DE4017103C1

DE4017103C1 -

Info

Publication number: DE4017103C1
Application number: DE4017103A
Authority: DE
Inventors: Bert Dr. Rehr; Hermann Prof. Dr. 5170 Juelich De Sahm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1990-05-28
Filing date: 1990-05-28
Publication date: 1991-10-31
Anticipated expiration: 2010-05-29
Also published as: US5190869A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Sorbit und Gluconsäure bzw. Gluconat ausgehend von wäßrigen Fructose/Glucose-Mischungen durch Stoffumwandlung mit Hilfe von permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis in Gel-immobilisierter Form.

Die Bildung von Sorbit und Gluconsäure ausgehend von Glucose-Fructose-Mischungen mittels Zymomonas mobilis ist bekannt. Bekannt ist auch (US-PS 47 55 467) die Verwendung permeabilisierter Zellen für dieses Verfahren, die ggf. in immobilisierter Kultur ein gesetzt werden sollen. Die Permeabilisierung erfolgte durch Einwirkung von Toluol. Über spezielle Mittel für die "Immobilisierung der Kultur" werden keine Angaben gemacht.

Eine besonders zweckmäßige Permeabilisierung von Zymomonas-mobilis-Zellen für die Sorbit- und Glucon säuregewinnung wird auch in der DE-PS 38 41 702 an gegeben, wonach durch eine Einfriertechnik besonders brauchbare Permeabilisate erhalten werden. In der DE-Patentanmeldung 39 36 757.6 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Sorbit und Gluconsäure mit Hilfe von kationtensid-permeabilisierten Zymomonas-mobilis- Zellen beschrieben. Auch im letzteren Falle wird die Verwendung immobilisierter Zellen empfohlen, ohne daß spezielle Trägermaterialien genannt werden.

Weit verbreitet in der biotechnologischen Prozeß führung ist die Verwendung von anorganischen Träger materialien wie insbesondere Sinterglas oder Keramik. Von M. T. Bomar wird in ZFL 6/85, Seiten 24-26, auch die Verwendung von Agargel oder Alginaten als Trägermaterialien für die Immobilisierung von Mikro organismen (z. B. E. coli) vorgesehen, wobei Agargel wegen seiner geringen Toxizität bevorzugt wird.

U. H. Chun a. a. (App. Microbiol. Biotechnol. [1988] 29, 19-24) beschreiben die Herstellung von Sorbit und Gluconsäure mit Hilfe von toluol-permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis, die in Natrium alginat/Celite®-Mischungen immobilisiert verwendet werden. Diese Immobilisate werden mit Calciumchlorid lösung gehärtet.

Von S. L. Paterson (Biocatalysis (1988) Bd. 1, Seiten 217-229) wird die Herstellung von Sorbit und Gluconsäure in einem Hohlfasermembranreaktor beschrieben, in dem toluol-behandelte Zellen von Zymomonas mobilis "immobilisiert" werden.

Bei den vorstehend beschriebenen Verfahren wird die Wirtschaftlichkeit der Sorbit- und Gluconsäurebildung durch die Verwendung von permeabilisierten Zellen zwar insoweit verbessert, als keine Nährstoffe für die Biomassebildung eingesetzt werden müssen, jedoch nimmt die Aktivität der für die Umsetzung wichtigen Enzyme relativ rasch ab: So wird z. B. bei den zuletzt beschriebenen Verfahren ein Umsatz verlust von mehr als 5% nach 5 Tagen bzw. von etwa 1,5-1,8% nach 10,5 Tagen festgestellt.

Ziel der Erfindung ist daher ein Herstellungsverfahren für Sorbit und Gluconsäure mit immobilisierten permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis, bei dem die Langzeitaktivität des Biokatalysators verbessert ist.

Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß durch K⁺-Ionen stabilisierte und gehärtete -Carrageenan- Immobilisate verwendet werden.

