DE3927467C2 - Device and use of a device for the separation and detection of components of a substance mixture by temperature gradient gel electrophoresis - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung und eine Verwendung der Vorrichtung zur Durchführung der Temperatur­ gradienten-Gelelektrophorese.The present invention relates to a device and a use of the device for performing the temperature gradient gel electrophoresis.

Der Nachweis von Mutationen in genetischem Material oder der Nachweis der phänotypischen Konsequenz einer genetischen Muta­ tion ist eine wichtige analytische Aufgabe in vielen Bereichen biologischer Forschung, angewandter Medizin, biotechnischer Produktion und Kriminalistik. Auf genetischer Ebene bedeutet eine Mutation den Austausch mindestens eines Nukleotides oder Basenpaares auf DNA- oder RNA-Ebene. Die Molekularbiologie erlaubt mit Hybridisierungs- oder Sequenzierungstechniken den Nachweis einer Mutation in klonaler DNA oder RNA. Diese Techni­ ken beschränken sich jedoch auf forschungsnahe Anwendungen. Für den Routineeinsatz konnte ein technischer Standard, der dem Ver­ gleich mit immunologischen Methoden (ELISA usw.) standhält, nicht erreicht werden.The detection of mutations in genetic material or the Evidence of the phenotypic consequence of a genetic muta tion is an important analytical task in many areas biological research, applied medicine, biotechnical Production and forensics. At the genetic level means a mutation is the exchange of at least one nucleotide or Base pair at the DNA or RNA level. Molecular biology allows with hybridization or sequencing techniques Detection of a mutation in clonal DNA or RNA. This techni However, they are limited to research-related applications. For the routine use could be a technical standard that the Ver withstands immediately with immunological methods (ELISA etc.), cannot be reached.

Die Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE), wie sie in der DE-OS 36 22 591 beschrieben wurde, ist eine Methode zur De­ tektion geringer struktureller Unterschiede oder Besonderheiten biologischer Makromoleküle wie Nukleinsäuren oder Proteine. Die Technik ist jedoch ungeeignet für eine automatisierbare Analyse, wie sie zum Beispiel bei Bestimmung vieler Einzelproben im kli­ nischen Bereich bei der Analyse genetischer Erkrankungen oder in der forensischen Analytik notwendig ist. Mit Hilfe der TGGE- Technologie gelang es, Mutationen ohne umständliche differen­ tielle Hybridisierung direkt sichtbar zu machen (Riesner et al. (1989), Electrophoresis 10, S. 377-389), jedoch beschränkt sich die Technik auf die Handhabung einer Flachbett-Gelelektrophorese für die forschungsmäßige Analytik. Ähnliche Resultate liefert die Kombination aus Flachbett-Gelelektrophorese und einem dena­ turierenden chemischen Gradienten, der sich aber kaum reprodu­ zierbar formen läßt und somit für eine Automatisierung nicht in Frage kommt.Temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), as described in DE-OS 36 22 591, is a method for detecting small structural differences or special features of biological macromolecules such as nucleic acids or proteins. However, the technology is unsuitable for automated analysis, as is necessary, for example, when determining many individual samples in the clinical area when analyzing genetic diseases or in forensic analysis. With the help of the TGGE technology it was possible to make mutations directly visible without cumbersome differential hybridization (Riesner et al. (1989), Electrophoresis 10 , pp. 377-389), but the technique is limited to the handling of a flat bed gel electrophoresis for research-based analytics. The combination of flatbed gel electrophoresis and a denaturing chemical gradient provides similar results, but it can hardly be reproducibly shaped and is therefore out of the question for automation.

Die notwendige Voraussetzung für die sensitive Erfassung selbst einzelner Mutationen in der TGGE ist ein homogenes Temperatur­ niveau im Gel senkrecht zur Laufrichtung der Elektrophorese, d. h. an Orten gleichen elektrischen Potentials. Dies kann zum Beispiel durch die doppelseitig temperierte senkrechte Elektro­ phorese nach D. R. Thatcher und B. Hodson (1981), Biochemistry 197, S. 105-109, nicht hinreichend realisiert werden, da die thermisch nicht ausreichend verbundenen gegenüberliegenden Thermostatierplatten an Orten gleichen elektrischen Potentials nicht identische Temperaturen aufweisen.The necessary prerequisite for the sensitive detection of even individual mutations in the TGGE is a homogeneous temperature level in the gel perpendicular to the direction of rotation of the electrophoresis, ie at locations with the same electrical potential. This cannot be sufficiently achieved, for example, by the double-sided temperature-controlled vertical electrophoresis according to DR Thatcher and B. Hodson (1981), Biochemistry 197 , pp. 105-109, since the thermostatic plates on the opposite side, which are not sufficiently thermally connected, do not have the same electrical potential have identical temperatures.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es somit, eine Vorrichtung zu schaffen, die die Anwendung der TGGE zur automa­ tischen Auswertung von Hybridisierungsexperimenten ermöglicht und die Nachteile der Undurchführbarkeit der TGGE für den analytischen Routinebetrieb beseitigt und die TGGE insgesamt leichter handhabbar macht.The object underlying the invention is therefore a To create device that the application of the TGGE to automa tical evaluation of hybridization experiments and the disadvantages of the impracticability of the TGGE for the eliminated analytical routine operations and the TGGE as a whole makes it easier to handle.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den Merkma­ len des Anspruchs 1.This task is solved by a device with the characteristics len of claim 1.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind den Unteransprüchen entnehmbar.Advantageous embodiments of the device according to the invention can be found in the subclaims.

