DE4017113A1 - Prodn. of butane 2,3-di ol by batch fermentation of molasses - with inhibition of cell growth after complete uptake of carbohydrate - Google Patents

Prodn. of butane 2,3-di ol by batch fermentation of molasses - with inhibition of cell growth after complete uptake of carbohydrate

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Abstract

In prodn. of 2,3-butane diol by batch fermentation of a substrate contg. carbohydrate, using a microorganism producing 2,3-butane diol with O2 limitation, the substrate is molasses, cell growth is inhibited after complete uptake of carbohydrate and 2,3-butane diol is recovered opt. with sepn. of the cells from the medium. The substrate may be added batchwise (substrate-shift), e.g. in 2 or 3 portions. The initial substrate concn. is more than 100 g of carbohydrate/l, and is opt. raised further after a cell concn. of at least 3 g of cell dry matter/l has been rached. Growth may be inhibited by addn. of an inhibitor, esp. not less than 10 g/l of ethanol, and opt. also by breaking off the feed of medium contg. O2, e.g. air or O2. After the ending of the batch fermentation and inhibition of cell growth, the cells are sepd. from the medium and used again in the process, opt. after addn. of a growth inhibitor and breaking off the O2 feed. The renewed process may be without substrate-shift. USE/ADVANTAGE - Yield of 2,3-butane diol (I) is better, e.g. using substrate-shift the yield is 95.2-98.6 g (I)/l and 2.4-4.3 g acetoin/l, at a diol productivity of 1.0-1.1 g/l/h (96-100% of theory). (8pp Dwg.No.0/4)

Description

2,3-Butandiol weist interessante Eigenschaften und große Anwendungsbreiten auf. Diese Verbindung könnte eine wertvolle Komponente für verschiedene Polymere werden, die wahrscheinlich biologisch leicht abbaubar sind. Die Anwendungsmöglichkeiten des 2,3-Butandiols eröffnen der Substanz eine Reihe von Entwicklungsmöglichkeiten, die in Zukunft eine industrielle Produktion erwarten lassen. Diese Produktion wird dann aber auf einem mikrobiologischen Verfahren beruhen, da die heute bekannten chemischen Verfahren nicht konkurrenzfähig sind; vgl. beispielsweise Rehm, Industrielle Mikrobiologie, 2. Auflage, 1980.2,3-butanediol has interesting properties and a wide range of applications on. This connection could be a valuable component for different polymers that are likely to be biological are easily degradable. The application possibilities of the 2,3-butanediols open up a number of development opportunities for the substance, which in the future will be an industrial production can be expected. This production is then based on a microbiological Processes are based on the chemical known today Procedures are not competitive; see. for example Rehm, Industrial Microbiology, 2nd edition, 1980.

Einige Untersuchungen über die Verwendung von Zuckerrübenmelasse (Sugar Beet Melasses) und schwarze Melasse (Blackstrap Molasses) zur Produktion von 2,3-Butandiol sind in den Jahren von 1943 bis 1954 durchgeführt worden. Bei allen Untersuchungen war die erzielte Produktausbeute sehr gering und betrug etwa 0,5 g Diol/g Zucker (etwa 42 bis 67% der theoretischen Ausbeute). Dabei wurden mit einer Produktivität von 0,51 bis 0,84 g l-1 h-1 etwa 20 bis 34 g Diol/l produziert; vgl. Appl. Microbiol., 2 (1954) 355-359. 1953 wurden sogar Fermentationen im halbtechnischen Maßstab (Pilot Plant mit 4000-l-Fermenter) batchweise durchgeführt; vgl. Can. J. Technol., 31 (1953) 73- 84. Dabei wurden aus 1000 kg Melasse 182,2 kg Acetoin und 2,3- Butandiol sowie 25,5 bis 65,1 kg Ethanol gewonnen.Some research on the use of beet molasses and blackstrap molasses to produce 2,3-butanediol was conducted between 1943 and 1954. In all investigations, the product yield achieved was very low and was about 0.5 g diol / g sugar (about 42 to 67% of the theoretical yield). About 20 to 34 g diol / l were produced with a productivity of 0.51 to 0.84 gl -1 h -1 ; see. Appl. Microbiol., 2 (1954) 355-359. In 1953 even fermentations on a semi-industrial scale (pilot plant with 4000 l fermenter) were carried out in batches; see. Can. J. Technol., 31 (1953) 73-84. 182.2 kg acetoin and 2,3-butanediol and 25.5 to 65.1 kg ethanol were obtained from 1000 kg molasses.

