu, daß Polio-3C zu
der Klasse der Cysteinproteasen gehört (Ivanoff, L. A.
et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
5392-5396). Ebenfalls durch "in vitro" Mutagenese von
Polio-3C (und zwar durch Austausch des konservierten
Valin gegen Alanin in Position 54 der Protease) konnte
gezeigt werden, daß diese Mutation in einer "full
size" cDNA von Polio nach Transfektion in COS 1 Zellen
zu einem Polymerase-defizienten Virus führt (Dewalt,
P. G. und Semler, B. L., 1987, J. Virol. 61,
2162-2170).
Auffallend ist, daß die flankierenden Sequenzen der
Dipeptidpaare an der Spaltstelle vielfach
Helix-brechende Aminosäuren, wie Prolin oder Threonin
enthalten. Außerdem befindet sich meistens an der
Position P4 neben einer Spaltstelle eine Aminosäure
mit einer aliphatischen Seitenkette (Nicklin, M.H.J.
et al., 1986, Biotechnol. 4, 33-42). Im Fall von Polio
(Toyoda, H. et al., 1984, J. Mol. Biol. 174, 561-585)
und Coxsackie (Iizuka, N. et al., 1987, Virology 156,
64-73; Lindberg, A.M. et al., 1987, Virology 156,
50-63; Jenkins, O. et al., 1987, J. Gen. Virol. 68,
1835-1848) kommt ein Ala vor; bei HRV ein Ala, Val
oder Leu (Skern, T. et al., 1985, loc. cit.; Duechler,
M. et al., 1987, loc. cit.; Hughes, P.J. et al., 1988,
loc. cit.; Stanway, G. et al., 1984, loc. cit.); im
Fall von Hepatitis A ein Ile, Val und Leu (Paul, A.V.
et al., 1987, Virus Res. 6, 153-171; Najarian, R. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 2627-2631); bei FMDV
ein Pro (Forss, S. et al., 1984, Nucleic Acids Res.
12, 6587-6601) und bei EMCV ein Phe oder Leu
(Palmenberg A. C. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12,
2960-2983).
In weiteren Arbeiten über die proteolytische Aktivität
von 3C konnte gezeigt werden, daß "in vitro"
exprimierte Vorläuferproteine, welche strukturelle
und Teile nicht struktureller Regionen beinhalten,
durch exogen zugegebene 3C, welche aus Extrakten von
infizierten Zellen stammte, gespalten werden (Nicklin,
M. H. J., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4002-4006;
Ypma-Wong, M. F. et al., 1988, Virology 166, 265-270).
Allerdings stellte sich dabei heraus, daß
Vorläuferproteine, denen entweder die 1A- oder die
1D-Region fehlte, sich weniger gut als Substrate
eigneten (zur systematischen Nomenklatur der
Picornavirus-Proteine siehe: Rueckert, R.R. und
Wimmer, E., 1984, J. Virol. 50, 957-959). Dieser
Befund weist auf sehr stringente Strukturanforderungen
der Proteinase 3C hin. Interessant ist auch die
Tatsache, daß in Polioviren zur Spaltung des
Kapsidvorläufers P1 in 1ABC und 1D die Anwesenheit von
3C ausreicht, jedoch für eine weitere effiziente
Spaltung in 1AB und 1C der 3C-Proteinase-Vorläufer 3CD
erforderlich ist (Ypma-Wong, M. F. und Semler, B. L.,
1987, Nucleic Acids Res. 15, 2069-2088; Ypma-Wong,
M.F. et al., 1988, loc. cit.). Dabei könnte durch
spezifische Wechselwirkungen der 3D-Region (virale
Polymerase) mit der P1-Region die Spaltstelle 1B/1C in
eine für die 3C günstige Position gebracht werden,
wodurch eine Erkennung des Spaltsignals ermöglicht
wird. Dieses Ergebnis wurde von Nicklin und
Mitarbeitern bestätigt, indem sie zeigen konnten, daß
eine im Großmaßstab produzierte und gereinigte,
rekombinante Proteinase 3C ausschließlich die Spaltung
zwischen 1C und 1D katalysiert und daß möglicherweise
für eine weitere Erkennung des Q-G Paares zwischen 1B
und 1C eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem
größeren Vorläufer und dem P1 Substrat erforderlich
ist. Außerdem zeigten sie, daß ein aus 11 Aminosäuren
bestehendes Peptid, welches der 2A/2B Spaltstelle und
den flankierenden Sequenzen im Polyprotein entspricht,
von gereinigter 3C in "trans" spezifisch gespalten
werden konnte (Nicklin, M.H.J. et al., 1988, loc.
cit.). Durch Klonieren und Exprimieren der Proteinase
3C von HRV14 in einem Maxizellsystem weiß man, daß
auch Rhino-3C proteolytisch aktiv ist und daß das
Prozessieren von 3C Vorläuferformen durch ZnCl2
spezifisch inhibiert wird (Keat-Chye, C. et al., 1988,
Gene 69, 265-274). Libby et al. konnten ebenfalls die
3C-Proteinase aus HRV14 in E. coli mittels eines
periplasmatischen Sekretionsvektors exprimieren und
die biologische Aktivität mit Hilfe eines
synthetischen Peptidsubstrats, welches die
Konsensussequenz aller der in HRV14 vorkommenden 3C
spezifischen Schnittstellen beinhaltete, nachweisen
(Libby, R.T. et al., 1988, loc. cit.). Schließlich
konnte die in E. coli exprimierte HRV14-3C gereinigt
und die enzymatische Aktivität auf ein synthetisches
"2A/2B" Peptid bewiesen werden (Knott, J.A. et al.,
1989, Eur. J. Biochem. 182, 547-555). Ferner konnte
die Spaltung von 14-16 Aminosäuren langen Peptiden,
welche die für Polio 3C authentischen Spaltstellen
repräsentieren, nach Zugabe von gereinigter Polio 3C,
demonstriert werden. Außerdem wurde die Effizienz der
verschiedenen Spaltungen mittels der Bestimmung von
v(max)/Km Werten ermittelt. Die Peptide, welche die
2C/3A Spaltstelle enthielten, wurden äußerst schnell
und effizient gespalten, so wie es auch "in vivo" bei
den Vorläuferproteinen der Fall ist; z. B. das die
3C/3D-Spaltstelle enthaltende Peptid wurde nur äußerst
langsam geschnitten - analog dem Prozessieren dieser
Stelle "in vivo". Peptide mit Q-G Paaren, aber sonst
willkürlich gewählten flankierenden Sequenzen, wurden
auch nach stundenlanger Inkubation mit sehr hohen
Konzentrationen an 3C nicht prozessiert (Pallai, P. et
al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 9738-9741). Neueste
Arbeiten zeigen, daß eine Serie von kleinen
Insertionsmutationen in der 3D-Region, die zur
Substitution von Wildtyp Sequenzen in einer
infektiösen "full size" cDNA verwendet wurden, zwar
keine lebensfähigen Viren hervorbringen, daß aber
diese Mutanten-cDNA′s in verschiedenen bakteriellen
Expressionssystemen sehr wohl 3CD-vorläufer
exprimieren, aus denen durch autokatalytische Spaltung
etwa die gleiche Menge an 3C wie im Wildtyp entsteht.
Der mutierte Vorläufer 3CD ändert aber seine
Spaltungseffizienz gegenüber der P1-Region. Manche
Insertionen beeinflußen die Aktivität von 3CD nicht,
andere wiederum eliminieren die Katalyse vollständig
(Burns, C.C., et al., 1989, Poster, EUROPIC 89, "Sixth
Meeting of the European Study Group on the Molecular
Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium). Daraus
resultiert, daß Änderungen in der Sequenz bzw. in der
Faltung einzelner Regionen im 3D-Protein verschiedene
Auswirkungen auf die Effizienz des Prozessierens
haben.