Die Vorrichtung besteht aus mindestens zwei Heiz- oder Kühlvor­ richtungen oder einer Heiz- und einer Kühlvorrichtung zum Aufbau des Temperaturgradienten. Die Heiz- oder Kühlvorrichtungen sind mit Wärmereservoirs verbunden. Die Wärmereservoirs und Heiz- oder Kühlvorrichtungen sind so ausgebildet, daß sie einen ein Trennmedium enthaltenden Hohlkörper vollkommen umschließen. The device consists of at least two heating or cooling devices directions or a heating and cooling device to build of the temperature gradient. The heaters or coolers are connected to heat reservoirs. The heat reservoirs and heating or cooling devices are designed so that they a Completely enclose the hollow body containing the separation medium.  

Dieser Hohlkörper enthält die zur Trennung verwendete Trenn­ matrix oder das trägerfreie Trennmedium in seinem Lumen. Zum Aufbau des reproduzierbaren Temperaturgradienten oder bei iso­ thermer Verfahrensweise zur Gewährleistung eines reproduzier­ baren einheitlichen Temperaturniveaus des Trennmediums ist der Hohlkörper von einem Thermostatiermantel umschlossen. Dabei kann der Thermostatiermantel vorzugsweise thermisch leitend mit dem Wärmereservoir oder den Heiz- oder Kühlvorrichtungen verbunden sein.This hollow body contains the separation used for the separation matrix or the carrier-free separation medium in its lumen. To the Structure of the reproducible temperature gradient or at iso Thermer procedure to ensure a reproducible The uniform temperature level of the separation medium is the Hollow body enclosed in a thermostatic jacket. It can the thermostatic jacket is preferably thermally conductive with the Heat reservoir or the heating or cooling devices connected be.

Die Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau einer bevorzugten Aus­ führungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Fig. 1a zeigt einen Querschnitt durch den von einem Thermostatiermantel um­ schlossenen Hohlkörper mit innen angeordnetem Trennmedium längs der Linie A-A. Fig. 1 shows schematically the structure of a preferred embodiment of the device according to the invention. Fig. 1a shows a cross section through the closed by a thermostatic jacket around the hollow body with the internal separation medium along the line AA.

Die Fig. 2 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Aufbau eines zeitlichen Temperaturgradienten. Fig. 2 shows another preferred embodiment of the device according to the invention for establishing a temporal temperature.

Die Fig. 3 zeigt schematisch eine Ausführungsform der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung, die eine Vielzahl der zur Trennung verwendeten Hohlkörper aufnehmen kann. Fig. 3 shows schematically an embodiment of the device according to the inven tion, which can accommodate a variety of hollow bodies used for separation.

Die Fig. 4 verdeutlicht schematisch den Verfahrensablauf mit der Vorrichtung gemäß Fig. 2. FIG. 4 schematically illustrates the process sequence with the device according to FIG. 2.

Die in Fig. 1 dargestellte bevorzugte Ausführungsform besteht aus zwei Heiz- oder Kühlvorrichtungen 1, 2 mit den dazugehörigen Temperaturen T₂ und T₁. Diese Heiz- bzw. Kühlvorrichtungen 1, 2 sind leitend mit Wärmereservoirs 4, 5 verbunden. Die Heiz- oder Kühlvorrichtungen sowie das Wärmereservoir weisen zentri­ sche Durchbohrungen auf. Durch diese Bohrungen ist ein Hohlkör­ per 6 beidseitig durchdringend angeordnet. Der Hohlkörper 6 ist von einem Thermostatiermantel 7 allseitig umschlossen. Der Hohlkörper befindet sich im Thermostatiermantel zentriert. Der Hohlkörper 6 enthält in seinem Lumen das zur Trennung verwendete Medium. Der Thermostatiermantel besteht aus wärmeleitendem Material, insbesondere dem Material, aus dem auch die Wärmere­ servoirs hergestellt sind. Die Temperaturniveaus 1, 2 werden zum Beispiel durch Peltierelemente, thermostatisierbare Flüssig­ keitsbäder oder elektrische Heizungen 9 beheizt bzw. gekühlt. Am Ende der Trennstrecke ist eine Detektionseinheit 10 vorge­ sehen. Die Fig. 1a zeigt die Situation im Querschnitt längs der. Linie A-A. Der Zwischenraum zwischen der äußeren Wand des Hohlkörpers 6 und der inneren Wand des Thermostatierman­ tels 7 ist durch eine viskose Flüssigkeit 8 ausgefüllt. Das Trennmedium füllt vollständig den Querschnitt des Hohlkörpers 6. Der Hohlkörper 6 ist zylindrisch ausgebildet, zum Beispiel als Kapillare. Die an einer beliebigen Stelle der Trennstrecke herrschende Temperaturberechnet sich nach der Formel T = T₂ - (T₂ - T₁) × d₂/(d₁ + d₂). Dabei bedeutet d₁ der Abstand des Ortes von der Temperatur T₁ und d₂ der Abstand des Ortes von der Tem­ peratur T₂, die jeweils an den Temperaturniveaus 2, 1 herrschen.The preferred embodiment shown in FIG. 1 consists of two heating or cooling devices 1 , 2 with the associated temperatures T ₂ and T ₁ . These heating and cooling devices 1 , 2 are conductively connected to heat reservoirs 4 , 5 . The heating or cooling devices and the heat reservoir have central perforations. Through these holes a hollow body is arranged penetrating by 6 on both sides. The hollow body 6 is enclosed on all sides by a thermostatic jacket 7 . The hollow body is centered in the thermostatic jacket. The hollow body 6 contains in its lumen the medium used for the separation. The thermostatic jacket consists of heat-conducting material, in particular the material from which the warmer servoirs are made. The temperature levels 1 , 2 are heated or cooled, for example, by Peltier elements, thermostatic liquid baths or electric heaters 9 . At the end of the separation section, a detection unit 10 is easily seen. FIG. 1a shows the situation in cross section along. Line AA. The gap between the outer wall of the hollow body 6 and the inner wall of the Thermostatierman means 7 is filled with a viscous liquid 8 . The separation medium completely fills the cross section of the hollow body 6 . The hollow body 6 is cylindrical, for example as a capillary. The temperature prevailing at any point in the separation distance is calculated according to the formula T = T ₂ - (T ₂ - T ₁ ) × d ₂ / (d ₁ + d ₂ ). Here, d _{1 means} the distance of the location from the temperature T ₁ and d ₂ the distance of the location from the temperature T ₂ , each prevailing at the temperature levels 2 , 1 .

