DE4005152A1 - Transforming plant protoplast(s) with DNA-histone complex - providing high and reproducible transfer rate, and expression of foreign genes - Google Patents

Transforming plant protoplast(s) with DNA-histone complex - providing high and reproducible transfer rate, and expression of foreign genes

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DE4005152A1 DE19904005152 DE4005152A DE4005152A1 DE 4005152 A1 DE4005152 A1 DE 4005152A1 DE 19904005152 DE19904005152 DE 19904005152 DE 4005152 A DE4005152 A DE 4005152A DE 4005152 A1 DE4005152 A1 DE 4005152A1
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Abstract

The use of a DNA-histone complex (A) for transforming plant cell protoplasts is new. Also new are (1) method for expressing foreign genes in plant cells by transformed protoplasts with (A); (2) calli, and their derived plants and replicative material, produced by such transformants. Pref the histone component is of plant origin and (A) is organised nucleosomally. USE/ADVANTAGE - The use of (A) provides very effective transformation, ie much greater and more reproducible transformation rate compared with other method of direct gene transfer. In particular, many intact copies of the foreign gene can be incorporated, and expressed under control of an efficient promoter.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines DNA-Histon- Komplexes zur Transformation von Pflanzenzellen-Protoplasten. Weitere Aspekte der Erfindung werden im folgenden erläutert und in den Patentansprüchen definiert.The invention relates to the use of a DNA histone Complex for the transformation of plant cell protoplasts. Further aspects of the invention are explained below and defined in the claims.

Wienhues et al., DNA 6 (1987) 81-89 haben erkannt, daß die Übertragung "nackter" DNA in eukaryotische Zellen unter unnatürlichen Bedingungen erfolgt, weshalb sie es für wünschenswert erklärten, die DNA in natürlicherer Konformation, möglicherweise als DNA-Protein-Komplex, zu übertragen. Sie benützten deshalb einen Komplex aus Adeno-Virus 2-Protein VII, einem stark basischen viralen Protein, oder Protamin und Adeno-Virus-DNA, um damit humane, Hamster- oder Insektenzellen zu transfizieren.Wienhues et al., DNA 6 (1987) 81-89 have recognized that the Transfer of "naked" DNA into eukaryotic cells unnatural conditions, which is why they are there for Desired to make the DNA more natural Conformation, possibly as a DNA-protein complex transfer. They therefore used a complex Adenovirus 2 protein VII, a strongly basic viral Protein, or protamine, and adenovirus DNA to help human, Transfect hamster or insect cells.

Böttger et al., Biochimica et Biophysica Acta 950 (1988) 221-228 beschäftigten sich mit der Verpackung von Vektoren in natürliche Chromatin-Bestandteile. Sie erzeugten hierzu einen Komplex aus dem chromosomalen Nicht-Histon HMG1 und Vektor-DNA. Dieser Komplex kann in Säugerzellen unter physiologischen Bedingungen eingebracht werden. Die Transfektionsraten werden als gleich oder sogar höher als mit der Calciumphosphat-Copräzipitationsmethode angegeben. Es wurde weiterhin ein Schutz der DNA im Komplex vor dem Angriff durch Endonucleasen festgestellt.Boettger et al., Biochimica et Biophysica Acta 950 (1988) 221-228 dealt with the packaging of vectors in natural chromatin components. They generated for this a complex of the chromosomal non-histone HMG1 and Vector DNA. This complex can be found in mammalian cells physiological conditions are introduced. The Transfection rates are considered to be equal to or even higher than indicated with the calcium phosphate coprecipitation method. Protection of the DNA in the complex from the Attack detected by endonucleases.

Kaneda et al., Science 243 (1989) 375-378 brachten Vesikel- Komplexe aus DNA und dem Kern-Protein HMG1 in Ratten-Leber­ zellen ein. Sie spekulierten, daß der Komplex beständiger gegen Nukleasen sei oder Konformationseigenschaften habe, die einen leichteren Durchgang durch die Kernporen erlaubten als für DNA. Kaneda et al., Science 243 (1989) 375-378 brought vesicle Complexes of DNA and the core protein HMG1 in rat liver cells. They speculated that the complex would be more permanent against nucleases or have conformational properties, which allowed an easier passage through the core pores than for DNA.  

Scherneck et al., Acta virol. 27 (1983) 1-11 studierten den Einfluß von Nukleoprotein-Komplexen auf die Transfektion von Hamsterzellen mit SV40-DNA. Hierbei stellten sie fest, daß die Transformationsfähigkeit der viralen DNA nicht gesteigert werden konnte, wenn sie mit den vier nukleosomalen Histonen assoziiert wurde (Kontrolle: proteinfreie SV40-DNA).Scherneck et al., Acta virol. 27 (1983) 1-11 studied the Influence of nucleoprotein complexes on transfection of hamster cells with SV40 DNA. Here they found that the transformability of viral DNA is not could be increased when using the four nucleosomal Histones were associated (control: protein-free SV40 DNA).