Aufgabe der Erfindung ist es nun u. a., ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von 2,3-Butandiol aus Melasse vorzusehen. The object of the invention is now u. a., an improved process To provide 2,3-butanediol from molasses.  

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Gewinnung von 2,3-Butandiol durch chargenweise Vergärung (Batch- Fermentation) eines kohlehydrathaltigen Substrats mit Hilfe von 2,3-Butandiol produzierenden Mikroorganismen unter Sauerstoff- Limitierung gelöst, bei dem man Melasse als kohlehydrathaltiges Medium (Substrat) verwendet und nach vollständiger Kohlehydrataufnahme das Zellwachstum inhibiert und 2,3-Butandiol gewinnt und dazu gegebenenfalls die Zellen vom Medium abtrennt.According to the invention, this object is achieved by a method for extraction of 2,3-butanediol by batch fermentation (batch Fermentation) of a carbohydrate-containing substrate with the help of 2,3-butanediol producing microorganisms under oxygen Limitation solved, in which molasses as a carbohydrate Medium (substrate) used and after complete carbohydrate intake inhibits cell growth and wins 2,3-butanediol and, if necessary, to separate the cells from the medium.

Ein Beispiel für einen 2,3-Butandiol produzierenden Mikroorganismus ist Klebsiella oxytoca (= K. pneumonia = Aerobacter aerogenes).An example of a 2,3-butanediol producing microorganism is Klebsiella oxytoca (= K. pneumonia = Aerobacter aerogenes).

Um ein ausreichendes Zellwachstum trotz hoher Zuckerkonzentrationen zu erreichen, kann man das Substrat schubweise (intermittierend oder pulsierend; Substrat-shift) zugeben, beispielsweise in zwei oder drei Portionen.Adequate cell growth despite high sugar concentrations the substrate can be reached intermittently (intermittently or pulsating; Add substrate shift), for example in two or three servings.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, in einer Batch-Fermentation mit Substrat-shift 95,2 bis 98,6 g 2,3-Butandiol/l und 2,4 bis 4,3 g Acetoin/l bei einer Diolproduktivität von 1,0 bis 1,1 g l-1 h-1 zu erreichen (96 bis 100% theoretische Ausbeute).According to the process of the invention, 95.2 to 98.6 g of 2,3-butanediol / l and 2.4 to 4.3 g of acetoin / l with a diol productivity of 1.0 can be achieved in a batch fermentation with a substrate shift to reach 1.1 gl -1 h -1 (96 to 100% theoretical yield).

Es kann sein, daß der verwendete Mikroorganismus, beispielsweise eine Klebsiella-Kultur, unmittelbar nach der vollständigen Zuckeraufnahme 2,3-Butandiol mit einer sehr hohen Aufnahmerate vergärt. In einem derartigen Fall kann man durch Zellwachstum-Inhibierung die Produkt-Aufnahmefähigkeit der Kultur vollständig zum Stillstand bringen. Dadurch ist die Trennung des extrazellulär produzierten 2,3-Butandiols ohne einen Konzentrationsverlust möglich. Zur Zellwachstum-Inhibierung kann man einen Inhibitor, wie Ethanol, zusetzen, beispielsweise eine Konzentration von nicht weniger als 10 g/l. Ferner kann man zur Zellwachstum-Inhibierung die Zufuhr des sauerstoffhaltigen Mediums, wie Luft oder Sauerstoff, abbrechen. The microorganism used may, for example a Klebsiella culture, immediately after complete Sugar intake 2,3-butanediol with a very high intake rate fermented. In such a case, one can inhibit cell growth the product receptivity of the culture bring it to a complete stop. This is the separation of the extracellularly produced 2,3-butanediol without loss of concentration possible. Can inhibit cell growth to add an inhibitor such as ethanol, for example one Concentration of not less than 10 g / l. Furthermore, one can Cell growth inhibition the supply of oxygen Break off medium such as air or oxygen.  