Die Fig. 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform zur Durchfüh­ rung des Verfahrens als einer von einem zeitlichen Temperatur­ gradienten überlagerten Elektrophorese. Sie besteht aus drei Temperaturniveaus 1, 2, 3, die hier wiederum mit Wärmereservoirs verbunden sind. Die Komponenten Hohlkörper 6, Thermostatierman­ tel 7, Detektionseinheit 10, Heiz- oder Kühlvorrichtung 9 sind ähnlich der Vorrichtung gemäß. Fig. 1 ausgebildet. Lediglich der Thermostatiermantel 7 ist mit dem Wärmereservoir der Heiz- oder Kühlvorrichtung am Temperaturniveau 2 nicht thermisch leitend verbunden. Fig. 2 shows a preferred embodiment for imple out the method as a gradient of a temporal temperature superimposed electrophoresis. It consists of three temperature levels 1 , 2 , 3 , which in turn are connected to heat reservoirs. The components hollow body 6 , Thermostatierman tel 7 , detection unit 10 , heating or cooling device 9 are similar to the device according to. Fig. 1 trained. Only the thermostatic jacket 7 is not thermally conductively connected to the heat reservoir of the heating or cooling device at temperature level 2 .

Die Fig. 4a bis 4d zeigen den Verfahrensablauf mit einer Vorrichtung gemäß der Fig. 2. Der Gradient des elektrischen Feldes, das zur Trennung verwendet wird, ist in Richtung der Abszisse aufgetragen und symbolisiert gleichzeitig beliebige Orte der zu durchlaufenden Trennstrecke. Auf der Ordinate sind einmal in positiver Richtung die Temperaturniveaus in Abhängig­ keit vom Ort eingezeichnet (Fig. 4a). Die Wanderungsgeschwin­ digkeit der Komponenten der zu trennenden Probe ist durch Stufenfunktion unterhalb der Temperaturkurve dargestellt. Z. B. ist die Wanderungsgeschwindigkeit bei T₁ (t₀) ungefähr gleich Null. Aufgetragen wird die Probe bei Temperaturniveau T₀, das in diesem Fall einfachheitshalber gleich dem Temperaturniveau T₂ am Ende der Elektrophorese-Trennstrecke sein soll. Nach Auftrag nehmen die Stoffe 1 und 2 das gepunktete Volumen in bezeichneter Position ein. Die Probe wandert längs des Feldgradienten in dem Trennmedium, bis sie das Temperaturniveau T₁ erreicht. Wenn beispielsweise die Probe aus Nukleinsäuren besteht, erfahren diese hier eine teilweise Denaturierung durch Aufweitung des Doppelstrangs in sogenannte "Loops" (Schleifen). Dadurch bedingt wird die Wanderungsgeschwindigkeit reduziert. Die Probe wird aufkonzentriert an der Grenze zwischen T₀ und T₁. Diese Situa­ tion ist in Fig. 4b in Form des geringeren Volumens dargestellt (Zeitpunkt t₁). Die Temperatur des Temperaturniveaus T₁ wird nun abgesenkt als Funktion der Zeit. Die thermodynamisch stabilere Fraktion, in Fig. 4c als Fraktion Nr. 2 gekennzeichnet, schließt nun die Doppelhelix und gewinnt höhere Mobilität. Dadurch bedingt beginnt diese Fraktion in das Trennmedium zu wandern. Fig. 4d zeigt nun die Situation bei einem Zeitpunkt t₃, bei dem die Temperatur T so weit abgesunken ist, daß auch die thermodynamisch instabilere Probe, hier mit der Nr. 1 ge­ kennzeichnet, mit der Wanderung durch das Trennmedium beginnt. Die Komponente Nr. 2 hat in dieser Zeit allerdings schon einen beträchtlichen Teil der Trennstrecke durchlaufen oder sie bei entsprechender Dimensionierung bereits verlassen, wo sie detek­ tiert werden kann. Diese Ausführungsform verwendet vorzugsweise eine sehr kurze Kapillare mit Trennmedium und läßt sich an drei thermisch voneinander getrennten Bereichen thermostatieren (T₀, T₁, T₂). Die an der Temperaturgrenze zwischen T₀ und T₁ statt­ findende partielle Denaturierung, beispielsweise von Nuklein­ säuren zur Bildung interner "Loops" (Schleifen), kann durch ent­ sprechende Reagenzien unterstützt werden. FIGS. 4a to 4d show the procedure with a device according to the Fig. 2. The gradient of the electric field, which is used for the separation, is plotted in the abscissa direction and simultaneously symbolizes any places to be continuous isolating distance. On the ordinate, the temperature levels depending on the location are drawn once in the positive direction ( FIG. 4a). The rate of migration of the components of the sample to be separated is represented by a step function below the temperature curve. For example, the rate of migration at T ₁ (t ₀ ) is approximately zero. The sample is applied at temperature level T ₀ , which in this case should be the same as temperature level T ₂ at the end of the electrophoresis separation path. After application, substances 1 and 2 take up the dotted volume in the designated position. The sample travels along the field gradient in the separation medium until it reaches the temperature level T ₁ . If, for example, the sample consists of nucleic acids, they undergo partial denaturation here by widening the double strand into so-called "loops". This reduces the speed of migration. The sample is concentrated at the border between T ₀ and T ₁ . This situation is shown in Fig. 4b in the form of the smaller volume (time t ₁ ). The temperature of the temperature level T ₁ is now lowered as a function of time. The thermodynamically more stable fraction, identified as fraction No. 2 in FIG. 4c, now closes the double helix and gains greater mobility. As a result, this fraction begins to migrate into the separation medium. Fig. 4d shows the situation at a time t ₃ , at which the temperature T has dropped so far that the thermodynamically unstable sample, here marked with the number 1, begins to migrate through the separation medium. Component no. 2 has already passed through a considerable part of the separation distance during this time or has already left it with appropriate dimensions, where it can be detected. This embodiment preferably uses a very short capillary with separation medium and can be thermostated in three thermally separated areas (T ₀ , T ₁ , T ₂ ). The partial denaturation taking place at the temperature limit between T ₀ and T ₁ , for example of nucleic acids to form internal "loops" (loops), can be supported by appropriate reagents.