Entsprechende Transformationsexperimente mit Pflanzenzellen wurden bisher nicht beschrieben. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Protoplasten von Pflanzenzellen sehr effektiv mit DNA-Histon-Komplexen transformiert werden können. Im Vergleich zu anderen Methoden des direkten Gentransfers wird nicht nur die Transformationsrate drastisch und reproduzierbar erhöht, sondern es werden auch in den Transformanten mehr intakte Kopien des eingebrachten Fremdgens gefunden. Es ist somit möglich und gewährleistet, daß das Fremdgen unter der Kontrolle eines miteingebrachten effektiven Promotors exprimiert wird. Hierdurch und durch die vermehrte Anzahl an funktionsfähigen Genkopien kann eine hohe Expressionsrate erzielt werden.Corresponding transformation experiments with plant cells have not yet been described. Surprisingly now found that protoplasts from plant cells very can be effectively transformed with DNA-histone complexes can. Compared to other direct methods Gene transfers not only make the transformation rate drastic and reproducibly increased, but also in the Transformants brought in more intact copies of the introduced Foreign gene found. It is therefore possible and guaranteed that the foreign gene is brought under the control of one effective promoter is expressed. Through and through the increased number of functional gene copies can be one high expression rate can be achieved.

Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Expression von Fremdgenen in Pflanzenzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Protoplasten mit DNA-Konstruktionen, die Histone gebunden enthalten, transformiert. Es ist bekannt, daß Histone im allgemeinen sehr hochkonservierte Proteine sind und daß Histon H3 und H4 aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen wie Hefe einen hohen Grad an Homologie aufweisen. Es wurde bereits eine ganze Reihe von Histongenen kloniert, so daß diese Produkte leicht zugänglich sind.The invention thus also relates to a method for expression of foreign genes in plant cells, which is characterized is that you can protoplasts with DNA constructions that Contain histones bound, transformed. It is known, that histones are generally very highly conserved proteins are and that histone H3 and H4 from animals, plants and Microorganisms such as yeast have a high degree of homology exhibit. A number of histone genes have already been identified cloned so that these products are easily accessible.

Aus Hofmann et al., FEBS Letters 256 (1989) 123-127 ist es bekannt, daß die Rekonstitution von Nukleosomen aus klonierter DNA und tierischen Histonen unproblematisch ist. Hierfür wurden entweder Zellextrakte oder gereinigte Histone eingesetzt. Die Isolierung funktionsfähiger pflanzlicher Histone gelingt durch Salzextraktion in Gegenwart von Harnstoff.From Hofmann et al., FEBS Letters 256 (1989) 123-127 it is known that the reconstitution of nucleosomes cloned DNA and animal histones is unproblematic. Either cell extracts or purified histones were used for this used. The isolation of functional herbal Histones are obtained by salt extraction in the presence of urea.

Für die Herstellung transgener Nutzpflanzen ist es natürlich wünschenswert, daß - außer dem gewünschten zu exprimierenden - kein fremdes Protein in die Zelle eingebracht wird. Lediglich aus diesem Gesichtspunkt, nicht aus Gründen der praktischen Durchführbarkeit werden pflanzliche Histone für die Komplexbildung bevorzugt.It is natural for the production of transgenic crops desirable that, besides the desired one to be expressed, no foreign protein is introduced into the cell. Only from this point of view, not for practical reasons Herbal histones are feasible for that Complex formation preferred.

Aus Hofmann et al., a. a. O., ist es bekannt, daß auch Komplexe, die keine nukleosomale Organisation aufweisen, DNA innerhalb dieser Komplexe gegen Nukleasen stabilisieren. Wie bereits erwähnt, vermuteten Kaneda et al., a. a. O., daß der Angriff von Nukleasen einen Einfluß auf die Transformationsrate haben könne.From Hofmann et al., A. a. O., is it known that complexes, that have no nucleosomal organization, DNA inside stabilize these complexes against nucleases. As before mentioned, suspected Kaneda et al., a. a. O. that the attack of nucleases have an impact on the rate of transformation could have.

Im Hinblick auf diese Befunde ist es also nicht erforderlich, daß die zur Transformation eingesetzten Komplexe eine strenge nukleosomale Organisation aufweisen. Bevorzugt sind jedoch Komplexe, bei denen zumindest im wesentlichen eine derartige Organisation vorliegt. Ein leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung solcher Komplexe ist bei Hofmann et al. beschrieben.So with regard to these findings, it is not required that the complexes used for transformation have a strict nucleosomal organization. Prefers are complexes, however, in which at least essentially there is such an organization. A powerful one The process for producing such complexes is at Hofmann et al. described.

Im Prinzip kann die erfindungsgemäße Transformation mit Komplexen aus Vektor-DNA und Histonen durchgeführt werden. Bevorzugt wird ein direkter Gentransfer mit den üblichen Methoden. Besonders bewährt hat sich der direkte Gentransfer mittels Elektroporation (Weising et al., Annu. Rev. Genet. 22 (1988) 421-477), mit der schon über 50 Pflanzenarten stabil transformiert werden konnten.In principle, the transformation according to the invention can also be used Complexes of vector DNA and histones can be performed. A direct gene transfer with the usual is preferred Methods. Direct gene transfer has proven particularly successful by means of electroporation (Weising et al., Annu. Rev. Genet. 22 (1988) 421-477), with over 50 plant species could be transformed stably.

