DE4023650A1 - Ueberaufloesendes konfokales mikroskop - Google Patents

Description

1. Konfokale Mikroskopie ist dadurch gekennzeichnet, daß durch zwei Lochblenden im scannenden Betrieb Streulicht effektiv unterdrückt wird, so daß auch feine Details in der Tiefe dicker Präparate beobachtet werden können. Das konstruktive Problem ist hierbei die punktgenaue Abbildung der Lochblenden aufeinander. Es gibt deshalb noch kein konfokales Durchlichtmikroskop mit gescanntem Strahlengang. Die im folgenden beschriebene Konstruktion löst das Problem durch die Verwendung eines flächenhaften CCD-Detektors, auf dem die 2. Lochblende gewissermaßen elektronisch erzeugt wird. Beleuchtungsseitig kann eine langsam rotierende Nipkowscheibe zur gleichzeitigen Erzeugung von mehreren hundert Leuchtfeldblenden verwendet werden. Diese kleinen Blenden erzeugen, durch das Objekt amplitudenmoduliert, Beugungsscheibchen auf dem CCD (Abb. 1a). Diese Beugungsbilder bestehen aus dem Zentralpeak des Airyscheibchens mit ringförmigen sekundären etc. Maxima, bei dickeren Objekten von von Streulicht umgeben. Die elektronische Bildverarbeitung kann so programmiert werden, daß sie alle Intensitätswerte unter einer gewissen Schwelle auf Null setzt und nur Intensitäten über diesem Wert digital abgespeichert werden. Man läßt nun die Nipkowscheibe langsam rotieren. Diese Rotation kann eventuell schrittweise erfolgen, oder der Beleuchtungsstrahlengang wird gechoppt. Alle 20 ms wird Bild auf Bild im Speicher addiert, sodaß abhängig vom Verhältnis von Lochbreite zu Lochabstand in der Nipkowscheibe nach einer Zeit von 100-200 ms aus den addierten Maxima der Beugungsscheibchen ein konfokales Bild entsteht. Dies könnte durch jumping oder rolling average ständig angezeigt werden. Hierfür sollte idealerweise eine modifizierte Nipkowscheibe verwendt werden, bei der die Löcher stufenförmig gegeneinander versetzt sind (Abb. 1b), aber auch herkömmliche Scheiben können bei längeren Integrationszeiten verwendet werden. Außer einer Nipkowscheibe käme noch eine stufenförmige Beleuchtungsblendenanordnung in Frage, die von einem Polygonspiegel linear über das Bild ge­ scannt würde. Prinzipiell ist es auch möglich einen CCD-Detektor beim Laserscanmikroskop zu verwenden, allerdings muß die Programmierung der Ausleseelektronik auf Minimierung der Auslesezeit eingestellt sein. Das oben beschriebene Verfahren ist sowohl für Durchlicht- als auch für Auflichtmikroskope verwendbar.

2. Es konnte mit Laserscanmikroskopen theoretisch und praktisch gezeigt werden, daß sich die Auflösung durch Subtraktion von Bildern steigern läßt, die mit verschieden großem Lochblendendurchmesser aufgenommen wurden. Dies läßt sich nun besonders einfach mit digitaler Bildverarbeitung durchführen, indem man die Schwelle, ab der die einzelnen Zentralpeaks abgespeichert werden, auf zwei verschieden hohe Werte setzt (Abb. 2). Dies bewirkt, daß man praktisch mit zwei verschieden großen Blenden ausliest. Die Einzelbilder werden dann von einander subtrahiert und die resultierenden Bilder wieder zum konfokalen Gesamtbild im Speicher addiert. Statt dessen kann man auch einen sharpening Filter auf die Einzelbilder anwenden und dann das Ergebnis im Speicher addieren. Diese Verfahren sind im Ergebnis der Verwendung ringförmiger Detektoren equivalent. Falls bei zu dicken Präparaten sich die Zentralpeaks der Beugungsscheibchen nicht mehr deutlich vom Streulicht abheben, kann man auch die Ausleseorte auf der CCD durch die Beleuchtungsmimik bestimmen lassen, z. B. durch einen Encoder an der Nipkowscheibe.

3. Bei dünneren Objekten sollte es möglich sein, durch Fourieranalyse des Beugungsscheibchens die Auflösung weiter zu steigern. Es konnte gezeigt werden, daß bei finiten Objekten das Fourierspektrum analytisch ist, somit aus der genauen Kenntnis eines begrenzten Bereiches dieses Spektrums der Bereich jenseits der cut-off Frequenz des Mikroskops extrapliert werden kann. Dieses Verfahren ist im Wesentlichen durch Detektorrauschen begrenzt. Die Mitte der zu analysierenden Beugungsscheibchen könnte nötigenfalls durch eine center-of-gravity Funktion festgelegt werden.

4. Bei Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast könnten Bilder mit verschieden großer Bildaufspaltung aufgenommen werden, durch Verwendung verschiedener Nomarski Prismen, oder durch variablen Interferenzkontrast nach Pluta. Auch bei Verwendung von Bildaufspaltungen < 0,5 der Auflösungsgrenze sollten bei doppelten oder periodischen Strukturen Minima und Maxima der Höhe des Zentralpeaks des Airyscheibchens auftreten, in Abhängigkeit von der Weite der Bildaufspaltung. Das Mikroskop würde damit als Interferometer analog zum Michelsonschen Sterninterferometer eingesetzt. Auch mit diesem Verfahren sollten sich Präparatstrukturen unterhalb der Auflösungsgrenze rekonstruieren lassen.

Claims (4)

1. Konfokales Mikroskop, dadurch gekennzeichnet, daß die 1. Lochblende mechanisch erzeugt wird, z. B. durch eine im Beleuchtungsstrahlengang rotierende Nipkow-Scheibe. Die 2. Lochblende wird dagegen elektronisch auf einem CCD-Detektor durch das Auslese- und Bildverarbeitungsprogramm generiert.

2. Das Bildverarbeitungsprogramm erlaubt die elektronische Erzeugung beliebiger ringförmiger Ausleseblenden, sodaß die höhere räumliche Auflösung solcher Blendenkombinationen zur Darstellung feinster Strukturen (Superresolution) im Präparat verwendet werden kann.

3. Der flächenhafte CCD-Detektor erlaubt Fourieranalyse des Beugungsscheibchens, sodaß aus dem Fourierspektrum des Bildes die vom Mikroskop beschnittenen hohen räumlichen Frequenzen extrapoliert werden können (Apertursynthese).

4. Das Ausleseprogramm kann insbesondere für die Überauflösung von mit DIC-Optik erzeugten Bildern verwendet werden. Bei Verwendung variabler kleinster differentieller Bildaufspaltung sind mit dem als Interferometer arbeitenden Mikroskop kleinste laterale Abstände im Objekt meßbar.