Das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus, beispielsweise von Klebsiella oxytoca, kann auch durch hohe Substratkonzentrationen limitiert werden. So kann man eine Substrat-Ausgangskonzentration von mehr als 100 g Kohlehydrat/l vorsehen, beispielsweise von 100 bis 200 g Kohlehydrat/l. Nachdem eine Zellkonzentration von mindestens 3 g Zelltrockenmasse/l erreicht worden ist, kann man die Substratkonzentration weiter erhöhen.The growth of the microorganism used, for example from Klebsiella oxytoca, can also be caused by high substrate concentrations be limited. So you can get an initial substrate concentration of more than 100 g carbohydrate / l, for example from 100 to 200 g carbohydrate / l. After a cell concentration reached at least 3 g dry cell mass / l , the substrate concentration can be increased further.

Auch in Hinblick auf hohe Substratkonzentrationen ist die Wiederverwendung der Biomasse empfehlenswert. So kann man nach Beendigung der Batchfermentation nach Zellwachstum-Inhibierung die Zellen vom Fermentationsmedium abtrennen und mit ihrer Hilfe erneut eine chargenweise Vergärung durchführen.Also with regard to high substrate concentrations Reuse of the biomass is recommended. So you can look after End of batch fermentation after cell growth inhibition separate the cells from the fermentation medium and use their Help carry out a batch fermentation again.

Man kann eine derartige erneute chargenweise Vergärung durchführen, nachdem man einen Wachstumsinhibitor zugesetzt und die Sauerstoffversorgung abgebrochen hat. Die erneute chargenweise Vergärung kann mit oder ohne Substrat-Shift durchgeführt werden.One can carry out such a new batch fermentation, after adding a growth inhibitor and the Has cut off oxygen supply. The renewed batchwise Fermentation can be done with or without substrate shift will.

Bei diesem Vorgehen lassen sich beispielsweise aus etwa 200 g Kohlehydrate/l mit Hilfe von Klebsiella oxytoca DSM 3539 bei 16 g Zelltrockenmasse/l zu Beginn der Fermentation 118 g 2,3-Butandiol/l und 1,8 g Acetoin/l mit einer Diolproduktivität von 2,4 g l-1 h-1 und einer Ausbeute von 0,5 g Diol/g Kohlehydrat (100% des theoretischen Wertes) produzieren. Am Ende der Fermentation kann auch hier Ethanol zugesetzt werden (beispielsweise etwa 10 g/l), um eine Wiederverwertung des produzierten 2,3-Butandiols durch die Kultur zu verhindern.In this procedure, for example, about 200 g carbohydrates / l with the help of Klebsiella oxytoca DSM 3539 at 16 g dry cell mass / l at the beginning of the fermentation, 118 g 2,3-butanediol / l and 1.8 g acetoin / l with a diol productivity of 2.4 gl -1 h -1 and a yield of 0.5 g diol / g carbohydrate (100% of the theoretical value). At the end of the fermentation, ethanol can also be added here (for example about 10 g / l) to prevent the culture from reusing the 2,3-butanediol produced.

Selbstverständlich wird zumindest die Hauptmenge eines ggf. eingesetzten Inhibitors vor der Wiederverwendung der Zellen in nachfolgenden Fermentationen entfernt.Of course, at least the main amount of any inhibitor used before reusing the cells in subsequent fermentations removed.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert.The invention is illustrated below using examples and figures explained in more detail.

VoruntersuchungenPreliminary examinations Vergleichsbeispiele 1 und 2Comparative Examples 1 and 2

Es wurden Untersuchungen zur Produktion von 2,3-Butandiol aus High-Test- oder Invertmelasse (HTM) durchgeführt. Verwendet wurden die Klebsiella-oxytoca-Stämme NRCC 3006, DSM 5175, DSM 3539 und DSM 30107. Mit Glucose als Substrat wurde folgendes festgestellt. Die Herstellung von 2,3-Butandiol durch kontinuierliche Fermentationen in üblicher Form ist nicht vorteilhaft, da bei kontinuierlichen Kulturen trotz erreichbar hohen Produktivitäten nur verhältnismäß geringe Produktkonzentrationen (maximal 40 g/l) und Produktausbeuten erreichbar sind.Studies on the production of 2,3-butanediol have been carried out High-test or invert molasses (HTM) performed. Used the Klebsiella oxytoca strains NRCC 3006, DSM 5175, DSM 3539 and DSM 30107. With glucose as the substrate, the following became detected. The production of 2,3-butanediol by continuous Fermentation in the usual form is not advantageous because with continuous crops despite the high productivity that can be achieved only relatively low product concentrations (maximum 40 g / l) and product yields can be achieved.