Für die Erkennung und Spaltung der potentiellen
Schnittstellen ist, wie schon zuvor erwähnt, weniger
das Aminosäurepaar unmittelbar an der Spaltstelle
maßgebend, sondern im verstärkten Maß die Sekundär
und Tertiärstruktur in der unmittelbaren Umgebung des
Spaltsignals. Die Annahme, daß es noch andere
Determinanten geben muß, geht allein schon aus der
Tatsache hervor, daß im Poliovirussystem von 3C nur 9
von insgesamt 13 vorhandenen Q-G Paaren gespalten
werden und daß in anderen Picornaviren neben Q-G auch
noch andere Spaltsignale gefunden werden. Arbeiten von
Ypma-Wong zeigen, daß die "β-barrel" Struktur der
Kapsidprotein-Vorläufer für die Erkennung und
Spezifität der Proteinase 3C bzw. 3CD von großer
Relevanz sein dürfte (Ypma-Wong, M. F. et al., 1989,
J. Biol. Chem. 263, 17 846-17 856). Durch Insertionen
von 4-6 Aminosäuren in die Pl-Region von Polio konnte
man zeigen, daß nur diejenigen Mutationen, die zu
einer Unterbrechung der "β-barrel" Struktur führen,
eine Spaltung durch die Proteinase 3C verhindern.
Insertionen in flexiblen "loop"-Regionen zeigen kaum
einen Einfluß auf die Aktivität. Eine Deletion bei der
Q-G Spaltstelle zwischen 1C und 1D bewirkt zwar eine
Inhibierung der Spaltung an dieser Stelle, übt aber
keinerlei negative Effekte auf das Prozessieren
zwischen 1AB und 1C aus (Blair, W. S. et al., 1989,
Poster, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the European
Study Group on the Molecular Biology of
Picornaviruses", Bruges, Belgium). Weiterhin zeigte
sich auch hier, daß dem aliphatischen Rest in der
Position P4, in diesem Fall ein Alanin, gewisse
Bedeutung zukommt, indem er eine funktionelle Rolle
bei der Enzym-Substrat Wechselwirkung übernehmen
dürfte.
Neuere Arbeiten mit chimären Picornavirus-
Polyproteinen ergaben, daß für das durch die 3C
vermittelte Prozessieren bei verschiedenen
Picornaviren gemeinsame strukturelle Determinanten
bestehen. Chimäre picornavirale cDNA Klone, bei denen
die 3C- bzw. 3CD-Regionen von Poliovirus durch die
Proteinase 3C bzw. 3CD von HRV14 und CoxB3 ersetzt
wurden, zeigten ein korrektes Prozessieren der P2- und
P3-Region, allerdings waren sie nicht in der Lage die
Poliovirus spezifischen Spaltsignale im
Kapsidvorläufer (P1) zu erkennen (Dewalt, P.G., et
al., 1989, J. Virol. 63, 3444-3452) . Obwohl die 3C von
HRVl4 eine Q-A und von CoxB3 eine Q-N Spaltstelle
zwischen 2B und 2C erkennt (Iizuka, N., et al., 1987,
Virology 156, 64-73; Lindberg, A. M. et al., 1987,
Virology 156, 50-63), fand eine Spaltung an diesen
besagten Stellen statt (in Polio befindet sich an
dieser Stelle ein Q-G Signal). Ein weiterer Hinweis
dafür, daß neben der speziellen Primärsequenz der
Spaltstelle eine bestimmte 3-dimensionale Konformation
des Substrats für die Erkennung maßgebend ist. Durch
Insertionsmutagenese innerhalb der 3C-Region und
Herstellung chimärer 3C-Proteine konnte aufgrund des
Ausmaßes des Prozessierens von P1, P2 und P3, welches
durch diese mutierten Proteinasen vermittelt wurde,
eine Art Hierarchie in derjeweiligen Enzym-Substrat-
Erkennung aufgestellt werden (Lawson, M. A. et al.,
1989, Poster, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the
European Study Group on the Molecular Biology of
Picornaviruses", Bruges, Belgium). Dabei zeigte sich,
daß die P3-Region (im Gegensatz zur P2-Region) die
geringste Stringenz bezüglich der Wechselwirkung mit
der 3C-Proteinase erfordert. Das Prozessieren der
P1-Region verlangt den höchsten Grad an spezifischer
Enzym-Substrat-Wechselwirkung.
Neueste Untersuchungen ergaben, daß in Polioviren,
welche offensichtlich eine strikte Spezifität für das
Prozessieren von Q-G Spaltstellen besitzen, auch
andere Aminosäurepaare als Spaltsignale akzeptiert
werden. Punktmutationen an der 3C/3D Schnittstelle
wurden in "full size"-Klonen eingeführt. Im Falle von
Q/A, Q/V und Q/S Mutationen zeigten die Viren den
Wildtyp-Phänotyp, die Einführung eines Prolins an
Stelle des Glycins hingegen erwies sich als lethal
(Kean, K.M. und Girard, M., 1989, Poster, EUROPIC 89,
"Sixth Meeting of the European Study Group on the
Molecular Biology of Picornaviruses", Bruges,
Belgium). Interessanterweise bewirkte das Q-A Paar
noch eine zusätzliche alternative Spaltung
"downstream" von 3C/3D, die aber den Phänotyp nicht
beeinflußte. Auch diese Daten geben ein gutes Beispiel
dafür, daß nicht das Spaltsignal selbst, sondern die
Struktur der Spaltregion bzw. die dreidimensionale
Faltung des Polyproteins den wesentlichsten Beitrag zu
einem effizienten Prozessieren leisten.
Antikörper, die gegen Polio-3C entwickelt wurden,
unterbanden zwar eindeutig sämtliche an Q-G
durchgeführten Spaltungen, nicht aber die Spaltung
zwischen Y-G (Hanecak, R. et al., 1982, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79, 3973-3977). Diese Beobachtung
führte zum Schluß, daß das proteolytische Prozessieren
an Y-G Stellen einer eigenen Proteinase bedarf. Der
Sitz dieser zweiten proteolytischen Aktivität konnte
in Poliovirus eindeutig 2A zugeordnet werden.
Interessant war der Befund, daß 2A eine alternative
Spaltung in der Proteinase-Polymeraseregion (3CD)
durchführt, welche ebenfalls an einer Y-G Stelle
stattfindet und inaktive Enzyme 3C und 3D liefert.
Diese Spaltung dient möglicherweise zur quantitativen
Regulation der Enzyme 3C und 3D (Lee, C.K. und Wimmer,
E., 1988, Virology 166, 1435-1441).
Da es während der Infektion mit Poliovirus in
HeLa-Zellen sehr rasch zu einem Abschalten der
Wirtsproteinsynthese kommt, die Translation der
Poliovirus-RNA jedoch unbehindert ablaufen kann, nahm
man an, daß ein oder mehrere Regulationsfaktoren der
Translation während der Infektion verändert werden.
Tatsächlich zeigen ältere Befunde, daß der
eukaryontische Initiationsfaktor 4F durch
proteolytische Spaltung der p220 Komponente während
der Poliovirusinfektion in HeLa-Zellen verändert wird
(Etchison, D. et al., 1984, J. Virol. 51, 832-837;
Etchison, D. et al., 1982, J. Biol. Chem. 257,
14 806-14 810; Etchison, D. und Etchison, J.R., 1987, J.
Virol. 61, 2702-2710). In der Folge konnte gezeigt
werden, daß 2A indirekt für diese Modifikation von
p220 in infizierten Zellen verantwortlich ist
(Kräusslich, H. G. et al., 1987, J. Vitology 61,
2711-2718; Lloyd, R.E. et al., 1986, Virology 150,
299-303; Lloyd, R.E. et al., 1987, J. Virol. 61,
2480-2488). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, daß
in mit Rhinovirus infizierten Zellen ebenfalls der
Abbau von p220 erfolgt (Kräusslich, H.-G.
unpublizierte Daten).
