DE4000773A1

DE4000773A1 - Highly sensitive immunological detection method - esp. for low mol.wt. pollutants, with extra wash stage between addn. of sample and tracer

Info

Publication number: DE4000773A1
Application number: DE19904000773
Authority: DE
Inventors: Renate Groenert; Wolfgang Dr Mies; Wolfgang Dr Pfeiffer
Original assignee: PFEIFFER BIOANALYTIK KG DR
Current assignee: PFEIFFER BIOANALYTIK KG DR
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1990-08-09

Abstract

In an immunological detection method, the new feature is that between addn. of sample antigen and tracer, additional washing steps are carried out. Pref. the method can be applied to systems where a radioisotope, enzyme, fluorescent substance or an electronic-signal generating cpd. is used as label. USE/ADVANTAGE - The method is used to detect low mol.wt. cpds., esp. environmentally important cpds. such as plant protection agents in drinking water. The extra washing step eliminates both cooperative and competitive effects in the test, so that reagent requirements are relaxed, esp. unpurified polyclonal antibodies can be used and the degree of antigen substitution on the enzyme is less critical. The detection sensitivity is icnreased, e.g. a limit of 1ng/l in an enzyme-immunoassay system using a single photo-optical measurement. The test kits are simpler and less expensive to produce.

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Verfahren zum hoch empfindlichen Nachweis von niedermolekularen Stoffen, insbesondere von umweltrelevanten Stoffen, wie Pflanzenschutzmittel.The invention relates to an immunological method for high sensitive detection of low molecular weight substances, in particular of environmentally relevant substances such as pesticides.

Die Trinkwasserverordnung und die "EG-Richtlinie über die Qualität von Wasser für den menschlichen Gebrauch" legen Grenzwerte für noch tolerierbare Mengen dieser Stoffe im Trinkwasser fest. Für einzel ne Substanzen beträgt dabei die Höchstgrenze 0,0001 mg/l (100 ng/l), und insgesamt darf die Summe dieser Stoffe die Konzen tration von 0,0005 mg/l (500 ng/l) nicht überschreiten. Für eine genau Analytik sollte die Nachweisgrenze ein bis zwei Größen ordnungen unter diesem Wert liegen. Die große Zahl der in Frage kommenden Stoffe und die niedrigen Grenzwerte stellen jedoch ein großes Problem für die chemische Analytik dar. Physikalisch-chemische Analysenmethoden (GC, GC-MS, HPLC) erfordern aufwendige Anreicherungs verfahren für eine Identifizierung und Quantifizierung von che mischen Stoffen und sind sehr kostspielig und zeitaufwendig, im Falle von wasserlöslichen Substanzen sind sie z. T. überhaupt nicht durchführbar.The Drinking Water Ordinance and the "EC Directive on Quality of water for human use "set limits for still tolerable amounts of these substances in drinking water. For single ne substances the maximum limit is 0.0001 mg / l (100 ng / l), and in total the sum of these substances may be the conc Do not exceed 0.0005 mg / l (500 ng / l). For one Exactly analytics, the detection limit should be one or two sizes orders are below this value. The large number of in question coming substances and the low limit values set however is a major problem for chemical analysis. Physico-chemical Analysis methods (GC, GC-MS, HPLC) require complex enrichment procedure for identification and quantification of che mix fabrics and are very expensive and time consuming, in the case of water-soluble substances they are e.g. T. at all not feasible.

Immunoassays sind hochempfindliche Testsysteme zur quantitativen Bestimmung von Substanzen auf der Grundlage der Antigen-Antikörper Reaktion. Dabei werden die Antikörper zunächst durch Immunisierung von Labortieren induziert und aus deren Seren oder aus Antikörper produzierenden Lymphozyten gewonnen, und über Affinitätssäulen oder nach herkömmlichen Verfahren gereinigt. Antikörper stellen eines der natürlichen Abwehrsysteme höherer tierischer Lebewesen dar. Die Abwehrfunktion beruht darauf, daß spezifische Antikörper aufgrund einer natürlichen Infektion oder einer "künstlichen In fektion" beim Impfen induziert werden. Eine gewisse Molekülgröße ist hierbei zur Bildung von Antikörpern wesentliche Voraussetzung. Soll gegen sehr kleine Moleküle, beispielsweise Pflanzenbehand lungsmittel, eine spezifische Antikörperbildung ausgelöst werden, so müssen diese (Haptene) vor der Immunisierung an ein hochmole kulares Trägermolekül, wie z. B. ein Protein (Hämocyanin, Rinder serumalbumin, Ovalbumin, Thyroglobulin, Polylysin und andere) ge koppelt werden.Immunoassays are highly sensitive test systems for quantitative Determination of substances based on antigen antibodies Reaction. The antibodies are first immunized induced by laboratory animals and from their sera or from antibodies producing lymphocytes, and via affinity columns or cleaned by conventional methods. Put antibodies one of the natural defense systems of higher animal beings The defense function is based on the fact that specific antibodies due to a natural infection or an "artificial in infection "during vaccination. A certain molecular size is an essential prerequisite for the formation of antibodies. Should be used against very small molecules, for example plant treatment specific antibody formation are triggered So these (haptens) must be immolated before they are immunized kular carrier molecule, such as. B. a protein (hemocyanin, cattle serum albumin, ovalbumin, thyroglobulin, polylysine and others) ge be coupled.