An den Grenzen der einzelnen Temperaturniveaus kommt es jedoch über einen flüssigen Wärmetauscher zu unscharfen Temperaturgren­ zen, so daß die Darstellung gemäß Fig. 4a bis 4d nur als idealisierte Rechteckform von Temperatur und Wanderungsgeschwin­ digkeit gesehen werden soll. Um trotzdem eine möglichst scharfe Grenze der Temperaturniveaus zu gewährleisten, wird bevorzugt, die Temperaturniveaus T₂/T₁/T₀ nicht wärmeleitend zu verbinden.At the limits of the individual temperature levels, however, there are fuzzy temperature limits via a liquid heat exchanger, so that the representation according to FIGS. 4a to 4d should only be seen as an idealized rectangular shape of temperature and speed of migration. In order nevertheless to ensure that the temperature levels are as sharp as possible, it is preferred not to connect the temperature levels T ₂ / T ₁ / T _{0 in a} heat-conducting manner.

Die Fig. 3 zeigt eine bevorzugte Vorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß Heiz- und Kühlvorrichtungen mit den entsprechenden Wärmereservoirs eine Vielzahl der Hohlkörper 6 aufnehmen können, indem die Vorrichtungen 4 und 5 blockartig - 4a, 5a - ausgestaltet sind und eine Vielzahl von Durchbohrungen 11 aufweisen, durch die die Hohlkörper 6 hinausragend, zum Beispiel endseitig hinausragend angeordnet sind. Diese Vorrich­ tung hat den Vorteil, daß sich mit einer Vorrichtung eine Großzahl von Analysen mit dem Ziel der Detektion von bekannten oder unbekannten Mutationen durchführen läßt. Die Vorrichtung gewährleistet, daß mehrere Proben gleichzeitig unter Temperie­ rung durch verschiedene Thermostatierelemente, jedoch mit je einem gemeinsamen Heiz- oder Kühlsystem analysiert werden kön­ nen. Eine bevorzugte Ausführungsform ist auf das Format Mikro­ titer (96 Well) adaptiert im Sinne linearer Mehrkanalsysteme, vorzugsweise 8 oder 12, oder einem 96-Kanal-System. Als "Read out"-System (Ablese-System) finden vorzugsweise fluoreszenzmar­ kierte Nukleinsäuresonden Verwendung, die optisch durch handels­ übliche Detektionssysteme am Anfang und/oder am Ende der Ther­ mostatiervorrichtung als Funktion der Trenndauer und ortsfest registriert werden können. Damit lassen sich mit Hilfe von geeigneten Reagenzienkits Mutationen in genetischem Material automatisch auswerten. Fig. 3 shows a preferred device, which is characterized in that heating and cooling devices with the corresponding heat reservoirs can accommodate a variety of hollow bodies 6 by the devices 4 and 5 block-like - 4 a, 5 a - and a variety have through-bores 11 through which the hollow bodies 6 protrude, for example protrude at the end. This device has the advantage that a large number of analyzes can be carried out with one device with the aim of detecting known or unknown mutations. The device ensures that several samples can be analyzed simultaneously under temperature by different thermostatting elements, but with a common heating or cooling system. A preferred embodiment is adapted to the format micro titer (96 well) in the sense of linear multi-channel systems, preferably 8 or 12, or a 96-channel system. As a "read out" system (reading system), fluorescence-labeled nucleic acid probes are preferably used, which can be registered optically by commercially available detection systems at the beginning and / or at the end of the thermostating device as a function of the separation duration and in a fixed position. With the help of suitable reagent kits, mutations in genetic material can be evaluated automatically.

Die thermische Äquilibrierung der jeweiligen Heiz- oder Kühlvor­ richtungen kann homogen elektrisch über Heizdrähte, vorzugsweise jedoch über Peltierelemente erfolgen. Auch flüssige Heizvorrich­ tungen in Form thermostatierbarer Flüssigkeitsbäder kommen in Frage. Hierbei ist jedoch darauf zu achten, daß die mit den thermostatierbaren Ummantelungen der Kapillare verbundenen Heiz- oder Kühlvorrichtungen gegenüber allen Ummantelungen nahezu identische Temperaturen an den jeweiligen Übergangsstellen auf­ weisen. Dieses läßt sich durch eine symmetrisch gebaute Peltier­ heizung/-Kühlung realisieren oder im Falle der Flüssigtemperie­ rung durch gegenläufige durchströmte Kanäle, wobei die Summe der Temperaturen gegenüberliegender Flüsse an jeder Kapillar­ position nahezu identisch bleibt.The thermal equilibration of the respective heating or cooling device directions can be homogeneous electrically over heating wires, preferably however, done via Peltier elements. Also liquid heating device in the form of thermostatable liquid baths Question. However, it should be ensured that the with the thermostable jackets of the capillary connected heating or cooling devices almost all sheaths identical temperatures at the respective transition points  point. This can be done by a symmetrically built Peltier Realize heating / cooling or in the case of liquid temperature through opposite channels through which the sum the temperatures of opposite rivers at each capillary position remains almost identical.