Die Frage nach der Transaktivität der Proteinase 2A
konnte zunächst im Poliovirussystem positiv
beantwortet werden, indem durch Insertionen und
Deletionen in 2A eine unprozessierte P1-P2 Region in
E. coli exprimiert wurde, die von 2A gespalten werden
konnte, die entweder aus mit Poliovirus infizierten
Zellen stammte (Nicklin, M. J. H. et al., 1987, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84, 4002-4006) oder "in vitro"
translatiert wurde (Kräusslich, H.-G. et al., 1987, J.
Virol. 61, 2711-2718) oder in E. coli exprimiert
wurde, oder aus Poliovirus infizierten Zellen
gereinigt wurde (König, R. und Rosenwirth, B., 1988,
J. Virol. 62, 1243-1250). Bernstein und Mitarbeiter
konnten mit Hilfe einer Poliovirusmutante klar
zwischen einer "cis"- und einer "trans"-aktiven Form
der Proteinase 2A unterscheiden. Diese 2A-Mutante
enthielt ein zusätzliches Leu zwischen der 102. und
103. Aminosäure von 2A. Diese Leu-Insertion führte
zwar zu einem wenn auch schlecht replizierendem aber
dennoch lebensfähigen Poliovirus. In mit dieser
Mutante infizierten HeLa-Zellen konnte dagegen keine
Spaltung des zellulären p220 Moleküls beobachtet
werden (Bernstein, H.D. et al., 1985, Mol. Cell. Biol.
5, 2913-2923; Bernstein, H.D. et al., 1986, J. Virol.
60, 1040-1049).
Mit Hilfe von rekombinanten Vaccinia Vektoren, die die
vollständige P1-Region und den Genabschnitt für eine
verkürzte inaktive Form der Proteinase 2A aus Polio
enthielten, konnte gezeigt werden, daß nach
Koinfektion mit jeweils einem der drei Serotypen von
Polio, mit HRV14 oder mit EMCV sowohl in den Fällen
von Polio 1,2 und 3 als auch von HRV14 ein korrektes
intermolekulares ("trans") Prozessieren an der P1/2A
Schnittstelle erfolgte. Nach Koinfektion mit EMCV fand
kein Prozessieren des inaktiven Vorläuferproteins von
Polio statt (Jewell, J.E. et al., 1990, J. Virol. 64,
1388-1393). Ferner konnte in höheren eukaryontischen
Zellen mit Hilfe von Expressionsvektoren, welche unter
der Kontrolle der LTR-Region von HIV I stehen und
mittels des "tat"-Genprodukts aktiviert werden, der
Beweis erbracht werden, daß 2A von Poliovirus das
induzierende Agens bei der Proteolyse von p220 ist
(Sun, X. H. und Baltimore, D., 1989, Proc. Natl. Acad.
Sci. 86, 2143-2146) . Weiterhin zeigten Kräusslich und
Mitarbeiter eindeutig, daß zwar die Anwesenheit einer
aktiven 2A zur proteolytischen Degradation von p220
während des "host cell shut off" unbedingt notwendig
ist, dieser Abbau aber nicht direkt von 2A
durchgeführt wird (Kräusslich, H.G. et al., 1987, loc.
cit.). Man vermutet zur Zeit, daß die Proteinase 2A in
der Lage ist, ein zelluläres Enzym zu aktivieren,
welches in der Folge die Spaltung von p220 bewirkt.
Neuere Untersuchungen geben Anlaß zu Spekulationen,
daß möglicherweise die Ca2+-abhängige zelluläre
Proteinase Calpain für diese "p220-ase" Aktivität in
Betracht zu ziehen ist. Nach diesem Modell soll die
Proteinase 2A ein inaktives Calpain durch dessen
Spaltung in eine aktive Form überführen, die in der
Folge das p220 attackiert. Die mögliche Spaltung des
Calpains könnte dabei 80 Aminosäuren vom N-Terminus
entfernt bei der Sequenz Y-G stattfinden (Wyckoff,
E.E. und Ehrenfeld, E., 1989, EUROPIC 89, "Sixth
Meeting of the European Study Group on the Molecular
Biology of Picornaviruses", Bruges, Belgium).
Möglicherweise sind die beiden Proteinasen 2A und 3C
direkt oder indirekt an der proteolytischen
Degradation von weiteren 14 zellulären Proteinen
während der Poliovirusinfektion von HeLa-Zellen
beteiligt (Urzainqui, A. und Carrasco, L., 1989, J.
Virol. 63-, 4729-4735).
Neben der raschen Inhibition der wirtszellspezifischen
Translation wird in einigen Picornaviren der
wirtszell-spezifische "shut off" der Transkription
beobachtet. Falk und Mitarbeiter konnten zeigen, daß
in FMDV die Proteinase 3C spezifisch das Histon H3
spaltet. Das modifizierte H3 bleibt dabei Chromatin
assoziiert, es fehlt aber der wahrscheinlich für die
Regulation der Transkription wichtige Teil und führt
so zu einer negativen Beeinflussung der Transkription
in Eukaryonten (Falk, M.M. et al., 1990, J. Virol. 64,
748-756). Im Rhinovirussystem wurde ebenfalls eine
Transaktivität der Proteinase 2A durch spezifische
Spaltung eines Peptidsubstrates, welches die native
Spaltregion zwischen VP1 und 2A repräsentiert,
nachgewiesen (Sommergruber, W. et al., loc. cit.).
Ein vergleich der Aminosäuresequenzen der einzelnen
viralen Proteine zeigt, daß die Polymerase- und
Proteinase-Regionen in besonderem Maße konserviert
sind. So beträgt etwa die Homologie zwischen der
Proteinase 2A von HRV89 und HRV2 85%; bei der
Proteinase 3C sind 75% der Aminosäuren identisch
(Düchler, M. et al., 1987, loc. cit.). Diese Werte
liegen wesentlich über den durchschnittlich im
Gesamtprotein beobachteten Prozentsätzen. Man kann
daher davon ausgehen, daß gerade die viralen Enzyme in
der Evolution besonders gut konserviert sind und in
ihren Eigenschaften bei verschiedenen Rhinoviren sehr
ähnlich sind. Bemerkenswert ist auch, daß zwei den
picornaviralen Proteinasen 3C und 2A ähnliche Proteine
in dem pflanzenviralen System der Comoviridae (Cowpea
Mosaic Virus) vorkommen (Garcia, J. A. et al., 1987,
Virology 159, 67-75; Verver, J. et al., 1987, EMBO 6,
549-554). Diese beiden viralen Proteine sind am
proteolytischen Prozessieren von zwei Polyproteinen
beteiligt, die durch zwei getrennt verpackte
einzelsträngige RNA Moleküle (B und M RNA) kodiert
werden. Zudem ist eine große Ähnlichkeit der beiden
Cowpea mosaic-Proteinasen in Sequenz und
Spaltspezifität zu den Picornaviren festzustellen.
Diese bemerkenswerte Homologie von nicht strukturellen
Proteinen zwischen Picorna- und Comoviren weist nicht
nur auf eine genetische Verwandtschaft zwischen diesen
beiden Virusfamilien hin, sondern zeigt auch auf, wie
essentiell das virale proteolytische Prozessieren für
diese beiden Virusfamilien ist.
Die dritte Art der viralen Reifungsspaltung, nämlich
die von 1AB (Vorläuferprotein von 1A und 1B) konnte
bei Mengo und Rhinovirus mit Hilfe von
Röntgenstrukturdaten beschrieben werden. Dieses letzte
proteolytische Ereignis bei der viralen Maturation
scheint auf einem ungewöhnlichen autokatalytischen
Serinprotease Typ zu beruhen, bei welchem basische
Gruppen der viralen RNA an der Ausbildung des
katalytischen Zentrums beteiligt sind, wobei diese
basischen Gruppen als Protonenakzeptor fungieren
(Arnold, E. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84, 21-25). Die Kristallstruktur von FMDV (Acharya, R.
et al., 1989, Nature 337, 709-716) schließt einen
solchen Mechanismus bei Aphtoviren aus.