Für den Nachweis eines chemischen Stoffes benutzt man in Immunoassays die Antigen-Antikörper-Bindung, die bei Zugabe des chemischen Stoffes als Antigen in der Probe zu dem Antikörper auftritt. Im Kopetitive Immunoassays die für Moleküle unterhalb von 1000 Daltons angewendet werden, konkurrieren die zu bestimmenden Antigene mit markierten Antigenen gleicher Spezifität um die Bindungsstellen am Antikörper. In neuerer Zeit hat der Enzym-Immunoassay (EIA) gegenüber dem Radioimmunoassay (RIA) an Bedeutung gewonnen. Im ersten Falle verwendet man Enzyme und im zweiten Falle Radioaktivität zur Markierung. Beim EIA wurde das radioaktive Antigen also durch ein Enzym-Antigen-Konjugat ersetzt, das dann mit dem Probenantigen um die freien Bindungsplätze des Antikörpers konkurrieren kann. For the detection of a chemical substance one uses in Immunoassays the antigen-antibody binding that occurs when the chemical substance as an antigen in the sample to the antibody occurs. In Kopetitive immunoassays for molecules below of 1000 daltons applied, they compete to determining antigens with labeled antigens of the same Specificity around the binding sites on the antibody. More recently the enzyme immunoassay (EIA) has over the radioimmunoassay (RIA) gained in importance. In the first case, enzymes are used and in the second case radioactivity for labeling. At the EIA the radioactive antigen an enzyme-antigen conjugate, which is then replaced with the sample antigen can compete for the free binding sites of the antibody.

Bei dem kompetitiven EIA konkurriert eine vorgegebene Menge des enzym-markierten Antigens mit dem Probenantigen um die Bindungs stellen am Antikörper, die ihrerseits adsorptiv bzw. kovalent an eine Trägeroberfläche, z. B. Polystyroloberfläche, gebunden sind. Bei geringer Konzentration von Probeantigen wird viel Enzym-Hapten- Konjugat (hoher Substratumsatz), bei einer hohen Konzentration von Probeantigen wird dagegen nur wenig Enzym-Hapten-Konjugat (geringer Substratumsatz) gebunden. Die Inhibition der Enzym-Hapten-Bindung ist damit eine Funktion der Probenantigenkonzentration. Nach Abtrennung der ungebundenen Anteile an Enzym-Hapten-Konjugat über einen Waschschritt läßt sich anhand der Substratumsetzung der Anteil des gebundenen, enzymmarkierten Antigens und damit die Antigenkonzentration in der Probe ermitteln. Meßgröße für die Bindung des Enzym-Hapten-Konjugates ist die Absorption der umgesetzten Substratmenge.In the competitive EIA, a predetermined amount of the competes enzyme-labeled antigen with the sample antigen around the binding put on the antibody, which in turn adsorptively or covalently a support surface, e.g. B. polystyrene surface, are bound. With a low concentration of sample antigen, a lot of enzyme hapten Conjugate (high substrate turnover), at a high concentration of In contrast, only little enzyme-hapten conjugate (less Substrate turnover). Inhibition of enzyme-hapten binding is therefore a function of the sample antigen concentration. To Separation of the unbound portions of the enzyme-hapten conjugate via a washing step can be based on the substrate conversion Share of the bound, enzyme-labeled antigen and thus the Determine the antigen concentration in the sample. Measured variable for the Binding of the enzyme-hapten conjugate is the absorption of the implemented amount of substrate.