Die Erfindung betrifft weiterhin Kalli, die aus den erfindungsgemäß erzeugten Transformanten gewonnen werden, aus solchen Kalli regenerierte Pflanzen sowie auf Vermehrungsgut, das aus einem solchen Kallus oder aus einer regenerierten Pflanze gewonnen wurde. The invention further relates to calli, which from the transformants produced according to the invention are obtained, plants regenerated from such calli as well Propagation material from such a callus or from a regenerated plant.  

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.The invention is illustrated in the following examples explained.

BeispieleExamples 1. Verwendetes Plasmid1. Plasmid used

Für alle Transformationsexperimente wurde das Plasmid pLGV 1103 neo (Czernilovsky et al., DNA 5 (1986) 101-113) eingesetzt. Dieses Plasmid enthält die Sequenz des Transposons Tn 5, das für die Neomycinphosphotransferase II (NPT-II) codiert, deren Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Nopalinsynthetase (NOS)-Promotors steht und am 3′-Ende mit der entsprechenden Octopinsynthetase- Terminatorsequenz gekoppelt ist. Zusätzlich enthält das Plasmid noch das Transposon Tn 903, das prokaryotische Kanamycinresistenz vermittelt. Das Gen für Kanamycin- Resistenz kodiert ein Protein, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert und damit inaktiviert. Es kann somit als selektierbarer Marker für Organismen eingesetzt werden, die nicht schon von Natur aus tolerant gegen Kanamycin sind. Für alle Transformationsversuche wurde pLGV 1103 neo an der EcoRI-Schnittstelle des pBR322 linearisiert und frei oder als Histonkomplex (Hofmann et al., a. a. O.) eingesetzt.The plasmid was used for all transformation experiments pLGV 1103 neo (Czernilovsky et al., DNA 5 (1986) 101-113) used. This plasmid contains the sequence of the Transposons Tn 5, which for neomycin phosphotransferase II (NPT-II), whose gene is under the control of the constitutive nopaline synthetase (NOS) promoter and at the 3'-end with the corresponding octopine synthetase Terminator sequence is coupled. In addition, it contains Plasmid also the transposon Tn 903, the prokaryotic Kanamycin resistance mediated. The gene for kanamycin Resistance encodes a protein called neomycin and kanamycin phosphorylated and thus inactivated. It can therefore be considered selectable markers are used for organisms, which are not inherently tolerant of kanamycin are. PLGV 1103 neo was used for all transformation attempts linearized at the EcoRI interface of pBR322 and free or as a histone complex (Hofmann et al., op. cit.) used.

2. Isolation und Reinigung von Protoplasten2. Isolation and cleaning of protoplasts

Protoplasten wurden aus jungen Blättern steril angezogener Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum, cv. Petit Havanna SR-1) isoliert. Vorversuche ergaben, daß die höchste Protoplastenausbeute aus der Sorte SR 1 gewonnen werden konnte, welche dann in allen Versuchen eingesetzt wurde. Der osmotische Wert aller Lösungen wurde mit einem Osmometer kryoskopisch ermittelt und durch Zugabe von destilliertem Wasser oder kristallinem Mannit eingestellt. Für die Isolation von Protoplasten aus Blättern von Nicotiana tabacum erwies sich ein Wert von 700 mosmol als ideal. Daher wurden alle eingesetzten Lösungen auf einen Wert von 700 mosmol ± 3% eingestellt.Protoplasts became sterile from young leaves grown tobacco plants (Nicotiana tabacum, cv. Petit Havana SR-1) isolated. Preliminary tests showed that the highest protoplast yield from grade SR 1 could be won, which then in all experiments was used. The osmotic value of all solutions  was determined cryoscopically with an osmometer and by adding distilled water or crystalline Mannite set. For the isolation of protoplasts from Nicotiana tabacum leaves a value was found of 700 mosmol as ideal. Therefore all were used Solutions to a value of 700 mosmol ± 3% set.

In eine Rollflasche (ca. 2 l) wurden 40 ml Gamborg B-5-Medium (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 506 (1968) 148-151) sowie 10 ml Enzymlösung I gegeben.40 ml of Gamborg were placed in a roller bottle (approx. 2 l) B-5 medium (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 506 (1968) 148-151) and 10 ml of enzyme solution I.