Bei der Erfindung vorausgehenden Untersuchungen über die kontinuierliche Vergärung von Glucose änderte sich die Produktausbeute, je nach Verdünnungsrate, bei vollständiger Aufnahme der vorhandenen Glucose zwischen 34 und 80% der theoretischen Ausbeute.Previous studies in the invention on continuous Fermentation of glucose changed the product yield, depending on the dilution rate, with complete absorption of the existing glucose between 34 and 80% of theoretical Yield.

Bei den Versuchen zur kontinuierlichen Vergärung von HTM war eine vollständige Zuckeraufnahme, insbesondere von Fructose, nicht zu erreichen.When trying to ferment HTM continuously complete sugar intake, especially of fructose, unavailable.

Vergleichsbeispiele 3 und 4Comparative Examples 3 and 4

Es wurde mit den Stämmen der Vergleichsbeispiele 1 und 2 sowie Glukose als Substrat gearbeitet.It was with the strains of Comparative Examples 1 and 2 as well Glucose worked as a substrate.

Bei der 2,3-Butandiolherstellung im Fedbatch-Verfahren lassen sich die Produktausbeute und die Produktkonzentration bereits steigern. Durch Entwicklung einer pulsförmigen Substratzugabe- Strategie in einer Fed-Batch-Fermentation wurde bei der Glucosevergärung maximal eine 2,3-Butandiolkonzentration von 72 g/l mit einer Produktivität von 0,9 g l-1 h-1 und einer Produktausbeute von 88% des theoretischen Wertes erreicht. Die Substratzugabe wurde über den Kohlendioxidgehalt im Abgas geregelt; vgl. Food Biotechnol., 4 (1990) 113-122. Bei dieser Untersuchung wurde die eingesetzte Glucose bis zu einer Endkonzentration von 0,8 g/l vergoren.With 2,3-butanediol production using the fedbatch process, the product yield and the product concentration can already be increased. By developing a pulse-shaped substrate addition strategy in a fed-batch fermentation, a maximum of 2,3-butanediol concentration of 72 g / l with a productivity of 0.9 gl -1 h -1 and a product yield of 88% of the theoretical value reached. The addition of substrate was regulated via the carbon dioxide content in the exhaust gas; see. Food Biotechnol., 4 (1990) 113-122. In this investigation, the glucose used was fermented to a final concentration of 0.8 g / l.

Abb. 1 zeigt einen mit EXPCON (vgl. Food Biotechnol., 4 (1990) 113-122) geregelten Fed-Batch-Prozeß zur 2,3-Butandiol-Produktion. Fig. 1 shows a fed-batch process for the production of 2,3-butanediol controlled with EXPCON (cf. Food Biotechnol., 4 (1990) 113-122).

Bei der Melasseverwertung in Fedbatchkulturen wurde eine Produktkonzentration von 68 g/l mit einer Produktivität von 1,1 g l-1 h-1 und einer Produktausbeute von 84% des theoretischen Wertes erreicht. Die in der HTM vorhandenen Zucker, Fructose, Saccharose und Glucose (mit einem Gewichtsanteil von 25, 16 bzw. 27%) werden bis zu einer Konzentration von 1,8 g Fructose und Saccharose/l vergoren.When using molasses in fed batch cultures, a product concentration of 68 g / l was achieved with a productivity of 1.1 gl -1 h -1 and a product yield of 84% of the theoretical value. The sugar, fructose, sucrose and glucose present in the HTM (with a weight fraction of 25, 16 and 27% respectively) are fermented up to a concentration of 1.8 g fructose and sucrose / l.