Alle immunologischen Verfahren basieren letzten Endes auf der Güte der Antikörper. Diese ist zum einen durch die Spezifität der Bin dung und zum anderen durch die Bindefestigkeit bestimmt. Für nie dermolekulare Substanzen ist es äußerst schwierig, relativ einheit liche Antikörper mit hinreichend fester Bindung zu erzeugen. Dies bedeutet, daß die Bindekonstanten der Antikörper bei 10^-11 mol/l liegen sollten, damit eine hinreichend empfindliche Analytik mög lich wird. Für einige Nitrophenole wurden Bindekonstanten in dieser Größenordnung beschrieben und das Biotin/Avidin-System hat eine Bindekonstante von 10^-15 mol/l. Von uns wurden darüber hinaus Bin dekonstanten in dieser Größenordnung bei Antikörpern gegen Phenoxy carbonsäure-, Phenylharnstoff- und s-Triazin-Herbizide beobachtet.All immunological methods are ultimately based on the quality of the antibodies. This is determined on the one hand by the specificity of the binding and on the other hand by the binding strength. It is extremely difficult for never dermolecular substances to generate relatively uniform antibodies with a sufficiently strong bond. This means that the binding constants of the antibodies should be 10 ^-11 mol / l, so that a sufficiently sensitive analysis is possible. Binding constants of this magnitude have been described for some nitrophenols and the biotin / avidin system has a binding constant of 10 ^-15 mol / l. We have also observed deconstants of this magnitude in antibodies against phenoxycarboxylic acid, phenylurea and s-triazine herbicides.

Diese Antikörper liegen aber nur selten einheitlich vor und müssen entweder über herkömmliche Verfahren sowie über haptenspezifische Affinitätssäulen bzw. über den Umweg von monoklonalen Antikörpern gereinigt werden, bevor sie in einem empfindlichen Immunoassay ein gesetzt werden können.However, these antibodies are only rarely and uniformly available either via conventional methods or via hapten-specific ones Affinity columns or via the detour of monoclonal antibodies to be cleaned before entering a sensitive immunoassay can be placed.

Polyklonale Antikörper führen im Immunoassay nämlich zu einer Viel zahl von überlagernden Bindekurven, deren Wendepunkt zum überwie genden Teil im unempfindlichen Bereich liegen (ungefähr 10^-6 mol/l). Diese Antikörperpopulationen verflachen die Bindekurve und führen so zu einer relativ geringen Steilheit der Bindekurven im hochempfindlichen Bereich.In the immunoassay, polyclonal antibodies lead to a large number of overlapping binding curves, the turning point of which is predominantly in the insensitive range (approximately 10 ^-6 mol / l). These antibody populations flatten the binding curve and thus lead to a relatively low slope of the binding curve in the highly sensitive area.

Durch Verkürzung der Inkubationszeiten sowie einem Zeit versetzten Zugeben von Hapten (Ligand) und Tracer (z. B. Enzym-Hapten-Konjugat im Enzymimmunoassay) kann man die Testempfindlichkeit erhöhen. Dies kommt dadurch zustande, daß vor allem die Antikörper mit fester Bindung vom Ligand zuerst besetzt werden.By shortening the incubation times and a time shift Add hapten (ligand) and tracer (e.g. enzyme-hapten conjugate in the enzyme immunoassay) the test sensitivity can be increased. This is due to the fact that especially the antibodies with solid Binding to be occupied by the ligand first.

Wir haben nun beobachtet, daß nach Hapten-(Ligand)-Zugabe durch Einlegen eines kurzen Waschschrittes dieser Unterschied von schwa chen und festbindenden Antikörpern verstärkt wird, so daß mit unge reinigten polyklonalen Antikörpern ein hochempfindlicher Test auf gebaut werden kann. Hierdurch läßt sich die Testempfindlichkeit beträchtlich erhöhen und gleichzeitig ist die Funktion des Enzym tracers weniger anfällig gegen seinen Substitutionsgrad. We have now observed that after hapten (ligand) addition by Insert a short wash this difference from schwa Chen and binding antibodies is strengthened, so that with unge purified a highly sensitive test on polyclonal antibodies can be built. This allows the test sensitivity increase considerably and at the same time is the function of the enzyme tracers less susceptible to its degree of substitution.