Enzymlösung I:Enzyme solution I:

1,0% Cellulase R 10
0,2% Macerozym R 10 (technische Pektinase)
4,3% Mannit
5-6 junge Tabakblätter wurden in einer Petrischale mit 0,3 M Mannit benetzt und in etwa 2×2 mm große Stücke geschnitten. Nach dem Absaugen überschüssiger Flüssigkeit wurden die Blattfragmente in die Rollflasche gegeben und 15-20 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5-10 rpm inkubiert. Die Vollständigkeit der Verdauung wurde unter dem Mikroskop geprüft. Die Protoplasten müssen kugelförmig sein. Zur Abtrennung von Sklerenchymresten, Leitbündelteilen usw. wurde durch ein Nylonnetz mit 80 µm Maschenweite gesiebt und mit Lösung W 5 (Menczel et al., Theor. Appl. Genet. 59 (1981) 191-195) auf 75 ml aufgefüllt.1.0% cellulase R 10
0.2% Macerozym R 10 (technical pectinase)
4.3% mannitol
5-6 young tobacco leaves were wetted in a petri dish with 0.3 M mannitol and cut into pieces approximately 2 × 2 mm in size. After aspirating excess liquid, the leaf fragments were placed in the roller bottle and incubated at room temperature at 5-10 rpm for 15-20 hours. The completeness of the digestion was checked under the microscope. The protoplasts must be spherical. For the separation of sclerenchyma residues, guide bundle parts, etc., sieving was carried out through a nylon mesh with a mesh size of 80 μm and made up to 75 ml with solution W 5 (Menczel et al., Theor. Appl. Genet. 59 (1981) 191-195).

Lösung W 5:Solution W 5:

154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
5 mM Glucose (pH 5,7). 154 mM NaCl
125 mM CaCl 2
5 mM KCl
5mM glucose (pH 5.7).

Im Ausschwingrotor wurde 3 Minuten lang bei 1000 rpm ohne Bremse zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die Pellets wurden sehr vorsichtig in W5 resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Pellets in einer Saccharoselösung resuspendiert.The swing-bucket rotor was at 1000 rpm for 3 minutes centrifuged without brake and the supernatant decanted. The pellets were very carefully resuspended in W5. After centrifugation again, the pellets were in a Sucrose solution resuspended.

Saccharoselösung:Sucrose solution:

0,6 M Saccharose
0,1% 4-Morpholin-ethansulfonsäure (MES, pH 5,7)
4% Percoll® (Pharmacia, synth. Polysaccharid).0.6 M sucrose
0.1% 4-morpholine-ethanesulfonic acid (MES, pH 5.7)
4% Percoll® (Pharmacia, synthetic polysaccharide).

Nach 10minütiger Zentrifugation bei 1000 rpm flotieren die Protoplasten als Bande und können mit einer 1 ml Eppendorfpipette mit abgeschnittener blauer Spitze abgesammelt werden. Sie wurden einmal mit MES-Puffer gewaschen und die Pellets nach der Zentrifugation in 2-4 ml MES-Puffer resuspendiert.After centrifugation for 10 minutes, float at 1000 rpm the protoplasts as a band and can be mixed with a 1 ml Eppendorf pipette with cut off blue tip be collected. They were once with MES buffer washed and the pellets in after centrifugation 2-4 ml of MES buffer resuspended.

MES-PufferMES buffer

0,1% MES (pH 5,7)
15 mM MgCl2
Mannit ad 600 mosmol.0.1% MES (pH 5.7)
15 mM MgCl 2
Mannitol ad 600 mosmol.

Die aufbereitete Protoplastensuspension wurde unter dem Mikroskop kontrolliert. Gereinigte Protoplasten erscheinen kugelförmig und sind nahezu frei von kontaminierenden Zellbestandteilen. Die Suspension wurde verworfen, wenn mehr als 10% sichtbar geschädigte Protoplasten enthalten waren, da dann eine ausreichende Regenerationsrate nicht sichergestellt war. Die hochgereinigten Protoplasten können direkt für die Elektroporation eingesetzt werden. The prepared protoplast suspension was placed under the Microscope checked. Purified protoplasts appear spherical and are almost free of contaminating cell components. The suspension was discarded when more than 10% visibly damaged Protoplasts were included as sufficient Regeneration rate was not ensured. The highly purified protoplasts can be used directly for the Electroporation can be used.  

3. Elektroporation3. Electroporation

Alle Experimente wurden mit dem "ELEKTROPORATOR®" (DiaLog) nach einer modifizierten Methode von Shillito et al., Biotechnology 3 (1985) 1099-1103) durchgeführt. Das Volumen der zylindrischen Kammer beträgt 1 ml bei einem Elektrodenabstand von 1 cm. Aufgrund der Ergebnisse der Vorversuche wurden für die Transformationsversuche folgende Bedingungen der Elektroporation festgelegt:All experiments were carried out with the "ELEKTROPORATOR®" (DiaLog) according to a modified method by Shillito et al., Biotechnology 3 (1985) 1099-1103). The volume of the cylindrical chamber is 1 ml with an electrode spacing of 1 cm. Based on the results of the preliminary tests, the following electroporation conditions were established for the transformation tests:

  • - Feldstärke 800 V/cm- Field strength 800 V / cm
  • - Kapazität 50 nF (vollständige Entladung)- Capacitance 50 nF (full discharge)
  • - 3 Pulse im Abstand von je 20 s.- 3 pulses at 20 s intervals.