Erfindunginvention

Bei der fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol ist somit die Durchführung im Batchbetrieb vorteilhaft, da bei dieser Arbeitsweise eine hohe Produktausbeute neben einer hohen Produktkonzentration erreicht werden kann. Bei derartig preisgünstigen Produkten wie 2,3-Butandiol ist wegen des verhältnismäßig hohen Preises des Ausgangsmaterials eine möglichst hohe Produktausbeute und wegen der hohen Aufarbeitungskosten eine möglichst hohe Produktkonzentration erwünscht. Um eine hohe Produktausbeute zu erzielen, muß die Batchkultur nicht nur sauerstofflimitiert, sondern auch zusätzlich wachstumsinhibiert betrieben werden. Dieser wachstumsinhibierende Effekt kann durch eine hohe Substratkonzentration (vgl. Adv. Appl. Microbiol., 32 (1987) 89-161) und/oder durch einen zusätzlich zugesetzten Inhibitor wie Milchsäure (vgl. J. Ind. Microbiol., 4 (1989) 453-456) oder Essigsäure (vgl. Appl. Env. Microbiol., 46 (1983) 630-636) erzielt werden. Um ein ausreichendes Zellwachstum trotz hoher Zuckerkonzentrationen zu erreichen, muß das Substrat schubweise zugegeben werden. Folgende Untersuchungen sind nach den oben erwähnten Überlegungen mit Invertmelasse als Kohlehydratquelle durchgeführt worden.Thus, in the fermentative production of 2,3-butanediol the implementation in batch mode advantageous because with this mode of operation a high product yield in addition to a high product concentration can be reached. With such inexpensive Products like 2,3-butanediol is proportionate because of that high price of the raw material as high as possible Product yield and because of the high refurbishment costs Highest possible product concentration desired. To a high Batch culture does not only have to achieve product yield oxygen-limited, but also additionally growth-inhibited operate. This growth-inhibiting effect can due to a high substrate concentration (see Adv. Appl. Microbiol., 32 (1987) 89-161) and / or by an additional one Inhibitor such as lactic acid (see J. Ind. Microbiol., 4 (1989) 453-456) or acetic acid (see Appl. Env. Microbiol., 46  (1983) 630-636). To ensure adequate cell growth to achieve despite high sugar concentrations, that must Substrate are added in batches. Following investigations are based on the considerations mentioned above with inverted molasses as Carbohydrate source has been carried out.

Beispiel 1Example 1

Bei den Batchkulturen mit Substrat-shift wurde zu Beginn der Fermentation mit einer Zuckerkonzentration von etwa 120 g/l und einer möglichst optimalen Begasungsrate fermentiert, um möglichst hohe Zellkonzentrationen zu erreichen. Anschließend wurden nach etwa 15 h die restlichen 40% aller Zucker (Gesamtzucker) zugegeben und die Begasung korrigiert. Verwendet wurde der Stamm Klebsiella oxytoca DSM 3539. Die Temperatur wurde konstant bei 35°C gehalten. Eine ständige und genaue pH- Kontrolle ist nicht unbedingt notwendig. Sinkt der pH unter einen Wert von 5,5, wird der pH-Wert durch eine entsprechende Menge KOH-Lösung auf einen Wert von 7,5 korrigiert. Mit Fortschreiten der Fermentation muß die Sauerstoffeintragsrate mehrfach zurückgenommen werden, so daß die Acetoinkonzentration den Wert von 7 g/l nicht überschreitet. Bei diesen Untersuchungen wurde der Fermenter konstant mit 0,3 vvm Luft begast und mit Fortschreiten der Fermentation die Rührerumdrehungsgeschwindigkeit mehrfach vermindert. Nach Vergärung des vorhandenen Zuckers wurde die Begasungsrate ebenfalls stark vermindert.In the case of batch cultures with substrate shift, the Fermentation with a sugar concentration of about 120 g / l and the best possible fumigation rate fermented to the greatest possible extent to achieve high cell concentrations. Subsequently after about 15 hours, the remaining 40% of all sugars (total sugar) added and the fumigation corrected. Used became the strain Klebsiella oxytoca DSM 3539. The temperature was kept constant at 35 ° C. A constant and accurate pH Control is not essential. If the pH drops below a value of 5.5, the pH is determined by an appropriate Corrected the amount of KOH solution to a value of 7.5. With progress the fermentation must the oxygen input rate several times be withdrawn so that the acetoin concentration Do not exceed a value of 7 g / l. In these examinations the fermenter was constantly gassed with 0.3 vvm air and with As the fermentation progresses, the stirrer rotation speed decreased several times. After fermenting the existing one Zuckers' fumigation rate was also greatly reduced.