Die Spaltstellenspezifität der viralen Proteasen wurde
im Poliovirussystem durch N-terminales Sequenzieren
der meisten Proteine ermittelt (Pallansch, M. A. et
al., 1984, loc. cit.). Durch das Klonieren und
Sequenzieren von HRV2 (Skern, T. et al., 1985, loc.
cit.) konnten anhand von Sequenzvergleichen mit
Poliovirus und HRV14 die meisten Spaltstellen
abgeleitet werden. Außerdem konnte die Lage der
Schnittstellen zwischen 1A/1B, 1B/1C sowie 1C/1D durch
N-terminales Sequenzieren von 1B, 1C und 1D bestimmt
werden. Das Spaltsignal zwischen 1D und 2A wurde, wie
bereits eingangs erwähnt, einerseits durch
C-terminales Sequenzieren von 1D (Kowalski, H. et al.,
1987, loc. cit.) andererseits durch N-terminale
Sequenzanalyse von 2A bestimmt (Sommergruber, W., et
al. 1989, loc. cit.). So konnten in HRV2 fünf
verschiedene Spaltsignale gefunden werden: Q-S, Q-G,
Q-N, A-G und E-S.
Experimentelle Daten über den katalytischen
Mechanismus von Poliovirus 3C zeigten, daß die
Protease 3C durch Inhibitoren für Thiolproteasen wie
z. B. N-Ethylmaleimid oder Jodacetamid blockiert werden
können (Pelham, H.R.B., 1978, Eur. J. Biochem. 85,
457-462; Gorbalenya, A.E. und Svitkin, Y.V., 1983,
Biochemistry USSR 48, 442-453). Aufgrund von
Vergleichen der 3C Sequenzen von Picornaviren (Argos,
P. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7251-7267) und
Punktmutationsexperimenten (Ivanoff,L. et al., 1986,
loc. cit.) wurde ein Cystein-Histidin Paar als
vermutetes aktives Zentrum definiert. Alle diese
Befunde lassen den Schluß zu, daß Polio-3C ein Cystein
im katalytischen Zentrum besitzt und der Klasse der
Cysteinproteinasen zuzuordnen ist, oder genauer
gesagt, als ein Mitglied einer neuen "Superfamilie"
von Cysteinproteinasen ohne typische Homologien zur
Cysteinproteinase Papain anzusehen ist. Zu den
Mitgliedern dieser Familie dürften auch die Proteinase
2A sowie die zwei im pflanzenviralen System der
Comoviridae (Cowpea Mosaic Virus) gefundenen
Proteinasen (Argos, P. et al., 1984, loc. cit.) und
die 49-kDa Proteinase des "Tobacco Etch Virus", ein
Vertreter der Potyviren, zählen (Dougherty, W.G. et
al., 1989, Virology 172, 302-310).
Neuere Arbeiten von Cheah, K.C. et al. (Cheah, K.C. et
al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 7180-7187) erbrachten
einen weiteren experimentellen Beweis der
funktionellen Verwandtschaft zwischen HRV14 3C und
zellulären Trypsin-ähnlichen Serin-Proteinasen. Mit
Hilfe von Punktmutationen und Immunpräzipitationsdaten
konnten sie zeigen, daß bei Punktmutation der Reste
His-40, Asp-85 und Cys-146 von HRV14 3C, welche
äquivalent der katalytischen Triade von Trypsin
(His-57, Asp-102 und Ser-195) sind, die katalytische
Aktivität inhibiert wird. Auch bei Mutation der Reste,
die der spezifischen "pocket"-Region von Trypsin
entsprechen (Thr-141, Gly-158, His-160 und Gly-162)
konnte die proteolytische Aktivität inhibiert werden,
nur bei einem konservativen Austausch von Thr-141 zu
Ser kann eine, wenn auch deutlich reduzierte,
Restaktivität beobachtet werden. Zusätzlich zeigten
Immunpräzipitationsdaten, daß zumindest die Reste
Asp-85, Thr-141 und Cys-146 in Analogie zu Trypsin in
einer leicht zugänglichen Oberflächenregion
lokalisiert sind.
Durch Vergleich mit anderen Picornaviren und weiteren
Inhibitorstudien (Parks, G.D. et al., 1986, J. Virol.
60, 376-384; König, H. und Rosenwirth, B., 1988, J.
Virol. 62, 1243-1250) sowie direkte Mutagenese des
vermuteten aktiven Zentrums der Protease 2A von HRV2
dürfte auch 2A ein Cystein als Nukleophil besitzt. Ein
Austausch des Cysteins 106 von HRV2 2A gegen ein Serin
im vermuteten aktiven Zentrum des Enzyms zerstört die
Aktivität (Sommergruber, W. et al., loc. cit.).
Außerdem konnte gezeigt werden, daß:
- - 2A von HRV2 als Substratenzym bestehend aus einem Fusionsanteil der MS2 Polymerase (98 Aminosäuren) C-terminale Teile von 1C, der Region für das virale Hüllenprotein VP1 und der Proteinase 2A selbst bei Expression in E. coli seinen eigenen N-Terminus erkennt und sich vom Vorläuferprotein abspaltet;
- - E. coli Extrakte, welche die aktive Proteinase 2A (ohne C-terminale Fusionsanteile) enthalten, spezifisch ein 16 Aminosäuren langes Peptid, das die native Spaltregion zwischen P1 und P2 in symmetrischer Art darstellt, in "trans" spalten können;
- - durch Deletion der letzten 10 C-terminalen Aminosäuren von 2A die proteolytische Funktion zerstört wird;
- - die minimale Länge eines Peptidsubstrats 12 Aminosäuren beträgt, wobei jeweils 6 Aminosäuren der "up"- und 6 Aminosäuren der "downstream"- Region vorhanden sein müssen;
- - ein Spaltsignal Tyr-Gly (wie es in Polio zw. P1 und 2A vorliegt) ebenfalls von HRV2 2A als Spaltsignal in Peptidsubstraten akzeptiert wird, daß aber andererseits ein die gesamte Poliospaltregion repräsentierendes Peptid von HRV2 2A nicht gespalten werden kann;
- - Detergentien die proteolytische Aktivität von 2A stark negativ beeinflussen, während hohe Salzkonzentrationen (z. B. 2,5 M NaCl) einen stabilisierenden Einfluß auf die Transaktivität von 2A ausüben;
- - ein gegen die letzten 20 C-terminalen Aminosäuren von 2A gerichtetes Peptidantiserum die Transaktivität "in vitro" nicht unterbindet;
- - Punktmutationen in der P1-Stelle generell einen geringen negativen Einfluß auf die Cisaktivität von 2A ausüben, mit der Ausnahme von verzweigten Aminosäuren Val und Ile, welche zu einer Reduzierung der proteolytischen Aktivität führen;
- - durch Austausch des hochkonservierten Arg 134 gegen Gln im C-Terminus von 2A ebenfalls die proteolytische Funktion unterbunden wird;
- - Deletions- und Mutationsstudien im vermutlich aktivem Zentrum von 2A die proteolytische Aktivität inhibieren;
- - HRV2 2A in "cis" nur sehr schlecht die P1-2A Spaltstelle von HRV89 prozessiert;
- - überhaupt keine "cis"-Spaltung von HRV2 2A durchgeführt werden kann, wenn die P -Regionen von Polio oder HRV14 vorliegen;
- - in "cis" 2A von HRV89 die Spaltstelle von HRV2 gegenüber ihrer eigenen bevorzugt spaltet.
(Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.; volkmann,
P. et al., 1989, EUROPIC 89, "Sixth Meeting of the
European Study Group on the Molecular Biology of
Picornaviruses", Bruges, Belgium; Sommergruber, W. et
al., ebendort; Skern, T. et al., Gordon
Conference/USA, 1990).
Diese Fakten weisen auf die überraschende "Hierarchie"
einer Spaltstelle hin; d. h. daß die Spaltstellen eine
Art Regulationspotential darstellen, das nicht eine
maximale Spaltung durch 2A ermöglicht, sondern die
Spalteffizienz dem Vermehrungszyklus des jeweiligen
Virussystem optimal anpaßt (z. B. könnte dadurch die
Geschwindigkeit der viralen Replikation des jeweiligen
Virustyp gesteuert werden).
Ein Vergleich der letzten 50 Aminosäuren mit dem
aktiven Zentrum von 2A mit der SWISSPROT
Sequenzdatenbank ergibt große Ähnlichkeiten des 2A
Proteins mit Serinproteasen und nicht mit
Cysteinproteasen. Das Cystein agiert offenbar im
aktiven Zentrum einer Serinprotease. Der Austausch des
Serins durch ein Cystein in Subtilisin (Philipp, M. et
al., 1971, Methods in Enzymology, 19, "Proteolytic
Enzymes", Colowick, S.P. und Kaplan, N. O.) zum
Thiosubtilisin durch chemische Modifikation erhält die
Esteraseaktivität; bei Trypsin wird durch gerichtete
Mutagenese des Serins in ein Cystein die Aktivität um
einen Faktor 100 000 gesenkt (Higaki, J. N. et al.,
1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52,
615-621). Zu einem ähnlichen Ergebnis, wenn auch
weniger signifikant, führt ein Vergleich des 3C
Proteins mit anderen Proteasen (Gorbalenya, A. E. et
al., 1986, FEBS Lett. 194, 253-257). Es wird sogar ein
gemeinsamer Vorläufer für Serin- und Cysteinproteasen
postuliert, dem die viralen Proteasen noch sehr
ähnlich sind (Gorbalenya, A. E. et al., 1989, FEBS
Lett. 243, 103-114). Möglicherweise stellt die
Proteinase 3C ein evolutionäres Bindeglied zwischen
Serin- und Cysteinproteinasen dar. Alle 3 könnten
Abkömmlinge einer einzigen "Urproteinase" sein
(Gorbalenya, A.E. et al., 1986, 1oc.cit.). virale
3C-Proteinasen mit einem Cystein im aktiven Zentrum
wurden in allen 4 Gruppen der Picornaviridae
identifiziert. Eine klare Unterscheidung zwischen den
beiden viralen Proteasen 2A und 3C treffen Bazan und
Fletterick. Sie finden eine starke Strukturhomologie
der 3C verschiedener Picornaviren und verwandter
Pflanzenviren mit der Chymotrypsinfamilie der
Serinproteasen bei Vergleich von Kristallstrukturen
von Chymotrypsin mit Vorhersagen über die
Sekundärstruktur der viralen Enzyme. Die für die
Struktur entscheidenden β-Faltblattkonformationen sind
konserviert, Insertionen und Deletionen treten nur in
den verbindenden Schleifen auf (Bazan, J. F. und
Fletterick, R. J., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85, 7872-7876). Das Protein 2A weist strukturelle
Gemeinsamkeiten mit der Subtilisinfamilie der
Serinproteasen auf. Die Proteine mit der höchsten
Ähnlichkeit mit den letzten 50 Aminosäuren von 2A
waren: Thaumatin I und II von Thaumatococcus daniellii
Benth, der Frucht einer einkeimblättrigen
westafrikanischen Buschpflanze (Van der Wel, H., 1972,
FEBS Lett. 21, 88-90; Iyengar, R. B. et al., 1979,
Eur. J. Biochem. 90, 195-204), von denen in der
Literatur ihre außerordentliche Süßkraft bekannt ist.
Bei der Reinigung eines verwandten Proteins, Monellin,
wird eine proteolytische Aktivität beschrieben
(Morris, J. A. und Cagan, R. H., 1972, Biochem.
Biophys. Acta 261, 114-122; Van der Wel, H., 1972,
Europ. J. Biochem. 31, 221-225), die möglicherweise
integraler Bestandteil dieser süßen Proteine ist. Vor
kurzem wurde die ausgeprägte Ähnlichkeit dieser
Proteine mit einem Proteaseinhibitor beschrieben
(Richardson, M. et al., 1987, Nature 327, 432-434),
der zu einer Gruppe von Proteinen gehört, die bei
Befall einer Pflanze durch Insekten, Mikroorganismen
oder Viren induziert wird. Einige dieser in Pflanzen
induzierten Proteine haben ebenfalls die Funktion
eines Proteinaseinhibitors bzw. einer Protease
(Cornelissen, B. J. C. et al., 1986, Nature 321,
531-532).
Cysteinproteasen sind in der Natur weit verbreitet (z. B.
Papain, Cathepsin B, H und S) und ihre
Charakterisierung und Inhibierung ist von großem
wissenschaftlichen und therapeutischen Wert (zur
Übersicht siehe Turk, V., 1986, "Cysteine Proteinases
and their Inhibitors", Walter de Gruyter; Barrett, A.
J. und Salvesen, G., 1986, "Proteinase Inhibitors",
Elsevier). Wie bereits dargelegt wurde, ist der
Infektionsablauf bei Picornaviren entscheidend von den
viralen Enzymen abhängig. Da gerade diese Enzyme
besonders gut konserviert und in ihren Eigenschaften
bei verschiedenen Rhinoviren sehr ähnlich sind, bieten
sie sich geradezu als Ziel eines chemotherapeutischen
Eingriffs an. Bevorzugtes Ziel könnte z. B. das virale
Enzym 2A sein. Der chemotherapeutische Ansatz ist die
Inhibierung der enzymatischen Aktivität durch
spezifische Inhibitoren. Inhibiert man die erste
proteolytische Aktivität, die 2A-Aktivität, so
unterbindet man jeden weiteren Reifungsprozeß des
viralen Systems. Überraschenderweise weist die
2A-Region von HRV2 nicht nur zu anderen Rhinoviren,
sondern auch zu Vertretern anderer Gruppen der
Picornaviridae eine ausgeprägte Homologie auf. Ein
Inhibitor gegen HRV2 2A könnte daher auch auf andere
Picornaviren anwendbar sein.
Die generelle Bedeutung der Inhibierung von viral
kodierten Proteinasen wurde nicht zuletzt durch
Arbeiten mit der Proteinase des humanen Immundefizienz
Virus 1 (HIV I) wieder in den Blickpunkt von möglichen
antiviralen Therapieansätzen gerückt. Durch Deletions
und Punktmutationen in der Proteinaseregion dieser Art
von Retroviren konnte die essentielle Rolle der
Proteinase bei der Reifung dieser Virenklasse erkannt
werden (Katoh, I. et al., 1985, Virol. 145, 280-292;
Kohl, N. E. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85, 4686-4690; Crowford, S. and Goff, S.P., 1985, J.
Virol. 53, 899-907). Durch Röntgenstrukturanalysen und
molekularbiologische Studien konnte weiterhin gezeigt
werden, daß die Proteinase von HIV I dem Asp-Typ
angehört, sich selbst am Vorläuferprotein prozessieren
kann (auch in rekombinanten prokaryontischen
Systemen), "in trans" spezifisch Peptide spalten kann
und als aktive Proteinase in einer homodimeren Form
vorliegt (Navia, M. A. et al., 1989, loc. cit.; Meek,
T.D. et al., 1989, loc. cit.; Katoh, I. et al., 1985,
loc. cit.). Aufgrund der Tatsache, daß die Proteinase
von HIV I in ihrer aktiven Form als Dimer vorliegt,
wurde von Wlodawer und Mitarbeitern auch die
Entwicklung spezifischer Dimerisierungs-Inhibitoren
vorgeschlagen (Wlodawer, A. et al., 1989, Science 245,
616-621). Die Entwicklung von hochspezifischen
kompetitiven Inhibitoren gegen die Proteinase von HIV
I auf der Basis von modifizierten Peptidsubstraten
wurde erst kürzlich von Tomasselli, und Mitarbeitern
beschrieben (Tomasselli, A.G. et al., 1990, Biochem.