Für die vergleichenden Versuche zwischen der Anwendung freier und nukleosomal organisierter DNA wurde die Gesamtausbeute einer Protoplastenpräparation jeweils im Verhältnis 45 : 45 : 10 aufgeteilt. Je 45% wurden mit freier beziehungsweise nukleosomal organisierter DNA elektroporiert; 10% der Protoplasten wurden als Kontrolle ohne Zusatz von DNA elektroporiert. Die Elektroporationsexperimente wurden nach der im folgenden beschriebenen Methode durchgeführt.For the comparative tests between the application free and nucleosomally organized DNA was the Overall yield of a protoplast preparation in each case Ratio 45: 45: 10 split. 45% were with each free or nucleosomally organized DNA electroporated; 10% of the protoplasts were considered Control electroporated without the addition of DNA. The Electroporation experiments were carried out according to the following described method performed.

Für die Elektroporation wurden 700 µl der Protoplastensuspension in ein Eppendorf-Gefäß gegeben und mit 50 µg Kalbsthymus-DNA als Carrier sowie 20 µg linearisiertem Plasmid pLGV 1103 neo beziehungsweise 20 µg nukleosomal organisiertem linearisiertem Plasmid pLGV 1103 neo versetzt. Nach 5 Minuten wurden 350 µl 20% Polyethylenglykol 6000 zugesetzt und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer 5 minütigen Inkubation auf Eis. 1010 µl der Suspension wurden luftblasenfrei in die vorgekühlte Kammer überführt und sofort elektroporiert. For the electroporation 700 ul of the Protoplast suspension placed in an Eppendorf tube and with 50 µg calf thymus DNA as a carrier and 20 µg linearized plasmid pLGV 1103 neo or 20 µg nucleosomally organized linearized plasmid pLGV 1103 neo offset. After 5 minutes, 350 µl 20% Polyethylene glycol 6000 added and another 10 minutes incubated at room temperature, followed by a 5 minute incubation on ice. 1010 µl of the suspension were free of air bubbles in the pre-cooled chamber transferred and immediately electroporated.  

Nach der Elektroporation wurden die Proben mit Waschpuffer W 5 (= Lösung W 5, wie oben definiert) aufgefüllt und 3 Minuten bei 1000 rpm ohne Bremse zentrifugiert. Der Niederschlag wurde anschließend vorsichtig in Gamborg B-5-Medium vorsichtig resuspendiert, dem folgende Hormone zugesetzt waren:After electroporation, the samples were taken with Wash buffer W 5 (= solution W 5, as defined above) filled up and 3 minutes at 1000 rpm without brake centrifuged. The precipitate then became careful in Gamborg B-5 medium carefully resuspended, to which the following hormones were added:

  • - 0,5 µg/ml 6-Benzylaminopurin (BAP)- 0.5 µg / ml 6-benzylaminopurine (BAP)
  • - 0,5 µg/ml a-Naphthyl-essigsäure (NAA)- 0.5 µg / ml a-naphthyl acetic acid (NAA)
  • - 0,5 µg/ml 2,4-Dichlorphenoxy-essigsäure (2.4-D).- 0.5 µg / ml 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2.4-D).

Um bakteriellen Infektionen vorzubeugen, wurden dem Medium folgende Antibiotica zugesetzt:In order to prevent bacterial infections, the The following antibiotics were added to the medium:

  • - 200 µg/ml Cefotaxim- 200 µg / ml cefotaxime
  • - 200 µg/ml Carbenicillin.- 200 µg / ml carbenicillin.

Die Suspension wurde mit einer Eppendorfpipette in Portionen zu je 2 ml in Petrischalen (⌀ 6 cm) überführt.The suspension was filled in with an Eppendorf pipette Transfer 2 ml portions into Petri dishes (⌀ 6 cm).

4. Regeneration zu Kalli4. Regeneration to calli

Die Protoplasten wurden zunächst in dem geschilderten Medium 6 Tage lang im Dunklen bei 22°C kultiviert. Der Inhalt der Petrischalen wurde täglich leicht bewegt. Nach einer Woche wurde 1 ml Gamborg B-5-Medium (unter Zusatz von 0,5 µg/ml BAP, 0,5 µg/ml NAA, 0,5 µg/ml 2.4-D, jedoch ohne Antibiotika) mit einem osmotischen Wert von 400 mosmol zugegeben. Gleichzeitig wurde die Verdunklung entfernt. Am 10. Tag nach der Isolation wurde das Medium gegen Gamborg B-5-Medium mit einem osmotischen Wert von 400 mosmol mit den oben beschriebenen Zusätzen getauscht. Am 15. Tag wurde das Medium gegen frisches Gamborg B-5-Medium (unter Zusatz von 0,5 µg/ml BAP, 0,5 µg/ml NAA, 0,5 µg/ml 2.4-D, jedoch ohne Antibiotika) ausgetauscht. Am 20. Tag hatten die Kalli eine Größe von durchschnittlich 20-50 Zellen erreicht.The protoplasts were initially described in the Medium grown in the dark at 22 ° C for 6 days. The The contents of the Petri dishes were moved slightly every day. After one week, 1 ml of Gamborg B-5 medium (under Add 0.5 µg / ml BAP, 0.5 µg / ml NAA, 0.5 µg / ml 2.4-D, but without antibiotics) with an osmotic Value of 400 mosmol added. At the same time, the Blackout removed. On the 10th day after isolation was the medium against Gamborg B-5 medium with a osmotic value of 400 mosmol with the above described additives exchanged. On the 15th day it was Medium against fresh Gamborg B-5 medium (with addition  of 0.5 µg / ml BAP, 0.5 µg / ml NAA, 0.5 µg / ml 2.4-D, but without antibiotics). Had on the 20th day the calli have an average size of 20-50 cells reached.