Abb. 2 zeigt den Verlauf einer Batchfermentation mit Substratshift zur Produktion von 2,3-Butandiol aus High-Test-Melasse. Bei dieser Batchfermentation mit Substratshift wurden aus 200 g Kohlehydrate/l 95,2 bis 98,6 g 2,3-Butandiol/l und 2,4 bis 4,3 g Acetoin/l mit einer Ausbeute von ca. 96 bis 100% des theoretischen Wertes und einer Diolproduktivität von 1,0 bis 1,1 g l-1 h-1 erreicht. Das verwendete Fermentationsmedium enthielt außer 280 g Melasse/l (entsprechend etwa 199 g Kohlehydrate/l) pro Liter noch 5 g Hefeextrakt, 5 g Trypton und 2 g K₂HPO₄. Da die Klebsiella-Kulturen unmittelbar nach der vollständigen Zuckeraufnahme mit einer sehr hohen Aufnahmerate 2,3-Butandiol vergären, wurden nach Erreichen der maximalen 2,3-Butandiolkonzentration 15 g Ethanol/l als Inhibitor zugesetzt und die Begasung abgestellt. Die Abtrennung des extrazellulär produzierten Diols war somit ohne Konzentrationsverlust möglich. Fig. 2 shows the course of a batch fermentation with substrate shift for the production of 2,3-butanediol from high-test molasses. In this batch fermentation with substrate shift, from 200 g carbohydrates / l 95.2 to 98.6 g 2,3-butanediol / l and 2.4 to 4.3 g acetoin / l were obtained with a yield of approx. 96 to 100% of the theoretical value and a diol productivity of 1.0 to 1.1 gl -1 h -1 reached. The fermentation medium used contained in addition to 280 g molasses / l (corresponding to about 199 g carbohydrates / l) per liter still 5 g yeast extract, 5 g tryptone and 2 g K₂HPO₄. Since the Klebsiella cultures ferment 2,3-butanediol immediately after complete sugar absorption, 15 g ethanol / l were added as an inhibitor after the maximum 2,3-butanediol concentration was reached and the gassing was switched off. The separation of the extracellularly produced diol was thus possible without loss of concentration.

Beispiel 2Example 2

Hohe Substratkonzentrationen limitieren das Wachstum der einzusetzenden Kulturen, andererseits ist zur Steigerung der Produktausbeute eine möglichst hohe Substratkonzentration zu Beginn der Fermentation notwendig. Die Überlegung ist angebracht, daß nach Beendigung einer Batchfermentation die erzeugte Zellmasse abgetrennt und bei einer darauffolgenden Fermentation eingesetzt wird. Für die Abtrennung der Zellen aus dem Fermentationsmedium können sowohl Zentrifugen als auch Mikrofiltrationsmodule eingesetzt werden. Für diese Untersuchungen wurde ein 20-l-Fermenter mit 16 l Arbeitsvolumen und integriertem Keramik-Crossflow-Mikrofiltrationsmodul (Ultrafermenteur, Fa. Setric Genie Industriel, Toulouse, France) eingesetzt.High substrate concentrations limit the growth of the ones to be used Crops, on the other hand, is used to increase product yield the highest possible substrate concentration at the beginning fermentation necessary. The consideration is appropriate that after completion of a batch fermentation, the cell mass generated separated and in a subsequent fermentation is used. For the separation of the cells from the fermentation medium can use both centrifuges and microfiltration modules be used. For these investigations a 20 l fermenter with 16 l working volume and integrated Ceramic crossflow microfiltration module (Ultrafermenteur, Fa. Setric Genie Industriel, Toulouse, France).

Abb. 3 zeigt die schematische Anordnung eines Fermenters mit integriertem Keramik-Cross-flow-Mikrofiltrationsmodul. Fig. 3 shows the schematic arrangement of a fermenter with an integrated ceramic cross-flow microfiltration module.

Bei den Repeated-Batch-Versuchen wurden zunächst mehrfach hintereinander Batchfermentationen mit Substratshift durchgeführt und jeweils nach Beendigung der Fermentation die Zellen zurückgehalten. Durch diese Maßnahme war es möglich, die Zellmasse bis zu einer Konzentration von etwa 16 g Zelltrockenmasse/l anzureichern. Anschließend wurde die Fermentation als Batch, d. h. durch Zugabe des gesamten Substrats zu Beginn der Fermentation, durchgeführt.The repeated batch tests were initially carried out several times Batch fermentations carried out in succession with substrate shift and the cells after the end of the fermentation held back. This measure made it possible to measure the cell mass up to a concentration of about 16 g dry cell mass / l enrich. Then the fermentation was called Batch, i. H. by adding the entire substrate at the beginning of the Fermentation.