Der räumliche Temperaturgradient des mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausführbaren Verfahrens kann so aufgebaut werden, daß mit einer regelbaren Heiz- oder Kühlvorrichtung auf der Probenseite ein bestimmtes Temperaturniveau eingestellt wird, während das zweite, räumlich getrennte Temperaturniveau durch die Temperatur des Elektrophoresebades auf der gegenpoligen Seite definiert ist. Diese einfache Verfahrensweise ist dann möglich, wenn das Elektrophoresebad so dimensioniert ist, daß die Temperatur konstant bleibt. Dazu ist ein hinreichend groß dimensioniertes Elektrophoresebad notwendig. Vorzugsweise wird jedoch auch hier das zweite Temperaturniveau etwa durch Peltier­ elemente, Heizdrähte oder thermostatierbare Wasserbäder regelbar ausgestaltet.The spatial temperature gradient of that with the invention Device executable method can be constructed that with an adjustable heating or cooling device on the Sample side a certain temperature level is set while the second, spatially separated temperature level by the temperature of the electrophoresis bath on the opposite pole Page is defined. This simple procedure is then possible if the electrophoresis bath is dimensioned so that the temperature remains constant. One is big enough Dimensioned electrophoresis bath necessary. Preferably however, here too the second temperature level, for example through Peltier elements, heating wires or thermostattable water baths adjustable designed.

Nach dem Probenauftrag werden die Komponenten des zu trennenden Stoffgemisches längs des elektrischen Feldes in das Trennmedium hineinwandern. Dabei erreichen sie das erste Temperaturniveau und erfahren eine Konformationsumwandlung, die in einer drasti­ schen Reduktion der Wanderungsgeschwindigkeit resultiert. Dies wird entweder direkt durch die eingestellte Temperatur erreicht oder in Kombination mit partiell denaturierenden Reagenzien. Sind die zu trennenden Komponenten beispielsweise Nukleinsäuren, werden durch die partielle Denaturierung die Doppelstränge teil­ weise zu größeren "Loops" aufgeweitet, die in dem Trennmedium quasi steckenbleiben und der Elektrophorese nicht mehr folgen können. Wird nun die Temperatur gesenkt, so bilden sich die "Loop"-Regionen in Abhängigkeit ihrer thermodynamischen Stabili­ tät zurück, wodurch die Mobilität der Nukleinsäuren in dem Trennmedium wieder erhöht wird. Die jeweilige Temperatur ist eine Stoffcharakteristik der entsprechenden Nukleinsäure. Somit gelingt es, die verschiedenen Komponenten in Abhängigkeit der Temperatur zu trennen. Die Moleküle, deren Mobilität erhöht wurde, wandern durch die Trennstrecke und können am Zielpol der Elektrophorese detektiert werden.After the sample application, the components of the to be separated Mix of substances along the electric field in the separation medium hike in. They reach the first temperature level and experience a conformational transformation that takes place in a drastic way reduction in the speed of migration results. This is achieved either directly by the set temperature or in combination with partially denaturing reagents. If the components to be separated are, for example, nucleic acids, the double strands become part of the partial denaturation widened to larger "loops" in the separation medium practically get stuck and stop following electrophoresis can. If the temperature is now lowered, the "Loop" regions depending on their thermodynamic stability act back, whereby the mobility of the nucleic acids in the Separation medium is increased again. The respective temperature is a substance characteristic of the corresponding nucleic acid. Consequently succeeds in depending on the different components  Separate temperature. The molecules whose mobility increases have walked through the separation distance and can reach the destination pole Electrophoresis can be detected.

Es ist ebenfalls möglich, einen Temperaturgradienten mit stei­ gender Temperatur in Elektrophorese-Richtung auszubilden, in welchem die Moleküle zunächst nach ihrem thermodynamisch par­ tiellen Aufschmelzverhalten in dem Trennmedium getrennt werden. Bei tieferer Temperatur werden zunächst die thermodynamisch instabilsten Strukturen partiell thermisch denaturieren, zum Beispiel bei Nukleinsäuren durch Ausbildung von "Loop"-Regionen. Die Mobilität dieser Nukleinsäuren wird drastisch gesenkt, so daß diese in dem Trennmedium entweder "steckenbleiben" oder zumindest nur noch sehr langsam wandern. Die übrigen Komponenten wandern weiter durch das Trennmedium, bis jeweils ihre spezifi­ sche Denaturierung zum drastischen Mobilitätsverlust der jewei­ ligen Moleküle in dem Trennmedium führt. Bei bestimmter Wahl der Maschengröße des Trenngels führt die Restmobilität der quasi arretierten Biomoleküle dazu, daß nach einiger Zeit - wenn auch sehr langer Zeit - alle Komponenten des zu trennenden Gemisches die Trennstrecke durchwandern können. Unterstützt wird dieser Effekt dadurch, daß die Mobilität der partiell denaturierten Nukleinsäuren bei vollständiger Denaturierung - also Trennung in die Einzelstränge - wieder drastisch zunimmt, da jetzt nur noch die Einzelstränge durch das Trennmedium wandern. Die thermodynamisch instabilsten Nukleinsäuren, die bei tiefen Temperaturen bereits ihre Mobilität verlieren, wandern zwar sehr langsam im Gel weiter, erreichen jedoch irgendwann ein höheres Temperaturniveau, das zum vollständigen Aufschmelzen führt, so daß die Doppelstränge in ihre Einzelstränge zerfallen. Dies führt dann zu der oben beschriebenen beschleunigten Wanderungs­ geschwindigkeit.It is also possible to use a temperature gradient with steep gender temperature in the electrophoresis direction, in which the molecules first have according to their thermodynamic par tial melting behavior in the separation medium are separated. At lower temperatures, the thermodynamic are first partially thermally denature the most unstable structures, for Example with nucleic acids through the formation of "loop" regions. The mobility of these nucleic acids is drastically reduced, so that they either "get stuck" in the separation medium or at least walking very slowly. The other components continue to travel through the separation medium until their specific denaturation to drastic loss of mobility of the respective leads molecules in the separation medium. With a certain choice the mesh size of the separating gel leads to the residual mobility of the quasi locked biomolecules that after a while - if very long time - all components of the mixture to be separated can walk the separation distance. This is supported Effect in that the mobility of the partially denatured Nucleic acids with complete denaturation - i.e. separation into the single strands - again increases drastically since now only still migrate the single strands through the separation medium. The most thermodynamically unstable nucleic acids at deep Temperatures are already losing their mobility, they migrate a lot slowly in the gel, but eventually reach a higher one Temperature level that leads to complete melting, see above that the double strands break down into their single strands. This then leads to the accelerated migration described above speed.