Die Härtung des -Carrageenan-Immobilisators erfolgt vorzugsweise durch Behandlung mit Glutaraldehyd oder durch aufeinanderfolgende Behandlung mit Polyethy lenimin oder Hexamethylendiamin und anschließende Einwirkung von Glutaraldehyd.

Während üblicherweise gepufferte Systeme verwendet werden, kann erfindungsgemäß gesonders zweckmäßig durch pH-Titration für eine Konstanthaltung des pH- Werts gesorgt werden, wofür insbesondere KOH verwendet wird, so daß bei der kontinuierlichen Durchführung des Fermentationsverfahrens keine nachteilige K⁺-Verarmung im Reaktionsmilieu stattfindet.

Besonders zweckmäßig ist eine pH-Titration mit gleich zeitiger Ausfällung von Gluconsäure durch Zugabe von Ca⁺⁺-Lösung.

Als permeabilisierte Zellen werden insbesondere mit Kationtensid behandelte Zellen von Zymomonas mobilis verwendet, wie sie gemäß der DE-Patentanmeldung P 39 36 757.6-41 erhalten werden.

Für die Immobilisierung wird insbesondere ein Carra geenananteil von 2-8%, insbesondere etwa 4% vor gesehen. Die Stabilisierung durch K⁺-Ionen erfolgt insbesondere durch Behandlung mit KCl-Lösung, wobei Einwirkzeiten von mehreren Stunden bis zu Tagen und Temperaturen bis maximal Zimmertemperatur zweck mäßig sind. Bevorzugt werden Kühlschranktemperaturen angewandt und als Lösung dient insbesondere eine 0,1-1 M KCl-Lösung.

Die auf diese Weise stabilisierten Carrageenan-Immo bilisatpartikeln (insbesondere Würfel oder Perlen) werden dann vorzugsweise bei pH 7 (HCl-neutralisiert) mit wäßriger Polyethylenimin-Lösung (z. B. 1%ig) und nachfolgend mit Glutaraldehydlösung behandelt (z. B. 0,5%ig), wobei ebenfalls maximal bei Zimmer temperatur und insbesondere bei Kühlschranktemperatur gearbeitet wird. Diese Härtungsprozedur dauert ins gesamt etwa 0,5-2 Std., wobei Einwirkzeiten von je etwa 0,5 Std. bevorzugt werden. Die Konzentration der für die Härtung vorgesehenen Flüssigkeiten ist nicht kritisch und liegt vorzugsweise zwischen 0,3 und 3%.

Statt der Polyethylenimin/Glutaraldehyd-Härtung kann auch mit Glutaraldehyd allein oder mit Glutaraldehyd und Hexamethylendiamin gehärtet werden. Andere Aldehyd- bzw. Amin/Aldehyd-Härter sind selbstverständlich anwendbar.

Die Bildung von Sorbit und Gluconsäure erfolgt mit Hilfe der Carrageenan-Immobilisate von permeabilisierten Zymomonas-mobilis-Zellen in an sich bekannter Weise und insbesodnere, wie in der DE-Patentanmeldung P 39 36 757.6-41 angegeben ist. Dabei wird vorzugs weise bei 39°C und pH 6,4 gearbeitet.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert; es zeigen

Fig. 1 und 2 Kurven für die kontinuierliche Bildung von Sorbit und Gluconsäure über längere Zeit hinweg.

Diese Produktion erfolgte mit Hilfe von CTAB-behandelten Zellen von Zymomonas mobilis, die an gehärteten -Carrageenanperlen immobilisiert waren. Die Substrat lösung enthielt 100 g/l Glucose und 100 g/l Fructose. Es wurde mit einer Verdünnungsrate von D=0,055 h^-1 gearbeitet. Die Proteinkonzentration lag bei 8,6 g/l.