5. Selektion auf Kanamycinresistenz5. Selection for kanamycin resistance

Nachdem in Vorversuchen mit unbehandelten Zellen in keinem Falle eine spontane Toleranz gegen eine Kanamycinkonzentration von 60 µg/mI nachgewiesen werden konnte, wurden alle weiteren Versuche mit Kanamycin als Selektionsmittel ausgeführt.After in preliminary experiments with untreated cells in never a spontaneous tolerance against one Kanamycin concentration of 60 µg / ml can be detected could, all further experiments with Kanamycin as Selection means executed.

Zur Selektion wurden die Kalli am 20. Tag nach der Protoplastenisolation in Gamborg B-5-Medium mit 0,8% Agarose, 0,5 µg/ml BAP, 0,5 µg/ml NAA, 0,5 µg/ml 2.4-D sowie 60 µg/ml Kanamycinsulfat eingebettet. Die Hormone sowie das Kanamycinsulfat (aus einer wäßrigen Stammlösung mit einer Konzentration von 60 mg/ml) wurden bei 50°C zugesetzt. Anschließend wurde das Medium im Wasserbad auf 37°C abgekühlt. Die Kalli wurden in das auf 37°C abgekühlte Medium (je Petrischale 3 ml) eingegossen und möglichst gleichmäßig verteilt. Unter diesen Bedingungen eingegossene Kalli können mit einem inversen Mikroskop ohne Schwierigkeiten beobachtet werden. Am 34. Tag nach der Einbettung in das Selektionsmedium wurden die Kalli zusammen mit der Agarose auf sterile Rundfilter (⌀ 80 mm) überführt. Der Inhalt wurde gleichmäßig auf 2 Rundfilter verteilt und mit einem Löffelspatel dünn ausgestrichen. Die Filterpapiere wurden anschließend auf Petrischalen (⌀ 95 mm) gelegt, die mit Selektionsmedium (Gamborg B-5-Medium mit den oben beschriebenen Hormonzusätzen sowie 60 µg/ml Kanamycinsulfat) gelegt. Aufgrund der Diffusion wurden die Kalli nun mit den Bestandteilen der frischen Medienschicht versorgt, so daß ein Mangel an Ionen oder Hormonen sowie Kanamycinsulfat durch Verbrauch oder Zerfall ausgeglichen werden kann.The calli were selected for selection on the 20th day after the Protoplast isolation in Gamborg B-5 medium with 0.8% Agarose, 0.5 µg / ml BAP, 0.5 µg / ml NAA, 0.5 µg / ml 2.4-D and 60 µg / ml kanamycin sulfate embedded. The hormones and kanamycin sulfate (from an aqueous stock solution with a concentration of 60 mg / ml) were at 50 ° C. added. The medium was then in a water bath cooled to 37 ° C. The calli were in the at 37 ° C cooled medium (3 ml per Petri dish) and poured distributed as evenly as possible. Under these conditions Poured calli can with an inverted microscope can be observed without difficulty. On the 34th day after the calli were embedded in the selection medium together with the agarose on sterile round filters (⌀ 80 mm) transferred. The content was evenly on 2nd Spread round filter and thin with a spatula crossed out. The filter papers were then on Petri dishes (⌀ 95 mm) placed with selection medium (Gamborg B-5 medium with those described above Hormone additives and 60 µg / ml kanamycin sulfate). Due to the diffusion, the calli were now with the  Components of the fresh media layer supplied, so that a lack of ions or hormones as well Kanamycin sulfate balanced by consumption or decay can be.

Zur Beendigung der Selektion auf Kanamycinresistenz wurden die Filterpapiere in neue Petrischalen mit dem gleichen Medium, jedoch ohne Zusatz von Kanamycinsulfat, umgesetzt. Dieser Vorgang wurde dreimal im Abstand von je zwei Tagen wiederholt. Durch die Diffusion gelangte der größte Teil des Kanamycinsulfats in die untere Mediumschicht und wurde so von den Kalli entfernt, während Ionen und Hormone aus der unteren Schicht nachgeliefert werden können. Die Dauer der Selektion auf kanamycinhaltigem Medium wurde zwischen 18 und 35 Tagen variiert. In Kontrollversuchen mit unbehandeltem Kalli konnte nach 18tägiger Selektion auf 60 µg/ml in keinem Fall ein überlebender Kallus nachgewiesen werden. Nach der Selektion wurden die überlebenden Kalli zunächst 2-6 Wochen lang auf kanamycinfreiem Medium gehalten, um ein Wachstum bis zu einer Größe von etwa 3-5 mm zu erreichen.To end the selection for kanamycin resistance were the filter papers in new petri dishes with the same medium, but without the addition of kanamycin sulfate, implemented. This process was spaced three times repeated two days each. Through diffusion most of the kanamycin sulfate in the lower Medium layer and was removed from the calli, while ions and hormones from the lower layer can be delivered later. The duration of the selection Medium containing kanamycin was between 18 and 35 days varies. In control experiments with untreated calli could select to 60 µg / ml in no surviving callus can be proven. After the selection, the surviving calli initially on kanamycin-free medium for 2-6 weeks kept growing up to a size of about To reach 3-5 mm.