Dieser Effekt kann auch zur Beschleunigung der Elektrophorese insgesamt ausgenutzt werden. Sind die Komponenten durch Teil­ denaturierung und Mobilitätsverlust in dem Trennmedium voneinan­ der getrennt worden, dann kann das Temperaturniveau des gesamten Trennmediums über den Schmelzpunkt der Doppelstränge hinaus erhöht werden, um alle Doppelstränge vollständig in Einzelsträn­ ge zu überführen. Danach gewinnen alle Komponenten ihre Mobili­ tät zurück. Zur Durchführung dieser Verfahrensweise ist es jedoch erforderlich, daß die Temperatur entweder sehr schnell über das gesamte Trennmedium äquilibriert wird oder die Elektro­ phorese bis zur Äquilibrierung der Temperatur unterbrochen wird, beispielsweise durch Abschaltung des elektrischen Feldes. Vor­ zugsweise sind die zu trennenden Moleküle von ähnlicher Größe. Die Verfahrensweise unter den beschriebenen Bedingungen gewähr­ leistet dann bei der isothermischen Elektrophorese mit hohem Temperaturniveau, daß die getrennten Komponenten im weiteren Verlauf der Elektrophorese ihren relativen räumlichen Abstand beibehalten.This effect can also accelerate electrophoresis be exploited overall. Are the components by part denaturation and loss of mobility in the separation medium from one another who have been separated, then the temperature level of the whole  Separation medium beyond the melting point of the double strands be increased to all double strands completely in single strands to convict. Then all components win their mobili act back. It is to carry out this procedure however, the temperature required either very quickly is equilibrated over the entire separation medium or the electro phoresis is interrupted until the temperature equilibrates, for example by switching off the electric field. Before preferably the molecules to be separated are of a similar size. Grant the procedure under the conditions described then performs with high isothermal electrophoresis Temperature level that the separated components in the further Course of electrophoresis their relative spatial distance maintained.

Eine andere Verfahrensweise, die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbar ist, benutzt lediglich ein zeitlich gesteuertes variables Temperaturprogramm an der Probenauftrags­ seite der Elektrophorese zum Aufbau eines zeitlichen Temperatur­ gradienten, der zur Trennung der Komponenten des Stoffgemisches führt. Man läßt die zu trennende Probe zunächst elektrophore­ tisch in das Trennmedium hineinwandern. Das Temperaturniveau auf der Probenauftragsseite ist so gewählt, daß beispielsweise bei Nukleinsäuren die Doppelstränge zu "Loops" aufgeweitet sind, ohne jedoch vollständig aufgeschmolzen zu werden. Die Bildung von "Loops" kann durch geeignete Reagenzienwahl unterstützt werden. Dies führt dazu, daß die zu analysierenden Komponenten am Beginn der Elektrophorese in dem Trennmedium quasi arretiert sind. Wird nun die Temperatur abschnittsweise gesenkt, so bilden sich die thermodynamisch stabilsten Doppelstränge zurück, so daß diese Nukleinsäuren eine erhöhte Mobilität aufweisen. Diese beginnen dann durch das Trenngel zu wandern. Durch die nachfol­ gende Temperaturänderung werden dann nachfolgend die Nuklein­ säuren mit der nächstniedrigeren thermodynamischen Stabilität mit der Wanderung beginnen. Es kann vorteilhaft sein, die Temperaturabsenkung schrittweise durchzuführen, um den Tren­ nungseffekt in räumlicher Hinsicht zu verstärken. Die mit der Wanderung beginnenden Moleküle gewinnen quasi einen räumlichen Vorsprung beim Durchwandern des Trennmediums. Bei hinreichend großem Abstand der thermodynamischen Stabilität ist es jedoch auch möglich, den Temperaturgradienten relativ schnell konti­ nuierlich zu senken. Bei dieser Verfahrensweise kann es vorteil­ haft sein, auch den Elektrophorese-Endpunkt mit einer regelbaren Heiz- oder Kühlvorrichtung zu versehen.Another procedure that with the invention Device is feasible, uses only one time Controlled variable temperature program on the sample application side of electrophoresis to build up a temporal temperature gradient that separates the components of the mixture of substances leads. The sample to be separated is first left electrophoric migrate the table into the separation medium. The temperature level on the sample order page is selected so that, for example in the case of nucleic acids, the double strands are expanded into "loops", but without being melted completely. The education of "loops" can be supported by suitable reagent choice become. This leads to the components to be analyzed virtually locked in the separation medium at the start of electrophoresis are. If the temperature is now lowered in sections, then form the most thermodynamically stable double strands back, so that these nucleic acids have increased mobility. This then start walking through the separating gel. By the successor The subsequent temperature change then becomes the nucleus acids with the next lower thermodynamic stability start the hike. It may be beneficial to Gradually lower the temperature to the door to reinforce the spatial effect. The one with the  Molecules beginning to migrate gain a spatial one A head start when migrating through the separation medium. With sufficient however, there is a large gap in thermodynamic stability also possible to maintain the temperature gradient relatively quickly to lower it. With this procedure, it can be advantageous the electrophoresis endpoint with an adjustable To provide heating or cooling device.