29, 264-269). Von einem fungiziden Antibiotikum, dem
Cerulenin, war schon länger bekannt, daß es eine
antiretrovirale Aktivität gegen Rous Sarcoma Virus und
Murine Leukemia Virus besitzt (Goldfine, H. et al.,
1978, Biochem. Biophys. Acad. 512, 229-240; Katoh, I.
et al., 1986, Virus Res. 5, 265-276; ). Im Fall des
HIV I konnte die inhibitorische Wirkung von Cerulenin
eindeutig mit der Inhibierung beim proteolytischen
Prozessieren des Polyproteins von HIV I in
Zusammenhang gebracht werden (Pal, R. et al., 1988,
Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 9283-9286). Ausgehend von
dieser Tatsache konnten Blumenstein und Mitarbeiter
ein sehr schönes Beispiel bei der Entwicklung von
spezifischen Inhibitoren gegen die Proteinase HIV I
auf der Basis von synthetischen Nicht-Peptid
Inhibitoren liefern. Sie konnten nämlich die
inhibitorische Wirkung des Cerulenin auf die
Wechselwirkung des elektrophilen Epoxidrestes mit
nukleophilen Regionen der Proteinase zurückführen.
Außerdem konnte durch die Entwicklung von
synthetischen Derivaten die ursprüngliche Toxizität
des Cerulenin vermindert werden (Blumenstein, J.J. et
al., 1989, Biochem Biophys. Res. Commun. 163, 980-987).
Auch im picornaviralen System sind derzeit
verschiedenste anorganische und organische
Verbindungen, sowie Peptidderivate und Proteine
bekannt, die eine inhibitorische Wirkung auf das
proteolytische Prozessieren dieser Viren besitzen. Der
Effekt dieser Substanzen beruht auf der direkten
Wechselwirkung mit den Proteinasen (Kettner, C. A. et
al., 1987, US Patent Nr.: 46 52 552; Korant, B. D. et
al., 1986, J. Cell. Biochem. 32, 91-95) und/oder auf
dem indirekten Weg der Wechselwirkung mit Substraten
dieser Proteinasen (Geist, F. C. et al., 1987,
Antimicrob. Agents Chemother. 31, 622-624; Perrin, D.
D. und Stünzi, H., 1984, Viral Chemotherapy 1,
288-189). Das Problem bei den meisten dieser
Substanzen ist die relativ hohe Konzentration, die zur
Inhibierung nötig ist und die zum Teil große Toxizität
dieser Verbindungen. Die bereits erfolgreiche
Anwendung von modifizierten Peptiden und
Peptidomimetica als Therapeutika in nicht-viralen
Gebieten (Fauchere, J. L., 1986, Advanc. Drug Res. 15,
29-69) und das "inhibitor designing" ausgehend von
bekannten Strukturen (DesJarlais, R.L. et al., 1989,
"Viral Proteinases as Targets for Chemotherapy", in
Curr. Commun. Mol. Biol., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 203-210) sowie die Zunahme an
molekularbiologischen und physikalischen Daten über
picornavirale Proteasen erweitert das Verständnis von
Struktur und Funktion dieser viralen Enzyme und
ermöglicht so ein schrittweises rationales "designing"
-ausgehend von modifizierten Peptidsubstraten- bis hin
zu hochspezifischen und nicht toxischen
Peptidomimetica.
Aufgrund von Vergleichen mit anderen Serinproteasen
könnten die Aminosäuren His 18, Asp 35 und Cys 106 das
aktive Zentrum, bzw. die am "charge relay system"
beteiligten Reste der katalytischen Triade von HRV2-2A
bilden.
Die Bedeutung der Reste (His 18 und Asp 35) und der in
der näheren Umgebung hochkonservierten Aminosäuren für
den Aufbau der katalytischen Triade wurde durch
Oligonukleotid gesteuerte Punktmutation einerseits des
His 18 und dessen unmittelbarer Umgebung, sowie des
Asp 35 ermittelt.
Der HRV2 2A verwandte Proteinasen verwenden für den
katalytischen Mechanismus ein "charge relay system"
ähnlich dem, wie es bei Chymotrypsin angetroffen wird.
Läge ein solches "charge relay sytem" auch bei der
HRV2 2A vor, so müßte insbesondere der
Asparginsäurerest 35 hierbei eine bedeutende Rolle
spielen. Überraschenderweise führte der Austausch von
Asp 35 durch Glutaminsäure, die aus sterischen Gründen
(CH2-Gruppe) zu einer Inhibierung der Aktivität
führen sollte, lediglich zu einer gewissen Reduktion
der Aktivität. Von entscheidener Bedeutung für die
Aktivität scheint jedoch die funktionelle Gruppe, die
-COOH-Gruppe zu sein. Bei Austausch des Asp 35 gegen
Ala kommt es zu einer vollständigen Inhibierung der
Aktivität.
Es erscheint daher möglich, daß eine Substanz, die
eine Wechselwirkung mit der funktionellen Gruppe des
Asp 35 eingehen kann, beispielsweise durch eine
basische funktionelle Gruppe, die proteolytische
Aktivität der HRV2 2A beeinflussen, vorzugsweise
inhibieren kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindungen sind im
einzelnen:
Oligonukleotide, die für ein modifiziertes aktives
Zentrum der HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen
die "cis"-Aktivität der Proteinase beeinflussen,
vorzugsweise diese inhibieren.
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen die
Aminosäure 18 und/oder die Aminosäure 35 betreffen:
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen zu einem Austausch His 18→Tyr oder His 18→Ala und/oder zu einem Austausch Asp 35→Glu oder Asp 35→Ala führen.
Oligunukleotide, die für eine modifizierte HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen in dem Bereich für die hochkonservierten Aminosäuren Asn 16 und Leu 19 liegen.
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen zu einem Austausch Asa 16→Ala und/oder Leu 19→Ser führen.
Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die erfindungsgemäßen Oligonukleotide enthält.
Expressionsplasmid, daß es das pEX2A/II(His 18→Ala), pEx2A/II(His18→Tyr), pEx2A/II(Ans16→Ala), pEx2A/II(Leu19→Ser), pEx2A/II(Asp35→Glu) oder pEx2A/II(Asp35→Ala) ist.
Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der Carboxylgruppe des Asp 35 von HRV2 2A in Wechselwirkung treten kann und dadurch die proteolytische Aktivität beeinflußt, vorzugsweise inhibiert.
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen zu einem Austausch His 18→Tyr oder His 18→Ala und/oder zu einem Austausch Asp 35→Glu oder Asp 35→Ala führen.
Oligunukleotide, die für eine modifizierte HRV2 2A kodieren, wobei die Modifikationen in dem Bereich für die hochkonservierten Aminosäuren Asn 16 und Leu 19 liegen.
Oligonukleotide, bei denen die Modifikationen zu einem Austausch Asa 16→Ala und/oder Leu 19→Ser führen.
Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die erfindungsgemäßen Oligonukleotide enthält.
Expressionsplasmid, daß es das pEX2A/II(His 18→Ala), pEx2A/II(His18→Tyr), pEx2A/II(Ans16→Ala), pEx2A/II(Leu19→Ser), pEx2A/II(Asp35→Glu) oder pEx2A/II(Asp35→Ala) ist.
Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der Carboxylgruppe des Asp 35 von HRV2 2A in Wechselwirkung treten kann und dadurch die proteolytische Aktivität beeinflußt, vorzugsweise inhibiert.