6. Differenzierung und Regeneration zu Pflanzen6. Differentiation and regeneration to plants

Für die Einleitung der Differenzierung wurden die 3-5 mm großen Kalli von den Filterpapieren entfernt und in Petrischalen mit Differenzierungsmedium umgesetzt. Als Differenzierungsmedium wurde Murashige/Skoog-Medium (Murashige et al., Physiol. Plant. (1962) 473-497) mit einem Zusatz von 1,0 µg/ml BAP eingesetzt. Um sicherzustellen, daß die Kalli auch in dieser Phase der Ontogenese das NPT-II-Gen exprimieren, wurde routinemäßig ein Zusatz von 60 µg/ml Kanamycinsulfat beigegeben. Die Kalli wurden bereits zu diesem Zeitpunkt vereinzelt und individuell gekennzeichnet. Unter diesen Bedingungen zeigten die Kalli gutes Wachstum, deutliche Ergrünung sowie Ansätze zur Sproßbildung. Nach 14 Tagen wurden die nun ergrünten, teilweise differenzierten Kalli auf Murashige/Skoog-Medium unter Zusatz von 0,1 µg/ml BAP umgesetzt. Auf eine weitere Zugabe von Kanamycinsulfat wurde verzichtet. Innerhalb von 10-20 Tagen differenzierten sich aus jedem Kallus mehrere Sprosse, die teilweise schon Blätter ansetzten oder trugen.The 3-5 mm were used to initiate the differentiation large calli removed from the filter papers and in Petri dishes implemented with differentiation medium. As The differentiation medium became Murashige / Skoog medium (Murashige et al., Physiol. Plant. (1962) 473-497) an addition of 1.0 µg / ml BAP was used. Around ensure that the calli also in this phase of Ontogenesis expressing the NPT-II gene routinely an addition of 60 µg / ml kanamycin sulfate added. The calli were already at that time  isolated and individually marked. Under these Conditions showed the calli good growth, clear Greening and approaches to sprouting. After 14 days the now greened, partially differentiated Calli on Murashige / Skoog medium with the addition of 0.1 µg / ml BAP implemented. On another addition of Kanamycin sulfate was omitted. Within 10-20 Days differentiated from each callus Rungs, some of which already have leaves or carried.

Zur Bewurzelung der Sprosse wurden von diesen etwa 1 cm lange Stücke abgeschnitten und auf frisches hormonfreies Murashige/Skoog-Medium aufgeIegt. Dem Medium wurden 60 µg/ml Kanamycinsulfat zugesetzt. Diese zusätzliche Erschwernis sollte verhindern, daß Transformanten, die das NPT-II-Gen nur während bestimmter Stadien ihrer Ontogenese exprimieren, in der Statistik als positive Klone erscheinen. Durch die Kombination dieser stringenten Selektions-Schritte sollte sichergestellt werden, daß weder spontane Mutanten noch Transformanten mit geringer oder nur temporärer Aktivität des NPT-Gens fälschlicherweise als positive Klone in statistische Auswertungen eingehen. Bewurzelte Pflanzen wurden in Kulturgefäße oder Container mit hormonfreiem Murashige/Skoog-Medium umgesetzt und bei 22°C im Kunstlicht kultiviert. Dem Medium wurden grundsätzlich 60 µg/ml Kanamycinsulfat beigegeben, um die Selektionsbedingungen aufrecht zu erhalten.To root the shoot, about 1 cm of it was taken cut long pieces and put on fresh hormone-free Murashige / Skoog medium laid on. The medium was 60 µg / ml Kanamycin sulfate added. This additional Difficulty should prevent transformants that the NPT-II gene only during certain stages of their Express ontogenesis in statistics as positive Clones appear. By combining this stringent selection steps should be ensured be that neither spontaneous mutants nor transformants with little or only temporary activity of the NPT gene erroneously as positive clones in statistical Receive evaluations. Rooted plants were in Culture vessels or containers with hormone-free Murashige / Skoog medium implemented and at 22 ° C in Cultivated artificial light. The medium were basically 60 µg / ml Kanamycin sulfate added to the To maintain selection conditions.

7. Ergebnisse der vergleichenden Versuche7. Results of the comparative tests

Zur Auswertung der Effizienz des Verfahrens wurde die maximale Kanamycinkonzentration der einzelnen Transformanten ermittelt, unter welcher diese auf hormonfreiem Medium noch aus Sproßstücken intakte Pflanzen regenerieren können. To evaluate the efficiency of the process, the maximum kanamycin concentration of each Transformants determined under which this is based hormone-free medium still intact from sprouts Plants can regenerate.  