Abb. 4 zeigt den Ablauf einer solchen Repeated-Batch-Fermentation mit erhöhter Zellkonzentration. In der Endstufe dieser Fermentation wurden aus etwa 200 g/l Kohlehydraten mit einer Diolausbeute von etwa 100% des theoretischen Wertes 118 g 2,3- Butandiol/l und 1,8 g Acetoin/l produziert. Die Diolproduktivität war hier 2,4 g l-1 h-1. Der Zusatz von 15 g Ethanol pro Liter Fermentationsmedium verhindert auch hier die Produktaufnahme durch die Kultur. Bei Abtrennung des extrazellulär produzierten 2,3-Butandiols wird auch der Hauptanteil des Ethanols entfernt, wodurch eine Wiederverwendung der Kultur für die darauffolgenden Batchfermentationen möglich wird. Fig. 4 shows the sequence of such a repeated batch fermentation with an increased cell concentration. In the final stage of this fermentation, 118 g of 2,3-butanediol / l and 1.8 g of acetoin / l were produced from about 200 g / l of carbohydrates with a diol yield of about 100% of the theoretical value. The diol productivity here was 2.4 gl -1 h -1 . The addition of 15 g of ethanol per liter of fermentation medium also prevents the product from being taken up by the culture. When the extracellularly produced 2,3-butanediol is removed, most of the ethanol is also removed, which enables the culture to be reused for the subsequent batch fermentations.

Claims (9)

1. Verfahren zur Gewinnung von 2,3-Butandiol durch chargenweise Vergärung (Batch-Fermentation) eines kohlenhydrathaltigen Substrats mit Hilfe von 2,3-Butandiol produzierenden Mikroorganismen unter Sauerstoff-Limitierung, dadurch gekennzeichnet, daß man Melasse als kohlenhydrathaltiges Medium (Substrat) verwendet, nach vollständiger Kohlenhydrataufnahme das Zellwachstum inhibiert und 2,3-Butandiol gewinnt und dazu gegebenenfalls die Zellen vom Medium abtrennt.1. A process for the production of 2,3-butanediol by batch fermentation (batch fermentation) of a carbohydrate-containing substrate with the aid of 2,3-butanediol-producing microorganisms with oxygen limitation, characterized in that molasses is used as the carbohydrate-containing medium (substrate) , after complete carbohydrate absorption inhibits cell growth and wins 2,3-butanediol and, if necessary, separates the cells from the medium. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Substrat schubweise zugibt (Substrat-Shift), beispielsweise in zwei oder drei Portionen.2. The method according to claim 1, characterized in that one the substrate is added in batches (substrate shift), for example in two or three servings. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Wachstum-Inhibierung einen Wachstumsinhibitor zusetzt, beispielsweise Ethanol.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that a growth inhibitor is added to inhibit growth, for example ethanol. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Ethanol in einer Konzentration von nicht weniger als 10 g/l zusetzt. 4. The method according to claim 3, characterized in that one Ethanol in a concentration of not less than 10 g / l adds.   5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Zellwachstum-Inhibierung zusätzlich die Zufuhr des sauerstoffhaltigen Mediums, wie Luft oder Sauerstoff, abbricht.5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that in addition to the cell growth inhibition the supply of medium containing oxygen, such as air or oxygen, breaks off. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substrat-Ausgangskonzentration von mehr als 100 g Kohlenhydrate/l vorsieht und gegebenenfalls, nachdem eine Zellkonzentration von mindestens 3 g Zelltrockenmasse/l erreicht worden ist, die Substratkonzentration weiter erhöht.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that an initial substrate concentration of provides more than 100 g carbohydrates / l and, if necessary, after a cell concentration of at least 3 g dry cell mass / l has been reached, the substrate concentration continues elevated. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Beendigung der Batchfermentation nach Zellwachstum-Inhibierung die Zellen vom Fermentationsmedium abtrennt und mit ihrer Hilfe erneut ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche durchführt.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that after completion of the batch fermentation after cell growth inhibition the cells from the fermentation medium separated and with their help again a procedure according to performs one of the preceding claims. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man erneut ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 durchgeführt, nachdem man einen Wachstumsinhibitor zugesetzt und die Sauerstoffversorgung abgebrochen hat.8. The method according to claim 7, characterized in that one carried out again a method according to one of claims 1 to 6, after adding a growth inhibitor and the Has cut off oxygen supply. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man erneut ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 3 bis 6 ohne Substrat-Shift durchführt.9. The method according to claim 7 or 8, characterized in that again a method according to one of claims 1 and / or 3 to 6 without substrate shift.
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Title
REHM: Industrielle Mikrobiologie, 1980, S. 314 u. 315 *

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