Inhibitor bei dem die Wechselwirkung durch eine
basische funktionelle Gruppe ausgelöst wird.
Fig. 1 zeigt die Sequenz der Oligonukleotide wie sie
zur Mutagenese der einzelnen Aminosäuren von HRv2 2A
verwendet wurden. Kleinbuchstaben geben die native
Sequenz der cDNA von HRV2 wieder, bzw. die Sequenz des
Expressionsplasmids pEx2A/II, einer
Restriktionsenzym-modifizierten Variante von pEx2A.
Großbuchstaben weisen auf die jeweilige Mutation hin.
Ebenfalls angeführt sind die Erkennungssequenzen der
Restriktionsenzyme, die bei der Konstruktion der
Mutanten verwendet wurden. X weist auf kompatible,
überhängende Enden der doppelsträngigen
Oligonukleotide hin, wie sie zur Konstruktion der
Mutanten verwendet wurden, die aber keine
Restriktionsenzym-Erkennungssequenz darstellen.
Fig. 2 zeigt die Western blot Analyse der
Expressionsprodukte der Mutagenese der katalytischen
Triade von 2A. Am linken Bildrand sind die relativen
Molmassen in kD angeführt.
65kD: unprozessiertes Expressionsprodukt des Wildtyps
und der Mutanten
50kD: prozessiertes Expressionsprodukt der Mutanten und des Wildtyps; entspricht dem Fusionsanteil (98 Aminosäuren der MS2-Polymerase), dem C-terminalen Ende von VP3 und dem gesamten VP1
15kD: HRV2 2A
50kD: prozessiertes Expressionsprodukt der Mutanten und des Wildtyps; entspricht dem Fusionsanteil (98 Aminosäuren der MS2-Polymerase), dem C-terminalen Ende von VP3 und dem gesamten VP1
15kD: HRV2 2A
Spur 1: Restriktionsenzym-modifizierte Variante
(pEx2A/II); entspricht der Aminosäuresequenz
des Wildtyps
Spur 2: pEx2A/II(His18→Ala)
Spur 3: pEx2A/II(His18→Tyr)
Spur 4: pEx2A/II(Asn16→Ala)
Spur 5: pEx2A/II(Leu19→Ser)
Spur 6: pEx2A/II(Asp35→Glu)
Spur 7: pEx2A/II(Asp35→Ala)
Spur 2: pEx2A/II(His18→Ala)
Spur 3: pEx2A/II(His18→Tyr)
Spur 4: pEx2A/II(Asn16→Ala)
Spur 5: pEx2A/II(Leu19→Ser)
Spur 6: pEx2A/II(Asp35→Glu)
Spur 7: pEx2A/II(Asp35→Ala)
Bild A: Western blot eines 12,5% Polyacrylamidgels mit
anti-MS2 Pol Antikörper.
Bild B: Western blot eines 12,5% Polyacrylamidgels mit dem anti-PC20 Antiserum
Bild B: Western blot eines 12,5% Polyacrylamidgels mit dem anti-PC20 Antiserum
Fig. 3 zeigt schematisch die Neuschaffung von
Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme um die
Spaltstelle von HRV2-2A und im kodierenden Teil von
HRV2-2A.
Nicht fett gedruckte Restriktionsenzyme geben die
ursprünglich schon in pEx2A vorhandenen
Erkennungssequenzen wieder; eingerahmte, fettgedruckte
weisen auf die neu eingeführten Erkennungssequenzen in
pEx2A/II hin. AS bedeutet Aminosäuren.
Mutationsanalyse der Aminosäuren Asn 16, His 18, Leu
19 und Asp 35 von HRV2 2A.
1. Mutationsanalyse der hochkonservierten Reste
Asn 16, His 18 und Leu 19.
Ein Derivat des Vektors pEx2A, nämlich
pEx2A/II (siehe Beispiel 2), welches eine neu
generierte Bgl II Erkennungssequenz an
Position 3263 und eine neu eingeführte SnaB I
Restriktionsstelle an Position 3333 der
HRV2-cDNA enthält, wurde dazu verwendet, um
mit Hilfe doppelsträngiger Oligonukleotide
(siehe Fig. 1) das Leucin 19 in ein Serin, das
Histidin 18 in ein Tyrosin respektive in ein
Alanin und das Asparagin 16 in ein Alanin
umzuwandeln. Bei dieser Mutationsanalyse wurde
die neu geschaffene Restriktionsstelle Bgl II
(3263) und die bereits in der nativen cDNA
vorhandene Erkennungssequenz für BstE II
(Positionsnummer 3189) verwendet. Für die
Konstruktion wurden die verschiedenen
doppelsträngigen Mutationsoligonukleotide
(siehe Fig. 1) mit dem BstE II/Bgl II Fragment
von pEx2A/II ausgetauscht. Die Präparation der
Vektor-DNA, die Synthese, Reinigung und Einbau
der Oligonukleotide, sowie die
DNA-Sequenzierung wurden nach Standardmethoden
durchgeführt. Die Klonierung und Propagation
der Vektor-DNA wurde in E. coli W6 (lambda),
die Expression der mutierten Proteine in E.
coli 537 vorgenommen. Die Expressionsprodukte
wurden auf reduzierenden SDS-Polyacrylamiden
aufgetrennt und identische Gele wurden einer
Western-blot Analyse unterworfen, wobei
jeweils 2 verschiedene Antisera verwendet
wurden, nämlich ein monoklonaler
Mausantikörper, der gegen den N-terminalen
Teil der MS2-Polymerase gerichtet ist (Hansen,
J., 1988, et al., loc. cit) und ein
polyklonales Kaninchenantiserum, das ein
Peptid erkennt, welches aus den letzten 20
Aminosäuren der nätiven HRV2 2A besteht (im
folgenden PC20 genannt; Sommergruber, W. et
al., 1989, loc. cit.; siehe Beispiel 3).
Die Analyse der mutierten Expressionsprodukte
ergab, daß ein Austausch des His 18 gegen Ala
respektive gegen Tyr in beiden Fällen zu einer
vollständig inaktiven Proteinase 2A führt
(Fig. 2A und 2B jeweils Spur 2 und 3). Die
Mutation des hochkonservierten Asn 16 zu Ala
führt ebenfalls zu einer inaktiven HRV2 2A und
zeigt damit die Bedeutung dieses Restes für
den Aufbau eines intakten katalytischen
Zentrums auf (Fig. 2A, 2B; jeweils Spur 4),
während überraschenderweise eine Mutation des
ebenfalls hochkonservierten Leu 19 zu Ser kaum
einen negativen Einfluß auf die proteolytische
Funktion ausübt (siehe Fig. 2A, 2B; jeweils
Spur 5).
Die katalytische Bedeutung, die dem His 18
zukommt, nämlich wie oben beschrieben, am
Aufbau einer katalytischen Triade beteiligt zu
sein, wird deutlich, wenn die Primärsequenz
der HRV2 2A den bereits ermittelten
Röntgenstrukturdaten von verwandten
Serinproteasen zugeordnet wird. Die räumlich
an dieser Stelle durchaus tolerierbaren
Aminosäuren Alanin und Tyrosin können
überraschenderweise die katalytische Funktion
nicht erfüllen.
2. Einfluß der Mutation des Restes Asp 35 auf die
proteolytische Aktivität von HRV2 2A.
Um das Vorliegen eines möglichen "charge relay
system" bei HRV2 2A zu untermauern, wurde der für
diese Funktion in Frage kommende Asparaginsäure
rest 35 ausgetauscht. Für die Mutation dieses Asp-
Restes wurde wiederum das oben erwähnte
pEx2A-Derivat, nämlich pEx2A/II verwendet. Über
die native Erkennungssequenz für BstE II
(Positionsnummer 3189) und die neu generierte
Erkenungssequenz für SnaB I (Positionsnummer
3333) wurde mit Hilfe von doppelsträngigen
Oligonukleotiden (siehe Fig. 1) die Mutationen
durchgeführt. Dazu wurden die beiden
doppelsträngigen Oligonukleotide Asp 35 → Ala
bzw. Asp 35 → Glu jeweils mit dem
Verbindungsoligonukleotid 3/4 an den kompatiblen
überhängenden Enden (in Fig. 1 mit X bezeichnet) ,
die keine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz
darstellen, ligiert und in den mit BstE II und
SnaBI geschnittenen Vektor pEx2A/II insertiert.