Zur experimentellen Durchführung wurden Sproßstücke auf hormonfreies Murashige/Skoog-Medium mit verschiedenen Kanamycinkonzentrationen aufgelegt und geprüft, ob eine Bewurzelung stattfand. Sproßstücke von etwa 1 cm Länge wurden dazu leicht in das Medium hineingedrückt. Von jedem Klon wurden je zwei Kulturen mit den nachfolgenden Kanamycinkonzentrationen angelegt:
60 µg<ml Kanamycinsulfat
125 µg/ml Kanamycinsulfat
250 µg/ml Kanamycinsulfat
500 µg/ml Kanamycinsulfat
1000 µg/ml Kanamycinsulfat.To carry out the experiment, shoots were placed on hormone-free Murashige / Skoog medium with different kanamycin concentrations and checked whether rooting took place. For this purpose, shoot pieces of about 1 cm in length were pressed gently into the medium. Two cultures with the following kanamycin concentrations were set up from each clone:
60 µg <ml kanamycin sulfate
125 µg / ml kanamycin sulfate
250 µg / ml kanamycin sulfate
500 µg / ml kanamycin sulfate
1000 µg / ml kanamycin sulfate.

Während des Versuchs wurden die Pflanzen bei 22°C im Kunstlicht gehalten. Umsetzungen fanden nicht statt. Die Auswertung wurde nach 21 Tagen vorgenommen. Es wurde dabei bewertet, ob die SproßstückeDuring the experiment, the plants were at 22 ° C in Artificial light kept. There were no implementations. The Evaluation was carried out after 21 days. It was thereby evaluated whether the sprouts

  • a) Blätter gebildet hatten, die grün und frei von Ausbleichung durch den Einfluß des Kanamycins waren,a) had formed leaves that were green and free of Fading due to the influence of kanamycin,
  • b) deutliche Wurzeln gebildet hatten, die im Medium und nicht nur in der Luft wuchsen, undb) had clearly formed roots in the medium and didn't just grow in the air, and
  • c) die Ergebnisse in den zwei identischen Ansätzen auch identisch waren.c) the results in the two identical approaches as well were identical.

Nur wenn alle drei Bedingungen a) bis c) erfüllt waren, wurde der Klon als resistent gegen die entsprechende Kanamycinkonzentration bezeichnet. Konnte erst nach mehr als 21 Tagen eine Bewurzelung beobachtet werden, so wurden die entsprechenden Klone als nicht-resistent gegen die entsprechende Kanamycinkonzentration bezeichnet, da eine nachlassende Wirkung des Kanamycins nicht auszuschließen war. Die Ergebnisse wurden in Statistiken zusammengefaßt und graphisch präsentiert. Only if all three conditions a) to c) were met the clone was considered resistant to the corresponding Kanamycin concentration. Could only after more rooting is observed after 21 days the corresponding clones became non-resistant against the corresponding kanamycin concentration referred to as a diminishing effect of the kanamycin could not be ruled out. The results were in Statistics summarized and presented graphically.  

Fig. 1 Resistenz gegen Kanamycinsulfat der Transformanten, die in 5 Versuchsansätzen erhalten wurden, bei denen je 20 µg freier DNA zur Transformation eingesetzt wurden. Fig. 1 Resistance to kanamycin sulfate of the transformants, which were obtained in 5 test batches in which 20 ug free DNA were used for the transformation.

Fig. 2 Resistenz gegen Kanamycinsulfat der Transformanten, die in 5 Versuchsansätzen erhalten wurden, bei denen je 20 µg nukleosomal organisierte DNA zur Transformation eingesetzt wurden. Fig. 2 Resistance to kanamycin sulfate of the transformants, which were obtained in 5 test batches in which 20 ug nucleosomally organized DNA were used for the transformation.

Claims (8)

1. Verwendung eines DNA-Histon-Komplexes zur Transformation von Pflanzenzellen-Protoplasten.1. Use of a DNA-histone complex for Transformation of plant cell protoplasts. 2. Verfahren zur Expression von Fremdgenen in Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protoplasten mit DNA-Konstruktionen, die Histone gebunden enthalten, transformiert.2. Process for the expression of foreign genes in Plant cells, characterized in that the Protoplasts with DNA constructions, the histones contained bound, transformed. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Histone pflanzliche Histone sind.3. The method according to claim 2, characterized in that the histones are vegetable histones. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der DNA-Histon-Komplex nucleosomal organisiert ist.4. The method according to claim 2 or 3, characterized characterized in that the DNA-histone complex is nucleosomal is organized. 5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe der Elektroporation erfolgt.5. Method according to one or more of the preceding Claims, characterized in that the Transformation is done with the help of electroporation. 6. Kalli, erhalten aus Transformanten, die nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5 erhalten wurden.6. Calli, obtained from transformants following one or several of claims 2 to 5 were obtained. 7. Pflanzen, erhalten aus einem Kallus nach Anspruch 6.7. Plants obtained from a callus according to claim 6. 8. Vermehrungsgut, erhalten aus einem Kallus nach Anspruch 6 oder aus einer Pflanze nach Anspruch 7.8. Propagation material obtained from a callus according to claim 6 or from a plant according to claim 7.
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