Bei allen Verfahrensweisen ist es jedoch notwendig, zum Aufbau eines reproduzierbaren Temperaturgradienten bzw. reproduzierba­ rer isothermischer Bedingungen das Trennmedium mit einem ther­ misch leitenden Thermostatiermantel zu umschließen. Zur Aus­ bildung des reproduzierbaren Temperaturgradienten bzw. des isothermen Temperaturniveaus ist es unbedingt erforderlich, daß der Energiefluß im Thermostatiermantel klein ist gegenüber den Energieflüssen in Heiz- und Kühlelement.With all procedures, however, it is necessary to build a reproducible temperature gradient or reproducible rer isothermal conditions the separation medium with a ther to enclose a mixed conductive thermostatic jacket. To the end formation of the reproducible temperature gradient or isothermal temperature levels it is imperative that the energy flow in the thermostat jacket is small compared to that Energy flows in heating and cooling elements.

Die zur Temperatur-Gelelektrophorese verwendbaren Temperaturen liegen vorzugsweise im Bereich von 0 bis 100°C. Das Trennmedium besteht vorzugsweise aus Polyacrylamid-Gelen.The temperatures that can be used for temperature gel electrophoresis are preferably in the range from 0 to 100.degree. The separation medium consists preferably of polyacrylamide gels.

Die erfindungsgemäß ausgestaltete Temperaturgradienten-Gelelek­ trophorese eignet sich insbesondere auch für eine Vorgehenswei­ se, bei der ein Temperaturgradient nicht räumlich dimensioniert ist, sondern zeitlich variabel bzw. zeitlich gradientenförmig aufgebaut wird. Darunter ist zu verstehen, daß ein Heiz- oder Kühlreservoir mit einem zeitlich definierten Temperaturprogramm geregelt wird, wodurch sich die Mobilitäten der zu trennenden Moleküle letztlich als Funktion der Zeit steuern lassen. So läßt sich zum Beispiel eine offene zirkuläre Nukleinsäure oder auch eine partiell denaturierte doppelsträngige Nukleinsäure bei hohen Temperaturen im Gel quasi "arretieren" und erst nach Ablauf einer bestimmten Zeit durch Senken der Temperatur nach reversibler Strukturrückbildung in dem Trennmedium mobilisieren. Der Vorteil dieser Technik liegt darin, daß hierbei äußerst kurze Trennstrecken realisiert werden können. The temperature gradient gel electrode designed according to the invention trophoresis is particularly suitable for a procedure se, in which a temperature gradient is not spatially dimensioned but is variable in time or gradient in time is built up. This means that a heating or Cooling reservoir with a time-defined temperature program is regulated, whereby the mobility of those to be separated Ultimately, let molecules be controlled as a function of time. So lets for example an open circular nucleic acid or a partially denatured double-stranded nucleic acid "Lock" high temperatures in the gel and only after Expiration of a certain time by lowering the temperature after Mobilize reversible structure regression in the separation medium. The advantage of this technique is that it is extremely short separation distances can be realized.  

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das damit durchführbare Verfahren können sowohl zur analytischen Erfassung als auch zur Präparation von Komponenten aus Stoffgemischen verwendet werden. Die Analyse und Präparation können an vielen Proben simultan durchgeführt werden. Die Detektion und Auswertung können automa­ tisch erfolgen. Insbesondere eignen sich Verfahren und Vorrich­ tung zur Präparation und Analyse von Viroiden, viralen Nuklein­ säuren, Satelliten-RNA, zur Analyse von Mutationen in Nuklein­ säuren, zur Analyse von Mutationen in Proteinen und zur Analyse von Protein-Nukleinsäure-Komplexen.The device according to the invention and what can be carried out with it Methods can be used for both analytical recording and Preparation of components from mixtures of substances can be used. The analysis and preparation can be performed on many samples simultaneously be performed. The detection and evaluation can automa done table. Methods and devices are particularly suitable processing and analysis of viroids, viral nucleotides acids, satellite RNA, for analysis of mutations in nucleotides acids, for analysis of mutations in proteins and for analysis of protein-nucleic acid complexes.