Einfluß verschiedener Härtungen auf die Aktivität des Immobilisats

20 ml einer Suspension von CTAB-permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis wurden mit 80 ml Carra geenan-Lösung gemischt (Carrageenan-Gehalt der Mischung: 4%) und die in Flachschalen ausge gossene Mischung aushärten gelassen. Das in 3×3×3-mm-Würfel zerteilte Immobilisat wurde über Nacht in 0,3 M KCl belassen und dann in Chargen auf geteilt, die wie folgt weiterbehandelt wurden:

1) Die mit Kaliumionen stabilisierten Würfel wurden ohne weitere Behandlung für die Sorbit/Gluconsäure bildung verwendet.
2) Eine weitere Charge wurde 30 Min. lang bei 4°C in wäßriger Glutaraldehydlösung (mit den angegebenen Konzentrationen) inkubiert.
3) Die Würfel nach (1) wurden 30 Min. lang bei 4°C mit einer 0,1%igen Hexamethylendiaminlösung inku biert und anschließend mit Glutaraldehyd, wie unter (2) behandelt.
4) Die Würfel nach (1) wurden 30 Min. lang bei Zimmertemperatur mit 1,0%iger Polyethyleniminlösung inkubiert und anschließend mit Glutaraldehyd behandelt wir unter (2).

Die unterschiedlich behandelten Würfel wurden nach der Behandlung mit K-Citratpuffer gewaschen und Aktivitätstests im Batch-Ansatz mit 10% Glucose/10% Fructose unterworfen. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Aufstellung zusammengefaßt.

A. Behandlung mit Glutaraldehyd

B. Behandlung mit Hexamethylendiamin (0,1%) und Glutaraldehyd

C. Behandlung mit Polyethylenimin (1,0%) und Glutaraldehyd

Das heißt, durch die Härtung ergeben sich keine wesent lichen Aktivitätsverluste.

Vergleichsversuch

450 ml Würfel nach (1) wurden in einem Fließbett-fermenter von 1,5 l mit einer Substratlösung von 100+100 g/l Glucose/Fructose (Titration mit 3 N KOH) mit D=0,053 h^-1, Proteinkonzentration 6,1 g/l umgesetzt.

Umsatz nach 48 Std.: 68,8%

3,65 g Sorbit/l×h
0,6 g Sorbit/g Protein×h;

die Produktivität des Fermenters ist nach ca. 50 Tagen um die Hälfte reduziert.

Analog wurden Würfel (behandelt gemäß (4); Glutaral dehydkonzentration: 0,5%) für die Umsetzung verwendet, und zwar unter folgenden Bedingungen:

Titration mit 3 N KOH;
D=0,055 h^-1;
Proteinkonzentration 8,6 g/l
in einem Fermentervolumen von 1,6 l

Umsatzrate mit je 10% Glucose/Fructose:
4,95 g Sorbit/l×h
0,58 g Sorbit/g Protein×h
Umsatz 90,0%;

nach 75 Tagen wurden nur 3,5% Verlust an Umsatz leistung festgestellt.

Die beigefügten Fig. 1 und 2 zeigen die Sorbit- bzw. Gluconsäurebildung bei diesem Langzeitversuch.

Durch Erhöhung von D kann die Ausbeute an Sorbit und Gluconsäure bis auf 98% gesteigert werden, indem z. B. zwei aufeinanderfolgende Reaktoren verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Sorbit und Gluconsäure bzw. Gluconat ausgehend von wäßrigen Fructose/ Glucose-Mischungen durch Stoffumwandlung mit Hilfe von permeabilisierten Zellen von Zymomonas mobilis in Gel-immobilisierter Form, dadurch gekennzeichnet,
daß durch K⁺-Ionen stabilisierte und gehärtete -Carrageenan-Immobilisate eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mittels Glutaraldehyd allein oder durch Behand lung mit Hexamethylendiamin oder Polyethylenimin und Glutaraldehyd gehärtete Immobilisate eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in pufferfreier Lösung gearbeitet und die pH- Regulierung lediglich durch pH-Titration, insbesondere mit KOH, vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Titration zusammen mit einer Ausfällung der gebildeten Gluconsäure durch Zugabe von Ca⁺⁺- Ionen erfolgt.