Bei hochsubstituierten Enzym-Hapten-Konjugaten kommt es durch kooperative Effekte zuerst zu einer Extinktions-Zunahme und dann zu einer Extinktions-Abnahme (Fig. 1a). Niedrigsubstituierte Konjugate zeigen diese Störung nicht (Fig. 1b). Deren Nachweisempfindlichkeit wird durch den Zwischenwaschschritt zusätzlich beträchtlich gesteigert (Fig. 1c).In the case of highly substituted enzyme-hapten conjugates, cooperative effects first lead to an increase in extinction and then to a decrease in extinction ( FIG. 1a). Low-substituted conjugates do not show this disorder ( Fig. 1b). Their sensitivity to detection is increased considerably by the intermediate washing step ( Fig. 1c).

Das hier beschriebene Verfahren weicht von dem oben beschriebenen bekannten kompetitiven Assays ab, daß zwischen Zugabe des Probenantigens und Zugabe des Enzym-Antigen-Konjugates zusätzliche Waschschritte eingefügt werden. Hierdurch entfällt die Konkurrenzreaktion zwischen Antigen und Konjugat um die Bindestellen auf den Antikörpern. Das Konjugat besetzt in unserem Verfahren also die freigebliebenen Antikörperbindestellen, ohne das die Kompetitiven oder eine störende Kooperation eine Rolle spielen könnte.The method described here differs from that described above known competitive assays that between the addition of the Sample antigen and addition of the enzyme-antigen conjugate additional Washing steps are inserted. This eliminates the Competition reaction between antigen and conjugate for the Binding sites on the antibodies. The conjugate occupies in our So move the free antibody binding sites without that the competitive or disruptive cooperation matter could play.

Das beschriebene Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß durch Einfügen zusätzlicher Waschschritte zwischen Ligand- und TracerzugabeThe described method is characterized in that Insert additional washing steps between ligand and Tracer addition

1. die Antikörperreinigung durch ein gezieltes Ansprechen der optimalen Antikörper ersetzt wird;1. antibody cleaning by targeting the optimal antibody is replaced;
2. die Testempfindlichkeit erhöht wird;2. the test sensitivity is increased;
3. und sich deshalb aufwendige Reinigungsschritte des Enzym-Hapten- Konjugates erübrigen.3. and therefore complex cleaning steps of the enzyme hapten There is no need for conjugates.

Durch diese Verfahrensänderung wird die Produktion des Testes also beträchtlich vereinfacht und die Nachweisempfindlichkeit gleichzeitig erhöht.This change in procedure will result in the production of the test so considerably simplified and the sensitivity of detection increased at the same time.

Claims

1. Immunologisches Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Zugabe des Probenantigens und des Tracers zusätzliche Waschschritte eingefügt werden.1. Immunological detection method, characterized in that additional washing steps are inserted between the addition of the sample antigen and the tracer.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß kompetitive sowie kooperative Einflüsse im Test weitgehend ausgeschaltet werden.2. The method according to claim 1, characterized in that competitive and cooperative influences in the test largely be turned off.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Nachweisbestimmung mit Hilfe eines radioaktiven Isotops, eines Enzyms, einer fluoreszierenden Substanz oder einer ein elektronisches Signal abgebende Substanz erfolgt.3. The method according to claim 1, characterized in that the immunological detection determination using a radioactive Isotope, an enzyme, a fluorescent substance or a substance emitting an electronic signal takes place.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Test empfindlichkeit im Vergleich zu ein kompetitiven Assay erhöht wird.4. The method according to claim 3, characterized in that the test sensitivity increased compared to a competitive assay becomes.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an die Antikörpereinheit geringere Ansprüche gestellt zu werden brau che, insbesondere können ungereinigte polyklonale Antikörper direkt verwendet werden.5. The method according to claim 1, characterized in that to the Antibody unit needs to be made less demanding che, in particular, unpurified polyclonal antibodies can be used directly.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der anti gene Substitutionsgrad des Enzyms im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren weniger kritisch ist.6. The method according to claim 3, characterized in that the anti gene degree of substitution of the enzyme compared to the conventional Procedure is less critical.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß durch den Zwischenwaschschritt die Produktion des Testes beträchtlich verbilligt und vereinfacht wird.7. The method according to claim 5, characterized in that through the intermediate washing step the production of the Testes is considerably cheaper and simplified.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung von Enzymimmunoassays und einfacher photooptischer Messung bisher nicht mögliche Nachweisempfindlichkeiten von unter 1 ng/l erreicht werden können.8. The method according to claim 7, characterized in that under Use of enzyme immunoassays and simple photo-optical Measurement of detection sensitivities of below 1 ng / l can be achieved.