Claims (16)

1. Vorrichtung zur Durchführung der Temperaturgradienten- Gelelektrophorese (TGGE), dadurch gekennzeichnet, daß zwi­ schen mindestens zwei einen Temperaturgradienten aufbauen­ den Heiz- oder Kühlvorrichtungen (1, 2) mit Wärmereservoir (4, 5), bei mehr als zwei Heiz- oder Kühlvorrichtungen zwischen den entferntesten Heiz- oder Kühlvorrichtungen, ein Hohlkörper (6), der die Heiz- oder Kühlvorrichtungen durchdringt, angeordnet ist, welcher das zur Trennung verwendete Trennmedium in seinem Lumen enthält, und der Hohlkörper (6) von einem wärmeleitenden Thermostatiermantel (7) umschlossen ist.1. Device for performing the temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), characterized in that between at least two build a temperature gradient between the heating or cooling devices ( 1 , 2 ) with a heat reservoir ( 4 , 5 ), with more than two heating or cooling devices between the most distant heating or cooling devices, a hollow body ( 6 ) which penetrates the heating or cooling devices is arranged, which contains the separation medium used for the separation in its lumen, and the hollow body ( 6 ) is enclosed by a thermally conductive thermostatic jacket ( 7 ) is. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlkörper zylindrisch ausgebildet ist.2. Device according to claim 1, characterized in that the hollow body is cylindrical. 3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Hohlkörper eine Kapillare ist.3. Device according to claim 1 and / or 2, characterized records that the hollow body is a capillary. 4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen äußerer Wand des Hohlkörpers (6) und innerer Wand des Thermostatiermantels (7) ein Wärmeaustauscher (8) vorhanden ist.4. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that a heat exchanger ( 8 ) is present between the outer wall of the hollow body ( 6 ) and the inner wall of the thermostatic jacket ( 7 ). 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wärmeaustauscher (8) aus einer viskosen Flüssigkeit besteht.5. The device according to claim 4, characterized in that the heat exchanger ( 8 ) consists of a viscous liquid. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Heiz- oder Kühlvorrichtungen aus einem thermostatisierten Flüssigkeitsbad, Peltierheizungen (9) oder elektrischen Heizungen bestehen. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the heating or cooling devices consist of a thermostated liquid bath, Peltier heaters ( 9 ) or electrical heaters. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Thermostatiermantel (7) mit allen Heiz- oder Kühlvorrichtungen (1, 2) wärmeleitend verbunden ist.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the thermostatic jacket ( 7 ) with all heating or cooling devices ( 1 , 2 ) is thermally connected. 8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine dritte Heiz- oder Kühlvorrichtung (3) vorgesehen ist an der zur Aufnähme der Probe gelegenen Seite, die mit dem Wärmereservoir seitenverbunden ist, während die zweite Vorrichtung (2) thermisch entkoppelt ist.8. Device according to one of claims 1 to 7, characterized in that a third heating or cooling device ( 3 ) is provided on the side for receiving the sample, which is connected to the side of the heat reservoir, while the second device ( 2 ) thermally is decoupled. 9. Vorrichtung nach Ansprüch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Thermostatiermantel (7) von der zweiten Vorrichtung (2) thermisch entkoppelt ist und nur mit dem Wärmereservoir der ersten Heiz- oder Kühlvorrichtung (1) thermisch leitend verbunden ist.9. The device according to claims 8, characterized in that the thermostatic jacket ( 7 ) is thermally decoupled from the second device ( 2 ) and is only conductively connected to the heat reservoir of the first heating or cooling device ( 1 ). 10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Heiz- oder Kühlvorrichtungen (1, 2) zeitlich regelbar sind.10. Device according to one of claims 1 to 9, characterized in that the heating or cooling devices ( 1 , 2 ) are adjustable in time. 11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Heiz- oder Kühlvorrichtungen (1, 2) mit den entsprechenden Wärmereservoirs (4, 5) eine Vielzahl von Hohlkörpern (6) aufnehmen können, indem die Vorrichtungen (1, 2) und (4, 5) blockartig (4a, 5a) ausge­ staltet sind und eine Vielzahl von Durchbohrungen (11) aufweisen, durch die die Hohlkörper. (6) hinausragend angeordnet sind.11. Device according to one of claims 1 to 10, characterized in that the heating or cooling devices ( 1 , 2 ) with the corresponding heat reservoirs ( 4 , 5 ) can accommodate a plurality of hollow bodies ( 6 ) by the devices ( 1 , 2 ) and ( 4 , 5 ) block-like ( 4 a, 5 a) are designed and have a plurality of through holes ( 11 ) through which the hollow body. ( 6 ) are arranged protruding. 12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlkörper (6) endseitig über die blockartig ausge­ stalteten Vorrichtungen (4a, 5a) hinausragen.12. The apparatus according to claim 11, characterized in that the hollow body ( 6 ) protrude at the end over the block-like designed devices ( 4 a, 5 a). 13. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Trennung von Stoffgemischen, in denen mindestens eine Komponente im Temperaturbereich des Temperaturgradien­ ten eine thermische Umwandlung erfährt.13. Use of the device according to one of claims 1 to 12 for the separation of mixtures in which at least  a component in the temperature range of the temperature gradients undergoes thermal transformation. 14. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Nachweis und zur Unterscheidung von Viroiden, viralen Nukleinsäuren, Satelliten-RNA, zur Analyse von Mutationen in Nukleinsäuren, zur Analyse von Mutationen in Proteinen und zur Analyse von Protein-/Nukleinsäure- Komplexen.14. Use of the device according to one of claims 1 to 12 for the detection and differentiation of viroids, viral nucleic acids, satellite RNA, for the analysis of Mutations in nucleic acids, for the analysis of mutations in proteins and for analysis of protein / nucleic acid Complexes. 15. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Präparation von Komponenten des zu trennenden Stoffgemisches.15. Use of the device according to one of claims 1 to 12 for the preparation of components to be separated Mixture of substances. 16. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Präparation von Viroiden, viralen Nukleinsäuren, Satelliten-RNA, zur Präparation von mutierten Nukleinsäuren in Homo- und Heteroduplices, zur Präparation von Proteinen und zur Präparation von Protein-/Nukleinsäure-Komplexen.16. Use of the device according to one of claims 1 to 12 for the preparation of viroids, viral nucleic acids, Satellite RNA, for the preparation of mutated nucleic acids in homo- and heteroduplexes, for the preparation of proteins and for the preparation of protein / nucleic acid complexes.