Die in pEx2A/II neu generierte Spaltstelle für
Bgl II geht bei diesen beiden Mutationen
verloren, da der Austausch exakt in der für Bgl
II kodierenden Region stattfindet. Im Fall der
Mutation Asp 35 zu Glu bleibt zwar die
funktionelle Gruppe (-COOH) erhalten, jedoch ist
aus sterischen Gründen (zusätzliche CH2-Gruppe)
eine Inhibierung der proteolytischen Aktivität zu
erwarten. Interessanterweise zeigten
Expressionsstudien mit dieser Mutante zwar eine
Reduktion gegenüber dem Wildtyp, nicht aber eine
Inhibierung der proteolytischen Aktivität (siehe
Fig. 2A und 2B; jeweils Spur 6). Wenn Asp 35 am
"charge relay system" beteiligt ist, so sollte im
Fall des Austauschs Asp 35 zu Ala keine
proteolytische Funktion mehr nachweisbar sein.
Tatsächlich zeigten Expressionsstudien mit dieser
Mutante eine vollständige Inhibierung der
proteolytischen Aktivität (Fig. 2A und 28;
jeweils Spur 7).
Zusammenfassend lassen die oben beschriebenen
Mutationsanalysen den Schluß zu, daß His 18 und
Asp 35 am Aufbau des katalytischen Zentrums
beteiligt sind.
Einführung singulärer Erkennungssequenzen für
Restriktionsenzyme in dem für die C-terminale Region
von VPl und die HRV2-2A kodierenden Abschnitt des
Expressionsvektors pEx2A.
Um geeignete neue singuläre Restriktionsschnitt
stellen in den mittleren für die HRV2-2A kodierenden
Bereich von pEx2A (Sommergruber, W. et al, 1989,
Virology 169, 68-77) zu erhalten, wurde zunächst die
Vektor-DNA von pEx2A mit BstEII und ApaI verdaut und
vom entstandenen BstEII/ApaI- Fragment (ca. 270 bp)
auf Agarosegelen abgetrennt. Sowohl ApaI als auch
BstEII sind Erkennungssequenzen für
Restriktionsenzyme, welche ursprünglich in der cDNA
von HRV2 anzutreffen sind (Positionsnummer 3458 für
ApaI und 3188 für BstEII siehe deutsche
Patentanmeldung P 35 05 148.5). Parallel dazu wurden 3
doppelsträngige Oligonukleotide (2A-1512AB, 2A-1600AB
und 2A-1728AB), die die Region zwischen der ApaI und
der BstEII Stelle von HRV2-2A repräsentieren (siehe
Fig. 3), ligiert, mit ApaI/BstEII nachgeschnitten und
in den mit ApaI und BstEII linearisierten pEx2A-Vektor
eingebaut. Dieser modifizierte pEx2A-Vektor wurde
verwendet, um kompetente E. coli W6(1) zu
transformieren. Von einigen 100 Klonen wurden 4
aufgrund des Restriktionsmusters ausgewählt,
sequenziert und damit kompetente E. coli 537
transformiert. Das Expressionsmuster eines Klons
(pEx2A/II) zeigte identes Verhalten wie das von pEx2A
Das neu eingebrachte BstEII/ApaI-Fragment weist
singuläre Schnittstellen für BglII und SnaBI auf.
Die letzten 20 Aminosäuren der Protease 2A stellen
eine potentielle antigene Determinante dar. Ein Peptid
(PC20), welches genau diese Aminosäuresequenz aufwies,
wurde synthetisiert und zur Induktion von Antikörpern
in Kaninchen verwendet:
570 µg dieses Peptids wurden in 0,4 ml PBS Lösung
aufgenommen und in einer 5 ml Spritze aufgezogen. In
einer zweiten 5 ml Spritze wurden 0,5 ml Freund′sches
Adjuvans (CAF; GIBCO) aufgezogen und die beiden
Komponenten wurden anschließend mit Hilfe eines
Dreiweg-Sperrhahnventils vermischt, bis eine Emulsion
gebildet wurde. Das Kaninchen wurde im Ohr arteriell
punktiert, um ein Pre-Serum für die Negativkontrolle
zu erhalten. Die Immunisierung erfolgte durch
subkutane Injektion der Peptid/CFA Mischung an 4
verschiedenen Stellen (0,2 ml/Injektionsstelle) des
Rückenbereiches. Nach 5 Wochen wurde mit 1,2 ml
Peptidlösung durch Injektion von jeweils 0,2 ml
intramuskulär in den Rückenteil "geboostet". Acht Tage
später wurde das Blut durch Herzpunktion entnommen.
Das Blut ließ man bei Zimmertemperatur gerinnen,
Fibrin und geformte Bestandteile wurden mit einem
sterilen Stäbchen entfernt und das Blut bei 2000 rpm
zentrifugiert. Das Serum wurde aliquotisiert und bei
-18°C gelagert.
Claims (9)
1. Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß sie
für ein modifiziertes aktives Zentrum der HRV2 2A
kodieren, wobei die Modifikationen die
"cis"-Aktivität der Proteinase beeinflussen,
vorzugsweise diese inhibieren.
2. Oligonukleotide nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifikationen die
Aminosäure 18 und/oder die Aminosäure 35
betreffen.
3. Oligonukleotide nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifikationen zu einem
Austausch His 18 → Tyr oder His 18 → Ala und/oder
zu einem Austausch Asp 35 → Glu oder Asp 35 → Ala
führen.
4. Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß sie
für eine modifizierte HRV2 2A kodieren, wobei die
Modifikationen in dem Bereich für die
hochkonservierten Aminosäuren Asn 16 und Leu 19
liegen.
5. Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß die
Modifikationen zu einem Austausch Asa 16 → Ala
und/oder Leu 19 → Ser führen.
6. Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß
es die Oligonukleotide nach einem der Ansprüche 1
bis 5 enthält.
7. Expressionsplasmid nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß es das pEX2A/II(His
18 → Ala), pEx2A/II(His18 → Tyr),
pEx2A/II(Asn16 → Ala), pEx2A/II(Leu19 → Ser),
pEx2A/II(Asp35 → Glu) oder pEx2A/II(Asp35 → Ala)
ist.
8. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er mit der-
Carboxylgruppe des Asp 35 von HRV2 2A in
Wechselwirkung treten kann und dadurch die
proteolytische Aktivität beeinflußt, vorzugsweise
inhibiert.
9. Inhibitor gemäß Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die Wechselwirkung durch eine
basische funktionelle Gruppe ausgelöst wird.
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---|---|---|---|
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EP19910914990 EP0497950A1 (de) | 1990-08-28 | 1991-08-24 | Mutation der hrv2 2a |
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DE3505148A1 (de) * | 1985-02-15 | 1986-10-30 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Polypeptide des rhinovirusstammes hrv2 sowie die hierfuer codierenden dna-molekuele |
-
1990
- 1990-08-28 DE DE19904027154 patent/DE4027154A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-08-24 EP EP19910914990 patent/EP0497950A1/de not_active Withdrawn
- 1991-08-24 JP JP51389691A patent/JPH05501959A/ja active Pending
- 1991-08-24 CA CA 2072105 patent/CA2072105A1/en not_active Abandoned
- 1991-08-24 WO PCT/EP1991/001612 patent/WO1992003555A1/de not_active Application Discontinuation
Also Published As
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---|---|---|---|
8141 | Disposal/no request for examination |